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maximal methodisch

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Durchflusszytometrie (2):

DNA-Gehalt- und Zellzyklusmessungen

Stephan LobitzKlinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK)

Wofür braucht man das ?

Bestimmung des Chromosomensatzes einer (Misch-) Population (Euploidie, Aneuploide, Polyploidie)

Veränderungen im Zellzyklus, z.B. - Tumorzellen mit erhöhter Proliferationsrate- DNA-Reparaturerkrankungen, z.B. Fanconi- Anämie mit typischem G2-Arrest

Zellzyklus

DNA-Färbung: Grundprinzip

Der fluoreszierende FarbstoffPropidiumiodid interkaliert in DNA

In einem gewissen Bereich geschiehtdas stöchiometrisch

=> Je mehr DNA, desto mehr Fluoreszenz

(Ein) Protokoll

Man nehme: 70 % Methanol (EISKALT!!!)RNAse-Stocklösung (1 mg/ml)Propidiumjodid-Stocklösung (1 mg/ml)PBS mit 2 % FKS1 diploider Standard als Kontrolle

(Ein) Protokoll

Zellen pelletierenUnter starkem Vortexen mit eiskaltem

Methanol überschichten und 1 Stunde fixieren

Zweimal mit PBS/FKS waschen, zählen und 1 Mill. Zellen in ein FACS-Röhrchen geben

Erneut pelletieren

(Ein) Protokoll

Pellet in 425 µl PBS resuspendieren50 µl RNAse (1 mg/ml) zugeben30 min bei 37°C im Dunkeln inkubieren25 µl Propidiumiodid (1 mg/ml) zugebenMessen

(Ein) Protokoll

Beim Messen beachten:50.000 events registrierenFlow-Rate auf low stellenMax. 300 Zellen/Sekunde messenBeachten, dass DDM-Parameter

aktiviert sind (dazu später mehr...)

Wie war das nochmal mit dem FACSen?

Partikel werden mit einem Laser beschossen

Was steck ich vorne rein? Was kommt hinten raus?

Partikeleigenschaften

Detektor

Das gängigste Durchflusszytometer ist der FACSCalibur von BD

Der Calibur hat zwei Laser

RoterRoterDioden-LaserDioden-Laser

~635 nm~635 nm

.BlauerBlauerArgon-LaserArgon-Laser

488 nm 488 nm

FlowCell

Der Calibur misst:

RoterRoterDioden-LaserDioden-Laser

~635 nm~635 nm

.BlauerBlauerArgon-LaserArgon-Laser

488 nm 488 nm

FlowCell

Partikelgröße (FSC)

Interne Partikel-komplexität (SSC)

LaserLaser

Spannung

Umwandlung des Lichtsignals in einen Spannungspuls am Detektor

Ein Spannungspuls kann nach3 Kriterien ausgewertet werden

Zeit (µs)

Pulsfläche (A)

höhe (

Pulsweite (W)

= Dauer

Warum ist das SOOO wichtig ????

Weil die Software routinemäßig nur die Pulshöhe aufzeichnet

Zeit (µs)

Pulsfläche (A)

höhe (

Pulsweite (W)

LaserLaser

Spannung

Über Pulsweite und Fläche kann man aber Einzelzellen von Aggregaten unterscheiden...

LaserLaser

Spannung

... denn Einzelzellen und Dubletten unterscheiden sich in Pulsweite und -fläche

Pulsweite (W) Pulsweite (W)

Zeit (µs)

Pulsfläche (A)

höhe (

- aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe

Die Einzelzellbetrachtung ist bei Zellzyklusmessungen extrem relevant!!!

Faktor 2 Faktor 101-104

Anders gesagt:

2 x G1 macht 1 x G2

Zurück zum Problem: Die CellQuest-Software zeichnet routinemäßig nur die Höhe eines Pulses auf

Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter

DDM = doublet discrimination

Es werden alle drei Parameter (Höhe, Weite, Fläche) aufgezeichnet - nicht nur die Höhe !!!

(Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)

25Zeit

Spannung

G2:1. Signal deutlich höherviel mehr Fläche

2. etwas größere Zellenetwas längere Dauer

Spannung

G1:1. Signal deutlich niedrigerviel weniger Fläche

2. etwas kleinere Zellenetwas kürzere Dauer

Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal + größere Fläche

Jetzt wird‘s richtig tricky! Gut AUFPASSEN!!!!!

Die THEORIE:

Spannung

G2:1. Signal deutlich höherviel mehr Fläche2. etwas größere Zellenetwas längere Dauer

Spannung

G1:1. Signal deutlich niedrigerviel weniger Fläche2. etwas kleinere Zellenetwas kürzere Dauer

Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal

Einzellzellen

FL-3-Weite

Weiter gut AUFPASSEN!!!!!

Der Beweis, dass man die richtigen Zellen ausgewählt

hat...

FL3-Fläche

Linearer Zusammenhang zwischen Fläche und Höhe

Einzelzell-diskriminierung Der erwähnte

lineare Zusammenhang

Dazwischen: S-Phase

CV als Gütekriterium

Als besonderes Bonbon: Anfärbung der Mitose durch spezif. Anti-Histon-H3-Antikörper

Auswertung der Daten I

Innerhalb von CellQuestVorteil: einfach und billigNachteil: S-Phase wird falsch niedrig bestimmt

(vgl. Dean PN, J Cell Biol. 1974 Feb;60(2):523-7)

Auswertung der Daten II: Spezial-Software, z.B. ModFit

Wieder die Einzelzell-diskriminierung

G2/M S

Ein Beispiel für Aneuploidie

Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische MessungenVerwendung anderer Farbstoffe z.B. 7-AAD statt PI (teurer und

aufwändiger, aber schmaleres Emissionsspektrum), daher günstiger bei Benutzung weiterer Antikörper

Darstellung der S-Phase durch BrdU-Pulsbehandlung

Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen

Anfärbung einer bestimmten Zellzyklusphase durch einen Antikörper (z.B. Mitose durch anti-Histon-H3)

Trennung von Tumor- und Normal-population durch tumorspezif. Antikörper (z.B. Zytokeratinantikörper beim Colon-Ca)

Weitere Infos und Software-download

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(Nephrologisches Forschungslabor)

„Einführung in das tierexperimentelle Arbeiten und gesetzliche Grundlagen“

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