43

GRUNDLAGEN DER ENZYMKINETIK:

MICHAELIS-MENTEN-GLEICHUNG, HEMMTYPEN

A. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

Die katalytischen Eigenschaften eines Enzyms können durch verschiedene Faktoren

beeinflusst werden. Dazu gehören vor allem Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke des

Reaktionsmilieus. Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion ist in bestimmten

Grenzen auch von der Konzentration des Substrates [S] abhängig. In der Regel nimmt die

Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Substratkonzentration zu, bis bei hohen Konzentra-

tionen ein Sättigungswert (Maximalgeschwindigkeit Vmax) erreicht wird. Das Erreichen dieser

Maximalgeschwindigkeit ist ein wesentliches Charakteristikum enzymatisch katalysierter

Reaktionen. Im einfachsten Fall, in dem nur ein Substrat umgesetzt wird, lässt sich die

Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration mit Hilfe der von

Michaelis und Menten angegebenen Gleichung beschreiben:

Dabei bedeutet:

[S]: Substratkonzentration bei Beginn der Reaktion

V0: Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion bei der entsprechenden Substratkonzentration

[S]

t: Zeit

Vmax: Maximalgeschwindigkeit der Reaktion, die bei Substratsättigung erreicht wird

Beachte: Vmax ist proportional zur gesamten Enzymkonzentration [E]0: Vmax ~ [E]0

Km: Michaelis-Konstante; bei dieser Substratkonzentration läuft die Reaktion mit

halbmaximaler Geschwindigkeit ab. Oft ist die Michaelis-Konstante ein Maß für die

Affinität des Enzyms zum Substrat.

Die Ermittlung der Michaelis-Konstante hat eine große praktische Bedeutung für die

Beurteilung eines Enzyms und der Wirkungsweise von Enzyminhibitoren.

SK

SV

dt

d[S]v

m

max

0

44

Die Bestimmung der Maximalgeschwindigkeit spielt im klinisch-chemischen Labor eine große

Rolle. Da die Maximalgeschwindigkeit Vmax proportional zur Enzymkonzentration ist, lässt sich

aus der Maximalgeschwindigkeit die Enzymkonzentration (z.B. im Blut) ermitteln.

Die Michaelis-Konstante lässt sich graphisch ermitteln, wenn man die Anfangsgeschwindigkeit

der Reaktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen unter sonst identischen

Bedingungen misst und die Werte V0 gegen [S] aufträgt (Auftragung nach Michaelis und

Menten). Dabei ergibt sich eine Hyperbel, die bei hohen Substratkonzentrationen der

Maximalgeschwindigkeit Vmax zustrebt. Im Bereich hoher Substratkonzentrationen ist also die

Reaktionsgeschwindigkeit praktisch unabhängig von der Substratkonzentration, im Bereich

niedriger Substratkonzentrationen ist V0 dagegen stark von der Substratkonzentration

abhängig. Aus der Kurve lässt sich die halbmaximale Geschwindigkeit und die zugehörige

Substratkonzentration, die der Michaelis-Konstante des Enzyms entspricht, ablesen.

Diese Methode zur Bestimmung der Michaelis-Konstante ist jedoch verhältnismäßig ungenau,

da sich Vmax in den wenigsten Fällen eindeutig festlegen lässt. Die graphische Bestimmung

wird wesentlich vereinfacht durch eine Auftragung nach Lineweaver und Burk, der eine

einfache Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung zugrunde liegt:

Bei einer Auftragung von 1/V0 gegen 1/[S] erhält man eine Gerade, die die Y-Achse im Punkt

1/Vmax und die X-Achse im Punkt -1/Km schneidet. Aus diesen Schnittpunkten lassen sich

sowohl die Maximalgeschwindigkeit als auch die Michaelis-Konstante bestimmen.

Im normalen Stoffwechsel spielt die Hemmung enzymatischer Reaktionen - ebenso wie die

Aktivierung - eine bedeutende Rolle bei der Regulation von metabolischen Prozessen. Daneben

lassen sich in vielen Fällen Vergiftungserscheinungen oder auch die Wirkung bestimmter

Pharmaka auf eine Hemmung spezifischer enzymatischer Reaktionen zurückführen.

Grundsätzlich unterscheidet man bei der Hemmung von Enzymen zwischen irreversibler und

reversibler Hemmung. Im Gegensatz zur irreversiblen Hemmung kann bei der reversiblen

Hemmung der Inhibitor vom Enzym dissoziieren (z.B. durch Verdünnen).

2

Vv wenn KS max

0m

45

REVERSIBLE HEMMTYPEN:

Man unterscheidet drei Hemmtypen: kompetitive Hemmung, nichtkompetitive Hemmung und

unkompetitive Hemmung.

Bei der kompetitiven Hemmung wird der Inhibitor reversibel am aktiven Zentrum des Enzyms

gebunden und verhindert so die Bindung des Substrats. Durch erhöhte Substratkon-

zentrationen kann der Inhibitor jedoch verdrängt werden, so dass bei sehr hohen Substrat-

konzentrationen die Maximalgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion erreicht werden

kann. Die scheinbare Michaelis-Konstante des Enzyms nimmt dagegen in Anwesenheit des

kompetitiven Inhibitors zu. Die Auftragung der Kehrwerte der Geschwindigkeit (1/V0) gegen

die Kehrwerte der Substratkonzentration (1/[S]) nach Lineweaver und Burk ergibt eine

Gerade, die die Gerade der ungehemmten Reaktion auf der Y-Achse im Punkt 1/Vmax

schneidet. Aus dem Schnittpunkt mit der X-Achse lässt sich die scheinbare (oder auch

apparente) Michaelis-Konstante (Km app) der gehemmten Reaktion errechnen, die mit der

Inhibitor-Konstante Ki über folgende Formel verknüpft ist:

Dabei ist [I] die molare Konzentration des Inhibitors. Die Inhibitor-Konstante Ki ist ein Maß

für die Affinität zwischen Enzym und Inhibitor. Sie gibt diejenige Konzentration des Inhibitors

an, bei der die apparente Michaelis-Konstante der gehemmten Reaktion gerade doppelt so

groß ist wie die Michaelis-Konstante der ungehemmten Reaktion.

Bei der nichtkompetitiven Hemmung wird der Inhibitor nicht am aktiven Zentrum, sondern an

einer anderen Stelle des Enzymproteins gebunden. Dadurch wird die Aktivität des Enzyms

herabgesetzt oder vollständig unterdrückt. Da in diesem Fall der Inhibitor nicht durch das

Substrat vom Enzym verdrängt werden kann, wird selbst bei sehr hohen

Substratkonzentrationen die Maximalgeschwindigkeit des Enzyms nicht erreicht. Für den

speziellen Fall, dass die Michaelis-Konstante für das Substrat unverändert bleibt, ergibt sich

bei der Kehrwertauftragung nach Lineweaver und Burk bei der nichtkompetitiven Hemmung

eine Gerade, welche die X-Achse im gleichen Punkt schneidet wie die Gerade der

ungehemmten Reaktion. Die Maximalgeschwindigkeit der gehemmten Reaktion lässt sich aus

dem Schnittpunkt mit der Y-Achse bestimmen. Die Dissoziationskonstante des Enzym-

Inhibitor-Komplexes (Ki) berechnet man mit Hilfe der folgenden Formel:

Km

Ki

I1appm

K

Ki

I1

maxV

appV

46

Hierbei ist Vapp die in Anwesenheit des Inhibitors erhaltene Maximalgeschwindigkeit, [I] die

molare Konzentration des Inhibitors und Vmax die Maximalgeschwindigkeit der ungehemmten

Reaktion. Ki entspricht der Inhibitorkonzentration, bei der die Maximalgeschwindigkeit der

gehemmten Reaktion gerade halb so groß ist wie die Maximalgeschwindigkeit der nicht

gehemmten Reaktion.

Wird der Inhibitor nur von dem Enzym-Substrat-Komplex und nicht vom freien Enzym ge-

bunden, handelt es sich um eine unkompetitive Hemmung. Bei diesem Hemmtyp wird der

Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplex nicht oder nur verlangsamt zum Enzym-Produkt-Komplex

umgesetzt. In der Auftragung nach Lineweaver und Burk ergibt eine enzymatische Reaktion

in Gegenwart eines unkompetitiven Inhibitors eine Gerade, die parallel zur Geraden für die

ungehemmte Reaktion verläuft. Die Inhibitorkonstante lässt sich nach folgenden Formeln

ermitteln:

wobei Km app bzw. Vapp die in Anwesenheit des Inhibitors erhaltene Michaelis-Konstante und

Maximalgeschwindigkeit, [I] die molare Konzentration des Inhibitors und Km und Vmax die

entsprechenden Konstanten der ungehemmten Reaktion sind. Ein unkompetitiver Inhibitor

reduziert in gleichem Maße sowohl Vmax als auch Km einer enzymatischen Reaktion.

Häufig wird auch das Auftreten von gemischten Hemmtypen beobachtet, die sich nicht

eindeutig einer dieser drei Grundarten zuordnen lassen.

ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN:

Enzyme als Biokatalysatoren;

Substratspezifität, Klassifizierung der Enzyme;

Grundlagen der Messung einer Reaktionsgeschwindigkeit im optischen Test;

Michaelis-Menten-Gleichung;

Mechanismen der Hemmung von Enzymen;

Interpretation von Km, Vmax, Ki;

Medizinische Bedeutung der Enzyme.

iK

I1

maxV

appV

oder

iK

I1

mK

appmK

47

48

B. ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

1. BESTIMMUNG DER MICHAELIS-KONSTANTE DER LACTATDEHYDROGENASE AUS

KANINCHEN-SKELETTMUSKELN

Die Lactatdehydrogenase (L-Lactat: NAD Oxidoreductase, EC 1.1.1.27) (LDH) katalysiert den

letzten Schritt der anaeroben Glykolyse

LDH

CH3-CHOH-COO + NAD+ CH3-CO-COO + NADH + H+

L (+) Lactat Pyruvat

Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite der Lactatproduktion.

Die Gleichgewichtskonstante K(25°C) =

Unter den Reaktionsbedingungen in diesem Versuch liegt das gesamte Enzym in Form eines

LDH-NADH Komplexes vor. Die Michaelis-Konstante Km für Pyruvat beschreibt in diesem Falle

die Wechselwirkung zwischen Pyruvat und dem LDH-NADH Komplex.

Die Reaktionsgeschwindigkeit wird mit dem photometrischen Test nach Otto Warburg

gemessen, wobei der Unterschied im Absorptionsmaximum von NAD+ und NADH ausgenutzt

wird.

Nikotinamid-Adenin-Dinukleotide (NAD) sind als Coenzyme von Dehydrogenasen in der

Übertragung von Reduktionsequivalenten beteiligt. Dabei geht die oxidierte Form, NAD+, in

die reduzierte Form, NADH, über:

RH2 + NAD+ R + NADH + H+

Bei der Dehydrogenierung wird ein H-Hydridion (1 Proton + 2 Elektronen) auf die C4-Position des

Pyridinringes übertragen. Der zweite Substratwasserstoff wird als Proton H+ freigesetzt. Dieser

Prozess ist schematisch am Beispiel der LDH-Reaktion dargestellt:

12102,7

NADLactat

HNADHPyruvat

49

NADH besitzt neben dem Absorptionsmaximum bei 260 nm ein zusätzliches Maximum bei 340

nm, das der oxidierten Form, dem NAD+, fehlt.

In der Praxis wird die Messung statt bei 340 nm oft bei 366 nm durchgeführt, da Wolframdraht-

Glühlampen in diesem Bereich benutzt werden können.

Der Extinktionskoeffizient für NADH beträgt in Abhängigkeit von der Wellenlänge:

340 = 6,2 · 103 (ℓ · mol-1 · cm-1)

366 = 3,3 · 103 (ℓ · mol-1 · cm-1)

50

(Bei Verwendung von zur Berechnung ist neben der verwendeten Wellenlänge die Dimen-

sion von unbedingt zu berücksichtigen.)

HEMMUNG DER LACTATDEHYDROGENASE DURCH OXAMAT

In diesem Versuch wird die Hemmung des Lactatdehydrogenase-NADH – Komplexes durch

Oxamat untersucht. Substrat ist dabei Pyruvat.

Man kann aber auch NADH als Substrat der Lactatdehydrogenase betrachten. Entsprechend

könnte auch die Hemmung des Umsatzes von NADH durch Oxamat untersucht werden. Aus

rein praktischen Gründen ist dieses Experiment mit den im Praktikum zur Verfügung

stehenden Mitteln nicht möglich: Wegen der hohen Affinität von NADH, also dem niedrigen

Km-Wert für die Bindung von NADH an Lactatdehydrogenase, müssten die Messungen bei

NADH-Konzentrationen durchgeführt werden, die so niedrig sind, dass ein photometrische

Bestimmung nicht möglich ist. Bei geeigneter Versuchsanordnung (Messung der NADH-

Konzentrationen durch Fluoreszenz) würde sich herausstellen, dass Oxamat nur an den

Lactatdehydrogenase–NADH–Komplex, aber nicht an die Lactatdehydrogenase bindet.

Oxamat (Halbamid der Oxalsäure)

FRAGEN:

Vergleichen Sie die Struktur des Inhibitors Oxamat mit der Struktur der Substrate Pyruvat und

NADH

Welchen Hemmtyp erwarten Sie für die Hemmung der Lactatdehydrogenase durch Oxamat

a) bezüglich Pyruvat?

b) bezüglich NADH?

51

C. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

Mitbringliste: 30cm langes Lineal, Taschenrechner, Kittel

MESSUNG DER REAKTIONSGESCHWINDIGKEIT DER LDH-REAKTION IN ABHÄNGIGKEIT VON DER

PYRUVAT-KONZENTRATION

1. IN ABWESENHEIT VON OXAMAT

PIPETTIERPLAN A

Küvette Nr. 1 2 3 4 5

ml Na-Phosphat-Puffer

(Flasche)

(0,1 mol/ℓ, pH 7.4)

2,00 2,00 2,00 2,00 2,00

ml NADH

(gelbes Eppendorf-

Gefäß)

(5 mmol/ℓ)

0,15 0,15 0,15 0,15 0,15

ml Na-Pyruvat

(blaues Eppendorf-

Gefäß)

(10 mmol/ℓ)

0,02 0,05 0,10 0,20 0,40

ml H2O 0,81 0,78 0,73 0,63 0,43

START der Reaktion

ml LDH*

(rotes Eppendorf-Gefäß) 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02

Die Messung erfolgt gegen eine mit 3ml Wasser gefüllte Küvette.

Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm

verschließen) dreimal invertiert und die Anfangsextinktion (E0) wird gemessen. Nach 30 sec wird

überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer herausgenommen.

Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der Küvetteninhalt wird sofort mit

Parafilm verschlossen und durch dreimaliges Wenden der Küvette gemischt. Für einen Zeitraum

von 2 min wird in Abständen von 15 sec die Extinktion abgelesen.

52

2. IN ANWESENHEIT VON OXAMAT

PIPETTIERPLAN B

Küvette Nr. 6 7 8 9 10

ml Na-Phosphat-Puffer

(Flasche)

(0,1 mol/ℓ, pH 7.4)

2,00 2,00 2,00 2,00 2,00

ml NADH

(gelbes Eppendorf-Gefäß)

(5 mmol/ℓ)

0,15 0,15 0,15 0,15 0,15

ml Na-Pyruvat

(blaues Eppendorf-Gefäß)

(10 mmol/ℓ)

0,02 0,05 0,10 0,20 0,40

ml Oxamat

(grünes Eppendorf-Gefäß)

(1 mmol/ℓ)

0,24 0,24 0,24 0,24 0,24

ml H2O 0,57 0,54 0,49 0,39 0,19

START der Reaktion

ml LDH*

(rotes Eppendorf-Gefäß) 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02

Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm

verschließen) gründlich gemischt und die Anfangsextinktion (E0) gemessen. Nach 30 sec wird

überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer herausgenommen.

Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der Küvetteninhalt wird sofort mit

Parafilm verschlossen und durch dreimaliges Wenden der Küvette gemischt und in das

Photometer eingesetzt. Für einen Zeitraum von 2 min wird in Abständen von 15 sec die

Extinktion abgelesen.

53

MESSERGEBNISSE ZU PIPETTIERPLAN A

Zeit

Küvette

1

2

3

4

5

Vor Zugabe von LDH

0

30“

Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)

15“

30“

45“

1’

1’15“

1’30“

1’45“

2'

MESSERGEBNISSE ZU PIPETTIERPLAN B

Zeit

Küvette

6

7

8

9

10

Vor Zugabe von LDH

0

30“

Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)

15“

30“

45“

1’

1’15“

1’30“

1’45“

2'

54

D. AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Die Anfangsgeschwindigkeiten (NADH Verbrauch pro Zeiteinheit) werden mit Hilfe des

Lambert-Beer Gesetzes errechnet:

E = · c · d

E = ermittelte Extinktionsänderung

= molarer Extinktionskoeffizient von NADH bei 366 nm = 3,3·103 l · mol-1· cm-1

d = Schichtdicke, 1 cm

c = Änderung der NADH-Konzentration

Für die mit Hilfe des Steigungsdreiecks für ein Zeitintervall von t min ermittelte

Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, v0, ergibt sich dann:

Für t = 1 min folgt daraus:

1-min

1mol

Δt1033,3

ΔE

Δtdε

ΔE

Δt

Δc

0v

1min

1mlµmol0,30ΔE

0v

55

AUFGABEN:

1. Stellen Sie die Zeitverläufe der Extinktion der Versuche 3 und 8 jeweils in einem

Graphen dar.

2. Bestimmen Sie Extinktionsabnahme pro min ab dem Messpunkt 15sec.

3. Stellen Sie die Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeiten von den Substratkonzen-

trationen in An- und Abwesenheit des Inhibitors jeweils in einem Graphen nach

Michaelis-Menten (Anfangsgeschwindigkeit gegen Substratkonzentration) und

Lineweaver-Burk (1/Anfangsgeschwindigkeit gegen 1/Substratkonzentration) dar.

BESTIMMUNG DER SUBSTRATKONZENTRATIONEN [S] (PYRUVATKONZENTRATIONEN):

Die Konzentration der Na-Pyruvat-Lösung beträgt 10 mmol/ℓ (siehe Pipettierplan A und B).

Diese Na-Pyruvat-Lösung wird durch das Pipettieren um folgenden Faktor verdünnt:

Pyruvatlösung

Volumen des gesamten Küvetteninhaltes (=3 ml)

Folglich beträgt die Konzentration [S] der Na-Pyruvat-Lösung in den einzelnen Küvetten:

[𝑺]=Konzentration der Na-Pyruvatlösung Pyruvatlösung

Volumen des gesamten Küvetteninhaltes

=10 mmol/l∙Pyruvatlösung (ml)

3 ml

4. Ermitteln Sie für die ungehemmte und die gehemmte Reaktion jeweils Vmax, Km und Km app

5. Welcher Typ der Enzymhemmung durch Oxamat liegt vor?

6. Berechnen Sie mit Hilfe der im Text für den jeweiligen Hemmtyp angegebenen Formel

die Inhibitor-Konstante, Ki.

Bestimmung der Konzentrationen des Hemmstoffs Oxamat (l)

Die Konzentration der Oxamatlösung beträgt 1mmol/ℓ (siehe Pipettierplan B). Diese

Lösung wird durch das Pipettieren um folgenden Faktor verdünnt:

Oxamatlösung

Volumen des gesamten Küvetteninhaltes (=3 ml)

Folglich beträgt die Konzentration der Oxamatlösung in den einzelnen Küvetten:

Konzentration der Oxamatlösung Oxamatlösung

Volumen des gesamten Küvetteninhaltes

=1 mmol/𝓵 ∙Oxamatlösung (ml)

3 ml

56

TABELLE

Küvette Nr.

Extinktions-abnahme pro Minute 30“ – 1‘30“

min

E

Anfangs-geschwindigkeit

*30,0min

Ev

0

minml

µmol

0v

1

µmol

minml

Substratkon-zentration [S] (in der Küvette)

mmol/

][

1

S

mmol

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

* siehe Berechnung

57

BERECHNUNGEN

58

HÄUFIGSTE FEHLER BEIM EXPERIMENT UND SEINER AUSWERTUNG

1. EXPERIMENT

- Photometer nicht gemäß der Anleitung am Arbeitsplatz eingestellt

- Mangelhafte Pipettierung (Merke: Pipettenspitze soll bei Entnahme aus dem Vorrat und

beim Pipettieren in die Küvette schräg aufstehen. Pipetten senkrecht halten,

Küvetten schräg!

- Durchmischung des Küvetteninhalts vergessen

- Ungenaue Ablesung vom Photometer (zu früh oder zu spät)

2. AUSWERTUNG

- Messpunkte nicht vollständig, unklar oder falsch eingetragen

- Dimension nicht angegeben, Koordinatenbezeichnung in Abbildungen ungenügend.

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E. SCHLUSSFOLGERUNGEN