Date post: | 09-Aug-2019 |
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1
DNA- Rekombinationstechnik
Gentechnik
2
Verwendung von Plasmiden in der Gentechnik
Campbell 19.1
3
Transformation
(Plasmid)
Die wichtigsten Schritte bei der DNA-Klonierung
4
Durch Klonierung kann man DNA-Fragmente in reiner Form isolieren
Vektoren
DNA-Fragmente
Konstruktion rekombinanter Moleküle
Jede Kolonie enthält zahlreiche Kopien eineseinzigen rekombinantenDNA-Moleküls
5
Das Handwerkszeug der Molekularbiologen
•Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen)•Ligasen•DNA-Vektoren (leiten sich von Plasmiden ab)•Wirtsorganismen
6
Restriktionsendonukleasen: Enzyme, die DNA schneiden
Bakterien bekämpfen eindringende Viren (Fremd-DNA)mit Restriktionsendonukleasen
Purves et al. 16.1
7
Restriktionsendonukleasen erkennen bestimmte Abfolgen von Sequenzen auf der DNA-> Restriktionsschnittstellen
Enzym EcoRI (aus Escherichia coli Stamm R)
erkennt
5‘-GAATTC-3‘3‘-CTTAAG-5‘
Diese Sequenz ist ein Palindrom:
z. B. Otto oder Anna Wörter, die von vorn und hinten gelesen gleich lauten
und schneidet versetzt5‘-G3‘-CTTAA
AATTC-3‘G-5‘
Janning & Knust 19.2b
8
5‘-G3‘-CTTAA
AATTC-3‘G-5‘
EcoRI erzeugt kohäsive (klebrige, engl. sticky) Enden
Die kurzen einzelsträngigen Enden sind komplementär
PvuI aus (Proteus vulgaris) erzeugt glatte (engl. blunt) Enden
5‘-CGATCG-3‘3‘-GCTAGC-5‘
5‘-CGA TCG-3‘3‘-GTC AGC-5‘
9Janning & Knust 19.2
Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme
10
11
Die gleichen klebrigen Enden erzeugt von verschiedenen Restriktionsendonukleasen
Die Enden sind kompatibel !
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Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese
Sichtbarmachen der DNA Fragmente durchEthidiumbromid und UV-Licht
kürzere Fragmentewandern schneller alslängere
DNA negativ geladenwandert zum positiven Pol
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Die Erkennungssequenz von EcoRI GAATTC kommt statistischin einem prokaryotischen Genomca. alle 4000 Bp vor
Ein prokaryotisches Genom von 4.000.000 bp (4 Mbp) würde inca. 1000 Fragmente zerlegt werden
14Purves et al. 16.4
Analyse von DNA Fragmenten durch den Southern-BlotDenaturierung inEinzelstränge
15
stabile Hybride erlauben die Detektionkomplementärer Sequenzen
16
Autoradigram
17
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
ForensikGenetischer Fingerabdruck
18
Zerschneiden und Verknüpfen von DNA Molekülen
Purves et al. 16.4
19
Ligasen verknüpfen DNA Moleküle(DNA Replikation)
in der Gentechnologie T4 DNA-Ligase: Cofaktor ATP
aus dem Phagen T4glatte Enden + überhängende Enden : sehr ineffektiv
glatte Enden + glatte Enden : annehmbare Ausbeuten
zwei passende überhängende Enden: sehr effektiv
20
allgemeine Eigenschaften von Vektoren
- Befähigung zur autonomen Replikation (ori)
- relativ geringe Größe (< 10 kb) mit singulären Schnittstellen (Polylinker) in nicht essentiellen Bereichen
- hohe Kopienzahl
- selektionierbarer Marker (Antibiotika Resistenz)
Multiple Klonierungssetlle (Polylinker)
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Antibiotika
Stoffe die Mikroorganismen am Wachstum hindern (bakteriostatisch) oder abtöten (bakteriocid); z. Zt. mehr als 7000 bekannt
wichtige Klassen:
Penicilline (aus Pilzen): Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese (z.B. Ampicillin)
Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin (aus Bakterien) Hemmung der Proteinsynthese
Resistenzgene wirken verschiedenartig: z.B.
amp (β-Lactamase): Spaltung des Penicillin-Ringes
CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase)
tet: Hemmung der Aufnahme von Tetracyclin in Bakterien
22
Klonierung mit pBR322
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Plasmide mit dem lacZ‘ Gen
Plasmid University of California
α
α-Kompementation
PlasmidBakterielles DNA-Molekül
α-Fragment Rest der β-Galaktosidase
aktive β-Galaktosidase
lacZ mit Deletion
(inaktiv)(inaktiv)
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Blau-Weiß-Selektion in E. coli
Protein Synthese
DNA wird in multipleKlonierungsstellekloniert
Protein Synthese
β−Galaktosidase aktiv
β−Galaktosidase inaktiv
lacZ Gen mit Deletion
α-Fragmentkomplett
α-Fragmentdefekt
ΔM15
AS11-41 fehlenAS1-146
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H2O
ß1->4
Künstlicher InduktorKünstliches Substrat
Indigo-Farbstoff
lacZ
26
Blau-Weiß-Selektion in E. coli
27
Klonierung eines menschlichen Gens in ein bakterielles Plasmid
Campbell19.3
28
Wie findet man ein bestimmtes Gen?
29
Herstellung einer Gen-Bibliothek
Menschliches Genom3 200 000 000 bp3 200 Mbp
Plasmide können ca. 10 000 bpFremder DNA aufnehmen
mindestens 320.000 Klone!Tatsächlich > 500.000
Purves et al. 16.7
30
Problem: Introns
•Eukaryotsiche Gene sind sehr groß und durch Introns unterbrochen
•Prokaryotische Organismen haben keine Introns, können eukaryotsiche Gene nicht exprimieren
Lösung: cDNA = komplementäre DNA
Campbell 19.5
31
Poly(A)Schwanz
Isolierung vonmRNA durch Oligo(dT) Zellulose
Reverse Transkription der poly(A)mRNAdurch Reverse Transkriptase
Janning & Knust 19.8Purves et al. 16.8
mRNA
32
Identifizierung des Klons,der das gewünschte Gen trägtmit einer Koloniefilter-Hybridisierung
Campbell 19.6
33
Sequenzierung: Kettenabbruchverfahren nach Sanger
Autoradiogramm
Janning & Knust 19.16
34
Automatische DNA-Sequenzierung
4 Reaktionen mit Fluoreszenz-Markierung
Janning & Knust 19.16, verändert
4 Spuren auf dem Gel
Fluoreszenz-Markierung
Jeder Base ist ein Farbe zugeordnet
35
Die Polymerasekettenreaktion PCR: (engl. polymerase chain reaction)Jedes beliebige Molekül kann in vitro amplifiziert werden
Purves et al. 11.120
ca. 50 °C 72°C
94°C
94°C
94°C
72°C
ca. 50 °C
ca. 50 °C
36
Jeder PCR-Zyklus hat 3 Schritte:
Denatureierung der DNA (94°C)Hybridisierung der Primer (annealing 45-65°C)Synthese der neuen DNA-Stränge durch Taq-Polymerase (72°C)
Exponentieller Vorgang
1 Molekül DNA nach Zyklus 1: 2 Molekülenach Zyklus 2: 4nach Zyklus 3: 8nach Zyklus 4: 16nach Zyklus 5: 32nach Zyklus 6: 64nach Zyklus 7: 128nach Zyklus 8: 256nach Zyklus 9: 512nach Zyklus 10: 1024
Nach Zyklus 20:524288
Taq-Polymerase aus Thermus aquaticusaus heißen Quellen des Yellowstone-National-Park USA
37
Ein Expressionsvektor ermöglicht die Expression eines fremden Gens in E. coli
Purves et al 16.13
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Medizinisch wirksame Produkte in der Biotechnologie
Löst nach Herzinfarkten und Schlaganfällen Blutgerinnsel auf
Gewebeplasminogen-aktivator
Für Menschen mit DiabetesInsulin
Ersetzt das Hormon bei Menschen mit geringem Wuchs
Wachstumshormon
Ersetzt den fehlenden Blutgerinnungsfaktor bei Patienten mit Hämophilie A
Faktor VIII
AnwendungProdukt
39Purves et al.16.14
Synthese des TPA-Proteins(Gewebeplasminogenaktivator)in E. colizur Behandlung von Schlaganfallpatienten
40
Hey, this bug makes wine, beer and bread! Why work with anything else?
Saccharomyces cerevisiae
(Bäckerhefe)
Sprossung
Synthese von Proteinen in der Bäckerhefe
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Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)
Wichtigster „domestizierter“ Pilz (>6000 Jahre bekannt)Wein-, Back- oder BrauhefeSetzen in Abwesenheit von Sauerstoff Zucker zu Alkohohl (Ethanol) und CO2 um
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Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)
Wichtigster „domestizierter“ Pilz (>6000 Jahre bekannt)Wein-, Back- oder BrauhefeEinzelliger Eukaryot -> eukaryotische Genexpression!Kurze Generationszeit (ca. 2h) Kann sowohl als Haplont als auch als Diplont existieren
Vorteile
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Klonierung von Hefegenen durch Komplementation von E. coli -Mutanten
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Integrierendes Hefeplasmid
YIp
Selektierbarer Hefemarker (z.B. LEU2)
klonierte Region von Interesse
Selektierbarerbakterieller Marker(z. B. AmpR)
BakteriellerReplikationsursprung(„origin of replication“)
Yeast integrating plasmid
Kopiezahl: 1 bis wenige,nicht autonom replizierbar
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Gezielter Einbau von DNA mit Hilfe homologer Rekombination
46
Gen-Austausch durch homologe Rekombination
47
Das 2μm-Plasmid von S. cerevisiae
in fast allen S. cerevisiae Stämmen (im Kern)(cir+-Stämme, cir0-Stämme)biologische Funktion unbekannt6318 bp = 2 μm50-100 Kopien, 2-3 % der Gesamt-DNA4 ORFs
Replikationsursprung
48
Hefeplasmid
klonierte Region von Interessez.B. Gen des Menschen
Selektierbarerbakterieller Marker(z. B. AmpR)
Selektierbarer Hefemarker (z.B. LEU2)
2μm Plasmid DNAoder Replikationsursprungdes 2μm Plasmids
ReplikationsursprungS. cerevisiae
BakteriellerReplikationsursprung(„origin of replication“)
Kopiezahl: ca. 50 („multicopy“),autonom replizierbar
Schaukel-Vektor („Shuttle-Vector“) Vektor, der in verschiedenen Wirtssystemen vermehrt werden kann
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künstliches Hefechromosome (YAC)
YAC (Yeast artificial Chromosome )
Telomer TelomerSlektionsmarke
S.cKlonierte RegionCentromerARSSelektion
E.c
Kopiezahl: 1,autonom replizierbarKlonierung großer DNA Fragmente
Aufnahme von 50 kb bis zu 1000 kbReplikationsursprung
50
Arabidopsis thaliana = Ackerschmalwand
51
52
Protoplasten-Transformation
PEG; Ca2+ + DNA
Regeneration
53
Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens
Wurzelhalsgalle
54
Prinzip des Gentransfers von Agrobakterienin Pflanzenzellen
Seyffert Abb D-9
55
Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe des Ti-Plasmids
Janning & Knust 2004; 20.6
Ti-Plasmid
T-DNA (23 kb)
Ti (Tumor induzeirendes) PlasmidT (transferred) DNA
56
Druckkammer
Träger für Partikel
AuffanggitterDNA-beschichtetePartikel
Petrischale mit Pflanze
Biolistische Transformation von Pflanzen
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Transgener Goldreis enthält einen hohen Anteil an β−Carotin
Einbringung von drei artfremden Genen:zwei Gene der Osterglocke und eins von aus dem Bakterium Erwinia uredovora.Durch diese Veränderung kommt es zur Bildung von ß-Carotin (Provitamin A) im Endosperm der Reiskörner, die deshalb (gold-)gelb / orange gefärbt sind. Wird der Reis in Verbindung mit Fetten verspeist kann das Provitamin aufgenommen werden und wird dann im Körper zu Vitamin A umgewandelt.
Warum?Mittel gegen Vitamin A-Mangel(in Entwicklungsländern Asiens häufig Ursache für Erblindung)
Goldreis
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Viel Erfolg im weiteren Studium!!