1 Zellbiologische Methoden der experimentellen Ernährungsforschung, Ersatzmethoden zum Tierversuch Zellkulturen I - Können sich in vitro unbegrenzt vermehren - Der Begriff „transformierte Zelllinie“ bezieht sich auf Zellen, die entweder von Tumorzellen stammen oder bei denen man durch künstliche Manipulation einen neuen transformierten Zellphänotyp (=Immortalisierung) erzeugt - Der transformierte Phänotyp kann sich in folgender weise äußern: • Adhärente Zellen können die Fähigkeit erwerben, ohne Substratkontakt zu wachsen • Zellen verringern die Ansprüche an das Serum • Immortalisierte Zellen müssen nicht bösartig transformiert sein, sie sind nur so verändert, das aus einer Primärkultur eine permanent wachsende Ziellinie entsteht - wurden von kurzer Zeit aus dem Gewebe isoliert - haben geringe Lebensbedingung unter Kulturbedingung (20-100 Generationen) => finite Kulturen Transformierte Zellen: Primärzellen:
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Zellbiologische Methoden der experimentellen
Ernährungsforschung, Ersatzmethoden zum
Tierversuch
Zellkulturen I
- Können sich in vitro unbegrenzt vermehren- Der Begriff „transformierte Zelllinie“ bezieht sich auf Zellen, die entweder von Tumorzellen stammen oder bei denen man durch künstliche Manipulation einen neuen transformierten Zellphänotyp (=Immortalisierung) erzeugt- Der transformierte Phänotyp kann sich in folgender weise äußern:• Adhärente Zellen können die Fähigkeit erwerben, ohne Substratkontakt zu wachsen• Zellen verringern die Ansprüche an das Serum• Immortalisierte Zellen müssen nicht bösartig transformiert sein, sie sind nur so verändert, das aus einer Primärkultur eine permanent wachsende Ziellinie entsteht
- wurden von kurzer Zeit aus dem Gewebe isoliert- haben geringe Lebensbedingung unter Kulturbedingung (20-100 Generationen)=> finite Kulturen
Transformierte Zellen:Primärzellen:
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Zellkulturen II
- Werden in Suspensionen kultiviert
- Binden sich nicht an die Oberfläche der Kultur-flasche
- Zellen des Immunsystems oder deren Vorläufern (zirkulieren in vivo im Blutstrom)
- Wachsen an inerte Oberfläche- Mono- und Multilayer- Heften sich an die Plastik-oberfläche der Kulturflasche an- Zellen leiten sich von Geweben ab, wie Muskulatur, Nerven, der Leber, Nieren (in vivo sind sie nicht beweglich)- Zusammenhängige Zelllage- Zeigen dichteabhängige Proliferationshemmung(Kontaktinhibition)
Nichtadhärente Zellen:Adhärente Zellen
„Zellarten“
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Stufen der Kultivierung von Primärzellen• Isolierung des Gewebes• „Disaggregation“ der Zellen • Inkubation und Wachstum
Arbeiten mit adhärenten (Tumor)Zellen
Typische
Wachstumskurve
von Caco-2-Zellen750
2000750
4000750
6000750
8000750
10000750
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Zeit (Tagen)
Zellz
ahl (
Mill
ione
n)
Zählkammer Neubauer improved, Caco-2 Zellen
Konfluenz
KörperzellenTumorzellen
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Passage von adhärenten Zellen
Wöchentliche Routine zum Wachstum von Subpopulationen:
1. Medium abnehmen
2. Waschen mit PBS (Phosphate Buffered Saline)
3. Zellen mit Trypsin überschichten und warten bis sie sich
ablösen (Mikroskop), in Medium resuspendieren (-->Serum!)
4. Frisches Medium vorlegen und entsprechende
Zellmenge einsäen
Wachstumsbedingungen für die meisten Säugetierzellen
Für die meisten Zellen gilt:
- 37°C
- 95% Luftfeuchtigkeit
- 5% CO2
- CO2 Inkubator notwendig
- Wasserwanne am Boden des Inkubators
- Sterilität wichtig
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Vorteile von Zellkulturen
• Verhalten von Zellen ohne der Variation, die in Tieren normalerweise vorkommt
• Enge Kontrolle der Wachstumsbedingungen führt zu einheitlichen “Proben”
• Charakteristik der Zellen kann über mehrere Generationen aufrechterhalten bleiben – gute Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten
• Inkubation mit Proben verschiedenster Konzentrationen
• Vorstudie zum Tierversuch
• Gute Interpretation der Ergebnisse
Nachteile von Zellkulturen
• Sie sind ein Modell
• Standardisierte Methoden müssen implementiert werden um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten
• Zeitaufwand zum Erlernen der Steriltechniken
• Veränderung der Zellen möglich
• Umlegung der Ergebnisse auf in-vivo Verhältnisse nur bedingt möglich – hängt von Versuchsplanung ab
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Steriles Arbeiten I
1. Ziel ist die Vermeidung mikrobiologischer Kontaminationen (Bakterien, Mycoplasmen, Pilze).
Diese Organismen können sich in Zellkulturmedien sehr gut vermehren und eine Kultur dadurch zerstören, da sie wichtige Nährstoffe verbrauchen oder durch die gebildeten Metabolitendie Kultur irreversibel schädigen.
2. Sterilität erreicht man durch Einhalten folgender Grundregeln:
- spezielle Steril- Arbeitsbänke (Laminar Flow)
- Kulturen vor Arbeitsbeginn auf Sterilität kontrollieren
- Arbeitsfläche aufgeräumt halten (nur das Nötigste in der Sterilbank haben)
- kein Mundpipettieren
- Handschuhe tragen, falls nötig, mit 70% Ethanol desinfizieren
- nicht über offenen sterilen Flaschen oder Schalen hantieren
(auch nicht über deren Deckeln!)
- nur sterile Glas-/Kunststoffwaren und Lösungen benutzen
(Abflammen ist nur ein Notbehelf!)
- verschüttete Lösungen sofort entfernen, Fläche mit 70% Ethanol desinfizieren
3. Antibiotika
- richtig dosiert verwenden
- geringe Stabilität in wässriger Lösung beachten
- Kultur gelegentlich antibiotikafrei weiterziehen, um Sterilität zu prüfen
Steriles Arbeiten II
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Steriles Arbeiten im Laminar Flow
Steriles Arbeiten
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Wichtige Begriffe: Zellkulturen
• Organkultur: Dreidimensionale Kultur von “Zellaggregaten”- in vivo Vergleichbarkeit
• Zellkultur: Einfache Zellen, keine Gewebe mehr, aus verteilten Zellen des Gewebes
• Primärkulturen: Gewonnen aus einem Explantat oder Gewebe eines Tieres, reduzierte Haltbarkeit
• Subkultur: Transfer mit Wachstum von Zellen in neuer Flasche
• Etablierte Zelllinie: Primärkultur ist Immortalisiert durch Transformation
• Passage: Anzahl der Subpopulationen einer Primärkultur
Auswahl der Zelllinien ist wichtig für die Interpretation der ErgebnisseDosisabhängigkeit (mindestens 4 Dosierungen/ physiologisch und nicht physiologisch) DosePositive/Negative KontrolleMetabolische Aktivierung notwendig, meist mit einem Rattenlebergemisch (S-9)Tests sind auch möglich um Schutzeffekte nachweisen zu können (siehe nächste Folie)
Wo werden Tierversuche - in vitro Methoden eingesetzt
Ersatz von Tierversuchen
Toxikologie (Giftigkeitsprüfungen)
• akute orale Toxizität (akute, orale Giftigkeit) • Schleimhautverträglichkeit• Hautverträglichkeit • Phototoxizität (Schädigung der Haut nach Einwirkung
von Licht) • Reproduktionstoxizität (schädigende Wirkung auf die
Frucht und die Nachkommen) • Mutagenität/Kanzerogenität (erbgutverändernde
und krebserregende Eigenschaften
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Akute orale Toxizität (akute, orale Giftigkeit)
TV: Akute, orale Toxizität: Bei dem so genannten LD50-Test (= tödliche Dosis bei 50% der Tiere) wird eine Substanz in verschiedenen Dosen, meist an Ratten oder Mäusen, aber auch Hunden oder Affen per Magensonde verabreicht.
Rindersamen-Test: Die zellschädigende Wirkung von Giften kann an Rindersamen getestet werden, indem, nach Zugabe der Substanz, Beweglichkeit, Sauerstoffverbrauch und Energiestatus bestimmt werden. Der Test ist schnell, billig, empfindlich und reproduzierbar. Er hat allerdings nur eine begrenzte Aussagekraft - vorwiegend in Kombination mit anderen in vitro Systemen. Säuger-Zellkulturen: Menschliche oder andere Säuger-Zellkulturen reagieren sehr empfindlich und sterben bei Zugabe von giftigen Stoffen ab. Die Substanzmenge, bei der die Hälfte der Zellen stirbt, wird als IC50 (mittlere inhibitorische Konzentration) angegeben. Auf diese Weise lassen sich verlässliche Daten für die Verbrauchersicherheit an schmerzfreier Materie gewinnen. Hefe-Test: Das Zellwachstum von Bier- oder Bäckerhefe wird durch Zugabe giftiger Substanzen gehemmt. Nach Auszählung der Hefezellen wird der IC50 errechnet. Dieser Test ist einfach und bequem durchführbar, extrem kostengünstig, ausgezeichnet reproduzierbar und zeigt eine gute Korrelation mit bekannten LD50 Werten.
Schleimhautverträglichkeit:TV: Draize Test
Leuchtbakterientest: Die Fähigkeit bestimmter Bakterien zu leuchten, lässt Rückschlüsse auf ihren Stoffwechselzustand zu. Bei Zugabe von reizenden oder ätzenden Substanzen wird der Stoffwechsel geschädigt und die Leuchtkraft somit vermindert. Einsatz im Bereich der Überprüfung der Aquatoxizität (Wassergiftigkeit) Roter-Blutkörperchen-Test: Die in Waschmitteln und anderen Haushaltsprodukten enthaltenen Tenside schädigen die Membran von roten Blutkörperchen. Starke Schädigung führt zur HämolyseHET-CAM-Test: Als Testorgan wird die direkt unter der Schale eines bebrüteten Hühnereis liegende Haut, die Venen und Arterien, aber keine Nerven enthält, verwendet. Die zu testende Substanz wird auf die Haut geträufelt und die Reaktion beobachtet. Der HET-CAM-Test wurde validiert und zusammen mit dem Neutralrot-Aufnahme-Test von den deutschen Behörden sowie der EU als Vorstufe für den Draize-Test anerkannt. Neutralrot-Aufnahme-Test (NRU-Test: Lebende, voll funktionstüchtige Zellen einer permanenten Mäuseembryo-Zellinie sind in der Lage den Farbstoff Neutralrot aufzunehmen. Werden sie durch Zugabe von irritierenden Stoffen geschädigt, kann der Farbstoff nicht in die Zelle eindringen. Die Anzahl der angefärbten Zellen gilt als Maß für die reizenden Eigenschaften einer Testsubstanz.
TV: Tiere, meist Nager, werden mit der Testsubstanz gefüttert und später getötet, um ihre Zellen auf DNA-Veränderungen zu untersuchen.
Ames-Test: Wenn Bakterien wie Salmonella typhimurium auf Nährböden ohne ein bestimmte Aminosäure angezüchtet werden, mutieren sie zu einer Abart, die ohne diese Aminosäure auskommt. Gibt man nun eine erbgutschädigende (mutagene) Substanz hinzu, wird in dem Bakterium „das Bedürfnis“ nach der Aminosäure wiederhergestellt. Mit dem nach seinem Entdecker benannten, 1972 beschriebenen Ames-Test, können mögliche mutagene Eigenschaften von Chemikalien schnell und billig identifiziert werden.
Zellkulturen: Erbgutveränderungen lassen sich in permanenten Zellkulturen von Säugetieren, z.B. mit Mäusetumorzellen oder Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, überprüfen.
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AMES-TEST
Genmutationen mit Salmonella
typhimurium Stämmen
Prinzip:Histidin-abhängige Stämme können durch Behandlung mit einer mutagenen Substanz zur prototrophen Form revertieren (Ames et al 1973). Die Anzahl der Revertantenkolonien ist ein Maß für das mutagene Potential dieser Substanz.
Prüfen, ob ein Stoff gentoxisch ist →mutagene Reaktionen verändern die genetische Information
Annahme: Mutagene Stoffe sind kanzerogen → schädlich, lösen Krebs ausEtwa 90% der mutagenen Stoffe sind kanzerogenEtwa 90% der kanzerogenen Stoffe sind mutagen
AMES-TEST
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Kolonien auf histidinfreiemMedium→was ist passiert?Stoff wirkt mutagen →Bakterien können „rückmutieren“ und Histidinwieder synthetisieren.
Sogenannte His-Revertanten können sich dann wieder vermehren
AMES-TEST
AMES-TEST
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DURCHFÜHRUNG
SalmonellaTyphimurium(~108 Bakterien)
100µl
Testsubstanz(Tocopherole+Mutagen)
100µl 500µl
S9-Mix
2ml Top Agar mitBiotin
Minimal Glucose Agar
Auszählen der revertanten Kolonien
37°C; 48h
(Mortelsmann,Zeiger; 2000)
AMES-Test – Antioxidativer Schutz gegenüber oxidativ induzierten Mutationen
(modifiz. nach Göggelmann, 1993)
t-BOOH bzw. H2O2
+
Tocopherole GM-Agar
Bakterienkultur
S9-Mix (optional)
Top-AgarHIS+-Revertanten
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Impfstoffe (müssen laufend, jede Charge, einer Prüfung unterzogen werden)
TV: Reinheits- und Unschädlichkeitsprüfung: anomale Toxizität und Pyrogentests
Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (LAL): Eine Lösung aus blutkörperchenähnliche Zellen des Pfeilschwanzkrebses reagiert sehr empfindlich auf fieberauslösende Stoffe – sie geliert. Die Körperflüssigkeit mit den Zellen wird den Krebsen abgezapft und dann als kommerzieller Fertigtest vertrieben.
Pyrocheck: Ganz ohne Tiere kommt dieser Fiebertest mit menschlichen weißen Blutkörperchen aus. Diese schütten den Botenstoff Interleukin-1 aus, wenn sie mit fieberauslösenden Bakterienbestandteilen in Berührung kommen. Die Menge des Interleukins-1 kann gemessen werden
Impfstoffe (müssen laufend, jede Charge, einer Prüfung unterzogen werden)
Research FoundationSwitzerland
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Impfstoffe (müssen laufend, jede Charge, einer Prüfung unterzogen werden)
Research FoundationSwitzerland
Herkunft: Material aus klinisch notwendigen Operationen, Organspenden, Plazenten, Tumorzellen.
Vorteil/Nachteil: Bei in vitro Systemen mit Tierzellen besteht für viele wissenschaftliche Fragestellungen das Problem der Übertragbarkeit von Resultaten auf die Verhältnisse beim Menschen. Deshalb sind Humanzellen das ideale Material zur Gewinnung von Erkenntnissen am Menschen. Keine gute Aussage über die Bioverfügbarkeit
Ethischer Aspekt: Bei Verwendung von Humanmaterial muss kein Tier leiden oder sterben.
Problem: Organisatorischer Aufwand ist beträchtlich, da das Material umgehend aus dem Operationssaal in das in vitro Labor gebracht werden muss. Erfordert hohe Koordination und optimale Zusammenarbeit zwischen Kliniken und Labor. Viele Publikationen mit humanen Zellen zeigen aber, dass sich diese Probleme überwinden lassen und zu sehr wichtigen Erkenntnissen führen.
In vitro Systeme mit menschlichen Zellen und Geweben:
