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erg Differenzierung von
Mikroorganismen mitmolekularbiologischen Methoden
Karlsruher Futtermitteltag
am CVUA Karlsruhe, 22.07.14
Dr. Wolfgang Wagner, LTZ Augustenberg,Referat 24 SG Mikrobiologie und Molekularbiologie
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Zur Unterstützung mikrobiol. Analysen
Fusarium oxysporum?
Peronospora oder nicht?
Anwendung bei
morphologisch/biochemisch nichtweiter differenzierbaren Kriterien
konkreten Zusatzfragen (Toxingene,Verwandtschaftsgrad, etc.)
Als Ersatz für komplexe, nichtetablierte kulturelle Methoden
Artbestimmung entweder mikrobiologisch/biochemisch oder durch PCR.
Aber enthält diese Clostridienart auch dasgesuchte Toxingen?
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erg • Anwendungsbeispiele am LTZ
Keimbesatz von Erbsen und BohnenMilchsäurebakterien und ProbiotikaFusarienTilletiaClostridien
• Möglichkeiten der MolekularbiologieDatenbank-Recherche
• weiteres Anwendungsbeispiel am LTZIntestinale Enterokokken
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Erbsen und Bohnen ausLandessortenversuchenMikrobiologische Analysevon Proben unter-schiedlicher Sorten,Standorte, Böden,Anbauweisen (öko – konv.)
Erarbeitung v. Orientierungs-werten zur mikrobiologischenQualitätsbeurteilung vonFuttermitteln
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Bakterien in Futtererbsen,Artbestimmung von KolonienErwinia spp.
Bacillus spp.
Pantoea spp.
Enterobacter spp.
Bacillus spp.
durch DNA-Sequenzierung
oder biochemisch:
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MSB Milchsäurebakterien- Milchsäuregärung, Konservierung
von Silagen, Verbesserung vonFutteraufnahme u. Verdaulichkeit
- Futtermittelzusatzstoff gem. VO(EU) 1831/2003, Verwendung alsProbiotikum und Siliermittel
- Aktuell ca. 15 Arten, > 90 Stämmeim FutterzusatzstoffverzeichnisAnhang 1k gelistet
- LTZ kontrolliert Deklarationen,bislang meist nur mikrobiologisch
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Mikrobiologische Möglichkeiten:
Gesamtkeimzahl:2 x 1011 KBE/g
MSB
Artbestimmung
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Molekularbiologische Möglichkeiten
Teil-Quantifizierungeinzelner Arten odereinzelner Stämme
MSB
Identifizierung derdeklarierten Stämme
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MSBFall eines RP im Mai 2014: 2 flüssigeVormischungen mit mangelhafter Deklarationund Verdacht auf Falschdeklaration:
- Lactobacillus plantarum: Stamm-ID fehlt;deklariert aber nicht nachgewiesen
- Lactobacillus casei: Stamm-ID fehlt;deklariert und als Art nachgewiesen(16S-Sequenzierung)
- zusätzlich wurden Hefen der GattungenPichia und Candida (Lebensmittelverderber)nachgewiesen (26S/28S-Sequenzierung)
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MSB - Isolierung eines Stammes aus einer Probe
- DNA-Sequenzierung des recA-Gens einer isolierten Kolonie
- Sequenzunterschiede bei verschiedenen Stämmen sinderkennbar und können genutzt werden
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Neuzulassung nachVO (EU) 1831/2003,
z.B. BIO-SIL Fa. Pieper
MSB+Probiotika
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erg EU-Projekt zur Entwicklung u.
Validierung von Methoden zurQuantifiz. und Identifizierungvon zugelassenen Probiotika aufStammebene (2002)
Bacillus, Lactobacillus,Bifidobacterium, Pediococcus,Enterococcus, Hefen
Literaturmethoden +eigene Entwicklungen
Validierungen mit21 Laboren (kulturell),8 Labs (PCR), 1 Lab (PFGE1)
Grundlage für (zu) vieleEURL evaluation reports
1 Pulsfeldgelelektrophorese
MSB+Probiotika
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Simpson et al. 2002
MSB+Probiotika Probleme der PFGE- nur ein Labor wendet PFGE
an (EU-Projekt 2002 mit 57von >200 Stämmen)
- Methode basiert aufMustererkennung, die nichteindeutig und nicht leichtinterpretierbar ist
- Fragestellung ist zu selten
- Stämme sind geschützt undnicht als Referenzmaterial zubekommen, auch nicht füramtliche Labore
- dadurch Entwicklung vonAlternativmethoden langwierig
- Stämme müssen in Reinkulturvorliegen; nicht direkt aus derProbe analysierbar
- Keine Quantifizierung möglich
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Fus
Feldbürtige, phytopathogene Pilze anGetreide, Mais, Früchten, etc.
Mykotoxin-Bildner: Fumonisine, Zearalenonund Trichothecene wie DON, T2 + HT-2
Beeinträchtigung der Tiergesundheit durchSchädigung von inneren Organen,Immunsystem, Haut, Hormonsystem
Morphologische/MikrobiologischeFeindifferenzierung nur durch absoluteExperten möglich; Bestimmungsschlüssellückenhaft
Fusarien
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Fus Fusarienbefall?
Wieviel Körner befallen?
Welche Arten u. Toxine?
F. proliferatum
F. culmorum
F. tricinctumF. sporotrichioides
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Fus 11 Arten mit157 Stämmen
PCR-Direkt-nachweis inGetreide-proben
qualitativ
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Fus
SpezifischerPCR-Nachweisder 11 Fusarien-Arten am LTZ
Methodeausbaubar fürweitere Artennach Wunsch
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Assay auf Basis von 9 Fusarien-Artenund 33 anderen Pilzen entwickelt;für Direktnachweis und aus Gerste- u. Maisproben
+ gruppenspezifischer Nachweis von• Der Gattung Fusarium (ITS)• Trichothecen-bildende Fusarien (tri6)• Fumonisin-bildende Fusarien (fum1)
- kein Spezies-spezifischer Nachweis
- Quantifizierung muss optimiert werden
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Til Steinbrand(Tilletia)
Phytopathogene undMykotoxin-Bildner inGetreide und Gräsern:Trimethylamin hemmtWachstum, schädigt Nieren,führt zu Verwerfungen undMinderung der Milchleistung
Sensorische Minderung derFuttermittelqualität: Geruchnach Heringslake
Hohe Infektionsrate, z. B.durch Mähdrescher
Klassische Mikroskopie bzw.Filtration + Haemocytometersind aufwändig
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Til Steinbrand (Tilletia)
- Weizensteinbrand (Tilletia caries)oder Zwergsteinbrand(T. controversa)?
- Orientierungswerte fürVerwendbarkeit
Öko-Saatgut < 20 Sporen/KornFuttermittel 10.000 Sporen/Korn
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Til Tilletia-Artidentifizierung- PCR-RFLP1 am LTZ entwickelt
zur Differenzierung von T.controversa und T. caries
1 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismuseines 620bp-Amplifikats am DNA-AbschnittRPB2, das mit dem Enzym HinfI bei T.controversa in 2 und bei T. caries in 3Fragmente geschnitten wird.
Gattungsnachweis durch PCR-Amplifikation,Artdifferenzierung durch Fragmentmuster
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Til Tilletia-Quantifizierung- Projekt 2011-13 um Alternative für aufwändige
mikroskopische Filtrationsmethode (Saatgut) zuentwickeln
- Literaturmethode zur Quantifizierung (realtime PCR,McNeil, Plant Pathology 2004, 53, 741-750)weiterentwickelt, etabliert und validiert; hat 2013Filtrationsmethode ersetzt
Anzahl der Sporen/ Korn Tilletia spp.
Kulturart Anzahl derProben 0 unter20 zw. 20 und
100 über 100
Sommerweizen 2 1 1Triticale 10 4 6
Spelzweizen 32 15 (47%) 12 (38%) 5 (16%)Winterweizen 42 3 (7%) 23 (55%) 8 (19%) 8 (19%)
gesamt 86 23 (27%) 42 (49%) 13 (15%) 8 (9%)
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Clos
Foto: RP Tübingen
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Clos
Foto: RP Tübingen
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Clos Fall am RP Tübingen im Nov. 2013: CrossCompliance Kontrolle bei einem Milchviehhalter:
- Erhebliche Mängel bei Tierschutz,Futtermittelqualität und –sicherheit
- Minderung der Futtermittelqualität durchClostridien u. a. Mikroorganismen
- DNA-Sequenzierung von Stichproben-Kolonienergab die Futtermittelverderber Clostridiumglycolicum, C.septicum und C.tertium, sowie denGasbranderreger C. perfringens (Toxinbildner,nekrotische Enteritidis bei oraler Aufnahme vonWiederkäuern)
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Clos Fall am RP Freiburg im Herbst 2013: tote Mastbullen –Diagnose Clostridium chauvoei:
- Erreger des Rauschbrands bei Rindern, Schafen undZiegen: nicht ansteckende Tierseuche, verläuft akut, hoheMortalität (Gasödeme im Muskelgewebe); Infektion überFutteraufnahme
- ob nur Grundfutter des Betriebs oder auch Handelsfutterverseucht ist?
- rasche Untersuchung, um Versorgung des Tierbestands zusichern bzw. im Handel Gefahr im Verzug auszuschließen;Transport über CVUA-Kurier – vielen Dank!!!
- Etablierung einer spez. PCR aus der Literatur am LTZ(Mikrobio kurzfristig zu aufwändig); Absicherung durchdas NRL Rauschbrand in Jena (Außenstelle des Friedrich-Loeffler-Instituts)
- Erreger wurde nicht nachgewiesen; Beprobung zu spät?
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Clos Nachweis vonClostridium
perfringens undseinen Toxinen:
cpa, cpb, cpe,iA, etx
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erg • Anwendungsbeispiele am LTZ
Keimbesatz von Erbsen und BohnenMilchsäurebakterien und ProbiotikaFusarienTilletiaClostridien
• Möglichkeiten der MolekularbiologieDatenbank-Recherche
• weiteres Anwendungsbeispiel am LTZIntestinale Enterokokken
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Datenbank-RechercheFast unbegrenzte Möglichkeiten auf DNA-Informationen zurückzugreifen:
kostenfrei, durch immense Forschungstätigkeitauf allen Gebieten fast lückenlosdurch immer neue Methoden (z. B. NextGeneration Sequenzing) fast exponentiellanwachsender Datenberg(Vgl. API mit nur ca. 600 Arten)Vergleich eigener Daten mit Datenbanken zurIdentifizierung von DNA-Abschnitten von Arten,Stämmen, Toxingenen, etc.Entwicklung eigener PCR-Nachweise auf dieserDatengrundlage
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• NCBI Datenbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• Sequenzierte Genomehttp://www.genomenewsnetwork.org/resources/sequenced_genomes/genome_guide_p1.shtml
• Genom-Atlas http://www.cbs.dtu.dk/services/GenomeAtlas/
• GOLD http://genomesonline.org/
Datenbank-Recherche
Ein paar Beispiele:
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erg • Anwendungsbeispiele am LTZ
Keimbesatz von Erbsen und BohnenMilchsäurebakterien und ProbiotikaFusarienTilletiaClostridien
• Möglichkeiten der MolekularbiologieDatenbank-Recherche
• weiteres Anwendungsbeispiel am LTZIntestinale Enterokokken
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Kolonien auf Filter +Slanetz&Bartley-Agar
Kolonien nach Abklatschauf Galle-Äskulin-Agar
Intestinale EnterokokkenHygieneindikator in Badegewässer, Trinkwasser, etc. undGärresten; auch für Futtermittel denkbar
oft Antibiotika-resistent
ISO7899-2 u. a. mikrobiologische Nachweismethoden erfassenKrankheitserreger bis hin zu harmlosen Arten und Probiotika
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- Auf Basis einer EFSA-Stellungnahme (EFSA Journal2012;10(5):2682) wurden am LTZ PCR-Nachweiseetabliert, um die krankheitsauslösenden Gene IS16, espund hylEfm nachzuweisen
- Artbestimmung mit anderen PCR oder DNA-Sequenzierung
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !!!
S2-Labor LTZ Augustenberg nachexplodiertem Gärrest 2007
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