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Biochemische und zellbiologische Untersuchung des ... · Bei Thymosin beta 4 (TB4) handelt es sich...

Date post: 04-Jun-2018
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Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Bei Thymosin beta 4 (TB4) handelt es sich um ein kleines intrinsisch unstrukuriertes Protein (IUP), dessen funktionelle Domänen bisher nicht eindeutig geklärt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde TB4 auf proteinbiochemischer und zellbiologischer Basis charakterisiert. Dazu wurde zur Kontrolle ein randomisiertes Peptid – scrambled-TB4 (scTB4) – eingesetzt, welches die selbe AS-Zusammensetzung und somit auch den gleichen pI aufweist wie TB4. Beide Peptide wurden zuerst mittels bioinformatischer Methoden hinsichtlich ihrer Ausprägung von definierten Sekundärstrukturen untersucht. Hier zeigte sich, dass sowohl TB4 als auch scTB4 typische Anzeichen eines IUPs aufweisen. Zur in vitro Untersuchung der Peptide wurden diese durch Klonierung mit einem C- terminalen 6xHis-Tag fusioniert und unter die Regulation des T7lac-Promotors gestellt. Diese Strategie erlaubte die prokaryotische Überexpression in E. coli, Stamm BL21 mit nachfolgender Aufreinigung und Aufkonzentrierung. Auf diese Weise konnten hochreine Proteinkonzentrate der Peptide TB4-HIS und scTB4-HIS gewonnen werden, die in biochemischen Versuchen genutzt wurden. Native Aktin-Bindungsstudien zeigten, dass nur TB4-HIS an G-Aktin binden kann und dessen Polymerisation inhibiert. Diese Daten zeigten eine korrekte Funktionalität des prokaryotisch überexprimierten TB4-HIS an. In Aktin-Bindungsstudien, in denen der chemische Quervernetzer 1-Ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl]carbodiimid (EDC) eingesetzt wurde, war es möglich, neben TB4 auch scTB4 mit G-Aktin zu verbinden. Die quervernetzten Komplexe konnten sowohl via SDS-Gel als auch über Western Blot Analysen nachgewiesen werden. Diese Befunde legen die Beteiligung eines fundamentalen biophysikalischen Parameters bei der Aktin-Bindung von TB4 nahe, der nicht sequenzspezifisch ist. Konkret kommt hier der pI der Peptide in Betracht. Die Quervernetzungsstudien und Pulldown-Assays mit Extrakten von HeLa-Zellen zeigten leider kein distinktes Bandenmuster bei Einsatz von TB4-HIS. Sowohl TB4-HIS als auch das photoaktivierbare ANP-TB4-HIS zeigten eine hohe Tendenz zur Aggregation und Ausbildung 96
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Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Bei Thymosin beta 4 (TB4) handelt es sich um ein kleines intrinsisch unstrukuriertes Protein

(IUP), dessen funktionelle Domänen bisher nicht eindeutig geklärt sind. Im Rahmen dieser

Arbeit wurde TB4 auf proteinbiochemischer und zellbiologischer Basis charakterisiert. Dazu

wurde zur Kontrolle ein randomisiertes Peptid – scrambled-TB4 (scTB4) – eingesetzt,

welches die selbe AS-Zusammensetzung und somit auch den gleichen pI aufweist wie TB4.

Beide Peptide wurden zuerst mittels bioinformatischer Methoden hinsichtlich ihrer

Ausprägung von definierten Sekundärstrukturen untersucht. Hier zeigte sich, dass sowohl

TB4 als auch scTB4 typische Anzeichen eines IUPs aufweisen.

Zur in vitro Untersuchung der Peptide wurden diese durch Klonierung mit einem C-

terminalen 6xHis-Tag fusioniert und unter die Regulation des T7lac-Promotors gestellt. Diese

Strategie erlaubte die prokaryotische Überexpression in E. coli, Stamm BL21 mit

nachfolgender Aufreinigung und Aufkonzentrierung. Auf diese Weise konnten hochreine

Proteinkonzentrate der Peptide TB4-HIS und scTB4-HIS gewonnen werden, die in

biochemischen Versuchen genutzt wurden.

Native Aktin-Bindungsstudien zeigten, dass nur TB4-HIS an G-Aktin binden kann und dessen

Polymerisation inhibiert. Diese Daten zeigten eine korrekte Funktionalität des prokaryotisch

überexprimierten TB4-HIS an.

In Aktin-Bindungsstudien, in denen der chemische Quervernetzer 1-Ethyl-3-[3-

dimethylaminopropyl]carbodiimid (EDC) eingesetzt wurde, war es möglich, neben TB4 auch

scTB4 mit G-Aktin zu verbinden. Die quervernetzten Komplexe konnten sowohl via SDS-Gel

als auch über Western Blot Analysen nachgewiesen werden. Diese Befunde legen die

Beteiligung eines fundamentalen biophysikalischen Parameters bei der Aktin-Bindung von

TB4 nahe, der nicht sequenzspezifisch ist. Konkret kommt hier der pI der Peptide in Betracht.

Die Quervernetzungsstudien und Pulldown-Assays mit Extrakten von HeLa-Zellen zeigten

leider kein distinktes Bandenmuster bei Einsatz von TB4-HIS. Sowohl TB4-HIS als auch das

photoaktivierbare ANP-TB4-HIS zeigten eine hohe Tendenz zur Aggregation und Ausbildung

96

Zusammenfassung

von Multimeren, sodass eine Quervernetzung zu einem definierten Bindungspartner nicht

festgestellt werden konnte.

In Quervernetzungsstudien von TB4-HIS mit Aktin-Oligomeren – die als Nukleationskeime

eine wichtige Rolle bei der Aktinpolymerisation spielen – wurde gezeigt dass TB4-HIS mit

Aktin-Dimeren und -Trimeren interagieren kann. Darauf folgend wurde der Einfluss von

TB4-HIS auf die Reaktionskinetik der Aktinpolymerisation bei Einsatz von von Aktin-

Dimeren, -Trimeren und -Tetrameren untersucht. Hier zeigte TB4-HIS nur einen klaren

Einfluss auf die Aktinpolymerisation bei Anwesenheit von Dimeren, der sich

überraschenderweise in einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit äußerte.

Zur zellbiologischen Untersuchung wurden durch Klonierung C-terminale Fusionskonstrukte

der Peptide TB4 und scTB4 mit kleinen Epitop-Tags hergestellt und unter die Regulation des

CMV-Promoters gestellt. Es wurden Plasmide zur eukaryotischen Expression der Peptide

TB4-HIS, TB4-HA und scTB4-HA erhalten, die eine erfolgreiche Überexpression in den

Zelllinien HeLa, NRK und HEK ermöglichten.

Die in vivo Transfektionsassays zeigten ein uneinheitliches Bild hinsichtlich der zellulären

Lokalisation der Konstrukte in den verschiedenen Zelllinien. Sowohl in HeLa- als auch in

NRK-Zellen konnten die TB4-Konstrukte mittels immunzytochemischer Färbungen sowohl

im Zytoplasma als auch im Zellkern nachgewiesen werden. Demgegenüber konnten diese

nicht – bzw. nur sehr wenig – im Nukleus von HEK-Zellen gefunden werden. Die Färbung

des scTB4-HA war hingegen bei allen drei Zelllinien homogen in der Zelle verteilt und

umfasste sowohl das Zytoplasma als den Zellkern.

Die Befunde der intrazellulären Verteilung legen eine sequenzabhängige und spezifische

subzelluläre Lokalisation von TB4 nahe. Die unterschiedliche nukleäre Verteilung basiert

möglicherweise auf einer Bindung von TB4 an einen Bindungspartner bzw. nukleären

Exportfaktor, der in HEK-Zellen vorhanden oder aktiver ist als in HeLa- und NRK-Zellen.

Eine vergleichende Transkriptom- und Proteomanalyse der drei Zelllinien mit einer

Fokussierung auf nukleäre Import- und Exportfaktoren könnte hier in Zukunft Klarheit

bringen und helfen neue Bindungspartner von TB4 zu identifizieren.

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