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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007

Claus Opper15. 4. 82

Protokoll zu den Übungen im Experimentalvortrag, LA Chemie

Thema: Enzymatische Reaktionen

Die biochemische Katalyse:Alle Enzyme stellen kompliziert gebaute Eiweißkörper ~ar.

Sie besitzen die Fähigkeit, die Geschwindigkeit chemischerReaktionen tausend- bis millionenfach zu beschleunigen, indemsie die Aktivierungsenergie herabsetzen, also den zum Raaktions­start notwendigen Energiebetrag so weit verringern, daß dieUmsetzung ablaufen kann, siehe auch Anlage 1.Für den menschlichen Organismus schätzt man die enzymatischkatalysierten Reaktionen auf über 10000. Da die Enzyme Substrat­spezifisch arbeiten, haben sie auch eine wichtige Steuerungs­funktion im intermediären Stoffwechsel. Diese steuerungsfunktionenwerden noch durch bestimmte He*mreaktionen unterstützt.Versuche zur Demonstration e n z yma t Lsche r- Reaktionen:1. Eiweißverdauung durch Pepsin2. Katalasereaktion in Hefe3. Explosionschemie der Bombardierkäfer, siehe auch Anl. 2.

~.

Der Eiweißcharakter der Enzyme:Er soll beispielhaft mit verschiedenen Nachweisreaktionen demon­striert werden:1. Nachweis der Peptidbindungen mit der Biuret-Probe2. '! der s-haltigen Aminosäuren3. XanthoproteinreaktionSiehe hierzu Anlage 31

Einteilung der Proteine:Systematische Einteilung seit 1964. Nachsilbe ist -ase.Zur Bezeichnung einer bestimmten Enzymgruppe, die z. B.hydrolisierende Eigenschaften besitzen werden als "Hydrolasen"bezeichnet.Hauptklassen sind:Hydrolasen ,z.B. LipaseOxidoreduktasen, z. B. Glucose OxidaseTransferasen, z. B. Glutamat-Oxalacet-TransaminaseLyasen, z. B. AldolaseIsomerasen, z. B. Phospohexose-Isomerase.Ligasen, z! B. Acetyl-CoA-Carboxylase

.Substratspezifität:Demonstration mit ausgesägtem(aus Holz) Schlüssel-Schloß ~lodell.

Aktives Zentrum des Enzym reagiert nur mit spezifischem Substrat •

. Enzymkinitik:Allgemein gilt Kinetik als Lehre der Reaktionsgeschwindigkeit.Enzyme erhöhen die Geschlvindigkeit einer Reaktion. Die Reaktions­geschwindigkeit ist das Maß für die Menge und Wirksamkeit einesEnzyms. Die Einheit ist Mikromol Substratumsatz pro Zeit.Erläuterung der Begriffe Substratsättigung, Michaeliskonstanteund aalbmaximale Geschwindigkeit.Versuch: irmittlung der MichaelisKonstanten bei der alkoholischen

Gärung. Eine Hefesuspension wird mit 3 verschiedenenMengen Glucose versetzt. Die entsteherlen CO

2-Gasmengen

werden aufgefangen~und notiert. Ebenso wird die Zeitin der sie entstanden sind notiert.Erläuterung"Lineweaver und Burk Auftragung" der Me s swe r-t ezur Ermittlung der MichaelisKonstanten.

Eine hohe MichaelisKonstante bedeutet eine geringe Affinität des

.....Chemie in der Schule: www.chids.de

Enzymes zum Substrat, denn eine hohe Substratsättigung ist nötig,um die "Halbsättigung"bzw. Halbmaximale Ge e c hw.Lrrdi.gke Lt; zu erhölten.

Volumenaktivität:

• d,

GPTL-A1anin + 2-0xoglutarat~yruvat + L-Glutamat

Enzymaktivitäten werden in internationalen Einheiten(Units)angegeben. Definitionsgemäß setzt 1 Unit (U) in l' ~Iinute 1 ~likro

mol Substrat unter definierten Bedingungen um. Man bezieht imallgemeinen auf das Volumen. Damit erhält man die Volumen­aktivität: U/l.

Photometrischer (optischeQ Test:Grundlagen sind das Lambert-Beersche Gesetz: E = c •sowie das Absorptionsverhalten von NAflH

2bzw. NAD.

In vielen enzymatischen Reaktionen wird \vasserstoff übertragen.Wasserstoffakzeptor ist NAß, das dabei zu NAOH

2reduziert wird.

NAD hat bei 3qO nm kein Absorptionsmaximum im ~egensatz zu NADH •Eine Konzentrationsänderung von NADH2 pro ~eiteinheit ist direktproportional der gemessenen Extinktion E. Uber den molarenExtinktionskoeffizienten von NADH2 können also Substratumsetzungen

pro Zeit photomerrisch gemessen werdenVersuch: zur praktischen Demonstration dieser Hesstechnik wurde

am registrierenden Zeissphotemeter die Glutamat­Pyruvat-Transaminase gemessen.Reaktionsschema

Pyruvat + NADH2LDH--....&>~ L-Lactat + NAD

Mit geeigneten Reagentien wird, an die eigentlicheEnzymreaktion die zweite Reaktion, bei der NADH2 ab­gebaut wird angeschlossen.Man nennt diese Reakt10ndann Indikatorreaktion, weil sie ja gemessen wird.Aus den stöchiometrischen Verhältnissen ergibt sichjedoch eine direkte Propoertionalität zur GPT-Aktivität.

In der klinischen Diagnostik ist eine Vergleichbarkeit derAnalysenergebnisse wichtig. Aus diesem Grund existieren "OptimierteStandardbedingungen nach dem Empfehlungen der Deutschen Gesell­schaft Cür Klinische Chemie(1972), Z. Klin. ehern. K1in. Biochem.

,--,,' 10,182-192."

Hinweis·: Zur einfacheren Darstellung des Protokolls wurde auf die~--Ableitung der Michaelis-Konstanten verzichtet. Zur Ableitung

si.ehe H. U. Bergmeyer, Me t h o d e n der enzymatischen Analyse t

Band 1', \ve inheim/Bergst r ••

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I JJJ.-tBEHRING INSTITUT

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Iestemar"-GPT [ALAT] optimiertCombipack 2 X 25 D]

I~I-Bestell-Nr . OSPE 10: Packung für 2 x 20 bzw . 2 x 25 Makro - oder 2 x 100Mikro-Bestimmungen

Handelsformenund Bestellnummern

MethodeOptimierter ' ) UV-Test mit Extinknonsabnahme zur Bestimmung der Glutamat-Pyruval ­Transaminase (GPT) nac h lo lqende m Reakl lon, sclll "na

Durchführung

Serum '"' 500 ,11 400 !II lGPT-Reagenz '21 ( + 25" Cl 2500 ..) 2000 ,11 IM;"Choo, 1 rn;, b;, 15 rni, be> 900," ' 25 eiern",,;. ,," -- -

Oxoglutarat 13 I 100 ,11 i 100 ,11' )_ _ _ ___-.1............... _

Sofort mischen , Lösung ggl. in Küvette umgießen. Extinktion Igenau ablesen und gleichzeitig Stoppunr U l u C ", C;I ( i. J W '~ 1 1 8I e I

Ablesungen in Abst änd en von gen au 1 min . I

I

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100 1'1500 111

Oxoglutarat ßI

Mischen. 1 min bis 15 min ber genau , 25 C temperieren II - ----------r----------i

20 ,11

Frauen : bis 19 U/I ( +- 25' C)

Männ er : bis 23 Uil ( I 25 C)

Sofort mischen , Lösung ggl. in tem perierte Kuvette umgie ßenNach ca . 1 rnin Extinktion gen au ablese n und ylelchzeitig Stopp ­uhr dr ücken"). 3 weitere Ablesungen in Abstanden von gen au1 rnin.

Bel d er Messung eine für Halbmikro-Küvetten geeignete Blendeverwende n.

Berechnung

Arbeitsanleitung für manuelle Makro- und Mikro-Best im mungen derGlutamat-Pyruvat-TransaminaseVerfahren mit Startreagenz')

Für die Regi str ierung mit einem Schr eiber sind ebenfalls Umr echnungs­tabellen von Winkelgrad u. in Enzyrnaktivi tät beigefugt.

Normalbereich im SerumS}

Die drei Extmktronsd ifterenzen aus den autemandertorcenden Meß-punkten bilden . daraus Mittelwert I. \E /mln) berechnen. -

Die Akti vität kann nach den folgend en F-orme ln ber echn et oder den folgen ­den Umrechnungstabellen entnommen werden (verdünnte Sera x 11):

2. Mikro-Bestimmung

I in eine temp erierte Halbmikro-Küv~te oder In ein geeignetesI Reag enzröhrchen pipettieren :

SerumGPT-Reagenz r2l (+25° C)

Meßbereich rns 1:33 U/I,\ E/mln 0 ,105 (Hg 365 nrn ),\ E/ min ... 0 ,195 (Hg 334 nm , 340 nm )

Bei höheren Aktivitäten 1 Teil Serum 'I HI J 0 T8118n rsoron l<ocrlsa1z -Lösun g(NaCI9 g/I) verdünnen und Test Wiederholen I Ergebnis x 11) ').

r= Wellenl äng e ----,--

LHg 365 nm TI U/I ( " ml.I/ rnl)

Hg 334 nm "\ E/min x 1823

___. ___ 340 nm L\ E/ min x 1003__ _~I._ _L\ E/~ ' ~ x _~~

-B

Makro-Ansatz

A

t -Lactat + NAD

Pyruvat ~ L-Glut amat.ser,~

Je nach vorhandenen Pipetten AnsatzA ode r B wählen . In eine Küvett e oderin ein Reagenzröhrchen pipettieren :

Makro-Bestimmung

L-Alamn I 2-0xoglutarat

Pyruval + NADH,

Küvette : 1 cm Sch ichtdicke

Wellenl änge : Hg 365 (bzw. 366) nm . Hg 334 nm oder 340 nm

Temperatur : + 25 C rTner rnostau

Probe: Serum. Heparin- oder EDT A-Pl asma.

Stabilit ät der GPT Im Serum ) .In der Literatur finden sich unterschied liche Angaben: ge­funden wurden z. B. nac h einer Woche Aktivitätsve rluste von5% be ii 4 bis +6 C und 15% bet +20 brs -t-25 C.

H ämolyse täuscht erhöhte Werte vor, da die GPT-Konzen­tration in Erythroz yten etwa ?fach höh er Ist als im Plasma").

ReagenzienJ) ,Puffer/Substrat

l.1JLösung in Flasche [~ unverdünnt verwenden. Haltbarkeit nach OHnender Flasche bei + 4 bis +- 6' C bis zum Verfalld atum der Packung .

GPT-Reagenz

12JInhalt einer Flasche l2i mit 50 ml Puffer/ Substrat aus Flasch e Wlösen .'- Lösung vor Gebrauch auf +25 C temp erieren . Haltb arkeit nach Auf­

löse n: 1 Tag bei + 15 bis + 25' C, 4 Tage bei + 4 bis +6' C.

Fr Oxoglutarat

[3 Inhalt in Flasche :31unverdünnt verwenden. Haltb arkeit nach Ottnen. ,der Flasche: 1 Woche bei + 15 bis +25° C, 6 Wochen bei +4 bis t- 6" C_

•••••••

Anmerkungen und Literatur

1 Eine Arberlsvorschnft fur vorge mrschles Reagenz (Serurnstartl enthalt das Ringbuch..Klinische Cherrue-Arbeitsanleitunqen" der Behringwerke AG.

2. Optimierte Testkonzentrationen nach den Empf ehlungen der Deutschen GesellschaftIur Klinische Chem ie (1972 ). Z. Khn Chem. Klm Bioehern 10. 182 - 192

Phosphat-Puffer. pH 7.4 80 mm oL·1L-Alanrn 800 rnmol/l2-0 xog lutaral 18 mrnol/ lNADH, 0.18 mmol. lLactat-Dehydrogenase (LOH) '" t .2 U/ml

3 MOSLEY . J . M. & GOODWIN. R F.11965). Amer J CI,n. Pathol. 44. 591

4 THOMAS. L 11978\. Labor und Diagnose. 1 Aufl. , S. 109. Die Medizirusche Verlaqs­gesellschafl Marburg.

S. Das tneoretrsche Prpeurervou.mer. ut.:lragt 0.08 rru. Der Ume rsclueu ":l . 0. ' 11: :.:..: \fE;:f

nachlassiebar (Abweichung rrn ErgebniSun ter 1% ).

6. Bel Analoqph olo metern Extmktion aul etwa O .~, e.nstetlen, bel DrgltalpllOlomelern >lcqt "-'Was ser oder Lull (E Ormessen

Be l hochaktiven Se ra Kann euren vo rzeitrqen NAOH -V.~ r !J r il u (. r r ",!i(' :-jen! 'l '-" ;r~: : " (1~ lt.:;

keine Aktivuai vo rqetauscht woruon VVenn das emqese tzre Serum I1 lc hH ln l:l ~ l q.:l l :.' [zeigen derarnqe Testansatze eitle qennue Ausqanpsexunknon Zur Kun l l () ~ : (': ~O ll !i"' d l( 'Analyse enen taus rnu verdunmem S 8JUI ~ 1 ' 'I.'\ .'l :. 'rl lol t wpr ,'~ ( ' "

8 NormalbereichSCHLEBUSCH. H et al. (1974I. tnscn. mu d. Wsch l 99, 7h5 - 756THEFELD . W. el al. ( 1974). lblo 99. :J"3 351

9. Richl igkeitskontrolle: Kontrollo u-:: l ,.'''' I F'Präzisionskontrolle: K. o ll t ro ll o~ I C fl -; Li l dlL! Se ruq uönl AU

Vor Kindern sichern ! ~3 t: r ,fIl HJ'''~ l';'" k(' AC "jj ;n :,ll! q V'i ( 'l ~ ( ' '<.: i " .

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®Testomar ·GPT [ALAT]Combipack

Verfahren mit Startreagenz

Instructions with Starting Reagent

Mode operatolre avec reactlt declenchant

Istruzioni con starter

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( ) rrun I J E(A ) rrun JEIA ) m ir] l EU' ) nu n

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11 B EHR IN G I N STITU T

-!ijeh~

Hg 365 nm

tan " x 182.3i--

Hg 334 nm

tan " x 100.3

optim.

340 nm

tan " x 98.4

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0.10010410811 2116

0 .120124128132136

0.140144148152156

0.160164168172176

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579

11131516182022242629333640444751555862666973778084889195::Jo

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