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29.04.11
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Title JUSTUS-LIEBIG
UNIVERSITY GIESSEN
MEDICAL FACULTY
HLA – System, klinische Bedeutung
Gregor Bein Zentrum für Transfusionsmedizin und Hämotherapie
Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH
Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin Justus-Liebig-Universität Gießen
HLA-System - Klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
(Krankheitsassoziationen)
HLA-System und klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
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Antigen + APC T +
Aktivierung, Proliferation
Anergie, Suppression
Ignoranz
Adaptive Immunantworten
Struktur HLA-Klasse I Molekül
Struktur HLA-Klasse II Molekül
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Peptid-Präsentation durch HLA-Moleküle
HLA – Moleküle präsentieren Peptidantigene
Antigen-Prozessierung und Präsentation MHC-Klasse II: Exogene Peptide
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Antigen-Prozessierung und Präsentation MHC-Klasse I: Endogene Peptide
Erkennung von Peptidantigenen durch den T-Zell-Rezeptor
Peptide binden über Anker-Aminosäuren an HLA-Moleküle
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Peptide binden über Anker-Aminosäuren an HLA-Moleküle
HLA – Moleküle: polymorphe AS-Positionen
Zusammenfassung: Antigenpräsentation
HLA-Klasse II – Moleküle – Exogene Peptide: Aufnahme von Antigenen zur
Initiierung einer adaptiven Immunantwort – Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen – Präsentation an CD4+ T-Zellen (T Helfer Zellen)
HLA-Klasse I – Moleküle – Endogene Peptide: Anzeige intrazellulärer Infektion – Expression auf fast allen kernhaltigen Zellen
(nicht auf Erythrozyten) – Präsentation an CD8+ T-Zellen (zytotoxische T Zellen)
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Shiina T Tissue Antigens 64:631 (2004)
Polymorphismus und Polygenie tragen zur Diversität der HLA-Moleküle eines Individuums bei
Haplotyp
HLA-Allele: Kodominante Expression
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HLA- A * 24: 02: 01: 02 L
Genort Breite Spezifität
(„Antigen“) Exonvariante
(stumm) Suffix*
Molekularbiologische Typisierung
Allel (Proteinvariante)
Intronvariante (stumm)
*Suffix: N Null allele L Low expression S Secreted, not on cell surface Q Questionable expression
- Doppelpunkt als Trennzeichen - Führende Nullen - Bis zu drei Stellen (e.g. A*02:101) - „w“ wir vom HLA-C-Genort entfernt: e.g. C*01:03
HLA-Nomenklatur 2010 (hla.alleles.org)
HLA alleles that encode for identical peptide binding domains (P groups) (exon 2 and 3 for HLA class I and exon 2 for HLA class II A*01:01P A*01:01:01:01/A*01:01:02/A*01:01:03/A*01:01:04/A*01:01:05/
A*01:01:06/A*01:01:07/A*01:01:08/A*01:01:09/A*01:01:10/A*01:01:11/A*01:01:12/A*01:01:13/A*01:01:14/A*01:32/A*01:37/A*01:45
HLA-Nomenklatur: P - Gruppen
HLA alleles that share identical nucleotide sequences for the exons encoding the peptide binding domains (G groups) (exon 2 and 3 for HLA class I and exon 2 for HLA class II
A*01:01:01G 01:01:01:01/01:01:01:02N/01:04N/01:22N/01:32/01:34N/01:37/01:45
HLA-Nomenklatur: G - Gruppen
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Bekannte Allele an den Genorten HLA-A, B, C, DRB1
Antigenic variants e.g. HLA-A2 (2 digit resolution)
Allelic variants* e.g. HLA-A*0201 (Proteins)
HLA-A 28 1176
HLA-B 60 1641
HLA-C 10 808
HLA-DRB1 21 774
* www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ Release 3.4.0, 08 April 2011
Aber, - die Zahl der häufigen Allele (f > 1%) in einer gegebenen Population ist deutlich niedriger - Allele sind nicht zufällig miteinander kombiniert: konservierte Haplotypen e.g. HLA-A1, B8, DR3
HLA-System und klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
Serologischer Nachweis von HLA-Antigenen und Antikörpern Mikro-Zytotoxizitätstest nach Terasaki
(Lymphozytotoxizitäts-Test, LCT-Test) – Isolierung von Lymphozyten
(Dichtegradientenzentrifugation, Beads) – Inkubation mit Antiseren (n ≥ 120 für Klasse I) – Inkubation mit Kaninchen-Komplement – Anfärbung der lysierten Zellen und Fixierung
ELISA Luminex
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HLA-Typisierung: Isolierung von PBMC durch Dichtegradienten-Zentrifugation
HLA-Typisierung: Mikrozytotoxizitätstest (Terasaki)
HLA-Typisierung: Mikrozytotoxizitätstest (Terasaki)
Negatives Testergebnis intakte Zellen
Positives Testergebnis lysierte Zellen
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No association of kidney graft loss with human leukocyte antigen antibodies detected exclusively by sensitive luminex single-antigen testing: a collaborative transplant study report.
Süsal C et al., Transplantation (2011)
HLA-Typisierung Molekulargenetische Typisierung von HLA-Allelen
Molekulargenetische Verfahren
– PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotides)
– PCR-SSP (Sequence Specific Primers)
– Sequenzierung (Sequencing Based Typing, SBT)
HLA-Polymorphismus
HLA-X*01 ... ACGTGGTCATAATGCTTCCAGACA ... HLA-X*02 ... ----C------------------- ... HLA-X*03 ... -------A---------------- ... HLA-X*04 ... -----------------TT----- ... HLA-X*05 ... ----C--A---------------- ... HLA-X*06 ... ----C------------TT----- ... HLA-X*07 ... -------A---------TT----- ... HLA-X*08 ... ----C--A---------TT----- ... HLA-X*09 ... ------------------T----- ... - Hypervariable Regionen (HVR) - Public epitopes (fast keine allelspezifischen SNPs) - Genduplikation und –konversion (Gen?) - Polymorphismus in cis oder trans (Chromosom?)
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Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?
HLA-X*01 ... ----A------.------T------ ... HLA-X*02 ... ----C------.------T------ ... HLA-X*03 ... ----A------.------G------ ... HLA-X*04 ... ----C------.------G------ ... Patient C.T. HLA-X*01 ... ----A------.------T------ ... HLA-X*04 ... ----C------.------G------ ... Patient T.C. HLA-X*02 ... ----C------.------T------ ... HLA-X*03 ... ----A------.------G------ ...
SSO, SBT
Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?
Wie lösen wir das cis/trans – Problem? – Familienuntersuchung (Segregation der Haplotypen) – Klonierung von PCR – Produkten – Klonierung von Chromosomen (Hybridoma-Technologie) – Trennung der Allele durch allelspezifische Sonden und
immunomagnetische Beads – Sequence Specific Priming (PCR-SSP)*
* Bein 1992, Olerup 1992
HLA-Typisierung: PCR – SSP, Prinzip I
Extension <--ATCACGTTGGACCGTAAGT-5´ ||||||||||||||||||| ===CAGTGCAACCTGGCATTCA===========TAGTGCAACCTGGCATTCA=== ===GTCACGTTGGACCGTAAGT===========ATCACGTTGGACCGTAAGT=== ||||||||||||||||||| 5´-CAGTGCAACCTGGCATTCA--> Extension
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HLA-Typisierung: PCR – SSP, Prinzip I
Extension <--ATCACGTTGGACCGTAAGT-5´ ||||||||||||||||||| ===CAGTGCAACCTGGCATTCC===========TAGTGCAACCTGGCATTCA=== ===GTCACGTTGGACCGTAAGG===========ATCACGTTGGACCGTAAGT=== ||||||||||||||||||X 5´-CAGTGCAACCTGGCATTCA--> STOP
Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?
Patient C.T. HLA-X*01 ... ----A------.------T------ ... HLA-X*04 ... ----C------.------G------ ... Patient T.C. HLA-X*02 ... ----C------.------T------ ... HLA-X*03 ... ----A------.------G------ ...
Sequence-Specific Priming
PCR 1 +
PCR 4 +
PCR 2 - PCR 3 -
PCR 1 -
PCR 4 +
PCR 2 + PCR 3 +
HLA-Typisierung: PCR – SSP Agarose-Gelelektrophorese von PCR – Produkten
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HLA-Typisierung: PCR – SSP Ethidiumbromid gefärbtes Gel, UV – Licht (254 nm)
HLA-Typisierung: PCR – SSP direkte Sequenzierung
C C G A T A C T C
G A T A C T G A T A
T+
Kontrolle HLA-Gen X
T+ C+ C+
Homozygot T Heterozygot Homozygot C
HLA-System und klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen
(Gewebetypisierung) 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
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Erkennung von Peptidantigenen durch den T-Zell-Rezeptor
Direkte Aktivierung von T-Zellen durch allogene Antigen-präsentierende Zellen
Hyperakute Abstoßung
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Akute Abstoßung
Chronische Abstoßung
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HLA-System und Organtransplantation
Das wichtigste Transplantationsantigen?
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Aufgaben der klinischen Immunologie in der Organtransplantation
Empfänger: – ABO-Blutgruppe (2x) – Erythrozytäre Antikörper (passenger lymphocyte syndrome) – HLA-Typisierung (HLA-A, B, DRB1) – HLA-Antikörpersuche- und Identifizierung (alle 3 Monate)
Achtung! Antikörper lebenslang berücksichtigen – Infektionsstatus – Cross match vor Transplantation
Spender: – ABO-Blutgruppe (2x) – Erythrozytäre Antikörper (passenger lymphocyte syndrome) – HLA-Typisierung (HLA-A, B, DRB1) – Infektionsstatus
HLA-System und klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen
(Gewebetypisierung) 3. Klinische Bedeutung in der
Thrombozytentransfusion 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
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Allogene Stammzelltransplantation
Transplantatabstoßung Graft-versus-host-disease (GVHD) Graft-versus-leukemia effect (GVL)
Rezidivrate nach syngener und allogener Transplantation hämatopoetischer Stammzellen
Appelbaum FR, Nature (2001)
Probleme klinischer Studien – Fallzahlen gering – Verschiedene Krankheitsbilder mit unterschiedlichen
immunologischen Komplikationen – Infolge des hohen Kopplungsungleichgewichts in der
HLA-Region ist die isolierte Untersuchung eines Genortes kaum möglich. Bsp.: DRB1, DQB1
– Ein „Allel-mismatch“ kann in verschiedenen Populationen völlig unterschiedliche Bedeutung haben
Klinische Bedeutung der HLA-Kompatibilität in der allogenen Stammzelltransplantation
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A*0201-0205 Kaukasier
A*0201-0206 Japaner
www.HistoCheck.de
Allel-mismatch in verschiedenen Populationen
High-resolution donor-recipient HLA matching contributes to the success of unrelated donor marrow transplantation
Lee SJ et al., Blood 110:4576 (2007)
Single allele or antigen mismatches at HLA-A, -B, -C, and -DRB1
Lee SJ et al., Blood 110:4576 (2007)
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Survival of patients with early disease depending on degree of HLA matching (8/8, 7/8, and 6/8) for HLA-A, -B, -C, and -DRB1
Lee SJ et al., Blood 110:4576 (2007)
Mortalität in Abhängigkeit eines einzelnen HLA-mismatch (adjustiert für Alter und ethnische Herkunft, n = 4796)
Petersdorf EW et al., Tissue Antigens 69 suppl 1:25 (2007)
National Marrow Donor Program HLA Matching Guidelines for Unrelated Adult Donor Hematopoietic Cell Transplants
Bray RA et al., Biol Blood Marrow Transplant 14(9 Suppl):45 (2008)
Genort Suchstrategie Matching Auflösung A ja empfohlen hoch
B ja empfohlen hoch
C ja empfohlen hoch
DRA nein nein
DBR1 ja empfohlen hoch
DRB3, DRB4, DRB5 ja nicht bekannt
DQA1 nein nein
DQB1 ja unklar
DPA1 nein nein
DPB1 nein unklar
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Suche nach HLA-identischen Fremdspendern
Zentrales Knochenmarkspender Register Deutschlands, www.zkrd.de
Wenn kein passender Spender gefunden wird?
HLA-A, -B, -C and -DRB1 sind gleich zu werten
Ein Allel-mismatch ist besser als ein Antigen-mismatch
Die Allel-mismatches sollten minimiert werden