H HLA 24/7 K A1 & CE G V 8 - s3.amazonaws.comHolotype+HLA+24-7… · HOLOTYPE HLATM 24/7...

HOLOTYPEHLATM

24/7KONFIGURATIONA1&CE

GEBRAUCHSANWEISUNG

VERSION805.08.2016

ZurAnwendunginderInvitro-Diagnostik

VorbereitungderDNAzurSequenzanalysemittelsIlluminaMiSeq

0086

OmixonHolotypeHLA-24/7KonfigurationA1&CEAnleitungzurBenutzungvonV8.ZurBenutzungvonInvitro-Diagnostik.Copyright©2015,OmixonBiocomputingLtd.Confidential&Proprietary Seite2│45

InhaltsverzeichnisHERSTELLERINFORMATIONEN.............................................................................................................................................7

SYMBOLSCHLÜSSEL.............................................................................................................................................................7

INHALTDESHOLOTYPEHLA-24/7KONFIGURATIONA1&CEKITS........................................................................................8PRIMERCOMPONENTBOX(PRIMERKOMPONENTENBOX).....................................................................................................................................................8LIBRARYPREPARATIONREAGENTSCOMPONENTBOX.............................................................................................................................................................896- WELLADAPTERPLATTE................................................................................................................................................................................................8EXCELWORKBOOK....................................................................................................................................................................................................................9SOFTWARE–OMIXONHLATWIN..............................................................................................................................................................................................9

TRANSPORTUNDLAGERUNG..............................................................................................................................................9

WARNHINWEISEUNDVORSICHTSMASSNAHMEN...............................................................................................................9

SICHERHEITSINFORMATIONEN..........................................................................................................................................10

LEISTUNGSPARAMETER.....................................................................................................................................................10

TECHNISCHEBETREUUNG..................................................................................................................................................10TELEFONISCHEBETREUUNG:.............................................................................................................................................10

EQUIPMENT,REAGENZIENUNDZUBEHÖR........................................................................................................................11TECHNISCHEUNDGERÄTEEMPFEHLUNG................................................................................................................................................................................11ZUGEHÖRIGEREAGENZEMPFEHLUNGEN................................................................................................................................................................................11

MISEQREAGENTKITKAPAZITÄT.......................................................................................................................................11EMPFOHLENESZUBEHÖR........................................................................................................................................................................................................11

IMPRESSUM......................................................................................................................................................................12

VERWENDUNGSZWECK.....................................................................................................................................................12

WICHTIGEHINWEISEVORBEGINN.....................................................................................................................................13EMPFOHLENEGENOMISCHEDNAISOLIERUNG......................................................................................................................................................................13

PRINZIPDERMETHODE.....................................................................................................................................................13

ZUSAMMENFASSUNGDERSCHRITTE.................................................................................................................................15

GLOSSAR/DEFINITIONEN...................................................................................................................................................16

SCHRITT1–HLAAMPLIFIKATIONMASTERMIXVORBEREITUNG.......................................................................................17LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................17PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................17

MASTERMIX:HLA-DQB1SET1(OPTIONAL)ANDDQB1SET2(EMPFOHLEN)..................................................................18

SCHRITT2–HLAKLASSEIUNDIIAMPLIFIKATION.............................................................................................................19LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................19PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................19

ENZYMBELADENERMASTERMIX:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1UNDDQA1..........................................................................19ENZYMBELADENERMASTERMIX:HLA-DQB1SET1(OPTIONAL)UNDHLA-DQB1SET2(EMPFOHLEN)..........................19AMPLIFIKATIONDERKLASSEI(HLA-A,BUNDC)...............................................................................................................20AMPLIFIKATIONDERKLASSEII(HLA-DRB1,DQB1SET1,DQB1SET2,DPB1UNDDQA1)................................................20GESCHÄTZTEAMPLIFIKATSGRÖSSEN.................................................................................................................................20

SCHRITT3-AMPLIFIKATSBEWERTUNGUND-NORMALISIERUNG(MITTELSPLATTEN-FLUOROMETER)...............................22LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................22PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................22

EXOSAP-ITPCR-REINIGUNG...............................................................................................................................................24

SCHRITT4–LIBRARYVORBEREITUNG................................................................................................................................25LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................25PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................25


FRAGMENTATIONMASTERMIX........................................................................................................................................25FRAGMENTIERUNGSPROGRAMM.....................................................................................................................................26ENDREPAIRMASTERMIX..................................................................................................................................................27ENDREPAIRPROGRAMM..................................................................................................................................................27LIGATIONMASTERMIX......................................................................................................................................................28LIGATIONSPROGRAMM.....................................................................................................................................................28

SCHRITT5–LIBRARY-GRÖSSENAUSWAHL.........................................................................................................................31LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................31PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................31

SCHRITT6–LIBRARYBEWERTUNG.....................................................................................................................................32LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................32PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................32

QPCRPRIMERMIX.............................................................................................................................................................32QPCRMASTERMIX............................................................................................................................................................33

SCHRITT7–SEQUENZIERUNGAMILLUMINAMISEQ..........................................................................................................34LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................34

MISEQREAGENTKITKAPAZITÄT.......................................................................................................................................34PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................34

SCHRITT8–ANALYSEDERHLASEQUENZDATEN................................................................................................................36AUTOMATISCHESPROTOKOLL................................................................................................................................................................................................36

ITSETUPUNDKONFIGURATION........................................................................................................................................36PROTOKOLLPERANALYSE.................................................................................................................................................36

MANUELLESSERVERPROTOKOLL............................................................................................................................................................................................36ITSETUPUNDKONFIGURATION........................................................................................................................................36PROTOKOLLPERANALYSE.................................................................................................................................................36

MANUELLESDESKTOPPROTOKOLL.........................................................................................................................................................................................36ITSETUPUNDKONFIGURATION........................................................................................................................................36PROTOKOLLPERANALYSE.................................................................................................................................................37

ERGÄNZENDEABBILDUNGEN............................................................................................................................................38PLATTENBEISPIELEFÜREINEAMPLIFIKATE-PLATTE,AMPLIFIKATIONSPLATTE,VERDÜNNUNGSPLATTE,AMPLIFIKATE-BEWERTUNGSPLATTE(FÜREINENINDIVIDUELLENORT)&REAKTIONSPLATTE............................................................................................................................................................................38BEISPIELEINERSTANDARD-BERWERTUNGSPLATTE................................................................................................................................................................39QPCR-PLATTENBEISPIEL...........................................................................................................................................................................................................39

ANHANG1:PIPPINPREP....................................................................................................................................................40PROGRAMMIERUNGVONPIPPINPREP...................................................................................................................................................................................40LAUFDERPIPPINPREP............................................................................................................................................................................................................40

ANHANG2:PROBENBLATT................................................................................................................................................43

ANHANG 3:AMPLIFIKATBEWERTUNGMITTELSEINESQPCR-GERÄTS............................................................................44LISTEDERREAGENZIEN............................................................................................................................................................................................................44PROTOKOLL..............................................................................................................................................................................................................................44


Dokumentenhistorie–WichtigeAnmerkungenundUpdates

Version Datum Autor SummederÄnderungen Autorisiertvon

V1 5/12/2015 RobertPollock Entwurfderersten

VersionGergelyTölgyesi

V2 18/01/2016 RobertPollock ZweiterEntwurf,geringfügigeKorrekturen

GergelyTölgyesi

V3 10/02/2016 RobertPollock DritterEntwurf,aktualisierteSymbolerklärung,aktualisierteGefrier/Tau-Zyklusempfehlungen,aktualisierte zweckmäßigeAnwendung

GergelyTölgyesi

V4 26/02/2016 RobertPollock Vierter Entwurf,Aktualisierung desAbschnitts"Sicherheitsinformationen"

GergelyTolgyesi

V5 05/04/2016 RobertPollock Fünfte Version,alternativeEmpfehlungzurAmplifikatsbewertung

EfiMelista

V6 05/05/2016 FruzsinaFelegyhazi

SechsteVersion,KleinwörtlichWeschselaufQiagenProtokolhin

EfiMelista

V7 05/06/2016 FruzsinaFelegyhazi

SiebenteVersion,DQB1Set1&Set2Aktualisierung

EfiMelista

V8 05/08/2016 FruzsinaFélegyházi

Achte–AchtualisierungvondemLibraryReagenzienvorbereitungKomponentenBox

EfiMelista


Haftungsausschluss

Omixon hat nach größtem Bemühen dafür gesorgt, dass diese Gebrauchsanweisung (IFU)korrekt ist. Omixon haftet nicht für jegliche Ungenauigkeit oder Versäumnisse, die eventuellvorkommen können. Informationen in dieser IFU können ohneMitteilung geändert werden.Omixon übernimmt keine Verantwortung für jegliche Ungenauigkeit, die in dieserGebrauchsanweisung(IFU)enthaltenseinkönnen.

OmixonbehältsichzujederZeitdasRechtvor,dieseIFUund/oderdieProdukte,dieindieserIFUbeschriebensindohneweitereMitteilungenzuverbessern.

Wenn Sie fehlerhafte, irreführende oder unvollständige Informationen in dieserGebrauchsanweisung finden,begrüßenwir IhreAnmerkungenundVorschläge.Bitte [email protected].


HerstellerinformationenFirmenname:OmixonBiocomputingLtd

Standortadresse:Fehérváriút50-52/6

Stadt:Budapest

PostleitzahlH-1117

Land:Ungarn

Symbolschlüssel


InhaltdesHolotypeHLA-24/7KonfigurationA1&CEKits

PrimerComponentBox(PrimerKomponentenBox)Die Primerkomponenten ermöglichen spezifische ready-to-use Lösungen zur gezieltenLongRange PCR Amplifikation der HLA Gene A, B, DPB1, DQA1, DQB1 und DRB1. ZudembeinhaltetsiezweiTypenvonPrimer-Additiven(Enhancer1undEnhancer2)

PrimerMix REF# Rxns Menge/Gefäß #Gefäße

FarbenkodeHLA-A P013 24 60μL 1 Gelb

HLA-B P023 24 60μL 1 RotHLA-C P033 24 60μL 1 OrangeHLA-DRB1 P043 24 60μL 1 GrünHLA-DQB1(Set1) P053 24 60μL 1 BlauHLA-DQB1(Set2) P063 24 60μL 1 Schwar

zHLA-DQA1 P073 24 60μL 1 BraunHLA-DPB1 P083 24 60μL 1 LilaEnhancer1 E01 24 1100μL 1 Transp

arentEnhancer2 E02 24 300μL 1 Transparent

LibraryPreparationReagentsComponentBox(LibraryReagenzienvorbereitungKomponentenBox)

Die Library Preparation Component Box beinhaltet Reagenzien zur Vorbereitung der Library(Fragmentierung,Blunt-endundPolyadenylierungderEndendesAmplifikatsunddie LigationderindiziertenAdaptersequenzdaran)desHLAAmplifikats.

Reagenz REF# Rxns Menge/Gefäß #Gefäße

FarbenkodeFragmentierungsenzym

(A)R12 24 70μL 1 Gelb

Fragmentierungspuffer(B) R22 24 70μL 1 RotEndRepair-Enzym(C) R32 24 41μL 1 GrünEndRepair-Puffer(D) R42 24 82μL 1 OrangeLigationsenzym(E) R52 24 81μL 1 BlauLigationspuffer(F) R62 24 900μL 2 Schwar

z

96- WellAdapterPlatteDie 96-Well indizierte Adapterplatte beinhaltet ready-to-use induzierte NGS-Adapter(doppelsträngigeDNAOligonukleotide)ineiner5μLLösungzurGenerierungindividuellerNGSLibraries. Die 96-Well indizierte Adapterplatte beinhaltet eine ausreichende Menge anindizierten Adaptern für die Generierung von 24 individuelle NGS-Libraries und für dieIdentifizierungvonDownstream-Proben


Reagenz REF# Rxns Menge/Gefäß #

Platte

AdapterplatteA1(i1-24) N4 24 5μL 1

ExcelWorkbookDas Excel Workbook wurde mitgeliefert, um das Protokoll des Holotype HLA 24/7 mitKalkulationen, Plattenanordnungen, Bestandsführung, Erstellung eines MiSeq-Probenblattesund vieles mehr, zu unterstützen. Wenn Sie keine Kopie besitzen, kontaktieren Sie [email protected]

Software–[email protected]üreinOmixonHLADoppelguthabenverbundenmitihremErwerbdesHolotypeHLA24/7Kits.

WichtigerHinweis:BenutzenSiealledreiOmixonHolotypeHLA24/7KitKomponentenunddieOmixonHLATwinSoftwareindemgleichenArbeitsablauf,umeinenArbeitsablaufesfürdieInvitro-Diagnostikzukonstituieren!BittebeachtensiedenAbschnittWarnhinweiseundVorsichtsmaßnahmenfürdieAnwendungsbeschränkungendesProdukts.

AustauschkomponentesindnachspeziellerAnfrageerhältlich.BittebeachtenSie,dassOmixonnur denAustausch von "Komponent Boxen" ermöglicht, nicht von einzelnen Fläschchen. [email protected]ürweitereInformationen.

TransportundLagerungTransport auf Trockeneis-Packungen in Styropor-Transportboxen, kannnachAnkunft bei -20°gelagertwerden.BittevalidierenSie ihreTemperaturkontrolleunddenÜberwachungsprozessihresGefriergerätsundhaltenSieihnkonstant.Ungeöffnete Kits sind bis zum Ablaufdatum des Kits haltbar (siehe Kit-Aufschrift) bei einerLagerungbei-20°C.

NachÖffnendesProdukteswirddieProduktstabilität fürmaximal vier (4)Gefrier/Tau-Zyklengewährleistet. Die Kits sind nach demÖffnen, bei einer Lagerung bei -20°, bis zu 3Monatehaltbar.

WarnhinweiseundVorsichtsmaßnahmenProduktbenutzungseinschränkungen

Für beste Leistungen benutzen Sie bitte die Arbeitsanweisungen desHolotypeHLA 24/7 KitsunddieOmixonHLATwinSoftware fürdieHLA-TypisierungmittelsNGSmitdenMaterialien,ReagenzienunddemEquipmentempfohlenimAbschnitt"EquipmentundReagenzien".DieBenutzungandererMaterialienalsimAbschnitt"EquipmentundReagenzien"beschrieben,müssenumfassendvomBenutzerüberprüftundvalidiertwerden!

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BittestellenSiedieReagenziennichterneutheroderverdünnenSiesienichtandersalsinderIFUbeschrieben.BittebenutzenSienichtwenigerMengenanReagenzalsinderIFUaufgeführt.DieseHandlungenkönnenzuLeistungsfehlernführen!Omixon kann keine Unterstützung bei jeglichem Problem bieten, die aus Tätigkeitenresultieren,dievondenProtokollschritteninderIFUabweichen.Bitte benutzen Sie das Produkt nicht im Falle von nachweisbaren Schäden der Komponente(gebrocheneGefäße,Platten,lockereVerschlüsse)!

SicherheitsinformationenLesen Sie den Abschnitt "Sicherheitsinformationen" und "Wichtige Hinweise" von jedemReagenz oder Kit, geschildert imAbschnitt "Equipment, Reagenzien und Lieferung", vor demBeginngründlichdurch.Wenn Sie mit Chemikalien arbeiten, tragen Sie bitte immer einen geeigneten Laborkittel,Einweghandschuhe und eine Schutzbrille. Für weitere Informationen ziehen Sie bitte dieentsprechenden Sicherheitsdatenblätter (SDSs) des jeweiligen Materials hinzu, erhältlich beidemProduktherstellerEinÜberblicküberdiechemischenZusammensetzungenderProdukt-ReagenzienfindenSie indenSDSsdesHolotypeHLA24/7KitsundsindnachAnfrageerhältlich.ProduktkomponentesollenalsgenerellmedizischerAbfallentsorgtwerden.

LeistungsparameterGängigeHaupt-LeistungsparametergemäßderProduktvalidierung.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensitivity 99.054% 99.171% 98.335% 96.310% 98.818% 98.927% 95.724%

Specificity 99.966% 99.982% 99.956% 99.863% 99.946% 99.881% 99.775%

Precision 99.054% 99.171% 98.335% 96.310% 98.818% 98.927% 95.724%

Accuracy 99.935% 99.965% 99.915% 99.736% 99.897% 99.785% 99.572%

Reproducibility 100.00% 100.00% 99.28% 100.00% 99.28% 100.00% 99.28%

Repeatability 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00%

TechnischeBetreuungZurgenerellenBetreuungdiesesProtokollskontaktierenSiebittesupport@omixon.com

TelefonischeBetreuung:

US|+1(617)500-0790Europa|+36705748001RestderWelt|+1(617)500-0790


Equipment,ReagenzienundZubehör

TechnischeundGeräteempfehlung§ ThermalCyclermit96-Well-Plattenformat§ Platten-Fluorometer(oderjedesandereGerätzumFluoreszenz-Nachweisim96-Well-

PlattenformatzurBenutzungmittelsPromegaQuantiFluordsDNASystem)§ PippinPrep(Cat#PIP0001)oderBluePippin(Cat#BLU0001)vonSAGEScience§ qPCR-Gerätmit96-Well-oder384-Well-Plattenformat§ IlluminaMiSeq(Cat#SY-410-1003)§ 64-bitComputermitmin.4Coresund16GBRAM§ LangfristigeDatenspeicherung(ca.2TBDatenproMiSeqproJahr)

ZugehörigeReagenzempfehlungen§ LongRangePCRKitsvonQiagen(Cat#206401,206402or206403)

§ JedeProbebenötigt4μLTaqPolymerase§ Cat#206401LongRangePCRkit(20)beinhaltet8μLTaqPolymerase§ Cat#206402LongRangePCRkit(100)beinhaltet40μLTaqPolymerase§ Cat#206403LongRangePCRkit(250)beinhaltet100μLTaqPolymerase

§ ExoSAP-ITvonAffymetrix(Cat#78200,78201,78202oder78205)§ JedeMischprobebenötigt4μLExoSAP-ITEnzym§ Cat#78200beinhaltet200μLExoSAP-ITEnzym§ Cat#78201beinhaltet1mLExoSAP-ITEnzym§ Cat#78202beinhaltet4mLExoSAP-ITEnzym§ Cat#78205beinhaltet10mLExoSAP-ITEnzym

§ LibraryQuantificationKit–Illumina/UniversalvonKAPABiosystems(Cat#KK4824)§ QuantiFluordsDNASystemvonPromega(Cat#E2670)§ AgencourtAMPureXPbeadsvonBeckmanCoulter(Cat#A63880,A63881,oderA63882)

§ JederHolotypeHLA-Laufbenötigtmaximal900μLAMpureXPbeads§ Cat#A63880beinhaltet5mLAMPureXPbeads§ Cat#A63881beinhaltet60mLAMPureXPbeads§ Cat#A63882450mLAMPureXPbeads

§ GelApparatur,1,5%Agarose,gefärbtnachinternemStandard(MarkerK/R2),fürPippinPrep/BluePippin(Cat#CDF1510fürPippinPrepundBDF1510fürBluePippin)

§ MolekulareingestuftesEthanol(AnhydrischerAlkohol)§ MolekulareingestuftesWasser(DNaseundRNasefrei)§ Natriumhydroxid§ 1XTEPuffer(pH8,0)§ MiSeqReagentKitvonIllumina

o MiSeqreagentkitvonIlluminav2(500-Zyklus)Cat#MS-102-2003o MiSeqreagentkitvonIlluminav2(500-Zyklus)Cat#MS-103-1003o MiSeqreagentkitvonIlluminav2(300-Zyklus)Cat#MS-102-2002o MiSeqreagentkitvonIlluminav2(300-Zyklus)Cat#MS-103-1002o MiSeqreagentkitvonIlluminav2(300-Zyklus)Cat#MS-103-1001


MiSeqReagentKitKapazität

IlluminaMiSeqReagentKit

ZeitStunden

24/7Proben

Std500Zyklus(MS-102-2003)

~39 24


~24 24

Micro300Zyklus(MS-103-1002)

~19 24

Nano500Zyklus(MS-103-1003)

~28 12


~17 6

EmpfohlenesZubehör§ 1,5mLMikrozentrifugenröhrchen§ 1,5mLlow-bindMikrozentrifugenröhrchen§ 2,0mLlow-bindMikrozentrifugenröhrchen(EppendorfDNALoBindCat#

022431048empfohlen)§ justierbarePipetten(1,0–1000μL)§ 8-Kanal-Pipetten,justierbar(2,0-500μL)§ 96-Well-PCR-PlattenpassendzumThermalCycler§ 96-Well-PCR-PlattenpassendzumPlatten-Fluorometer§ 96-Well-PCR-PlattenpassendzumqPCR-Gerät§ 96-WellDeep-WellPlatten(>1000μL)§ PlattenabdichtungzurgenerellenBenutzung§ PlattenabdichtungenkompatibelzumThermalCycler(getestetfürLongRange-PCR)§ OptischePlattenabdichtungenkompatibelzumqPCR-Gerät§ MagnetischerStänder(MagneticStand)kompatibelmit2mlMikrozentifugenröhrchen§ 96-wellCoolerRacks(2Stück)§ 50mLFalkonröhrchen§ 50mLReservoire


ImpressumDieHolotypeHLA24/7IFUundderenInhaltsindEigentumvonOmixonBiocomputingLimited("Omixon"), und sind ausschließlich für die vertragliche Benutzung dessen Käufer unterBeachtung der nachstehend beschriebenen Produkte vorgesehen und für keinen anderenZweck.DiesesDokumentunddessenInhaltdarf,ohnedasvorherigeschriftlicheEinverständnisvon Omixon, nicht für andere Zwecke benutzt oder verteilt und/oder übertagen, verbreitetoder reproduziert werden. Omixon überträgt mit diesem Dokument keine Patentlizenzen,Markenrechte, Copyright oderRechtedesRechtssystems, noch ähnlicheRechte einer drittenPartei.Omixon HLA Twin (“Software”) ist für den Käufer lizensiert unter den Bedingungen undKonditionenvonOmixonHLATwinEULA(www.omixon.com/hla-twin-eula/).WennSiemitdendarin stehenden Bedingungen und Konditionen nicht einverstanden sind, überträgt OmixonIhnenkeineSoftware-LizenzundSiedürfendieSoftwarewederbenutzennochinstallieren.Der Anleitung in diesemDokumentmuss von qualifiziertem und genau trainiertem Personalgenau und explizit gefolgt werden, um die sichere Benutzung des beschriebenen Produktessicherzustellen. Der gesamte Inhalt dieses Dokumentsmuss vor der Benutzung des Produktsvollständiggelesenundverstandenwerden.VERSÄUMNISSE BEIM VOLLSTÄNDIGEN LESEN UND EXPLIZITEM BEFOLGEN DER GESAMTENDARIN BEINAHLTENDEN INSTRUKTIONEN KANN ZU EINEM SCHADEN DES PRODUKTS,VERLETZUNG VON PERSONEN, DEM BENUTZER UND ANDEREN PERSONEN, UND ANDERENSCHÄDENFÜHREN.OMIXON ÜBERNIMMT KEINE VERANTWORTUNG RESULTIEREND AUS DER UNSACHGEMÄßENHANDHABUNG DER DARIN BESCHRIEBENEN PRODUKTE (ENTHALTENE BESTANDTEILE ODERSOFTWARE)ODERDERBENUTZUNGVONDIESENPRODUKTENAUßERHALBDESBEREICHESDERVERTRAGLICH GESCHRIEBENEN LIZENZ ODER GENEHMIGUNG, GEWÄHRLEISTET DURCHOMIXONINVERBINDUNGMITDEMKAUFDIESESPRODUKTES.ZURBENUTZUNGFÜRDIEINVITRODIAGNOSE©2015OmixonBiocomputingLtd.AlleRechtevorbehalten.

VerwendungszweckDasHolotypeHLA24/7–KonfigurationA1&CEProdukt (benanntals“HolotypeHLA) isteineKombination von in-vitro Diagnostik-Test-Reagenzien und einer Datenanalyse-Software(OmixonHLATwin™)undistzurIdentifizierungundDefinitiondesHumanLeukocyteAntigens(HLA)derKlasseIundKlasseIIundzurAnwendungderHLATypisierungunterAnwendungderIllumina® MiSeq Next Generation Sequencing Plattform gedacht. Das Holotype HLA bietethumane histokompatible Informationen des HLA Klasse I (A, B, und C) und Klasse II (DPB1,DQA1,DQB1undDRB1)unterVerwendunghumanergenomischerDNA.


DieOmixonHLATwin™Software,beinhaltetimHolotypeHLAProdukt,istdafürgedacht,dieimIllumina®MiSeqSystemgeneriertenDatenzuinterpretierenundzuvergleichen,umeinehoheGenauigkeit,Single-passAlleleLevelHLATypisierungmitsehrgeringerUngenauigkeitsratebeidem2fieldLevelzuerreichen.

Das Holotype HLA Produkt wurde für die In vitro-Diagnostik entwickelt, benutzt vonprofessionellem Personal im Gesundheitswesen, sowie Labortechnikern und Laborphysikern,trainiert in der HLA-Typisierung in Diagnostiklaboren, sowie EFI- oder ASHI-Akkordierte oderPersonendieinderLagesind,nachdenVorgabenderEFIoderASHIzuarbeiten.

WichtigeHinweisevorBeginn

EmpfohleneGenomischeDNAIsolierungHumanegenomischeDNA(gDNA)solltemitHilfevongutgetesteten,kommerziellerhältlichenDNAPräparationKits vorbereitetwerden,umeineKonstanzderPräparierung sicherzustellenUngeachtetdemAnsatz, ist eineakkurateBestimmungderKonzentrationenundReinheit füreinestabileProbenleistungerforderlich.

Die DNA muss frei sein von Kontaminationen, die die spätere Amplifikation, LibraryVorbereitungundSequenzierungsschritte(z.B.Alkohol,Salze,Detergenzien,FormaldehydeundHeparin) beeinflussen können. Das Blut sollte nicht in heparinisierten Gefäßen verwendetwerden und Blutproben von Patienten, die sich einer Heparintherapie unterziehen, undlipämischeoderhämolysischeProbensolltennichtverwendetwerden.

Präparierte genomische DNA kann sofort verwendet werden, wenn sie in Nuklease-freiemWasser oder über längere Zeit bei -20oC oder weniger in TE-Puffer gelagert wurde.WiederholtesGefrierenundTauensolltevermiedenwerden,umdieZersetzungzureduzieren.

EineKonzentrationvon20-30ng/µDNAwirdempfohlen,um100-150ngInputgenomischeDNAproPCR-Amplifikationzugewährleisten.

Absorptionsgradbei260nm/280nmund260nm/230nmvomWert1,7–2wirdsehrempfohlen.

PrinzipderMethodeÜbervieleJahrehatdieHLAGemeinschaftaneinerMethodegearbeitet,diedenumfassendenPolymorphismusdesHLA-GensunddessenGenproduktegenauidentifiziert.DieEinführungderPCRverbundenmitanderenTechnologien(Sangersequencing,SSOP,SSP,Luminex),stellteeineFormelzursignifikantenVerbesserungdesNachweisesdesHLA-Polymorphismusbereit,jedochmit etlichen Einschränkungen, die bis dahin führe, dass unsere Fähigkeit, eine umfassendeKarakterisierungdesHLA-Gensdurchzuführen,gehemmtwurde.DieTechnik,dieindenletztenJahrenentwickeltwurdeund zunehmendbenannt ist alsNextGeneration Sequencing (NGS),hatneueMöglichkeitenbereitgestellt,dieeinevollständigeKarakterisierungvonHLA-Geneninhaploider Form ermöglichen. NGS besitzt zwei individuelle Eigenschaften, 1) klonaleSequenzierung von DNA-Fragmenten und 2) gewaltig hoher Datendurchlauf. NGS bietet dieFähigkeit, den Polymorphismus aufeinander abzustimmen und dadurch die Beseitigung von


Zweideutigkeiten, und bietet HLA-Typisierung auf der drei-zu-vier Feldniveau ohnereflektierende Tests und dadurch die Einführung einer potenziellen Gesamtlösung des HLA-Typisierungsproblems. Das hier beschriebene Protokoll nutzt diese Technologie aus undkombiniertdieLongRangePCR-AmplifikationvonHLA-GenenmitderSequenzierungaufeinerIlluminaMiSeq-Plattform. Noch speziellerwerden die HLA-Gene A, B, C, DQA1 und DQB1 inihrer gesamtenKodierungslängeamplifiziert, Elementeder5’ und3’endUntranslatedRegioneingeschlossen,währenddessenDRB1vomIntron1biszumIntron4undDPB1vomIntron1biszur3’UntranslatedRegionamplifiziertwird.DieAmplifikatewerdendanndurcheineSerieanSchrittenbearbeitet:

1. Fragmentierung der Amplifikate auf eine Größe, geeignet zum Sequenzieren auf einerIlluminaPlattform,

2. Blunt-endundAdenylierungderEndenderfragmentiertenAmplifikate.

3. Binden der Adapter-Sequenzen, die durchgehend im Prozess im MiSeq zur Erfassung,AmplifizierungundSequenzierungderDNAbenutztwerden.DieAdapterbeinhaltenaucheinenIndexauseinemkurzemSequenzabschnitt,gleicheinemAdapter,derdenUrsprungderLibraryidentifiziert(Probe/Ort).

Nach der Vereinigung der indizierten Libraries, Größenselektion und Bewertung, werden dieProben imMiSeq sequenziert.Der gesamteProzessdauert 3-5 Tage, abhängig vonderWahlderFlowCellaufderIlluminaPlattformDieZusammenfassungderSchritteimProtokollwurdeindernachstehendenAbbildungdargestellt.


ZusammenfassungderSchritte


Glossar/Definitionen§ Amplifikate-Verdünnungsplatte–Eine96-WellDeep-WellPlattezurVerdünnungder

AmplifikatefürdieBewertung§ Amplifikate-Platte - Alternativer Name für die Amplifikationsplatte; im Fall von DQB1

wirdderInhaltvonbeidenAmplifikationsplatten(Set1undSet2)kombiniert.§ Amplifikate-Bewertungsplatte-96-Well-PlattekompatibelzumPlatten-Fluorometer,wo

dieverdünntenAmplifikatebewertetwerden.§ Amplifikationsplatte–96-WellPCR-PlattezurAmplifizierungderHLA-Orte.§ End-Library–Library,diealleProbenLibrariesbeinhaltet,fertigzurSequenzierungin

einemeinzelnenMiSeq-Lauf.§ Reaktionsplatte–Platte,wodieSequenzreaktion,wieFragmentierung,EndRepair,

LigationdesIndex-AdapterszudenProben-Librariesdurchgeführtwird.§ Reagenzplatte–PlattezumAliquotierenderverschiedenenReagenzien,umdieLibraries

vorzubereiten.§ Proben-Library–LibraryvorbereitetdurchKombination(Pooling)allerHLA-Ortefüreine

vorgegebeneProbe.§ Proben-Libraries-Platte:PlattebeinhalteteineProben-Library(alleOrtekombiniert)proWell.§ Standards-Bewertungsplatte–96-Well-PlattekompatibelzumPlatten-Fluorometer,wo

DNAStandardsfürdieAmplifikate-Bewertungplaziertwerden.


Schritt1–HLAAmplifikationMasterMixVorbereitungDauer:~50Minuten

Der Zweck dieses Schrittes ist es, den Ort-spezifischen Master Mix, zur individuellenAmplifizierung jedes gezielten HLA-Ortes, vorzubereiten. Die amplifizierten Orte in diesemProtokollsindHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DQB1,HLA-DPB1undHLA-DQA1.FürHLADQB1sind2PrimerSetsbeigeliefert:Set1amplifiziertExons1-4undSet2amplifiziertExons2-5.Set2istnötigundausreichendzurErlangungakkuraterErgebnissederGentypisierung,sowiederenAmplifikatevomIntron1biszur3’UTR.Set1,welchesvonder5’UTRbiszumIntron4amplifiziert, hat eine Amplifikationsfehlerrate höher als empfohlen für eine verlässlicheklinischeGenotypisierung.DasHLA-DQB1Set1istfakultativzurVerwendunginApplikationen,woderkompletteUmfangdesDQB1Gensnichtnötigist.

Notiz:Die vorbereitetenMasterMix indiesemSchrittbeinhaltenalleReagenzien,die fürdieAmplifikationbenötigtwerden,mitAusnahmedesTaqPolymerase.

ListederReagenzien

Artikel Lagerung

GeliefertdurchHLA-APrimerMix -20°C Omixon

HLA-BPrimerMix -20°C OmixonHLA-CPrimerMix -20°C OmixonHLA-DRB1PrimerMix -20°C OmixonHLA-DQB1(Set1)PrimerMix(Optional) -20°C OmixonHLA-DQB1(Set2)PrimerMix(Empfohlen) -20°C OmixonHLA-DPB1PrimerMix -20°C OmixonHLA-DQA1PrimerMix -20°C OmixonDQBEnhancer1 -20°C OmixonDQBEnhancer2 -20°C OmixonLongRangePCRPuffer(10×) -20°C QiagendNTPs(10mMjeweils) -20°C QiagenH2O(bidest.) -20°C Qiagen

Protokoll

1.1. -EntnehmenSieallePrimer-Mix,DQBEnhancer1und2,diedNTPsunddenLongRangePCRPuffer(10×),ausderLagerung,AuftauenbeiRaumtemperatur.

1.2. -VorbereitungderkombiniertenDQBEnhancer:gebenSie132μLDQBEnhancer2 in

das DQB Enhancer 1-Gefäß. Umbeschriften Sie das DQB Enhancer 1-Gefäßes inkombinierterDQBEnhancer.

1.3. - Bereiten Sie einenMasterMix vor für jedenPrimerMix anhandder nachstehenden

Tabelle:


MasterMix:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1undDQA1

Reagenz Volumen/Probe/locus Volumen/24Proben/locusPrimerMix 2μL 51μLLongRangePCRPuffer(10×) 2,5μL 63,8μLdNTPMix(10mMjeweils) 1,25μL 31,9μLH2O(bidest.) 13,85μL 353,2μLGesamtvolumen 19,6μL 499,9μL

MasterMix:HLA-DQB1Set1(Optional)andDQB1Set2(Empfohlen)

Reagenz Volumen/Probe/locus Volumen/24Proben/locusPrimerMix 2μL 51μLLongRangePCRPuffer(10×) 2,5μL 63,8μLdNTPMix(10mMjeweils) 1,25μL 31,9μLKombinierterDQBEnhancer 5,6μL 142,8μLH2O(bidest.) 7,85μL 200,2μLGesamtvolumen 19,2μL 489,7μL

1.4. –jedenMasterMixvortexenundfür1Sekunderunterzentrifugieren.MasterMixaufEis

plazieren.

1.5. -allegDNAsaufeineKonzentrationzwischen20-30ng/μL(minimumVolumenist45μL)verdünnen.

Notiz:HolotypeHLAbeinhaltetgenügendReagenzienfür24ReaktionenpluseinezusätzlicheMengezumPipettierenverlorenerundmisslungenerAmplifikationen.


Schritt2–HLAKlasseIundIIAmplifikationDauer:~7Stunden40MinutenDer Zweck von Schritt 2 ist die Amplifizierung der HLA-Orte. HLA Klasse I und Klasse IIAmplifikationen wurden unter Verwendung von zwei separaten Sets von PCR-Bedingungenoptimiert. Sind die PCR-Reaktionen vollständig, wird die Amplifikation mittels Agarose-Gelelektrophoreseverifiziert.

ListederReagenzien

Artikel Lagerung

GeliefertdurchHLA-AMasterMix -20°C Schritt1HLA-BMasterMix -20°C Schritt1HLA-CMasterMix -20°C Schritt1HLA-DRB1MasterMix -20°C Schritt1HLA-DQB1(Set1)MasterMix -20°C Schritt1HLA-DQB1(Set2)MasterMix -20°C Schritt1HLA-DPB1MasterMix -20°C Schritt1HLA-DQA1MasterMix -20°C Schritt1TaqPolymerase -20°C Qiagen

gDNA 4°C BenutzerH2O(bidest.) 20°C Benutzer

Protokoll2.1 –dasgelagerteTaqPolymeraserunterzentrifugierenundzumMasterMixgemäßdernachstehendenTabellezugebenunddurchgründlichesSpülenderPipettenmischen:

TaqPolymerasebeladenerMasterMix:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1undDQA1

Reagenz Volumen/Probe/locus Volumen/24Proben/locusMasterMixvonSchritt1 19,6μL 499,9μLTaqPolymerase 0,4μL 10,2μLGesamt 20μL 510,1μL

TaqPolymerasebeladenerMasterMix:HLA-DQB1Set1(optional)undHLA-DQB1Set2(Empfohlen)

Reagenz Volumen/Probe/locus Volumen/24Proben/locusMasterMixvonSchritt1 19,2μL 489,7μLTaqPolymerase 0,8μL 20,4μLGesamt 20μL 510,1μL

OmixonHolotypeHLA-24/7KonfigurationA1&CEAnleitungzurBenutzungvonV8.ZurBenutzungvonInvitro-Diagnostik.Copyright©2015,OmixonBiocomputingLtd.Confidential&Proprietary

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2.2 - kurz vortexen und runterzentrifugieren aller Taq Polymerase-beladener Master Mixe.Aliquotevon20μLvon jedemTaqPolymerase-beladenenMasterMix indie separatenWellsder96-WellPCRPlatten.

Notiz: Amplifikation der Klasse I und Klasse II wurde unter Verwendung zweiverschiedener PCR-Konditionenoptimiert, daher solltendieMasterMixeder Klasse IundKlasseIInichtindergleichenPlattesein.

2.3 –5μL von jeder verdünnten gDNA in das entsprechendeWell auf der Platte geben,wievorangegangenbeschrieben.MixendurchPipettieren.VersiegelnmittelsthermalenVerschlussund visuelle Überprüfung jedes Wells. Alle Amplifikationsplatten in der Zentrifugerunterzentrifugieren.

2.4 – Die Amplifikationsplatten in den Thermal Cycler plazieren und das Programm für dieKlasseI-undKlasseII-AmplifikationanhandderuntenstehendenTabellelaufenlassen:

AmplifikationderKlasseI(HLA-A,BundC)

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 95

°C3Minuten

35

95°C

15Sekunden65

°C30

Sekunden68°C

5Minuten1 68

°C10Minuten

1 4°C ∞

AmplifikationderKlasseII(HLA-DRB1,DQB1Set1,DQB1Set2,DPB1undDQA1)


°C3Minuten

35

93°C

15Sekunden60

°C30

Sekunden68°C

9Minuten1 68

°C10Minuten

1 4°C ∞

2.5 -VerifizierungdesAmplifikationserfolgsdurchLaufvon2μLjedesAmplifikatsineinemStandard2%AgaroseGelbei250Vfür30Minuten.

GeschätzteAmplifikatsgrößenHLAOrt Geschätzte

Amplifikatsgröße(kb)HLA-A,BundC ~3kbHLA-DRB1 ~4,3kb

HLA-DQB1(Set1) ~4,7kbHLA-DQB1(Set2) ~5,8kb

HLA-DPB1 ~4,5kbHLA-DQA1

~4,5kb


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SichereHaltestelle.Amplifikatekönnenbei4°CüberNachtoderbei-20°Cfürlängergelagertwerden.


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Schritt 3 - Amplifikatsbewertung und -normalisierung(mittelsPlatten-Fluorometer)Dauer:~1StundeDieAmplifikationsbewertungund-normalisierungwirdzurAbsicherungdesgenauenInputsimLibrary-Vorbereitungsschritt empfohlen. Amplifikatskonzentration wird mittels einesQuantiFluor dsDNASystems gemessen,was einen fluoreszierendenDNA-bindenden Farbstoffund einen DNA Standard beinhaltet, für eine sensitive Bewertung von kleinen Mengen vondoppelsträngiger DNA (dsDNA). Als Alternative kannman statt des Platten-Fluorometers dasqPCR-Gerät verwenden. Siehe Anhang 3 "Anweisungen zur Durchführung derAmplifikatsbewertungmittelsqPCR-Gerät"

ListederReagenzien

Artikel Lagerung GeliefertdurchKlasseI-Amplifikationplatte(n) 4°C Schritt2

KlasseII-Amplifikationplatte(n) 4°C Schritt2LambdaDNAStandard(100ng/μL) 4°C PromegaQuantiFluordsDNADye(200×) 4°C Promega20×TEPuffer(pH7.5) 4°C PromegaH2O(bidest.) 20°Cbis25

°CBenutzer

ExoSAP-iT -20°C Affymetrix

Protokoll3.1. VorbereitungvonDNA-Standardsdurch serielleVerdünnungvonLambdaDNAStandards

(100 ng/μL) mitgeliefert im QuantiFluor Kit anhand der nachstehendenVerdünnungstabelle:

LabelaufdemGefäß

InputDNA VolumenDNA(μL)

Volumen1xTE(μL)

EndKonz.(ng/μL)

Standard1 LambdaDNA 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLStandard2 Standard1 250μL 250μL 0,75ng/μLStandard3 Standard2 250μL 250μL 0,38ng/μLStandard4 Standard3 250μL 250μL 0,19ng/μLStandard5 Standard4 250μL 250μL 0,09ng/μLStandard6 Standard5 250μL 250μL 0,05ng/μLBlank Blank 0μL 250μL 0ng/μL

3.2. -VorbereitungeinerAmplifikate-Verdünnungsplatte für jedenOrt: in96-WellDeep-Well-PlattenAliquotevon498μ1×TEPufferund2μLdesentsprechendenAmplifikatsvonderAmplifikate-Platte in jedes Well geben. Spülen der Pipettenspitzen durch Pipettieren.VersiegelnderPlattenundgründlichvortexen.IneinerZentrifugerunterzentrifugieren.


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3.3. - Vorbereitung einer 1×QuantiFluor gefärbten Arbeitslösung nach der nachstehendenFormel: 0,5 μL QuantiFluor Dye (200X) + 99,5 μL 1×TE Puffer. Vorbereitung einerausreichend1×QuantiFluorgefärbtenArbeitslösung,sodassjedeProbe(gesamteProbeninderAmplifikatPlatte)undeinStandard(gesamt14)einAliquotvon100μLerreicht.

3.4. – Vorbereitung einer Standards-Bewertungsplatte und Amplifikate-Bewertungsplatte.

Aliquote von100μL1×QuantiFluor gefärbterArbeitslösung indieWells einer frischen96-Well optischen Platten, unter Beibehaltung des Formats der Standards-BewertungsplatteundderAmplifikate-Bewertunsplatte(sieheergänzendeAbbildung)

3.5. -VerwendungderzuvorvorbereitetenStandards,100μLeinesjedenStandardsalsKopiein

die jeweiligenWells auf der Standards-Bewertungsplatte füllen (gesamt 14Wells).MixendurchPipettieren.

3.6. - Zugeben von 100 μL verdünntem Amplifikat aus den entsprechenden Wells in der

Amplfikate-VerdünnungplatteindieAmplifikate-Bewertungsplatte.MixendurchPipettieren.3.7. - Lauf der Standards-Bewertungsplatte im Platten Fluorometer sowie der Amplifikate-

Bewertungsplatte.3.8. - Kalkulation der DNA-Konzentration in den Amplifikate-Bewertungsplatten mittels RFU-

Daten. Siehe Verdünnungstabelle im bereitgestellten Workbook zur Hilfestellung vonKalkulationen.

3.9. Verdünnung der DNA in den Amplifikateplatten mit H2O bidest., so dass die DNA-

Endkonzentrationetwa67ng/μLbeträgt.• ImFalleinerDNA-Konzentrationvon150ng/μLodermehr:Zugabevon25μLH2O• ImFalleinerDNA-Konzentrationzwischen100-150ng/μL:Zugabevon10μLH2O• ImFalleinerDNA-Konzentrationwenigerals100ng/μL:keineZugabevonH2O

3.10 -MischenjederProbemit15μLDQB1(Set1)undDQB1(Set2)ineinemneuenWell(wennbeideDQB1Setsbenutztwerden).

Notiz:DQB1Set1undSet2amplifizierenbeideExons2,3und4.FallseinederDQB1Reaktionen misslingt oder ist signifikant weniger als bei den anderen Reaktionen,solltesienichtmiteinererfolgreichenReaktionvermischtwerden.DasverhindertdieVerdünnungeinergutenAmplifikation.

3.11 -VereinigealleOrteeinerProbe ineinereinzelnenAmplifikateplatte5μLvon jedemOrteinerProbeineinerneuen96-WellPCR-Plattezusammenfügen.JedeProbesollteeineinzelnesWellbesetzenmiteinemVolumenvon35μL.WenndasEndvolumen jederProbeaufgetragenwurde,gutdurchPipettierenmischen.3.12 – Zugabe von 4 μL ExoSAP-iT in ein zusammengefügtes Amplifikat. Spülen der


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PipettenspitzendurchPipettieren.VersiegelnderPlattemit einer thermalenVersiegelungundrunterzentrifugieren.3.13 - Die Amplifikateplatte in dem Thermal Cycler plazieren und das folgende Programm

durchführen:

ExoSAP-ITPCR-Reinigung

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 37°C 45Minuten1 80°C 15Minuten1 4°C ∞

Sichere Haltestelle. Amplifikat kann bei 4 °C über Nacht oder bei -20 °C für längergelagertwerden.


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Schritt4–LibraryVorbereitungDauer:~3Stunden20MinutenWährenddiesesSchritteswerdendiezusammengefügtenAmplifikatefürdieSequenzierungamIllumina MiSeq vorbereitet. Die Amplifikate sind enzymatisch fragmentiert, die Enden sindrepariertundadenylisiertundindizierteAdaptersindandieEndenligiert.DieLibrarieswerdennundurcheineneinfachenAufreinigungs-undKonzentrationsschrittmitHilfevonAMPureXPbeadsgepoolt.

Notiz:OmixonempfiehltgrößereVolumen,alsdie,diefür24Probennotwendigsind,weilvielederEnzymeundPufferdickflüssigsind,waszueinemübermäßigenVerlustbeimPipettierenführenkann.

ListederReagenzien

Artikel Lagerung GeliefertdurchAmplifikate-Platte 4°C Schritt1

Adapterplatte -20°C OmixonFragmentierungsenzym(A) -20°C OmixonFragmentierungspuffer(B) -20°C OmixonEndRepair-Enzym(C) -20°C OmixonEndRepair-Puffer(D) -20°C OmixonLigationsenzym(E) -20°C OmixonLigationspuffer(F) -20°C OmixonAMPureXPbeads 4°C BeckmanCoulter80%Ethanol(frischzubereitet) 20°Cbis25

°CBenutzer

H2O(bidest.) 20°Cbis25°C

Benutzer

Protokoll4.1 -AnschaltendesThermalCyclers.Überprüfung,obdieHeizdeckelsichaufwärmen.

Notiz: Vor der Benutzung das Fragmentation Enzyms (A) gründlich durch vortexenaufmischen.

4.2 -VorbereitungdesFragmentationMasterMixanhanddernachstehendenTabelle:

FragmentationMasterMix

Reagenz VolumenproLibrary(μL)

EmpfohlenesVolumenfür24Libraries(μL)

Farbenkode

Fragmentierungsenzym(A) 2μL 55,2μL GelbFragmentierungspuffer(B) 2μL 55,2μL RotGesamtvolumen 4μL 110,4μL


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4.3 - VorbereitungeinerReagenz-Platte: eineneue96-Well PCR-Platte auf einPCRKühl-RackplazierenundgleicheMengendesFragmentationMasterMixes in jedesWelleinereinzelnenSäulealiquotieren.

Notiz: Die Fragmentierungsreaktion wurde designt, um ideal große DNA zurSequenzierungimIlluminaMiSeqbereitzustellen.Esistwichtig,dieReagenzienbiszumStart der Reaktion im Thermal Cycler, kalt zu stellen, um einer exzessivenFragmentierungvorzubeugen.BenutzungvonMehrkanal-Pipettenwerdenempfohlen,umderMöglichkeiteinerexzessivenFragmentierungvorzubeugen.

4.4 -ZentrifugierenderAmplifikate-Plattefür10SekundenundkühlenaufEisoderaufeinemKühlblock

4.5 -VorbereitungderReaktionsplatte:Plaziereneinerneuen96-WellPCRPlatteaufeinenPCR-

Kühlblock.4.6 - Zugabevon4μLFragmentationMasterMix vonderReagenzplatte indieWells aufderReaktionsplatte entsprechend der Proben in der Amplifikate-Platte. Die Benutzung einerMehrkanal-Pipettewirdempfohlen.

4.7 -Übertragung von jeweils 4 μL FragmentationMasterMix von jedemAmplifikat vonderAmplifikate-Platte in das entsprechende Well auf der Reaktionsplatte mittels Mehrkanal-PipetteMixendurchPipettieren.

4.8 - Abdecken der Reaktionsplatte mit einer thermalen Versiegelung und 10 Sekunden

runterzentrifugieren.4.9 -InkubationderReaktionsplatteimThermalCyclermitfolgendemProgramm:

Fragmentierungsprogramm

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 37°C 10

Minuten1 70°C 15Minuten1 4°C ∞

SichereHaltestelle.LagerungderLibrariesbei4°CüberNachtoderbei-20°Cfürlänger

4.10 -VorbereitungdesEndRepairMasterMixanhanddernachstehendenTabelle.


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EndRepairMasterMix

Reagenz VolumenproLibrary(μL)

EmpfohlenesVolumenfür24Libraries(μL)

Farbenkode

H2O(bidest.) 1,25μL 34,8μL

EndRepair-Enzym(C) 1,25μL 34,8μL GrünEndRepair-Puffer(D) 2,5μL 69,6μL OrangeGesamtvolumen 5μL 139,2μL

4.11 - Aliquotieren gleicher Mengen des End Repair Master Mixes in einzelne unbenutzteSäulenderReagenzplatte.

4.12 - Zentrifugieren der Reaktionsplatte (beinhaltet die fragmentierten Proben) für 10Sekunden. Zugabe von 5 μL EndRepairMasterMix von der Reagenzplatte in jedesWell derReaktionslatte. Die Benutzung einer Mehrkanal-Pipette wird empfohlen. Mixen durchPipettieren.

4.13 - Abdecken der Reaktionsplatte mit einer thermalen Versiegelung und 10 Sekunden

runterzentrifugieren.4.14 -InkubationderReaktionsplatteimThermalCyclermitfolgendemProgramm:

EndRepairProgramm




4.15 -DiemitgelieferteAdapterplattebeiRaumtemperaturauftauen,nachdemdasEndRepair-Programm im Thermal Cycler gestartetwurde.Wenn die Adapterplatte bei Raumtemperaturist,für3Minutenbei3000rpmzentrifugieren.

4.16 - Vorsichtiges Abziehen der Versiegelung der Adapterplatte Nicht die Adapterplatteschütteln, nachdem die Versiegelung entfernt wurde, um eventuellen Kreuzkontaminationenvorzubeugen.

4.17 -ÜbertragendesgesamtenVolumensjedesWellsvonderReaktionsplatte(25μL)indasentsprechendeWellaufderAdapterplatte.


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Notiz: Wird NICHT die gesamte Adapterplatte verwendet, es ist möglich nur diebenötigteAnzahlanAdapternzuverwenden.DiePlattenversiegelungzwischendenWells, die verwendet werden und den Wells, die verbleiben, zerschneiden.Vorsichtiges Abziehen zwischen der Versiegelung der Adapterplatte lässt dasVersiegelungüberdenWells,dienichtbenutztwerden,anseinemPlatz.

a. Übertragungvon25μLjederEndrepair-ProbeinderReaktionsplatteineinWellinderAdapterplatte,gründlichesMischendurchpipettieren.

b. ÜbertragungderGesamtmengeeinerjedenProbevonderAdapterplatteindasoriginalWellaufderReaktionsplatte.

c. Wiederversiegeln der Adapter-Platte und Rückkühlen auf -20 °C. Benutzen derReaktionsplatte anstelle der Adapter-Platte für die übrigen Schritte imHandbuch.

4.18 - Vorbereitung des LigationMasterMix. Vorbereitung von ausreichend LigationMasterMixfürjedeProbe.

LigationMasterMix

Reagenz Volume(μL) EmpfohlenesVolumenfür24Libraries(μL)

Farbenkode

Ligationsenzym(E) 2,5μL 63,2μL BlauLigationspuffer(F) 30μL 757,5μL Schw

arzGesamtvolumen 32,5 820,7μL

4.19 -DenLigationMasterMixineineunbenutzteSäuleaufderReagenzplattealiquotieren.DieBenutzungeinerMehrkanal-Pipettewirdempfohlen.

4.20 - Zugabe von 32,5 μL Ligation Master Mix in jedes Well auf der Reaktionsplatte. DieBenutzungeinerMehrkanal-Pipettewirdempfohlen.MixendurchPipettieren.

4.21 - Abdecken der Reaktionsplatte mit einer thermalen Versiegelung und 10 Sekundenrunterzentrifugieren.

4.22 -InkubationderReaktionsplatteimThermalCyclermitfolgendemProgramm:

Ligationsprogramm





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4.23-AufwärmenderAMPureXPbeads(Magnetpartikel)aufRaumtemperatur.Sicherstellung,dasssiehomogensind (keineKlumpenoderPellets)Vorbereitendes frischhergestellten80%Ethanols(4mlEthanol+1mlH2O).4.24 -ErstellungderLibrarydurchKombinationeinesAliquotsvon jedenzusammengefügtemAmplifikat, jetzt eine Proben-spezifische Library, in eine 2,0 ml low-bindingMikrozentrifugenröhrchen.

a. Für16odermehrProben-KalkulieredieMengeeinerjedenProben-Library,umsie zu einer einzelnen Library mit einem Gesamtvolumen von 900 μLzusammenzufügen.900μLaufdieAnzahlderProben-Librariesverteilen.Diesistdas Volumen eines Aliquots, was von jeder Proben-Library besetzt und in dieLibrarypipettiertwerdenkann.

b. Fürweniger als 16Proben -Übertragen von60μL jederProben-Library indieLibrary.

4.25 -Zugabevon900μLAMPureXPbeadsindasLibrary-Röhrchen.GründlichMischendurchvortexen und kurzes runterzentrifugieren Magnetpartikel dürfen sich nicht separieren.InkubationderLibraryfür10MinutenbeiRaumtemperatur.

Notiz: Fallswenigerals900μLLibrary imEnd-Pool sind,ZugabeeineräquivalentenMengeanAMPureXPBeads.EssollteeinVerhältnisvon1:1zwischenEnd-PoolundAMPureXPBeadsvorliegen.

4.26 - Platzierungdes Library-RöhrchenaufdenMagnetischenStänderund Inkubation für10Minuten.

4.27 - Das Röhrchen auf dem Magnetischen Ständer halten. Vorsichtiges Entfernen undVerwerfendesÜberstandesausdemLibrary-Röhrchen,ohnedieMagnetpartikelzuberühren.4.28 - Das Röhrchen auf dem Magnetischen Ständer halten. Zugabe von ~1,5 mL frischhergestelltem 80% Ethanol in das Library-Röhrchen. Das Volumen des zugefügten Ethanolssollteausreichen,umdieMagnetpartikelzubedecken.

Notiz:VerwendungdesEthanolsaufderSeitedesRöhrchensohneMagnetpartikel.

4.29 - Inkubationdes Library-Röhrchens bei Raumtemperatur für 30 Sekunden, anschließendvorsichtgesEntfernenundVerwerfdesÜberstandes.4.30 -WiederholugvonSchritt4.28und4.29.4.31 -SchnellesrunterdrehendesLibrary-RöhrchensundRückplazierungindenMagnetischenStänder mit offenem Deckel. Entfernen von Rest-Ethanol mit einer Pipette. Nicht dieMagnetpartikelberühren


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Notiz:Sicherstellen,dassdasMagnetpartikel-PelletkeinenRest-Ethanolenthält.DieskönnteeineRotationdesGefäßesaufdemMagnetischenStänderbenötigen,umdasEthanolzuentfernenohnedasPelletaufzuwühlen.

4.32 - Das Pellet für 5-8 Minuten auf dem Magnetischen Ständer lufttrocken bis dasMagnetpartikel-Pellettrockenist.4.33 - Entfernen des Library-Röhrchens vomMagnetischen Ständer und Eluieren der Librarymit 31μLH2Obidest.Nichtmit der PipettenspitzedieMagnetpartikel berühren, solange sieanhaften.4.34 - Vortexen der Library bis zur vollständigen Auslösung der Magnetpartikel. KurzesZentrifugieren, falls einige Tröpfchen an der Seitenwand verharren. Sicherstellen, dass dieBeadsinderSuspensionvorhandensind.4.35 -InkubationderLibrarybeiRaumtemperaturfür2Minuten.4.36 -DasLibrary-Röhrchenfür2MinutenaufdemMagnetischenStänderplazieren.4.37 -SammelnderLibrary:DasEnd-Library-RöhrchenindenMagnetischenStänderstellen,31μLvomÜberstandineinem1,5mllow-bindingMikrozentrifugenröhrchensammeln.

SichereHaltestelle.LagerungderLibrariesbei4°CüberNachtoderbei-20°Cfürlänger.


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Schritt5–Library-GrößenauswahlDauer:~1StundeSchritt5benutztdie LibraryausSchritt4und führteineGrößenselektionmittelsPippinPrepdurch.Das Pippin Prep kann automatisch einenBereich anDNA Fragmentgrößen selektierenund in eine Sammelkammer eluieren. Notiz: Blue Pippin kann anstelle von Pippin Prepverwendetwerden.BezogenaufAnhang1füreineAnleitungzurBenutzungvonPippinPrep

ListederReagenzien

Artikel Lagerung Geliefertdurch1,5%AgaroseGelKassette,Farbstoff

frei20°Cbis25

°CSageScience

PippinLoadingSolution/MarkerMix(LabelK)

4°C SageScience

VereinigteLibrary 4°C Schritt4

Notiz: Marker K wird zusammenmit dem Pippin Prep verwendet Das Blaue PippinbenutztMarkerR2.

Protokoll5.1 -DieMarkerKLoadingLösungaufRaumtemperaturbringen.

5.2 -Kombiniere31μLderVereinigungmit10μLMarkerKLoadingLösung.

5.3 -MixendurchvortexenundanschließendesZentrifugieren.

5.4 -AufbauderPippinPrepzumSammelnvonDNAFragmentenzwischen650und1300bps.40μLProbeindieProbenöffnungladenundlaufenlassen.Laufzeitbeträgt45-50Minuten.

5.5 - Sammeln des gesamten Inhalts (ca. 40 μL aus der Elutionsöffnung des Pippin prep undÜbertragung in ein neues 1,5 ml low-binding Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist dieGrößenselektions-Library.

Sichere Haltestelle. Lagerung der Libraries bei 4 °C über Nacht oder bei -20 °C fürlänger.


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Schritt6–LibraryBewertungDauer:~1StundeFür einen optimalen Gebrauch des Outputs des Illumina MiSeq Sequencers ist es nötig dieGrößenselektions-Library zu quantifizieren. Die Konzentration der Größenselektions-LibrarykannmittelsqPCRakkuratgemessenwerden.

ListederReagenzien

Artikel Lagerung Geliefertdurch10×IlluminaPrimerPremix -20°C KAPABiosystems

2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0.20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsIlluminaDNAStandards -20°C KAPABiosystemsH2O(bidest.) Benutzer1×TEPuffer(pH8.0) BenutzerGrößenselektions-Library 4

°CSchritt5

Protokoll6.1 -VorbereitungdesqPCRPrimerMixmittels10×IlluminaPrimerPremixund2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix:

Notiz: Die KAPA SYBR FAST qPCR Kit Reagenzien (qPCRMasterMix, Primer Premixund ROX Lösung) werden bei der ersten Benutzung des Kits kombiniert. DiekombinieteLösung ist für30Gefrier/Tau-Schrittestabil.ZurBestimmungderKAPA-Dokumentationfolgen,fallsROXfürihrqPCRGerätempfohlenwird.

qPCRPrimerMix

Reagenz Volumen(ml)10×IlluminaPrimerPremix 1mL

2×KAPASYBRFASTqPCRMasterMix 5mLGesamtvolumen 6mL

6.2 -VorbereitendesqPCRMasterMix.


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qPCRMasterMix

Reagenz Volumen(μL)qPCRPrimerMix 228μL

H2O(bidest.) 76μLGesamtvolumen 304μL

6.3 -VorbereitungeinerReihenverdünnungderGrößenselektions-Library

a. Vorbereitung einer 1 :1000 Verdünnung durch Zugabe von 1 μL derGrößenselektions-Library zu 999 μL 1xTE Puffer (pH 8.0), gründliches Spülen derPipettenspitze.Vortexenundrunterzentrifugieren.

b. Vorbereitung einer 1 :2000 Verdünnung durch Zugabe von 100 μL der 1:1000Verdünnungzu100μL1xTEPuffer(pH8.0).Vortexenundrunterzentrifugieren.

6.4 -VorbereitungderqPCR-BewertungsplatteineinerneuenPCR-PlattekompatibelzumPCR-System

6.5 - 16 μL qPCR Master Mix in dreifacher Ausfertigung für die Standards 1-4 aliquotieren,

Verdünnung1:1000undVerdünnung1:2000(sieheergänzendeAbbildung).6.6 - 4 μL des Standards 1-4, Verdünnung 1:1000 und Verdünnung 1:2000 in die

entsprechendenWellsaliquotieren.6.7 -VersiegelungderqPCR-Bewertungsplatteundfür10Sekundenzentrifugieren.

Notiz: Die Bildung von Blasen sollten auf der PCR-Bewertungsplatte vermiedenwerden.DasZentrifugierenwirdzumBeseitigenderBlasenbenötigt.

6.8 -DNA-KonzentrationderGrößen-selektiertenLibrarymittelsqPCRGerätbestimmen.

6.9 - Mit Hilfe der Ergebnisse der qPCR, 10 μL der Größen-selektierten Library zu einer

Konzentration von 2 nM mit sterilem H2O in frischen 1,5 mL low-bindingMikrozentrifugenröhrchenverdünnen.DieverbliebeneGrößen-selektiertenLibrarykannbei-20°Cgelagertwerden.

SichererHaltestelle. Lagerungder Libraries bei 4 °CüberNachtoderbei -20 °C fürlänger. Im Falle einer Lagerung über einen längeren Zeitraum, wird eine Re-Quantifizierung der Library dringend empfohlen, bevor sie in derMiSeq eingesetztwird.


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Schritt7–SequenzierungamIlluminaMiSeqDuration:~20-40StundenDer Illumina MiSeq ist ein automatisiertes NGS Gerät, dass die im vorherigen Schnittvorbereitete Größenselektions-Library sequenziert. De-Multiplexing der indizierten ProbenerfolgtautomatischdurchdieBeendigungdesSequenzierungslaufs.

Kurzhinweis–mankanneinen1%PhiXspike-inalszusätzlicheKontrolleverwenden,um die Sequenzreaktion zu überwachen. Für weitere Informationen zur Phix-KontrollewendenSiesichbitteandieDokumentationvonIllumina

ListederReagenzien

Artikel Lagerung GeliefertdurchReagenzpatrone -20°C Illumina

HT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaMiSeqFlowCell 4°C IlluminaLibrarybei2nM 4°C Schritt6NaOH1Noder2N 20°Cbis25

°CBenutze

rH2O(bidest.) 20°Cbis25°C

Benutzer

MiSeqReagentKitKapazität

IlluminaMiSeqReagentKit

ZeitStunden

X2-24/7Proben


~39 24


~24 24

Micro300Zyklus(MS-103-1002)

~19 24


~28 12


~17 6

Protokoll7.1-VorbereitungderMiseqanhandderStandardIlluminaProtokolle.

7.2 -Vorbereitungeiner1nMdenaturiertenLibrary:Kombiniere10μLfrischzubereitetem0,2NNaOH und 10 μL 2 nM verdünntes Größen-selektierter Library in einem neuen 1,5 mL low-bindingMikrozentrifugenröhrchen.


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Vortexen und runterzentrifugieren. Inkubation dieser 1 nM denaturierten Library beiRaumtemperaturfür5Minuten.7.3 - Vorbereitung einer 20 nM denaturierten Library: 980 μL gekühlte HT1 zu 20 μL 1 nMdenaturierterLibraryhinzugeben.Vortexenundrunterzentrifugieren.7.4 - Vorbereitung einer 9 nM denaturierten Library: 550 μL gekühlte HT1 zu 450 μL 20 nMdenaturierter Library ineinneuen1,5mL low-bindingMikrozentrifugenröhrchenpippetieren.Vortexenundrunterzentrifugieren.7.5 - Übertragung von 9 pM denaturierter Library in das Proben Ladebehälter der MiSeqReagenzpatrone.

Kurzhinweis – Es ist empfehlenswert das empfohleneWorkbook zu benutzen, dasvonMiseqbenötigtwird,umdasProbenblattzuerstellen.


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Schritt8–AnalysederHLASequenzdatenDasIlluminaMiSeqarbeitetdie9pMvereinigteLibraryaufundgeneriertdieSequenzdatenalsfastqFile.BittebeziehenSiesichaufdesHLATwinHandbuchzurUnterstützungderkorrektenInstallationvonHLATwinundzu Informationenzur InterpretationderGenotyp-Analyse ihrerSequenzdaten. Für die Inbetriebnahme des Automatisierte Protokolls und Fragen zurInstallationoderDatenanalysekontaktierenSiebittesupport@omixon.com.

AutomatischesProtokoll

ITSetupundKonfiguration1. InstallationdesHLATwinServersaufdemServer§ InstallationdesHLATwinClientaufdenClientComputer -multipleHLATwinClienten

könntensichzumSerververbinden§ Kontaktieren Sie Omixon Support ([email protected]) für die Installations-

GebrauchsanleitungfürdieAutomatisierung.

ProtokollperAnalyse

1. StartendesHLATwinClientundEinloggen.2. Daten sind bereits bearbeitet oder werden bearbeitet. Überprüfung der Ergebnisse

mittelsTrafficLightSysteminHLATwin.3. Die Ergebnisse der Genotypen und/oder Konsensus-Sequenzen können wie folgt

exportiertwerden.

ManuellesServerProtokollITSetupundKonfiguration§ InstallationdesHLATwinServersaufdenServer.§ InstallationdesHLATwinClientaufdemClientComputer.

ProtokollperAnalyse§ StartendesHLATwinClientundEinloggen.§ Die MiSeq Datei im .fastq oder .fastq.gz Format auswählen und den Holotype HLA

Typisierungslaufsstarten.§ Nachdem die Holotype HLA Typisierung beendet ist, können die Ergebnisse mittels

TrafficLightSystemimHLATwinüberprüftwerden.§ Die Ergebnisse der Genotypen und/oder Konsensus-Sequenzen können wie folgt

exportiertwerden.

ManuellesDesktopProtokollITSetupundKonfiguration§ HLATwinDesktopinstallieren.


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ProtokollperAnalyse7 StartendesHLATwinClientundEinloggen.8 Die MiSeq Datei im .fastq oder .fastq.gz Format auswählen und den Holotype HLA

Typisierungslaufsstarten.9 NachdemdieHolotypeHLATypisierungbeendet ist, könnendieErgebnissemittelsTraffic

LightSystemimHLATwinüberprüftwerden.10 DieErgebnissederGenotypenund/oderKonsensus-Sequenzenkönnenwiefolgtexportiert

werden.


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ErgänzendeAbbildungen

Plattenbeispiele für eine Amplifikate-Platte, Amplifikationsplatte,Verdünnungsplatte, Amplifikate-Bewertungsplatte (für einenindividuellenOrt)&Reaktionsplatte


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BeispieleinerStandard-Berwertungsplatte

qPCR-Plattenbeispiel


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Anhang1:PippinPrep

ProgrammierungvonPippinPrep1. DasProtocolEditor-VerzeichnisanklickenunddenKnopf“New”anklicken.

2. Das"Folder"-Symbolnebendem"Cassette"-Feldanklickenund“1.5%DFMarkerK”fürdiePippinPrepoder“1.5%DFMarkerR2”fürdieBluePippinauswählen.

3. InderSpur,dieprogrammiertwird:Das“Range”-Feldhervorheben.Setzten einer “Ref Spur”, um die Anzahl der Spuren, die benutzt werden, anzugleichen. Das“Start*”-Feldauf650stellen.Das“End*”-Feldauf1300stellen.4. Indem"ReferenceLane"-Feld,dieSpurauswählen,indergearbeitetwird.

5. AufdenKnopf"Saveas"drückenunddemProgrammeinenNamengeben.

LaufderPippinPrep1. MitHilfedesAnschaltknopfesaufderHinterseitedesPippinPrepdasGerätanschalten.2. VisuelleÜberprüfungdesPippinPrep.Sicherstellen,dassalle5LEDsleuchtenunddass

dasGerätimInnenraumsauberundtrockenist.3. RechtsaufdemBildschirmaufden"SageSciencelogo"-Knopfklicken.Eskannjetztein

Passworteingegebenwerden.DasBetriebsstandard-Passwortist“pips”.4. Auf das "Factory-Setup"-Verzeichnis klicken und sicherstellen, dass das der "Base-to-

Threshold"-Wertauf0,02gesetztist.5. Den Kalibrierungsaufsatz in das Pippin Prep platzieren. Sicherstellen, dass der dunkle

StreifenmitderSchriftseitenachuntenundüberdenLED-Lichternplatziertwurde.6. Im"Main"-VerzeichnisaufdenKnopf“Calibration”klicken.7. Im "Calibration"-Fenster überprüfen, ob das “Target I pHmA”-Feld auf 0,80 (0,06 für

BluePippin)gesetztistunddannden"Calibrate"-Knopfdrücken.8. Ins "Protocol"-Verzeichnis gehen. Den “Load”-Knopf anklicken und das Programm für

den Holotype HLA und die spezielle Spur, die verwendet werden soll, anklickenSicherstellen,dass:a. DiekorrekteSpurangeschaltetist.b. DerBreitspektrum-Selektionsindikatoranist.c. DieReferenzspurindergleichenSpurist,dieverwendetwird.

9. Zum"Main"-Verzeichnisgehen.Sicherstellen,dass:a. DasgeladeneProgrammdasist,dasausgewähltwordenist.b. Die entsprechendeReferenz-Spur ausgewähltwurde und das es auch die Spur

ist,inderdieProbenlaufen.10. Überprüfen der Kassette. Bevor das Band zur Versiegelung entfernt wird, sollte

sichergestelltwerden,dasssichkeineBlasenhinterderElutionsöffnungbefinden.Wennman hinter der Elutionsöffnung Blasen erkennt, die Kassette behutsam in der HandnehmenunddieBasenrausklopfenund-rollen.

11. DieKassettemitdemnochüberdenWellsbefindlichenBandindasPippinPrepstellen.


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12. VorsichtigdasBandablösenunddaraufachten,dassdasBandvondersauberenSeiteder Kassette (Spur 5) aus zur benutzten Seite der Kassette (Spur 1) abgelöst wird.Aufpassen, dass die Flüssigkeit beim Entfernen des Bandes nicht spritzt, um eineKontaminationzuvermeiden.

13. Das ganze Volumen des Puffers in der Elutionöffnung der Spur, die verwendet wird,entfernen und durch 40 μL frisch hergestellten Elektrophoresepuffer in derElutionsöffnungersetzen.

14. EinendünnenStreifendesBandesüberdieElutionsöffnunggeben.15. Alle Gefäße, die weniger als ein 3/4 voll sind, sollten mit Elektrophoresepuffer

aufgestocktwerden.NichtdieWellsüberfüllen!DerRanddesPufferssolltenichthöherals das Plastik sein, umeinemVerschleppen vorzubeugen, falls derDeckel verrutscht.PufferausdensauberenWells(Spur5)indiebenutztenWells(Spur1)füllen.

16. Sicherstellen, dass die beladenen Wells (Well mit Agarose) mit Elektrophoresepufferbefüllt sind. Der Puffer sollte 'gerade so' über der Agarose sein und komplett flacherscheinen

17. Die Pippin Prep langsam schließenund schauen, dass beim SchließendesGeräts keinPufferdenDeckelberührt.

18. DenKontinuitätstestdurchführen.WenndieSensorenleichtausgetrocknetsind,schlägtderKontinuitätstestüblicherweisefehl.FallsderKontinuitätstestfehlschlägt,denTestnocheinmaldurchführen. IstderKontinuitätstestbeendet,dasPippin langsamöffnen.Sicherstellen,dassdurchdenDeckelderPippinPrepkeineFlüssigkeitdurchdieKassettedurchgezogenwurde.

19. KurzdieMarkerKLoadingSolutionvortexenundrunterzentrifugieren.10μLMarkerKLoadingSolutionzuden~30μLLibraryhinzugeben.

20. KurzesvortexenderLibraryundrunterzentrifugieren21. 40μLPufferausdemProben-Well,dasbenutztwird,entfernen.22. ~40μLderLibrary,beladenmitdemwithMarkerK,zudemProben-Well,dasverwendet

wird,hinzugeben.23. DieverwendeteSpurmitdenInitialiendesTechnikersunddemDatummarkieren.24. Das Pippin Prep schließen und den "Start"-Knopf anklicken. Sicherstellen, dass die

entsprechendeSpurangeschaltetwurde.DieProbesollte45Minutenlaufen.25. NachdemderLaufbeendetist,dasPippinPrepvorsichtigöffnen.Nachschauen,obder

DeckelFlüssigkeitdurchdieKassettegeschleppthat.26. Vorsichtiges entfernen des Bandes über den Elutionsöffnungen, ohne dabei die

Flüssigkeitzustreifen.27. ÜberführungdesVolumensderElutionsöffnungineinneues1,5mllow-bindingGefäß28. Alle offenen Wells mit zwei Stück des Plattenversiegelungsbandes abdecken. Daran

erinnern,einBandaufdersauberenSeitezulassen.Daswirdesvereinfachen,dasBandvomSauberenzumBenutztenzuentfernen.

29. DieversiegelteKassetteinseineTascheplazierenundbeiseitelegen.30. DiegewascheneKassettenehmenundmitMiliQWasserbefüllen.BehutsamdenDeckel

der Pippin Prep schließen und gucken, um zu sehen, ob Flüssigkeit durch diegewascheneKassettegezogenwird.

32. DiePippinPrepfüreinpaarSekundengeschlossenlassen.


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33. ÖffnenderPippinPrepundgucken,umzusehen,obFlüssigkeitdurchdiegewascheneKassettegezogenwird.

34. DiegewascheneKassetteentfernen,vomWasserentlehrenundtrocknenlassen.35. AllesWasserausderPippinPrepentfernenundbehutsamschließen.36. Den"ShutDown"KnopfimPippinPrepMenüwählen.


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Anhang2:Probenblatt[Header],,,,,,,IEMFileVersion,4,,,,,,InvestigatorName,RHP,,,,,,ExperimentName,030315S_RHP,,,,,,Date,3/3/15,,,,,,Workflow,GenerateFASTQ,,,,,,Application,FASTQOnly,,,,,,Assay,CHOPPCRFree,,,,,,Description,030315L_RHP,,,,,,Chemistry,Default,,,,,,,,,,,,,[Reads],,,,,,,251,,,,,,,251,,,,,,,,,,,,,,[Settings],,,,,,,Adapter,AGATCGGAAGAGCACACGTC,,,,,,AdapterRead2,AGATCGGAAGAGCGTCGTGT,,,,,,,,,,,,,[Data],,,,,,,Sample_ID,Sample_Name,Sample_Plate,Sample_Well,I7_Index_ID,index,Sample_Project,Description001030315S_RHP_1,001030315S_RHP_1,030315P_RHP,A1,1,TAAGTGATC,030315S_RHP,002030315S_RHP_2,002030315S_RHP_2,030315P_RHP,B1,2,GTGGTATTC,030315S_RHP,003030315S_RHP_3,003030315S_RHP_3,030315P_RHP,C1,3,ATAAGTACT,030315S_RHP,004030315S_RHP_4,004030315S_RHP_4,030315P_RHP,D1,4,TAGGATTCA,030315S_RHP,005030315S_RHP_5,005030315S_RHP_5,030315P_RHP,E1,5,AAGTGCATA,030315S_RHP,006030315S_RHP_6,006030315S_RHP_6,030315P_RHP,F1,6,TACACACAA,030315S_RHP,007030315S_RHP_7,007030315S_RHP_7,030315P_RHP,G1,7,TCTCCGAGC,030315S_RHP,008030315S_RHP_8,008030315S_RHP_8,030315P_RHP,H1,8,AGTAACCGC,030315S_RHP,009030315S_RHP_9,009030315S_RHP_9,030315P_RHP,A2,9,AGGCAAGTT,030315S_RHP,010030315S_RHP_10,010030315S_RHP_10,030315P_RHP,B2,10,CCGTACTAT,030315S_RHP,011030315S_RHP_11,011030315S_RHP_11,030315P_RHP,C2,11,GCCAGGTGC,030315S_RHP,012030315S_RHP_12,012030315S_RHP_12,030315P_RHP,D2,12,CAACATCAC,030315S_RHP,013030315S_RHP_13,013030315S_RHP_13,030315P_RHP,E2,13,GTCAGCACC,030315S_RHP,014030315S_RHP_14,014030315S_RHP_14,030315P_RHP,F2,14,CTTGGCTGT,030315S_RHP,015030315S_RHP_15,015030315S_RHP_15,030315P_RHP,G2,15,GTAGTACTA,030315S_RHP,016030315S_RHP_16,016030315S_RHP_16,030315P_RHP,H2,16,GCAAGTCAA,030315S_RHP,017030315S_RHP_17,017030315S_RHP_17,030315P_RHP,A3,17,ATTACTACC,030315S_RHP,018030315S_RHP_18,018030315S_RHP_18,030315P_RHP,B3,18,CGCTCTAAT,030315S_RHP,019030315S_RHP_19,019030315S_RHP_19,030315P_RHP,C3,19,ACTTCGGTC,030315S_RHP,020030315S_RHP_20,020030315S_RHP_20,030315P_RHP,D3,20,TGGTACGAC,030315S_RHP,021030315S_RHP_21,021030315S_RHP_21,030315P_RHP,E3,21,TGCATAATG,030315S_RHP,022030315S_RHP_22,022030315S_RHP_22,030315P_RHP,F3,22,CTGGTTGGC,030315S_RHP,023030315S_RHP_23,023030315S_RHP_23,030315P_RHP,G3,23,CTCTTATTC,030315S_RHP,024030315S_RHP_24,024030315S_RHP_24,030315P_RHP,H3,24,AGGACTCTC,030315S_RHP,


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Anhang 3: Amplifikat Bewertung mittelseines qPCR-Geräts

ListederReagenzien

Artikel Lagerung Geliefertdurch20×TEPuffer(pH7.5) 4°C Promega

LambdaDNAStandard(100ng/μL) 4°C Promega200×QuantiFluordsDNADye 4°C PromegaSterilesH2O 20°Cbis25

°CBenutzer

KlasseI-Amplifikationplatte(n) 4°C Schritt2KlasseII-Amplifikationplatte(n) 4°C Schritt2

Protokoll1. Herstellung einer seriellen Verdünnungmittels 1,5mLMikrozentrifugenröhrchen und

dem QuantiFluor Lambda DNA Standard (100 ng/μL). Befolge die nachstehendeVerdünnungstabelle:

LabelaufdemGefäß

InputDNA VolumenDNA(μL)

Volumen1xTE(μL)

EndKonz.(ng/μL)

Standard1 LambdaDNA 7,5μL 492,5μL 1,5ng/μLStandard2 Standard1 250μL 250μL 0,75ng/μLStandard3 Standard2 250μL 250μL 0,38ng/μLStandard4 Standard3 250μL 250μL 0,19ng/μLStandard5 Standard4 250μL 250μL 0,09ng/μLStandard6 Standard5 250μL 250μL 0,05ng/μLStandard7,Blank

Blank 0μL 250μL 0ng/μL

1. Vorbereitung der Amplifikat-Verdünnungsplatte mit Hilfe einer 96-Well Deep-WellPlatte (1 mL pro Well Fassungsvermögen) Zugabe von 498 μL 1×TE Buffer pro WellentsprechendderAmplifikate-Platte.Zugabevon2μLDNAausderAmplifikate-PlatteindasentsprechendeWellaufderAmplifikat-Verdünnungsplatte.DiePipettenspitzesollteimmergründlichgespültwerden.DiePlatteversiegelnundgutvortexen.Platte für10Sekundenzentrifugieren

2. 1×QuantiFluor Dye working solution nach folgendem Rezept vorbereiten 0,5 μLQuantiFluorDye(200X)+99,5μL1×TEPuffer.Ausreichend1×QuantiFluorDyeWorkingSolution vorbereiten, so dass jede Probe (gesamte Proben auf der Amplifikate-Platte)undderStandard(6StandardsundeinBlankLaufindoppelterAusfertigung)einAliquotvon50μLbekommt.

3. Ineineneue96-Well-Platte,diekompatibelzumjeweiligenqPCRGerätist,Aliquotevon50μL1×QuantiFluorDyeWorkingSolutionindieverwendetenWellpipettieren.


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4. Unter Verwendung der vorangegangenen Standards-Vorbereitung, 50 μL von jedemStandard im Doppel in einzelne Wells der 96-Well-Bewertungsplatte auftragen(insgesamt14Wells)MixendurchPipettieren.

5. Dann50μLder verdünntenAmplifikateder entsprechendenWells in dieAmplifikate-Verdünnungsplatten indie jeweiligenWells der 96-Well-Bewertungsplattenauftragen.MixendurchPipettieren.

6. Eine Bewertungsplatte nach der anderen in das qPCR-Gerät stellen und folgendesProgrammlaufenlassen:


°C10Sekunden

2

25°C

15Sekunden25°C

30Sekunden(Datenerwerb)

7. DieKonzentrationderDNAinderAmplifikate-Bewertungsplatte,unterVerwendungder

unverarbeitetenRFU-Daten,erzeugtvomqPCRGerät,berechnen.

8. Die DNA in den Amplifikate-Platten mit sterilem H2O verdünnen, so dass dieEndkonzentrationderDNAca.67ng/μLbetrifft.

• ImFalleinerDNA-Konzentrationvon150ng/μLodermehr:Zugabevon25μLofH2O

• ImFalleinerDNA-Konzentrationzwischen100-150ng/μL:Zugabevon10μLH2O

• IstdieDNA-Konzentrationwenigerals100ng/μL:Zugabevon0μLH2O

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