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Aus dem
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes
Dexamethason hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Maren Irina Milewski aus Münster
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. h. c. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2006
Ein Tag wie dieser,
eine Stunde wie jene,
ein Moment wie immer
und doch ein guter Augenblick zu sagen:
Dank all denen, die mich stetig unterstützten
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
® eingetragenes Warenzeichen
°C Grad Celsius
% Prozent
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µmol Mikromol
a Fehlerwahrscheinlichkeit
A2 Arzneistoffmenge im peripheren Kompartiment
Abb. Abbildung
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization
AUC Area under the curve
AUC e.v. Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach extravasaler
Applikation
AUC i.v. Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach intravenöser
Applikation
AUC Standard Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Standardpräparates
AUC Test Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Testpräparates
ß Hybridkonstante
bzw beziehungsweise
C chemisches Symbol für Kohlenstoff
C Wirkstoffkonzentration
C(Grenze) Wirkstoffkonzentration des Grenzwertes
C0 Anfangskonzentration eines Arzneistoffes im Plasma
ca. circa
CBG Cortisol binding globulin
CI Chemische Ionisation
CL Clearance
CLNR extrarenale Clearance
CLR renale Clearance
Abkürzungsverzeichnis
cm Zentimeter
C(max) maximale Wirkstoffkonzentration
CRF Corticotropin-Releasing-Faktor
CRH Corticotropin-releasing hormone
Css Steady-State-Konzentration
D im Körper vorhandenen Gesamtarzneistoffmenge
dc/dt Eliminationsrate, ausgeschiedene Wirkstoffmenge pro Zeit
DIN Deutsche Industrie Norm
DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen
d.h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
DSB Deutscher Sportbund e.V.
e.V. eingetragener Verein
EHSLC European Horserace Scientific Liaison Committee
EI Elektronen-Stoß-Ionisation (electron impact)
ELISA Enzym-linked Immunosorbent Assey
EPC effektive Plasmakonzentration
ESI Elektrospray-Ionisation
et al et alii
f Freiheitsgrade der linearen Kalibration
f absolute Bioverfügbarkeit
FAL Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft, Mariensee
FN Federation Equestre International
f r relative Bioverfügbarkeit
g Gramm
h Stunde
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HQC High Qualitiy Control Standard
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen e.V.
i.m. intramuskulär
i.v. intravenös
IPC irrelevante Plasmakonzentration
IS interner Standard
Abkürzungsverzeichnis
IUC irrelevante Urinkonzentration
k12 Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere
Kompartiment
k13 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante für das zentrale Kompartiment
k 21 Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale
Kompartiment
ke Eliminationskonstante
kel Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
kg Kilogramm
KGW Kilogramm Körpergewicht
Konz. Konzentration
l Liter
LC-MS Liquid Chromatographie mit angeschlossenem Massenspektrometer
ln natürlicher Logarithmus
LOD Limit of detection
LOQ Limit of quantification
LPO Leistungsprüfungsordnung
LQC Lower quality Control Standard
m/z Masse zu Ladung Verhältnis
MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation
max maximal
MeOH Methanol
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mmol Millimol
mol Mol
MQC Midrange Quality Control Standard
MRM Multi Reaction Monitoring
mRNA messenger Ribonucleinsäure
MS Massenspektrometrie
MS/MS Tandem–Massenspektrometer
MW Mittelwert
Abkürzungsverzeichnis
n Anzahl der Proben
n.g. nicht gemessen
n.n. nicht nachweisbar
NADA Nationale Anti Doping Agentur
ng Nanogramm
NG Nachweisgrenze
nm Nanometer
Nr. Nummer
NRHA National Reining Horse Association
pg Picogramm
pH-Wert negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PK/PD Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Modell
prä appl. prä applikationem
Qx Summe der Abweichungsquadrate
R ² Regressionskoeffizient
RE relativer Fehler
rpm Umdrehungen pro Minute
s² Varianz
sb Zwischenpräzision
sec Sekunde
Std Stunde
sw Wiederholpräzision
sxo Reststandardabweichung
t 0,5 Halbwertszeit
t A Ausscheidungszeit
t A(Grenze) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen eines Grenzwertes
t f, a vorgegebener Tabellenwert
Tab. Tabelle
TBME tertiär Butylmethylether
TINV (α; f ) t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen des Freiheitsgrades (f) sowie
der Fehlerwahrscheinlichkeit (α)
u.a. und andere
UV Ultraviolett
V1 Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment
Abkürzungsverzeichnis
V2 Verteilungsvolumen im peripheren Kompartiment
VB Vertrauensbereich (Konfidenzinterval)
VB0 Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null
Vd Verteilungsvolumen
Vdß Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady-State
Vss Verteilungsvolumen im Steady-State
X Mittelwert
z. B. zum Beispiel
ZNS Zentralnervensystem
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
I. Einleitung 15
II. Literaturübersicht 16
1. Definition des Dopings 16
2. Formen des Dopings 16
3. Verdachtssymptome für Doping 17
4. Angaben zum European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC) 18
5. Pharmakokinetik und Pharmakodynamik 20
5.1. Pharmakokinetik 20
5.2. Pharmakodynamik 28
6. Glucocorticoide 30
6.1. Physiologie und Sekretion von Glucocorticoiden 30
6.2. Cortisol 31
6.3. Herstellung synthetischer Glucocorticoide 32
6.4. Dexamethason 33
6.5. Pharmakokinetik synthetischer Glucocorticoide 34
6.6. Pharmakodynamische Wirkung von Glucocorticoiden 36
6.7. Glucocorticoidester 40
6.7.1. Einteilung der Glucocorticoidester 40
6.7.2. Dexamethason-21-isonicotinat 41
7. Dexamethason als Dopingsubstanz 43
8. Prinzip der HPLC als Analyseverfahren 44
III. Material und Methoden 48
1. Versuchsaufbau 48
1.1. Testsubstanzen 48
1.2. Versuchstiere 49
Inhaltsverzeichnis
1.3. Versuchsablauf 50
1.3.1. Vorversuch 50
1.3.2. Hauptversuch 50
1.4. Probenaufbereitung und Probenlagerung 53
2. Aufbereitung der Plasma- und Urinproben 54
3. Methodenentwicklung 54
3.1. Chemikalien 54
3.2. Herstellung von Standardlösungen 55
3.3. Wahl und Herstellung des internen Standards 56
3.4. Entwicklung der angewandten Methoden 56
3.5. Chromatographie/HPLC 57
3.6. Hydrolyseversuche Urin 58
3.7. Bewertung der Methodenentwicklung 59
4. Methodenvalidierung 60
4.1. Selektivität 60
4.2. Linearität 61
4.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze 62
4.4. Richtigkeit 63
4.5. Präzision 64
4.6. Stabilität 65
4.7. Wiederfindung 66
5. Aufbereitung der Plasma- und Urinproben des Hauptversuches 67
5.1. Aufarbeitung Plasmaproben (mit täglichen Kalibrationskurven) 67
5.2. Aufarbeitung Urinproben (mit täglichen Kalibrationskurven) 68
6. Messung von Cortisol, Glucose und Kreatinin 69
6.1. Messung von Cortisol 69
6.2. Messung von Glucose 70
6.3. Messung von Kreatinin 70
7. Statistische Auswertung 71
IV. Ergebnisse 72
1. Ergebnisse der Analysemethoden 72
1.1. Massenspektrum von Dexamethason 72
1.2. Massenspektrum von Fluocortolon 73
Inhaltsverzeichnis
2. Validierung der Analysemethoden 73
2.1. Selektivität 73
2.2. Linearität 75
2.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze 77
2.4. Richtigkeit 77
2.5. Präzision 78
2.6. Stabilität 79
2.7. Wiederfindung 81
3. Überprüfung der Urinaufarbeitung 82
4. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason 83
4.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason 83
4.1.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach
Voren® Suspension-Applikation 83
4.1.2. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach
Voren®-Depot-Applikation 85
4.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason 87
4.2.1. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach
Voren® Suspension-Applikation 87
4.2.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach
Voren®-Depot-Applikation 88
5. Plasmakonzentrationen von Cortisol und Glucose 90
5.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol 90
5.1.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach
Voren® Suspension-Applikation 90
5.1.2. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach
Voren®-Depot-Applikation 91
5.2. Plasmakonzentrationen von Glucose 93
V. Diskussion 96
1. Eignung der gewählten Analysemethoden 96
2. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason 98
2.1. Plasmakonzentrationen 98
2.2. Urinkonzentrationen 103
2.3. Pharmakokinetische Berechnungen 106
Inhaltsverzeichnis
3. Beeinflussung des Cortisolspiegels durch Dexamethason 108
4. Beeinflussung des Glucosespiegels durch Dexamethason 112
5. Vergleichende Bewertung der erzielten Ergebnisse 113
6. Bewertung der Ergebnisse bezüglich ihrer Dopingrelevanz 115
VI. Zusammenfassung 123
VII. Summary 125
VIII. Literaturverzeichnis 127
IX. Tabellenverzeichnis 146
X. Abbildungsverzeichnis 151
XI. Anhang 156
Einleitung
15
I. Einleitung
In den letzten Jahren findet das Thema Doping im Pferdesport gesteigerte Beachtung. Dies
bedeutet, dass speziell im Bereich therapeutisch eingesetzter Medikamente bei Sport– und
Rennpferden eine Verbesserung des Kenntnisstandes und des Datenmaterials bezüglich
Pharmakokinetik, Nachweisdauer und Eliminationszeiten der verwendeten Arzneistoffe
erzielt werden muss, um positive Dopingbefunde nach einer notwendigen
Arzneimittelapplikation zu vermeiden.
Die Relevanz der hier beschriebenen Studie zeigt sich darin, dass sowohl der Kenntnisstand
als auch verfügbare Daten über den Wirkstoff Dexamethason, ein vielfach eingesetztes
Glucocorticoid, bezüglich der oben erwähnten Gesichtspunkte unzureichend und lückenhaft
sind. Praktisch tätige Tierärzte können insbesondere bei der Behandlung von Sportpferden
nicht mit eindeutiger Sicherheit eine Aussage darüber machen, wann ein Sportpferd nach
vorheriger Verabreichung eines Medikamentes, in diesem Fall Dexamethason, wieder in
einem Wettkampf eingesetzt werden darf. Den Tierärzten müssen geeignete Daten und
Informationen über die Nachweiszeiten eines Wirkstoffes und seiner Abbauprodukte zur
Verfügung gestellt werden, damit eine tierärztliche Betreuung nicht gegen die bestehenden
Dopingreglementierungen der einzelnen Pferdesportverbände verstößt. Dopingrichtlinien im
Pferdesport sollen einen fairen Wettkampf gewährleisten, das Wohlergehen des Pferdes
schützen und die Pferdezucht vor einem Wertverlust bewahren. Auch fordern das
Tierschutzgesetz, sowie auch die erwähnten Dopingreglementierungen, dass zum Turnier-
oder Rennzeitpunkt keine leistungsbeeinflussenden und damit dopingrelevanten Substanzen
nachgewiesen werden dürfen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Ausscheidungsverhalten von Dexamethason an Pferden
untersucht werden. Plasma- und Urinproben der an der Studie beteiligten Pferde wurden
gewonnen, und anschließend im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule in
Köln mit einer vorher entwickelten Methode untersucht. Neben der Bestimmung der
Dexamethasonkonzentrationen wurden auch die Konzentrationen von Cortisol und Glucose
erfasst, um die Wirkung von Dexamethason auf diese Parameter genauer zu untersuchen.
Mit Hilfe dieser Untersuchungen sollte zum einen geprüft werden, ob Aussagen zu
Ausscheidungszeiten beziehungsweise Absetzfristen für den Arzneistoff Dexamethason
gemacht werden können, zum anderen sollte am Beispiel von Dexamethason versucht
werden, einen Ansatz für ein mögliches Lösungsmodell für die Stoffgruppe der
Glucocorticoide hinsichtlich ihrer Dopingproblematik zu bieten.
Literaturübersicht
16
II. Literaturübersicht
1. Definition des Dopings
Nach UNGEMACH (1985) ist Doping als die Verabreichung eines jeden Mittels an Mensch
oder Tier definiert, das geeignet ist, die aktuelle und natürliche Leistungsbereitschaft, in
diesem Falle eines Pferdes, zum Rennzeitpunkt zu verändern. Eine Verabreichung eines
solchen Mittels ist verboten. Ebenfalls verboten ist die Verabreichung von Mitteln, welche
den Nachweis verbotener Substanzen beeinträchtigen können (KLUGE, 2002). KLUGE
(2002) verdeutlicht weiterhin, dass ein Pferd als gedopt zu bezeichnen ist, wenn bei den
Dopingkontrollen eine beliebige Menge einer verbotenen Substanz oder einer ihrer
Metaboliten im Gewebe oder in den Körperflüssigkeiten nachgewiesen wird. Insbesondere
sind die in den Dopinglisten der einzelnen Pferdesportverbände aufgeführten Substanzen
verboten, die ihre pharmakologischen Wirkungen direkt oder indirekt als Haupt- oder
Nebenwirkung entfalten (KLUGE, 2002). Zu erwähnen sind hier vor allem die Angaben der
Deutschen Reiterlichen Vereinigung (FN) in der Leistungsprüfungsordnung (LPO), dem
Regelwerk für den Deutschen Turniersport in der Fassung vom 1. Januar 2004, die
Rennordnung des Direktoriums für Vollblutzucht des Jahres 2002, sowie die Satzung und
Ordnung des Hauptverbandes für Traber-Zucht und -Rennen e.V. (HVT), welche am
01.02.2003 ihre Gültigkeit erlangte. Eine detaillierte Ausführung und vergleichende
Gegenüberstellung dieser soeben erwähnten Regelwerke erfolgte bereits durch HAMMER
(2004).
2. Formen des Dopings
Die unerlaubte Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit kann im
Pferdesport unter verschiedenen Zielsetzungen erfolgen. UNGEMACH u. NÜRNBERGER
(1999) treffen folgende Einteilung:
1. Doping auf Sieg (akute, chronische, paradoxe Form)
2. Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit
3. Doping mit körpereigenen Substanzen
4. Physikalisches Doping
Literaturübersicht
17
5. Doping auf Niederlage
6. unabsichtliches Doping
7. Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises
Die unter Punkt eins bis vier erwähnten Formen werden laut UNGEMACH u.
NÜRNBERGER (1999) auch als positives Doping zusammengefasst, Doping auf Niederlage
ist dagegen negatives Doping. Neben diesen beiden am häufigsten vorkommenden
Dopingarten finden sich auch Fälle von unabsichtlichem Doping sowie die Anwendung von
Maßnahmen, die den Dopingnachweis erschweren. Fälle von unbeabsichtigtem Doping
beruhen meist auf der Unkenntnis über die Pharmakologie bzw. die Pharmakokinetik eines
verabreichten Stoffes (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Als Maßnahmen zur
Erschwerung des Dopingnachweises werden Mittel eingesetzt, die die Diurese steigern
(SCHOENE, 1996).
Der in dieser Arbeit zu untersuchende Wirkstoff Dexamethason fällt nach beabsichtigter
Applikation aufgrund seiner pharmakologischen Eigenschaften unter den Gesichtspunkt
„Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit“. Jedoch sind aufgrund von
unzureichender Kenntnisse bezüglich Pharmakokinetik, Nachweisdauer und
Eliminationszeiten von Dexamethason auch Fälle von „unabsichtlichem Doping“ zu finden.
3. Verdachtssymptome für Doping
Bei Pferdesportveranstaltungen, Pferderennen und Turnieren erfolgt die Auswahl der zu
beprobenden Pferde für die in den Reglementierungen der jeweiligen Verbände
vorgeschriebenen Dopingkontrollen nach dem Zufallsprinzip oder auf begründeten Verdacht.
Die Kontrollen erfolgen durch den zuständigen Turnier- oder Rennbahntierarzt.
UNGEMACH u. NÜRNBERGER (1999) fassen in Tabelle 1 klinisch feststellbare Symptome
bzw. Anzeichen dafür, ob ein Pferd gedopt ist, und die jeweils mögliche ursächliche
Manipulation zusammen.
Literaturübersicht
18
Klinische Symptome Mögliche Manipulation Lokale Schwellungen, Einstichstellen, Schweißflecken
Injektion
Unkontrollierte Reaktionen, Unruhe, Übererregbarkeit
Psychoanaleptika
Zwangsbewegungen Weckamine Ängstlichkeit, Schnauben Apomorphin Sedation Ataraktika, Neuroleptika Ganganomalien Opioide Hyperthermie Weckamine Hypothermie Neuroleptika erhöhte Puls- und Atemfrequenz Psychoanaleptika Salivationshemmung Weckamine Hemmung der Schweißsekretion Opioide Penisvorfall Neuroleptika Mydriasis Weckamine, Opioide Harnverhalten Opioide, Neuroleptika Hengstigkeit bei Stuten Anabolika sprunghafte Formverbesserung Analgetika, Glucocorticoide Außenseitersieg, fehlende Ermüdung Psychoanaleptika, Opioide Tabelle 1: klinische Verdachtssymptome und mögliche Manipulation für Doping bei Pferden
(nach UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999)
4. Angaben zum European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC)
Wie von der INTERNATIONAL FEDERATION OF HORSERACING AUTHORITIES
(2005) dargelegt, lässt sich die Entwicklung sowie die Zielsetzung des EHSLC wie folgt kurz
beschreiben:
Im Jahr 1991 diskutierten Rennsportvereinigungen aus Frankreich, Großbritannien und Irland
eine Strategie, um potentiellen Problemen im Hinblick auf den Gebrauch von verbotenen
Substanzen entgegen treten zu können. Sie entschieden sich für eine Verbesserung von
Kooperation und Zusammenarbeit bezüglich der Dopingproblematik im Pferdesport.
Aus dieser Idee heraus wurde 1992 das European Horserace Scientific Liaison Committee
(EHSLC) gegründet. 1999 traten auch Deutschland und Italien dem EHSLC bei.
Ziele des EHSLC sind es, das technische Vorgehen und die Vorschriften von
Dopingkontrollen zu harmonisieren, die Zusammenarbeit der beteiligten Nationen im
Hinblick auf Vermeidung von Dopingfällen zu verbessern, sowie ein länderübergreifendes
Forum zum Informationsaustausch zu schaffen. Meinungen und Sichtweisen bezüglich
Dopingkontrollen sollen vereinheitlicht werden, so dass ein gemeinsamer Standpunkt
Literaturübersicht
19
repräsentiert werden kann (EHSLC, 1997). Übergeordnete Absicht ist es, eine einheitliche
Basis zu schaffen, so dass jedes Pferd, in welchem dieser fünf Länder es auch immer an den
Start geht, samt seiner Belange in der gleichen Art und Weise behandelt wird (EHSLC, 1997).
Vertreter der zum EHSLC gehörigen Nationen sowie die Laboratorien des Jockey Clubs
Hongkong und des Jockey Clubs von Südafrika befassen sich mit genau dieser Thematik.
Hierzulande wird durch Zusammenarbeit des European Horserace Scientific Liaison
Committee (EHSLC) und der Deutschen Reiterlichen Vereinigung (FN) ein Schritt in diese
Richtung ermöglicht. Mittels einheitlich aufgebauter pharmakologischer Studien soll,
ergänzend zu den bisher üblichen Untersuchungen auf Vorhandensein von dopingrelevanten
Substanzen, versucht werden, pharmakologische Effekte von therapeutisch eingesetzten
Substanzen zu kontrollieren. Diese Kontrolle erfolgt in Form von Festlegung einer Grenze, ab
der die untersuchte Substanz keine Wirkung mehr hat. Ein geeignetes Modell zur
pharmakologischen und pharmakokinetischen Bewertung eines Wirkstoffes wurde von
TOUTAIN u. LASSOURD (2002) vorgeschlagen. Dieses Pharmakokinetik-
Pharmakodynamik-Modell (PK/PD-Modell) basiert auf der Berechnung einer effektiven
Plasmakonzentration (EPC) eines Stoffes. Mittels Umrechnung der effektiven
Plasmakonzentration wird eine ineffektive und somit irrelevante Plasmakonzentration (IPC)
bestimmt. Die Umrechnung erfolgt mit Hilfe eines Sicherheitsfaktors. Dieser
Sicherheitsfaktor von 500 ergibt sich aus einem Faktor 50, der EPC in IPC umrechnet,
multipliziert mit einem Faktor 10, welcher die individuellen Unterschiede des Einzeltiers mit
einbezieht. Aus der so errechneten irrelevanten Plasmakonzentration wird wiederum eine
irrelevante Urinkonzentration (IUC) abgeleitet. Dieses PK/PD-Modell wurde bereits für
verschiedene pharmakokinetische Studien bei Pferden angewandt (TOUTAIN u.
LASSOURD, 2003).
Pharmakokinetische Berechnungen nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN u. LASSOURD
(2002) sind im Falle der in dieser Studie behandelten Glucocorticoide nicht möglich, da ihre
Wirkung, wie später noch detailliert beschrieben, erst „zeitversetzt“ eintritt.
Literaturübersicht
20
5. Pharmakokinetik und Pharmakodynamik
5.1. Pharmakokinetik
Die Pharmakokinetik beschäftigt sich mit den Einflüssen des Organismus auf das Pharmakon
(DOST, 1968). Sie beschreibt Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und Ausscheidung
eines Pharmakons in Abhängigkeit von der Zeit. Nach KOCH u. RITSCHEL (1986) fallen
unter den Gesichtspunkt der Invasion, und somit des Eindringens des Pharmakons in den
Organismus, die Begriffe der Liberation, der Resorption und der Distribution, während die
Evasion bzw. die Ausscheidung des Pharmakons mittels der Begriffe der Metabolisierung und
der Elimination beschrieben wird.
Die Invasion beginnt demnach mit der Liberation, der Freisetzung des Wirkstoffes aus der
Arzneiform, welche im Wesentlichen durch die galenische Zubereitung bestimmt ist. Nach
erfolgter Freisetzung schließt sich, im Falle von nicht intravasaler Applikation, die Resorption
des Wirkstoffes in die Blut- oder Lymphbahn an. Ausmaß und Geschwindigkeit der
Resorption hängen von der Liberationsgeschwindigkeit des Wirkstoffes, der Applikationsart,
den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Arzneistoffes, der Stoffkonzentration am
Applikationsort sowie vom physiologischen Zustand des Patienten ab (KOCH u. RITSCHEL,
1986).
Nach PFEIFER et al. (1984) sind bei der Resorption durch die Biomembranen des
Organismus mehrere Transportmechanismen zu betrachten. Die passive Diffusion, eine reine
Lipiddiffusion, Diffusion bzw. Filtration durch Poren, der Carrier-vermittelte Transport, auch
aktiver Transport oder erleichterte Diffusion genannt, und der vesikuläre Transport mittels
Zytopempsis. Bezüglich der Resorptionsgeschwindigkeit unterscheidet man zwischen einem
Prozess 0. Ordnung und einem Prozess 1. Ordnung (KOCH u. RITSCHEL, 1986). Bei einer
Resorption 0. Ordnung wird eine konstante Menge des Pharmakons pro Zeiteinheit resorbiert.
Dies ist zum Beispiel bei Inhalationsnarkotika im Steady-State der Fall. Hingegen wird bei
einer Resorption 1. Ordnung pro Zeiteinheit nur eine bestimmte Fraktion des sich an der
Applikationsstelle befindlichen Pharmakons aufgenommen, z.B. bei oraler, subkutaner oder
intramuskulärer Applikationen. Abbildung 1 verdeutlicht die Formen der Resorptionskinetik.
Literaturübersicht
21
Zeit
Kon
zent
ratio
n
Zeit
Kon
zent
ratio
n
Abb. 1: Resorptionskinetik 0. Ordnung (links), Resorptionskinetik 1. Ordnung (rechts)
KOCH u. RITSCHEL (1986) definieren den Begriff der Bioverfügbarkeit als den Anteil eines
Arzneistoffes, der in den Blutkreislauf gelangt. Eine vollständige Bioverfügbarkeit liegt nach
intravenöser Applikation vor. Nach oraler und somit extravasaler Verabreichung beträgt die
Bioverfügbarkeit weniger als 100 % (FICHTL et al., 1996). Die Berechnung der
Bioverfügbarkeit erfolgt mit Hilfe der Fläche unterhalb der Plasmakonzentrationskurve (Area
Under the Curve, AUC), welche proportional zur Menge des Arzneistoffes ist.
Nach KOCH u. RITSCHEL (1986) vergleicht man die Fläche unter der Kurve des
Plasmakonzentrationsverlaufs (AUC) nach extravasaler (z.B. oraler) Applikation mit der
AUC nach intravenöser Applikation, um die absolute Bioverfügbarkeit (f) eines Arzneimittels
zu ermitteln.
f = i.v.e.v.
AUCAUC
f = absolute Bioverfügbarkeit
AUC e.v.= Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach extravasaler Applikation
AUC i.v.= Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach intravenöser Applikation
Die relative Bioverfügbarkeit (f r) ergibt sich aus dem Vergleich von zwei verschiedenen
Arzneimittelformulierungen bei identischer Applikationsart:
f r = Standard
Test
AUCAUC
f r = relative Bioverfügbarkeit
AUC Test = Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Testpräparates
AUC Standard = Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Standardpräparates
Literaturübersicht
22
Nach DOST (1968) erstreckt sich die Verteilung des Pharmakons auf das Plasma, den
Extrazellularraum, den Extra- und Intrazellularraum und auf die Anreicherung in bestimmten
Geweben. Stoffeigenschaften wie Lipophilie, Molekülgrösse, Plasma- und
Gewebsproteinbindung beeinflussen die Verteilung. Maßgebende Faktoren von Seiten des
Organismus sind die Organdurchblutung, die Durchlässigkeit von Membranen sowie die pH-
Wert-Verhältnisse der Gewebe.
Das Verteilungsvolumen beschreibt, in welchem Volumen sich ein Wirkstoff bei einer
gemessenen Konzentration verteilen würde. Es ist eine fiktive Größe und wird deswegen auch
als „scheinbares“ Verteilungsvolumen bezeichnet (GLADTKE u. VON HATTINGBERG,
1977). Mit Hilfe des Verteilungsvolumen (Vd), einem Proportionalitätsfaktor zwischen der im
Körper vorhandenen Arzneistoffmenge (D) und der Anfangskonzentration im Plasma (C0),
wird die Verteilung des Arzneistoffes auf die Körperkompartimente direkt nach der
Arzneimittelapplikation beschrieben (KOCH u. RITSCHEL, 1986).
Vd [l/kg] = ]/[]/[
lmgCkgmgD
�
Vd = Verteilungsvolumen
D = im Körper vorhandenen Arzneistoffmenge
C0 = Anfangskonzentration eines Arzneistoffes im Plasma
Wird eine definierte Menge eines Wirkstoffs intravenös appliziert, befindet sich die
verabreichte Dosis im Blut. Das initiale Verteilungsvolumen (Vd) ist also gering, bei einem
geringen Quotienten aus der Gesamtmenge (D) und einer initial hohen Plasmakonzentration
(C0).
Im weiteren Verlauf findet eine Verteilung des Wirkstoffes vom Blut in andere Gewebe statt,
was demzufolge auch zu einer Änderung des Quotienten Vd führt. Dieser wird größer. Nun ist
nur noch ein Teil der applizierten Gesamtmenge des Wirkstoffes im Plasma zu finden, so dass
das Verteilungsvolumen in der Verteilungsphase entsprechend größer ist als in der
Initialphase (FICHTL et al., 1996). Ein Vd > 1 [l/kg] kann für eine Anreicherung des
Pharmakons in bestimmten Geweben sprechen. Nach abgeschlossener Verteilung des
Pharmakons wird für kurze Zeit ein konstantes Verhältnis zwischen Gesamtmenge und
Plasmakonzentration erreicht. Dieser Gleichgewichtszustand zwischen Input und Output wird
auch als Steady-State (Vss) bezeichnet (KOCH u. RITSCHEL, 1986). Die Geschwindigkeit
Literaturübersicht
23
dieser Gleichgewichtseinstellung wird, wie später noch erklärt, durch
Geschwindigkeitskonstanten (k12 und k21) bestimmt, und nach folgender Formel berechnet:
Vss [l/kg] = )1(21
12
kk+
Vss = Verteilungsvolumen im Steady-State
k 12 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment
k 21 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment
Während der Elimination des Wirkstoffes aus dem zentralen Kompartiment kommt es dort zu
einer Abnahme der Konzentration. Der entstandene Konzentrationsgradient zwischen
peripherem und zentralem Raum bewirkt eine Diffusion des Wirkstoffes aus dem peripheren
in den zentralen Raum. Dieser Zustand wird auch als Pseudo-Steady-State bezeichnet
(DERENDORF et al., 2002), in welchem sich der Organismus wie ein Ein-Kompartiment-
Modell verhält. Der Plasmaspiegel fällt linear ab, was mit der Hybridkonstanten (ß)
beschrieben werden kann.
Das entsprechende scheinbare Verteilungsvolumens (Vdß) kann als Quotient aus Clearance
(CL) und der Hybridkonstanten (ß) beschrieben werden (DERENDORF et al., 2002):
Vdß [l/kg] = β
CL
Vdß = Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady-State
CL = Clearance
ß = Hybridkonstante
Im Rahmen der Metabolisierungsprozesse kommt es zum durch chemischen Umbau der
Ausgangsstoffe zur Verbesserung der Exkretionsfähigkeit, zum anderen zur Inaktivierung
oder Aktivierung von Ausgangsstoffen. Diese von FAIGLE (1981) beschriebenen Vorgänge
erfolgen als Phase 1-Reaktionen und Phase 2-Reaktionen. In der Phase 1-Reaktion kommt es
durch Oxidation, Reduktion und Hydrolyse zu Veränderungen am Molekül, so dass das
Molekül zu einer stärker polaren Verbindung wird (FAIGLE, 1981). Die Phase 2-Reaktion
dagegen vermittelt eine Konjugation bzw. eine Kopplung von Muttersubstanzen und den in
Phase 1-Reaktion entstandenen Verbindungen an Glucuronsäure, Schwefelsäure,
Carbonsäuren, Aminosäuren und Glutathion, wodurch eine verbesserte renale und biliäre
Literaturübersicht
24
Ausscheidung der nun unwirksamen Kopplungsprodukte erreicht wird. Diese Phase 1- und
Phase 2-Reaktionen finden hauptsächlich in der Leber statt.
Laut KOCH u. RITSCHEL (1986) gibt es mehrere Eliminationswege, z.B. den renalen, den
biliären, den intestinalen, den pulmonalen Weg sowie die Elimination über Speichel,
Schweiß, Milch und Eier. Die Elimination aus dem Organismus kann, ebenso wie die
Resorption, nach einem Prozess 0. Ordnung oder einem Prozess 1. Ordnung verlaufen
(KOCH u. RITSCHEL, 1986). Bei einer Elimination 0. Ordnung wird pro Zeiteinheit dieselbe
Menge eines Wirkstoffes eliminiert. Prozesse 1. Ordnung sind die Regel. Hierbei handelt es
sich um eine konzentrationsabhängige Elimination. Abbildung 2 stellt die beiden Arten der
Eliminationskinetik gegenüber.
Zeit
Kon
zent
ratio
n
Zeit
Kon
zent
ratio
n
Abb. 2: Eliminationskinetik 0. Ordnung (links), Eliminationskinetik 1. Ordnung (rechts)
Ein zentraler Begriff, der die Elimination beschreibt, ist die Clearance (CL). Sie beschreibt
die Fähigkeit eines Organismus einen Wirkstoff zu eliminieren (RETTING, 1981). Nach
DERENDORF et al. (2002) entspricht die totale Clearance dem Volumen einer
Körperflüssigkeit, welches vom Wirkstoff befreit wird. Der Quotient aus der Eliminationsrate
(dc/dt), welche die ausgeschiedene Wirkstoffmenge pro Zeit beschreibt, und der
Wirkstoffkonzentration (C) gibt an, welche Menge Plasma pro Minute von einer Substanz
vollständig befreit wird.
CL [ml/min] = ]/[
min]/[/mlmgC
mgdd tc
CL = Clearance
dc/dt =Eliminationsrate, ausgeschiedene Wirkstoffmenge pro Zeit
C = Wirkstoffkonzentration
Literaturübersicht
25
Die Eliminationsleistung wird, wie bereits erwähnt, hauptsächlich durch die Nieren und die
Leber geleistet. Man unterscheidet zwischen der renalen und der hepatischen Clearance
(FICHTL et al., 1996). Nach SAMS (1992) gibt die hepatische Clearance Aufschluss über die
Verstoffwechslung und Exkretion lipophiler Substanzen, wohingegen die renale Clearance für
die Elimination von hydrophilen Stoffen steht.
Die totale Clearance (CL) ergibt sich durch Summierung der renalen Clearance (CLR) und der
extrarenalen Clearance (CLNR), welche sich wiederum aus der hepatischen Clearance und der
Clearance aller anderen an der Elimination beteiligten Organe zusammensetzt.
Im Zuge der Elimination sei auch ein weiterer wichtiger Begriff erklärt, der die Ausscheidung
eines Pharmakons mitbestimmt, nämlich die Halbwertszeit (t 0,5) Als Halbwertszeit wird die
Zeit bezeichnet, nach der sich die Konzentration eines Pharmakons um die Hälfte ihres
ursprünglichen Ausgangswertes verringert hat (DERENDORF et al., 2002). Nach FREY
(2002) ist die Halbwertszeit eines Stoffes im Organismus proportional zum
Verteilungsvolumen (Vd) und umgekehrt proportional zur Clearance (CL), wobei
Verteilungsvolumen und Clearance voneinander unabhängige Parameter sind. Es besteht
folgende Beziehung:
t 0,5 [h] ~ CLVd
t 0,5 = Halbwertszeit
Vd = Verteilungsvolumen
CL = Clearance
Laut DERENDORF et al. (2002) ist eine Veränderung der Halbwertszeit auf eine
Veränderung der Clearance oder des Verteilungsvolumens zurückzuführen.
Weiterhin lässt sich die Halbwertszeit auch über die Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
(kel) ableiten. Die Eliminationsgeschwindigkeitskonstante (kel) beschreibt das Verhältnis
zwischen dem natürlichen Logarithmus von 2 und der Halbwertszeit (t 0,5):
k el = 5,0t2ln ⇒ t 0,5 [h] =
elk2ln
t 0,5 = Halbwertszeit
ln 2 = 0,693
k el = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
Literaturübersicht
26
Neben der Halbwertszeit ist weiterhin die Ausscheidungszeit (tA) von Interesse. Sie beschreibt
die Zeit, die vergeht, um einen Wirkstoff bis zu einem gewissen Grenzwert aus dem
Organismus zu eliminieren. Mittels folgender Gestzmäßigkeit kann die Ausscheidungszeit bis
zum Erreichen eines Grenzwertes (t A(Grenze)) beschrieben werden (KIETZMANN, 1983):
t A(Grenze) [h] = e
)((max)
klnln GrenzeCC −
t A(Grenze) = Ausscheidungszeit bis zum Erreichen eines Grenzwertes
ln C(max) = natürlicher Logarithmus der maximalen Wirkstoffkonzentration
ln C(Grenze) = natürlicher Logarithmus der Wirkstoffkonzentration des Grenzwertes
k e = Eliminationskonstante
Zum Verständnis des zeitlichen Verlaufs der Konzentrationen eines Pharmakons in Blut,
Plasma und Exkreten bedient man sich so genannter „Kompartiment-Modelle“ (FICHTL et
al., 1996). Die Kompartimente stellen allerdings nur eine vereinfachte Form der
physiologischen Abläufe dar, sie haben keine direkte physiologische Entsprechung. Nach
KOCH u. RITSCHEL (1986) sind Kompartimente die verschiedenen Verteilungsräume des
tierischen Organismus, z.B. der extrazelluläre Raum, das gesamte Körperwasser (extrazellulär
und intrazellulär) und der intravavsale Raum. Arzneimittel können sich im einfachsten Fall
auf ein einziges dieser Kompartimente, in anderen Fällen jedoch auf zwei oder mehrere
Kompartimente verteilen. Die pharmakokinetischen Modelle lassen sich durch die oben
beschriebenen mathematischen Parameter der Halbwertszeit, der Clearance, des
Verteilungsvolumens und der Bioverfügbarkeit beschreiben (FICHTL et al., 1996).
a) Offenes-1-Kompartiment-Modell (intravenöse Injektion)
Bei diesem vereinfachten Modell wird der gesamte Körper als ein Verteilungsraum
angesehen. Eine injizierte Dosis (D) verteilt sich unmittelbar im gesamten
Verteilungsvolumen (Vd). Aus dem Kompartiment wird das Pharmakon nach einer
Kinetik 1. Ordnung eliminiert. Die Geschwindigkeit der Elimination wird mit Hilfe
der oben bereits erwähnten Geschwindigkeitskonstanten (kel) beschrieben, welche das
Verhältnis zwischen dem natürlichen Logarithmus von 2 und der Halbwertszeit (t 0,5)
darstellt.
Literaturübersicht
27
b) Offenes-1-Kompartiment-Modell (intravenöse Infusion)
Per Dauerinfusion gelangt eine konstante Menge eines Pharmakons pro Zeiteinheit in
das Kompartiment. In diesem Fall liegt eine Invasion des Arzneimittels nach einer
Kinetik 0. Ordnung vor. Die Elimination läuft nach einer Kinetik 1. Ordnung ab, so
dass sich eine Steady-State-Konzentration (Css) einstellt. Die Geschwindigkeit zur
Einstellung dieses Steady-State hängt von der Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
(kel) ab.
c) Offenes-1-Kompartiment-Modell (extravasale Applikation)
Bei einer extravasalen Applikation, d.h. bei einer oralen, intramuskulären oder
subkutanen Applikation, ergibt sich die Konzentration des Pharmakons im
Kompartiment aus der gleichzeitig ablaufenden Resorption (Kinetik 1. Ordnung) und
Elimination (Kinetik 1. Ordnung). An- und Abflutung des Wirkstoffes überlagern sich
bei dieser Modellvorstellung.
d) Mehrfachkompartiment- Modelle
Aus dem zentralen Kompartiment verteilt sich das Pharmakon mit unterschiedlicher
Konzentration in die anderen Kompartimente. Der Übertritt des Pharmakons vom
zentralen ins periphere bzw. vom peripheren ins zentrale Kompartiment wird durch
die Geschwindigkeitskonstanten (k12 und k21) verdeutlicht. Die Elimination wird
wiederum mittels der Eliminationsgeschwindigkeitskonstanten (kel bzw. k13)
beschrieben. Dabei unterliegen die Hin- und Rückverteilung zwischen den
Kompartimenten sowie die Elimination aus dem zentralen Kompartiment einer
Kinetik 1. Ordnung. Auch bei diesen Mehrfachkompartiment-Modellen unterscheidet
man zwischen intravasaler und extravasaler Applikation.
Abbildung 3 zeigt die Verhältnisse nach intravasaler Applikation.
Literaturübersicht
28
Abb. 3: schematische Darstellung einer intravasalen Applikation im Zwei-Kompartiment-
Modell ( nach KOCH u. RITSCHEL, 1986)
1 = zentrales Kompartiment
2 = peripheres Kompartiment
C = Wirkstoffkonzentration im Blut
V1 = Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment
V2 = Verteilungsvolumen im peripheren Kompartiment
k 12 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment
k 21 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment
k13 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante für das zentrale Kompartiment
A2 = Arzneistoffmenge im peripheren Kompartiment
5.2. Pharmakodynamik
Die Pharmakodynamik beschreibt die Einflüsse des Pharmakons auf den Organismus (PÖCH
u. JUAN, 1985). Die Pharmakodynamik wird durch die Konzentration des Arzneistoffes, die
Ansprechbarkeit von Rezeptoren auf das Arzneimittel sowie durch die nicht rezeptor-
vermittelten Wirkungen des Arzneistoffes bestimmt (FREY, 2002).
Um die Wirkung eines Pharmakons in einer bestimmten Dosierung bestimmen zu können,
trägt man die Zahlenwerte gemessener Wirkungen gegen die zugehörigen Dosen auf und
erhält eine Dosis-Wirkung-Beziehung (SCHELER, 1980). Für die meisten Pharmaka lässt
sich eine Dosis-Wirkung-Beziehung erstellen, wobei bei zunehmender Dosis eine
zunehmende Wirkung festgestellt werden kann. Im mittleren Bereich der Dosis-Wirkung-
Kurve stellt sich meist ein annähernd linear verlaufender Kurvenabschnitt dar. Dieser ist laut
FREY (2002) der therapeutisch interessante Konzentrationsbereich, denn hier besteht eine
nahezu logarithmische Abhängigkeit von Dosis und Wirkung. Nach PÖCH u. JUAN (1990)
kann aus einer Dosis-Wirkung-Beziehung die für bestimmte Wirkungen erforderliche Dosis,
das Ausmaß der Wirkung und die eigentliche Dosis-Wirkung-Beziehung entnommen werden.
Literaturübersicht
29
Die Wirkung der meisten Arzneimittel wird, wie bereits erwähnt, über Rezeptoren vermittelt
(PÖCH u. JUAN, 1990). Durch eine reversible, selten durch eine irreversible Bindung des
Pharmakons an den Rezeptor, entsteht ein Rezeptor-Wirkstoff-Komplex. Rezeptor-Wirkstoff-
Komplexe können verschiedener Natur sein und somit unterschiedliche Wirkungen auslösen
(FREY, 2002). Anhand der Lokalisation der Rezeptoren an der Effektorzelle lassen sich
membranständige Rezeptoren, zytoplasmatische Rezeptoren und Kernrezeptoren
unterscheiden, anhand der Rezeptorart die Klasse-1-Rezeptoren und die Klasse-2-Rezeptoren.
Klasse-1-Rezeptoren, auch schnelle Rezeptoren genannt, sind aus mehreren Untereinheiten
bestehende Makromoleküle, die ihre Wirkung durch Öffnung oder Schließen von
spannungsabhängigen Ionenkanälen vermitteln. Klasse-2-Rezeptoren hingegen sind langsame
Rezeptoren, die ihrerseits Second-Messenger-Systeme aktivieren oder hemmen und somit
eine indirekte Wirkung vermitteln. Bei dem für Steroidhormone typischen, und in Kapitel
II.6.5. näher beschriebenen Weg über zytoplasmatische Rezeptoren bindet der entstandene
Rezeptor-Wirkstoff-Komplex an kernständige DNA und greift somit in die Proteinsynthese
der Zelle ein. Die daraus resultierenden Wirkungen sind aber meist der Zahl der tatsächlich
besetzten Rezeptoren nicht proportional. Maximale Wirkungen werden oft schon ausgelöst,
wenn nur ein Teil der Rezeptoren durch Moleküle des Pharmakons besetzt ist (FRIMMER,
1986).
Die Wirkung am Rezeptor kann durch die Begriffe Affinität und der intrinsischen Aktivität
beschrieben werden. Die Affinität bezeichnet die Anzahl der besetzten Rezeptoren (FREY,
2002), die dem Pharmakon innewohnende Wirkung am einzelnen Rezeptor wird auch als
intrinsische Aktivität bezeichnet (FRIMMER, 1986). Mit Hilfe dieser Begriffe der Affinität
und der intrinsischen Aktivität lässt sich nun das mögliche Verhalten eines Pharmakons an
einem Rezeptor veranschaulichen. An der Efffektorzelle kann ein Pharmakon als Agonist,
partieller Antagonist und Vollantagonist fungieren (FRIMMER, 1986). Agonisten haben
meist eine hohe intrinsische Aktivität und auch eine günstige Affinität zum Rezeptor.
Antagonisten hemmen umso stärker, je größer ihre Affinität zum Rezeptor bei fehlender
intrinsischer Aktivität ist. Sie verdrängen Agonisten vom Rezeptor, ohne selbst wirksam zu
sein. Partielle Antagonisten stellen einen fließenden Übergang zwischen Agonisten und
Antagonisten dar. Sie besitzen lediglich eine geringe intrinsische Aktivität.
Nach FREY (2002) ist eine Reihe von Arzneimittelwirkungen nicht durch einen Rezeptor
vermittelt, sondern Folge direkter physikalischer oder auch chemischer Einwirkungen auf die
Literaturübersicht
30
physiologischen Vorgänge im Körper. So wirken beispielsweise osmotische Diuretika,
Abführmittel, Antacida und auch Desinfektionsmittel ohne eine vorherige Rezeptorbindung.
6. Glucocorticoide
6.1. Physiologie und Sekretion von Glucocorticoiden
In den Nebennieren werden verschiedene Hormone gebildet. Über 50 Steroide werden
synthetisiert, wovon nur einige biologische Effekte zeigen (MAC HARG et al., 1985). Nach
ihrer biologischen Wirkung lassen sie sich in drei Hormonklassen einteilen:
a. Glucocorticoide
b. Mineralocorticoide
c. Androgene
Die Mineralocorticoide und die Glucocorticoide werden zu der übergeordneten Gruppe der
Corticosteroide zusammengefasst (SCHIMMER u. PARKER 2001; THUN u. SCHWARTZ-
PORSCHE, 1992).
Die Glucocorticoide werden überwiegend in der Zona fasciculata, die Mineralocorticoide in
der Zona glomerulosa und die Androgene in der Zona reticularis der Nebennierenrinde
gebildet (FICHTL et al., 2001). Sie werden ohne vorherige Speicherung ins Blut abgegeben.
Alle Glucocorticoide sind Derivate des aus 21 C-Atomen bestehenden Pregnan (LUTZ,
1988), das aus Cholesterol gebildet wird. Das Grundgerüst des Cholesterols ist ein Steran,
welches aus drei miteinander kondensierten sechsgliedrigen Ringen und einem fünfgliedrigen
Rind besteht.
Nach MUNCK et al. (1984) wird die Sekretion der Glucocorticoide durch das aus dem
Hypophysenvorderlappen stammende Adrenocorticotrope Hormon (ACTH) stimuliert,
welches wiederum durch den aus dem Hypothalamus freigesetzten Corticotropin-Releasing-
Faktor (CRF) kontrolliert wird. Steigende Blutkonzentrationen von körpereigenen oder
exogenen Glucocorticoiden sowie Stress greifen durch negative Rückkopplung in diesen
Regelkreis ein (SENDELBECK u. YATES, 1970). Ein erhöhter Glucocorticoidspiegel hemmt
die Freisetzung von CRF. Der Stimulus zur ACTH-Ausschüttung fällt somit weg, was
folglich die Synthese von endogenem Cortisol verhindert.
Literaturübersicht
31
6.2. Cortisol
Cortisol ist auch unter dem Synonym Hydrocortison bekannt. Der chemische Name ist
11,17,21-Trihydroxy-,(11beta)-pregn-4-ene-3,20-dione, die Summenformel lautet C21H30O5
und ergibt die in Abbildung 4 dargestellte Strukturformel. Die Molekularmasse beträgt 362,47
g/mol, der Schmelzpunkt liegt bei 217-220 °C (MERCK INDEX, 2001).
Abb. 4: Strukturformel Cortisol
Das Cortisol ist beim Pferd der Hauptvertreter der endogenen Glucocorticoide. Insgesamt
gesehen repräsentiert Cortisol beim Pferd 90 % der zirkulierenden Corticoide (IRVINE et al.,
1988; COVALESKY et al., 1992). Als weitere endogene Glucocorticoide kommen Cortison
und Corticosteron in unterschiedlichen Anteilen vor. Das Verhältnis von Cortisol zu
Corticosteron liegt nach IRVINE et al. (1988) bei 7:1. Laut UNGEMACH (2002) ist Cortison
pharmakologisch inaktiv, womit dessen Wirkungsvoraussetzung eine intakte Leberfunktion
ist, da Cortison in der Leber zu den physiologisch aktiven Formen Cortisol und Corticosteron
umgesetzt wird (KLAUS u. HAPKE, 1996). Diese Umwandlung erfolgt rasch, bei einer
Halbwertszeit des unveränderten Cortisons von ca. 30 Minuten. In der Konzentration von 10 -
10 bis 10 -7 mol/l ist Cortisol physiologisch wirksam (MUNCK, 1968).
Die Cortisolsekretion erfolgt pulsatil im circadianen Rhythmus (FICHTL et al., 2001).
Zwischen 3 und 10 Uhr steigt die Cortisolkonzentration im Blut steil an. Im Laufe des
Nachmittags ist ein beginnender Abfall ist zu beobachten, welcher zwischen Mitternacht und
3 Uhr seinen Tiefpunkt erreicht. LANE (1986) fand beim Pferd tageszeitliche Schwankungen
von 30 bis 57 ng/ml Plasma, GYLSTROFF u. HEGNER (1983) von ca. 40 bis 80 ng/ml
Plasma. Bei Pferden kann, in Abhängigkeit von Tageszeit und Belastung, eine
O
CH3
CH3
HO OH
CO CH2OH
Literaturübersicht
32
Cortisolkonzentration von 25 bis 65 ng/ml Plasma als normal angesehen werden (KLAUS u.
HAPKE, 1996).
Im Plasma ist Cortisol zu mehr als 90 % an verschiedene Proteine gebunden. Davon sind etwa
75 % an Transcortin, ein spezifisches Corticosteroid-bindendes Globulin (CBG) gebunden,
weitere 15 % sind unspezifisch an Albumin gebunden. Lediglich 10 % des Cortisols
zirkulieren frei. Nach BALLARD (1979) ist nur freies, nicht proteingebundenes Cortisol
physiologisch wirksam.
Nach UNGEMACH (2002) kann beim Pferd von einem Verteilungsvolumen von 0,3 l/kg
ausgegangen werden. Als weitere pharmakologische Eigenschaft des Cortisols ist die
Eliminationshalbwertszeit von 78-96 Minuten zu nennen, wobei die Cortisolmetaboliten zu
mehr als 99 % als Glucuronide über die Nieren ausgeschieden werden und nur zu etwa 0,5 %
als freies Cortisol im Urin erscheinen (FICHTL et al., 2001).
Mit der Entwicklung von synthetischen Glucocorticoiden hat Cortisol als Arzneimittel an
Bedeutung verloren und ist heute als Tierarzneimittel nur noch zur äußeren Anwendung auf
dem Markt (UNGEMACH, 2002).
6.3. Herstellung synthetischer Glucocorticoide
Cortisol und Cortison dienen bei der Herstellung neuer Glucocorticoide als Ausgangssubstanz
(FICHTL et al., 2001). Bereits kleine chemische Modifikationen am Grundgerüst des
Cortisols können Absorptionsrate, Wirkungsbeginn und Wirkpotenz wesentlich beeinflussen
(SCHIMMER u. PARKER, 2001). Durch Einführung einer zweiten Doppelbindung im ersten
Ring zwischen dem C-1-Atom und dem C-2-Atom entstanden aus Cortisol und Cortison
Prednisolon und Prednison, die ersten synthetischen Glucocorticoide (FICHTL et al., 2001).
Die meisten synthetischen Glucocorticoide leiten sich von Prednisolon ab.
Die Struktur und die Seitenketten des Glucocorticoidgrundgerüstes haben ebenfalls einen
Einfluss auf die Stärke der entzündungshemmenden, sowie der mineralocorticoiden Wirkung
und auf die Wirkungsdauer nach Erreichen des Wirkortes (UNGEMACH, 2003; FERGUSON
u. HOENIG, 2001). So konnten durch Einführung von Halogenatomen, Methylgruppen sowie
durch Hydroxylierung bzw. Dehydrogenierung mit Bildung neuer Doppelbindungen weitere
synthetische Glucocorticoide hergestellt werden. Doppelbindungen potenzieren die
glucocorticoide Wirkung, Methylierung verringert die mineralocorticoide Wirkung und eine
Halogenierung verlängert die Wirkdauer. Somit zeigen synthetische Glucocorticoide
gegenüber den natürlichen Glucocorticoiden eine deutliche Steigerung der glucocorticoiden
Literaturübersicht
33
Wirkung und zugleich eine Verringerung der unerwünschten mineralocorticoiden Wirkung
(THUN u. SCHWARTZ-PORSCHE, 1992; NEUMANN et al., 1998). Speziell durch die
Synthese von Glucocorticoiden, die ein Fluor- (Dexamethason) oder Chloratom
(Beclomethason) am C-9-Atom tragen kommt es nicht nur zur Erhöhung der Affinität zum
Glucocorticoidrezeptor, und somit zu Verbindungen mit ausgeprägter
entzündungshemmender Wirkung und sehr geringer Natriumretention, sondern auch zur
Verlangsamung der Metabolisierung, was eine dementsprechend längere Wirkdauer zur Folge
hat. Als weitere halogenierte Glucocorticoide sind Betamethason, Fluticason, Flumethason
und Triamcinolon zu nennen (HOGGER, 2003; THUN u. SCHWARTZ-PORSCHE, 1992).
6.4. Dexamethason
Dexamethason (9α-Fluor-16α-metylprednisolon) zählt zur Gruppe der synthetischen
Glucocorticoide. Die zugehörige Summenformel lautet C22H29FO5, die Molekularmasse liegt
bei 392,45 g/mol und der Schmelzpunkt ist mit 262-264 °C angegeben. Der freie Wirkstoff ist
bei 25 °C in Wasser, jedoch schlecht in Alkohol löslich (MERCK INDEX, 2001).
O
OH OH
O OH
F
Abb. 5: Strukturformel Dexamethason
Dexamethason (Abbildung 5) gehört durch die Fluorierung am C-9-Atom und weitere
Substituierung am C-16-Atom zu der Gruppe der fluorierten Glucocorticoide, welche sich
durch starke antiallergische, antiinflammatorische und immunsuppressive Wirkung
auszeichnen. Die Wirkstärke von Cortisol wird bis zu 40fach übertroffen, wobei die
mineralocorticoide Wirkung zu vernachlässigen ist (UNGEMACH, 2002).
Dexamethason ist in der Veterinärmedizin ein therapeutisch häufig eingesetzter Wirkstoff aus
der Gruppe der Glucocorticoide (KLAUS u. HAPKE, 1996). Tierarzneimittel enthalten
Dexamethason in freier oder auch verschiedenartig veresterter Form, zur oralen, intravenösen,
intramuskulären und topischen Anwendung, in galenischer Kurzzeit- oder auch
Literaturübersicht
34
Depotformulierung (UNGEMACH, 2002). Neben Tabletten, die lediglich bei Hund und Katze
angewandt werden, gibt es verschiedene Injektionspräparate für Groß- und Kleintiere in Form
von wässrigen Lösungen, wässrigen Suspensionen und Kristallsuspensionen. Tabletten
enthalten Dexamethason in freier Form oder als Dexamethason-21-acetat. Die wässrigen
Lösungen enthalten meist gut wasserlösliche und leicht spaltbare Ester (z.B. Dexamethason-
21-isonicotinat, Dexamethason-21-dinatriumphosphat oder Trioxaundecanoat) während die
wässrigen Suspensionen anstelle von Estern (z.B. Dexamethason-21-isonicotinat,
Dexamethason-21-phenylpropionat) auch Dexamethason in freier Form enthalten können. Die
ebenfalls zu den wässrigen Suspensionen gehörende Formulierung der Kristallsuspension
besteht meist aus Dexamethasonestern (Dexamethason-21-acetat, Dexamethason-21-
isonicotinat). Bei jeder Form der Verabreichung ist jedoch eine systemische Wirkung möglich
(KLAUS u. HAPKE, 1996)
6.5. Pharmakokinetik synthetischer Glucocorticoide
Die Applikation der exogenen Glucocorticoide kann über unterschiedliche Wege stattfinden
(UNGEMACH, 2002). Wie für jeden Wirkstoff ist die Kinetik post applikationem vom
Präparat, von der Applikationsart und von der Spezies abhängig (UNGEMACH, 2002). Im
Allgemeinen sind Glucocorticoide sehr lipophile Wirkstoffe und werden unabhängig von der
Applikationsart gut resorbiert (BEHREND u. GRECO, 1995). Bei oraler Applikation von
freien, unveresterten Glucocorticoiden ist die Resorption nahezu vollständig und schnell. Die
Bioverfügbarkeit liegt beim Menschen nach oraler Applikation für alle therapeutisch
wichtigen Glucocorticoide bei über 80 % (HOGGER, 2003). Beim Pferd wurde nach oraler
Applikation von 10 mg Dexamethason an drei aufeinander folgenden Tagen lediglich eine
durchschnittliche Bioverfügbarkeit von 60 % ± 19 % festgestellt (CUNNINGHAM et al.,
1996). Nach intramuskulärer Injektion werden freie Glucocorticoid-Alkohole sowie
wasserlösliche Ester gut resorbiert, im Gegensatz zu schwerlöslichen oder in Depots
vorliegenden Estern. Die Resorption von Esterverbindungen dauert Wochen bis Monate.
Angaben zur Bioverfügbarkeit nach intravenöser und intramuskulärer Verabreichung von
Glucocorticoidestern beim Pferd sind lückenhaft. Auch bei lokaler Verabreichung von
synthetischen Glucocorticoiden auf Haut, Schleimhäuten oder Gelenken findet eine
substanzielle Resorption mit anzunehmender systemischer Wirkung statt. Die systemische
Wirkung von dermal verabreichtem Dexamethason bewiesen ALLERSMEIER et al. (2005).
Sie zeigten, dass eine topische Applikation von Glucocorticoiden bei Pferden zu einer
Literaturübersicht
35
substanziellen Wirkstoffresorption und zu systemischen Effekten mittels Eingriff in die
Aktivität der Hypopyhsen-Nebennierenrinden-Achse führt.
Nach Applikation und Anflutung im Organismus werden die Glucocorticoidverbindungen
durch Gewebeesterasen gespalten. Die nun pharmakologisch wirksamen Moleküle gelangen
dann in die Blutzirkulation (COPPOC, 1984; FERGUSON u. HOENIG, 2001). Laut
UNGEMACH (2002) sind die synthetischen Glucocorticoide je nach Wirkstärke bis zu 80 %
an Plasmaproteine gebunden. Die Plasmaproteinbindung von Dexamethason beträgt 80 %
(PEETS et al., 1969; BARTH et al., 1994). Exemplarisch für den Menschen aufgeführt
beläuft sich die Plasmaproteinbindung von Prednisolon auf 75 %, die von Dexamethason auf
70 %. Ein Teil der synthetischen Glucocorticoide, mit Ausnahme des Prednisolons, ist locker
an Transcortin, das spezifische Transportprotein für Cortisol gebunden, der überwiegende
Anteil, etwa 60 %, ist jedoch unspezifisch an Albumin gebunden. Ein Rest zirkuliert frei
(FICHTL et al., 2001).
Auf dem Blutweg verteilen sich die Glucocorticoide in alle Gewebe und passieren die Blut-
Hirn- und die Plazentaschranke. Nach peroraler Gabe von Dexamethason werden ca. 20 % der
gemessenen Plasmakonzentration im Liquor gemessen (HOGGER, 2003). Kleine Mengen
gelangen sogar in die Milch (UNGEMACH, 2002). Das Verteilungsvolumen synthetischer
Glucocorticoide beläuft sich beim Hund und Rind auf 1,2 l/kg (TOUTAIN et al., 1982).
TOUTAIN et al. (1984) gibt das Verteilungsvolumen von Dexamethason beim Pferd mit 906-
965 ml/kg an. Ähnliche Werte wurden nach der oralen Applikation von 10 mg Dexamethason
gemessen (CUNNINGHAM et al., 1996).
In der Leber werden exogene Glucocorticoide, wenn auch etwas langsamer als endogene
Glucocorticoide, metabolisch inaktiviert. Zur Inaktivierung der Steroidhormone kommt es vor
allem durch Reduktion der Doppelbindungen und Ketogruppen. Durch Kopplung an polare
Moleküle, wie Glucuronid, sowie zu geringen Teilen auch an Sulfat, verlieren die Steroide
ihre Aktivität und werden wasserlöslich gemacht (KOOLMAN, 1994). Diese so
resultierenden Ester werden, neben einem sehr geringen freien und unveränderten Anteil,
hauptsächlich renal ausgeschieden (KAISER u. KLEY, 1997). Die Beteiligung des entero-
hepatischen Kreislaufs an der Ausscheidung ist nach UNGEMACH (2002) gering.
Bedingt durch die unterschiedliche chemische Struktur der verschiedenen synthetischen
Glucocorticoide sind die Metabolisierung und somit auch die Halbwertszeit unterschiedlich.
Stellvertretend ist die Halbwertszeit von Prednisolon mit ca. 100 Minuten und die
Halbwertszeit von Dexamethason mit 180-200 Minuten für die Spezies Pferd angegeben.
Literaturübersicht
36
6.6. Pharmakodynamische Wirkung von Glucocorticoiden
Steroidhormone bzw. Glucocorticoide beeinflussen praktisch alle Zellen eines
Säugetierorganismus (UMLAND et al., 2002; MCDONALD u. LANGSTON, 1995). Ihre
pharmakodynamische Wirkung vermitteln die Glucocorticoide zum überwiegenden Teil über
Rezeptormechanismen. Laut GUSTAFSSON et al. (1987) sind Glucocorticoidrezeptoren im
Zytoplasma diverser Zellarten lokalisiert. Nach VOIGT u. FEHM (1981) und FERGUSON u.
HOENIG (2001) befinden sich diese Rezeptoren hauptsächlich in Muskulatur, Fettgewebe,
Haut, Leber und lymphatischen Gewebe. Steroidhormonrezeptoren bestehen aus einer
Polypeptidkette und weisen charakteristische Domänen auf (DNA-Domäne,
Hormonbindungsdomäne, regularorische Domäne und Hinge-Region) (EVANS, 1988). Über
einen Proteinkomplex bestehend aus den Hitze-Schock-Proteinen hsp90 und hsp70
(Chaperone) sowie aus Cochaperonen (Immunophilin FKBP51), aus Dynein und aus weiteren
Proteinen ist der Glucocorticoidrezeptor im Zytoplasma gebunden (PRATT, 1998;
DEFRANCO u. CSERMELY, 2000; CROXTALL et al., 2000). Glucocorticoide diffundieren
als lipophile Hormone in die Zielzelle (LUTZ, 1988) und binden im Zytoplasma der
Zielzellen an diese Rezeptoren (LAPOINTE u. BAXTER, 1989). Die Bindung der
Glucocorticoide an den Rezeptor erfolgt in der Hormonbindungsdomäne (GUSTAFSSON et
al., 1987) und es kommt zur Bildung von Rezeptorkomplexen. Durch diese Bindung in der
Hormonbindungsdomäne ist der Glucocorticoidrezeptor maskiert und inaktiv. Es kommt
jedoch im Zuge der Bindung des Glucocorticoids an den Rezeptor zu einer Aktivierung bzw.
Hyperphosphorylierung des Rezeptors, indem das Immunophilin FKBP51 gegen FKBP52
ausgetauscht und das Transportproteins Dynein aktiviert wird. Eine Translokation des nun
aktivierten Rezeptorkomplexes in den Kern schließt sich an (DAVIES et al., 2002). Im
Zellkern interagiert die DNA-Domöne mit spezifischen DNA-Sequenzen der regulatorischen
Region (Promoter-Region) beeinflussbarer Gene (ROUSSEAU, 1984). Folge ist eine
gesteigerte Exprimierung spezifischer mRNA und somit der Synthese von korrespondieren
Proteinen (DANON u. ASSOULINE, 1978). Es werden vermehrt katabole Enzyme, Enzyme
für die Gluconeogenese und Hemmproteine gebildet (BATEMAN, 1989).
Anhand dieses vorgeschalteten Reaktionsgeschehens sind die erst nach einer Latenz
einsetzenden Glucocorticoideffekte zu erklären. Auch kann noch eine glucocorticoide
Wirkung bestehen, wenn sich keine Glucocorticoid-Rezeptor-Komplexe mehr im Zellkern
befinden (GUSTAFSSON et al., 1987). Aufgrund der von der Elimination unabhängigen
Persistenz von Glucocorticoid-Rezeptor-Komplexen in den Kernen der Zielzellen kommt es
Literaturübersicht
37
zu einer weiter bestehenden Wirkung der Glucocorticoide auch noch nach deren
Verschwinden aus der Blutbahn. Die Halbwertszeit der biologischen Wirkung ist deutlich
länger im Gegensatz zur Eliminationshalbwertszeit (UNGEMACH, 2002).
Nach HAYNES u. MURAD (1985) sind Glucocorticoide nicht nur, wie der Name bereits
sagt, an der Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels beteiligt. Sie nehmen auch beim Fett-
und Eiweißstoffwechsel eine zentrale Rolle ein und wirken auf den Wasser- und
Elektrolythaushalt. Auch beeinflussen sie den Organismus in Stresssituationen. Weiterhin
haben sie antiinflammatorische bzw. antiphlogistische, immunsuppressive und antiexsudative
Eigenschaften.
Glucocorticoide regulieren den Metabolismus von Proteinen, sie wirken katabol. Sie fördern
in praktisch allen Zellen, exklusive der Leberzellen, den Proteinabbau. Die durch den Abbau
von Proteinen frei gewordenen Aminosäuren werden zur Gluconeogenese eingesetzt
(MUNCK u. GUYRE, 1989). Die neu gebildete Glucose wird zum Teil in Form von
Glykogen als Energiereserve in der Leber gespeichert. Nach KUSCHINSKY et al. (1993)
hemmen Glucocorticoide weiterhin die Glucoseverwertung in der Peripherie. Hier fördert
Cortisol zusätzlich die Bereitstellung von Aminosäuren für die Gluconeogenese (REILY u.
FORD, 1974). Insgesamt ist der Glucoseumsatz gesteigert, die Glucosetoleranz und die
Insulinempfindlichkeit nehmen ab.
Der Eingriff der Glucocorticoide in den Fettstoffwechsel ist durch eine gesteigerte
lipolytische Wirkung von Katecholaminen und lipolytischen Enzymen zu erklären.
Gleichzeitig wird die Fettsäuresynthese in der Leber gehemmt (MÖSTL, 2000). Hohe Dosen
an Glucocorticoiden bewirken aus diesen Gründen eine Umverteilung des Fettgewebes. Es
kommt zu Fettverlust an den Extremitäten und Fettzunahme an Stamm, Nacken und Gesicht,
somit zur Stammfettsucht (MAJO-SMITH et al., 1989; UNGEMACH, 2002).
Natürliche und synthetische Glucocorticoide haben auf den Wasser- und Elektrolythaushalt
einen, in Abhängigkeit des jeweiligen Stoffes, geringgradigen mineralocorticoiden Effekt
(FICHTL et al., 2001; HARVEY et al., 2002). Die Natriumretention und die
Natriumresorption sind erhöht, was ein vergrößertes Extrazellularvolumen mit darauf
folgender indirekter Blutdruckerhöhung zur Folge hat (MÖSTL, 2000). Cortisol steigert die
tubuläre Filtration und hemmt die Wasserdurchlässigkeit der distalen Tubuli. GRISHAN u.
MENEELY (1982) ergänzen in diesem Zusammenhang die durch Glucocorticoide gehemmte
Resorption von Calcium aus dem Darm. Zusätzlich kommt es zu einer vermehrten
Ausscheidung von Calcium und Phosphat über die Nieren (BLAHOS et al., 1986; HARVEY
Literaturübersicht
38
et al., 2002). Hypokaliämie und metabolische Alkalose sind die Folge. Auch beeinflussen
Glucocorticoide durch den Abbau von Knochensubstanz den Calciumstoffwechsel (KAISER
u. KLEY, 1997).
Einen Einfluss auf das Entzündungsgeschehen besitzen Glucocorticoide, indem sie über eine
Hemmung der Proteinbiosynthese weniger entzündungsfördernde Substanzen (Zytokine und
Interleukine) und Enzyme des Entzündungsgeschehens (Cyclooxygenase-1, Cyclooxygenase-
2, u.a.) bilden und sezernieren. Durch die Cyclooxygenasehemmung wird die
Prostaglandinsynthese rasch blockiert (MASFERRER et al., 1992). Zusätzlich erfolgt ein
Eingriff in die Arachidonsäurekaskade. RUZICKA (1984) beschreibt diesen Eingriff in die
Arachidonsäurekaskade als Hemmung der Phospholipase A2 durch das Hemmprotein
Lipocortin. Lipocortin inhibiert die Phospholipase A2 und hemmt damit die Synthese von
Leukotrienen, Hydroxyfettsäuren, Prostacyclin, Prostaglandin E2 und Thromboxan A2.
Katabole Enzyme und Hemmproteine, wie das Lipocortin, werden im Zuge der zuvor
beschriebenen Geninteraktion gebildet (UNGEMACH, 2002). Durch Hemmung der
Prostaglandinsynthese sind auch die von WILLIAMS u. PECK (1977) beschrieben
gefäßerweiternden und exsudativen Eigenschaften der Prostaglandine verringert. Mittels
gestärkter Integrität von Zell- und Plasmamembranen und durch stabilisierte Membranen der
Lysosomen kommt es zu einer reduzierten Ausschüttung von Entzündungszellen (MELBY,
1977). Durch Normalisierung der erhöhten Membranpermeabilität wird auch einer Migration
von Leukozyten, Makrophagen und Mastzellen ins Gewebe entgegengewirkt (FREY, 2002).
Die antiproliferative Wirkung wird durch gehemmte DNA-Synthese und Zellteilung und
durch die durch verlangsamten Erythrozytenabbau bedingte Zunahme von Erythrozytenzahl
und Haemoglobinkonzentration vermittelt. Nach DURANT et al. (1986) führt die
antiproliferative Wirkung zu gehemmten Fibroblastenwachstum, verringerter
Kollagensynthese sowie zu einer verringerten Vaskularisation im Gewebe.
Die immunsuppresive Wirkung der Glucocorticoide wird durch eine verhinderte Bindung von
Immunglobulinen an ihren Rezeptor (MERK u. BICKERS, 1992) sowie durch eine gehemmte
Komplement-Reaktion bedingt (FICHTL et al., 2001). Nach UNGEMACH (2002) kommt es
durch Glucocorticoide weiterhin zu einer gehemmten Differenzierung von T-Lymphozyten,
zu charakteristischen Veränderungen des weißen Blutbildes in Form von Eosinopenie, zu
einem Abfall von T-Lymphozyten, zu regressiven Veränderungen des lymphatischen
Gewebes, sowie zu einer Lymphozytopenie, beruhend auf einer Sequestrierung der T-
Lymphozyten in Milz und Lunge. Die zelluläre Abwehr ist somit unterdrückt (MERK u.
BICKERS, 1992).
Literaturübersicht
39
An besonders beeinflussten Organsystemen sind das kardiovaskuläre und das
Zentralnervensystem (ZNS) zu nennen. Glucocorticoide wirken positiv inotrop, erhöhen die
Ansprechbarkeit der Mikrozirkulation auf Noradrenalin und verbessern dadurch die lokale
Durchblutung (FREY, 2002). Direkte Effekte am ZNS sind mittels gesteigerter Erregbarkeit,
verminderter Reizschwelle und Veränderungen im Elektroenzephalogramm zu
charakterisieren (FICHTL et al., 2001).
Nebenwirkungen der Glucocorticoide lassen sich laut FREY (2002) aus ihren
pharmakodynamischen Wirkungen ableiten und resultieren aus einem Einfluss von übermäßig
stark erhöhten Glucocorticoiddosen. Grundsätzlich gilt, dass eine kurzfristige, auch hoch
dosierte Anwendung gut verträglich ist. Jedoch ist jede längerfristig andauernde
Glucocorticoidverabreichung, die nicht einer indizierten Hormonsubstitution gilt, mit einem
Risiko für den Patienten behaftet.
Die Einsatzmöglichkeiten der Glucocorticoide in der Veterinärmedizin sind vielseitig.
FICHTL et al. (2001) stellen einige wichtige Indikationsgebiete unterteilt nach systemischer
und lokaler Anwendung gegenüber. Bei den erwähnten Erkrankungen ist die Gruppe der
Glucocorticoide jedoch nicht als erstes und einziges Mittel der Wahl anzusehen. Auch können
Krankheiten bei denen eine systemische Applikation indiziert ist ebenfalls lokal behandelt
werden. Beim Pferd finden die systemische Anwendung von Glucocorticoiden vorzugsweise
bei rheumatischen und andere entzündlichen Gewebserkrankungen, bei allergischen
Erkrankungen, bei Haut-, Lungen- und Augenerkrankungen sowie zur hormonellen
Substitution endokriner Erkrankungen Anwendung. Im Rahmen der lokalen Anwendung ist
der Einsatz bei Haut-, Augen-, Gelenks- und Atemwegserkrankungen zu nennen. Der Einsatz
der synthetischen Glucocorticoide zur Behandlung entzündlicher Schmerzen des
Bewegungsapparates und der damit verbundenen Lahmheiten steht in der tiermedizinischen
Praxis im Vordergrund, was laut FRIEDRICH et al. (1990) durch die starke antiphlogistische
Wirkungskomponente der Glucocorticoide zu begründen ist. Diese Substanzen bewirken
somit eine Milderung der Entzündung, die die Gebrauchsfähigkeit des Pferdes kurzweilig
wiederherstellt. Eine kausale Therapie ist jedoch hierdurch nicht gegeben (KLAUS u.
HAPKE, 1996).
Literaturübersicht
40
6.7. Glucocorticoidester
6.7.1. Einteilung der Glucocorticoidester
Durch Veresterung am C-17- oder C-21-Atom mit kurzkettigen Fettsäuren wie z.B. Acetat,
Propionat und Butyrat, entstehen Glucocorticoidester. Die Veresterung bestimmt zum einen
die Wasser- und Lipidlöslichkeit des jeweiligen Stoffes (FERGUSON u. HOENIG, 2001),
zum anderen bestimmt die Art des Esters in einem Arzneistoff dessen mögliche
Applikationsart, d.h. die Möglichkeit einer intravenösen, intramuskulären oder subkutanen
Applikation (COPPOC, 1984). Weiterhin beeinflusst die Art des Esters wesentlich die
Freisetzungsgeschwindigkeit des Präparates aus subkutanen oder intramuskulären Depots. Sie
hat somit Einfluss auf die Wirkungs- und Ausscheidungsdauer des Präparates. Es wird
innerhalb der Glucocorticoidester zwischen zwei Hauptgruppen unterschieden:
1) Wässrige Injektionslösungen gut löslicher, also leicht spaltbarer und schnell zum
Wirkungsmaximum führender Glucocorticoidester
2) Langsam resorbierbare Kristallsuspensionen und wässrige Suspensionen schlecht
löslicher Ester mit Depotwirkung
Zur Gruppe der gut löslichen Ester gehören nach BEHREND u. GRECO (1995),
FERGUSON u. HOENIG (2001) und UNGEMACH (2003) Succinat-, Hemisuccinat- und
Phosphatester. Auch der Isonicotinatester ist grundsätzlich dieser Gruppe zuzurechnen. Liegt
der Isonicotinatester als wässrige Suspension eines gut löslichen Esters, und nicht als
Kristallsuspension vor, eignet er sich insbesondere zur intravenösen Injektion, wird aber auch
nach intramuskulärer Injektion schnell resorbiert (UNGEMACH, 2002).
Zur Gruppe der langsam löslichen Ester gehören zum einen die Kristallsuspensionen, zum
anderen die öligen Suspensionen schlecht löslicher Ester. Die Zubereitung als
Kristallsuspension stellt eine mögliche Formulierung des Dexamethason-21-isonicotinatesters
dar. Kristallsuspensionen haben eine spezifische galenische Formulierung und werden aus
ihren Depots nur langsam freigesetzt (KLAUS u. HAPKE, 1996). Weiterhin zählt man
Acetat-, Diacetat- und Tebutatester zu den schwerlöslichen Estern. Schwerlösliche
Glucocorticoidester zeichnen sich durch eine langsame Absorptionsrate und damit durch eine
lange Wirkungszeit aus (BEHREND u. GRECO, 1995). Aufgrund dieser Eigenschaften
werden sie als Depotpräparat eingesetzt (UNGEMACH, 1992; COPPOC, 1984).
Literaturübersicht
41
6.7.2. Dexamethason-21-isonicotinat
Dexamethason-21-isonicotinat (Abbildung 6) trägt den chemischen Namen Pyridin-4-
carbonsäure-(dexamethason-21)-ester. Die Summenformel ist mit C28H32FNO6, die
Molekülmasse mit 478,56 g/mol und die Schmelztemperatur mit 250-252 °C angegeben
(PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE, 1998).
N
OO
O
OH OH
O
F
Abb. 6: Strukturformel Dexamethason-21-isonicotinat
Der Dexamethason-21-isonicotinatester stellt eine der möglichen Esterformulierungen des
Dexamethasons dar. Der Isonicotinatester von Dexamethason als wirksamer Bestandteil in
Voren®-Formulierungen wurde bereits in mehreren Studien getestet (interner Bericht
Boehringer Ingelheim).
Sowohl im Fall von Voren® Suspension als auch im Fall von Voren®-Depot handelt es sich
um Suspensionen mit makrokristalliner Aufbereitung (Kristallsuspensionen). Die kristallinen
Partikel haben in diesen beiden Präparaten eine unterschiedliche Größe. Bei der Voren®
Suspension-Formulierung beläuft sich die Partikelgröße auf < 12 µm, in der Formulierung als
Voren®-Depot sind 70 % der suspendierten Partikel zwischen 12 und 32 µm groß (interner
Bericht Boehringer Ingelheim). Über diese zu variierende Partikelgröße des
Dexamethasonesters kann nach dem internen Bericht Boehringer Ingelheim das
pharmakologische Verhalten der beiden genannten Präparate beeinflusst werden.
Der in Voren®-Depot und Voren® Suspension enthaltene Dexamethason-21-isonicotinatester
ist langsamer löslich als Dexamethason (interner Bericht Boehringer Ingelheim; BEHREND
u. GRECO, 1995). Corticoidester unterliegen im Organismus einer raschen Spaltung
Literaturübersicht
42
(ENGELHARDT, 1963). Die Spaltung des Dexamethason-21-isonicotinats in Dexamethason
und Isonicotinsäure erfolgt durch unspezifische Esterasen, deren Vorkommen und Aktivität
speziesabhängig stark variieren (WEISENBERGER, 1972). Bei der Ratte sind nach 10
Minuten bereits 90 % des Esters hydrolysiert und beim Kaninchen sogar 99 % des Esters. Im
Humanserum liegt die Halbwertszeit des Esters bei 90-100 Minuten. Exakte Angaben zu den
Esteraseaktivitäten anderer Tierarten sind ungenau und lückenhaft. Nach TOUTAIN et al.
(1984) kommt es beim Pferd nach intravenöser wie auch nach intramuskulärer Applikation zu
einer schnellen und vollständigen Hydrolyse, sodass von einer vollständigen systemischen
Verfügbarkeit von Dexamethason nach einer Injektion als Dexamethason-21-isonicotinat
ausgegangen werden kann. Dexamethason ist nach der Hydrolyse, wie bereits in Kapitel
II.6.5. detaillierter beschrieben, im Plasma bis zu 80 % an Protein gebunden.
Die pharmakologischen Parameter des Verteilungsvolumens, der Halbwertszeit und der
Clearance wurden für freies Dexamethason sowie für den Dexamethason-21-isonicotinatester
verglichen (interner Bericht Boehringer Ingelheim). Nach intravenöser Applikation von
Dexamethason und Dexamethason-21-isonicotinat ergibt sich für die Spezies Pferd ein
vergleichbares Verteilungsvolumen von 0,96 l/kg (Dexamethason) bzw. 0,91 l/kg
(Dexamethason-21-isonicotinat) an, während UNGEMACH (2002) für Dexamethason ein
Verteilungsvolumen von etwa 1,2 l/kg erwähnt.
Auch der zeitliche Verlauf der Blutplasmakonzentration von Dexamethason und
Dexamethason-21-isonicotinatester ist vergleichbar (interner Bericht Boehringer Ingelheim).
Beim Pferd liegt die Halbwertszeit für beide Präparate nach intravenöser Applikation von
0,05 mg/kg KGW bei jeweils 0,9 Stunden. Laut UNGEMACH (2002) liegt beim Pferd die
Halbwertszeit für freies Dexamethason sowie für leicht spaltbare, wasserlösliche Ester bei
180-200 Minuten. TOUTAIN et al. (1984) verweisen auf eine Plasmahalbwertszeit für
Dexamethason von ca. 53 Minuten.
Die Metabolisierung von Dexamethason erfolgt, wie bereits in Kapitel II.6.5. erwähnt,
überwiegend in der Leber. Nach UNGEMACH (2002) werden insbesondere fluorierte
Verbindungen, wie auch das Dexamethason, im Vergleich zu anderen synthetischen
Glucocorticoiden sehr langsam abgebaut. Beim Pferd beträgt die totale Clearance von
Dexamethason 0,77 l/h/kg, die von Dexamethason-21-isonicotinat 0,74 l/h/kg (interner
Bericht Boehringer Ingelheim).
Im Gegensatz zum unveresterten Präparat führen die C-21-Ester zu einem veränderten
pharmakologischen Verhalten. Es kommt zu einem verspäteten Wirkungseintritt und einer
länger anhaltenden Wirkung der Esterverbindungen (interner Bericht Boehringer Ingelheim).
Literaturübersicht
43
Speziell bei Kristallsuspensionen ist der Wirkungseintritt verzögert (interner Bericht
Boehringer Ingelheim) und die Wirkdauer deutlich verlängert. Auch UNGEMACH (2002)
erwähnt eine erst nach 24 Stunden eintretende pharmakologische Wirkung nach einer
intramuskulären Verabreichung von Kristallsuspensionen. Die lange Cortisolsuppression
unterstreicht die lang anhaltende Wirkung eines kristallinen Depotpräparates (interner Bericht
Boehringer Ingelheim).
7. Dexamethason als Dopingsubstanz
Wie in Kapitel II.2. bereits erwähnt, ist die dopingrelevante Wirkung von Dexamethason
unter dem Gesichtspunkt „Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit“
einzuordnen. Neben den Glucocorticoiden zählen auch nichtsteroidale Antiphlogistika,
Lokalanästhetika und Dimethylsulfoxid (DMSO) zu dieser Gruppe.
Diese Form des Dopings spielt bei der medikamentösen Schmerzausschaltung bei
Sportpferden besonders im Bereich des Bewegungsapparates eine immer größer werdende
Rolle (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Bei der Anwendung von Glucocorticoiden
zur Behandlung entzündlicher Prozesse des Bewegungsapparates führt die oben bereits
detailliert beschriebene antiexsudative, abschwellende und konsekutiv analgetische Wirkung
zu einer raschen, jedoch rein symptomatischen Besserung. Die somit wiederhergestellte
Beweglichkeit und der Wegfall des Schmerzes ermöglichen den Einsatz eines erkrankten
Pferdes beim Wettkampf, jedoch mit der Gefahr, den Krankheitsprozess durch Überbelastung
zu verschlimmern.
Nach den in Deutschland derzeitig gültigen, und bereits erwähnten, Dopingreglementierungen
besteht zum Zeitpunkt des Rennens oder Wettkampfes kein Unterschied zwischen Therapie
und Doping. Jeder Nachweis eines in den Dopinglisten verbotenen Arzneimittels gilt als
„Doping positiv“ und das gedopte Pferd ist von der Teilnahme am Wettkampf auszuschließen.
Die Jahresstatistik 2004 der Nationalen Anti Doping Agentur (NADA) stellt die Ergebnisse
der im akkreditierten Laboratorium des Instituts für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln untersuchten Dopingproben vor.
Im Bereich des Pferdesports wurden im Jahr 2004 in den, dem Deutschen Sportbund e.V.
(DSB) angehörigen Pferdsportvereinen insgesamt 416 Wettkampfkontrollen und 12
Trainingskontrollen durchgeführt. Sieben dieser im Auftrag der Deutschen Reiterlichen
Literaturübersicht
44
Vereinigung untersuchten Wettkampfkontrollen erwiesen sich als positiv. Die
Wettkampfkontrollen in anderen deutschen Pferdesportverbänden (Direktorium für
Vollblutzucht und Rennen (DIR), National Reining Horse Association (NRHA), Verband der
Züchter des Arabischen Pferdes) beliefen sich auf 814, von denen 8 Proben positiv waren. In
all diesen Analysen wurde in keinem Fall Dexamethason nachgewiesen. In den Analysen, die
im Auftrag von ausländischen und internationalen Verbänden durchgeführt wurden, wurde bei
283 Wettkampf- und einer Trainingskontrolle ein positiver Fall von Dexamethason gefunden.
Auch die Jahresstatistiken der Jahre 2002 und 2003 lassen einen positiven Dopingbefund
aufgrund von Dexamethasonapplikation nur jeweils einmalig erkennen. Wiederum bei den im
Auftrag ausländischer und internationaler Verbände untersuchten Dopingproben.
In den Jahren 1999 und 2000 wurden im Auftrag der FN insgesamt 1237 Dopingproben
analysiert. Von 31 positiven Proben waren drei Proben aufgrund des Vorhandenseins von
Dexamethason positiv.
Doping positive Proben durch andere Wirkstoffe aus der Gruppe der Glucocorticoide wurden
ebenfalls in einzelnen Fällen gefunden.
8. Prinzip der HPLC als Analyseverfahren
Unter der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) versteht man eine automatische
Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie in Säulen (SCHWEDT, 1986). Es handelt sich um
ein chromatographisches Trennverfahren, bestehend aus Pumpe, Trennsäule, Einspritzsystem
und Detektor (LINDSAY, 1987). Die zu untersuchende Substanz wird zwischen einer
mobilen und einer stationären Phase verteilt (SCHWEDT, 1996). Die Probenaufgabe erfolgt
mit Hilfe eines Einspritzsystems, das die zu untersuchende Substanz direkt in die mobile
Phase injiziert und diese dann durch Weiterleitung des Elutionsstrom zur Trennsäule
transportiert (SCHWEDT, 1986). Die zu trennende Substanz wird zusammen mit einem
flüssigen Laufmittel mit Hilfe einer Pumpe durch eine Trennsäule gepumpt. Das Innere der
Trennsäule wird durch einen dichten Verband poröser Teilchen gebildet, um ein hohes
Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu erhalten (UNGER et al., 1995). Der 5 bis 30 cm
langen Trennsäule ist eine Vorsäule vorgeschaltet, die zur Abspaltung von Verunreinigungen
dient. Reagiert ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären
Phase, verbleibt er relativ lange in der Säule. Reagiert er hingegen schwach mit der
stationären Phase, verlässt er die Säule früher (LINDSAY, 1987).
Literaturübersicht
45
Ihre Anwendung findet die HPLC zur Analyse von sehr flüchtigen, stark polaren, ionischen,
thermisch instabilen und leicht zersetzlichen Substanzen, sowie zur Analyse von Substanzen
mit hohen Molmassen (UNGER et al., 1995).
Es werden zwei Methoden der HPLC unterschieden:
1. Normal Phase-HPLC
2. Reversed Phase-HPLC
Die Reversed Phase-HPLC ist in der Praxis die Methode der Wahl und wird bei 70 % aller
HPLC-Trennungen eingesetzt. Auch kam sie in dieser Studie zur Anwendung. Bei dieser
Methode wird eine unpolare stationäre Phase eingesetzt. Das bei der Normal Phase-HPLC als
stationäre Phase dienende polare Silikagel wird bei der Reversed Phase-HPLC vorbereitend
mit einer unpolaren Schicht aus Alkenen überzogen, wodurch die Polarität umgekehrt wird.
Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer mit Acetonitril,
Tetrahydrofuran oder Methanol eingesetzt (SCHWEDT, 1996).
Die Darstellung der Ergebnisse der Stofftrennung erfolgt in Form eines Chromatogrammes,
indem die mobile Phase nach dem Verlassen der Säule durch den Detektor geführt wird
(SCWEDT, 1996). Je nach Stärke der Wechselwirkung der Bestandteile der untersuchten
Substanz mit der Säule erscheinen unterschiedliche Substanzen zu verschiedenen
Retentionszeiten am Ende der Säule, wo sie mit Hilfe von Detektoren sichtbar gemacht
werden (SCWEDT, 1986).
Es stehen folgende Detektoren zur Verfügung:
• UV-Detektor
• Lichtstreudetektor
• Fluoreszenzdetektor
• Brechungsindexdetektor
• Massenspektrometer
• Leitfähigkeitsdetektor
• Elektrochemischer Detektor
In dieser Studie erfolgte die Detektion mit Hilfe eines Massenspektrometers (MS), so dass
nachfolgend nur auf dieses Detektorsystem eingegangen wird.
Literaturübersicht
46
Die Massenspektrometrie ist ein Analyseverfahren zur Massentrennung und –messung von
Ionen (SEIBL, 1970). Neben der Bestimmung der Häufigkeit, mit der geladene Moleküle und
deren Massenfragmente auftreten, werden auch die Struktur und die Zusammensetzung von
Verbindungen und Gemischen bestimmt. Auch sind der qualitative sowie der quantitative
Nachweis sehr kleiner Substanzmengen möglich.
Ein Massnspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, einem Analysator und einem Detektor
(LEHMANN, 1996). Die Ionenquelle erzeugt aus der zu untersuchenden Probe einen Strahl
gasförmiger Ionen, der Analysator trennt diese nach Masse und Ladung auf und der Detektor
bildet das Massenspektrum ab. Die in einer Zeiteinheit gebildeten Ionen bezeichnet man als
Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt- oder Totalionenstrom
(BUDZIKIEWICZ, 1998).
Nach LEHMANN (1996) stehen in der analytischen Praxis folgende Ionisationsquellen zur
Verfügung:
1. Elektronen-Stoß-Ionisation (EI, electron impact)
2. Chemische Ionisation (CI)
3. Elektrospray-Ionisation (ESI)
4. Chemische Ionisation unter Atmosphärendruck (APCI, Atmospheric Pressure
Chemical Ionization)
5. Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation (MALDI, Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization)
An dieser Stelle soll jedoch nur die in dieser Studie verwendete, unter Punkt vier genannte
Form der chemischen Ionisation näher erläutert werden.
Bei der chemischen Ionisation unter Atmosphärendruck wird das aus der HPLC-Säule
austretende Eluat unter atmosphärischem Druck über eine beheizte Kapillare weitergeleitet
und in eine geheizte und unter Vakuum stehende Verdampfungskammer gesprüht. In dieser
Verdampfungskammer befindet sich eine Glühkathode, an welcher die nun gasförmigen
Moleküle ionisiert und anschließend über eine kleine Öffnung in der Verdampfungskammer
an das Massenspektrum zur Analyse weitergeleitet werden (LEHMANN, 1996).
Das Massenspektrometer wird hier in Form einer Reihenschaltung oder Kopplung zweier
Massenspektrometer genutzt, auch Tandem–Massenspektrometer (MS/MS) genannt. Ziel ist
es, die im Massenspektrometer getrennten Ionen zu fragmentieren und die Fragmente erneut
mittels Massenspektrometrie zu untersuchen (LEHMANN, 1996). Zwischen den zwei
Literaturübersicht
47
Analysatoren wird eine so genannte Kollisionszelle (Stoßkammer) eingebaut, so dass die
Ionen durch Kollision mit Gasatomen angeregt werden und daraufhin sehr spezifisch in
leichtere Ionen zerfallen.
Nach LEHMANN (1996) handelt es sich bei den Tandem-Massenspektrometern um
Quadrupol-Massenpektrometer. Im ersten Analysatorquadrupol werden die durch die
Ionenquelle produzierten Ionen aufgereinigt, d.h. Bestandteile, die nicht zum Analyten
gehören, werden isoliert. Die ins zweite Quadrupol, die Kollisionszelle, gelangenden Ionen
werden angeregt, und im dritten Quadrupol erfolgt die Analyse der entstandenen Ionen. Durch
die Produktionenanalyse wird auf die Struktur der im ersten Quadrupol isolierten Ionen
zurückgeschlossen. Es können alle Produktionen bestimmt werden, aber auch nur ein oder
zwei Fragmentionen, so dass sehr empfindlich und selektiv quantifiziert werden kann
(LEHMANN, 1996). Im Fall der Fragmentionen spricht man laut auch von MRM (Multi
Reaction Monitoring).
Die entstandenen Fragmentionen werden zur abschließenden Analyse an einen Detekor,
welcher sich der Säule direkt anschließt, weitergeleitet. Das Detektionssystem macht das
chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Das entstandene
Signal ist proportional zur Menge der gemessenen Substanz und wird in Abhängigkeit von der
Zeit in Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm stellt die Retentionszeit des
Peaks sowie seine Höhe und Fläche dar. Die Retentionszeit entspricht der Zeitspanne von der
Probenaufgabe bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Durch Vergleich der
Flächenwerte von Substanz und internem Standard kann auf die Konzentration der Probe
geschlossen werden.
Die beschriebene kollisions-induzierte Dissoziation mit anschließender HPLC-Messung
gekoppelt mit einer Tandem-Massenspektrometrie ist für Corticosteroide im Allgemeinen,
aber auch Dexamethason im speziellen, gebräuchlich und in der Literatur beschrieben
(ANTIGNAC et al, 2000).
Material und Methoden
48
III. Material und Methoden
1. Versuchsaufbau
Bei dem durchgeführten Versuch handelt es sich um eine pharmakokinetische Studie an
insgesamt zwölf Pferden. Nach Applikation von zwei verschiedenen Dexamethasonpräparaten
an je sechs Pferden wurden Blut- und Urinproben dieser Pferde gewonnen. Anschließend
wurden diese Proben im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln
aufgearbeitet.
1.1. Testsubstanzen
In der Studie wurden die Substanzen Voren® Suspension und Voren®-Depot der Firma
Boehringer Ingelheim verwendet.
Voren® Suspension : Wirkstoff : Dexamethason-21-isonicotinat (1 mg/ml)
Bestandteile: 1,35 mg Methyl (4-hydroxybenzoat)
0,15 mg Propyl (4-hydroxybenzoat)
Natriumchlorid
Polysorbat 80
Wasser für Injektionszwecke
Chargennummer: S20564
Voren®-Depot : Wirkstoff : Dexamethason-21-isonicotinat (3 mg/ml)
Bestandteile: 1,35 mg Methyl (4-hydroxybenzoat)
0,15 mg Propyl (4-hydroxybenzoat)
Natriumchlorid
Polysorbat 80
Wasser für Injektionszwecke
Material und Methoden
49
Chargennummer: S20605
Beide Präparate wurden in dieser durchgeführten Arbeit einmalig und in der vom Hersteller
empfohlenen Dosierung eingesetzt.
1.2. Versuchstiere
Die Versuchspferde wurden vom Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für
Landwirtschaft (FAL) in Mariensee gehalten und untergebracht. Als Stall diente ein großer
Boxenlaufstall mit einzelnen Futterplätzen. Über Tag bewegten sich die Pferde auf einem
angrenzenden Paddock, über Nacht hatten sie Auslauf auf einer Weide. Die Fütterung bestand
aus Grassilage bzw. Gras, jeweils zur freien Verfügung. Wasser stand in Form einer
Selbsttränke ebenfalls ad libitum zur Verfügung.
Die Tiere bildeten eine homogene Gruppe von Wallachen (zehn Wallache der Rasse
Warmblut, zwei Wallache der Rasse Englisches Vollblut) im Alter von sechs bis elf Jahren.
Alter, Geschlecht und Rasse der Tiere sind Tabelle 2 zu entnehmen.
Pferd [Nr.]
Alter [Jahre]
Geschlecht Rasse
1 9 Wallach Warmblut 2 9 Wallach Warmblut 3 9 Wallach Warmblut 4 9 Wallach Vollblut 5 10 Wallach Warmblut 6 6 Wallach Vollblut 7 10 Wallach Warmblut 8 11 Wallach Warmblut 9 8 Wallach Warmblut 10 10 Wallach Warmblut 11 9 Wallach Warmblut 12 9 Wallach Warmblut
Tabelle 2: Alter, Geschlecht und Rasse der Versuchspferde
Zu Versuchsbeginn sowie während des gesamten Versuchsablaufes erwiesen sich alle Tiere
als klinisch gesund. Die Nierengesundheit der Pferde wurde mittels Überprüfung der
Kreatininkonzentrationen im Plasma gezeigt. In den Tabellen 29-40 im Anhang sind die
ermittelten Kreatininwerte jedes einzelnen Pferdes aufgeführt.
Material und Methoden
50
1.3. Versuchsablauf
Der praktische Teil der Studie, die Phase der Probenentnahme, gliederte sich in einen
Vorversuch und einen anschließenden Hauptversuch.
1.3.1. Vorversuch
Der pro Testsubstanz an einem Pferd pro Tiergruppe (Pferd 5 und Pferd 12) durchgeführte
Vorversuch diente zur Abschätzung der zu erwartenden Dexamethasonkonzentrationen in den
gewonnenen Blut- und Urinproben, zur Überprüfung des Probenentnahmeschemas, sowie zur
Entwicklung eines geeigneten Analyseverfahrens für Dexamethason. Der Versuchsaufbau ist
in Kapitel III.1.3.2. näher beschrieben.
1.3.2. Hauptversuch
In diesen Teil des Versuchs waren alle zwölf Versuchspferde beteiligt. Die Gruppe wurde
geteilt. Sechs der Pferde dienten der Untersuchung von Voren® Suspension, die anderen
sechs der von Voren®-Depot.
Direkt vor Beginn dieser Versuchsphase wurden alle Pferde mit Hilfe einer digitalen
Viehwaage gewogen, um die Dosierung der Präparate genau auf das Körpergewicht der
einzelnen Tiere abstimmen zu können. Die Dosierung von Voren® Suspension betrug 0,02
mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat, was einer Arzneimittelmenge von 2 ml
pro 100 kg Körpergewicht entspricht. Voren® Suspension wurde den sechs Pferden der ersten
Gruppe einmalig intravenös verabreicht. Voren®-Depot wurde in einer Konzentration von
0,06 mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat dosiert, was ebenfalls einer
Arzneimittelmenge von 2 ml pro 100 kg Körpergewicht entspricht. Voren®-Depot wurde den
sechs Pferden der zweiten Gruppe einmalig intramuskulär appliziert.
Umgerechnet auf das Körpergewicht ergeben sich für die eingesetzten Pferde die den
nachfolgenden Tabellen 3 und 4 zu entnehmenden Arzneimittelmengen:
Material und Methoden
51
Pferd [Nr.]
Testsubstanz Gewicht [kg]
Wirkstoffmenge[mg]
Arzneimittelmenge [ml]
1 Voren® Suspension i.v. 666 13,32 13,32 2 Voren® Suspension i.v. 630 12,60 12,60 3 Voren® Suspension i.v. 606 12,12 12,12 4 Voren® Suspension i.v. 450 9,00 9,00 5 Voren® Suspension i.v. 644 12,88 12,88 6 Voren® Suspension i.v. 566 11,32 11,32
Tabelle 3: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 1 und verabreichte Menge an Voren®
Suspension (Dosierung: 0,02 mg/kg Körpergewicht)
Pferd [Nr.]
Testsubstanz Gewicht [kg]
Wirkstoffmenge[mg]
Arzneimittelmenge [ml]
7 Voren®-Depot i.m. 602 36,12 12,04 8 Voren®-Depot i.m. 586 35,16 11,72 9 Voren®-Depot i.m. 598 35,88 11,96 10 Voren®-Depot i.m. 630 37,80 12,60 11 Voren®-Depot i.m. 634 38,04 12,68 12 Voren®-Depot i.m. 644 38,64 12,88
Tabelle 4: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 2 und verabreichte Menge an Voren®-
Depot (Dosierung: 0,06 mg/kg Körpergewicht)
Eine halbe Stunde vor Applikation der Testsubstanz wurde von allen Pferden eine Urinprobe
gewonnen, welche als Leer–Urinprobe diente. Auch wurde eine Leer–Blutprobe pro Pferd
entnommen, nachdem bei jedem Pferd ein Venenverweilkather gelegt wurde. Der Katheter
(Vygonüle S®) wurde jedem Pferd nach vorheriger Rasur und Desinfektion der betreffenden
Stelle in die Vena jugularis sinister gelegt und dort mit nicht resorbierbarem Faden (Filovet
Bengen®) fixiert.
Voren® Suspension wurde den sechs Tieren der ersten Gruppe verabreicht, indem jedem
dieser Pferde ein Verweilkatheter nach dem oben bereits beschriebenen Verfahren in die Vena
jugularis dextra gelegt wurde. Durch diesen Katheter wurde die jeweils errechnete
Arzneimittelmenge mittels Einmalspritzen streng intravenös appliziert. Die Spritze wurde
nach der Applikation dreimal durch Aspiration von Vollblut gespült, um Medikamentenreste
in der Spritze zu vermeiden. Direkt nach der Applikation wurde der Katheter wieder entfernt
und die Einstichstelle mit einer antiseptischen Salbe (Vet-Sept Salbe®) behandelt.
Die Applikation von Voren®-Depot erfolgte bei den sechs Tieren der zweiten Gruppe, nach
vorheriger Desinfektion der Einstichstelle, intramuskulär in die lange Sitzbeinmuskulatur der
linken Hintergliedmaße. Zu diesem Zweck wurden Einmalkanülen und -spritzen verwendet.
Material und Methoden
52
Vor Injektion der berechneten Stoffmenge aus den Einmalspritzen wurde im Gewebe
asperiert, um zu gewährleisten, dass kein Gefäß beim Einstich getroffen wurde. Nach
vollzogener Applikation der Präparate wurde nun in festgelegten Zeitabständen, wie sie
Tabelle 5 zeigen, Blut– und Urinproben entnommen. Die Proben wurden reproduzierbar zur
gleichen Tageszeit entnommen, um eine Vergleichbarkeit der Probenergebnisse zu
gewährleisten.
Die Blutproben wurden in vier, jeweils 9 ml fassenden, mit Lithium–Heparin beschichteten
Monovetten® (Sarstedt) aufgefangen. Zwölf Stunden nach Versuchsbeginn wurden die
Verweilkatheter in der linken Jugularvene entfernt und an der Einstichstelle ebenfalls mit
antiseptischer Salbe (Vet-Sept Salbe®) behandelt. Die weiteren Blutproben wurden durch
Punktion der Vena jugularis mittels einer Einmalkanüle entnommen.
Die Pferde waren darauf konditioniert, bei Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles
Urin abzusetzen. Die Urinproben wurden in Form von Spontanharnproben gewonnen und mit
Hilfe eines Hartplastikbechers, in welchen ein Einmalplastikbecher eingesetzt wurde,
aufgefangen. Der Hartplastikbecher war am Ende eines ca. 50 cm langen Stabes befestigt.
Material und Methoden
53
Voren®-Depot Voren® Suspension Blut Urin Blut Urin Proben-Nr.: Zeit [Std] Zeit [Std] Proben-Nr.: Zeit [Std] Zeit [Std]
1 -0,25 -0,5 1 -0,25 -0,5 2 1 2 2 0,25 1 3 2,25 5 3 0,5 2 4 3 7 4 1,25 5 5 4 12 5 2,25 7 6 6 48 6 3 12 7 8 72 7 4 24,5 8 12,25 96 8 6 36 9 23,50 120 9 8 48,5 10 48,25 144 10 10 72,5 11 72,25 168 11 12,25 96,5 12 96,25 192 12 24,25 120,5 13 120,25 216 13 48,25 144,5 14 144,25 240 14 72,25 168,5 15 168,25 288 15 96,25 192,5 16 192,25 336 16 120,25 216,5 17 216,25 384 17 144,25 240,5 18 240,25 432 18 168,25 264,5 19 264,25 480 19 216,25 312,5 20 312,25 552 20 264,25 384,5 21 360,25 624 21 312,25 456,5 22 408,25 696 22 360,25 528,5 23 456,25 768 24 840 25 912
Tabelle 5: Entnahmezeitpunkte von Blut– und Urinproben im Hauptversuch
1.4. Probenaufbereitung und Probenlagerung
Das zum jeweiligen Entnahmezeitpunkt mit Monovetten® entnommene Vollblut wurde direkt
zentrifugiert (1000 Umdrehungen pro Minute, 15 Minuten). Anschließend wurde das den
Überstand der jeweiligen Probe darstellende Plasma mittels steriler Einmalkanülen und 20 ml
Einmalspritzen in ein 16 ml fassendes Glasgefäß mit Kunststoffschraubdeckel überführt. Pro
Probe wurden weiterhin jeweils drei Eppendorfgefässe mit je 1,5 ml Plasma befüllt. Die
Plasmaproben wurden bis zur Aufarbeitung bei -20 °C gelagert.
Die in Einwegplastikbechern aufgefangenen Urinproben wurden umgehend in jeweils einen
100 ml fassenden Urinbecher aus Kunststoff mit Schraubverschluss umgefüllt. Bis zur
Analyse wurden diese Proben bei ebenfalls -20 °C aufbewahrt.
Material und Methoden
54
2. Aufarbeitung der Plasma- und Urinproben
Die bei -20 °C gelagerten Blut– und Urinproben des Vorversuchs wurden mit den in Kapitel
III.5.1. und III.5.2. beschriebenen Analysemethoden im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln aufgearbeitet. Die gemessenen Dexamethasonkonzentrationen dienten
zur Abschätzung der Anreicherung sowie Abflutung von Dexamethason in Blut und Urin. Auf
diese Konzentrationsbereiche bezogen wurden die Analysemethoden abgestimmt und
validiert, um den gesamten ermittelten Konzentrationsbereich in Blut und Urin abdecken zu
können.
3. Methodenentwicklung
Diese Versuchsphase diente dem Ziel, eine geeignete Analysemethode einschließlich
Aufarbeitung der gesammelten Blut– und Urinproben zum Nachweis von Dexamethason zu
entwickeln.
3.1. Chemikalien
Die zur Analyse der Blut– und Urinproben benötigten Gegenstände und Chemikalien standen
im Institut für Biochemie der Sporthochschule in Köln zur Verfügung oder wurden durch
dieses bereitgestellt.
Tabelle 6 sind die Chemikalien sowie der jeweilige Hersteller zu entnehmen.
Material und Methoden
55
Chemikalie Herstellung durch: Acetronitril J.T.Baker, Deventer, Holland Ammoniumacetat Merck KGaA, Darmstadt Bidestilliertes Wasser (Milli-Q-Wasser) Institut für Biochemie, Köln ß-Glucuronidase von Escherichia coli Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim ß-Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Destilliertes Wasser Institut für Biochemie, Köln D5-Androsteron-glucuronid-Lösung (1000 µg/ml)
Institut für Biochemie, Köln
Dexamethason Firma Sigma Dexamethason-21-isonicotinat Pharmakologie, Tierärztliche
Hochschule Hannover Essigsäure (100 %) Merck KGaA, Darmstadt Fluocortolon-Stammlösung (1000 µg/ml) Institut für Biochemie, Köln Kalilauge (10 N) Institut für Biochemie, Köln Kaliumcarbonat KMF Laborchemie GmbH,
Lohmar L-Cystein SERVA Electrophoresis GmbH,
Heidelberg Methanol, vor Gebrauch destilliert Institut für Biochemie, Köln Natrium-Acetat-Puffer (4 mol/l) Institut für Biochemie, Köln Natriumhydrogencarbonat KMF Laborchemie GmbH,
Lohmar n–Pentan Merck KGaA, Darmstadt Phophatpuffer (0,8 mol/l) Institut für Biochemie, Köln Salzsäure (10 N) Merck KGaA, Darmstadt tertiär Butanol Merck KGaA, Darmstadt tertiär Butylmethylether (TBME), vor Gebrauch destilliert
KMF Laborchemie GmbH, Lohmar
Tabelle 6: verwendete Chemikalien
3.2. Herstellung von Standardlösungen
Zur Quantifizierung des Dexamethasongehaltes wird gegen einen Referenzstandard
verglichen. Zur Herstellung des Dexamethasonstandards wurden 10 mg Dexamethason
(Firma Sigma) in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben eingewogen und dieser bis zur
Markierung des Kolbens mit destilliertem Methanol aufgefüllt. Der Inhalt wurde gut
durchmischt. Der so entstandene Referenzstandard hatte eine Konzentration von 1 mg/ml.
Aus dieser Lösung wurden durch anschließende Verdünnungsschritte mit wiederum Methanol
weitere Dexamethasonstandards mit den Konzentrationen 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1µg/ml und
Material und Methoden
56
0,01 µg/ml hergestellt. Die Referenzstandards wurden über den gesamten Zeitraum der
Probenaufarbeitung bei -20 °C aufbewahrt.
3.3. Wahl und Herstellung des internen Standards
Aufgrund seiner großen strukturellen Ähnlichkeit, seiner Stoffgruppenzugehörigkeit, seines
chemischen Verhaltens und seiner reproduzierbaren Ergebnisse in wiederholten
Kalibrierungen im Vergleich zum Dexamethason wurde Fluocortolon (6α-Fluoro-16α-methyl-
1-dehydrocorticosteron) als interner Standard gewählt.
Zur Herstellung des internen Standards wurden 10 µl einer 1000 µg/ml Fluocortolon-
Stammlösung in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben vorgelegt und bis zur Markierung
des Kolbens mit destilliertem Methanol aufgefüllt, und der Inhalt durchmischt. Der
entstandene Standard hatte eine Konzentration an Fluocortolon von 1 µg/ml.
Dem internen Standard, welcher den aufzuarbeitenden Urinproben zugesetzt wurde, wurde,
bei gleicher Fluocortolonkonzentration, zusätzlich noch 250 µl einer 1000 µg/ml D5-
Androsteron-glucuronid-Lösung zusetzt. Diese sollte als Hydrolysemarker dienen. Ein
Hydrolysemarker zeigt als Indikator die Vollständigkeit einer abgelaufenen Hydrolyse. In
dieser Studie wurden mittels Hydrolyse die an Dexamethason gebundenen Glucuronide
abgespalten und die Gesamtfraktion an Dexamethason frei. Die Vollständigkeit dieser
abgelaufenen Hydrolyse wurde, wie in Kapitel IV.3. gezeigt, durch das eingesetzte D5-
Androsteron-glucuronid-Lösung überprüft. Die internen Standards wurden ebenfalls bei -20
°C gelagert.
3.4. Entwicklung der angewandten Methoden
Im Rahmen der Routinediagnostik besteht im Institut für Biochemie der Sporthochschule in
Köln eine Analysemethode zum Nachweis von Glucocorticosteroiden im Pferdeplasma und –
urin. Diese Methode wurde auf die Detektion von Dexamethason abgestimmt.
Die Leer-Plasmaproben und die Leer-Urinproben wurden jeweils mit einer vorher
festgelegten Menge Dexamethason sowie einer definierten Menge internem Standard versetzt,
so dass Kalibrationsreihen beider Matrices entstanden. Diese wurden nach den bestehenden
Analysemethoden aufgearbeitet und anschließend mit der in Kapitel III.3.5. beschriebenen
Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Methode gemessen.
Material und Methoden
57
Die gemessenen Dexamethasonkonzentrationen lagen im Blut jedoch deutlich unter den zuvor
zugegebenen Dexamethasonkonzentrationen. Aufgrund dieser Konzentrationsunterschiede
mussten Veränderungen an der Methode vorgenommen werden. Die eingesetzte
Plasmamenge sowie die Menge des zum Anlösen der bearbeiten Plasmaprobe verwendeten
Methanols wurden verdoppelt. Die eingesetzte Urinmenge blieb gleich. Jedoch wurde bei der
Aufarbeitung der Urinproben die Menge des Extraktionsmittels (tertiär Butylmethylether) um
1 ml verringert.
3.5. Chromatographie/HPLC
Zur Probenmessung wurde die nachfolgend beschriebene Kombination eines Hochleistungs-
Flüssigchromatographen und eines Massenspektrometers (HPLC/MS/MS) genutzt.
HPLC:
Gerät: HP Series 1100 Liquid Chromatograph (Waldbronn, Germany)
Säule: Merck LiChroCART®RP 18 endcapped 55x4 mm
Eluent: A: H2O, 4 mmol Ammoniumacetat /l, 0,1 ml Essigsäure (100 %)/l; ph: 3,5
B: Acetonitril
Gradient:
Tabelle 7: Gradientenbedingungen
Injektionsvolumen: 20 µl
Run Time: 9 min
Post Time: 3, 5 min
Schritt Zeit [min] Flussrate [µl/min] Eluent A(%) Eluent B(%)1 0,10 500 90 10 2 8,00 500 10 90 3 9,00 500 10 90 4 9,01 500 90 10 5 12,51 500 90 10
Material und Methoden
58
Massenspektrometer:
Gerät: Perkin Elmer Sciex API 2000 Triple-Quadrupol-Massenspekrometer (Foster City,
California, USA)
Interface Temperature: 475°C
Ionenquelle: APCI
Ionisationseinstellung: positiv
Aquisitionseinstellung: MRM
Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10E-5 torr
Kollisionsenergie: optimiert für jedes Ionenprodukt
3.6. Hydrolyseversuche Urin
Um in den Urinproben die Gesamtmenge an Dexamethason, d.h. sowohl das frei vorliegende
Dexamethason als auch den glucuronidiert vorliegenden Anteil an Dexamethason zu erfassen,
wurden der eigentlichen Analysemethode versuchsweise verschiedene Hydrolysen
vorgeschaltet. Dazu wurden Urinproben mit einer vorher ermittelten
Dexamethasonkonzentration verwendet.
Da wenige Erfahrungswerte vorlagen, welche Form der Hydrolyse zu diesem Zweck am
effektivsten ist, wurden drei Hydrolysearten getestet.
1) Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli
Es wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard versetzt.
Durch Zugabe von 1,5 ml Phosphat-Puffer (0,8 mol/l) wurde der Urin auf einen ph-Wert von
7 eingestellt. Es folgte die Zugabe von 70 µl ß-Glucuronidase von Escherichia coli und
anschließende Inkubation für eine Stunde bei 50 °C im Wasserbad. Nach Ablauf der
vorgesehenen Inkubationszeit wurden die Proben nach der in Kapitel III.5.2. beschriebenen
Analysemethode aufgearbeitet.
2) Hydrolyse mit ß-Glucuronidase /Arylsulfatase von Helix pomatia
Es wurden wiederum 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard
versetzt. Durch Zugabe von 0,4 ml Natrium-Acetat-Puffer (4 mol/l) wurde der Urin auf einen
Material und Methoden
59
ph-Wert von 5,2 eingestellt. Es folgte die Zugabe von 50 µl ß-Glucuronidase/Arylsulfatase
von Helix pomatia und anschließende Inkubation für zwei Stunden bei 50 °C im Wasserbad.
Nach Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit wurden die Proben nach der in Kapitel III.5.2.
beschriebenen Analysemethode aufgearbeitet.
3) Saure Hydrolyse
Nochmals wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard
versetzt. Es folgte die Zugabe von 0,5 ml Salzsäure (10 N) und ca. 100 mg L-Cystein. Nach
Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit von einer Stunde bei 100 °C im Heizblock wurden
0,5 ml Kalilauge (10 N) zugegeben. Anschließend wurden die Proben nach der in Kapitel
III.5.2. beschriebenen Analysemethode aufgearbeitet.
Die Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli und ß-Glucuronidase von Helix
pomatia erwiesen sich beide als effektiv. Die zuvor ermittelten Dexamethasonkonzentrationen
der Proben wurden überschritten. Die saure Hydrolyse erbrachte einen geringen Anstieg der
Dexamethasonkonzentration und wurde somit bei weiteren Hydrolyseversuchen außer Acht
gelassen.
In einem weiteren Schritt wurde die Hydrolysedauer verlängert. Die Hydrolysen mit ß-
Glucuronidase von Escherichia coli bzw. Helix pomatia wurden wiederholt und die
Probenansätze bei 37 °C über Nacht für 14 Stunden im Wasserbad inkubiert. In beiden Fällen
wurde eine Erhöhung der Dexamethasonausbeute von 200 % bis knapp 300 % erzielt. In den
Probenansätzen der Hydrolyse mit Helix pomatia schwankte der Hydrolysemarker sehr stark,
obwohl dieser nach abgelaufener und anzunehmend vollständiger Hydrolyse reproduzierbar
gleich bleiben sollte. Dieses Kriterium wurde in den Probenansätzen der Hydrolyse mit ß-
Glucuronidase von Escherichia coli besser erfüllt.
Anhand dieser Erkenntnisse wurde die Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli
als Hydrolyse der Wahl festgelegt.
3.7. Bewertung der Methodenentwicklung
Mit den Erkenntnissen aus den Vorarbeiten zur Methodenentwicklung konnte gezeigt werden,
dass die Methoden eine eindeutige und reproduzierbare Darstellung der zu untersuchenden
Material und Methoden
60
Substanzen im Chromatogramm erbrachten. Sie wurden als geeignet angesehen, so dass sie
zur Aufarbeitung der Vorversuchsproben sowie der Hauptversuchsproben verwendet wurden.
Weiterhin konnte eine Entscheidung bezüglich der Entnahmezeiten der Blut– und Urinproben
getroffen werden. Da Dexamethason in den letzten entnommenen Proben des Vorversuchs
noch deutlich nachzuweisen war, wurde der Probenentnahmezeitraum des nachfolgenden
Hauptversuches für Blut bei Voren® Suspension um acht Tage, bei Voren®-Depot um neun
Tage verlängert. Der Entnahmezeitraum für die Urinproben verlängerte sich bei Voren®
Suspension um dreizehn Tage, bei Voren®-Depot um wiederum neun Tage.
4. Methodenvalidierung
Vor Aufarbeitung und Messung der Hauptversuchsproben sollte mittels Methodenvalidierung
gezeigt werden, dass die entwickelten Analysemethoden geeignet waren, und sowohl sichere
als auch reproduzierbare pharmakokinetische Daten für den Wirkstoff Dexamethason
lieferten. Für die Validierung wurden Leer-Plasma- und Leer-Urinproben sowie tagesaktuelle
Kalibrationskurven mit mindestens fünf Kalibrationspunkten nach den in Kapitel III.5.1. und
III.5.2. beschriebenen Analysemethoden aufgearbeitet.
Die nachfolgend beschriebenen Kriterien galten in dieser Studie als Validierungsparameter.
4.1. Selektivität
Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode, verschiedene nebeneinander vorliegende und zu
bestimmende Komponenten ohne gegenseitige Störung zu erfassen und sie somit eindeutig zu
identifizieren (KROMIDAS, 1999). Man versteht darunter auch das Maß für die Güte der
Trenntechnik einer HPLC–Methode. Sie ist gekennzeichnet durch eine ausreichende
Trennung der zu analysierenden Substanz von allen denkbaren Störsubstanzen inklusive der
Matrix, was sich im Chromatogramm anhand der unterschiedlichen Retentionszeiten der
Peaks darstellt.
Um die Selektivität der gewählten HPLC-Methode abzusichern, wurden Leer–Plasmaproben
und Leer-Urinproben von sechs Pferden an den in Tabelle 8 aufgezeigten Kalibrationspunkten
aufgearbeitet und analysiert.
Material und Methoden
61
Leer-Matrix Konzentrationspunkte der Kalibrationskurve [ng/ml]
Plasma 0,1 / 0,25 / 0,5 / 1 / 1,5 / 2 / 5 Urin 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 20 / 50 Tabelle 8: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur
Bestimmung der Selektivität
4.2. Linearität
Mit dem Begriff der Linearität wird in der Analytik die Korrelation zwischen Signal des
Detektors und Konzentration des Analyten verbunden. Diese Korrelation wird durch eine
Kalibrierfunktion, die sich als eine Gerade darstellen sollte, beschrieben. Linearität ist somit
die Fähigkeit einer Methode, innerhalb eines gegebenen Konzentrationsbereiches Ergebnisse
zu liefern, die der Konzentration des Analyten direkt proportional sind (KROMIDAS, 1999).
Die Überprüfung der Linearität erfolgte an sechs Leermatrixproben für Plasma und Urin.
Diese wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten versetzt und zwar so, dass
sie den gesamten Messbereich abdeckten, äquidistant waren und aus zwei Wiederholungen
eines jeden Messpunktes bestanden (DIN 38402, 1986). Messpunkte unterhalb der
Nachweisgrenze und Leermatrixwerte dürfen nicht zu der Kalibrationskurve hinzugerechnet
werden (DIN 32645, 1994). Die nach diesen Kriterien dotierten Leermatrixproben der
Kalibrationsreihe wurden an drei aufeinander folgenden Tagen jeweils aufgearbeitet und
gemessen.
Die Kalibrationspunkte wurden wie folgt festgelegt (Tabelle 9):
Leer-Matrix Konzentrationspunkte der
Kalibrationskurve [ng/ml] Plasma 0,1 / 0,25 / 0,5 / 1 / 1,5 / 2 / 3 / 4 Urin 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 /15 / 20 / 25 Tabelle 9: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur
Bestimmung der Linearität
Die nach der chromatographischen Messung erhaltenen Rohdaten werden gegen die
Konzentration der einzelnen Kalibrationspunkte aufgetragen, graphisch dargestellt und
standardmäßig visuell auf Ausreißer und Linearität untersucht.
Material und Methoden
62
4.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze
Die Nachweisgrenze (= Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) ist die niedrigste
Konzentration eines Analyten, bei der das Messignal ein vom Leerwert unterscheidbares
Instrumentensignal liefert.
In dieser Studie erfolgte die Bestimmung der Nachweisgrenze anhand der
Kalibrierkurvenmethode, einer indirekten Methode nach DIN 32645 (1994). Hierbei wird
zunächst aus den Residuen der linearen Regression die Reststandardabweichung sxo aus der
Summe der Abweichungsquadrate Qx der Freiheitsgraden der linearen Kalibration f errechnet.
sxo = f
Qx
sxo = Reststandardabweichung
Qx = Summe der Abweichungsquadrate
f = Freiheitsgrade der linearen Kalibration
Mittels dieser Standardabweichung sxo und dem errechneten Mittelwert X aller
Kalibrationskonzentrationen wird dann das Konfidenzintervall (Vertrauensbereich, VB) für
den Merkmalswert Null (VB0) errechnet, wobei eine t-Verteilung für eine vorgesehene
Fehlerwahrscheinlichkeit α angenommen wird.
VB0 = sxo · t f, α · 1²1 ++QxX
n
VB0 = Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null
sxo = Reststandardabweichung
t f, a = ein vorgegebener Tabellenwert
X = Mittelwert
Qx = Summe der Abweichungsquadrate
n = Anzahl der Proben
Der Term t f, a ist ein vorgegebener Tabellenwert oder kann alternativ mit Hilfe der unten
aufgeführten Formel berechnet werden:
Material und Methoden
63
t f, α = TINV (α; f )
TINV (α; f ) = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen des Freiheitsgrades (f) sowie der
Fehlerwahrscheinlichkeit (α)
Über die Steigung α der linearen Regressionsgeraden kann die Nachweisgrenze (NG) mit
einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α folgendermaßen errechnet werden:
NG = α
οVB
NG = Nachweisgrenze
VB0 = Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null
a = Fehlerwahrscheinlichkeit
Nach DIN 32645 (1994) beschreibt die Bestimmungsgrenze die kleinste quantifizierbare
Menge eines Analyten und wird somit auch als Quantifizierungsgrenze (= limit of
quantification, LOQ) bezeichnet. Es ist die Menge des Analyten, die mit einer vorgegeben
Richtigkeit und Präzision quantitativ erfasst werden kann. Dieser Punkt entspricht dem
niedrigsten Kalibrationspunkt bei einer Reproduzierbarkeit von ≤ 20 % und einer
Messgenauigkeit von 100 ± 20 % für diesen Punkt. Der relative Fehler ist kleiner oder gleich
20 % (EHSLC, 2002).
Zur Bestimmung der Quantifizierungsgrenze wurden fünf Proben aus dem gewünschten
Kalibrationsbereich an drei aufeinander folgenden Tagen aufgearbeitet und
chromatographisch gemessen.
4.4. Richtigkeit
Die Richtigkeit ist das Maß der Übereinstimmung zwischen einem ermittelten und einem
erwarteten Referenzwert. Man bezieht sich demnach auf diesen Referenzwert, der als
fehlerfrei und richtig gilt.
In dieser Studie wurde die Richtigkeit überprüft, indem jeweils fünf Leer-Matrixproben für
Plasma und Urin mit einer niedrigen (low qualitiy control standard, LQC), einer mittleren
(midrange quality control standard, MQC) und einer hohen (high quality control standard,
Material und Methoden
64
HQC) Kalibrationskonzentration des zu analysierenden Stoffes dotiert wurden. Anschließend
wurden die Probenansätze an drei aufeinander folgenden Tagen aufgearbeitet und
chromatographisch gemessen (EHSLC, 2002). Die ermittelten Ergebnisse sollten für den
mittleren und den hohen Kalibrationspunkt nicht mehr als 15 %, für den niedrigsten
Kalibrationspunkt nicht mehr als 20 % vom Referenzwert abweichen.
Die relative Abweichung wird auch als relativer Fehler (RE) bezeichnet.
Um die relative Abweichung des ermittelten vom erwarteten Referenzwert zu bestimmen,
werden die mittlere berechnete Konzentration (A) und die theoretische Konzentration (B)
nach folgender Formel in Beziehung gesetzt:
RE % = [(A-B)/B·x·100)]
4.5. Präzision
Die Präzision ist das Maß für die Übereinstimmung unabhängiger Analysenergebnisse
untereinander oder einfach ausgedrückt das Maß für die Streuung von Analysenergebnissen.
Als Streuungsmaß, und damit als Präzisionsmaß, wird die Standardabweichung s verwendet.
Weiterhin unterscheidet man die Wiederholpräzision sw (= intraday reproducibility oder
Tagespräzision) von der Zwischenpräzision sb (= interday reproducibility).
Die Wiederholpräzision beschreibt die Präzision der Tagesserien, somit eine Aufarbeitung
unter Wiederholbedingungen, mit demselben Verfahren, identischen Proben, im selben Labor,
durch denselben Bearbeiter und mit derselben Geräteausrüstung.
Die Zwischenpräzision dient der Ermittlung der Präzision zwischen den Tagesserien.
Zur Bestimmung der beiden genannten Formen der Präzision wurden, wie auch bei
Ermittlung der Richtigkeit, an drei aufeinander folgenden Tagen jeweils fünf Leer-
Matrixproben für Plasma und Urin mit einer niedrigen (LQC), einer mittleren (MQC) und
einer hohen (HQC) Kalibrationskonzentration des zu analysierenden Stoffes dotiert und
anschließend aufgearbeitet und chromatographisch gemessen.
Nach Vorgaben des EHSLC (EHSLC, 2002) dürfen die Präzisionen relativ zum gemessenen
Mittelwert von diesem nicht mehr als 15 % für den hohen und den mittleren
Kalibrationspunkt bzw. nicht mehr als 20 % für den niedrigen Kalibrationspunkt abweichen.
Die Wiederholpräzision und die Zwischenpräzision errechnen sich wie folgt (HERBOLD u.
SCHMITT, 2000):
Material und Methoden
65
sw = ∑
∑ ⋅Tagesserie
TagesserieTagesserie
fsf ²)(
sb = Tage
gesamtTagesserie
fXX∑ − )²(
sb = Zwischenpräzision
sw = Wiederholpräzision
f = Freiheitsgrad
s² = Varianz
X = errechneter Mittelwert
4.6. Stabilität
Ein Analyt in einer Kontrollprobe gilt unter den Aufbewahrungsbedingungen für einen
definierten Zeitraum so lange als stabil, wie die Gehaltsdifferenz einen bestimmten, vorher
festgelegten Schwellenwert nicht überschreitet (KROMIDAS, 1999).
Die Substanzstabilität muss über den gesamten Zeitraum zwischen Probenentnahme und
Quantifizierung gewährleistet sein und auch gezeigt werden.
Zur Ermittlung der Stabilität wurden für Plasma und Urin jeweils zwölf hohe, zwölf mittlere
und zwölf niedrige Kalibrationsaliquots durch Zugabe des Referenzstandards hergestellt. Pro
Konzentrationspunkt und Matrix wurden sechs Proben direkt aufgearbeitet,
chromatographisch gemessen und anhand einer aktuellen Kalibrierung quantifiziert. Die
weiteren sechs Proben je Konzentration und Matrix wurden unter identischen Bedingungen
wie die Messproben gelagert.
Nach Vorschrift des EHSLC (EHSLC, 2002) wurden diese tiefgefrorenen und für 164 Tage
zurückgestellten Plasmaproben, sowie die für 155 Tage zurückgestellten Urinproben
zusammen mit den letzten zu messenden Proben des Hauptversuches ebenfalls aufgearbeitet,
chromatographisch gemessen und anhand einer aktuellen Kalibrierung quantifiziert.
Die aliquotierten Probenansätze des Stabilitätstestes hatten die in Tabelle 10 aufgeführten
Konzentrationen:
Material und Methoden
66
Probenansatz Konzentration pro ml Probe [ng/ml] Plasma 0,25 / 1 / 3 Urin 1 / 5 / 15
Tabelle 10: Dexamethasonkonzentrationen in den einzelnen Probenansätzen zur Bestimmung
der Stabilität
Die Mittelwerte eines jeden Kalibrationspunktes beider Gruppen wurden unter Anwendung
des t-Tests verglichen.
4.7. Wiederfindung
Die Wiederfindung oder die Wiederfindungsrate ist das Verhältnis des unter
Wiederholbedingungen gemessenen Mittelwerts zum richtigen Wert des Analyten in einer
Probe (KROMIDAS, 1999). Mit Hilfe der Wiederfindungsrate kann die gesamte Methode,
genauer gesagt ihre Extraktionseffektivität, bewertet werden. Eine hohe Wiederfindungsrate
bedeutet, dass während sämtlicher Schritte der Analysemethode keine nennenswerten
Substanzverluste zu verzeichnen sind.
In dieser Studie erfolgte die Bestimmung der Wiederfindung in Anlehnung an die DIN EN
ISO/IEC 17025 (2005).
Die Wiederfindung wird anhand von realistischen, also im Kalibrationsbereich liegenden
Konzentrationen bestimmt. Zwölf Plasmaproben und zwölf Urinproben wurden aufgearbeitet.
In den Proben 1 bis 6 jeder Matrix wurde die Substanz, hier Dexamethason–
Referenzstandard, zu Beginn der Aufarbeitung zugesetzt. Dies ergab für die Plasmaproben
eine Konzentration von 2,5 ng/ml. Die Urinproben wiesen eine Konzentration von 10 ng/ml
auf. Der interne Standard (Fluocortolon) wurde erst im letzten Schritt der Aufarbeitung, also
zum Anlösen der am Rotationsverdampfer eingeengten Probe, zugesetzt. Die Proben wurden
nun chromatographisch gemessen.
Die Proben 7 bis 12 jeder Matrix wurden ohne vorherige Zugabe von Dexamethason-
Referenzstandard oder internem Standard aufgearbeitet. Erst zum Anlösen der eingedampften
Probe wurden Referenzstandard und interner Standard zugegeben. Die sich anschließende
Berechnung der Wiederfindung des Analyten erfolgt nach:
Material und Methoden
67
Wiederfindung (Analyt) (%) = 100127Proben61Proben
Standards)internendesreaAnalyten/Ades(Area
Standards)internendesreaAnalyten/Ades(Area ⋅−−
MWMW
MW = Mittelwert
Zusätzlich wurde auch die Wiederfindungsrate des internen Standards (IS) bestimmt.
Pro Matrix wurden sechs weitere Proben aufgearbeitet. In den Probenansätzen 13 bis 18 jeder
Matrix wurde der interne Standard zu Beginn der Aufarbeitung zugegeben, der
Dexamethason-Referenzstandard wurde erst zum Anlösen der eingedampften Proben
hinzugefügt. Es folgten nun ebenfalls die chromatographische Messung und abschließende
Berechnung nach folgender Formel:
Wiederfindung (IS) (%) = 100127Proben1813Proben
Analyten)desAreaStandards/internendes(Area
Analyten)desAreaStandards/internendes(Area ⋅−−
MWMW
MW = Mittelwert
5. Aufarbeitung der Plasma- und Urinproben des Hauptversuches
5.1. Aufarbeitung der Plasmaproben (mit täglichen Kalibrationskurven)
Wie auch für jede Probenaufarbeitung der Validierung wurden bei der Aufarbeitung der
Plasmaproben des Hauptversuches tägliche Kalibrationskurven mit mindestens fünf
Kalibrationspunkten erstellt, über welche die Proben anschließend quantifiziert werden
konnten. Die gewählten Kalibrationspunkte deckten den gesamten Arbeitsbereich ab und
richteten sich nach den erwarteten Konzentrationen der Plasmaproben (Tabelle 8 in Kapitel
III.4.1.).
Zur Aufarbeitung der Plasmaproben wurden 2 ml der jeweiligen Plasmaprobe in einem
Reagenzglas vorgelegt. Dann wurden 50 µl des internen Standards zugegeben, so dass eine
Fluocortolonkonzentration von 25 ng/ml Plasma erreicht wurde. Es erfolgte eine Zugabe von
100 µl einer 5%igen wässrigen Kaliumcarbonat-Lösung und von 500 µl tertiär Butanol. Die
Zugabe von Kaliumcarbonat-Lösung dient der Einstellung des pH-Wertes auf ph 9,6. Der
Lösungsvermittler tertiär Butanol bewirkt eine partielle Fällung der Plasmaproteine und
Material und Methoden
68
Blutfette. Die Plasmaprobe wird somit klarer, und die Phasentrennung zwischen der Ether-
und der Plasmaphase wird verbessert.
Anschließend wurde die Probe auf dem Vortexschüttler für fünf Sekunden durchmischt.
Durch Hinzufügen von 8 ml tertiär Butylmethylether und weiterer Durchmischung der Probe
für zehn Minuten auf dem Schüttler erfolgte die Extraktion.
Die sich im Reagenzglas als Überstand darstellende Etherphase wurde nun mit Hilfe einer
Pasteurpipette in ein neues Reagenzglas überführt und am Rotationsverdampfer bei ca. 50 °C
eingeengt. Der trockene Rückstand wurde mit 2 ml destilliertem Methanol und 100 µl Milli-
Q-Wasser angelöst und fünf Sekunden mittels Vortexschüttler durchmischt. Eine Zugabe von
5 ml n-Pentan folgte direkt. Hieran schloss sich eine weitere Durchmischung für fünf
Minuten, wiederum auf dem Schüttler, an. Der Überstand der Probe, in diesem Falle nun die
n-Pentanphase darstellend, wurde verworfen und die verbleibende methanolische Phase
wurde mittels Rotationsverdampfer bei 50 °C zur Trockene eingeengt. Abschließend wurde
der Rückstand der Probe mit 100 µl destilliertem Methanol angelöst und per Pasteurpipette in
ein HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführt.
Die sich anschließende Messung erfolgte nach den in Kapitel III.3.5. beschriebenen
Einstellungen des Chromatographen.
Die gesamte Aufarbeitungsmethode findet sich schematisch dargestellt in Abbildung 30 im
Anhang.
5.2. Aufarbeitung der Urinproben (mit täglichen Kalibrationskurven)
Auch bei der Aufarbeitung der Urinproben des Hauptversuches wurden tagesaktuelle
Kalibrationskurven mit fünf Kalibrationspunkten zur anschließenden Quantifizierung erstellt.
Die gewählten Kalibrationspunkte deckten auch hier den erwarteten Konzentrationsbereich ab
(Tabelle 8 in Kapitel III.4.1.).
In ein Reagenzglas wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe pipettiert. Die Zugabe von
50 µl des internen Standards, der in dieser Aufarbeitung neben Fluocortolon noch den
Hydrolysemarker D5-Androsteron-glucuronid enthielt, ergab pro ml der Probe eine
Konzentration von 10 ng Fluocortolon/ml und 2500 ng D5-Androsteron-glucuronid/ml. Durch
Zugabe von 1,5 ml Phosphat-Puffer (0,8 mol/l) wurde der pH-Wert der Probe auf 7
eingestellt, was mittels Alkalit-Papier geprüft wurde. Die Probe wurde durchmischt und
anschließend mit 70 µl ß-Glucoronidase von Eschericha coli versetzt.
Material und Methoden
69
Die Proben wurden über Nacht (14 Stunden) in einem auf 37 °C temperierten Wasserbad
inkubiert.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der pH-Wert der Probe durch Zugabe von ca. 2 g
Kaliumcarbonat/Natriumhydrogencarbonat-Gemisch auf pH 9,6 eingestellt. 6 ml tertiär
Butylmethylether wurden hinzugefügt und die Probe wurde für fünfzehn Minuten mittels
Schüttler durchmischt. Nach einem Zentrifugationsvorgang (zehn Minuten bei 1000
Umdrehungen pro Minute) wurde die organische Phase der Probe, der Überstand, mit Hilfe
einer Pasteurpipette in ein neues Reagenzglas überführt. Der verbleibende Rest wurde
verworfen. Mittels Rotationsverdampfer wurde die organische Phase bei 50 °C bis zur
Trockene eingeengt. Dieser eingeengte Rückstand wurde mit 100 µl destilliertem Methanol
angelöst, mittels Pasteurpipette in ein HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführt und
chromatographisch gemessen.
Abbildung 31 im Anhang stellt die soeben beschriebene Methode nochmals schematisch dar.
6. Messung von Cortisol, Glucose und Kreatinin
6.1. Messung von Cortisol
Dieser Teil der Laborarbeit erfolgte im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
Die Cortisolkonzentrationen wurden in allen entnommenen Blutproben der zwölf Pferde
bestimmt.
Die Bestimmung der Cortisolkonzentrationen der Plasmaproben erfolgte mittels eines Enzym-
gekoppelten Immunnachweises (Enzym-linked Immunosorbent Assay, Elisa). Hierbei
handelte es sich um einen spezifischen Cortisol-Elisa der Firma IBL Hamburg. Die
Nachweisgrenze dieses Testsystems liegt bei 2,5 ng/ml Probe.
Grundlage dieses Verfahrens ist eine kompetitive Antigen-Antikörper-Reaktion, was eine
rasche Untersuchung und auch Quantifizierung eines Antigens in einer Probe erlaubt
(LEHNINGER, 2001). Die Oberfläche der Vertiefungen der Mikrotiterplatte, einer 96-Loch-
Polysterol-Platte, ist mit monoklonalen Antikörpern bedeckt, welche gegen die
Cortisolmoleküle in der jeweiligen Probe gerichtet sind. Zusätzlich zur Probe wurde ein
Cortisol-Peroxidase-Konjugat in die Vertiefungen gegeben, welches mit dem zu
bestimmenden Cortisol um die Bindungsstellen an den monoklonalen Antikörpern
Material und Methoden
70
konkurriert. Nach einer Inkubationszeit von 60 Minuten wurde das ungebundene Konjugat
herausgewaschen, um weitere Bindungen zu verhindern. Dann erfolgte die Zugabe einer
Enzym-Substratlösung, welche die entstandenen Antigen-Antikörper-Komplexe sichtbar
machen sollte. 15 Minuten nach Zugebe dieser Enzym-Substratlösung wurde die
enzymatische Reaktion angehalten, und nach Ablauf von weiteren 10 Minuten photometrisch
bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
Neben den Proben wurde zusätzlich eine Cortisol-Standardreihe (0 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml,
100 ng/ml, 200 ng/ml, 400 ng/ml, 800 ng/ml) aufgearbeitet. Die ermittelten Extinktionen der
Kalibrationspunkte wurden gegen ihre Konzentration graphisch aufgetragen. Durch
Rückrechnung über die Regressionsgleichung der erhaltenen Kalibrierfunktion konnten die
Cortisolkonzentrationen der Plasmaproben berechnet und quantifiziert werden. Die
ermittelten Cortisolkonzentrationen wurden gegen die Entnahmezeit aufgetragen und
graphisch dargestellt.
6.2. Messung von Glucose
Die Bestimmung von Glucose erfolgte mittels enzymatischer Bestimmung durch die Klinik
für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover. Alle Plasmaproben jedes Pferdes wurden untersucht. Die
vor Applikation der Dexamethason-21-isonicotinat-präparate entnommenen Plasmaproben
dienten als Kontrolle des Glucoseausgangswertes jedes Pferdes.
6.3. Messung von Kreatinin
Kreatinin wird im Wesentlichen glomerulär filtriert und ermöglicht hauptsächlich Aussagen
über das Glomerulumsystem (KRAFT u. DÜRR, 1999). Zur Überprüfung der
Nierengesundheit der an der Studie beteiligten Pferde wurden die Kreatininwerte von drei
Plasmaproben pro Pferd bestimmt. Die Bestimmung erfolgte ebenfalls durch die Klinik für
kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Material und Methoden
71
7. Statistische Auswertung
Nach KRAFT u. DÜRR (1999) für beide Tiergruppen mittels der vor der Dexamethason-21-
isonicotinat-Applikation entnommen Leerplasmaproben ein Normalbereich für Cortisol
errechnet. Dieser Referenzbereich wurde als ein nichtparametischer Referenzbereich in Form
eines 95%-Perzentil-Intervalls dargestellt, welcher einseitig definiert war. Es wurde nur die
Untergrenze festgelegt. Diese Art von Referenzbereich ist von der Verteilung der Messwerte
unabhängig und kommt biologisch-medizinischen Verhältnissen am nächsten.
Die statistische Auswertung der ermittelten Cortisolkonzentrationen erfolgte mit dem
Statistikprogramm SigmaStat (Jandel Cooperation). Die Cortisoleinzelwerte aller Pferde
wurden berücksichtigt. Der Cortisolausgangswert wurde mit den Cortisolwerten jedes
Entnahmezeitpunktes verglichen. Es wurde der Mann-Whitney-U-Test als nichtparametischer
Test verwendet.
Im Rahmen der Bewertung der statistischen Ergebnisse wurde ein p-Wert von < 0,05 als
signifikant (95 %), von < 0,01 als hochsignifikant (99 %) und von < 0,001 als
höchstsignifikant (99,9 %) angesehen.
Pharmakokinetischen Berechnungen konnten aufgrund der sehr niedrigen
Plasmakonzentrationen an Dexamethason nicht durchgeführt werden.
Ergebnisse
72
IV. Ergebnisse
1. Ergebnisse der Analysemethoden
1.1. Massenspektrum von Dexamethason
Abbildung 7 zeigt das Fragmentationsverhalten des Analyten Dexamethason im
Massenspektrum sowie seine Strukturformel. Die charakteristischen Ionenübergänge und
entstandenen Hauptfragmente werden bei m/z 392,9 und m/z 373,1 registriert. Die
Retentionszeit von Dexamethason beträgt nach der beschriebenen Einstellung der HPLC 6,56
Minuten.
Abb. 7: Massenspektrum und Strukturformel von Dexamethason
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
392.9
120.9
91.1
373.1147.1
355.1 77.1
115.1 237.1
337.1 128.1 107.1
319.1 170.9104.9 278.9131.1 95.1 79.1
158.9 309.1 239.1172.9117.1 262.9103.1 223.1 301.1151.9 65.1 325.1 225.1181.1 261.197.1 198.9168.9 83.1 272.9
O
OH OH
O OH
F
Ergebnisse
73
1.2. Massenspektrum von Fluocortolon
Der interne Standard Fluocortolon zeigt bei den angegebenen Gerätebedingungen ein
typisches Fragmentationsverhalten mit charakteristischen Ionen bei m/z 377,1 und m/z 303,3.
Abbildung 8 ist weiterhin die Strukturformel des Moleküls zu entnehmen. Die Retentionszeit
von Fluocortolon beträgt 7,06 Minuten.
Abb. 8: Massenspektrum und Strukturformel von Fluocortolon
2. Validierung der Analysemethoden
2.1. Selektivität
Um die Selektivität der Analysemethode zu zeigen, wurden Chromatogramme von
Leermatrixproben sowie Chromatogramme von mit Dexamethason bzw. Fluocortolon
dotierten Plasma- und Urinproben überprüft. Anhand zufrieden stellender
chromatographischer Auflösung der Peaks und ausreichenden Abständen zwischen den
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
171.1
377.1
120.9
303.3
90.9
128.1 321.3
77.1 147.1
339.3 115.1
191.1107.1 138.9 165.1 359.3279.183.1 261.1197.1101.1 235.1117.1 159.165.1 288.1211.1 247.1 293.3 69.1 179.1 232.997.1 357.3163.1 110.9
O
OH
O OH
F
Ergebnisse
74
einzelnen Substanzpeaks stellte sich Dexamethason nach einer Retentionszeit 6,56 Minuten
dar. Die Retentionszeit von Fluocortolon belief sich auf 7,06 Minuten.
In den Abbildungen 9, 10 und 11 sind sowohl die substanzspezifischen Peaks für
Dexamethason und Fluocortolon zu den jeweiligen Retentionszeiten in Plasma und Urin als
auch die Leermatrixproben für Plasma und Urin dargestellt.
Abb. 9: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer
Leerplasmaprobe (links) und einer mit 5 ng/ml Dexamethason dotierten Plasmaprobe (rechts)
zum Zeitpunkt der Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)
Abb. 10: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer Leerurinprobe
(links) und einer mit 50 ng/ml Dexamethason dotierten Urinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der
Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)
Ergebnisse
75
Abb. 11: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer mit 25 ng/ml
Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerplasmaprobe (links) und einer mit 10 ng/ml
Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerurinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der
Retention von Fluocortolon (7,06 Minuten)
2.2. Linearität
Die Kalibrationskurven für Plasma und Urin wurden, wie in Kapitel III.4.2. beschrieben, an
drei Tagen aufgearbeitet. Im Plasma wurde die Kalibrationskurve in einen unteren (0,1 bis 1
ng/ml) und einen oberen (1 bis 4 ng/ml) Kalibrationsbereich eingeteilt. Im Urin erstreckte sich
der Kalibrationsbereich von 0,5 bis 25 ng/ml. Nach der Messung wurden diese
Kalibrationskurven für Plasma und Urin wie folgt ausgewertet:
Die erhaltenen Quotienten der Flächen von Dexamethason und Fluocortolon für Plasma und
Urin wurden gegen die erwarteten Konzentrationspunkte der Kalibration graphisch
aufgetragen. Abbildungen 12, 13 und 14 stellen beispielhaft die Kalibrationskurven für
Plasma und Urin dar. Visuell wurde jeweils eine Linearität festgestellt. Zur weiteren Analyse
wurde ein lineares Regressionsmodell angewandt. Die Kalibrationsgleichung (y = ax + b)
wurde nach dem Prinzip der kleinsten Abweichungsquadrate aus den ermittelten Quotienten
relativ zu den erwarteten Konzentrationen errechnet (DIN 32645, 1994). Die
Kalibrationsgleichungen und auch die dazugehörigen Korrelationskoeffizienten (R²) werden
in den graphischen Darstellungen angegeben.
Ergebnisse
76
y = 0,0905x + 0,0036R2 = 0,99
0,000,020,040,060,080,100,12
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2Konzentration Dexamethason [ng/ml]
Quo
tient
aus
Flä
che
Dex
amet
haso
n/Fl
äche
Flu
ocor
tolo
n
Abb. 12: Kalibrationskurve des unteren Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma
inklusive Geradengleichung und Korrelationskoeffizient
y = 0,0988x + 0,0072R2 = 0,99
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,45
0 1 2 3 4 5Konzentration Dexamethason [ng/ml]
Quo
tient
aus
Flä
che
D
exam
etha
son/
Fläc
he
Fluo
cort
olon
Abb. 13: Kalibrationskurve des oberen Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma
inklusive Geradengleichung und Korrelationskoeffizient
Ergebnisse
77
y = 0,2556x - 0,0209R2 = 0,99
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0 5 10 15 20 25 30
Konzentration Dexamethason [ng/ml]
Quo
tient
aus
Flä
che
Dex
amet
haso
n/Fl
äche
Flu
ocor
tolo
n
Abb. 14: Kalibrationskurve für Dexamethason im Urin inklusive Geradengleichung und
Korrelationskoeffizient
2.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze
Für die in dieser Studie entwickelten und beschriebenen Aufarbeitungs- und
Chromatographiemethoden wurden anhand der in Kapitel III.4.3. dargestellten
Kalibrationsfunktion Nachweis– und Quantifizierungsgrenzen für Dexamethason in equinem
Plasma und Urin berechnet. Die ermittelten Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen für
Dexamethason sind Tabelle 11 zu entnehmen.
Matrix Nachweisgrenze [ng/ml] Quantifizierungsgrenze
[ng/ml] Plasma 0,12 0,25
Urin 0,67 1,00 Tabelle 11: Nachweis- und Quantifizierungsgrenze für Dexamethason in Plasma und Urin
2.4. Richtigkeit
Als Ergebnis der Prüfung auf Richtigkeit zwischen der ermittelten und der erwarteten
Konzentration ist hier der relative Fehler (RE) in Prozent angegeben.
Die relativen Fehler der an drei verschiedenen Tagen aufgearbeiteten Plasma- und Urinproben
im niedrigen, mittleren und hohen Kalibrationsbereich sind in den sich anschließenden
Tabellen 12 und 13 aufgeführt.
Ergebnisse
78
Konzentration [ng/ml]
Tag 1 Mittelwert
Tag 1 RE (%)
Tag 2 Mittelwert
Tag 2 RE (%)
Tag 3 Mittelwert
Tag 3 RE (%)
0,25 0,23 7,25 0,30 18,58 0,23 9,62 1 0,96 4,48 1,11 11,47 1,03 3,32 3 2,81 6,32 3,37 12,37 2,65 11,65
Tabelle 12: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit von
Dexamethason im Plasma
Konzentration
[ng/ml] Tag 1
Mittelwert Tag 1
RE (%) Tag 2
MittelwertTag 2
RE (%) Tag 3
Mittelwert Tag 3
RE (%) 1 0,96 4,09 1,16 16,41 1,10 10,13 5 4,53 9,41 4,88 2,31 4,73 5,42 15 13,57 9,51 14,19 5,41 14,06 6,24
Tabelle 13: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit von
Dexamethason im Urin
Alle Ergebnisse liegen im Rahmen der erlaubten Abweichung des theoretischen vom
ermittelten Wert, d.h. innerhalb einer Abweichung von 20 % im unteren und einer
Abweichung von 15 % im mittleren und hohen Kalibrationsbereich.
2.5. Präzision
Wie in Kapitel III.4.5. beschrieben, wurden die Wiederholpräzision sw (= intraday
reproducibility oder Tagespräzision) sowie die Zwischenpräzision sb (= interday
reproducibility) für Plasma und Urin ermittelt.
Die ermittelten Ergebnisdaten sind in den Tabellen 14 und 15 zusammengestellt:
Konzentration
[ng/ml] Intraday Präzision absolut
Intraday Präzision (%)
Interday Präzision absolut
Interday Präzision (%)
0,25 0,03 14,00 0,04 16,15 1 0,09 8,82 0,08 7,88 3 0,28 9,59 0,38 13,01
Tabelle 14: Intraday Präzision und Interday Präzision im Plasma
Ergebnisse
79
Konzentration [ng/ml]
Intraday Präzision absolut
Intraday Präzision (%)
Interday Präzision absolut
Interday Präzision (%)
1 0,08 7,05 0,11 9,74 5 0,55 11,58 0,18 3,78 15 1,70 12,21 0,33 2,36
Tabelle 15: Intraday Präzision und Interday Präzision im Urin
Die vorgeschriebenen Richtwerte einer erlaubten Abweichung (20 % im unteren
Kalibrationsbereich, 15 % im mittleren und hohen Kalibrationsbereich) werden in Plasma und
Urin nicht überschritten.
2.6. Stabilität
Die Prüfung der Stabilität des Analyten Dexamethason erfolgte, wie bereits in Kapitel III.4.6.
beschrieben, in zwei Aufarbeitungs- und Messdurchgängen.
In den nachfolgenden Tabellen 16 bis 21 sind die an Tag 0 und an Tag X (Tag X belief sich
bei den Plasmaproben auf 164 Tage, für die Urinproben auf 155 Tage) ermittelten Ergebnisse
aufgeführt und gegenübergestellt. An Tag 0 wurden die Proben angesetzt und direkt
aufgearbeitet. An Tag X wurden die an Tag 0 angesetzten, jedoch bis zu diesem Tag
zurückgestellten und tiefgefrorenen Proben aufgearbeitet.
Konzentration [ng/ml]
Anzahl der gemessenen
Proben
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen[ng/ml]
Standardab- weichung (%)
Variations- koeffizient (%)
0,25 6 0,28 0,04 16,08 1 6 1,07 0,10 8,98 3 6 2,94 0,09 3,17
Tabelle 16: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Plasmaproben an Tag 0
Ergebnisse
80
Konzentration [ng/ml]
Anzahl der gemessenen
Proben
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen[ng/ml]
Standardab- weichung (%)
Variations- koeffizient (%)
0,25 6 0,22 0,02 10,85 1 6 0,85 0,09 11,07 3 6 2,34 0,12 5,27
Tabelle 17: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Plasmaproben an Tag 164
Konzentration
[ng/ml] Mittelwert der
gemessenen Konzentrationen
[ng/ml] Tag 0
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen[ng/ml] Tag 164
Abweichung (%)
Stabilität (95%)
0,25 0,28 0,22 -21,83 anzunehmen 1 1,07 0,85 -21,07 anzunehmen 3 2,94 2,33 -20,68 anzunehmen
Tabelle 18: gemessene Mittelwerte, prozentuale Abweichung und Bewertung der Stabilität
von Dexamethason in den Plasmaproben
Konzentration [ng/ml]
Anzahl der gemessenen
Proben
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen[ng/ml]
Standardab- weichung (%)
Variations- koeffizient (%)
1 6 0,97 0,08 8,14 5 6 4,52 0,13 2,78 15 6 13,39 0,58 4,36
Tabelle 19: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Urinproben an Tag 0
Konzentration
[ng/ml] Anzahl der gemessenen
Proben
Mittelwert der gemessenen
Konzentration [ng/ml]
Standardab- weichung (%)
Variations- koeffizient (%)
1 6 0,58 0,24 40,53 5 6 4,36 0,43 9,95 15 6 13,61 1,20 8,82
Tabelle 20: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Urinproben an Tag 155
Ergebnisse
81
Konzentration [ng/ml]
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen[ng/ml] Tag 0
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen[ng/ml] Tag 155
Abweichung (%)
Stabilität (95%)
1 0,97 0,58 -39,51 anzunehmen 5 4,52 4,36 - 3,53 anzunehmen 15 13,39 13,61 - 1,59 anzunehmen
Tabelle 21: gemessene Mittelwerte, prozentuale Abweichung und Bewertung der Stabilität
von Dexamethason in den Urinproben
Anhand dieser Ergebnisse und der errechneten anzunehmenden Stabilität in allen drei
Konzentationsbereichen beider Matrices wird deutlich, dass Dexamethason mit einer
Wahrscheinlichkeit von > 95 % stabil ist.
2.7. Wiederfindung
Im Rahmen der Prüfung der Wiederfindungsrate für Dexamethason konnte nach dem in
Kapitel III.4.7. beschriebenen Vorgehen die Wiederfindung für Dexamethason in Plasma und
Urin ermittelt werden. Zusätzlich wurde die Wiederfindung des internen Standards
Fluocortolon für Plasma und Urin überprüft. Die Tabellen 22 und 23 zeigen die ermittelten
Ergebnisse.
Matrix Anzahl der
Proben mittlere
Wiederfindung x (%)
Plasma 12 78,51 Urin 12 77,43
Tabelle 22: Wiederfindungsrate von Dexamethason in Plasma und Urin
Matrix Anzahl der
Proben mittlere
Wiederfindung x (%)
Plasma 12 79,35 Urin 12 78,28
Tabelle 23: Wiederfindungsrate von Fluocortolon in Plasma und Urin
Ergebnisse
82
3. Überprüfung der Urinaufarbeitung
Zur Überprüfung des Aufarbeitungsvorganges wurde allen Urinproben zu Beginn der Analyse
D5-Androsteron-glucuronid als Hydrolysemarker zugesetzt. Diese Zugabe erfolgte mit dem
Ziel, die Vollständigkeit der ablaufenden Hydrolyse mittels der Abspaltung der Konjugate
von D5-Androsteron-glucuronid zu kontrollieren. Die Auswertung der entstandenen
Signalpeaks erfolgte optisch. Abbildung 15 stellt exemplarisch ein Chromatogramm von D5-
Androsteron-glucuronid im Urin ohne Hydrolyse bzw. nach abgelaufener Hydrolyse dar.
Bei allen auszuwertenden Proben war ein deutliches und reproduzierbares Signal zu ermitteln.
Die Hydrolyse der Urinproben war als vollständig zu beurteilen.
Abb. 15: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit von D5-
Androsteron-glucuronid im Urin ohne Hydrolyse (links) bzw. nach Hydrolyse (rechts) zum
Zeitpunkt der Retention von D5-Androsteron-glucuronid (8,9 Minuten)
Ergebnisse
83
4. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason
4.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason
4.1.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach Voren® Suspension-Applikation
Nach der Voren® Suspension-Applikation wurden nach 3 bis 24,25 Stunden maximale
Dexamethasonplasmakonzentrationen zwischen 0,4 ng/ml und 1,3 ng/ml erreicht. Nach 48,25
Stunden kam es bei den Pferden 2, 3 und 6 der intravenös behandelten Tiergruppe zum
Unterschreiten der Quantifizierungsgrenze. Pferd 1 und 5 folgten nach 72,25 Stunden, Pferd 4
nach 120,25 Stunden. Die Nachweisgrenze war bei Pferd 3 bereits nach 48,25 Stunden
erreicht, bei den Tieren 2, 5 und 6 nach 72,25 Stunden. Jedoch war bei Pferd 2 in den Proben
nach 144,25, 264,25 und 360,25 Stunden nochmals ein Signal detektierbar. Pferd 1 war nach
96,25 Stunden und Pferd 4 nach 216,25 Stunden unterhalb der Nachweisgrenze.
Abbildung 16 stellt die Konzentrationsverläufe von Dexamethason im Plasma der einmalig
mit Voren® Suspension intravenös behandelten sechs Pferde dar. Die Abbildungen 17 und 18
zeigen des Weiteren die gemittelten Dexamethasonkonzentrationen vor und nach Erreichen
der Quantifizierungsgrenze sowie eine vergrößerte Darstellung der ersten 80 Stunden nach
Applikation. Der Unterschied zwischen quantifizierbaren Werten (Werte > LOQ) und nicht
quantifizierbaren Werten (Werte < LOQ, aber > LOD) wird in den Abbildungen 16-20
graphisch hervorgehoben. Werte unterhalb der Nachweisgrenze sind zur Vervollständigung
des Konzentrationsverlaufes an Dexamethason gezeigt und stellen lediglich die mittels
HPLC/MS/MS ermittelten restlichen Spuren des Analyten dar. Den Tabellen 29-34 im
Anhang sind die gemessenen Plasmakonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes dieser
Gruppe zu entnehmen.
Ergebnisse
84
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 60 120 180 240 300 360Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6LOQLOD
Abb. 16: Plasmakonzentrationsverläufe (Werte unterhalb der Quantifizierungsgrenze sind
nicht zu exakt quantifizieren), Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von
Dexamethason bei sechs Pferden nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg
KGW Voren® Suspension
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 100 200 300 400Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son[
ng/m
l]
Abb. 17: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf vor (─♦─) und nach (··♦··) Erreichen der
Quanitfizierungsgrenze, Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden
Ergebnisse
85
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 20 40 60 80Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Abb. 18: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf vor (─♦─) und nach (··♦··) Erreichen der
Quanitfizierungsgrenze, Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden in den ersten 80 Stunden nach der Behandlung
4.1.2. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach Voren®-Depot-Applikation
Nach der Voren®-Depot-Applikation lagen die Plasmakonzentrationen an Dexamethason in
den ersten 12,25 bis 72,25 Stunden meist unter 0,3 ng/ml, Einzelwerte erreichten 0,3 ng/ml.
Somit war der Dexamethasongehalt nur in einzelnen Proben zu quantifizieren. Lediglich bei
Pferd 1 und Pferd 2 wurden Maximalwerte mit 1,0 ng/ml nach 312,25 Stunden (Pferd 1) bzw.
0,6 ng/ml nach 192,25 Stunden (Pferd 2) erreicht. Im Mittel lagen die Dexamethasonwerte
nach 23,5 Stunden unterhalb der Quantifizierungsgrenze. Nach 192,25 Stunden war Pferd 1
unter der Nachweisgrenze. Pferd 2 gelangte nach 216,25 Stunden, Pferd 3 nach 360,25
Stunden und Pferd 4 nach 240,25 Stunden zur Nachweisgrenze. Die Pferde 5 und 6 folgten
nach 192,25 bzw. 120,25 Stunden, mit jedoch wiederkehrenden Signalen nach 408,25 bzw.
216,25 und 264,25 Stunden.
Die Abbildungen 19 und 20 zeigen die gemittelten Dexamethasonkonzentrationen sowie eine
vergrößerte Darstellung der ersten 80 Stunden nach einmaliger intramuskulärer Applikation
von Voren®-Depot. Auf eine gemeinsame Übersichtsdarstellung der
Plasmakonzentrationsverläufe der sechs Pferde dieser Gruppe wurde aufgrund von
mangelnder Übersichtlichkeit verzichtet. In den Tabellen 35-40 im Anhang sind die
gemessenen Plasmakonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes dieser Gruppe
aufgeführt.
Ergebnisse
86
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 100 200 300 400 500Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Abb. 19: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (··♦··), Quantifizierungsgrenze (——) und
Nachweisgrenze (−−) von Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von
0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 20 40 60 80Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Abb. 20: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (··♦··), Quantifizierungsgrenze (——) und
Nachweisgrenze (−−) von Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von
0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 80 Stunden nach der
Behandlung
Ergebnisse
87
4.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason
4.2.1. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach Voren® Suspension-Applikation
Abbildung 21 zeigt den gemittelten Konzentrationsverlauf von Dexamethason im Urin von
den mit Voren® Suspension behandelten Tieren. Die gemessenen
Dexamethasonkonzentrationen bewegten sich zwischen 26,0 ng/ml und 65,4 ng/ml. Den
Maximalwert an Dexamethason erreichte Pferd 6 bereits nach 2 Stunden, Pferd 3 nach 7
Stunden und die übrigen vier Tiere nach 12 Stunden. Die Pferde 1 und 3 unterschritten die
Quantifizierungsgrenze nach 96,5 Stunden, die Pferde 5 und 6 nach 120,25 Stunden und die
Pferde 2 und 4 nach 144,25 Stunden. Unterhalb der Nacheisgrenze befanden sich die Pferde 3,
5 sowie 6 nach 120,25 Stunden, Pferde 1 und 4 nach 144,25 Stunden und Pferd 2 nach 168,5
Stunden. Nochmals zu detektierende Signale stellten sich bei Pferd 2 nach 216,25, 384,25
sowie nach 456,25 Stunden dar.
Die Abbildung 22 stellt, analog zu der Graphik des Plasmakonzentrationsverlaufes, eine
Ausschnittsvergrößerung der ersten 200 Stunden nach Applikation dar. Die Tabellen 41-43 im
Anhang beinhalten die gemessenen Urinkonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes
dieser Tiergruppe.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
0 100 200 300 400 500 600Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Abb. 21: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden
Ergebnisse
88
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
0 50 100 150 200Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Abb. 22: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden in den ersten 200 Stunden nach der Behandlung
4.2.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach Voren®-Depot-Applikation
Abbildung 23 stellt die entsprechenden Verhältnisse für die mit Voren®-Depot behandelten
Tiere dar. Die Maximalkonzentrationen lagen zwischen 7,3 ng/ml und 22,4 ng/ml, sie waren
nach 7 Stunden bis 12 Stunden erreicht. Jedes Pferd zeigte, wenn auch zu unterschiedlichen
Zeitpunkten, nach den anfänglich hohen Dexamethasonkonzentrationen einen einzigen rapide
abfallenden Wert bis zum Unterschreiten der Nachweisgrenze (Pferde 1 bis 5) bzw. bis zum
Unterschreiten der Quantifizierungsgrenze (Pferd 6). Dieser niedrige Konzentrationspunkt
erschien bei Pferd 5 nach bereits 48 Stunden, bei Pferd 3 nach 96 Stunden, bei Pferd 6
nach144 Stunden, bei Pferd 2 nach 192 Stunden, bei Pferd 1 nach 288 Stunden und letztlich
bei Pferd 4 nach 336 Stunden. Nach diesem punktuellen Konzentrationsabfall stieg die
Dexamethasonkonzentrationen bei allen 6 Tieren wieder auf Werte an, welche sich um die
Quantifizierungs- und Nachweisgrenze bewegten. Bis zum Erreichen der Quantifizierungs-
und Nachweisgrenze waren somit weiterhin deutlich zu detektierende und quantifizierbare
Signale darstellbar.
Die Unterschreitung der Quantifizierungsgrenze hatte bei Pferd 5 nach bereits 240 Stunden
stattgefunden, bei Pferd 2 nach 480 Stunden, bei den Pferden 1 und 3 nach 552 Stunden sowie
bei den Pferden 4 und 6 dieser Gruppe nach 624 Stunden. Bei den Pferden 1, 2 und 3 war
nach 552 Stunden auch die Nachweisgrenze unterschritten. Bei den Pferden 4, 5 und 6 waren
die Nachweisgrenzen zeitgleich mit den angegebenen Quantifizierungsgrenzen erreicht. Bei
Ergebnisse
89
den Pferden 5 und 6 war jedoch noch ein einmaliges Signal in der Probe nach 912 Stunden zu
ermitteln.
Die Abbildung 24 stellt eine Ausschnittsvergrößerung der ersten 200 Stunden nach
Applikation dar. Die gemessenen Urinkonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes dieser
Tiergruppe sind in den Tabellen 44-46 im Anhang zusammengestellt.
0,02,04,06,08,0
10,012,014,016,018,020,0
0 200 400 600 800 1000Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Abb. 23: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-
Depot bei sechs Pferden
0,02,04,06,08,0
10,012,014,016,018,020,0
0 50 100 150 200Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
Abb. 24: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-
Depot bei sechs Pferden in den ersten 200 Stunden nach der Behandlung
Ergebnisse
90
5. Plasmakonzentrationen von Cortisol und Glucose
5.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol
5.1.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach Voren® Suspension-Applikation
Die ermittelte Untergrenze des Cortisolreferenzbereiches lag für Voren® Suspension bei 39,4
ng/ml. Die Blutcortisolspiegel der behandelten Tiere lagen im Mittel, nach einem in den
ersten Proben beobachteten geringen Anstieg, nach 2,25 Stunden hochsignifikant unter dem
zuvor bestimmten Schwellenwert (p < 0,01). Abweichend erreichte Pferd 6 den
Schwellenwert nach 1,25 Stunden, Pferd 3 nach 3 Stunden. Der maximal supprimierte Wert
war im Mittel bei einer hochsignifikanten Abweichung (p < 0,01) nach 48,25 Stunden
erreicht. Pferd 3 und 5 zeigten je nach 24,25 und 48,25 Stunden, Pferd 4 zwischen 8 und
72,25 Stunden Werte die unterhalb der Testnachweisgrenze lagen, und somit nicht mehr zu
detektieren waren.
Nach 144,25 Stunden hatten sich die gemittelten Cortisolwerte den Ausgangswerten wieder
weitestgehend angeglichen. Es war keine statistische Abweichung mehr festzustellen (p >
0,05). Abweichend fielen nochmals Pferd 3 und Pferd 5 auf. Der Cortisolwert von Pferd 3 war
bereits nach 96,25 Stunden wieder im Referenzbereich, der von Pferd 5 erst nach 216,25
Stunden. Wiederholte, jedoch nicht signifikant erniedrigte Cortisolspiegel zeigten sich in den
Plasmaproben nach 168,25 und 360,25 Stunden (Pferd 3), sowie nach 312,25 und 360,25
Stunden (Pferd 5).
In Abbildungen 25 und 26 werden die gemittelten Cortisolkonzentrationen der sechs mit
Voren® Suspension behandelten Pferde im Gesamtverlauf und in den ersten 25 Stunden
dargestellt. In den Tabellen 29-34 im Anhang sind die genauen Zahlenwerte der gemessenen
Cortisolkonzentrationen tabellarisch dargestellt.
Ergebnisse
91
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 100 200 300 400Stunden
Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 25: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und untere Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Hydrocortisol nach einmaliger intravenöser Applikation von
0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 5 10 15 20 25Stunden
Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 26: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und untere Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Hydrocortisol nach einmaliger intravenöser Applikation von
0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der
Behandlung
5.1.2. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach Voren®-Depot-Applikation
Die Untergrenze der Cortisolreferenzbereiches lag für die Pferde der Voren®-Depot-Gruppe
bei 38,1 ng/ml. Nach der Verabreichung von Voren®-Depot war der geringe anfängliche
Anstieg der Cortisolwerte bei den Tieren dieser Gruppe ebenfalls zu beobachten. Die
Ergebnisse
92
Schwelle des Referenzbereiches war im Mittel nach 6 Stunden signifikant unterschritten (p <
0,05). Der Cortisolspiegel von Pferd 1 lag bereits nach 2,25 Stunden, der von Pferd 6 nach 3
Stunden, der von Pferd 4 nach 4 Stunden und der von Pferd 5 nach 8 Stunden unterhalb des
Schwellenwertes. Nach 72,25 Stunden war der Cortsiolwert maximal und hochsignifikant
supprimiert (p < 0,01). Eine Erniedrigung der Cortisolwerte bis unterhalb der Nachweisgrenze
zeigte nur Pferd 4 zwischen 96,25 und 168,25 Stunden.
Nach 216,25 Stunden lagen die Werte im Mittel wieder im Normbereich, ohne erkennbare
statistische Abweichung (p > 0,05). Wiederholte Erniedrigungen waren nach 264,25 Stunden
(p < 0,05), 360,25 Stunden (p < 0,05) und 408,25 Stunden (p < 0,05) zu erkennen. Nach
456,25 Stunden lag der Cortisolwert wieder median im Referenzbereich (p > 0,05). Pferd 5
war bereits nach 192,25 Stunden zurück im Referenzbereich, Pferde 2 und 3 nach 312,25
Stunden. Wiederholtes Absinken der Cortisolwerte war bei Pferd 2 und 6 zu beobachten, sehr
geringfügig bei Pferd 2 nach 360,25 und 408,25 Stunden und deutlicher bei Pferd 6 nach
264,25, 360,25 und 408,25 Stunden. Die Cortisolwerte der Pferde 1 und 4 reihten sich im
Verlauf der Probenentnahme nicht bzw. nur annäherungsweise in den vorher festgelegten
Referenzbereich ein. Der Cortisolwert von Pferd 1 lag mit 37,84 ng/ml nach 456,25 Stunden
nur knapp unterhalb des Schwellenwertes. Pferd 4 hingegen hatte zu diesem Zeitpunkt einen
Cortisolwert von 25,98 ng/ml.
Die Abbildungen 27 und 28 stellen die gemittelten Cortisolkonzentrationen der sechs mit
Voren®-Depot behandelten Pferde im Gesamtverlauf und in den ersten 25 Stunden
dargestellt. In den Tabellen 35-40 im Anhang sind die genauen Zahlenwerte der gemessenen
Cortisolkonzentrationen tabellarisch aufgeführt.
Ergebnisse
93
0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0
0 100 200 300 400 500
Stunden
Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 27: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und unterer Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Cortisol nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06
mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden
0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0
0 5 10 15 20 25Stunden
Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 28: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und untere Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Cortisol nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06
mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der
Behandlung
5.2. Plasmakonzentrationen von Glucose
Der von der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische
Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover angegebene Referenzbereich für
Ergebnisse
94
Blutglucose in equinem Serum oder Plasma von 4,0 bis 7,0 mmol/l war nur in wenigen
Einzelwerten überschritten.
Die Pferde 4, 5 und 6 der mit Voren® Suspension behandelten Tiergruppe zeigten nach 8, 10
bzw. 24,25 Stunden einen deutlich erhöhten Einzelwert. Eine tendenzielle Erhöhung bis zum
Erreichen dieses erhöhten Einzelwertes und eine sich anschließende Erniedrigung des
Blutzuckerspiegels innerhalb des Referenzbereiches waren angedeutet. Den Pferden 1, 2 und
3 dieser Gruppe waren physiologische Werte zuzuordnen.
Bei den mit Voren®-Depot behandelten Pferden lagen alle Werte im Referenzbereich. Es war
keine signifikante Erhöhung zu messen.
Tabelle 24 und 25 zeigen die gemittelten Glucosekonzentrationen der mit Voren® Suspension
bzw. Voren®-Depot behandelten Pferde.
Die Einzelwerte jedes Pferdes sind in den Tabellen 29-40 im Anhang aufgeführt.
Proben-Nr.: Entnahmezeitpunkt
(Stunden) gemittelte
Glucosekonzentrationim Plasma [mmol/l]
Standardabweichung[%]
1 0 4,9 0,3 2 0,25 5,2 0,5 3 0,5 4,9 0,5 4 1,25 4,7 0,4 5 2,25 4,9 0,4 6 3 5,2 0,6 7 4 5,1 0,6 8 6 5,4 0,4 9 8 6,1 1,5 10 10 5,5 1,4 11 12,25 5,0 0,3 12 24,25 5,6 1,5 13 48,25 5,3 0,3 14 72,25 4,9 0,2 15 96,25 4,6 0,2 16 120,25 5,0 0,4 17 144,25 4,6 0,2 18 168,25 4,7 0,2 19 216,25 4,7 0,2 20 264,25 4,7 0,3 21 312,25 5,0 0,4 22 360,25 4,7 0,1
Tabelle 24: Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von
Glucose nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden
Ergebnisse
95
Proben-Nr.: Entnahmezeitpunkt (Stunden)
gemittelte Glucosekonzentration
im Plasma [mmol/l]
Standardabweichung [%]
1 0 4,8 0,1 2 1 4,7 0,2 3 2,25 5,0 0,6 4 3 5,2 0,5 5 4 5,1 0,5 6 6 5,0 0,5 7 8 5,4 1,1 8 12,25 4,5 1,1 9 23,5 5,2 0,8 10 48,25 5,1 0,4 11 72,25 5,2 0,4 12 96,25 5,4 0,7 13 120,25 5,4 0,5 14 144,25 4,9 0,3 15 168,25 5,3 0,8 16 192,25 5,0 0,4 17 216,25 4,9 0,3 18 240,25 5,0 0,4 19 264,25 5,5 0,6 20 312,25 5,0 0,6 21 360,25 5,0 0,5 22 408,25 5,5 0,7 23 456,25 5,3 0,3
Tabelle 25 : Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von
Glucose nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
bei sechs Pferden
Diskussion
96
V. Diskussion
Ziel der durchgeführten Arbeit war es, mittels einer pharmakologischen Studie an zwölf
Pferden und anschließender quantitativer Analyse von Plasma- und Urinproben eine Aussage
über das Ausscheidungsverhalten von Dexamethason nach einmaliger intravenöser bzw.
einmaliger intramuskulärer Injektion von Dexamethason-21-isonicotinat machen zu können.
Anhand der gewonnenen Erkenntnisse sollte geprüft werden, ob konkrete Aussagen über
Nachweisfristen und Ausscheidungszeiten für Dexamethason in equinem Plasma und Urin
gemacht werden können, und welche Schlussfolgerungen und Konsequenzen sich für diesen
Wirkstoff im Hinblick auf seine Applikation vor Pferdeleistungsprüfungen ergeben.
Die angewandten Analysemethoden, die der Bestimmung der Dexamethasonkonzentrationen
in den Plasma- und Urinproben dienten, wurden mit einer Messung mittels HPLC/MS/MS
kombiniert und im Vorfeld der Probenaufbereitung entwickelt, optimiert und validiert.
Neben den Dexamethasonkonzentrationen in Plasma und Urin wurden als weitere Parameter
der Blutcortisol- und der Blutglucosespiegel jedes Tieres bestimmt.
1. Eignung der gewählten Analysemethoden
Die Grundlagen der in dieser Arbeit angewandten Analysemethoden waren als
Routinemethoden zum Nachweis von Glucocorticosteroiden in equinem Plasma bzw. Urin im
Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln bereits etabliert. Durch die
beschriebenen Vorversuche und Veränderungen der Methoden wurden diese auf die
Detektion von Dexamethason abgestimmt. Es konnte nachfolgend auf das Vorhandensein von
Dexamethason, jedoch nicht seiner Metaboliten, geprüft werden. Als interner Standard wurde
das dem Dexamethason verwandte und ebenfalls synthetische Glucocorticoid Fluocortolon
gewählt. Die Analysemethoden für Plasma und Urin ergaben sich aus einem
Aufarbeitungsgang und anschließender Messung mittels HPLC/MS/MS. Sowohl die
Aufarbeitung der Plasmaproben als auch die Aufarbeitung der Urinproben basierten auf einer
Flüssigextraktion. In beiden Fällen fungierte tertiär Butylmethylether als Lösungsmittel. Um
die Ausbeute an Dexamethason möglichst vollständig zu gestalten, d.h. sowohl das frei
vorliegende Dexamethason als auch den glucuronidiert vorliegenden Anteil an Dexamethason
(KOOLMAN, 1994) zu erfassen wurde der Flüssigextraktion der Urinproben eine Hydrolyse
Diskussion
97
mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli vorgeschaltet. Die Vollständigkeit der Hydrolyse
wurde mit Hilfe des eingesetzten Hydrolysemarkers D5-Androsteron-glucuronid geprüft und
gezeigt.
Um die Eignung der in dieser Studie entwickelten Analysemethoden zu beweisen, wurde
sowohl die analytische Methode für Plasma als auch die analytische Methode für Urin einer
Validierung nach den Vorgaben des EHSLC (2002) unterzogen. Die Validierung beinhaltete
die Parameter Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Etablierung von Nachweis- und
Quantifizierungsgrenze, Wiederfindung und Stabilität.
Die Selektivität der Analysemethoden zeigte sich darin, dass eine ausreichende Trennung der
zu analysierenden Substanz von allen denkbaren Störsubstanzen inklusive der Matrix und
auch vom internen Standard gegeben war. Die Linearität wurde anhand von
Kalibrationsreihen überprüft. Es konnte für alle Kalibrationskurven ein Bestimmtheitsmaß der
linearen Regression von R² > 0,99 erzielt werden. Die Validierungsparameter Richtigkeit und
Präzision wurden an drei Messtagen geprüft. Die Ergebnisse lagen im Rahmen der erlaubten
Abweichung des theoretischen vom ermittelten Wert. Richtigkeit und Präzision waren somit
gezeigt. Die Quantifizierungsgrenze belief sich auf 0,25 ng/ml für Plasma und 1 ng/ml für
Urin. Die Nachweisgrenze für Dexamethason lag im Plasma bei 0,12 ng/ml, im Urin bei 0,67
ng/ml. Die Wiederfindungsrate für Dexamethason im Plasma belief sich auf 78,51 %, die für
Urin auf 77,43 %. Die Wiederfindungsraten für den internen Standard Fluocortolon stellten
sich mit 79,35 % im Plasma und 78,28 % im Urin ähnlich dar. Die Analysemethoden für
Plasma und Urin waren sowohl im Hinblick auf den Analyten als auch im Hinblick auf den
internen Standard vergleichbar gut. Die ermittelten Substanzverluste von ca. 20 % sind bei
einem für die Wiederfindung theoretischen Idealwert von 100 % zu tolerieren (KROMIDAS,
1999). Auch ist laut KROMIDAS (1999) in dieser Studie eine Vergleichbarkeit von Analyt
und internem Standard gegeben. Sowohl der Analyt Dexamethason als auch der interne
Standard Fluocortolon verzeichneten einen identischen Substanzverlust, so dass eine
rechnerische Korrektur entfiel. Somit war auch der interne Standard Fluocortolon als geeignet
anzusehen. Zur Überprüfung der Stabilität des Analyten Dexamethason in den Matrices
Plasma und Urin wurden mit Dexamethason dotierte Plasma- und Urinproben bei -20 °C
tiefgefroren. Die Lagerungsdauer der Stabilitäts- und der Hauptversuchsproben belief sich bei
den Plasmaproben auf 164 Tage, bei den Urinproben auf 155 Tage. Es konnte gezeigt werden,
dass der Analyt über diesen Zeitraum in beiden Matrices stabil war.
Diskussion
98
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass jeder einzelne Validierungsparameter die Vorgaben
des EHSLC (2002) erfüllt hat. Mittels der durchgeführten Validierung konnte gezeigt werden,
dass die entwickelten Analysemethoden für Plasma und Urin jeweils sehr zufrieden stellende
Extraktionsausbeuten, eine hohe Präzision und eine hohe Reproduzierbarkeit aufwiesen, und
sich durch überschaubare und einfache Aufarbeitungsgänge auszeichneten. Die Methoden
eignen sich somit für die Routinediagnostik von Dexamethason sowohl in Plasma als auch in
Urin.
Weiterhin führen die in dieser Studie entwickelten und validierten Analysemethoden im
Vergleich zu früheren Studien zu sensitiveren Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen.
ALVINERIE u. TOUTAIN (1982) beschrieben eine HPLC-Methode mit einer Sensitivität
von 2 ng/ml zur Detektion von Dexamethason im Plasma von Hunden. In der Studie von
TOUTAIN et al. (1984) lag die Nachweisgrenze der verwendeten HPLC-Methode für
Dexamethason in equinem Plasma und Urin bei 2-3 ng/ml. VINE et al. (1992) ermittelten
unter Verwendung eines Gaschromatographen kombiniert mit einem
Tandemmassenspekrometer eine Nachweisgrenze für Dexamethason in equinem Urin von 1
ng/ml. GRIPPA et al. (2000) erarbeiteten mittels Umkehr-Phase-HPLC und gleichzeitiger
Bestimmung von Cortisol, Dexamethason, Indomethacin, Phenylbutazon und
Oxyphenbutazon im Plasma von Pferden eine Nachweis- sowie eine Quantifizierungsgrenze
für Dexamethason von 0,25 µg/ml. TANG et al. (2001) verwendeten eine Methode aus
Flüssigchromatographie und Massenspektroskopie (LC-MS) zur Detektion von
dreiundzwanzig Corticosteroiden (inklusive Dexamethason) in equinem Urin bei einer
jeweiligen Sensitivitätsgrenze von 5 ng/ml. Die in dieser Studie erarbeiteten Nachweisgrenzen
für Dexamethason im Plasma von 0,12 ng/ml und im Urin von 0,67 ng/ml ermöglichen
hingegen eine Detektion noch geringerer Dexamethasonkonzentrationen. Diese Grenzen
ermöglichen somit einen immer genaueren und längeren Substanznachweis, was positiv für
die derzeitige Dopinganalytik zu werten ist.
2. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason
2.1. Plasmakonzentrationen
Die erreichten Maximalkonzentrationen von Dexamethason lagen bei den sechs mit Voren®
Suspension behandelten Pferden zwischen 0,4 ng/ml und 1,3 ng/ml. Durch die Voren®-
Diskussion
99
Depot-Applikation wurde bei sechs Pferden eine maximale Dexamethasonkonzentration
zwischen 0,3 ng/ml und 1,0 ng/ml erreicht. Diese wurden bei der erst genannten Gruppe nach
3 bis 24,25 Stunden erreicht, bei vier Tieren der zweiten Gruppe nach 12,25 bis 72,25
Stunden. Lediglich bei Pferd 1 und Pferd 2 der zweiten Gruppe entsprach dieser genannte
Maximalwert den erst nach 192,25 bzw. 360,25 Stunden auftretenden Einzelwerten. Dass es
sich bei diesen spät erreichten Dexamethasonmaximalwerten um Messfehler handeln könnte,
wurde durch wiederholtes Aufarbeiten und Messen dieser Proben ausgeschlossen.
Bei beiden Tiergruppen waren deutliche zeitliche Schwankungen bis zum Unterschreiten der
Quantifizierungs- und der Nachweisgrenze zu beobachten. Im Mittel war die
Quantifizierungsgrenze nach der Voren® Suspension-Applikation nach 72,25 Stunden
unterschritten, nach der Voren®-Depot-Applikation nach 23,5 Stunden. Die Nachweisgrenze
wurde bei dem erst genannten Präparat ebenfalls nach 72,25 Stunden post applikationem
erreicht, beim zweit genannten Arzneistoff nach 168,25 Stunden. Jedoch zeigten sich nach
vorherigem Unterschreiten der etablierten Nachweisgrenze bei einem Pferd der Voren®
Suspension-Gruppe sowie bei drei Pferden der Voren®-Depot-Gruppe nochmals
wiederkehrende und deutlich nachweisbare Signale.
Die Schwankungen in den Dexamethasonplasmakonzentrationen und in der Zeit bis zum
Erreichen der erwähnten Grenzen sind durch die individuell unterschiedliche Metabolisierung
des Stoffes durch die einzelnen Pferde zu erklären. Die schon während Resorption und
Metabolisierung einsetzende Elimination eines Stoffes (DOST, 1968) kann dazu führen, dass
nicht die gesamte resorbierte Wirkstoffmenge unverändert im Blut erscheint (GRAMATTE,
2002). Die wiederkehrenden Peaks bei einigen Tieren sind vor allem durch die als
Depotpräparat formulierte Galenik der beiden verabreichten Präparate zu erklären. Das in
beiden Fällen als Suspension vorliegende Präparat besitzt eine makrokristalline Aufbereitung.
Aus diesen kristallinen Partikeln werden die wirksamen Bestandteile nur langsam und
schrittweise freigesetzt, sie werden somit auch schrittweise resorbiert und erscheinen anteilig
im Blutkreislauf. Eben diese Formulierung als Kristallsuspension begründet den Depoteffekt
der Präparate (interner Bericht Boehringer Ingelheim).
Des Weiteren waren die im Plasma erreichten nur sehr niedrigen Maximalkonzentrationen an
Dexamethason auffällig. Sowohl nach intravenöser Applikation von Voren® Suspension als
auch nach intramuskulärer Verabreichung von Voren®-Depot, in der vom Hersteller
empfohlenen Dosierung, wurden nur Werte bis knapp oberhalb von 1,0 ng Dexamethason pro
ml Plasma erzielt. Bei der Verabreichung von Voren®-Depot in der Dosierung von 0,06
mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat und einem durchschnittlichen
Diskussion
100
Körpergewicht der Pferde der Voren®-Depot-Gruppe von 615,6 kg beträgt die intramuskulär
applizierte Wirkstoffmenge an Dexamethason-21-isonicotinat 36,9 mg. Die Ermittlung der
daraus resultierenden niedrigen Dexamethasonwerte im Plasma war überraschend. Diese nach
intramuskulärer Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat erreichten niedrigen
Plasmakonzentrationen an Dexamethason wurden jedoch bereits von SEAWRIGHT et al.
(1979) und TOUTAIN et al. (1984) beobachtet und beschrieben. SEAWRIGHT et al. (1979)
zeigten mittels Radioimmunoassey bei zwei Pferden, dass ein Plasmakonzentrationsspiegel an
Dexamethason nach intramuskulärer Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat in
den entnommenen Plasmaproben nicht bzw. nur in zwei Einzelproben (nach 65 und 75
Stunden) des einen Pferdes detektierbar war. In der Studie von TOUTAIN et al. (1984)
konnten mittels HPLC-Methode und einer Nachweisgrenze von 2 bis 3 ng/ml nur sehr
niedrige bis nicht detektierbare Dexamethasonkonzentrationen im Plasma festgestellt werden.
TOUTAIN et al. (1984) verweisen darauf, dass dieses beobachtete Phänomen der niedrigen
bis nicht detektierbaren Plasmakonzentrationen an Dexamethason nach Verabreichung von
Dexamethason-21-isonicotinat das Resultat einer lediglich anteiligen Resorption der
verabreichten Dosis sein muss. Die im Vergleich zur applizierten Dosis nur anteilige
Resorption könnte durch die Tatsache begründet sein, dass die konstante Resorptionsrate
kleiner ist als die konstante Eliminationsrate. Es wird somit weniger resorbiert, als eigentlich
eliminiert werden könnte. Dies deutet darauf hin, dass die Elimination des Wirkstoffes durch
seine Resorptionsrate limitiert wird, d.h. die Resorptionsrate kontrolliert die Eliminationsrate.
Weiterhin kann das Fehlen von deutlich detektierbaren und somit quantifizierbaren
Dexamethasonkonzentrationen nach Voren®-Depot-Applikation durch eine langsame und nur
schrittweise Resorption des Wirkstoffes an der Injektionsstelle begründet sein (interner
Bericht Boehringer Ingelheim). Die Begründungsansätze nach TOUTAIN et al. (1984) und
dem internen Bericht von Boehringer Ingelheim werden auch in dieser Studie als Erklärung
der niedrigen Plasmakonzentrationen an Dexamethason nach intramuskulärer Applikation von
Dexamethason-21-isonicotinat herangezogen.
Auf die niedrigen Dexamethasonkonzentrationen nach der intravenösen Applikation können
diese Erklärungen jedoch nicht übertragen werden, da eine Resorption nach intravasaler
Applikation entfällt. Laut Hersteller ist Voren® Suspension zur intramuskulären Applikation
vorgesehen. In dieser Studie wurde es jedoch intravenös verabreicht. Mittels einer
intravenösen Verabreichung sollte zum einen erreicht werden, dass die Anzahl an Faktoren,
welche die durchgeführte Ausscheidungsstudie beeinflussen könnten, möglichst gering
gehalten werden, zum anderen sollten praxisnahe Bedingungen erstellt werden, da Voren®
Diskussion
101
Suspension bis vor kurzem auch zur intravenösen Applikation zugelassen war und in der
tierärztlichen Praxis mittels intravasaler Verabreichung die wesentlich größere
Dopingrelevanz besitzt. Bei der Durchführung dieser Arbeit wurde die nach unbeabsichtigter
paravenöser Verabreichung des Arzneistoffes mögliche Resorption durch Applikation mittels
Braunülen, deren Sitz mehrmals kontrolliert und als korrekt intravenös befunden wurde,
ausgeschlossen. Es konnte von einer streng intravenösen Applikation ausgegangen werden.
Bei der Verabreichung von Voren® Suspension in der Dosierung 0,02 mg/kg Körpergewicht
Dexamethason-21-isonicotinat, einem durchschnittlichen Körpergewicht der Pferde der
Voren® Suspension-Gruppe von 593,6 kg, und einem anzunehmenden Blutvolumen eines
Pferdes von 6-10 % (gemittelt 8 %) des Körpergewichtes (TAYLOR u. HILLYER, 2001)
wären nach intravenöser Applikation von Voren® Suspension (applizierte Wirkstoffmenge:
11,87 mg/593,6 kg KGW) theoretische anfängliche Plasmakonzentration von ca. 250 ng
Dexamethason pro ml Plasma zu erwarten gewesen. Die gemessenen
Dexamethasonkonzentrationen lagen jedoch nur knapp oberhalb von 1,0 ng Dexamethason
pro ml Plasma. Es ist anzunehmen, dass die niedrigen Dexamethasonkonzentrationen nach
intravenöser Applikation durch zwei wesentliche Aspekte begründet sind. Als ein Grund kann
die zu spät durchgeführte Kontrolle des Plasmaspiegels an Dexamethason angesehen werden.
Die erste Plasmaprobe wurde erst nach Ablauf von einer Viertelstunde post applikationem
entnommen, sodass die nach intravenös applizierter Dosis erwartete Anfangskonzentration
von Dexamethason durch schnelle Abflutung des Medikamentes und Umverteilung in andere
Gewebe nicht bestimmt werden konnte. Die in dieser Studie nach Ablauf von 15 Minuten
entnommene Plasmaprobe scheint somit keine repräsentative Aussage über einen initialen
Wirkstoffspiegel zu machen. Um eine exakte Bestimmung der Konzentrationsverhältnisse an
Dexamethason machen zu können, hätten demnach schon vor Ablauf von 15 Minuten
engmaschige Kontrollen des Plasmaspiegels an Dexamethason durchgeführt werden müssen.
Eine weitere anzunehmende Begründung für die niedrigen Dexamethasonkonzentrationen
beruht auf der Galenik des Präparates. Es handelt sich bei dem Arzneistoff Voren®
Suspension, wie oben bereits erwähnt, um ein kristallines Depotpräparat, welches sich durch
langsame und schrittweise Freisetzung des Wirkstoffes auszeichnet (interner Bericht
Boehringer Ingelheim). Bedingt durch diese schrittweise Freisetzung des Wirkstoffes aus
seiner kristallinen Formulierung erscheinen als Folge, und im Vergleich zur applizierten
Wirkstoffgesamtmenge, nur anteilige Dexamethasonkonzentrationen im Plasma, so dass
weniger Dexamethason gemessen werden kann, als eigentlich verabreicht wurde.
Diskussion
102
Nach den Ergebnissen dieser Arbeit zu urteilen, kommt es somit sowohl nach intravenöser als
auch nach intramuskulärer Verabreichung der kristallinen Dexamethason-21-isonicotinat-
Suspensionen zu vergleichbaren Ergebnissen. Dabei scheint die Galenik des Präparates
deutlichen Einfluss auf die Wirkpotenz des jeweiligen Präparates zu haben. Dies zeigt sich
auch in der Studie von TOUTAIN et al. (1984). In dieser Studie lag Dexamethason-21-
isonicotinat als Lösung vor, und nicht, wie in dieser Arbeit, als Kristallsuspension. Die
Lösung wurde außerdem in einer Dosierung von 0,6 mg/kg Körpergewicht appliziert,
verglichen mit der in dieser Studie verabreichten Dosis von 0,02 mg/kg Körpergewicht. So
wurden bei TOUTAIN et al. (1984) zum einen durch die Galenik des Arzneistoffes, zum
anderen durch die höhere Dosierung deutlich höhere Dexamethasonplasmakonzentrationen
beobachtet als in dieser Studie.
Die Erklärung, dass die ermittelten niedrigen Dexamethasonkonzentrationen für die
Depotwirkung der Präparate und nicht für mangelnde systemische Verfügbarkeit des
Präparates post applikationem sprechen, kann belegt werden. Nach ENGELHARDT (1963)
erfolgt die Spaltung des Dexamethason-21-isonicotinats in Dexamethason und Isonicotinsäure
direkt, so dass von einer totalen systemischen Verfügbarkeit von Dexamethason nach einer
Injektion als Dexamethason-21-isonicotinat ausgegangen werden kann (TOUTAIN et al.,
1984). Die hydrolytische Spaltung wird durch unspezifische Esterasen vermittelt, deren
Vorkommen und Aktivität speziesabhängig stark variiert (WEISENBERGER, 1972). Diese
Esterasen sind im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten zu finden (PELZER, 1975). Bei
der Ratte sind nach 10 Minuten bereits 90 % des Esters hydrolysiert und beim Kaninchen
sogar 99 % des Esters. Im Humanserum liegt die Halbwertszeit des Esters bei 90-100 Minuten
(WEISENBERGER, 1972). Exakte Angaben zu den Esteraseaktivitäten anderer Tierarten sind
ungenau und lückenhaft. Im Rahmen der damaligen Arbeit verwiesen TOUTAIN et al. (1984)
auf eine Plasmahalbwertszeit von intravenös appliziertem Dexamethason von ca. 53 Minuten.
Diese ist beim Pferd signifikant kürzer als bei anderen Spezies, was auf einen aktiveren
Metabolisierungsprozess in der Leber zurückzuführen ist. Sie beträgt 119 bis 136 Minuten bei
Hunden (TOUTAIN et al., 1983), 142 bis 201 Minuten beim Menschen (TSUEI et al., 1979)
und 291 bis 335 Minuten bei Kühen (TOUTAIN et al., 1982). UNGEMACH (2002) gibt die
Halbwertszeit für freies Dexamethason sowie für leicht spaltbare, wasserlösliche Ester beim
Pferd mit 180-200 Minuten an. Hingegen beschreiben CUNNINGHAM et al. (1996) nach
oraler Gabe von Dexamethason eine Halbwertszeit von 4,36 ± 1,34 Stunden. Die
Metabolisierung von Glucocorticoiddepotpräparaten dauert Wochen bis Monate
(UNGEMACH, 2002). Der deutliche Unterschied in den Halbwertszeiten von freiem
Diskussion
103
Dexamethason, wasserlöslichen Estern und Depotformulierungen bestärkt nochmals den
erwähnten Unterschied zwischen einer Dexamethason-21-isonicotinat-Lösung und einer
Dexamethason-21-isonicotinat-Kristallsuspension.
2.2. Urinkonzentrationen
Die Höchstkonzentrationen an Dexamethason waren bei der Voren® Suspension-Tiergruppe
innerhalb eines Zeitraumes von 2 bis 12 Stunden erreicht und beliefen sich auf 26,0 ng/ml bis
65,4 ng/ml. Bei der Voren®-Depot-Tiergruppe wurden innerhalb von 7 bis 12 Stunden die
Höchstwerte von 7,3 ng/ml bis 22,4 ng/ml erreicht.
Im Mittel war die Quantifizierungsgrenze nach der Voren® Suspension-Applikation nach
120,5 Stunden unterschritten. Nach der Voren®-Depot-Applikation war diese Grenze
erstmals nach Ablauf von 288 Stunden, und nach einem wiederkehrend quantifizierbaren
Signal nach 432 Stunden, letztendlich also nach 480 Stunden unterschritten. Die
Nachweisgrenze unterschritten die mit Voren® Suspension behandelten Tiere
durchschnittlich nach 144,5 Stunden post applikationem, nach Applikation von Voren®-
Depot war diese Grenze nach 552 Stunden erreicht. Nach Unterscheiten der Nachweisgrenze
bei der Voren® Suspension-Gruppe stellten sich lediglich bei Pferd 2 nochmals zu
detektierende Signale nach 216,25, 384,25 sowie 456,25 Stunden dar. Bei den Tieren der
Voren®-Depot-Gruppe zeigten die Pferde 5 und 6 nach Ablauf von 912 Stunden nochmals
ein Signal nach bereits vorherigem Unterschreiten der Nachweisgrenze.
In der bereits zitierten Studie von SEAWRIGHT et al. (1979) konnten nach intramuskulärer
Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat vergleichbare Ergebnisse erzielt werden.
So wurden Dexamethasonmaximalwerte zwischen 25 und 35 ng/ml erreicht und die
deutlichste Dexamethasonausscheidung fand in den ersten 12 bis 36 Stunden statt. Die
Nachweisbarkeit von Dexamethason im Urin bis zu 5 Tagen post applikationem war jedoch
kürzer als in dieser Studie, was vermutlich auf eine weniger sensible Nachweisgrenze
zurückzuführen ist. Laut SEAWRIGHT et al. (1979) werden die in ihrer Studie ermittelten
Maximalkonzentrationen in der Praxis ebenfalls beobachtet. In als positiv befundenen
Urindopingproben wird meist nicht mehr als 20 ng/ml Dexamethason gefunden, jedoch
vergesellschaftet mit einem deutlich erniedrigten Cortisolspiegel.
Ähnliche Studien, die sich, wie diese durchgeführte Arbeit, mit der intravenösen Gabe von
Dexamethason-21-isonicotinat als Depotpräparat beschäftigen konnten nicht gefunden
Diskussion
104
werden, sodass den hier ermittelten Urinkonzentrationen an Dexamethason keine
Erfahrungswerte zum Vergleich zugeordnet werden konnten.
Bei den einzelnen Tieren dieser Studie sind sowohl die Schwankungen der
Dexamethasonkonzentrationen im Urin als auch die zeitlichen Schwankungen bis zum
Erreichen der Quantifizierungs- und Nachweisgrenze zum einen durch die in Kapitel V.2.1.1.
bereits erwähnte und für jedes Einzeltier individuelle Metabolisierungsfähigkeit begründet,
zum anderen durch die Galenik der verabreichten Präparate.
Einfluss auf die Metabolsierung haben laut GRAMATTE (2002) mehrere endogene
Parameter. Auch nach SAMS (1992) wird die Urinkonzentration eines Wirkstoffes durch eine
Reihe physiologischer Faktoren beeinflusst und spiegelt nur in seltenen Fällen die
Plasmakonzentrationsverläufe wieder. Eine variierende Harnmenge infolge unterschiedlicher
Flüssigkeitsaufnahme und individueller körperlicher Belastung (SAMS, 1992), die
Beeinflussung der Ausscheidungsrate durch den Harn-pH-Wert (GRAMATTE, 2002) und
auch eine erhöhte Clearance infolge vermehrter Urinproduktion (GRAMATTE, 2002) stellen
einige dieser physiologischen Faktoren dar. Die Möglichkeit einer gestörten
Harnausscheidung infolge krankhafter Veränderungen der Nieren konnte bei den
Versuchstieren dieser Studie mittels Kontrolle der Kreatininwerte ausgeschlossen werden.
Anzumerken ist an dieser Stelle jedoch, dass die in dieser Studie beobachteten Schwankungen
der Dexamethasonkonzentrationen zum Teil durch die Art der Urinentnahme begründet sein
könnten. Da es sich um Spontanharngewinnung der Pferde handelte, wurde nur jeweils ein
Teil des Mittelstrahlurins, nicht aber die Gesamturinmenge aufgefangen. Für eine exakte
Beurteilung wäre es erforderlich die kumulative Gesamtmenge an Urin über die Dauer des
Ausscheidungsversuchs zu sammeln und zu untersuchen. So wäre eine Ermittlung der
Ausscheidungsrate (ausgeschiedene Menge pro Zeiteinheit) möglich gewesen (DYKE u.
SAMS, 1994). Die praktische Durchführung dieser Technik der Urinentnahme wäre jedoch
über die Länge der Versuchsphase schwer durchführbar gewesen. Durch die hier angewandte
Art der Probenentnahme könnte auch der bei den mit Voren®-Depot behandelten Tieren
beobachtete, einmalige starke Konzentrationsabfall an Dexamethason vor Erreichen des LOQ
begründet sein. Da dieser Konzentrationsabfall jedoch kein Einzelfall war, sondern sich
reproduzierbar bei allen sechs Pferden dieser Gruppe beobachten ließ, muss von einem
absinkenden Wirkstoffspiegel des Dexamethasons und daraufhin folgender wiederholter
Wirkstofffreisetzung aus den intramuskulären Depots ausgegangen werden.
Diskussion
105
Auch im Rahmen der untersuchten Urinproben konnte somit der gewünschte und auch
eingetretene Depoteffekt des Dexamethason-21-isonicotinats nach Verabreichung von sowohl
Voren® Suspension als auch von Voren®-Depot gezeigt werden. So kam es auch nach
vorherigen nicht mehr messbaren Signalen wieder zu deutlich quantifizierbaren
Konzentrationserhöhungen, was für eine stattgefundene schrittweise Freisetzung des
Wirkstoffes aus der mikrokristallinen Struktur bzw. aus den Depots spricht (interner Bericht
Boehringer Ingelheim). Neben dieser schrittweisen Wirkstofffreisetzung verlängert sich auch
die Wirkdauer der Präparate. Auch CHAPMANN et al. (1977) arbeiteten den Aspekt der
langen Wirkdauer eines Depotpräparates heraus, indem sie zeigten, dass ein
Dexamethasonester in Form von Dexamethason-21-isonicotinat eine längere
Ausscheidungsdauer hat als die lösliche Form eines Glucocorticoidesters- oder alkohols.
Einen zeitlichen Überblick bzw. eine Angabe darüber, wie viel Dexamethason renal
ausgeschieden wird, gibt der pharmakokinetische Parameter der renalen Clearance. Die renale
Clearance konnte, wie in Kapitel V.2.3. beschrieben, in dieser Studie nicht bestimmt werden.
Deswegen sind an dieser Stelle stellvertretend die ermittelten Clearancewerte anderer Studien
angeführt. Nach einer intravenösen Verabreichung von 10 mg Dexamethason an acht Pferden
wurde eine Clearance von 0,479 ± 0,064 l/kg/h bestimmt (CUNNINGHAM et al., 1996). Die
von TOUTAIN et al. (1984) errechnete renale Clearance für Dexamethason liegt beim Pferd
mit 12 bis 13 ml/min/kg signifikant höher als bei anderen Spezies. Sie beträgt 3 bis 4
ml/min/kg beim Menschen (TSUEI et al., 1979), 6,4 ml/min/kg bei Hunden (TOUTAIN et al.,
1983) und 2,4 bis 2,6 ml/min/kg bei Kühen (TOUTAIN et al., 1982). Weiterhin stellt der
renal ausgeschiedene Anteil an Dexamethason laut TOUTAIN et al. (1984) lediglich 6-9 %
der verabreichten Dosis dar. Die Beobachtung, dass lediglich ein Teil der verabreichten Dosis
renal eliminiert wird, konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Ausgehend vom
gemittelten Körpergewicht der Pferde der Voren® Suspension-Gruppe (593,6 kg KGW)
sowie der Voren®-Depot-Gruppe (615,6 kg KGW) und der Annahme eines Blutvolumens
beim Pferd von 6-10 % (gemittelt 8 %) des Körpergewichtes (TAYLOR u. HILLYER, 2001),
wurde die nach Verabreichung der Medikamente im Körper vorhandene Arzneistoffmenge
mit der Menge an renal eliminiertem Dexamethason verglichen. Die renale Exkretion betrug
bei den Pferden der Voren® Suspension-Gruppe 8-24 % der verabreichten Dosis, bei den
Tieren der Voren®-Depot-Gruppe lediglich 1,07-2,67 % der applizierten Arzneistoffmenge.
Die lediglich anteilige Exkretion von Dexamethason belegt nochmals die in Kapitel V.2.1.
erwähnten Erklärungsansätze. So wird die Elimination, wie es besonders nach der Voren®-
Diskussion
106
Depot-Applikation deutlich wird, zum einen durch die Resorptionsrate limitiert, da es zu einer
langsamen Resorption des Wirkstoffes aus dem Depot an der Injektionsstelle kommt (interner
Bericht Boehringer Ingelheim). Zum anderen kommt es durch die als kristallines
Depotpräparat formulierte Galenik zu einer langsamen und schrittweisen Freisetzung des
Wirkstoffes (interner Bericht Boehringer Ingelheim), und somit als Konsequenz auch zur
schrittweisen Elimination der jeweiligen freigesetzten Wirkstoffmenge.
In dieser Studie wurden die Biotransformation und das Ausscheidungsverhalten einzelner
Metaboliten von Dexamethason nicht detailliert untersucht. Lediglich die Gesamtmenge an
ausgeschiedenem reinem Dexamethason wurde bestimmt. Einen Überblick über
Metabolisierung und Exkretionsverhalten von Dexamethason beim Pferd geben DUMASIA et
al. (1986). Sie erarbeiteten in einer Studie mit Hilfe von radioaktiv markiertem
Dexamethason, dass 40-50 % der an Dexamethason gebundenen Radioaktivität in den ersten
24 Stunden renal ausgeschieden werden. Weitere 10 % folgen in den nächsten drei Tagen. Die
ausgeschiedene Radioaktivität war zum größten Teil (26-36 %) in der Fraktion des
unkonjugierten Dexamethasons zu finden, 8-13 % lagen konjugiert vor und ca. 5 % waren
nicht extrahierbar. Metaboliten kamen in Form von unverändertem Dexamethason, 17-
Oxodexamethason, 11-Dehydrodexamethason, 20-Dihydrodexamethason, 6-
Hydroxydexamethason und 6-Hydroxy-17-oxodexamethason vor. Diese Metaboliten machten
aufsummiert 60 % der Radioaktivität im Urin aus. Über 25 % der Radioaktivität waren an
polare Metaboliten gebunden und blieben unidentifiziert. Laut SKRABALAK u. MAYLIN
(1982) ist 9-fluoro-16a-methyl-6ß-,11ß,16ß-trihydroxy-1,4-androstadien-3,17-dion der
Hauptmetabolit im Pferdeurin.
2.3. Pharmakokinetische Berechnungen
Durch eine mathematische Beschreibung von Konzentrationsverläufen lässt sich die
Verstoffwechselung von in den Organismus verbrachten Arzneimitteln darstellen. Da die
Pharmakokinetik ihre Daten vorwiegend aus der Kreislaufflüssigkeit, dem Blut bezieht
(GLADTKE u. VON HATTINGBERG, 1977), sind aussagekräftige Plasmakonzentrationen
des zu untersuchenden Arzneistoffes die Grundlage einer Kinetikberechnung. In dieser Studie
konnten jedoch sowohl nach Applikation von Voren® Suspension als auch von Voren®-
Depot nur sehr niedrige Plasmakonzentrationen an Dexamethason ermittelt werden. Für
kinetische Berechnungen geeignete Werte lagen mit nur wenigen Werten oberhalb der
Quantifizierungsgrenze. Die meisten Werte bewegten sich zwischen Quantifizierungs- und
Diskussion
107
Nachweisgrenze. So konnte nur bei wenigen Werten oberhalb des LOQ der Plasmagehalt an
Dexamethason genau quantifiziert werden. Werte zwischen dem LOQ und dem LOD konnten
lediglich nachgewiesen, nicht aber mengenmäßig bestimmt werden. Diese Differenzierung
zwischen quantifizierbaren und nicht quantifizierbaren Werten wurde in den Abbildungen 16-
20 optisch hervorgehoben. Pharmakokinetische Berechnungen bezüglich Halbwertszeit,
Verteilungsvolumen und Clearance konnten somit mit gängigen pharmakokinetischen
Computerprogrammen nicht vorgenommen werden.
Betrachtet man zum Beispiel die Halbwertszeit, so ist deren Ermittlung sowohl aufgrund ihrer
Definition als auch aufgrund ihrer Berechnungsmöglichkeiten in dieser Studie nicht möglich.
Die Halbwertszeit ist eindeutig für einen zeitlich bestimmten exponentiellen Verlauf der
Arzneimittelkonzentration und nicht für ihren Gesamtverlauf definiert. Dieser exponentielle
Verlauf, bzw. der Verlauf einer Geraden nach halblogarithmischer Darstellung muss sich
mindestens über drei Punkte erstrecken, um für eine Bestimmung der Halbwertszeit
auswertbar zu sein (GLADTKE u. VON HATTINGBERG, 1977). In Praxi werden laut
GLADTKE u. VON HATTINGBERG (1977) einer solchen Kurve vier bis sechs Punkte
zugrunde gelegt, was der Kontrolle und der Beseitigung unsystematischer Analysen- und
Versuchsfehler dient. Das Vorhandensein von nur einem über dem LOQ liegenden und somit
verwendbaren Wert bei der Voren®-Depot-Gruppe macht eine Bestimmung der
Halbwertszeit dieses Stoffes nicht möglich. Bei der Voren® Suspension-Gruppe lagen im
Mittel 12 Werte oberhalb des LOQ. Diese schwankten jedoch stark und nur zwei Messwerte
erfüllten die oben genannten Bedingungen eines exponentiellen Verlaufs. Einer dieser zwei
Messpunkte war zudem deckungsgleich mit der Quantifizierungsgrenze, so dass auch in
diesem Falle aufgrund mangelnder verwertbarer Daten auf die Berechnung der Halbwertszeit
verzichtet werden musste.
Ein weiterer wichtiger pharmakokinetischer Parameter ist das Verteilungsvolumen. Eine
Berechnung des Verteilungsvolumens, ist, wie in Kapitel II.5.1. erwähnt, nur nach
intravenöser Applikation eines Arzneistoffes möglich. Eine eventuelle Berechnung innerhalb
der mit Voren®-Depot behandelten Tiergruppe schließt sich somit aus. Bei den mit Voren®
Suspension behandelten Tieren wäre eine Berechnung des Verteilungsvolumens aufgrund der
intravasalen Verabreichung grundsätzlich möglich. Jedoch setzt das Verteilungsvolumen die
intravenös applizierte Dosis und die daraufhin erreichte Anfangskonzentration des
Wirkstoffes ins Verhältnis. Da die erste Plasmaprobe nach der intravasalen Verabreichung
von Voren® Suspension aber erst nach Ablauf von einer Viertelstunde entnommen wurde,
war eine repräsentative Aussage über die Anfangskonzentration von Dexamethason durch
Diskussion
108
schnelle Abflutung des Medikamentes nicht zu erwarten, so dass auf eine Berechnung
verzichtet werden musste.
Die Bestimmung der Clearance erfolgt, wie auch in Kapitel II.5.1. beschrieben, entweder über
den Quotienten aus Eliminationsrate und Wirkstoffkonzentration, oder mittels
Verteilungsvolumen und Halbwertszeit. Da aber die für beide Rechenansätze notwendigen
Daten nicht ermittelt werden konnten, war auch die Bestimmung dieses Parameters nicht
durchführbar.
Pharmakokinetische Berechnungen nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN und
LASSOURD (2002) sind im Falle von Dexamethason, und somit von Glucocorticoiden
allgemein, nicht möglich. Dieses Modell kann nur bei Stoffen Anwendung finden, deren
biologische Halbwertszeit der Eliminationshalbwertszeit entspricht. Bei Glucocorticoiden
hingegen kommt es, wie bereits beschrieben, zu einer deutlich längeren biologischen
Wirkung, d.h. zu einer weiter bestehenden Wirkung bei gleichzeitig fehlender
Nachweisbarkeit des entsprechenden Glucocorticoids im Plasma.
3. Beeinflussung des Cortisolspiegels durch Dexamethason
In dieser Studie dienten die Plasmaproben jedes Pferdes als zu untersuchende Matrix, um den
Cortisolspiegel zu ermitteln. Abgestimmt auf den bestehenden circadianen Rhythmus der
Plasmacortisolausschüttung wurden alle Plasmaproben, exklusive der engmaschigen Proben
in den ersten 36 Stunden, morgens zur gleichen Uhrzeit entnommen, um eine
Vergleichbarkeit der Werte durch Umgehung der circadianen Schwankungen zu
gewährleisten.
Der basale Ausgangswert an Plasmacortisol, bestimmt kurz vor der Dexamethason-21-
isonicotinat-Applikation, wurde für beide Tiergruppen ermittelt. Der nichtparametrische
Referenzbereich war einseitig definiert, es wurde also nur die Untergrenze festgelegt. Diese
lag bei der erst genannten Gruppe bei 39,4 ng/ml, bei der zweiten genannten Tiergruppe bei
38,1 ng/ml. Sowohl der basale Mittelwert als auch der untere Schwellenwert für Cortisol
waren bei beiden Gruppen vergleichbar und stimmten recht genau mit von GYLSTROFF u.
HEGNER (1983), LANE (1986) und KLAUS u. HAPKE (1996) ermittelten Werten überein.
LANE (1986) fand tageszeitliche Schwankungen des Cortisols zwischen 30 bis 57 ng/ml
Plasma, GYLSTROFF u. HEGNER (1983) fanden Schwankungen zwischen 40 bis 80 ng/ml
Diskussion
109
Plasma. KLAUS u. HAPKE (1996) sehen eine Cortisolkonzentration von 25 bis 65 ng/ml
Plasma, in Abhängigkeit von Tageszeit und Belastung, als normal an.
In dieser Studie war, sowohl nach der intravenösen als auch nach der intramuskulären
Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat, bei allen Pferden ein geringer, jedoch
statistisch nicht signifikanter Anstieg des Blutcortisolspiegels zu verzeichnen. Bei der
Voren® Suspension-Gruppe war dieser Anstieg innerhalb der ersten halben Stunde nach der
intravenösen Behandlung sichtbar, bei der Voren®-Depot-Gruppe innerhalb der ersten Stunde
nach der intramuskulären Applikation. Auch TOUTAIN et al. (1984) ermittelten nach
intravenöser Verabreichung einer Dexamethason-21-isonicotinat-Lösung einen Anstieg des
Cortisolspiegels in der ersten halben Stunde nach der Applikation, während sie eine
vergleichbare Cortisolwerterhöhung nach intramuskulärer Applikation von Dexamethason-
21-isonicotinat-Lösung nicht feststellen konnten.
Der Anstieg der Cortisolkonzentration ist vermutlich auf den Stress durch die Platzierung des
Venenverweilkatheters und die sich anschließende Blutentnahme zurückzuführen. Nach
FICHTL et al. (2001) nimmt in Stresssituationen die Frequenz und die Höhe der
Corticoidsekretionsspitzen zu. Im Gegensatz zu dieser stressbedingten Cortisolwerterhöhung,
wie sie bei der Platzierung eines Verweilkatheters deutlich wurde, konnte gezeigt werden,
dass die einfache Punktion von Venen zur Blutentnahme keinen Effekt auf den
Plasmacortisolspiegel hat. Auch TOUTAIN et al. (1984) beobachteten dieses Phänomen und
stellten die in dieser Arbeit bestätigte These einer „stressfreien Blutentnahme durch
Venenpunktion“ auf.
Die Cortisolwerte der mit Voren® Suspension behandelten Tiere lagen nach Ablauf von 2,25
Stunden unterhalb des Cortisolschwellenwertes, die der mit Voren®-Depot behandelten
Pferde nach 6 Stunden. Der maximale Suppressionswert war im Mittel bei der Voren®
Suspension-Gruppe nach 48,25 Stunden, bei der Voren®-Depot-Gruppe nach 72,25 Stunden
erreicht. Beide Zeitpunkte liegen somit hinter dem von SLONE et al. (1981) ermittelten
maximalen Suppressionszeitpunkt von 12 Stunden nach intramuskulärer Applikation von
reinem Dexamethason.
Der Cortisolausgangsbereich war bei den Tieren der Voren® Suspension-Gruppe nach 144,25
Stunden, bei den Tieren der Voren®-Depot-Gruppe nach 216,25 Stunden wieder erreicht.
Anders ausgedrückt hielt die Cortisolsuppression nach der Voren® Suspension-Applikation
über 6 Tage bzw. nach der Voren®-Depot-Applikation über 9 Tage an. Dieser Zeitraum war
signifikant länger als der von TOUTAIN et al. (1984) beschriebene Suppressionseffekt über 3
Diskussion
110
Tage nach intravenöser und auch länger als die Suppressionsdauer über 4 Tage nach
intramuskulärer Gabe einer Dexamethason-21-isonicotinat-Lösung. Auch konnte die von
SEAWRIGHT et al. (1979) beobachtete rasche Erholung der Cortisolwerte in dieser Studie
nicht bestätigt werden. Sie ermittelten in ihrer damaligen Studie 60 Stunden post
applikationem und nach vorheriger Cortisolsuppression Cortisolwerte von 30 bis 40 ng pro ml
Plasma. Selbst Studien aktuelleren Datums präsentieren eine schnellere Erholung des
Blutcortisolspiegels. SOMA et al. (2005) beschreiben eine Cortisolsuppression über nur 4
Tage nach intravenöser Injektion einer Voren®-Lösung. Nach FREY (2002) beläuft sich der
suppressive Effekt von wässrigen Kristallsuspensionen sogar auf bis zu mehrere Wochen.
Diese Angabe wurde durch die sich in dieser Studie nochmals zeigende Cortisolsuppression
nach 264,25 Stunden (11 Tage), 360,25 Stunden (15 Tage) und 408,25 Stunden (17 Tage) bei
dem intramuskulär verabreichten Arzneistoff Voren®-Depot bestärkt.
Der Zeitpunkt bis zum Unterschreiten des Cortisolschwellenwertes, die Dauer der
Cortisolsuppression und auch das Wiedereinreihen in den Referenzbereich dauerte bei den
intramuskulär behandelten Tieren deutlich länger als bei den intravenös behandelten Tieren.
Dies ist auf die Tatsache der stattgefundenen Resorption nach intramuskulärer Applikation
vor Beginn des Wirkungseintritts zurückzuführen. Weiterhin war aus den Cortisolwerten der
einzelnen Tiere ersichtlich, dass die Cortisolsuppression nach intravenöser Gabe von Voren®
Suspension stärker war als nach intramuskulärer Verabreichung von Voren®-Depot. Auch
war die Cortisolsuppression innerhalb der Voren® Suspension-Gruppe vergleichbar stark
ausgeprägt. Es war hier bei drei Pferden eine Suppression bis unterhalb der
Testnachweisgrenze zu erkennen. Eine vergleichbar starke Suppression zeigte aus der
Voren®-Depot-Gruppe lediglich ein Pferd, dessen Cortisolspiegel sich im Laufe des
kontrollierten Zeitraumes auch nicht wieder in den Referenzbereich einreihte. Das Absinken
des Cortisolspiegels bis zu einem nicht detektierbaren Wert geht konform mit dem von
HOFFSIS et al. (1970) u. EILER et al. (1979) dokumentierten suppressiven Effekt von
Dexamethason auf die Nebenniere des Pferdes.
Die kürzere, aber deutlichere und bei den sechs Einzeltieren vergleichbar stark ausgeprägte
Cortisolsuppression nach intravenöser Behandlung im Vergleich zur intramuskulären
Verabreichung kann durch den schneller eintretenden Eingriff in die Regulation der
Nebennnierenfunktion verstanden werden. Laut FICHTL et al. (2001) gehört die
Cortisolsuppression zu den ohne Latenz einsetzenden Glucocorticoideffekten. Die erste Phase
der negativen Rückkopplung erfolgt, durch Hemmung der Sekretion von Corticotropin-
Diskussion
111
releasing hormone (CRH) und ACTH, direkt beim Anfluten des Glucocorticoids. Auch nach
einmaliger Gabe kommt es zur sofortigen Suppression der endogenen Cortisolsekretion. Eine
im weiteren Verlauf anhaltende Suppression wird durch die Hemmung der Synthese von
ACTH begründet. Steigende Blutspiegel von körpereigenem oder auch exogen zugeführten
synthetischen Glucocorticoiden hemmen den hypothalamisch-hypophysären Regelkreis
(FREY, 2002). Diese hormonelle Regulation reagiert, wie in dieser Studie verdeutlicht, selbst
bei niedrigen Konzentrationen an synthetischen Glucocorticoiden sehr sensibel. Eine
ausgeprägte Cortisolsuppression bei zeitgleich niedrigen Plasmakonzentrationen an
Dexamethason wurde auch von TOUTAIN et al. (1984) beobachtet, und führte zu der bereits
erwähnten Schlussfolgerung, dass es, gemessen an der starken Cortisolsuppression, lediglich
zu einer anteiligen Resorption der verabreichten Dosis des Glucocorticoids kommt.
Die in dieser Studie trotz niedriger Dexamethasonkonzentrationen ermittelte ausgeprägte
Cortisolsuppression zeigt die Wirksamkeit der Präparate. Eine nachgewiesene Senkung des
endogenen Glucocorticoidspiegels belegt die Wirkung des verabreichten synthetischen
Präparates auf die Steuerungsmechanismen der Cortisolkonzentration im Sinne einer
negativen Rückkopplung auf die ACTH-Ausschüttung im Hypophysenvorderlappen
(TOUTAIN et al., 1984). Das verabreichte Dexamethason-21-isonicotinat hat sowohl in Form
von Voren®-Depot als auch in Form von Voren® Suspension die Produktion von
körpereigenem Cortisol durch die Nebennieren gehemmt.
Abbildung 29 stellt das Gesagte noch einmal graphisch gegenüber.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
0 50 100 150 200 250 300 350 4000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
0 100 200 300 400 5000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Abb. 29: gemittelte Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─♦─) und Cortisol (---)
nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension (links)
bzw. nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
(rechts) bei jeweils sechs Pferden (x-Achse: Zeit [Stunden]; y-Achse (links): Konzentration
Cortisol [ng/ml]; y-Achse (rechts): Konzentration Dexamethason [ng/ml])
Diskussion
112
4. Beeinflussung des Glucosespiegels durch Dexamethason
Eine nach einer Glucocorticoidbehandlung erwartete Erhöhung der Blutzuckerwerte war in
dieser Studie nicht eindeutig ersichtlich. Der physiologische Referenzbereich in equinem
Serum oder Plasma für Blutglucose von 4,0 bis 7,0 mmol/l wurde bei den zwölf Pferden
beider Gruppen nur in wenigen Einzelwerten überschritten. Nach einem anfänglich
tendenziellen Anstieg des Glucosespiegels zeigten Pferd 4, 5 und 6 der mit Voren®
Suspension behandelten Tiergruppe mit 8,6 mmol/l, 8,8 mmol/l bzw. 7,5 mmol/l je einen
deutlich erhöhten Einzelwert. Die Werte der übrigen Tiere sowohl dieser Tiergruppe als auch
der gesamten Voren®-Depot-Gruppe bewegten sich gleich bleibend im erwähnten
Referenzbereich.
SLONE et al. (1981) ermittelten ähnliche Ergebnisse. Nach intramuskulärer Applikation von
Dexamethason reihte sich hier der in den ersten 12 Stunden leicht erhöhte
Plasmaglucosespiegel innerhalb von zwei bis sieben Tagen post applikationem in ein dem
Referenzbereich entsprechendes Plateau ein. Auch LANE (1986) erzielte nach intravenöser
Applikation von Voren®-Lösung in einer zu dieser Studie adäquaten Dosierung eine nur
geringgradige Erhöhung der Glucosewerte nach 4, 8, 12 und 24 Stunden.
Anders als bei der Cortisolsuppression gehört der gluconeogenetische Effekt der
Glucocorticoide nicht zu den sofort eintretenden Wirkungen. Er wird, wie bereits beschrieben,
durch einen Wirkmechanismus über intrazelluläre Glucocorticoidrezeptoren vermittelt. Diese
Effekte setzten erst nach einer gewissen Latenz ein (FICHTL et al., 2001). Diese Wirklatenz
war auch in dieser Studie zu erkennen, und zwar daran, dass die oben erwähnten erhöhten
Einzelwerte erst nach 8 (Pferd 5), 10 (Pferd 6) bzw. 24,25 (Pferd 4) Stunden auftraten.
Laut FICHTL et al. (2001) steigt die Glucosekonzentration im Plasma erst nach längerer
Anwendung von Glucocorticoiden an. Eine stärkere Erhöhung des Blutglucosespiegels wäre
somit erst nach weiteren Applikationen eines Glucocorticoids zu erwarten. In dieser Studie
wurde das Dexamethason-21-isonicotinat sowohl in Form von Voren® Suspension als auch in
Form von Voren®-Depot jedoch nur einmalig appliziert, da beide Präparate aufgrund ihres
Depoteffektes laut Hersteller nur zur einmaligen Verabreichung vorgesehen sind. Auch
UNGEMACH (2002) rät aufgrund der langen Wirkdauer von Depotpräparaten nur zu einer
einmaligen Verabreichung. Nach MACDONALD (2000) sollten schlechtlösliche Ester nicht
für eine Langzeittherapie in Form von mehrmaliger Applikation eingesetzt werden.
Diskussion
113
In der dieser Studie sehr ähnlichen Arbeit von TOUTAIN et al. (1984) wurde der
Blutglucosespiegel nach Verabreichung von Glucocorticoiden bei Pferden nicht überprüft.
Auch in den von ihnen durchgeführten Studien an Hunden und Rindern wurde dieser
blutchemische Parameter außer Acht gelassen. Eine Untersuchung der Blutglucosewerte
wurde in den Versuchen von ALLERSMEIER et al. (2005) durchgeführt. Jedoch konnte nach
dermaler Applikation von Dexamethason, und erwiesenen systemischen Effekten, keine
Erhöhung des physiologischen Blutglucosespiegels festgestellt werden. Bei anderen Tierarten
hat eine einmalige Verabreichung von Glucocorticoiden einen erwiesenen stärkeren Effekt
auf die Gluconeogenese im Vergleich zum Pferd. Bei Kühen kann schon die einmalige
Verabreichung eines Glucocorticoids und eine daraus resultierende Erhöhung des
Blutglucosespiegels einer Ketose vorbeugen, oder diese in anfänglichen Stadien therapieren
(KEGL, 1992). Auch BRAUN et al. (1970) beobachteten nach einer
Dexamethasonapplikation bei Kühen einen deutlichen Blutglucoseanstieg bei gleichzeitigem
Absinken von Ketonkörpern im Blut und Rückgang der Milchproduktion. Im Vergleich zu
anderen synthetischen Glucocorticoiden erwies sich Dexamethason in der damaligen Studie
als eines der potentesten Mittel.
5. Vergleichende Bewertung der erzielten Ergebnisse
Parallel zum Glucocorticoidplasmaanstieg zeigt sich die einsetzende Cortisolsuppression
(FICHTL et al., 2001). Die nach dieser These erwarteten erniedrigten Cortisolwerte nach
Erhöhung des Dexamethasonspiegels im Plasma konnten sowohl bei den mit Voren®
Suspension als auch bei den mit Voren®-Depot behandelten Tieren eindeutig gezeigt werden.
In den Abbildungen 32-43 im Anhang und in der Abbildung 29 in Kapitel V.3. sind die
Parameter der Dexamethasonkonzentration und der Cortisolkonzentration im Plasma für jedes
einzelne Pferd bzw. gemittelt graphisch gegenübergestellt.
Aufgrund der gezeigten sofort einsetzenden Cortisolsuppression nach einer
Glucocorticoidgabe, wurde die Korrelation zwischen der Plasmakonzentration an
Dexamethason und Cortisol genauer untersucht. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf
deren Verhältnis an den Zeitpunkten nahe der Quantifizierungs- und der Nachweisgrenze
gelegt.
Der untere Grenzwert des Cortisolreferenzbereiches war schon vor Erreichen des maximalen
Plasmadexamethasonwertes bei allen Pferden unterschritten. Nach dem erreichten
Maximalwert an Dexamethason prägte sich die Cortisolsuppression am deutlichsten aus.
Diskussion
114
Lediglich bei zwei Pferden der Voren®-Depot-Gruppe war der maximale Dexamethasonwert
erst spät, d.h. nach 312,25 bzw. 192,25 Stunden erreicht. Als Folge dieser relativ späten
Erhöhung der Plasmakonzentration an Dexamethason war bei Pferd 1 das Nicht-Wieder-
Einreihen des Cortisolwerts in den Referenzbereich zu sehen. Bei Pferd 2 konnten als Folge,
nach vorherigem Erreichen des Cortisolreferenzbereiches, nochmals erniedrigte Werte
gemessen werden. Bei diesen zwei Tieren schien ein direkter zeitlicher Zusammenhang
zwischen der Dexamethasonkonzentration und dem Cortisolspiegel zu bestehen. Dieser
zeitliche Zusammenhang konnte jedoch bei den wiederholt erniedrigten Cortisolwerten der
übrigen Pferde nicht gezeigt werden. Nach vorherigem Einreihen in den Referenzbereich
korrelierten die erneut erniedrigten Cortisolwerte dieser Pferde nicht mit zeitgleich erhöhten
Plasmakonzentrationen an Dexamethason. Die Plasmakonzentrationen an Dexamethason
waren zu diesen Zeitpunkten bereits unterhalb der Nachweisgrenze. Die gezeigte
Cortisolsuppression bzw. die weiter bestehende Wirkung des Glucocorticoids bei fehlender
Nachweisbarkeit von Dexamethason im Plasma kann durch die Persistenz von
Glucocorticoid-Rezeptor-Komplexen in den Kernen der Zielzellen erklärt werden
(GUSTAFSSON et al., 1987).
Eine vergleichende Betrachtung der Dexamethasonspiegel im Urin und der Cortisolwerte im
Plasma war nur bedingt möglich, da die Urinproben über einen deutlich längeren Zeitraum
entnommen und gemessen wurden als die Plasmaproben. Sowohl bei der Voren®
Suspension-Gruppe als auch bei der Voren®-Depot-Gruppe war der Schwellenwert an
Cortisol noch vor Erreichen des maximalen Dexamethasonwertes im Urin unterschritten. Der
maximal erniedrigte Plasmacortisolwert lag zeitlich gesehen auch in der Matrix Urin hinter
dem ermittelten Dexamethasonmaximalwert. Wiederholt erniedrigte Plasmacortisolspiegel
waren nicht mit nochmals signifikant erhöhten Dexamethasonkonzentrationen im Urin
deckungsgleich. Diese erniedrigten Cortisolspiegel traten zeitgleich mit Dexamethasonwerten
auf, die im Fall von Voren®-Depot nur knapp oberhalb der Quantifizierungsgrenze, im Fall
von Voren® Suspension sogar unterhalb der Nachweisgrenze lagen.
Zusammenfassend lässt sich somit, trotz des bestehenden funktionalen Zusammenhanges
zwischen Dexamethason und Cortisol, weder für die Matrix Blut noch für die Matrix Urin
eine direkte konzentrationsabhängige bzw. zeitliche Regelmäßigkeit ableiten.
Weiterhin konnte kein zeitlicher Zusammenhang bzw. eine direkte Korrelation zwischen den
an den jeweiligen Entnahmezeitpunkten ermittelten Dexamethasonwerten in Plasma und Urin
beobachtet werden. Eine sowohl zum gleichen Zeitpunkt auftretende als auch vergleichbar
Diskussion
115
stark ausgeprägte Konzentration eines Wirkstoffes in Plasma und Urin ist nach SAMS (1992)
auch nicht zu erwarten.
6. Bewertung der Ergebnisse bezüglich ihrer Dopingrelevanz
Glucocorticoide erlangen unter dem Gesichtspunkt „Doping zur Wiederherstellung der
normalen Leistungsfähigkeit“ oder als „unabsichtliches Doping“ ihre Bedeutung im
Pferdesport (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Insbesondere schmerzhafte und
entzündliche Prozesse des Bewegungsapparates können mit ihrer Hilfe maskiert werden.
Derzeit gilt jeder Nachweis einer verbotenen Substanz, bzw. in diesem Fall von
Glucocorticoiden, als positives Dopingergebnis gewertet („Null-Lösung“). Jeder oberhalb
einer festgesetzten Nachweisgrenze liegende Wert gilt als „Doping positiv“. Werte unterhalb
der Nachweisgrenze gelten als „Doping negativ“. Zu diesen über der Nachweis- oder der
Quantifizierungsgrenze von Dexamethason liegenden Werten sind auch die wiederholt
detektierbaren Signale nach vorherigem Unterschreiten dieser Grenzen zu zählen. Eine
erwiesenermaßen erhöhte Glucocorticoidkonzentration ist, auch Wochen nach der
Applikation und bei gleichzeitig fehlender Cortisolsuppression, als „Doping positiv“ zu
werten. Diese zurzeit gültige Regelung ist streng und schränkt, gerade bei Sportpferden, den
therapeutischen Einsatz speziell von Depot-Glucocorticoidpräparaten stark ein. Dies kann
einer therapeutisch indizierten Verabreichung eines solchen Präparates und einem
gewünschten Therapieerfolg entgegenstehen. Auch wird nicht berücksichtigt, dass die Menge
der vorliegenden Substanz bereits vollkommen wirkungslos sein kann, so dass das Pferd in
seiner Leistung nicht mehr beeinflusst wird. Die Notwendigkeit dieser strikten
Reglementierung zeigt sich jedoch darin, dass ein die Dopingprobe untersuchendes Labor
nicht unterscheiden kann, ob das Glucocorticoid erst vor kurzem verabreicht wurde, oder ob
es sich um eine eventuelle Restkonzentrationen eines Glucocorticoids nach einer länger
zurückliegenden Glucocorticoidtherapie handelt. Eine Entscheidung über den eventuell lang
oder kurz zurückliegenden Applikationszeitpunkt allein anhand der
Glucocorticoidkonzentration zu treffen, erweist sich folglich als nicht möglich. Erst anhand
einer Gegenüberstellung von Glucocorticoidkonzentration und Cortisolspiegel könnte der
Applikationszeitpunkt eingegrenzt werden.
Diskussion
116
Vergleichbar mit der festgesetzten Nachweisgrenze für synthetische Glucocorticoide gelten
auch für Cortisol Grenzwerte. UNGEMACH u. NÜRNBERGER (1999) stellen den
Grenzwert der Reiterlichen Vereinigung mit < 1 µg Cortisol /ml Urin und den des DIR mit
mindestens 20-30 ng Cortisol/ml Blut gegenüber. Letztgenannter Grenzwert wird in dieser
Arbeit als Vergleichswert herangezogen. Es handelt sich hierbei um einen Grenzwert, der
einen Mindestgehalt angibt, und nicht, wie bei Grenzwerten üblich, einen nicht zu
überschreitenden Höchstwert. Das Unterschreiten dieses Mindestgehaltes an Cortisol ist
demnach als Doping anzusehen. Um im Falle einer bestehenden Cortisolsuppression bei
gleichzeitig fehlender Glucocorticoidnachweisbarkeit über „Doping positiv“ oder „negativ“
zu entscheiden, wäre es vorab notwendig, einen einheitlichen und eventuell später national
bzw. international anerkannten unteren Schwellenwert für Cortisol zu definieren. Ein solcher
Schwellenwert müsste circadiane Rhythmik, Geschlechtsunterschiede, Belastung, Stress und
weitere den Cortisolspiegel beeinflussende Parameter berücksichtigen. Ansonsten wäre
BEYER (1998) zuzustimmen, die das routinemäßig durchgeführte Cortisolscreening in Harn
oder Blut und somit auch die dopingrelevante Aussage des Screeningtests aufgrund von
erheblichen individuellen Schwankungen in Frage stellt. Ein erniedrigter Cortisolspiegel
allein wäre demnach kein sicherer Hinweis auf das Vorhandensein von Glucocorticoiden im
Organismus.
Der vom DIR angegebene Mindestgehalt an Cortisol von 20-30 ng/ml Blut deckt sich mit den
Ergebnissen dieser Studie. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt und auch statistisch abgesichert
werden, dass ein Cortisolwert von 31,87 ng/ml Blut als signifikant erniedrigt anzusehen ist.
Die Festlegung der Untergrenze für den Blutcortisolspiegel nach Applikation von
Dexamethason bei mindestens 30 ng/ml erscheint somit realistisch und ist ein weiterhin noch
zu diskutierender und zu prüfender Vorschlag.
Für andere therapeutisch eingesetzte Glucocorticoide müsste ein solcher Schwellenwert
ebenfalls substanzbezogen festgelegt werden.
Aus den Ergebnissen dieser Studie zeigt sich weiterhin, dass nach der Applikation beider
Präparate die Nachweisgrenze für Dexamethason im Plasma unterschritten ist, noch bevor der
Plasmacortisolspiegel wieder im Referenzbereich liegt. Die Cortisolsuppression bzw. die
biologische Wirkung des Dexamethasons überdauert somit dessen Nachweisbarkeit im
Plasma. Betrachtet man nun die Matrix Urin, so ist das Ende der Plasmacortisolsuppression
im Fall von Voren® Suspension zeitgleich mit dem Unterschreiten der Nachweisgrenze für
Dexamethason im Urin erreicht. Im Fall von Voren®-Depot ist die Plasmacortisolsuppression
Diskussion
117
noch vor Erreichen der Quantifizierungsgrenze für Dexamethason im Urin beendet. Somit
wird deutlich, dass die Ergebnisse der Urinproben eine Aussage über einen längeren Zeitraum
ermöglichen als die Plasmaproben. In Bezug auf die Gruppe der Glucocorticoide, und speziell
Dexamethason, ist es, wie diese Studie zeigt, aufgrund der langen Nachweisbarkeit des
Glucocorticoids im Urin, in jedem Falle notwendig eine Urinprobe zu untersuchen. Dies
impliziert, dass, wie es in der Praxis bereits üblich ist, die Urinprobe die bevorzugte
Probenmatrix für Dopingkontrollen ist. Bei einem Verdacht auf Vorhandensein von
Glucocorticoiden sollte als Konsequenz somit immer eine Urinprobe entnommen werden,
unabhängig von einer gerade bei Urinproben aufwendigeren Entnahmeprozedur und dem
oftmals limitierenden Faktor Zeit. Auch die Entnahme einer Blutprobe ist bei einem Verdacht
hinsichtlich einer Anwendung von Glucocorticoiden ratsam, um den durch die
Glucocorticoidgabe eventuell beeinflussten Cortisolspiegel zu kontrollieren. Da ein
eventueller Verdacht nicht immer so explizit in Richtung eines Einsatzes von
Glucocorticoiden geäußert werden kann, muss überlegt werden, ob Dopingkontrollen im
Allgemeinen beide Matrices, d.h. Blut und Urin, standardmäßig mit einbeziehen sollten.
Für die Stoffklasse der Glucocorticoide ist es nicht möglich, mit Hilfe des von TOUTAIN u.
LASSOURD (2002) vorgestellten Modells eine Aussage über deren Dopingrelevanz zu
machen. So sollte in dieser Studie am Beispiel von Dexamethason versucht werden, den
Ansatz eines möglichen Lösungsmodells für die Gruppe der Glucocorticoide zu erarbeiten.
Dieser Lösungsvorschlag, der sich speziell mit der Problematik von unklaren und strittigen
Dopingfällen beschäftigt, soll somit versuchen, die bestehende Grauzone zwischen „Doping
positiven“ und „Doping negativen“ Fällen zu lichten. Ein solcher Ansatz könnte eine
Alternative zu den derzeit gültigen Dopingreglementierungen darstellen.
Die Parameter der Glucocorticoidkonzentration und des Cortisolspiegels werden bislang
getrennt betrachtet. TOUTAIN et al. (1984) gehen jedoch davon aus, dass eine klinische
Wirkung der Glucocorticoide zu erwarten ist, wenn die pharmakodynamische Wirkung
anhand der Cortisolsuppression belegt werden kann. Es kann auch bei einer fehlenden
Nachweisbarkeit der Substanz noch eine biologische Wirkung bestehen, was für die Gruppe
der Glucocorticoide charakteristisch ist (UNGEMACH, 2002). Auch erwähnen UNGEMACH
u. NÜRNBERGER (1999), dass der nach Applikation von Glucocorticoiden auftretende
Abfall der Blutcortisolkonzentration ein Hinweis auf eine unerlaubte Medikation sein kann.
Diskussion
118
Wie aus dem bisher gesagten deutlich wird, sollte neben der eigentlich interessierenden
Dexamethasonkonzentration der durch Glucocorticoide beeinflussbare Parameter des
Cortisolspiegels in die Entwicklung eines etwaigen Modells mit einbezogen werden.
Um eine zu prüfende und zu diskutierende Grundlage für die bei Dopingkontrollen ermittelten
Ergebnisdaten zu schaffen, müssen theoretisch mehrere Konstellationen eines Ergebnisses
beachtet werden (Tabelle 26):
Ergebnis-
Nr. Dexamethasonkonzentration Blutcortisolwert
I. Dexamethasonkonzentration in Plasma und Urin unter dem LOD
Blutcortisolwert im Referenzbereich
II. Dexamethasonkonzentration in Plasma und Urin unter dem LOD
Blutcortisolwert gleich dem Schwellenwert
III. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin gleich dem LOD
Blutcortisolwert im Referenzbereich
IV. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOD, aber unter dem LOQ
Blutcortisolwert im Referenzbereich
V. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOQ
Blutcortisolwert im Referenzbereich
VI. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOQ
Blutcortisolwert unter Schwellenwert
VII. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOD, aber unter dem LOQ
Blutcortisolwert unter Schwellenwert
VIII Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin gleich dem LOD
Blutcortisolwert unter Schwellenwert
IV. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin unter dem LOD
Blutcortisolwert unter Schwellenwert
Tabelle 26: theoretische Konstellationen an Ergebnissen von Dopingkontrollen
Die in Tabelle 26 zusammengestellten Konstellationen an Ergebnissen von Dopingkontrollen
wurden in dieser Studie exemplarisch ermittelt, in unterschiedliche „Dopinggrade“ (Grad 1
bis 5) zusammengefasst und im Folgenden hinsichtlich ihrer Dopingrelevanz beurteilt. Die
Zusammenstellung der Gradeinteilungen berücksichtigt speziell die Konstellationen von
Ergebnisdaten in unklaren oder zweifelhaften Dopingfällen. So wurden die unterschiedlichen
Stufen des Dopinggrades anhand des Auftretens von Dexamethasonkonzentrationen in Blut
und/oder Urin, anhand eventuellen zeitgleich veränderten Cortisolkonzentrationen, somit nach
der Ausprägung der pharmakodynamischen Wirkung, und anhand der Höhe der
Glucocorticoid- und der Cortisolkonzentrationen eingeteilt.
Unter paralleler Betrachtung eines bestehenden Cortisolschwellenwertes, dem Vorliegen von
sowohl Blut als auch Urin als zu untersuchende Matrices und dem Vorliegen von in
Diskussion
119
unterschiedliche Dopinggrade eingeteilten Ergebnissen kann ein mögliches Lösungsmodell
für die Gruppe der Glucocorticoide, am Beispiel von Dexamethason, formuliert werden:
• Unter „Dopinggrad 1“ fallen Dexamethasonkonzentrationen, die in Plasma und/oder
Urin über dem LOQ liegen, bei einem gleichzeitig innerhalb des Referenzbereiches
liegenden Blutcortisolwert. Der Dexamethasongehalt ist eindeutig zu quantifizieren.
Der Cortisolgehalt ist jedoch nicht erniedrigt. Es ist anzunehmen, dass die
Verabreichung des Glucocorticoids sehr kurzfristig vor dem Wettkampf stattfand, da
eine pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel noch nicht eingetreten ist.
Das Ergebnis der Dopingkontrolle ist in diesem Fall als „Doping positiv“ zu bewerten.
• „Dopinggrad 2“ beinhaltet Dexamethasonkonzentrationen in Plasma und/oder Urin,
die über dem LOQ liegen, bei einem gleichzeitig unter dem Schwellenwert liegenden
Blutcortisolwert. Der erhöhte Dexamethasongehalt ist eindeutig zu quantifizieren. Der
Cortisolgehalt ist erwiesenermaßen erniedrigt und die pharmakodynamische Wirkung
auf den Cortisolspiegel ist gezeigt. Die Verabreichung des Glucocorticoids scheint
wettkampfnah stattgefunden zu haben. Ein solcher Fall ist ebenfalls als „Doping
positiv“ einzustufen.
• „Dopinggrad 3“ umfasst zum einen Dexamethasonkonzentrationen, die im Plasma
unter dem LOQ, aber im Urin gleich oder über dem LOD bzw. LOQ liegen und mit
einem Blutcortisolwert unterhalb des Schwellenwertes vergesellschaftet sind, zum
anderen Dexamethasonkonzentrationen, die im Plasma unter dem LOD, aber im Urin
gleich oder über dem LOD bzw. LOQ liegen und gleichzeitig mit einem
Blutcortisolwert unterhalb des Schwellenwertes auftreten. Der Dexamethasongehalt
im Urin ist bei den beiden angeführten Ergebniskonstellationen eindeutig zu
quantifizieren. Jedoch ist im ersten Fall keine Quantifizierung bzw. im zweiten Fall
keine Nachweisbarkeit des Glucocorticoids im Blut mehr möglich. Der Cortisolgehalt
ist wiederum in beiden Fällen erwiesenermaßen erniedrigt und die
pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel ist gezeigt. Anzunehmend
kann von einer wettkampfnahen Verabreichung eines kurzwirksamen Glucocorticoids
oder einer wettkampffernen Verabreichung eines langwirksamen Glucocorticoids
(evtl. eines Glucocorticoidesters) ausgegangen werden. Beide Ergebniskonstellationen
sind als „Doping positiv“ zu bewerten.
Diskussion
120
• „Dopinggrad 4“ fasst Ergebnisse von Dopingkontrollen zusammen, bei denen sich die
Dexamethasonkonzentrationen im Plasma unter dem LOD, im Urin gleich oder über
dem LOD, aber unter dem LOQ bewegen, bei einem innerhalb des Referenzbereiches
liegenden Blutcortisolwert. In diesem Fall ist der Dexamethasongehalt weder im Blut
noch im Urin eindeutig zu quantifizieren. Es besteht keine Nachweisbarkeit des
Glucocorticoids mehr im Blut, jedoch im Urin. Der Cortisolgehalt ist nicht erniedrigt.
Es kann von einer wettkampffernen Verabreichung des Glucocorticoids ausgegangen
werden, da die pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel nicht mehr
gezeigt ist. Die fehlende Quantifizierbarkeit des Glucocorticoids im Urin, sowie eine
fehlende pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel schließen eine noch
bestehende Wirksamkeit des Glucocorticoids aus. Das beprobte Pferd sollte als
“Doping auffällig“ gelten, nach einer angenommen länger zurückliegenden Therapie
mit Glucocorticoiden.
• Unter „Dopinggrad 5“ sind Dexamethasonkonzentrationen einzustufen, die im Plasma
und Urin unter dem LOD liegen und gleichzeitig einen dem Schwellenwert
entsprechenden Blutcortisolwert aufweisen. Das Glucocorticoid Dexamethason ist
weder im Plasma noch im Urin nachzuweisen, so dass kein Verdacht hinsichtlich einer
Glucocorticoidapplikation geäußert werden kann. Der Cortisolwert ist zwar erniedrigt,
er liegt jedoch an der Untergrenze des festgelegten Referenzbereiches. Die
Erniedrigung des Cortisolwertes ist vermutlich durch circadiane Rhythmik,
Geschlechtsunterschiede, Belastung, Stress oder weitere den Cortisolspiegel
beeinflussende Parameter begründet. Ein solches Ergebnis einer Dopingprobe ist
demnach als „Doping negativ“ zu bewerten.
Die in dieser Studie erarbeiteten, und in dem dargestellten Lösungsmodell integrierten
Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen sind einerseits sehr genau und sensibel, so dass
schon kleinste Mengen an Dexamethason detektiert werden können. Andererseits limitieren
diese Grenzen, wie oben bereits erwähnt, den Einsatz von mit Glucocorticoiden behandelten
Pferden im Wettkampf. In diesem Zusammenhang kommt die Frage von Karenzzeiten und
Absetzfristen auf. Eine von CUNNINGHAM et al. (1996) festgelegte Karenzzeit, welche der
Zeit bis zum Unterschreiten der Quantifizierungsgrenze im Plasma entspricht, wird als sehr
unsicher beurteilt und als nicht ratsam betrachtet. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, reicht
Diskussion
121
diese Zeitspanne nicht aus, um das Glucocorticoid Dexamethason aus dem Organismus zu
eliminieren. Auch ist in der Studie von CUNNINGHAM et al. (1996) eine im Hinblick auf
eine interindividuelle Variabilität der Pferde als sinnvoll erachtete Sicherheitsspanne nicht mit
einkalkuliert. Eine solche Sicherheitsspanne sollte einen zeitlichen Rahmen setzten, innerhalb
dessen ein Wirkstoff bei jedem Pferd ausgeschieden bzw. wirkungslos ist.
Auch in dieser Studie ist eine Empfehlung für Karenzzeiten sowie für Absetzfristen aufgrund
der erwähnten interindividuellen Variabilität der Pferde kaum möglich. Aufgrund der
gezeigten interindividuellen Schwankungen der erreichten Dexamethasonkonzentrationen in
Blut und Urin, der unterschiedlichen Zeiten bis zum Erreichen der Quantifizierungs- und
Nachweisgrenze, der verschieden stark ausgeprägten Cortisolsuppression, der nur sehr
eingeschränkt möglichen pharmakokinetischen Berechnungen und natürlich auch aufgrund
der sehr geringen Anzahl an Versuchspferden können die Ergebnisse nicht auf die
Gesamtpopulation an Pferden übertragen werden. Eine definitive Aussage darüber, wie lange
die Substanz Dexamethason in der Spezies Pferd nachgewiesen werden kann, kann damit
nicht getroffen werden. Die ermittelten Ausscheidungszeiten bis zum Erreichen der
Nachweisgrenzen und die Dauer der Cortisolsuppression können als ein Anhaltspunkt, nicht
aber als eine verbindliche Aussage für den Einsatz von Voren® Suspension und Voren®-
Depot vor einem Turnier oder Wettkampf angesehen werden.
Als Alternative zu den nicht verbindlich zu ermittelnden Ausscheidungs- und Karenzzeiten
bietet das in dieser Arbeit entwickelte und oben vorgeschlagene Modell für den Wirkstoff
Dexamethason konkrete dopingrelevante Rahmenbedingungen. Um die Bedingungen eines
„Doping negativen“ Ergebnisses zu erfüllen, muss der Dexamethasongehalt unter der
Nachweisgrenze liegen, d.h. im Plasma unter 0,12 ng/ml, im Urin unter 0,67 ng/ml.
Gleichzeitig darf sich der Blutcortisolspiegel nicht unterhalb des Schwellenwertes von 30
ng/ml bewegen. Als „Doping positiv“ sind die folgenden Ergebnisse einzustufen. Eindeutig
„positiv“ sind zum einen Dexamethasonwerte, die in Plasma über 0,25 ng/ml und im Urin
über 1 ng/ml, d.h. über der Quantifizierungsgrenze liegen. Zum anderen Dexamethasonwerte
in Plasma und Urin, die unterhalb der Quantifizierungsgrenze liegen, aber die
Nachweisgrenze von 0,12 ng/ml bzw. 0,67 ng/ml überschreiten und mit einem Cortisolwert
von weniger als 30 ng/ml vergesellschaftet sind. Der Fall eines “Doping auffälligen“
Ergebnisses ist bei zwischen 0,67 ng/ml und 1 ng/ml liegenden Dexamethasonwerten im Urin
und einem Cortisolspiegel von über 30 ng/ml gegeben.
Diese Ergebnisse wurden anhand der intravenösen Applikation von Voren® Suspension und
der intramuskulären Applikation von Voren®-Depot erarbeitet, so dass weiterhin zu prüfen
Diskussion
122
bleibt, ob diese Angaben auf andere Dexamethasonpräparate und auf andere
Applikationsarten zu übertragen sind.
Zusammenfassung
123
VI. Zusammenfassung
Maren Milewski (2006)
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Dexamethason hinsichtlich der
Dopingrelevanz beim Pferd
Ziel der durchgeführten Arbeit war es, mittels einer pharmakologischen Studie an zwölf
Pferden und sich anschließender Analyse von Plasma- und Urinproben eine Aussage darüber
machen zu können, wie lange das Glucocorticoid Dexamethason nach einmaliger intravenöser
und einmaliger intramuskulärer Applikation von Dexamethason-21-isonicotinat nachgewiesen
und quantifiziert werden kann. Geeignete Analysemethoden für Plasma und Urin kombiniert
mit einer HPLC/MS/MS-Methode wurden im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln im Vorfeld entwickelt und validiert. Als interner Standard diente
Fluocortolon. Die Validierung beinhaltete die Parameter Selektivität, Linearität, Richtigkeit,
Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Quantifizierungsgrenze lag im Plasma bei 0,25
ng/ml und im Urin bei 1 ng/ml. Die Nachweisgrenze belief sich im Plasma auf 0,12 ng/ml, im
Urin auf 0,67 ng/ml.
In dieser Studie wurde Dexamethason-21-isonicotinat in Form von Voren® Suspension sechs
Pferden einmalig intravenös in einer Dosierung von 0,02 mg /kg Körpergewicht verabreicht,
weitere sechs Pferde wurden einmalig intramuskulär mit Dexamethason-21-isonicotinat in
Form von Voren®-Depot in einer Dosierung von 0,06 mg/kg Körpergewicht behandelt. Nach
Applikation von Voren® Suspension war die Nachweisgrenze im Plasma nach 72,25 Stunden
unterschritten, im Urin nach 144,5 Stunden. Die Nachweisgrenze wurde nach der Voren®-
Depot-Behandlung im Plasma nach 168,25 Stunden und im Urin nach 552 Stunden erreicht.
Neben der Bestimmung der Dexamethasonkonzentrationen in Plasma und Urin wurden
weiterhin die Cortisol- und die Glucosekonzentrationen im Plasma ermittelt, um den
Glucocorticoideinfluss auf diese Parameter beurteilen zu können. Eine signifikante Erhöhung
des Blutglucosespiegel der einzelnen Pferde konnte nicht gezeigt werden. Die
Cortisolsuppression hielt nach der intravenösen Verabreichung von Voren® Suspension im
Mittel über 6 Tage an, nach der Voren®-Depot-Applikation wurde ein gemittelter
suppressiver Effekt über 9 Tagen beobachtet. Die biologische Wirkung des Glucocorticoids
Zusammenfassung
124
Dexamethason wurde somit mit Hilfe der Cortisolkonzentration gezeigt. Die anhand der
Cortisolsuppression bemessene und angegebene Dauer der Dexamethasonwirkung kann
jedoch lediglich als ein Anhaltspunkt, nicht als Garantie, für den erneuten Einsatz eines mit
Dexamethsaon-21-isonicotinat behandelten Tieres in einem Wettkampf angesehen werden.
Pharmakokinetische Berechnungen bezüglich Halbwertszeit, Verteilungsvolumen und
Clearance konnten aufgrund der nur sehr niedrigen Plasmakonzentrationen an Dexamethason
nicht durchgeführt werden. Auch die pharmakokinetischen Berechnungen nach dem PK/PD-
Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) sind im Falle von Dexamethason bzw. von
Glucocorticoiden nicht möglich, da dieses Modell nur bei Stoffen Anwendung finden kann,
deren biologische Halbwertszeit der Eliminationshalbwertszeit entspricht.
Eine generelle und für den Einzelfall Sicherheit bietende Aussage bezüglich der
Ausscheidungszeit für Dexamethason war in dieser Studie aufgrund der eingeschränkten
Möglichkeit der pharmakokinetischen Berechnung, sowie aufgrund der begrenzten Tierzahl,
mit weiterhin interindividuellen Unterschieden, nicht möglich. Alternativ wurde anhand von
paralleler Betrachtung und Gegenüberstellung der ermittelten Dexamethasonkonzentrationen
in Plasma und Urin und des Cortisolspiegels versucht, einen Ansatz eines möglichen
Lösungsmodells für die Gruppe der Glucocorticoide zu erarbeiten.
Summary
125
VII. Summary
Maren Milewski (2006)
Pharmacokinetic investigation of the drug dexamethasone with respect to its relevance in
horse-doping
It was the objective of this survey to give a stated view about how long the glucocorticoid
dexamathasone can be detected and quantified after a single intravenous and a single
intramuscular administration of dexamethasone-21-isonicotinate. This could be achieved by
means of a pharmacological study on twelve horses and the following analysis of plasma and
urine samples. A suitable method for the analysis of plasma and urine combined with
measurement by HPLC/MS/MS was developed and validated at the institute of Biochemistry
at the Deutsche Sporthochschule in Cologne before. Fluocortolon was chosen as the internal
standard. The validation contained the criteria selectivity, linearity, accuracy, precision,
stability and recovery. The limit of quantification in plasma was fixed at 0,25 ng/ml and 1
ng/ml in urine. The limit of detection was fixed at 0,12 ng/ml in plasma and 0,67 ng/ml in
urine.
In the present study dexamethasone-21-isonicotinate, as Voren® Suspension, was
administered intravenously to six horses at a singular dosage rate of 0,02 mg/kg body weight,
dexamethasone-21-isonicotinate in form of Voren®-Depot was administered intramuscularly
to another six horses in a singular dosage of 0,06 mg/kg body weight. After the administration
of Voren® Suspension the limit of detection in plasma was reached after 72,25 hours and in
urine after 144,25 hours. The limit of detection after administration of Voren®-Depot was
reached in plasma after 168,25 hours and in urine after 552 hours. Besides qualifying the
concentration of dexamethasone in plasma and urine samples the concentration of
hydrocortisone and glucose in plasma was determined with the intention to evaluate the effect
of glucocorticoid on these parameters. A significant increase in blood glucose could not be
shown. The average duration of suppressive effect after the application of Voren® Suspension
longs for 6 days and after the application of Voren®-Depot for 9 days. The biological effect
of the glucocorticoid dexamethasone could therefore be shown. The duration of the
glucocorticoid effects calculated on the basis of the suppressive effect of hydrocortisone can
Summary
126
merely be regarded as an indication but not as an assurance for starting a horse in a
competition which was administrated with dexamethasone-21-isonicotinate.
Pharmacological calculations regarding plasma half-life-time, volume of distribution and
clearance could not be made because of very low concentrations of dexamethasone in plasma.
Furthermore it was not possible to make pharmacokinetic calculations with the
pharmacokinetic-pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) for the
drug dexamethasone. This model can only be used for drugs whose biological half-life-time is
in accordance with its half-life-time of elimination.
In this study a definite and in each particular case certainty providing statement concerning
the excretion times of dexamethasone could not be given because of the limited possibility of
pharmacological calculations and the too small number of probands with also interindividual
variability. As an alternative we tried to develop a basic model of resolution for the group of
glucocorticoids by parallel contemplation of the hydrocortisone level and the determined
concentrations of dexamethasone.
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Tabellenverzeichnis
146
IX. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: klinische Verdachtssymptome und mögliche Manipulation für Doping bei Pferden
(nach UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999)
Tabelle 2: Alter, Geschlecht und Rasse der Versuchspferde
Tabelle 3: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 1 und verabreichte Menge an Voren®
Suspension (Dosierung: 0,02 mg/kg Körpergewicht)
Tabelle 4: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 2 und verabreichte Menge an Voren®-
Depot (Dosierung: 0,06 mg/kg Körpergewicht)
Tabelle 5: Entnahmezeitpunkte von Blut– und Urinproben im Hauptversuch
Tabelle 6: verwendete Chemikalien
Tabelle 7: Gradientenbedingungen
Tabelle 8: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur
Bestimmung der Selektivität
Tabelle 9: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur
Bestimmung der Linearität
Tabelle 10: Dexamethasonkonzentrationen in den einzelnen Probenansätzen zur Bestimmung
der Stabilität
Tabelle 11: Nachweis- und Quantifizierungsgrenze für Dexamethason in Plasma und Urin
Tabelle 12: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit von
Dexamethason im Plasma
Tabellenverzeichnis
147
Tabelle 13: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit von
Dexamethason im Urin
Tabelle 14: Intraday Präzision und Interday Präzision im Plasma
Tabelle 15: Intraday Präzision und Interday Präzision im Urin
Tabelle 16: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Plasmaproben an Tag 0
Tabelle 17: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Plasmaproben an Tag 164
Tabelle 18: gemessene Mittelwerte, prozentuale Abweichung und Bewertung der Stabilität
von Dexamethason in den Plasmaproben
Tabelle 19: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Urinproben an Tag 0
Tabelle 20: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur
Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Urinproben an Tag 155
Tabelle 21: gemessene Mittelwerte, prozentuale Abweichung und Bewertung der Stabilität
von Dexamethason in den Urinproben
Tabelle 22: Wiederfindungsrate von Dexamethason in Plasma und Urin
Tabelle 23: Wiederfindungsrate von Fluocortolon in Plasma und Urin
Tabelle 24: Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von
Glucose nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden
Tabellenverzeichnis
148
Tabelle 25 : Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von
Glucose nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
bei sechs Pferden
Tabelle 26: theoretische Konstellationen an Ergebnissen von Dopingkontrollen
Tabelle 27: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 1 der Voren®
Suspension-Gruppe
Tabelle 28: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 2 der Voren®
Suspension-Gruppe
Tabelle 29: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 3 der Voren®
Suspension-Gruppe
Tabelle 30: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 4 der Voren®
Suspension-Gruppe
Tabelle 31: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 5 der Voren®
Suspension-Gruppe
Tabelle 32: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 6 der Voren®
Suspension-Gruppe
Tabelle 33: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 1 der Voren®-
Depot-Gruppe
Tabellenverzeichnis
149
Tabelle 34: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 2 der Voren®-
Depot-Gruppe
Tabelle 35: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 3 der Voren®-
Depot-Gruppe
Tabelle 36: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 4 der Voren®-
Depot-Gruppe
Tabelle 37: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 5 der Voren®-
Depot-Gruppe
Tabelle 38: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 6 der Voren®-
Depot-Gruppe
Tabelle 39: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 1 und 2 der Voren® Suspension-Gruppe
Tabelle 40: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 3 und 4 der Voren® Suspension-Gruppe
Tabelle 41: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 5 und 6 der Voren® Suspension-Gruppe
Tabelle 42: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 1 und 2 der Voren®-Depot-Gruppe
Tabelle 43: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 3 und 4 der Voren®-Depot-Gruppe
Tabellenverzeichnis
150
Tabelle 44: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 5 und 6 der Voren®-Depot-Gruppe
Abbildungsverzeichnis
151
X. Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Resorptionskinetik 0. Ordnung (links), Resorptionskinetik 1. Ordnung (rechts)
Abb. 2: Eliminationskinetik 0. Ordnung (links), Eliminationskinetik 1. Ordnung (rechts)
Abb. 3: schematische Darstellung einer intravasalen Applikation im Zwei-Kompartiment-
Modell
Abb. 4: Strukturformel Cortisol
Abb. 5: Strukturformel Dexamethason
Abb. 6: Strukturformel Dexamethason-21-isonicotinat
Abb. 7: Massenspektrum und Strukturformel von Dexamethason
Abb. 8: Massenspektrum und Strukturformel von Fluocortolon
Abb. 9: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer
Leerplasmaprobe (links) und einer mit 5 ng/ml Dexamethason dotierten Plasmaprobe (rechts)
zum Zeitpunkt der Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)
Abb. 10: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer Leerurinprobe
(links) und einer mit 50 ng/ml Dexamethason dotierten Urinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der
Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)
Abb. 11: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer mit 25 ng/ml
Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerplasmaprobe (links) und einer mit 10 ng/ml
Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerurinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der
Retention von Fluocortolon (7,06 Minuten)
Abbildungsverzeichnis
152
Abb. 12: Kalibrationskurve des unteren Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma
inklusive Geradengleichung und Korrelationskoeffizient
Abb. 13: Kalibrationskurve des oberen Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma
inklusive Geradengleichung und Korrelationskoeffizient
Abb. 14: Kalibrationskurve für Dexamethason im Urin inklusive Geradengleichung und
Korrelationskoeffizient
Abb. 15: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit von D5-
Androsteron-glucuronid im Urin ohne Hydrolyse (links) bzw. nach Hydrolyse (rechts) zum
Zeitpunkt der Retention von D5-Androsteron-glucuronid (8,9 Minuten)
Abb. 16: Plasmakonzentrationsverläufe (Werte unterhalb der Quantifizierungsgrenze sind
nicht zu exakt quantifizieren), Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von
Dexamethason bei sechs Pferden nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg
KGW Voren® Suspension
Abb. 17: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf vor (─♦─) und nach (··♦··) Erreichen der
Quanitfizierungsgrenze, Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden
Abb. 18: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf vor (─♦─) und nach (··♦··) Erreichen der
Quanitfizierungsgrenze, Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden in den ersten 80 Stunden nach der Behandlung
Abb. 19: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (··♦··), Quantifizierungsgrenze (——) und
Nachweisgrenze (−−) von Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von
0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden
Abb. 20: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (··♦··), Quantifizierungsgrenze (——) und
Nachweisgrenze (−−) von Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von
Abbildungsverzeichnis
153
0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 80 Stunden nach der
Behandlung
Abb. 21: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden
Abb. 22: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®
Suspension bei sechs Pferden in den ersten 200 Stunden nach der Behandlung
Abb. 23: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-
Depot bei sechs Pferden
Abb. 24: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von
Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-
Depot bei sechs Pferden in den ersten 200 Stunden nach der Behandlung
Abb. 25: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und untere Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Hydrocortisol nach einmaliger intravenöser Applikation von
0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden
Abb. 26: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und untere Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Hydrocortisol nach einmaliger intravenöser Applikation von
0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der
Behandlung
Abb. 27: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und unterer Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Cortisol nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06
mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden
Abb. 28: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und untere Grenze des 95%-
Perzentil-Intervalls (──) von Cortisol nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06
Abbildungsverzeichnis
154
mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der
Behandlung
Abb. 29: gemittelte Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─♦─) und Cortisol (---)
nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension (links)
bzw. nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
(rechts) bei jeweils sechs Pferden (x-Achse: Zeit [Stunden]; y-Achse (links): Konzentration
Cortisol [ng/ml]; y-Achse (rechts): Konzentration Dexamethason [ng/ml])
Abb. 30: Schema der Aufarbeitung von Plasmaproben von Pferden zur Bestimmung von
Dexamethason
Abb. 31: Schema der Aufarbeitung von Urinproben von Pferden zur Bestimmung von
Dexamethason
Abb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
1 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Abb. 33: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
2 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
3 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Abb. 35: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
4 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Abb. 36: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
5 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Abb. 37: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
6 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Abbildungsverzeichnis
155
Abb. 38: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
1 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Abb. 39: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
2 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Abb. 40: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
3 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Abb. 41: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
4 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Abb. 42: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
5 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Abb. 43: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
6 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Anhang
156
XI. Anhang
Probenvorbereitung
↓
2 ml Plasma im Reagenzglas
↓
+ 25 ng Fluocortolon (interner Standard)
(50 µl einer methanolischen Lösung, die 1 µg/ml Fluocortolon enthält)
↓
+ 100 µl wässrige K2CO3–Lösung (5 %) + 500 ml tertiär Butanol, 5 sec schütteln (Vortex)
↓
+ 8 ml tertiär Butylmethylether, 10 min schütteln ↓
Etherphase in ein neues Reagenzglas überführen, am Rotationsverdampfer zur Trockene einengen
↓
trockener Rückstand: + 2 ml MeOH, 5 sec schütteln (Vortex)
+ 100 µl Milli-Q-H2O, 5 sec schütteln (Vortex) + 5 ml n-Pentan 5 min schütteln
↓
n-Pentanphase verwerfen und methanolische Phase am Rotationsverdampfer zur Trockene einengen
in 100 µl MeOH anlösen und in HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführen
Abb. 30: Schema der Aufarbeitung von Plasmaproben von Pferden zur Bestimmung von
Dexamethason
Anhang
157
Probenvorbereitung
↓
5 ml Urin im Reagenzglas
↓
+ 25 ng Fluocortolon, 2500 ng D5-Androsteron-glucuronid /ml (interner Standard) (50 µl einer methanolischen Lösung, die 1 µg/ml Fluocortolon und 250 µg/ml D5-
Androsteron-glucuronid enthält)
↓
+ 1,5 ml Phosphat-Puffer (0,8 molar); bis ph 7 ↓
+ 70 µl ß-Glucoronidase von Escherichia coli ↓
Hydrolyse über Nacht (14 Stunden) bei 37 °C im Wasserbad ↓
+ ca. 1,5 g NaHCO3/K2CO3 (2:1; g: g)
30 sec schütteln (Vortex) ↓
+ 6 ml tertiär Butymethyllether, 15 min schütteln 10 min zentrifugieren bei 1800 rpm
↓
Etherphase in ein neues Reagenzglas überführen (Pasteurpipette), am Rotationsverdampfer zur Trockene
einengen ↓
in 100 µl MeOH anlösen und in HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführen (Pasteurpipette)
Abb. 31: Schema der Aufarbeitung von Urinproben von Pferden zur Bestimmung von
Dexamethason
Anhang
158
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 100 200 300 400Stunden
Kon
z. D
exam
etha
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[ng/
ml]
0,0
20,0
40,0
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80,0
100,0
120,0
Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
1 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 100 200 300 400Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
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Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 33: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
2 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Anhang
159
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 100 200 300 400Stunden
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z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
0,0
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60,0
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Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
3 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 100 200 300 400Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
0,0
20,0
40,0
60,0
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100,0
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Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 35: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
4 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Anhang
160
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0 100 200 300 400Stunden
Kon
z. D
exam
etha
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ml]
0,0
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60,0
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Kon
z. C
ortis
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g/m
l]
Abb. 36: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
5 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 100 200 300 400Stunden
Kon
z. D
exam
etha
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ml]
0,0
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g/m
l]
Abb. 37: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
6 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension
Anhang
161
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 100 200 300 400 500Stunden
Kon
z. D
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etha
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ml]
0,0
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60,0
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z. C
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g/m
l]
Abb. 38: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
1 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 100 200 300 400 500Stunden
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ml]
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g/m
l]
Abb. 39: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
2 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Anhang
162
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 100 200 300 400 500Stunden
Kon
z. D
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[ng/
ml]
0,0
20,0
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100,0
120,0
Kon
z. C
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g/m
l]
Abb. 40: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
3 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 100 200 300 400 500Stunden
Kon
z. D
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etha
son
[ng/
ml]
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
Kon
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g/m
l]
Abb. 41: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
4 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Anhang
163
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 100 200 300 400 500Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 42: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
5 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 100 200 300 400 500Stunden
Kon
z. D
exam
etha
son
[ng/
ml]
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
Kon
z. C
ortis
ol [n
g/m
l]
Abb. 43: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd
6 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot
Anhang
164
Proben-Nr.
Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 66,5 5,1 75 2 0,25 0,7 97,3 5,1 3 0,5 0,9 83,9 4,8 4 1,25 0,9 64,0 4,7 5 2,25 1,0 36,1 5,4 6 3 1,0 22,8 5,3 7 4 1,2 17,2 5,1 8 6 1,1 10,4 5,9 9 8 1,3 6,9 5,8 10 10 1,2 7,8 5,0 11 12,25 1,1 5,3 5,3 12 24,25 0,9 8,0 5,0 13 48,25 0,3 4,7 5,7 14 72,25 0,2 4,2 4,5 15 96,25 n.n. 2,9 4,6 16 120,25 n.n. 13,6 4,9 17 144,25 n.n. 69,1 4,6 18 168,25 n.n. 112,5 4,6 80 19 216,25 n.n. 60,3 4,5 20 264,25 n.n. 70,7 4,6 21 312,25 n.n. 40,5 4,9 22 360,25 n.n. 44,3 4,8 78
Tabelle 27: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 1 der Voren®
Suspension-Gruppe
Anhang
165
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 81,9 5,2 73 2 0,25 0,4 87,3 5,3 3 0,5 0,6 87,3 5,0 4 1,25 0,6 57,2 5,3 5 2,25 0,7 38,2 4,8 6 3 0,6 23,9 5,1 7 4 0,6 18,7 5,0 8 6 0,7 6,9 5,6 9 8 0,8 3,9 4,9 10 10 0,7 3,6 4,8 11 12,25 0,6 n.n. 4,6 12 24,25 0,5 n.n. 5,2 13 48,25 0,3 3,2 5,5 14 72,25 n.n. n.n. 5,2 15 96,25 n.n. 8,8 4,8 16 120,25 n.n. 28,5 4,8 17 144,25 n.n. 62,3 5,1 18 168,25 n.n. 79,4 5,0 83 19 216,25 n.n. 71,5 4,6 20 264,25 0,2 70,9 4,7 21 312,25 n.n. 88,7 5,7 22 360,25 n.n. 73,7 4,7 83
Tabelle 28: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 2 der Voren®
Suspension-Gruppe
Anhang
166
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 75,8 4,7 97 2 0,25 0,2 108,4 4,6 3 0,5 0,2 105,2 4,2 4 1,25 0,2 69,3 4,6 5 2,25 0,3 43,3 4,4 6 3 0,3 29,4 6,3 7 4 0,4 25,2 6,2 8 6 0,4 15,1 5,4 9 8 0,4 6,7 4,6 10 10 0,4 5,2 3,6 11 12,25 0,4 34,4 5,4 12 24,25 0,3 n.n. 5,3 13 48,25 n.n. n.n. 4,9 14 72,25 n.n. 14,2 5,1 15 96,25 n.n. 39,6 4,4 16 120,25 n.n. 52,9 5,3 17 144,25 n.n. 65,0 4,5 18 168,25 n.n. 27,6 4,8 99 19 216,25 n.n. 43,8 4,9 20 264,25 n.n. 48,7 5,3 21 312,25 n.n. 49,8 4,7 22 360,25 n.n. 35,2 4,9 100
Tabelle 29: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 3 der Voren®
Suspension-Gruppe
Anhang
167
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 52,7 5,3 85 2 0,25 0,2 69,9 5,6 3 0,5 0,3 73,4 5,3 4 1,25 0,4 44,4 5,2 5 2,25 0,4 25,1 5,4 6 3 0,4 9,5 5,1 7 4 0,5 7,7 5,5 8 6 0,4 n.n. 5,4 9 8 0,5 n.n. 5,6 10 10 0,5 n.n. 5,4 11 12,25 0,4 n.n. 4,9 12 24,25 1,1 n.n. 8,6 13 48,25 0,3 n.n. 5,1 14 72,25 n.n. n.n. 4,8 15 96,25 0,3 n.n. 4,7 16 120,25 n.n. 25,4 5,6 17 144,25 n.n. 51,7 4,7 18 168,25 0,2 55,3 4,9 100 19 216,25 n.n. 47,0 4,9 20 264,25 n.n. 57,2 4,7 21 312,25 n.n. 92,7 4,8 22 360,25 n.n. 74,6 4,8 72
Tabelle 30: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 4 der Voren®
Suspension-Gruppe
Anhang
168
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 35,2 4,5 64 2 0,25 0,3 42,4 5,8 3 0,5 0,6 70,7 5,6 4 1,25 0,5 54,1 4,2 5 2,25 0,8 31,1 4,5 6 3 1,0 22,4 4,6 7 4 0,7 11,8 4,5 8 6 0,4 4,9 5,2 9 8 0,7 n.n. 8,8 10 10 0,5 n.n. 6,9 11 12,25 0,3 n.n. 5,1 12 24,25 0,6 n.n. 4,9 13 48,25 0,3 n.n. 4,9 14 72,25 n.n. n.n. 4,8 15 96,25 n.n. 4,6 4,4 16 120,25 n.n. 28,7 4,6 17 144,25 n.n. 30,4 4,3 18 168,25 n.n. 33,6 4,4 67 19 216,25 n.n. 43,4 4,6 20 264,25 n.n. 48,0 4,8 21 312,25 n.n. 38,1 5,0 22 360,25 n.n. 27,9 4,7 59
Tabelle 31: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 5 der Voren®
Suspension-Gruppe
Anhang
169
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 52,0 4,7 69 2 0,25 0,4 48,7 4,7 3 0,5 0,6 44,6 4,8 4 1,25 0,6 28,5 4,5 5 2,25 0,6 17,5 4,7 6 3 0,7 18,8 4,9 7 4 0,8 12,0 4,5 8 6 0,8 9,0 4,8 9 8 0,6 4,8 6,7 10 10 0,5 3,8 7,5 11 12,25 0,6 3,9 4,8 12 24,25 0,5 4,0 4,8 13 48,25 0,2 3,6 5,4 14 72,25 n.n. 5,6 4,9 15 96,25 n.n. 9,1 4,7 16 120,25 n.n. 17,1 4,6 17 144,25 n.n. 50,2 4,7 18 168,25 n.n. 51,5 4,8 74 19 216,25 n.n. 66,4 4,5 20 264,25 n.n. 78,3 4,5 21 312,25 n.n. 47,8 5,2 22 360,25 n.n. 69,7 4,5 97
Tabelle 32: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 6 der Voren®
Suspension-Gruppe
Anhang
170
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 36,8 4,7 107 2 1 0,2 44,6 4,9 3 2,25 n.n. 25,0 4,5 4 3 n.n. 16,1 4,8 5 4 n.n. 14,7 4,8 6 6 n.n. 32,8 5,0 7 8 0,2 11,6 5,0 8 12,25 0,2 8,3 4,9 9 23,5 0,2 5,2 4,7 10 48,25 0,2 3,8 4,8 11 72,25 n.n. 3,9 4,5 12 96,25 n.n. 5,9 4,8 13 120,25 n.n. 13,2 5,1 14 144,25 n.n. 12,7 4,8 15 168,25 n.n. 28,1 4,4 16 192,25 n.n. 20,2 4,6 17 216,25 n.n. 24,6 4,4 94 18 240,25 n.n. n.g. 4,4 19 264,25 n.n. 35,2 5,2 20 312,25 1,0 31,2 4,6 21 360,25 n.n. 23,8 4,6 22 408,25 n.n. 24,4 4,7 23 456,25 n.n. 37,8 4,9 86
Tabelle 33: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 1 der Voren®-
Depot-Gruppe
Anhang
171
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 42,1 4,7 83 2 1 n.n. 61,3 4,3 3 2,25 n.n. 51,1 5,8 4 3 n.n. 59,3 5,8 5 4 0,2 62,6 5,8 6 6 0,2 17,9 5,9 7 8 0,2 6,6 3,8 8 12,25 0,2 1,1 2,8 9 23,5 0,2 6,6 4,6 10 48,25 0,2 5,1 5,1 11 72,25 n.n. 4,1 5,2 12 96,25 n.n. 3,6 5,1 13 120,25 n.n. 8,0 5,3 14 144,25 n.n. 13,9 5,5 15 168,25 n.n. 14,9 5,0 16 192,25 0,6 19,7 5,6 17 216,25 n.n. 31,5 5,1 66 18 240,25 n.n. n.g. 5,0 19 264,25 n.n. 33,0 5,9 20 312,25 n.n. 39,4 4,8 21 360,25 n.n. 34,9 4,9 22 408,25 n.n. 38,0 5,9 23 456,25 n.n. 61,7 5,3 97
Tabelle 34: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 2 der Voren®-
Depot-Gruppe
Anhang
172
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 44,8 4,9 48 2 1 0,2 64,1 4,7 3 2,25 0,2 45,0 4,8 4 3 n.n. 68,9 4,5 5 4 n.n. 48,4 5,0 6 6 0,2 25,9 4,5 7 8 0,2 32,1 4,5 8 12,25 0,2 9,1 3,8 9 23,5 0,2 19,1 4,7 10 48,25 0,2 9,5 5,6 11 72,25 0,2 4,5 5,3 12 96,25 n.n. 12,0 5,0 13 120,25 n.n. 19,5 5,2 14 144,25 n.n. 28,4 4,8 15 168,25 n.n. 39,7 5,1 16 192,25 n.n. 25,5 5,3 17 216,25 n.n. 38,7 4,5 62 18 240,25 n.n. n.g. 4,8 19 264,25 n.n. 36,3 4,4 20 312,25 n.n. 39,3 4,2 21 360,25 n.n. 52,1 4,3 22 408,25 n.n. 52,9 4,6 23 456,25 n.n. 60,1 5,1 76
Tabelle 35: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 3 der Voren®-
Depot-Gruppe
Anhang
173
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 87,6 4,9 86 2 1 n.n. 43,2 5,0 3 2,25 n.n. 51,3 4,7 4 3 n.n. 42,5 5,1 5 4 0,2 25,6 5,0 6 6 0,2 12,5 5,0 7 8 0,2 9,3 6,1 8 12,25 0,3 2,7 4,9 9 23,5 0,3 n.n. 5,0 10 48,25 0,2 n.n. 5,7 11 72,25 0,2 n.n. 5,3 12 96,25 0,2 n.n. 5,4 13 120,25 n.n. n.n. 5,5 14 144,25 0,2 n.n. 4,9 15 168,25 n.n. n.n. 5,2 16 192,25 n.n. n.n. 4,8 17 216,25 n.n. 3,7 4,9 86 18 240,25 n.n. n.g. 5,0 19 264,25 n.n. 4,6 5,7 20 312,25 n.n. 8,3 5,5 21 360,25 n.n. 7,6 5,7 22 408,25 n.n. 13,0 5,7 23 456,25 n.n. 26,0 5,3 86
Tabelle 36: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 4 der Voren®-
Depot-Gruppe
Anhang
174
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 83,9 4,9 86 2 1 0,2 83,6 4,9 3 2,25 0,3 91,0 4,7 4 3 0,3 73,5 5,4 5 4 0,2 53,9 5,4 6 6 0,2 52,3 5,0 7 8 0,2 23,6 6,3 8 12,25 0,2 30,1 5,1 9 23,5 0,2 15,2 5,8 10 48,25 n.n. 24,6 4,9 11 72,25 0,3 15,0 5,1 12 96,25 0,2 16,8 5,5 13 120,25 n.n. 27,5 5,0 14 144,25 0,2 36,8 4,8 15 168,25 0,2 27,8 5,2 16 192,25 n.n. 45,7 5,0 17 216,25 n.n. 68,3 4,9 84 18 240,25 n.n. n.g. 5,4 19 264,25 n.n. 38,1 5,9 20 312,25 n.n. 61,3 5,6 21 360,25 n.n. 47,3 5,4 22 408,25 n.n. 44,3 5,8 23 456,25 n.n. 83,6 5,6 71
Tabelle 37: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 5 der Voren®-
Depot-Gruppe
Anhang
175
Proben-
Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Plasma [ng/ml]
Cortisol- konzentration
im Plasma [ng/ml]
Glucose- konzentration
im Plasma [mmol/l]
Kreatinin- wert
im Plasma [µmol/l]
1 0 n.n. 63,3 4,9 71 2 1 n.n. 91,0 4,6 3 2,25 n.n. 53,1 5,7 4 3 n.n. 35,6 5,5 5 4 0,2 26,2 4,4 6 6 n.n. 38,1 4,6 7 8 0,2 17,3 6,6 8 12,25 0,3 8,9 5,8 9 23,5 0,2 2,9 6,7 10 48,25 0,2 3,6 4,8 11 72,25 n.n. 4,4 5,6 12 96,25 n.n. 5,2 6,6 13 120,25 n.n. 13,3 6,3 14 144,25 n.n. 10,1 4,8 15 168,25 n.n. 18,0 6,8 16 192,25 n.n. 32,5 5,0 17 216,25 n.n. 62,3 5,3 76 18 240,25 n.n. n.g. 5,6 19 264,25 n.n. 27,8 6,0 20 312,25 n.n. 56,9 5,5 21 360,25 n.n. 32,9 4,8 22 408,25 n.n. 18,2 6,3 23 456,25 n.n. 30,8 5,8 71
Tabelle 38: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 6 der Voren®-
Depot-Gruppe
Anhang
176
Pferd 1 Pferd 2
Proben-Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
Proben-Nr.
Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 1 1,0 2 1 4,6 3 2 10,6 3 2 22,8 4 5 6,4 4 5 30,3 5 7 43,8 5 7 40,5 6 12 45,2 6 12 50,3 7 24,5 2,3 7 24,5 8,2 8 36 8,4 8 36 10,4 9 48,5 3,0 9 48,5 5,0 10 72,5 2,2 10 72,5 4,8 11 96,5 0,8 11 96,5 2,0 12 120,5 1,0 12 120,5 1,0 13 144,5 n.n. 13 144,5 0,8 14 168,5 n.n. 14 168,5 n.n. 15 192,5 n.n. 15 192,5 n.n. 16 216,5 n.n. 16 216,5 0,8 17 240,5 n.n. 17 240,5 n.n. 18 264,5 n.n. 18 264,5 n.n. 19 312,5 n.n. 19 312,5 n.n. 20 384,5 n.n. 20 384,5 0,7 21 456,5 n.n. 21 456,5 0,9 22 528,5 n.n. 22 528,5 n.n.
Tabelle 39: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 1 und 2 der Voren® Suspension-Gruppe
Anhang
177
Pferd 3 Pferd 4
Proben-Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
Proben-Nr.
Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 1 2,4 2 1 5,8 3 2 10,2 3 2 12,4 4 5 15,2 4 5 24,1 5 7 26,0 5 7 32,7 6 12 16,8 6 12 40,7 7 24,5 10,7 7 24,5 10,4 8 36 5,1 8 36 6,7 9 48,5 4,2 9 48,5 5,8 10 72,5 1,2 10 72,5 2,4 11 96,5 1,0 11 96,5 1,1 12 120,5 n.n. 12 120,5 1,2 13 144,5 n.n. 13 144,5 n.n. 14 168,5 n.n. 14 168,5 n.n. 15 192,5 n.n. 15 192,5 n.n. 16 216,5 n.n. 16 216,5 n.n. 17 240,5 n.n. 17 240,5 n.n. 18 264,5 n.n. 18 264,5 n.n. 19 312,5 n.n. 19 312,5 n.n. 20 384,5 n.n. 20 384,5 n.n. 21 456,5 n.n. 21 456,5 n.n. 22 528,5 n.n. 22 528,5 n.n.
Tabelle 40: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 3 und 4 der Voren® Suspension-Gruppe
Anhang
178
Pferd 5 Pferd 6
Proben-Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
Proben-Nr.
Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 1 n.n. 2 1 16,0 3 2 6,8 3 2 36,6 4 5 7,0 4 5 33,9 5 7 11,8 5 7 6,6 6 12 65,4 6 12 16,6 7 24,5 22,7 7 24,5 14,7 8 36 9,8 8 36 5,7 9 48,5 6,9 9 48,5 2,5 10 72,5 3,4 10 72,5 4,9 11 96,5 1,1 11 96,5 1,1 12 120,5 n.n. 12 120,5 n.n. 13 144,5 n.n. 13 144,5 n.n. 14 168,5 n.n. 14 168,5 n.n. 15 192,5 n.n. 15 192,5 n.n. 16 216,5 n.n. 16 216,5 n.n. 17 240,5 n.n. 17 240,5 n.n. 18 264,5 n.n. 18 264,5 n.n. 19 312,5 n.n. 19 312,5 n.n. 20 384,5 n.n. 20 384,5 n.n. 21 456,5 n.n. 21 456,5 n.n. 22 528,5 n.n. 22 528,5 n.n.
Tabelle 41: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 5 und 6 der Voren® Suspension-Gruppe
Anhang
179
Pferd 1 Pferd 2
Proben-Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
Proben-Nr.
Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 2 2,0 2 2 n.n. 3 5 8,6 3 5 8,0 4 7 17,7 4 7 8,2 5 12 16,9 5 12 5,9 6 48 7,9 6 48 2,3 7 72 4,7 7 72 2,0 8 96 4,9 8 96 3,3 9 120 2,6 9 120 1,2 10 144 2,5 10 144 1,7 11 168 1,7 11 168 1,7 12 192 2,7 12 192 n.n. 13 216 2,3 13 216 1,8 14 240 2,6 14 240 2,7 15 288 n.n. 15 288 1,7 16 336 0,9 16 336 1,2 17 384 n.n. 17 384 1,0 18 432 1,6 18 432 1,4 19 480 1,4 19 480 0,9 20 552 n.n. 20 552 n.n. 21 624 n.n. 21 624 n.n. 22 696 n.n. 22 696 n.n. 23 768 n.n. 23 768 n.n. 23 840 n.n. 24 840 n.n. 25 912 n.n. 25 912 n.n.
Tabelle 42: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 1 und 2 der Voren®-Depot-Gruppe
Anhang
180
Pferd 3 Pferd 4
Proben-Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
Proben-Nr.
Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 2 n.n. 2 2 2,1 3 5 1,5 3 5 12,4 4 7 4,9 4 7 20,1 5 12 8,4 5 12 22,4 6 48 4,6 6 48 9,3 7 72 3,2 7 72 3,1 8 96 0,6 8 96 4,0 9 120 1,6 9 120 3,7 10 144 n.n. 10 144 2,4 11 168 n.n. 11 168 3,4 12 192 0,7 12 192 1,8 13 216 2,7 13 216 3,9 14 240 1,8 14 240 2,2 15 288 1,2 15 288 1,3 16 336 n.n. 16 336 n.n. 17 384 n.n. 17 384 1,0 18 432 1,4 18 432 0,9 19 480 1,1 19 480 0,8 20 552 n.n. 20 552 1,3 21 624 n.n. 21 624 n.n. 22 696 n.n. 22 696 n.n. 23 768 n.n. 23 768 n.n. 23 840 n.n. 24 840 n.n. 25 912 n.n. 25 912 n.n.
Tabelle 43: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 3 und 4 der Voren®-Depot-Gruppe
Anhang
181
Pferd 5 Pferd 6 Proben-Nr. Entnahme-
zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
Proben-Nr.
Entnahme- zeitpunkt (Stunden)
Dexamethason-konzentration
im Urin [ng/ml]
1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 2 1,4 2 2 0,8 3 5 2,9 3 5 4,3 4 7 1,8 4 7 3,6 5 12 7,3 5 12 7,1 6 48 0,5 6 48 2,7 7 72 1,8 7 72 2,9 8 96 n.n. 8 96 2,1 9 120 n.n. 9 120 1,3 10 144 2,0 10 144 0,9 11 168 0,9 11 168 1,5 12 192 n.n. 12 192 0,7 13 216 1,5 13 216 1,6 14 240 n.n. 14 240 1,0 15 288 n.n. 15 288 1,0 16 336 n.n. 16 336 n.n. 17 384 n.n. 17 384 1,2 18 432 n.n. 18 432 n.n. 19 480 n.n. 19 480 n.n. 20 552 n.n. 20 552 1,2 21 624 n.n. 21 624 n.n. 22 696 n.n. 22 696 n.n. 23 768 n.n. 23 768 n.n. 23 840 n.n. 24 840 n.n. 25 912 0,9 25 912 0,8
Tabelle 44: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte
Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 5 und 6 der Voren®-Depot-Gruppe
Danksagung
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann gilt mein ganz besonderer Dank für das Überlassen
dieses sehr interessanten und ausgesprochen aktuellen Themas. Dank auch für freundliche
und hilfreiche Unterstützung seinerseits zu jeder Zeit sowie für die Hilfestellung bei
Problemen und Fragen während der Anfertigung dieser Arbeit.
Einen weiteren Dank richte ich an die Reiterliche Vereinigung (FN) e.V. in Warendorf, vor
allem an Dr. Michael Düe, für die freundliche Unterstützung und Organisation.
Mein Dank gilt weiterhin Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorf der FAL Mariensee für die
freundliche Unterstützung und das großzügig gewährte Bereitstellen der Versuchspferde des
Instituts für Tierzucht.
Mein besonderer Dank gebührt Prof. Dr. W. Schänzer und insbesondere Dr. Marc Machnik
aus dem Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln für die umfassende und
stets freundliche Unterstützung bei der gesamten Laborarbeit sowie bei der Erarbeitung und
Entwicklung der Analysemethoden. An dieser Stelle ein ganz besonderer Dank speziell an
Michael Bredehöft für den arbeitstechnischen Grundstock der entwickelten Analysemethoden
durch kompetente, bereitwillige, sehr umfassende und immer geduldige Einarbeitung in
Labor, Datenverarbeitung und zusammen mit Sven Gudat für die Einarbeitung an der HPLC.
Des weiteren der Firma Boehringer Ingelheim ein herzliches Dankeschön, besonders Herrn
Dr. A. Fenner, für das Interesse an dieser Studie und die Bereitstellung der Medikamente.
Speziell bei Herrn Jonny Meier und auch bei Herrn Heinrich Waßmann möchte ich mich ganz
herzlich bedanken für Ihren immer sehr freundlichen, stets verlässlichen und zeitintensiven
Einsatz bei unserer praktischen Arbeit im Pferdestall. Ohne Ihre Hilfe wäre so einiges nicht
realisierbar gewesen. Meinen Dank hiermit auch den weiteren helfenden Händen in dieser
Versuchsphase.
Großer Dank auch an Herrn Dr. Frank Niedorf aus dem Institut für Pharmakologie,
Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover für seine Hilfe
Danksagung
im Rahmen der Methodenvalidierung. Danke auch an Dr. Michael Brown, Dr. Wolfgang
Bäumer und Herrn Hans-Herbert Bohr für ihre selbstverständliche Hilfe.
Auch ein Dankeschön an die Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover und die Klinik für kleine Klauentiere Klauentiere und forensische Medizin und
Ambulatorische Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover für die geleistete
Hilfe.
Danke auch an alle weiteren Mitarbeiter des Instituts für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln, die während der Laborarbeit nicht nur mit Rat und Tat zur Seite
standen, sondern die Monate in Köln zu einer schönen Zeit gemacht haben.
Bei meinen Mitdoktorandinnen Sophie und Simone bedanke ich mich für die tolle
Zusammenarbeit und die neben der Arbeit auch sehr schöne gemeinsame Zeit, an die ich mich
immer sehr gern erinnern werde.
Einen aber ganz besonderen Dank richte ich an meine Familie, besonders an meine Mutter,
ohne deren Unterstützung in vielerlei Hinsicht die Anfertigung dieser Arbeit nicht möglich
gewesen wäre.
Danke meiner Kölner Ersatzfamilie für all das, was das Ganze mehr zur „Familie“ als zum
„Ersatz“ gemacht hat.
Gebührender Dank an meinen Bruder, der mir bei computertechnischen Fragen rund um diese
Arbeit eine mehr als große Hilfe war.
Tausend Dank an Ina für die geduldige, rettende und meine „Computersünden“ ausgleichende
Hilfe beim Formatieren.
Lieben lieben Dank an Patricia für die große moralische und auch praktische Unterstützung,
samt investierter Zeit und positiv anregender Kritik.
Danke meinen Mitbewohnerinnen, Freunden und Bekannten, die mich in dieser Zeit begleitet
haben, für mich da waren und helfend zur Seite standen.