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maximal methodisch

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Durchflusszytometrie (2):

DNA-Gehalt- und Zellzyklusmessungen

Stephan LobitzKlinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK)

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Wofür braucht man das ?

Bestimmung des Chromosomensatzes einer (Misch-) Population (Euploidie, Aneuploide, Polyploidie)

Veränderungen im Zellzyklus, z.B. - Tumorzellen mit erhöhter Proliferationsrate- DNA-Reparaturerkrankungen, z.B. Fanconi- Anämie mit typischem G2-Arrest

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Zellzyklus

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DNA-Färbung: Grundprinzip

Der fluoreszierende FarbstoffPropidiumiodid interkaliert in DNA

In einem gewissen Bereich geschiehtdas stöchiometrisch

=> Je mehr DNA, desto mehr Fluoreszenz

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(Ein) Protokoll

Man nehme: 70 % Methanol (EISKALT!!!)RNAse-Stocklösung (1 mg/ml)Propidiumjodid-Stocklösung (1 mg/ml)PBS mit 2 % FKS1 diploider Standard als Kontrolle

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(Ein) Protokoll

Zellen pelletierenUnter starkem Vortexen mit eiskaltem

Methanol überschichten und 1 Stunde fixieren

Zweimal mit PBS/FKS waschen, zählen und 1 Mill. Zellen in ein FACS-Röhrchen geben

Erneut pelletieren

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(Ein) Protokoll

Pellet in 425 µl PBS resuspendieren50 µl RNAse (1 mg/ml) zugeben30 min bei 37°C im Dunkeln inkubieren25 µl Propidiumiodid (1 mg/ml) zugebenMessen

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(Ein) Protokoll

Beim Messen beachten:50.000 events registrierenFlow-Rate auf low stellenMax. 300 Zellen/Sekunde messenBeachten, dass DDM-Parameter

aktiviert sind (dazu später mehr...)

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Wie war das nochmal mit dem FACSen?

Laser

Partikel werden mit einem Laser beschossen

Was steck ich vorne rein? Was kommt hinten raus?

Partikeleigenschaften

Detektor

Das gängigste Durchflusszytometer ist der FACSCalibur von BD

Der Calibur hat zwei Laser

FL1

RoterRoterDioden-LaserDioden-Laser

~635 nm~635 nm

SSC

FL3

FL4

.BlauerBlauerArgon-LaserArgon-Laser

488 nm 488 nm

FL2

FlowCell

FSC

Der Calibur misst:

FL1

RoterRoterDioden-LaserDioden-Laser

~635 nm~635 nm

SSC

FL3

FL4

.BlauerBlauerArgon-LaserArgon-Laser

488 nm 488 nm

FL2

FlowCell

FSC

Partikelgröße (FSC)

Interne Partikel-komplexität (SSC)

FL-1

FL-2

FL-4

FL-3

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LaserLaser

LaserLaser

LaserLaser

Zeit

Spannung

Zeit

Spannung

Zeit

Spannung

Umwandlung des Lichtsignals in einen Spannungspuls am Detektor

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Ein Spannungspuls kann nach3 Kriterien ausgewertet werden

Zeit (µs)

Volt

Pulsfläche (A)

Puls

höhe (

H)

Pulsweite (W)

= Dauer

400

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Warum ist das SOOO wichtig ????

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Weil die Software routinemäßig nur die Pulshöhe aufzeichnet

Zeit (µs)

Volt

Pulsfläche (A)

Puls

höhe (

H)

Pulsweite (W)

400

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LaserLaser

LaserLaser

LaserLaser

Zeit

Spannung

Zeit

Spannung

Zeit

Spannung

Über Pulsweite und Fläche kann man aber Einzelzellen von Aggregaten unterscheiden...

LaserLaser

LaserLaser

LaserLaser

Zeit

Spannung

Zeit

Spannung

Zeit

Spannung

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... denn Einzelzellen und Dubletten unterscheiden sich in Pulsweite und -fläche

Pulsweite (W) Pulsweite (W)

Zeit (µs)

Volt

Pulsfläche (A)

Puls

höhe (

H)

0

- aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe

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Die Einzelzellbetrachtung ist bei Zellzyklusmessungen extrem relevant!!!

Faktor 2 Faktor 101-104

vs.

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Anders gesagt:

2 x G1 macht 1 x G2

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Zurück zum Problem: Die CellQuest-Software zeichnet routinemäßig nur die Höhe eines Pulses auf

Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter

DDM = doublet discrimination

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Es werden alle drei Parameter (Höhe, Weite, Fläche) aufgezeichnet - nicht nur die Höhe !!!

(Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)

25Zeit

Spannung

G2:1. Signal deutlich höherviel mehr Fläche

2. etwas größere Zellenetwas längere Dauer

Zeit

Spannung

G1:1. Signal deutlich niedrigerviel weniger Fläche

2. etwas kleinere Zellenetwas kürzere Dauer

Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal + größere Fläche

Jetzt wird‘s richtig tricky! Gut AUFPASSEN!!!!!

Die THEORIE:

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Zeit

Spannung

G2:1. Signal deutlich höherviel mehr Fläche2. etwas größere Zellenetwas längere Dauer

Zeit

Spannung

G1:1. Signal deutlich niedrigerviel weniger Fläche2. etwas kleinere Zellenetwas kürzere Dauer

Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal

Einzellzellen

FL-3-Weite

FL-3

-Flä

che

Weiter gut AUFPASSEN!!!!!

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Der Beweis, dass man die richtigen Zellen ausgewählt

hat...

FL3-Fläche

FL3-H

öhe

Linearer Zusammenhang zwischen Fläche und Höhe

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Einzelzell-diskriminierung Der erwähnte

lineare Zusammenhang

G1/G0

G2/M

Dazwischen: S-Phase

CV als Gütekriterium

Als besonderes Bonbon: Anfärbung der Mitose durch spezif. Anti-Histon-H3-Antikörper

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Auswertung der Daten I

Innerhalb von CellQuestVorteil: einfach und billigNachteil: S-Phase wird falsch niedrig bestimmt

(vgl. Dean PN, J Cell Biol. 1974 Feb;60(2):523-7)

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Auswertung der Daten II: Spezial-Software, z.B. ModFit

Wieder die Einzelzell-diskriminierung

G0/G1

G2/M S

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Ein Beispiel für Aneuploidie

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Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische MessungenVerwendung anderer Farbstoffe z.B. 7-AAD statt PI (teurer und

aufwändiger, aber schmaleres Emissionsspektrum), daher günstiger bei Benutzung weiterer Antikörper

Darstellung der S-Phase durch BrdU-Pulsbehandlung

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Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen

Anfärbung einer bestimmten Zellzyklusphase durch einen Antikörper (z.B. Mitose durch anti-Histon-H3)

Trennung von Tumor- und Normal-population durch tumorspezif. Antikörper (z.B. Zytokeratinantikörper beim Colon-Ca)

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Weitere Infos und Software-download

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Nächstes Thema:Stephanie Krämer, Tierärztin

(Nephrologisches Forschungslabor)

„Einführung in das tierexperimentelle Arbeiten und gesetzliche Grundlagen“

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