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Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro
zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell
Inaugural-DissertationZur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Katrin Gohr
aus Bremen
Hannover 2003
2
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen
1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen
2. Gutachter: Prof. Dr. Christiane Kirchhoff
Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2003
Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (TO 114/5-3)
3
Abkürzungen
4
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis............................................................................................. 4
1 Einleitung.................................................................................................. 11
2 Literaturübersicht .................................................................................... 13
2.1 Besamung ........................................................................................................ 13
2.2 Spermatozoon................................................................................................... 14
2.2.1 Morphologie der Samenzelle ..................................................................... 14
2.2.2 Spermienkopf............................................................................................ 15
2.2.3 Spermienschwanz...................................................................................... 15
2.3 Spermatozoenreifung........................................................................................ 16
2.4 Kapazitation ..................................................................................................... 18
2.5 Akrosomreaktion .............................................................................................. 20
2.6 Seminalplasma.................................................................................................. 21
2.7 Spermientransport im weiblichen Genitaltrakt .................................................. 22
2.8 Funktionelles Spermienreservoir....................................................................... 24
2.9 Spermadhäsine.................................................................................................. 26
3 Material und Methoden ........................................................................... 29
3.1 Spermienaufbereitung....................................................................................... 29
3.1.1 Gewinnung der Ejakulate .......................................................................... 29
3.1.2 Konventionelle spermatologische Untersuchung ....................................... 29
3.1.3 Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll ............................................. 30
3.1.4 Darstellung der Membranintegrität durch Propidiumjodidfärbung............. 31
3.2 Biochemische Charakterisierung von Proteinen ................................................ 32
3.2.1 Auftrennen des Seminalplasmas mittels analytischer HPLC...................... 32
3.2.2 Herstellung von Spermienextrakten........................................................... 32
3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ..................................................... 33
Abkürzungen
5
3.2.4 Western Blot Analyse................................................................................ 34
3.2.5 Spezifischer Proteinnachweis durch Immunfärbung .................................. 35
3.2.6 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen ...................................... 36
3.2.7 Chemilumineszenzverfahren ..................................................................... 37
3.2.8 Auftrennen des Spermienextraktes mittels analytischer HPLC .................. 38
3.2.9 Massenspektrometrische Analyse .............................................................. 38
3.3 Durchflusszytometrie........................................................................................ 39
3.3.1 Etablierung des Messverfahrens ................................................................ 40
3.3.2 Bestimmung der optimalen Inkubationszeit bei der durchfluss-
zytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen............... 41
3.3.3 Bestimmung der optimalen Zuckerkonzentration bei der durchfluss-
zytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen............... 41
3.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchung der Veränderungen in der
Mannose/Galaktose Bindung unter Kapazitationsbedingungen.................. 42
3.4 Fluoreszenzmikroskopie ................................................................................... 44
3.5 Explant-Assay .................................................................................................. 45
3.5.1 Gewinnung der Explante ........................................................................... 45
3.5.2 Koinkubation der Explante mit den Spermatozoen .................................... 47
3.5.3 Videomikrographie der gebundenen Spermien am Explant ....................... 47
3.5.4 Berechnung des Bindungsindexes ............................................................. 48
3.5.5 Kompetitive Hemmungsversuche .............................................................. 49
4 Ergebnisse................................................................................................. 50
4.1 Isolierung der Seminalplasmaproteine .............................................................. 50
4.2 Nachweis von mannosebindenden Proteinen im Seminalplasma....................... 52
4.3 Nachweis von Spermadhäsinen im Spermienextrakt ......................................... 54
4.4 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen im Spermienextrakt .............. 55
4.5 Nachweis von AQN-1 im Spermienextrakt ....................................................... 57
4.6 Isolierung der Spermienextraktproteine ............................................................ 58
Abkürzungen
6
4.7 Nachweis mannosebindender Proteine an ejakulierten, Percoll gewaschenen
Spermien mittels durchflusszytometrischer Analyse ........................................ 60
4.8 Nachweis von mannosebindenden Strukturen auf der Spermienoberfläche ....... 63
4.9 Explant-Assay .................................................................................................. 64
4.9.1 Vergleich von AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay .............................. 65
4.9.2 Vergleich der inhibitorischen Wirkung von 2-Fukosyl-Laktose, ...................
3-Fukosyl-Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose
und β-Laktose im Explant-Assay............................................................... 66
5 Diskussion ................................................................................................. 68
5.1 Die Interaktion zwischen Spermium und Oviduktepithel ist ein
kohlenhydratvermittelter Prozess ..................................................................... 69
5.2 Die Rolle der Spermadhäsine............................................................................ 72
5.3 Nachweis von AQN-1 auf percollgewaschenen Spermien................................. 74
5.4 Kohlenhydratbindungsstellen des Spermatozoens während der Kapazitation .... 75
5.5 Abschlussbetrachtung ....................................................................................... 77
6 Zusammenfassung.................................................................................... 79
7 Summary................................................................................................... 82
8 Literaturverzeichnis ................................................................................. 85
9 Anhang.................................................................................................... 104
9.1 Rezeptverzeichnis............................................................................................104
9.1.1 Spermienextrakte......................................................................................106
9.1.2 Durchflusszytometrie ...............................................................................110
9.1.3 Fluoreszenzmikroskopie...........................................................................110
9.1.4 Explant-Assay ..........................................................................................111
10 Eidesstattliche Erklärung ...................................................................... 113
11 Danksagung ............................................................................................ 115
Abkürzungen
7
Abkürzungen
Abb. Abbildung
AQN porcines Spermadhäsin mit N-Terminus AQN
Aqua dest. Aqua destillata
AU Absorptions Unit
AWN porcines Spermadhäsin mit N-Terminus AWN
BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat
BI Bindungsindex
BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CO2 Kohlenstoffdioxid
Da Dalton
et al. et alii (und andere)
Explant Gewebestück, welches aus dem ursprünglichen Zellverband
entfernt wurde
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
HBS Hepes-Buffered-Saline
Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazinN-2-ethan
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
kDa Kilodalton
l Liter
LMW Low Molecular Weight
MaldiTof Matrix-assisted Laser-Desorption Ionisation Time-of-Flight
M Molar
Mio. Millionen
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
Abkürzungen
8
mM Millimolar
MS Massenspektrometrie
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
NaCl Natriumchlorid
NBT Nitroblau Tetrazoliumsalz
N-Glycan Über eine NH2-Gruppe an Glycoproteine gebundene
Zuckerseitenkette
nm Nanometer
O-Glycan Über eine OH-Gruppe an Glycoproteine gebundene
Zuckerseitenkette
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Phosphate-Buffered-
Saline)
pH Negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
PI Propidiumjodid
PSP Porcine Seminalplasmaproteine
PVDF Polyvinylidene Difluoride
SDS Sodium-Dodecyl-Sulfate
Tab. Tabelle
TBS Trisgepufferte Kochsalzlösung (Tris-Buffered-Saline)
TEMED N,N,N`N`- Tetramethylethylendiamin
TFA Trifluoressigsäure
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
v/v volume/volume (Volumen/Volumen)
w/v weight/volume (Gewicht/Volumen)
x g x-fache der Erdbeschleunigung
z.B. zum Beispiel
Abkürzungen
9
Materialien
Alle verwendeten Chemikalien stammen von Merck, Darmstadt, soweit nicht anders
angegeben ist. Die Rezepturen der verwendeten Pufferlösungen und Reagenzien sind
im Anhang (9) aufgeführt.
Die Begriffe Spermium und Spermatozoon werden synonym verwendet.
Abkürzungen
10
11
1 Einleitung
Die Interaktion zwischen den Gameten ist ein komplexer Vorgang, der in den letzten
Jahren zu einem wichtigen Gegenstand der reproduktionsmedizinischen Forschung
geworden ist. Um eine erfolgreiche Besamung und Zucht sicherzustellen, ist es
unablässig, dass befruchtungskompetente Gameten aufeinander treffen.
Da die Ovulation bei den Haussäugern erst gegen Ende der Brunst erfolgt, muß es
einen Mechanismus geben, der das Zusammentreffen von Spermium und Oozyte
optimiert. Der Eileiter des weiblichen Tieres birgt besondere Eigenschaften zur
Erhaltung der Fortpflanzung. Die meisten Säugetiere haben zu diesem Zweck im
Eileiter ein funktionelles Spermienreservoir ausgebildet, in welchem die Spermien
gelagert werden können. Während der Lagerung werden die Energiereserven der
Spermatozoen geschont und ihre Vitalität erhalten, um die Zeit bis zur Ovulation zu
überbrücken.
Zur Aufrechterhaltung einer vitalen Spermienpopulation dient in erster Linie der
kaudale Isthmus des Oviduktes. Das Spermienreservoir wird durch die Bindung der
Spermien an die zilientragenden Epithelzellen etabliert, gleichzeitig erfolgt durch
diesen Vorgang eine Selektion befruchtungskompetenter Spermien. Nachdem die
Bindung wieder gelöst ist, erreicht das Spermatozoon durch den Vorgang der
Kapazitation mit anschließender Akrosomreaktion seine vollständige
Befruchtungsfähigkeit. Im Verlauf der Kapazitation kommt es zu einer Veränderung
im Spermienmetabolismus, der zu Hyperaktivierung und durch damit verbundenen
größeren Energieverlust auch zu einer geringeren Lebenserwartung führt. Die Aufgabe
des Spermienreservoirs der Säugetiere liegt darin, diese komplizierten Vorgänge zu
modulieren und mit der Ovulation zu synchronisieren.
Durch vorangegangene Studien ist bekannt, dass die initiale Bindung von
Spermatozoen an den Eileiter ein Kohlenhydrat vermittelter Prozess ist, daher
kommen lektinähnliche Substanzen (Spermadhäsine) in Frage, die die Bindung
ermöglichen. Beim Schwein konnte bereits eine große Gruppe von
Einleitung
1212
kohlenhydratbindenden Proteinen charakterisiert werden, die als Kandidatenproteine
für die Bindung in Frage kommen.
Die Zellkontakte von Spermien und Epithelzellen können einerseits mit
standardisierten Zellkulturen, andererseits mit Explant-Bindungs-Assays untersucht
werden. Explante sind kleine Teile des Eileiterepithels, die aus dem Ovidukt frisch
geschlachteter Altsauen gewonnen werden. Durch die Art der Zellgewinnung sind die
Untersuchungen mit Hilfe des Explant-Bindungs-Assays sehr gut vergleichbar mit der
in vivo Situation.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Nachweis zu erbringen, ob Spermadhäsine bei
der Etablierung des Spermienreservoirs eine Rolle spielen. Durch Studien von
WAGNER et al. (2002) konnte bereits beim Schwein die Zuckerspezifität des
beteiligten Rezeptorsystems lokalisiert werden. Im Rahmen der vorliegenden
Untersuchungen sollte dieses detailiert charakterisiert werden. Die
kohlenhydratbindenden Strukturen der Spermienrezeptoren werden mit Hilfe von
Spermienextrakten, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie sowie mit dem
Explant-Bindungs-Assay untersucht.
Literaturübersicht
1313
2 Literaturübersicht
2.1 Besamung
Zur Sicherstellung einer erfolgreichen Zucht ist eine exakte Koordination von
Insemination und Ovulationszeitpunkt notwendig (FLOWERS u. ESBENSHADE
1993). Durch das angewendete Besamungsregime sollte sichergestellt sein, dass vor
der Ovulation eine ausreichende Menge von befruchtungsfähigen Spermatozoen im
Eileiter vorhanden ist (DZUIK u. POLGE 1965). Da Ovulationszeitpunkt und
Östrusdauer beim Schwein variabel sein können, gibt es oft nur retrospektiv
Anhaltspunkte hinsichtlich des Ovulationszeitpunktes. Beim Schwein wird der Beginn
der Rausche durch den Zeitpunkt definiert, an dem der Eberaufsprung durch die Sau
geduldet wird (WILLEMSE u. BOENDER 1967). Die Ovulation erfolgt bei den
meisten Sauen im letzten Drittel der Brunst (WEITZE et al. 1994). Daher sollte die
Östrusdauer einer Sau vor der Besamung bekannt sein, um einen geeigneten
Besamungszeitpunkt zu wählen. Die Ovulationsdauer beträgt 1-6 Stunden (SOEDE u.
KEMP 1993). Durch Ultraschalltechnik konnte bei neueren Untersuchungen der
Ovulationszeitpunkt exakt bestimmt werden und weitere Inseminations-
Ovulationsintervalle ausprobiert werden (WABERSKI et al. 1994; NISSEN et al.
1997). Durch diese Studien war es möglich, die Reproduktionsleistung in Hinsicht auf
den Besamungszeitpunkt zu bewerten. Bei der Durchführung einer Besamung vor der
Ovulation waren zu wenig befruchtungskompetente Spermien am Ort der Befruchtung.
Dies wurde durch eine verminderte Anzahl von akzessorischen Spermien an der Zona
pellucida nachgewiesen (SOEDE et al. 1995). Gleichzeitig war ein Anstieg von
unbefruchteten bzw. mangelhaft befruchteten Sauen zu verzeichnen.
Bei einer postovulatorischen Besamung sind zwar ausreichend befruchtungsfähige
Spermien am Ort der Befruchtung, allerdings sind hier Alterungsprozesse der Oozyten,
die bereits 8-12 Stunden nach der Ovulation beginnen, der Grund für eine reduzierte
Fertilisationsrate (HUNTER 1967, 1994; HUNTER u. DZUIK 1968).
Literaturübersicht
1414
Um Schwankungen in der Vorhersage des Ovulationszeitpunktes entgegenzuwirken,
wird die Besamungsfrequenz in praxi erhöht. Durch zweimalige Belegungen konnten
FLOWERS u. ALHUSEN (1992) deutlich bessere Konzeptionsraten und
Wurfgrößenerhöhungen feststellen als bei einmaligen Besamungen.
2.2 Spermatozoon
2.2.1 Morphologie der Samenzelle
Eberspermatozoen entsprechen im wesentlichen den Spermatozoen anderer
Säugetierarten (Abb.1). Die Samenzelle geht als Produkt der Gametogenese des
männlichen Tieres hervor. Das Spermium besteht aus Kopf, Hals und Schwanz, wobei
sich der Spermienschwanz in Mittel-, Haupt- und Endstück gliedert (SETCHEL 1982).
Die Gesamtlänge eines Spermiums liegt zwischen 50 und 70 µm.
Abb. 1: Schematische Darstellung (Querschnitt) der Ebersamenzelle
Literaturübersicht
1515
2.2.2 Spermienkopf
Der Spermatozoenkopf beinhaltet fast ausschließlich den Zellkern, der aus stark
kondensiertem Chromatin besteht, das die Desoxyribonucleinsäure als Träger der
genetischen Information enthält (MONESI 1976). Der Zellkern ist von der inneren und
äußeren Kernmembran umgeben und ist von ovaler bis rechteckiger, seitlich
abgeflachter Form. Der Kopf eines Eberspermatozoen ist 7-10 µm lang und 4-5 µm
breit (DÖCKE et al. 1982). Ungefähr 2/3 des Kopfes bestehen aus der Kopfkappe,
dem sogenannten Akrosom, das aus den Vesikeln des Golgikomplexes entsteht. Das
Akrosom beinhaltet hydrolytische Enzyme wie Akrosin und Hyaluronidase, die bei der
Interaktion mit der Eizelle freigesetzt werden und dadurch dem Spermium die
Penetration der Oozyte ermöglichen (YANAGIMACHI 1994). Das Halsstück des
Spermiums stellt eine bewegliche Verbindung zwischen Spermienkopf und
Spermienschwanz dar. Als Kontaktstelle gilt die Basalplatte, die zwischen der
Implantationsgrube des Kerns und dem proximalen Zentriol eine Verbindung herstellt.
Dieser als Gelenkkopf bezeichnete Bereich ist eine Prädilektionsstelle für Halsbrüche.
2.2.3 Spermienschwanz
Der Spermienschwanz wird in Mittel-, Haupt- und Endstück unterteilt und entspringt
als Achsenfaden am proximalen Zentriol des Spermienhalses. Der Achsenfaden besitzt
eine für Geißeln typische radialsymetrische Struktur, die aus zwei zentral
angeordneten Mikrotubuli, umgeben von neun Doppelmikrotubuli sowie neun
Außenfibrillen, besteht. Um die Energieversorgung des Spermiums sicherzustellen, ist
das Mittelstück von einer einlagigen, spiralförmig angeordneten Schicht
Mitochondrien umgeben. Den längsten Teil des Spermienschwanzes bildet das
Hauptstück, wobei die Dicke der Außenfibrillen nach distal abnimmt. Dieser Bereich
ist von der sogenannten Ringfaserscheide umgeben, die aus einer Schicht fibrillärer
Proteine besteht. Am Ende der Ringfaserscheide beginnt das Endstück, das weder
Mantelfasern noch eine Faserscheide besitzt und in dessen Verlauf der Achsenfaden
Literaturübersicht
1616
frei vom Plasmalemm umgeben ist (SETCHEL 1982). Alle Abschnitte eines
Spermatozoons sind von einer Plasmamembran umgeben, deren
Lipidzusammensetzung entsprechend der Funktion der einzelnen Spermatozoenareale
variiert.
2.3 Spermatozoenreifung
Die sich an die Spermatogenese anschließende posttestikuläre Spermienreifung ist für
die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen essentiell. Die posttestikuläre
Spermienreifung vollzieht sich während der Nebenhodenpassage und der Ejakulation.
Die aus dem Keimepithel des Hodens freigesetzten Spermien besitzen noch nicht die
Fähigkeit, sich aktiv fortzubewegen. Sie werden durch Kontraktionen der myoiden
Zellen der Lamina propria der Samenkanälchen zum Rete testis des Hodens
transportiert und gelangen von dort in den Nebenhoden. Der Nebenhoden wird in die
Bereiche Nebenhodenkopf, Nebenhodenkörper und Nebenhodenschwanz gegliedert.
Durch die Passage im Nebenhoden erfahren die Spermien einige physiologische,
morphologische und biochemische Veränderungen, die als Nebenhodenreifung
bezeichnet werden. Verbunden mit diesen Prozessen kommt es im Nebenhodenkörper
zum Erwerb der Motilität, während der Nebenhodenschwanz hauptsächlich als
Spermienspeicher genutzt wird.
Im Verlauf der Nebenhodenpassage kommt es zu einer biochemischen Veränderung an
der Oberfläche der Spermatozoen, die sowohl Kohlenhydrate und Proteine als auch in
die Membran integrierte Lipide betreffen (YANAGIMACHI 1994). Hier finden
Umbauprozesse der Plasmamembran statt, die durch Lokalisationsänderungen von
integralen oder peripheren Membranproteinen gekennzeichnet sind
(HAMMERSTEDT et al. 1982). Des weiteren werden Peptidstrukturen zum Teil
partiell durch den Einbau von epididymalen Proteinen ersetzt (OVERSTREET 1983,
DACHEUX et al. 1989).
Literaturübersicht
1717
Eine wichtige Rolle spielt das im Nebenhoden synthetisierte Cholesterin für den
Schutz der Spermatozoen vor mechanischer Schädigung. Cholesterin wird vom Epithel
des Nebenhodens sezerniert und in die Plasmamembran des Spermiums eingebaut
(SEKI et al. 1992). Die Negativladung der Spermienoberfläche steigt während des
Reifungsvorganges an; eine Hypothese beschreibt als Ursache die Übertragung von
Sialsäuren auf Glykokonjugate durch Sialyltransferasen, die ebenfalls Bestandteil der
Nebenhodenflüssigkeit sind (TULSANI et al. 1993; FLECHON 1979).
Nach der Passage durch den Nebenhoden besitzen die Spermatozoen die vollständige
Fähigkeit, an die Zona pellucida der Oozyte zu binden und sind in der Lage, sich
gerichtet vorwärts zu bewegen (COOPER 1996, KIRCHHOFF u. IVELL 1995). Die
Dauer der Reifung im Nebenhoden variiert beim Säuger zwischen zwei und elf Tagen
(JOHNSON und VARNER 1988).
Während der Ejakulation kommen die Spermatozoen mit den Sekreten der
akzessorischen Geschlechtsdrüsen in Berührung und verlieren vorübergehend ihre
Befruchtungsfähigkeit wieder. Dieser Vorgang dient dem Schutz des Spermiums vor
Degeneration, aber vor allem soll frühzeitige Kapazitation beziehungsweise das
Eintreten der Akrosomreaktion vermieden werden. Diese Schutzeinrichtung ist
insbesondere während der Ejakulation und der nachfolgenden Wanderung im
weiblichen Genital bis zum eigentlichen Ort der Befruchtung, dem Eileiter, notwendig
(TÖPFER-PETERSEN et al. 1996).
Literaturübersicht
1818
2.4 Kapazitation
Durch AUSTIN u. CHANG wurde 1952 erstmals die Bedeutung der Kapazitation
beschrieben. Mit Kapazitation ist eine physiologische und biochemische Veränderung
gemeint, die notwendig ist, um die Spermien auf die Befruchtung vorzubereiten bzw.
die Akrosomreaktion einzuleiten. Die Kapazitation kann als progressiver
Destabilisierungsprozess angesehen werden, der für die Akrosomreaktion essentiell ist
(YANAGIMACHI 1994).
Den Spermien sind so genannte Dekapazitationsfaktoren aufgelagert, die eine
vorzeitige Kapazitation verhindern sollen (SHIVAJI et al. 1990, YANAGIMACHI
1994). Die Stabilisierung der Spermatozoenmembran erfolgt über den Einbau von
Cholesterin, über Protein-Proteinwechselwirkungen wird dann eine Schutzschicht um
die empfindliche akrosomale Region des Spermienkopfes gebildet.
Biochemisch gesehen betreffen die Veränderungen während der Kapazitation im
wesentlichen die Membranen der Spermatozoen, sowie die intrazellulären
Ionenkonzentrationen (BEDFORD u. HOSKINS 1990). Durch die Entfernung der
Sialsäuren und der Sulfatreste aus der Plasmamembran durch Hydrolasen des
weiblichen Genitalsekretes nehmen die negativen Oberflächenladungen ab
(LANGLAIS et al. 1981). Aus der Plasmamembran wird zusätzlich Cholesterin
entfernt, das über verschiedene Lipoproteine reguliert wird.
Durch die erhöhte Membrandurchlässigkeit kommt es zu einem zweiphasigen
Calciuminflux. Hierbei ist die erste Phase mit dem Kapazitationsprozess eng
verbunden, während die zweite Phase durch einen massiven Anstieg der Calciumionen
den Beginn der Akrosomreaktion anzeigt (FRASER 1995). Durch die Aktivierung der
Calcium abhängigen Adenylatcyclase steigt der intrazelluläre cAMP-Spiegel,
Proteinkinase A wird aktiviert; die wiederum reguliert die Tyrosinkinaseaktivität
(VISCONTI et al. 1997; VISCONTI u. KOPF 1998). Eine kapazitationsabhängige
Tyrosinphosphorylierung wurde 1996 von TÖPFER-PETERSEN et al. beim Eber und
Bullen beobachtet. Durch den Anstieg des intrazellulären Calciums und cAMP sowie
Literaturübersicht
1919
durch die Destabilisierung der Spermatozoenmembran kommt es zu einer
Hyperaktivierung der Spermatozoen am Ende des Kapazitationsvorganges.
An welchem Ort im weiblichen Genitaltrakt die Kapazitation beginnt, ist
speziesabhängig. Bei Tierarten mit intrauteriner Ejakulatdeponierung erfolgt die
Kapazitation fast ausschließlich im unteren Isthmusabschnitt des Eileiters
(YANAGIMACHI 1994).
KAWAKAMI et al. (1998) konnten in einer Studie zeigen, dass die Kapazitation bei
Hundespermatozoen durch Eileiterflüssigkeit induzierbar ist. Durch verschiedene
Medien mit Zusätzen wie BSA, Hydrogencarbonat oder Calcium kann in vitro eine
Kapazitation herbeigeführt werden (VISCONTI et al. 1997). HARRISON (1996)
berichtete, dass die Kapazitation ein spezifischer, initiierbarer und kontrollierbarer
Prozeß ist, bei dem Hydrogencarbonat die entscheidende Rolle spielt.
Sind die Spermatozoen kapazitiert, ist ihre Membran instabil und ihre Lebensdauer
verringert (BEDFORD 1970), so dass davon ausgegangen werden kann, dass der
Prozeß der Kapazitation mit der Ovulation synchronisiert sein muß. Durch HUNTER
(1995) wurde beschrieben, dass der Ablauf der vollständigen Kapazitation nicht von
der Verweildauer der Spermien im unteren Isthmusabschnitt abhängt, sondern direkt
mit der Ovulation in Zusammenhang zu bringen ist.
Diese Vorgänge sind in ihrer Gesamtheit notwendig, damit das Spermatozoon später
die Akrosomreaktion durchführen und sich schließlich mit der Eizelle vereinigen kann.
Literaturübersicht
2020
2.5 Akrosomreaktion
Bei der Akrosomreaktion werden akrosomale Enzyme aktiviert und freigesetzt, die für
die Penetration der Zona pellucida benötigt werden. Bei dieser Reaktion fusioniert die
äußere akrosomale Membran mit der darüber liegenden Plasmamembran; dadurch
werden Kanäle im Akrosom gebildet und lytische Enzyme freigesetzt
(YANAGIMACHI 1994). Durch diese Enzyme kommt es zu einer partiellen
Hydrolyse der Zona pellucida, wodurch die Spermatozoen in der Lage sind, die
extrazelluläre Matrix zu penetrieren. Die Penetration ist die Voraussetzung für die
Fusion mit der Vitellinmembran der Oozyte.
Das zentrale Ereignis der Akrosomreaktion ist die Exozytose des Spermienakrosoms
die durch einen massiven Influx extrazellulärer Calciumionen entsteht (FLORMANN
et al. 1992; FRASER 1993). Dabei haben Untersuchungen von HARRISON et al.
(1993) bei Eberspermatozoen ergeben, dass durch die Anwesenheit von Bicarbonat die
intrazelluläre Calciumaufnahme erleichtert wird. Durch den Anstieg des
intrazellulären Calciumspiegels erhöht sich der pH-Wert intrazellulär, die negative
Ladung an der Spermienoberfläche vermindert sich, und durch diese Komponenten
wird die Plasmamembran der Spermatozoen direkt destabilisiert.
Literaturübersicht
2121
2.6 Seminalplasma
Direkt nach der Ejakulation verlieren Säugetierspermatozoen die bereits im
Nebenhoden erworbene Fähigkeit, eine Eizelle zu befruchten. Dieses Phänomen ist auf
den Einfluss des Seminalplasmas zurückzuführen. Als Seminalplasma wird das
sekretorische Produkt von Hoden und Nebenhoden sowie der verschiedenen
akzessorischen Organe (Ampulle, Samenblasendrüse, Prostata, Bulbourethraldrüse)
des männlichen Genitaltraktes bezeichnet. Die verschiedenen Drüsen beinhalten
sowohl vom Volumen als auch von der Zusammensetzung unterschiedliche
Komponenten, die jahreszeitlichen und auch individuellen Schwankungen unterliegen.
Die Befruchtungsfähigkeit geht vorübergehend verloren, weil die Inhaltsstoffe des
Seminalplasmas sich während der Ejakulation wie eine Schutzhülle um die
Spermatozoen legen und die Spermien vor Schädigungen, Umwelteinflüssen und
frühzeitiger Kapazitation schützen (SHIVAJI 1990).
Noch vor einigen Jahren waren Wissenschaftler der Meinung, dass diese Schutz- und
Nährfunktion (WILLIAMS-ASHMAN 1988) die einzige Aufgabe des Seminalplasmas
sei. Inzwischen ist die Zusammensetzung des flüssigen, spermienfreien Anteils des
Ejakulates besser untersucht, und es sind diverse neue Erkenntnisse gewonnen worden.
Das Seminalplasma enthält niedermolekulare organische Substanzen wie freie
Aminosäuren, Monosaccharide, Prostaglandine, Polyamine, Lipide, Steroidhormone
und Proteine (MANN und LUTWACK-MANN 1981). Weiterhin sind eine Reihe von
verschiedenen Ionen wie Na+, K+, H+, Mg2+, Cl- und Ca2+ gefunden worden (HAFEZ
1993; FRASER 1995). Der pH-Wert des Seminalplasmas liegt im basischen Bereich
zwischen 7,2 und 7,8, um das saure Milieu im weiblichen Genitale zu neutralisieren,
und bietet eine Spermienschutzfunktion (SETCHELL et al. 1994).
Literaturübersicht
2222
2.7 Spermientransport im weiblichen Genitaltrakt
Bereits vor dem Zeitpunkt der Ovulation sind am Ort der Befruchtung schon
ausreichend befruchtungskompetente Spermatozoen vorhanden. Dies kennzeichnet
einen erfolgreichen Spermientransport, denn schon vor dem Einsetzen physiologischer
Alterungsprozesse der Oozyte können die Spermatozoen die Eizelle penetrieren und
befruchten. Der Spermientransport ist ein komplexer Vorgang, der durch verschiedene
Faktoren beeinflusst wird. Seminalplasmaanteil, Seminalplasmazusammensetzung,
Paarungsverhalten der Tierart, der weibliche Reproduktionstrakt mit mechanischen
und physikochemischen Barrieren sowie immunogene Anteile des Uterus (HUNTER
1988, 1995) beeinflussen die Spermatozoen auf ihrem Weg zum Eileiter. Bei den
Säugetieren wird zwischen Tieren unterschieden, die das Ejakulat vaginal (Rind,
Ziege, Schaf, Kaninchen, Affe) oder im Uterus (Pferd, Schwein) deponieren. Der
eigentliche Transport zum Ovidukt erfolgt in einer Kombination aus aktivem und
passivem Transport. Durch VIRING u. EINARSSON (1981) wurde erstmals ein
transuteriner Transport von Spermatozoen durch koordinierte
Myometriumskontraktionen beim Schwein beschrieben.
Durch im Uterus vorhandene Hormone wie Östrogene und Progesteron wird die
Motilität des Uterus gesteigert (CLAUS et al. 1989). Auch Östrogene sind im
Seminalplasma enthalten, wodurch eine Synthese und Freisetzung von Prostaglandin F
2 α induziert wird (PAKRASI et al. 1983). Durch die Hormonfreisetzung kommt es zu
einer Frequenzsteigerung der Kontraktionswellen am Uterus (CLAUS u. SCHAMS
1990). Die Tierarten bei denen die Spermatozoen direkt in den Uterus abgesetzt
werden, besitzen als Hauptbarriere die uterotubale Verbindung, die aktiv überwunden
werden muß und der eine gewisse selektive Funktion auf die Gesamtpopulation der
Spermien zukommt (HUNTER 1995).
Je nach Tierart sind die Zeiten unterschiedlich, in denen sich eine Anzahl
befruchtungsfähiger Spermien in der uterotubalen Verbindung und im kaudalen
Isthmus etabliert. Untersuchungen von STEVERINK et al. (1998) ließen die
Literaturübersicht
2323
Vermutung zu, dass beim Schwein bereits 30 Minuten nach der Insemination eine
ausreichende Anzahl Spermatozoen im Ovidukt vorhanden ist, um eine Fertilisation zu
ermöglichen. Durch Untersuchungen von HUNTER (1981) konnte nachgewiesen
werden, dass beim Schwein innerhalb von 30 Minuten 50 % der Oozyten befruchtet
sind und nach maximal 2 Stunden eine 100%ige Fertilisation gewährleistet ist. Wird
die Besamung oder Bedeckung einer Sau in Ovulationsnähe durchgeführt, ist die
Transportgeschwindigkeit sowie die Anzahl transportierter Spermatozoen erhöht
(HUNTER 1981). Untersuchungen ergaben, dass es bei Pferd und Rind nach der
Bedeckung 4-8 Stunden dauert, bis sich eine ausreichende Anzahl
befruchtungskompetenter Spermatozoen am Befruchtungsort befindet (SCOTT u.
OVERSTREET 1999).
Literaturübersicht
2424
2.8 Funktionelles Spermienreservoir
Besonders bei Haussäugetieren mit mehrtägiger Östrusdauer ist bei einer frühen
Bedeckung bzw. Besamung in der Brunst eine Art Spermienspeicher im weiblichen
Genitaltrakt erforderlich, in dem die Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoen bis zur
Freissetzung der Eizelle bewahrt werden kann.
Der kaudale Isthmus des Eileiters erfüllt die Aufgaben eines funktionellen
Spermienreservoirs sowohl bei Scheidenbesamern, wie Ziege, Schaf und Rind
(Reservoir II) als auch bei Uterusbesamern, wie Pferd und Schwein (Reservoir I).
Das Spermienreservoir besitzt verschiedene wichtige Aufgaben:
1. Selektion intakter, befruchtungsfähiger Spermien
2. Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien bis zum Zeitpunkt der
Ovulation
3. Regulation von Hyperaktivierung und Kapazitation
4. Begrenzung der Spermienzahl am Ort der Befruchtung durch gezielte Loslösung
Durch das extrem enge Lumen im Bereich des Eileiteristhmus kommt es zu einer
Auftrennung der Gesamtspermienpopulation. Ein Teil der Spermienpopulation
befindet sich im Lumen des Eileiters, ein anderer Teil bindet an das
Schleimhautepithel (MBURU et al. 1997). Die im Lumen befindlichen Spermien
unterliegen morphologischen Veränderungen im Sinne eines Alterungsprozesses,
während die an die Epithelzellen der Schleimhaut gebundenen Spermien vor einem
Transport durch die Zilien geschützt sind (BLANDAU u. GADDUM-ROSSE 1974).
Die Spermien sind im Eileiter vor Phagozytose, übermäßigem Energieverlust sowie
frühzeitiger Kapazitation geschützt. Die Regulation dieser Vorgänge unterliegt der
zyklusstandabhängig unterschiedlichen Zusammensetzung der luminalen
Eileiterflüssigkeit hinsichtlich des Proteingehaltes, enzymatischer Aktivität,
Elektrolytgehalt und Viskosität.
Literaturübersicht
2525
Kapazitierte Spermien besitzen eine deutlich reduzierte Fähigkeit mit den
Oviduktepithelzellen eine Bindung einzugehen (FAZELI et al. 1999) sowie deutlich
sichtbare hyperaktive Geißelbewegungen, durch die sie aktiv zum Ort der Befruchtung
(Ampulla) gelangen (SMITH 1998). Durch das funktionelle Spermienreservoir wird
sichergestellt, dass zum Zeitpunkt der Ovulation ausreichend befruchtungskompetente
Spermien zur Befruchtung zur Verfügung stehen, da die Spermatozoen zeitlich
versetzt freigesetzt werden. Somit spielt das Spermienreservoir für eine erfolgreiche
Befruchtung eine bedeutende Rolle (Abb.2).
In der Literatur wird die Beteiligung von Kohlenhydrat-Proteinbindungen bei der
beschriebenen Anheftung der Spermien an das Epithel des Spermienrerservoirs
diskutiert (SMITH u. YANAGIMACHI 1991; SUAREZ et al. 1991; HUNTER 1995
LEFEBRE et al. 1997; GEHLHAAR et al. 2000; WAGNER et al. 2001). Die
Erkennung der spezifischen kohlenhydratbindenden Proteine oder lektinähnlichen
Moleküle der Spermien erfolgt über vom Oviduktepithel exprimierte Oligosaccharide
(SUAREZ 1998; SUAREZ et al. 1998).
Abb. 2: Bindungsmodell des funktionellen Spermienreservoirs; gebundene
Spermatozoen (grau) an Oligosaccharidstrukturen des Oviduktepithels. Nach der
Kapazitation lösen sich die Spermien (weiß) vom Epithel und setzen ihre Migration
fort.
Literaturübersicht
2626
2.9 Spermadhäsine
Als Spermadhäsine werden Proteinmoleküle mit kleiner molekularer Masse
(12-15 kDa) bezeichnet, die sich im Seminalplasma verschiedener Säugetierspezies
nachweisen lassen.
Tab. 1: Nomenklatur der Spermadhäsine
Tierart Spermadhäsine
Schwein AWN-1, AWN-2
AQN-1, AQN-3
PSP-1, PSP-2
Rind aSFP
Pferd HSP-7
Spermadhäsine sind spermienoberflächenassoziierte Eiweiße, für die Funktionen bei
der Kapazitation sowie bei der Gametenerkennung gezeigt werden konnten
(CALVETE et al. 1996, RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1998). Die Analyse ihres
Ursprungs, ihrer Lokalisation auf der Oberfläche und ihres
Ligandenbindungsverhaltens sowie ihre quantitative Bestimmung kann wertvolle
Hinweise geben, um die Funktion auf molekularer Ebene zu verstehen und damit auch
reproduktionsmedizinisch effektiver in das Fortpflanzungsgeschehen eingreifen zu
können.
Die Primärstruktur der Spermadhäsine besteht aus 111-133 Aminosäuren mit einer
Sequenzidentität von 40 – 60% und einer homologen Anordnung von zwei
Disulfidbrücken (SANZ et al. 1991, 1992a, 1992b; EINSPANIER et al. 1994). Jeweils
zwei benachbarte Cysteinreste sind über zwei Disulfidbrücken verknüpft. Es konnte
nachgewiesen werden, dass Spermadhäsine von ihrer Struktur zu einer Familie von
ontogenetisch regulierten Proteinen gehören, die durch die sogenannte CUB-Domäne
charakterisiert sind (BORK u. BECKMANN 1993).
Literaturübersicht
2727
Die Namensgebung erfolgte durch den Vergleich von Proteinsequenzen der
Komplementfaktoren Clr/Cls, des embryonalen Seeigelproteins Uegf sowie des
Knochen-morphogenetischen-Proteins bmpf. Für die CUB-Domäne wurde eine
ähnliche Tertiärstruktur vorgefunden wie im variablen Bereich der Immunglobuline.
Als Erkennungsmerkmal sind neun antiparallele β-Faltblattstränge beschrieben (Bork
u. Beckmann 1993). Durch ROMERO et al. konnte 1997 mittels
Röntgenstrukturanalyse und durch biophysikalische Verfahren erstmals die
dreidimensionale Struktur der CUB-Domäne am Beispiel der Spermadhäsine
aufgeklärt werden. Spermadhäsine enthalten eine einzige CUB-Domäne.
Spermadhäsine sind in der Lage, spezifisch an Kohlenhydrate zu binden, zeigen mit
den bisher bekannten Lektinen aber keinerlei Ähnlichkeit. Aus diesem Grund werden
sie als eine Gruppe neuartiger Lektine angesehen.
Das Spermadhäsin AWN bildet in seinem Syntheseort eine Ausnahme zu den anderen
Spermadhäsinen, denn es wird nicht erst in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen
gebildet, sondern bereits in den Tubuli recti und im Rete testis des Hodens
(SINOWATZ et al. 1995; EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2002).
Spermadhäsine besitzen verschiedene Möglichkeiten, an biochemischen Prozessen
teilzunehmen. Über die Kohlenhydratbindungsmöglichkeiten hinaus sind
Spermadhäsine in der Lage, Glycoaminoglycane, Phospholipide und
Serinproteinaseinhibitoren zu binden (SANZ et al. 1992a). Durch ihr Bestreben,
sulfatierte Glukosaminoglycane wie Heparin zu binden, können sie als regulative
Kapazitationsfaktoren wirken (CALVETE et al. 1995).
Eine wichtige Rolle spielen die Spermadhäsine bei der Bindung der Gameten, die über
die apikale Region des Spermienkopfes vermittelt wird. Durch indirekte
Immunfluoreszenzmikroskopie zeigten SANZ et al. (1993), dass Spermadhäsine im
akrosomalen Bereich des Spermienkopfes lokalisiert sind und gingen von einer
Beteiligung der Spermadhäsine bei der initialen Bindung der Gameten aus. AWN
wurde durchflusszytometrisch durch PETRUNKINA et al. (2000) an lebenden
Spermatozoen nachgewiesen.
Literaturübersicht
2828
RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. (1998) konnten nachweisen, dass AWN bei an die
Zona pellucida gebundenen Spermatozoen in vivo als Bindungspartner noch zur
Verfügung steht.
Material und Methoden
2929
3 Material und Methoden
3.1 Spermienaufbereitung
3.1.1 Gewinnung der Ejakulate
Für die Versuche wurden ausschließlich Spermatozoen klinisch gesunder,
institutseigener Eber verwendet. Alle Eber wurden während der
Versuchsdurchführung von November 2001 bis Dezember 2002 regelmäßig abgesamt,
um eine möglichst gleichbleibende Samenqualität zu gewährleisten. Die Tiere wurden
jeweils am Versuchstag mit Hilfe eines Phantoms durch die Handmethode abgesamt.
In einem isolierten Gefäß mit einem innenliegenden Plastikbeutel wurde das Ejakulat
aufgefangen. Durch ein steriles Netz wurde das Bulbourethraldrüsensekret abgetrennt.
Für die Versuche im Explant-Assay wurde die spermienreiche Fraktion des Ejakulates
gesammelt, bei allen anderen Untersuchungen wurde das Gesamtejakulat verwendet.
Es wurden für alle Untersuchungen ausschließlich Spermatozoen eingesetzt, die sich
nach dem konventionellen Verfahren als normosperm erwiesen. Alle verwendeten
Spermatozoen wurden einer Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll (Amersham
Biosciences, Uppsala, Schweden) unterzogen.
3.1.2 Konventionelle spermatologische Untersuchung
Mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes (Zeiss 1697, Jena) mit Wärmeplatte
wurden die Samenzellen direkt nach der Gewinnung bei 160-facher Vergrößerung
einer Motilitätsschätzung unterzogen. Weiterhin erfolgte eine makroskopische
Beurteilung von Farbe und Beschaffenheit des Ejakulates, die Bestimmung der
Samenzelldichte und Untersuchung der Samenzellmorphologie. Um den Anteil der
morphologisch abweichenden Spermien festzustellen, wurden 200 Spermien unter
dem Phasenkontrastmikroskop mit Ölimmersion bei 1000-facher Vergrößerung
ausgezählt und beurteilt. Aus der spermienreichen Fraktion des Ejakulates wurden
Material und Methoden
3030
10 µl in ein Eppendorfgefäß (Eppendorf, Sarstedt) zusammen mit temperaturgleicher
Formolcitratlösung pipettiert und vermischt. Von dieser Suspension wurden auf einem
staubfreien Objektträger zwei Tropfen aufgetragen und mit Deckgläsern (18 x 18 mm)
abgedeckt. Diese fixierten Spermien wurden nach KRAUSE (1965) untersucht.
3.1.3 Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll
Bei der Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala,
Schweden) wurde eine Trennung vorwärtsbeweglicher Spermien von den übrigen
Bestandteilen des Ejakulates aufgrund des unterschiedlichen spezifischen Gewichtes
und der unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeit erreicht (CLAASSENS et
al. 1998, PERTOFT et al. 1977).
Ein Zentrifugenröhrchen aus Glas mit konischem Boden wurde in schräger Position
zunächst mit 2 ml 70 % Percoll -Lösung befüllt und anschließend mit 4 ml 35 %
Percoll -Lösung überschichtet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass die 35 %
Percoll -Lösung beim Pipettieren vorsichtig an der Wand des Röhrchens entlang läuft
und beide Lösungen sich nicht vermischen.
Die Zentrifugation erfolgte bei 20 °C in zwei Schritten:
a.) 10 min bei ca. 300 x g
b.) 20 min bei ca. 800 x g
Nach der Zentrifugation konnte der Überstand mit Hilfe einer Eppendorfpipette
abgehebert werden. Das Spermienpellet am Boden des Glasgefäßes wurde mit 500 µl
HBS-Pufferlösung resuspendiert. Die Ermittlung der Spermiendichte folgte mit einer
Zählkammer nach Thoma. Dazu wurden 10 µl Spermiensuspension in 10 ml einer 10
% Kochsalzlösung gegeben und nach der Durchmischung in eine vorbereitete Thoma-
Zählkammer pipettiert. Nachdem die Spermien sich nach einer Minute Ruhezeit
abgesetzt hatten, konnten sie unter dem Mikroskop bei einer 40 fachen Vergrößerung
Material und Methoden
3131
ausgezählt werden. Zur Ermittlung der Dichte wurden im oberen und unteren
Zählkreuz jeweils fünf Quadrate ausgezählt und addiert.
ausgezählte SpermienDichte =
ausgezählte Fläche x Kammerhöhe x Verdünnung
Ausgezählte Fläche = 10/25 mm2
Kammerhöhe = 1/10 mm
Verdünnung = 1: 1000
Der durch Einsetzen in die Formel errechnete Faktor beträgt 10.000 und wurde mit den
ausgezählten Spermien multipliziert. Das Resultat ergab die Dichte in Mio
Spermienzellen /ml.
3.1.4 Darstellung der Membranintegrität durch Propidiumjodidfärbung
Propidiumjodid gehört zu den Farbstoffen, die in der Lage sind, eine nicht intakte
Zellmembran zu durchdringen und an die DNA der Zelle zu binden. Das
Absorptionsmaximum liegt bei 536 nm, der maximale Emissionsbereich bei 617 nm.
Hierbei weisen Zellen mit nicht intakter Zellmembran eine rote Fluoreszenz auf. Mit
einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml wurde Propidiumjodid in Aqua dest. gelöst und
im Gefrierschrank bei -20 °C lichtgeschützt aufbewahrt (HARRISON u. WICKERS
1990). Die Spermiensupension (970µl) wurde mit 20µl Formolcitrat und 10µl
Propidiumjodid versetzt. Nach 5 Minuten Reaktionszeit unter Lichtabschluss wurden
rote (membrandefekt) und grüne (membranintakt) Spermienzellen ausgezählt. Je 200
Samenzellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von
536 nm ausgewertet und prozentual angegeben. Durch dieses Verfahren konnte der
Anteil der membrandefekten Spermien objektiv ermittelt werden.
Material und Methoden
3232
3.2 Biochemische Charakterisierung von Proteinen
3.2.1 Auftrennen des Seminalplasmas mittels analytischer HPLC
Zur Herstellung eines spermienfreien Seminalplasmas wurde das Gesamtejakulat
zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Die Zentrifugation erfolgte bei 160 x g
bei 20 °C für 10 Minuten. Nach einer lichtmikroskopischen Kontrolle auf
Spermienfreiheit wurde das Seminalplasma lyophilisiert und davon 4 mg mit 1 ml
eines 0,0085 %igen Trifuoressigsäure (TFA)-Wassergemisches (Puffer A) verdünnt,
und über eine analytische C18-Säule (ET 250/10, Nucleosil 100-7, Macherey-Nagel,
Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System (Beckman mit LKB
2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt. Die Detektion
erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflussrate betrug 2 ml/min, die
Range 2,0 AU. Die Elution erfolgte durch 90 % Acetonitril + 0,085 % TFA in Wasser
(Puffer B) bei einem Gradienten von 25-70 % in 60 Minuten und von 70-90 % in
10 Minuten. Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min
erstellt. Die Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.
3.2.2 Herstellung von Spermienextrakten
Die Dichte der Spermatozoen wurde auf 107 Spermatozoen/ml HBS-Puffer eingestellt.
Die Extraktion erfolgte durch Extraktionspuffer/1 % Chaps in PBS-Puffer
(AppliChem, Darmstadt). Das vorbereitete Gefäß mit Spermien und Puffern wurde 20
Minuten bei 1000 x g zentrifugiert und der Überstand in ein frisches Gefäß
abpipettiert.
Material und Methoden
3333
3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Zu analytischen Zwecken wurde die Elektrophorese in einer Modifikation nach der
von LAEMMLI (1970) beschriebenen Methode durchgeführt. Die verwendeten
18 %igen Polyacrylamidgele wurden selbst hergestellt und mit einem 4,5 % igen
Sammelgel überschichtet. In diesem Sammelgel wurden je nach Versuchsansatz
Kunststoffkämme eingesetzt, durch die eine unterschiedliche Anzahl von
Probentaschen im Gel geformt wurden. Die aufgebrachten Spermienextrakte wurden
von 2 bis 15 µl mit je 2fach konzentriertem Laemmli-Puffer versetzt, 7 Minuten bei
95 °C erhitzt, 1 Minute auf Eis gestellt und 1 Minute bei 13.000 x rpm zentrifugiert. Je
nach Auftragsvolumen der Probe variierten die Taschengrößen des Gels. Zur
Ermittlung der relativen Molekulargewichte wurde routinemäßig ein LMW-Standard
(Low Molecular Weight Proteinstandard, Bio Rad, 161-0304) verwendet.
Die Elektrophorese wurde in einer Elektrophoresekammer (Bio Rad Mini-Protein II,
Bio Rad) durchgeführt. Im oben aufgetragenen Sammelgel erfolgte die Auftrennung
der Proteine mit 100 V, im Trenngel wurde die Stromstärke auf 200 V erhöht. Durch
das Austreten des blauen Farbstoffes am unteren Gelrand wurde das Ende der
Elektrophorese sichtbar. Nach diesem Verfahren konnten die zu analysierenden
Proteine auf Membranen übertragen werden oder mit Coomassie Brilliant Blue R
(Serva, Heidelberg, 35051) angefärbt werden.
Die Gele wurden nach der Elektrophorese für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit
Coomassie Brilliant Blue R (Serva, Heidelberg 35051) 0,25 % ige Färbelösung
(40 % Methanol, 10 % Eisessig) angefärbt. Um die überschüssige Hintergrundfarbe zu
entfernen, wurde das Gel in einer Entfärbelösung (20 % Methanol, 10 % Eisessig)
geschwenkt. Die Entfärbelösung wurde bei diesem Vorgang mehrmals gewechselt.
Zwischen mit Wasser befeuchteten Cellophanblättern (Gel Drying Film, Promega,
Madison) wurden die Gele bei Raumtemperatur getrocknet.
Material und Methoden
3434
3.2.4 Western Blot Analyse
Zu den empfindlichsten Nachweismethoden der Proteine nach elektrophoretischer
Auftrennung gehören immunologische Verfahren. Zu diesem Zweck werden Proteine
aus dem Gel durch ein Blotting-Verfahren auf eine Membran transferiert. Nach der
von TOWBIN et al. (1992) beschriebenen Methode wurde der Elektroblot
durchgeführt. Die 6 x 8 cm große PVDF Membran (Roche, Nr. 1722026) wurde für
eine Minute mit 100 % Methanol durchfeuchtet und danach in Aqua dest. und
Blotting-Puffer äquilibriert. In einem Semi-dry-Apparat (Biometra, Göttingen) mit
Wasserkühlung wurde ein Blotsandwich, bestehend aus drei Lagen Blotpapier
(GB 003, Schleicher & Schuell, Dassel), der Blotmembran, dem Gel und wiederum
drei Lagen Blotpapier, angeordnet. Das Blotpapier wurde vorher in Blottingpuffer
angefeuchtet, dann wurden die Proteine bei 1 mA/cm2 für zwei Stunden bei
Raumtemperatur übertragen.
Material und Methoden
3535
3.2.5 Spezifischer Proteinnachweis durch Immunfärbung
Die Qualität der Übertragung durch den Blotvorgang wurde durch das Färben der
geblotteten Gele in Coomassie Brilliant Blue und durch eine reversible Färbung der
geblotteten Membran in Ponceau Rot (5 min bei Raumtemperatur) kontrolliert. Bei
erfolgreicher Übertragung wurde die angefärbte Membran mit Aqua dest. entfärbt und
über Nacht bei 4 °C in Blocking Reagenz (Roche, Nr. 1096176) inkubiert, um die
freien Kapazitäten der Membran abzusättigen und unspezifische Bindungen der
verwendeten Antikörper an die Membran zu verhindern. Die darauf folgende
Inkubation mit dem ersten Antikörper wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur
durchgeführt. Alle verwendeten Antikörper wurden vor der Inkubation mit Blocking
Reagenz in der optimalen Konzentration verdünnt. Nicht gebundene Antikörper
wurden durch Waschen (3 x 10 min) mit TBS-Puffer von der Membran entfernt. Die
Membran wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem zweiten an Alkalische
Phosphatase gebundenen Antikörper beschickt und danach in TBS/1 % TWEEN und
in Detektionspuffer je 2 x 10 min gewaschen.
Die Farbreaktion erfolgte mit NBT/BCIP Stock Solution (AppliChem, Darmstadt
Nr. 298 83 9) in 100 mM TRIS-HCl bei einem pH-Wert 9,5 in 100mM NaCl. Bei
dieser Färbung dient BCIP als Substrat für die alkalische Phosphatase, das nach der
Dephosphorylierung oxidativ in einen Indigofarbstoff überführt wird. Bei dieser
Reaktion oxidiert NBT ebenfalls zu einem blauen Farbstoff und wirkt somit
farbverstärkend. Die Färbung findet unter Lichtabschluß statt und wird mit Wasser
gestoppt.
Tab. 2: Verwendete Antikörper
Primärantikörper Sekundärantikörper
Anti AQN-1 1:1000
(eigene Herstellung) in Blocking-Reagenz
Anti-Rabbit-AP 1:5000
(Dianova, Hamburg) in Blocking-
Reagenz
Material und Methoden
3636
3.2.6 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen
Bei diesen Versuchen wurde die Membran nach dem Blockieren über Nacht in
Blocking Reagenz Lösung bei 4 °C mit immobilisierten Zuckern (40 µg
α-D-Mannose-Biotin/ml Blocking Reagenz), die kovalent an eine
Polyacrylamidmatrix gebunden sind, inkubiert. Überschüssige Reagenzien wurden
durch 3 x Waschen mit TBS entfernt. Der Nachweis der Bindung der Modellzucker
erfolgt über Streptavidin-Alkalische-Phosphatase. Die überschüssige
Sekundärsubstanz wird durch 2 x 10 Minuten Waschen mit TBS Puffer/1 % Tween
entfernt. Abschließend wird die Membran 2 x 10 Minuten in Detektionspuffer
gewaschen.
Die Membran wurde mit NBT/BCIP Stock Solution (Roche Nr. 1681451) gefärbt und
getrocknet.
Tab. 3: Verwendete Primär-und Sekundärsubstanzen
Primärsubstanz Sekundärsubstanz
α-Mannose-PAA-Biotin
40µg/ml Blocking Reagenz
(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)
Streptavidin- Alkalische-Phosphatase
1:5000 in TBS-Puffer
(Dianova, Hamburg, 016030084)
α-Galaktose-PAA-Biotin (1-3 Verknüpfung)
20 µg/ml Blocking-Reagenz
(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)
Streptavidin- Alkalische-Phosphatase
1:5000 in TBS-Puffer
(Dianova, Hamburg, 016030084)
β-Galaktose-PAA-Biotin (1-3 Verknüpfung)
20 µg/ml Blocking-Reagenz
(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)
Streptavidin- Alkalische-Phosphatase
1:5000 in TBS-Puffer
(Dianova, Hamburg, 016030084)
Material und Methoden
3737
3.2.7 Chemilumineszenzverfahren
Alternativ wurde bei sehr geringen Proteinmengen das Chemilumineszenzverfahren
eingesetzt, das sich durch eine empfindliche Detektion auszeichnet. Durch variable
Belichtungszeiten sind unterschiedlich intensive Bilder von einer Membran
herstellbar.
Nach der Inkubation mit Primär- und Sekundärantikörper wurden die Membranen in
eine Folie mit 4 ml working solution des Chemilumineszenz-Substrates (Super Signal
West Pico; Pierce über KMF Laborchemie, St. Augustin-Buisdorf) eingeschweißt und
für 60 Sekunden leicht geschwenkt. Die Membran wurde aus der Folie entfernt und in
einer mit einer neuen Folie ausgestatteten Röntgenkassette mit Klebestreifen befestigt.
Ein Röntgenfilm (XAR-5, Kodak GmbH, Stuttgart) wurde in einer Dunkelkammer in
die Röntgenkassette eingelegt und durch das von der Membran ausgehende Lichtsignal
belichtet.
Die Belichtungszeiten variierten zwischen 15 Sekunden und drei Minuten. In einem
Entwicklungsbad (G 150, Agfa Deutschland) wurde der Film für 20-40 Sekunden
geschwenkt, danach in einem mit Aqua dest. gefüllten Stoppbad für einige Sekunden
gewaschen. Die Fixation des Röntgenfilms erfolgte für eine Minute in einem Fixierbad
(G 350, Agfa Deutschland). Nach einer fünfminütigen Wässerung wurde der Film
hängend getrocknet.
Die Membran kann nach einer Behandlung mit 3 M Kaliumthiocyanatlösung (Merck,
Darmstadt) über Nacht („Strippen“) für andere Verfahren eingesetzt werden. Eine
weitere Inkubation mit Primär- und Sekundärsubstanzen ist nach erneutem Blockieren
durchführbar. Zur Überprüfung des erfolgreichen Ablösens der Zuckerstrukturen
wurde nach dem „Strippen“ der Membran eine Leeruntersuchung mit 4 ml working
solution durchgeführt. Auf dem verwendeten Röntgenfilm konnten keinerlei Signale
erkannt werden.
Material und Methoden
3838
3.2.8 Auftrennen des Spermienextraktes mittels analytischer HPLC
Um eine Auftrennung der im Spermienextrakt enthaltenen Proteine durchführen zu
können, wurde die Probe in einer Verdünnung von 1 : 20 verwendet. Davon wurden
50 µl Probe mit 450µl eines 0,085 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Wassergemisches
(Puffer A) verdünnt und über eine analytische C18 –Säule (ET 250/4, Nucleosil 300-5,
Macherey-Nagel, Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System
(Beckman mit LKB 2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt.
Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflußrate betrug
800 µl/min, die Range 1,0 AU. Die Elution wurde mit 90 % Acetonitril +0,085 % TFA
in Wasser (Puffer B) bei einem Gradienten von 5-60 % in 120 Minuten durchgeführt.
Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min erstellt. Die
Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.
3.2.9 Massenspektrometrische Analyse
Die mittels reverse phase HPLC isolierten Proteine wurden in der
massenspektrometrischen Analyse mit einem matrix-assisted laser
desorption/ionization MALDI-II (Kratos Analytical V 5.2), der mit einem Bruker
REFLEX time-of flight (TOF) ausgestattet war, untersucht. Die Proteinfraktionen
wurden mit α-Cyano-4-hydroxycinnamidsäure in einer Acetonitril/0,1 % TFA-
Mischung (70:30, v/v) auf einen Stahlobjektträger gegeben und nach der Sandwich-
Methode (KUSSMANN et al. 1997) kokristallisiert. Die Profilerstellung fand im
positiven Ionenmodus mit linearer High-Power von 100 - 120 statt. Pro Spektrum
wurden 60 - 80 Laserschüsse abgegeben.
Material und Methoden
3939
3.3 Durchflusszytometrie
Mit der Durchflusszytometrie können physikalische Eigenschaften von Zellen, wie
Größe, Form und Struktur bestimmt werden. Zusätzlich können Zellfunktionen erfaßt
werden, die mit Hilfe von marker-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen dargestellt
werden können.
Das verwendete Durchflusszytometer (Galaxy, S 2314, DAKO, Hamburg ) ist mit
einem Argonionenlaser und einer UV-Quecksilberlampe ausgestattet, wobei der Laser
bei einer Wellenlänge von 488 nm detektiert. Zum Gerät gehört eine Computereinheit
mit Software (Mikrosoft Windows 98, FloMax), die eine gezielte Auswertung der
Messungen mit Hilfe der Sechsparameterdarstellung (zwei optische und vier
Fluoreszenzparameter) ermöglicht.
Zur Messung muß eine Einzelzellsuspension vorliegen. Die Probenflüssigkeit wird
durch Überdruck aus dem Probenröhrchen (No./ REF 55484; 3,5 ml; 55 x 12 mm;
Sarstedt, Nürnbrecht) über eine Stahlkapillare in die Quarz-Flowküvette eingeführt.
Um Zellaggregate aufzutrennen, werden die Zellen in der sie umgebenden
Trägerflüssigkeit stark beschleunigt und dadurch hintereinander aufgereiht gemessen.
Jede einzelne Zelle passiert so den fokussierten Laserstrahl. Je nach Zellmorphologie
(Größe und Granularität) entstehen Lichtbeugungen, die als Streulichtsignale von
Lichtdetektoren in bis zu 65.536 Kanälen pro Parameter registriert werden. Das
Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter) verhält sich proportional zur Größe der
gemessenen Zellen, während das Seitwärtsstreulicht (SSC = side scatter) Rückschlüsse
über die intrazelläre Beschaffenheit (Granularität) sowie über die Oberflächenstruktur
(Komplexität) der Zellen zulässt.
Bei der Verwendung von fluorochrommarkierten Partikeln werden diese durch die
Intensität des einfallenden Lichtes angeregt (Anregungslicht) und emittieren Photonen
einer für jeden Fluorochromfarbstoff typischen Wellenlänge. Die Fluoreszenzsignale
werden von für verschiedene Wellenlängen empfindliche Lichtdetektoren ermittelt.
Für die Grünfluoreszenz (FL-1) ist das verwendete Durchflusszytometer genauso mit
einem Messbereich ausgestattet wie für Messbereiche im Orange- und
Material und Methoden
4040
Rotfluoreszenzbereich (FL-2, FL-3). Die Intensität der Fluoreszenz wird logarithmisch
verstärkt und auf einer logarithmischen Skala dargestellt.
Durch das Computerprogramm (Mikrosoft Windows 98, FlowMax) wird eine gezielte
Auswertung der Messungen durch eine Zweiparameterdarstellung ermöglicht. In
einem Punktdiagramm (Dot Blot) wird jeweils ein Punkt eingezeichnet, wenn an einer
Intensitätsachse (linear oder logarithmisch), an der beide Parameter gegeneinander
aufgetragen werden, sich die ermittelten Werte der Parameter schneiden. Eine weitere
Möglichkeit der Darstellung ist das Einparameter-Histogramm bei dem vertikal die
Anzahl der Zellen je Kanal aufgetragen werden und horizontal die jeweilige
Messgröße aufgetragen wird.
Eine separate Auswertung verschiedener Zellsubpopulationen aus einem Probenansatz
ist möglich. In einem Dot Blot können bestimmte Meßfenster definiert (gating) und
einzelnd analysiert werden. In den Versuchen sind als Markerfarbstoffe
Propidiumjodid (610 nm Bandpass Filter) und Fluoreszenzisothiozyanat (FITC,
520 nm Bandpass Filter) eingesetzt worden.
3.3.1 Etablierung des Messverfahrens
Um die Kohlenhydratbindungsstellen quantifiziert darzustellen, erfolgte zur
Etablierung des Messsystems zunächst eine Untersuchung mit α-D-Mannose-PAA-
FITC. Zur Wahl der Messeinstellung des Durchflusszytometers wurde zunächst je eine
Messung mit Spermatozoen in HBS-Puffer, denen entweder nur Propidiumjodid-
Lösung oder nur immobilisierte Zucker (FITC-Konjugat) zugesetzt wurden,
durchgeführt. Bei den unter Kapazitationsbedingungen durchgeführten
Untersuchungen erfolgte eine zusätzliche Messung der Spermien mit den zu
untersuchenden Zuckern in Tyrode-Kapazitationsmedium (HARRISON 1993), um das
Gerät für alle nachfolgenden Untersuchungen desselben Tages einzustellen. Während
der gesamten Untersuchungsreihe wurden bei einer Messung jeweils 10.000 Zellen
(400-600 Spermienzellen pro Sekunde) im Trägermedium ausgewertet.
Material und Methoden
4141
Bei jeder Messung betrug das Probenvolumen 1 ml, in das 5 µl Propidiumjodid-
Stammlösung als Lebend-Tot-Kontrolle sowie BSA (5 µg/ml) zugesetzt wurden, um
unspezifische Bindungen zu verhindern.
3.3.2 Bestimmung der optimalen Inkubationszeit bei der
durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen
Um die optimale Inkubationszeit für den Nachweis mannosebindender Strukturen auf
der Spermienoberfläche festzustellen, wurden kinetische Vorversuche zu
verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. In einer Konzentration von 3 µg/ml HBS-
Puffer wurden mit α-D-Mannose-PAA-FITC markierte Spermiensuspensionen jeweils
nach 1, 3, 5, 7 10 und 15 Minuten durchflusszytometrisch untersucht. Für den weiteren
Versuchsablauf wurde nach dieser Untersuchung eine Inkubationszeit von 3 Minuten
festgelegt.
3.3.3 Bestimmung der optimalen Zuckerkonzentration bei der
durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen
In diesem Vorversuch wurde die optimale Zuckerkonzentration bei einem
Probenvolumen von 1 ml ermittelt. Jeweils nach einer Zeitspanne von 3 Minuten
wurden verschiedene Konzentrationen von 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 5 µg und 8 µg jeweils
pro Milliliter Probenvolumen durchflusszytometrisch gemessen. Nach der
Untersuchung ergab sich ein Optimum der Fluoreszenz für 2-5 µg des Reagenzes/ml
Probenvolumen. Für die weiteren Versuche wurde eine Zuckerkonzentration von
3 µg/ml Trägermedium festgelegt.
Material und Methoden
4242
3.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchung der Veränderungen in der
Mannose/Galaktose Bindung unter Kapazitationsbedingungen
Nach dem heutigen Wissensstand ergibt sich die Hypothese, dass sich die
Bindungsstellen der Spermatozoen während des Kapazitationsvorganges verändern.
Daher wurden die Spermien in diesem Versuchsabschnitt in ein spezielles
Kapazitationsmedium (Tyrode-Medium) überführt und gemessen.
Die Messungen erfolgten 3, 15 und 30 Minuten nach Überführen der Spermatozoen in
das Tyrode-Medium. Während der Inkubationszeiten wurden die Probenröhrchen in
einem CO2-Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) bei 39 °C
aufbewahrt. Die durchflusszytometrische Bestimmung der mittleren Fluoreszenz der
Spermienpopulationen erfolgte unverzüglich nach der Entnahme der inkubierten
Spwermiensuspensionen aus dem Brutschrank. Die Inkubation der Spermien wurde
mit α-D-Mannose-PAA-FITC, α-Galaktose-PAA-FITC sowie mit β-Galaktose-PAA-
FITC durchgeführt. Jeder Zucker wurde zu einer Endkonzentration von 3 µg/ml
Tyrode-Medium hinzupipettiert und die mittlere Intensität der Fluoreszenz mit Hilfe
der Flow Max Software ermittelt. Als Negativkontrolle wurde bei α-D-Mannose-
PAA-FITC eine 0,5 M α-Methylmannopyranosid Lösung eingesetzt. Bei den
Galaktosen wurde jeweils eine Kontrolle mit 0,5 M Laktose-Lösung durchgeführt.
Um die proportionale Umverteilung innerhalb der Population lebender Zellen zu
beobachten, wurde eine Einteilung in vier Quadranten vorgenommen (Abb. 3).
Quadrant 1 (Q1) beeinhaltet die toten Zellen mit niedriger Fluoreszenz der
gebundenen Zucker, während Quadrant 2 (Q2) die toten Spermienzellen repräsentiert,
die eine hohe Fluoreszenz aufweisen. Im Quadrant 3 (Q3) werden die lebenden
Spermienzellen mit niedriger Fluoreszenz dargestellt. Die hohe Fluoreszenz lebender
Zellen zeigt Quadrant 4 (Q4). Die Darstellung der Umverteilung konnte mit dem
Einfügen sogenannter „Gatings“ (Messfenster) erreicht werden, wobei die Trennung
der Population mit hoher Zuckerbindungskapazität von der Spermienpopulation mit
niedriger Fluoreszenz der Zucker erfolgte. Vor der Messung wurde die Trennung
Material und Methoden
4343
durch Gatings vorgenommen, festgelegt und während der gesamten
durchflusszytometrischen Analyse konstant gehalten.
Abb. 3: Darstellung eines Punktdiagrammes (Dot Blot) der durchflusszytometrischen
Analyse
Q1: Tote Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q2: Tote Zellen mit hoher Fluoreszenz
Q3: Lebende Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q4: Lebende Zellen mit hoher
Fluoreszenz
Material und Methoden
4444
3.4 Fluoreszenzmikroskopie
Durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen sollten mannosebindende
Strukturen auf der Oberfläche der Spermatozoen sichtbar gemacht werden. Es wurden
wie bei der Durchflusszytometrie Spermatozoen in Tyrode-Medium inkubiert und
jeweils 3, 15 und 30 Minuten nach der Inkubation Spermienausstriche angefertigt, die
eine Stunde luftgetrocknet wurden. Die Fixation erfolgte mit Paraformaldehydlösung.
Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurden die Ausstriche mit
PBS/10 % BSA in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach
wurde Mannose-PAA-FITC in 100 µl Portionen auf die Objektträger gegeben. Die
Inkubation mit Mannose-PAA-FITC (20 µg/ml in PBS/1 % BSA) in einer feuchten
Kammer bei 37 °C wurde 60 Minuten durchgeführt. Zum Waschen wurden die
Objektträger 3 x 10 Minuten in PBS geschwenkt. Die Objektträger wurden mit 50 µl
Glycerin-PBS-Gemisch (9:1; Mountingpuffer) beschichtet und mit einem
Deckgläschen versehen. Bis zur Fluoreszenzmikroskopie wurden die Objektträger
unter Lichtabschluss aufbewahrt.
Als Negativkontrolle wurde bei einem Ausstrich vor der Zugabe von Mannose-PAA-
FITC eine Lösung von 0,5 M α-Methylmannopyranosid auf einen Objektträger
gegeben und unter den oben genannten Bedingungen inkubiert.
Material und Methoden
4545
3.5 Explant-Assay
Für den Versuchsabschnitt wurden die Ejakulate von zwei klinisch gesunden,
institutseigenen Ebern verwendet. Für die Versuche wurde ausschließlich die
spermienreiche Fraktion des Ejakulates eingesetzt.
Am örtlichen Schlachthof wurden am Tag des Versuches zwei Eileiter von
verschiedenen Altsauen gewonnen, die in 4 °C gekühlter PBS-Lösung transportiert
wurden. Die Eileiter von postpuberalen Sauen wurden ausgewählt, da sie
ausgeprägtere Epithelfalten aufweisen und sich dadurch zur Explantgewinnung besser
eignen als solche von Jungsauen. Der Zyklusstand der Tiere konnte für diesen
Versuchsansatz vernachlässigt werden (GEHLHAAR et al. 2000).
3.5.1 Gewinnung der Explante
Die Eileiter wurden im Labor in eine mit frischer, gekühlter PBS-Pufferlösung
vorbereitete Petrischale (Greiner GmbH, Frickenhausen) überführt. Mit Hilfe einer
anatomischen Pinzette (TBH GmbH, Langenhagen) und einer Schere mit zwei spitzen
Schenkeln (Aesculap, TBH GmbH, Langenhagen) wurde das Eileitergekröse
(Mesosalpinx) vom Eileiter (Abb. 4/1) entfernt. Zur weiteren Präparation wurden eine
Mikropinzette (Dumont forceps 45°, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) und eine
Mikroschere mit zwei spitzen Schenkeln und einer Schnittfläche von drei Millimetern
(Mini-Vannas, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) verwendet. Nachdem das
Gekröse nahezu vollständig abpräpariert war, konnte der Eileiter mit der Schere
longitudinal eröffnet werden. In einer mit Parafin gefüllten Petrischale wurde der
Eileiter unter leichtem Zug mit zwei grauen Kanülen (0,7 x 30mm, Luer Lock,
Heiland, Hamburg) fixiert und das Epithel mit PBS-Lösung feuchtgehalten. Aus den
Epithellängsfalten (Abb. 4/2) des kaudalen Isthmus des Oviduktes wurden nun die
Explante (0,5-1mm, Abb. 4/3) unter einem Stereomikroskop (Zeiss 475003, Jena) mit
Hilfe der Mikroinstrumente gewonnen. Für den Versuch wurden nur die Explante
Material und Methoden
4646
verwendet, die sich bei der anschließenden Prüfung mit Hilfe des Inversmikroskopes
(IM 35, Zeiss, Jena) durch ihre Größe, einen vorhandenen Epithelsaum sowie gute
Zilienbewegung als tauglich erwiesen. Die ausgewählten Explante wurden in kleinen
mit TALP-Medium gefüllten Petrischalen (35 x 10 mm, Greiner GmbH,
Frickenhausen) bis zum Versuchsbeginn im Kühlschrank gelagert.
Abb. 4: Schematische Darstellung der Explantgewinnung:
1 = Querschnitt durch den Eileiter
2 = Längsschnitt durch den Eileiter
3 = Explant (im Verhältnis etwas vergrößert)
1 2 3
Material und Methoden
4747
3.5.2 Koinkubation der Explante mit den Spermatozoen
In einer kleinen Petrischale wurden zwei Explante in 60 µl TALP-Medium im
Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) für fünf Minuten bei 39 °C
und fünf Prozent CO2 Begasung äquilibriert. Gleichzeitig wurden auch die in einem
Eppendorfgefäß vorverdünnten Spermatozoen und eine Gewebekulturschale mit vier
Nocken (35 x10 mm, Greiner GmbH, Frickenhausen) in den Brutschrank verbracht.
Zu diesen Explanten wurde nach Ablauf der fünf Minuten die 10 µl
Spermiensuspension (105 Spermien/ml TALP-Medium) hinzugegeben und unter
denselben Bedingungen für weitere fünfzehn Minuten koinkubiert. Die Explante
wurden nun in einer Gewebekulturschale mit Nocken je 2 x in 60 µl TALP-Medium
gewaschen. Ein mit Silikonrahmen (Silicone Stopcock Grease, Dow-Corning, Serva
Feinbiochemica, Heidelberg) versehener Objektträger (IDL, Interessengemeinschaft
der Laborffachhändler, GmbH + Co KG) wurde mit frischem, vorgewärmten TALP-
Medium (60 µl) beschickt und die Explante mit Hilfe der Mikropinzette auf den
gewärmten Objektträger aufgegeben und mit einem Deckglas abgedeckt.
3.5.3 Videomikrographie der gebundenen Spermien am Explant
Mit Hilfe des Inversmikroskopes, welches mit einer Videokamera (Kappa, CF 8/1),
einem Monitor (WV-BM 1400, Panasonic) und einem Videorecorder (SLV-
E 720,VHS, Sony) gekoppelt war, wurde der Versuch dokumentiert. Der Objektträger
wurde auf dem Deckglas liegend auf den Mikroskoptisch verbracht und die Explante
in ihrer Gesamtheit bei einer 50,4 fachen (6,3 x 8) Vergrößerung gefilmt. Zusätzlich
wurden von jedem Explant drei Fragmente (Teilstücke) in der 256 fachen (32 x 8)
Vergrößerung aufgenommen. Durch das Drehen der Mikrometerschraube des
Inversmikroskopes konnten die gebundenen Spermatozoen in allen Ebenen erfaßt und
gezählt werden. Nachdem alle Versuche durchgeführt und aufgezeichnet waren,
erfolgte die Auswertung in der 256 fachen Vergrößerung mit Hilfe einer am Monitor
befestigten Folie, auf der jedes Spermium mit einem Folienstift markiert wurde.
Material und Methoden
4848
Um die Größe der gefilmten Explante und Fragmente bestimmen zu können, wurde an
jedem Versuchstag eine Skalierung (OT, 0,01mm2, Olympus) in den beschriebenen
Vergrößerungen auf der Videokassette festgehalten. Die Flächenausmessung wurde
mit Hilfe des computergestützten Flächenmeßprogrammes „ AIDA “ (mika medical
GmbH, Bildanalyse Ver. 2.0, Copyright 1992, Rosenheim) durchgeführt. Zu diesem
Zweck wurde der Computer (Dell 450/M, Germany) mit einem Monitor (Trinitron,
Germany) und dem Videorekorder gekoppelt. Die während des Versuches
aufgenommene Skalierung wurde vor Beginn der Berechnungen gespeichert. Durch
Umfahren des Explantes bzw. des Fragmentes (im Standbild) mit der Maus des
Computers konnte die Fläche der Explante und Fragmente errechnet werden.
3.5.4 Berechnung des Bindungsindexes
Durch die gezählten Spermien und die mit dem Flächenmessprogramm gemessene
Größe des Explantes konnte der Bindungsindex mit einem SAS-Computerprogramm
ermittelt werden. Definiert ist der Bindungsindex als die mittlere Anzahl der gezählten
und am Explant gebundenen Spermien pro 0,01 mm2 Explantfläche (PETRUNKINA
et al. 2001)
BIE = (SG1 + SG2 + SG3 ) / (FF1 + FF2 + FF3)
BIE = Bindungsindex der an das Explant gebundenen Spermien
SG1,2,3 = Anzahl der gebundenen Spermien an das Fragment des jeweiligen Explantes
FF1,2,3 = Gemessene Fläche des Fragmentes eines Explantes
BI= (BIE1+ BIE2) / 2
BIE1 + BIE2 sind die Bindungsindices des ersten und zweiten Explantes, die
gleichzeitig im Versuch verwendet wurden.
Material und Methoden
4949
3.5.5 Kompetitive Hemmungsversuche
Bei diesen Versuchen sollte eine mögliche Beteiligung verschiedener Spermadhäsine
bei der Interaktion der Spermatozoen mit den Oviduktepithelzellen untersucht werden.
Dazu wurden zu den vorinkubierten Explanten und Spermien Spermadhäsine gegeben,
so dass Spermien und Spermadhäsine miteinander um die Strukturen der
Oviduktepithelzellen konkurrieren konnten. Die Versuchsbedingungen entsprechen
denen in 3.5-3.5.4 beschriebenen. Eine signifikant herabgesetzte Anzahl (p < 0,05) der
gebundenen Spermien war ein Hinweis auf die Beteiligung des kompetitiv
eingesetzten Spermadhäsins bei der Spermatozoen-Oviduktepithelzellbindung. Als
Spermadhäsine wurden vergleichsweise AQN-1 und AWN-2 in verschiedenen
Konzentrationen (1,25 µM – 20 µM) eingesetzt.
In einem weiteren Versuch wurden verschiedene Kohlenhydrate eingesetzt und ihre
Rolle als Inhibitionssubstanzen untersucht. Bei einer Konzentration von 3 µM wurden
2-Fukosyl-Laktose, 3-Fukosyl-Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-
Laktose und β-Laktose (Sigma, Aldrich) zu den vorinkubierten Explanten gegeben
und in ihrer Fähigkeit, die Spermatozoenbindung an das Eileiterepithel zu
beeinflussen, verglichen.
Ergebnisse
5050
4 Ergebnisse
Durch die Spermadhäsine wird eine Gruppe von Proteinen repräsentiert, die
oberflächenassoziiert den Spermatozoen aufliegen. Hinsichtlich ihrer physiologischen
Funktion wird den Spermadhäsinen sowohl eine Rolle bei der initialen Bindung der
Spermatozoen an die Zona pellucida der Eizelle als auch bei der Etablierung des
Spermienreservoirs zugedacht. Verschiedene Spermadhäsine aus dem porcinen
Seminalplasma sind proteinbiochemisch charakterisiert, allerdings stehen
Untersuchungen im Spermienreservoir des weiblichen Genitaltraktes zur
Identifizierung des Rezeptorsystems beim Schwein noch aus. Zu diesem Zweck
wurden im Rahmen dieser Arbeit Untersuchungen auf proteinbiochemischer Ebene,
durchflusszytometrische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen, sowie
kompetitive Hemmversuche im Explant-Assay durchgeführt.
4.1 Isolierung der Seminalplasmaproteine
Das Seminalplasma setzt sich aus den Sekreten von Hoden, Nebenhoden und
akzessorischen Geschlechtsdrüsen zusammen und weist einen hohen Gehalt
unterschiedlicher Proteine auf. Ein Einfluß der Seminalplasmaproteine auf die
Spermienfunktion bei der Spermien-Epithelzell-Interaktion bei der Kapazitation sowie
als Protektor während der Ejakulation und des Transportes im weiblichen Genital wird
diskutiert. Mit einem reverse phase HPLC System konnten 16 Proteinfraktionen aus
dem zellfreien Eberseminalplasmapool isoliert werden. Davon sind sechs Fraktionen
als Spermadhäsine mittels massenspektrometrischer Untersuchung (Malditof, Kratos
Analytical V 5.2) identifiziert worden (Tab. 4). Die Identifizierung erfolgte für die
Spermadhäsine PSP-1, PSP-2, AWN-1, AWN-2, AQN-1 sowie AQN-3. Das
entsprechende Chromatogramm ist in Abbildung 5 dargestellt. Für die weiteren
Untersuchungen wurden die gekennzeichneten Proteinfraktionen aufgefangen,
dialysiert und gefriergetrocknet.
Ergebnisse
5151
Abb. 5 : Chromatogramm der Spermadhäsine aus porcinem Seminalplasma,
aufgetrennt über ein reverse phase HPLC System; Säule: C18 (ET 250/10,
Nucleosil 100-7), Durchfluss = 2ml/min; Range = 2 AU; Wellenlänge = 220 nm;
Papier 2mm/min; Gradienten von 25-70 % in 60 Minuten und von 70 – 90 %
in 10 Minuten
I = PSP-1, II = AQN-1, III = PSP-2, IV = AQN-3, V = AWN-1, VI = AWN-2
Ergebnisse
5252
Tab. 4: Massenspektrometrie der Spermadhäsine; Vergleich der gemessenen zur
errechneten relativen Molekülmasse in Dalton (Da).
Spermadhäsin Relative Molekülmasse (Da)
Gemessener Wert Errechneter Wert
PSP-1 12.170,9 12.297,04
AQN-1 11.832,9 11.833,2
PSP-2 12.657,7 12.646,46 (GlcNAc)
AQN-3 12.883,0 12.884,6
AWN-1 14.774,5 14.776,05
AWN-2 15.066,9 14.818,05 (GlcNAc)
4.2 Nachweis von mannosebindenden Proteinen im Seminalplasma
Um festzustellen, ob die im Seminalplasma isolierten Spermadhäsine sich, wie in der
Literatur beschrieben, als mannosebindend herausstellen, wurden Untersuchungen
durchgeführt, bei denen die Kohlenhydratbindungseigenschaften charakterisiert
werden konnten.
Die Fraktionen der Seminalplasmaproteine, die über das reverse phase HPLC System
aufgetrennt und fraktioniert aufgefangen wurden, eigneten sich für die weitere
Proteinuntersuchung in der SDS-Gelelektrophorese. In der SDS-Gelelektrophorese
wurden die isolierten Seminalplasmaproteine PSP-1, PSP-2, AWN-1/2, glykosiliertes
AWN-1/2, AQN-1 sowie AQN-3 aufgetrennt (Abb. 6 A). Die relative Molekülmasse
der isolierten Seminalplasmaproteine lagen im Vergleich zum
Molekulargewichtsstandard im Bereich von 11-15 kDa.
Ergebnisse
5353
Im Western-Ligand-Blot (Abb. 6 B) sind mannosebindende Fraktionen nachgewiesen
worden. Neben den dominierenden Proteinbanden von PSP-1/2 wurden zusätzliche
Banden im Bereich von 31 kDa dargestellt. In diesem Fall handelt es sich vermutlich
um aggregierte Formen dieses Proteins. Des weiteren ergab die Untersuchung bei
AQN-3 und AWN-1 je eine Bandenbildung mit geringerer Intensität. Mit diesem
Verfahren konnte bei der glykosylierten Form von AWN-1 keine Reaktion mit α-D-
Mannose nachgewiesen werden.
Bei AQN-1 wurden deutliche Signale mit geringfügig größeren relativen
Molekülmassen nachgewiesen. Hierbei handelt es sich höchstwahrscheinlich um
aggregierte Formen von AQN-1.
Abb. 6 : Auftrennung der Seminalplasmaproteine (Spermadhäsine) mittels SDS-
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (A) und dazugehöriger Western-Ligand-Blot (B)
mannosebindener Proteine. Der Western-Ligand-Blot wurde auf eine Mannosebindung
getestet.
1 = AQN-3; 2 = AQN-1; 3 = Glykosyliertes AWN1/2; 4 = AWN1/2; 6 = PSP-1/2
In der Spur 5 wurde kein Protein aufgetragen.
Ergebnisse
5454
4.3 Nachweis von Spermadhäsinen im Spermienextrakt
Da die Spermatozoen vor der Extraktion durch eine Dichtegradientenzentrifugation
vorbehandelt waren, stellte sich am Anfang der Untersuchungen die Frage, ob die
Spermadhäsine nach der Zentrifugation in ausreichender Menge isoliert werden
können. Nach den Versuchen konnte kein negativer Einfluß durch Percoll® in Bezug
auf die Spermadhäsinassoziation sowie in den Bindungseigenschaften der Spermien
festgestellt werden.
Für die Isolierung des Proteins sollte zunächst eine Methode gefunden werden, die es
erlaubte möglichst viel Protein zu extrahieren. Vergleichsweise wurden Extrakte mit
OGP-Extraktionspuffer und mit Extraktionspuffer/1 % Chaps angefertigt. Als
effektivere Auszugsmöglichkeit der Spermadhäsine wurde für die Extraktion in den
folgenden Versuchen Extraktionspuffer/1 % Chaps verwendet. In der Abbildung 7 ist
die Auftrennung der extrahierten Proteine vergleichsweise sowohl mit OGP-
Extraktionspuffer als auch mit Extraktionspuffer/1 % Chaps im SDS-Gel zu sehen.
Abb. 7: Auftrennung der Spermienextraktproteine mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-
Elektrophorese (18 %); 1, 2 und 3 = OGP-Extraktion; 4 und 5 = Extraktion durch
Extraktionspuffer/ 1 % Chaps
Ergebnisse
5555
4.4 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen im Spermienextrakt
Da im Vorfeld nicht eindeutig geklärt werden konnte, ob bei Percoll® gewaschenen
Spermien noch mannosebindende Proteine vorhanden sind, wurde zur Klärung dieser
Frage im Dot Blot Verfahren eine Chemilumineszenzanalyse durchgeführt. Zum
Vergleich wurde neben den aufgetragenen Spermienextrakten in verschiedenen
Konzentrationen reverse phase HPLC gereinigtes AQN-1 sowie AQN-3 aufgetragen.
Die PVDF Membran wurde mit α-D-Mannose-Biotin, sowie nach dem Waschen mit
alkalischer Peroxidase/Streptavidin inkubiert.
Bei der Analyse der isolierten Proteine wurden positive Signale im Bereich der
Spermienextrakte (Abb. 8, I A, I B) festgestellt. AQN-3 (Abb. 8, II C) zeigte eine
geringere Bindung von α-D-Mannose-Biotin als AQN-1 (Abb. 8 II A). Dabei wurden
aufgrund der höher eingesetzten Konzentration stärkere Signale bei AQN-1 und AQN-
3 dargestellt als bei den Spermienextrakten (Abb. 8, II A/B/C). Als
Kandidatenproteine kommen zu diesem Zeitpunkt der Untersuchung sowohl AQN-1
als auch AQN-3 in Frage.
Abb. 8 : Nachweis mannosebindender Proteine des Spermienextraktes im Dot Blot
Verfahren
I A = 10 µl (ca. 50 µg) Spermienextrakt; I B = 20 µl (ca. 100 µg) Spermienextrakt;
II A = 20 µl (ca. 15 µg) AQN-1; II B = 30 µl (ca. 20 µg) AQN-1;
II C = 10 µl (ca. 15 µg) AQN-3
Ergebnisse
5656
Der Extrakt wurde in verschiedenen Konzentrationen im Dot Blot System auf seine
Kohlenhydratbindungseigenschaften untersucht. Die eingesetzten Zucker α-Mannose-
PAA-Biotin, α-Galaktose-PAA-Biotin und β–Galaktose-PAA-Biotin zeigten alle gute
Bindungseigenschaften, wobei die extrahierten Proteine bevorzugt eine Bindung mit
Mannose eingingen. Die Spermienextrakte von percollgewaschenen Spermien wiesen
bereits bei niedrigen Konzentrationen (Abb. 9, 5/6µg) deutliche Signale bei der
Mannosebindung auf. In der Abbildung 9 sind die mit den verschiedenen Zuckern
behandelten PVDF Membranen zu sehen. Es wurde deutlich, dass Mannose gegenüber
a-und ß-Galaktose bevorzugt gebunden wurde.
Abb. 9: Dot Blot Analyse des Spermienextraktes
Die Spermienextrakte wurden in abnehmenden Konzentrationen (1 = ca. 100 µg,
2 = ca. 50 µg; 3 =ca. 25 µg; 4 =ca. 12,5 µg; 5 =ca. 6,2 µg; 6 =ca. 3,1 µg) aufgetragen.
Ergebnisse
5757
4.5 Nachweis von AQN-1 im Spermienextrakt
Das Spermadhäsin AQN-1 zeigte in der Western Blot Analyse eine sehr hohe Affinität
zu α-D-Mannose. Dieses Ergebnis stützt das Konzept, dass die Bindung porciner
Spermien über die Bindung von assoziierten Spermadhäsinen an mannosehaltige
Oligosaccharide des Epithels vermittelt wird. Da mannosebindende Proteine im
Spermienextrakt durch die Dot Blot Analyse nachgewiesen wurden und AQN-1 sich
bereits durch seine hohe Affinität zu Mannose im Western-Blot zu erkennen gab,
wurde AQN-1 näher untersucht.
Der Spermienextrakt wurde im 18 % SDS-Gel aufgetrennt und anschließend im
Western-Blot analysiert. Unter Verwendung von AQN-1 spezifischen polyklonalen
Antikörpern konnte ein intensives Signal im Bereich von 14 kDa nachgewiesen
werden (Abb.10). Dies bedeutete, dass im Spermienextrakt das Spermadhäsin AQN-1
vorhanden war. Als Positivkontrolle wurde ein HPLC gereinigtes AQN-1 aufgetragen.
AQN-1 konnte im Spermienextrakt charakterisiert werden.
Abb. 10: Nachweis von AQN-1 im Spermienextrakt mittels Western Blot Analyse
A/E = 5 µl (ca. 25 µg) Spermienextrakt =, B = AQN-1 (ca. 20 µg) Positivkontrolle,
C = 10 µl (ca. 50 µg) Spermienextrakt, G = 2 µl (ca. 12 µg) Spermienextrakt;
In den Spuren D/F wurde kein Spermienextrakt aufgetragen.
Ergebnisse
5858
4.6 Isolierung der Spermienextraktproteine
Da bei vorangegangenen Untersuchungen sowohl AQN-1 als auch AQN-3 eine
Mannosebindung zeigten, wurden zur Absicherung der Ergebnisse der Western Blot-
und Chemilumineszenz Analyse weiterführende Untersuchungen durchgeführt.
Die gewonnenen Spermienextrakte wurden mit der reverse phase HPLC aufgetrennt
und fraktioniert aufgefangen (Abb. 11). Die einzelnen Fraktionen wurden lyophilisiert
und massenspektrometrisch analysiert. Aus der massenspektrometrischen Analyse
ging eindeutig hervor, dass es sich bei den isolierten Fraktionen vorwiegend um die
Spermadhäsine AQN-1 und AQN-3 handelte (Tab.5). Andere Proteine konnten durch
die massenspektrometrische Analyse nicht eindeutig zugeordnet werden.
Abb. 11: Chromatogramm der AQN-1 (1) und AQN-3 (2) Isolierung aus dem
Spermienextrakt über ein reverse phase HPLC System; Säule: C18 (ET 250/4,
Nucleosil 300-5), Durchfluss = 800 µl/min; Range = 1,0 AU; Wellenlänge = 220 nm;
Gradient = 5-60 % in 120 Minuten; Papier: 2 mm/min
Ergebnisse
5959
Tab. 5 : Massenspektrometrische Analyse der Spermadhäsine AQN-1 und AQN-3;
Vergleich der gemessenen zur errechneten relativen Molekülmasse in Dalton (Da)
Spermadhäsine Relative Molekülmasse (Da)
AQN-1 Gemessener Wert:
11.823,9
Errechneter Wert:
11.833,2
AQN-3 12.844,1 12.884,6
Ergebnisse
6060
4.7 Nachweis mannosebindender Proteine an ejakulierten, Percoll
gewaschenen Spermien mittels durchflusszytometrischer Analyse
Vor Beginn des Versuches lag die Vermutung nahe, dass sich die zuckerbindenden
Strukturen der Spermien während des Kapazitationsprozesses ändern. Durch die
vorangegangenen Ergebnisse wurde Mannose als der Zucker identifiziert, zu dem das
Spermadhäsin AQN-1 die höchste Bindungsaffinität besitzt. Ob und in welchem
Umfang die Bindungsstellen für Mannose sich bei der Kapazitation verändern, zeigte
dieser Versuchsabschnitt.
Die Kapazitation wurde mit dem Tyrode-Medium im Brutschrank bei 39 °C und
5 % CO2 Begasung induziert. Die durchflusszytometrischen Analysen wurden 3, 15
und 30 Minuten nach der Inkubation durchgeführt.
Während der Kapazitation halbierte sich die Fluoreszenz der mit Mannose markierten
Spermienzellen, wobei ein stetiger Anstieg der Fluoreszenz der mit
β-Galaktose inkubierten Spermien zu verzeichnen war. Die Fluoreszenzkurve der
α-Galaktose (Abb. 12) zeigte eine geringgradige Verminderung der Bindungsstellen
im Laufe der Kapazitation.
Die Abbildung 13 zeigt die Umverteilung von Spermien mit unterschiedlichen
Zuckerbindungsaffinitäten innerhalb der Population lebender Zellen. Die verwendeten
Daten wurden aus einem Quotienten von Quadrant 4 zu Quadrant 3 ermittelt (siehe
Material und Methoden, 3.3.4). Die Vergrößerung dieses Wertes entspricht der
Umverteilung der Zellen aus den Quadranten mit niedriger Fluoreszenz zu hoher
Fluoreszenz. Die Verkleinerung des Quotienten entspricht einer Abwanderung der
Zellen von einem Quadranten mit hoher Fluoreszenz zu niedriger Fluoreszenz. Bei der
Berechnung der proportionalen Verschiebung innerhalb der Population lebender
Zellen inkubiert mit Mannose-PAA-FITC wurde bei einem anfänglichen Mittelwert
der Proportion der lebenden Zellen von 3,8 (nach 3 Minuten) nach 30 Minuten eine
stark verminderte proportionale Verteilung von 1,0 festgestellt. Im Gegensatz dazu hat
sich die Proportion der lebenden Zellen von ß-Galaktose-PAA-FITC inkubierten
Ergebnisse
6161
Spermien im Laufe der Kapazitation bei einem anfänglichen Wert von 0,04 stark
vergrößert, bereits nach 30 Minuten konnte ein Mittelwert von 3,08 errechnet werden.
Die mit a-Galaktose-PAA-FITC inkubierten Spermienpopulationen zeigten eine
geringgradige Vergrößerung der proportionalen Verteilung der Zellen mit höherer und
niedrigerer Fluoreszenz während des Kapazitationsprozesses (siehe Material und
Methoden, 3.3.4). Diese Ergebnisse zeigen eine signifikante Verschiebung der
Population der mit a-D-Mannose-PAA-FITC gebundenen Spermien in den niedrigen
Signalbereich; im Gegensatz zu einer massiven Verschiebung der ß-Galaktose-PAA-
FITC gebundenen Spermienzellpopulation in den höheren Signalbereich.
Ergebnisse
6262
Abb. 12: Darstellung der Bindungsintensität von kapazitierten Spermatozoen unter
Einfluß von α-Galaktose-, β-Galaktose- und α-D-Mannose-PAA-FITC
Abb. 13: Proportionale Verteilung von Spermien mit unterschiedlichen
Zuckerbindungsaffinitäten innerhalb der Population lebender Zellen
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20 25 30 35Inkubation, min
Pro
port
ion
alpha-gal beta-gal man
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 5 10 15 20 25 30 35Inkubation, min
Inte
nsitä
t
alpha-gal beta-gal man
Ergebnisse
6363
4.8 Nachweis von mannosebindenden Strukturen auf der
Spermienoberfläche
Durch Fluoreszenzmikroskopie sollten mannosebindende Strukturen auf den
Plasmamembranen der Eberspermien lokalisiert werden. Die Spermien wurden im
Tyrode-Medium inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (3, 15, und 30 Minuten)
nach der Inkubation wurden Spermienausstriche angefertigt, die mit Mannose-PAA-
FITC beschickt wurden. Um eine unspezifische Bindung auszuschließen, wurde die
Rezeptorenbindung spezifisch mit 0,5 M α-Methylmannopyranosid gehemmt. Die
Abbildung 14 zeigt den Nachweis von mannosebindenden Strukturen an ejakulierten,
percollgewaschenen Spermien im Hellfeld (A) und im Fluoreszenzlicht (B). Bei
intakten Spermien ist der mannoseerkennende Bereich im akrosomalen Bereich des
Spermienkopfes lokalisiert. Nach der Kapazitation konnten die fluoreszierenden
Signale im akrosomalen Teil des Spermienkopfes nach 30 Minuten nicht mehr
nachgewiesen werden.
A B
Abb. 14: Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von mannosebindenden Strukturen
auf der Spermienoberfläche:
A: Spermium vor der Kapazitation im Hellfeld; B: Spermium mit mannosebindenden
Strukturen im apikalen Bereich dargestellt im Fluoreszenzlicht.
Ergebnisse
6464
4.9 Explant-Assay
Um das komplementäre Rezeptorsystem, das für die Etablierung des
Spermienreservoirs beim Schwein verantwortlich ist, untersuchen zu können, wurden
mit Hilfe des Explant-Assays kompetitive Hemmversuchsreihen durchgeführt
(GEHLHAAR et al. 2000). Für die Untersuchungen wurden etwa 1mm große
Gewebestückchen aus den Longitudinalfalten des kaudalen Isthmus des Oviduktes von
frisch geschlachteten Sauen verwendet. Die Bindung von Spermien an das
Oviduktepithel wurde als Bindungsindex (Material und Methoden, 3.5.4) quantifiziert.
Der Bindungsindex stand in einer linearen Beziehung zu der Menge hinzugegebener
Spermatozoen. Damit war die mathematische Grundlage gegeben, um kompetitive
Hemmversuche sowie Rezeptorstudien durchführen zu können.
Ergebnisse
6565
4.9.1 Vergleich von AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay
Im Explant-Assay wurden die Spermadhäsine AQN-1 und AWN-2 auf ihre
inhibitorischen Fähigkeiten getestet (Abb. 15). Jedes Protein wurde in einer
abfallenden Konzentrationsreihe von 20 µM bis 1,25 µM zu den Explanten gegeben.
Um die inhibitorische Aktivität zu vergleichen, wurde für AQN-1 ein IC50-Wert von
4,6 µM ermittelt. Durch das Spermadhäsin AWN-2 konnte keine spezifische
Hemmung erreicht werden.
Abb. 15: Einsatz von AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
Konzentration (µM)
Bin
dung
sind
ex (S
perm
ien
/ 0.0
1 m
m2 )
AWN-2 AQN-1
Ergebnisse
6666
4.9.2 Vergleich der inhibitorischen Wirkung von 2-Fukosyl-Laktose, 3-Fukosyl-
Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose und β-Laktose im
Explant-Assay
Um zu überprüfen, ob außer Mannose auch andere Zucker bei der Spermienbindung
eine Rolle spielen, wurden im Explant-Assay Vergleichszucker in bezug auf die
Hemmbarkeit der Spermienbindung eingesetzt. Alle verwendeten Substanzen wurden
bei einer Konzentration von 3 µM gegen eine Kontrolle verwendet. Aus der Abbildung
16 ist ersichtlich, dass gegen die Kontrolle eine hohe signifikante Inhibition von
Mannopentaose ausging (p ≤ 0,0001), die von der Grundstruktur zum
Oligomannosyltyp gehört, hervorging. 2- (p ≤ 0,0003) bzw. 3-Fukosyl-Laktose
(p ≤ 0,0009) wirkten ebenfalls signifikant hemmend auf die Spermienbindung. Eine
nicht signifikante Inhibition zeigten bei dieser Untersuchung β-Laktose und N-Acetyl-
Neuraminyl-Laktose (p ≥ 0,05).
Ergebnisse
6767
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Kontrolle N-Acetyl-Lak. beta-Lak. 3-Fuk.-Lak. 2-Fuk.-Lak. Mannopent.
Mittelwert Standardabw.
Abb. 16 : Einsatz von N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose, β-Laktose, 3-Fukosyl-Laktose,
2-Fukosyl-Laktose und Mannopentaose im Explant-Assay, aufgeführt als
Bindungsindices.
Diskussion
6868
5 Diskussion
Der Schweinebestand in der Bundesrepublik Deutschland betrug im Jahr 2001 rund 26
Mio. Tiere. Von den rund 2,5 Mio. Zuchtsauen wurden im Wirtschaftsjahr 1998/99
etwa 63 % künstlich besamt.
Am Beispiel der Schweiz wird deutlich, dass der Anteil der künstlichen Besamung von
20 % im Jahre 1995 auf 43 % im Jahre 2001 angestiegen ist; dies verdeutlicht, wie
wichtig die Kenntnisse der Befruchtung aus veterinärmedizinischer Sicht sind. Durch
die künstliche Besamung kommt es international zu einem Strukturwandel und zu
einer Professionalisierung in der Schweineproduktion. Durch die Anwendung der
künstlichen Besamung kommen nur Besamungseber zum Einsatz, die bezüglich
Fruchtbarkeit, Mast- und Schlachtleistung und Erbfehlerfrequenzen positiv zum
züchterischen Fortschritt beitragen. Die Wirtschaftlichkeit in der Ferkelerzeugung
wird vor allem durch die Anzahl der je Sau und Jahr abgesetzten und verkauften
Ferkel bestimmt.
Mit Hilfe der künstlichen Besamung ist es möglich, die Schweinezucht ökonomischer
zu gestalten. Da trotz mehrjähriger Erfahrung im Umgang mit der künstlichen
Besamung die Korrelation von Ovulationszeitpunkt und Besamungszeitpunkt
Schwierigkeiten mit sich bringt, ist es notwendig, die Befruchtungsvorgänge weiter zu
erforschen. Durch detailierte Grundlagenkenntnisse des Befruchtungsprozesses wird
die Tierproduktion zukünftig optimiert werden.
Diskussion
6969
5.1 Die Interaktion zwischen Spermium und Oviduktepithel ist ein
kohlenhydratvermittelter Prozess
Nach der Ejakulation bzw. nach der künstlichen Besamung werden die Spermatozoen
bis zur Ovulation der Eizelle im Isthmus des Oviduktes gespeichert. An diesem
Prozess scheinen beim Schwein kohlenhydratbindende Proteine aus dem männlichen
Genitaltrakt beteiligt zu sein. Diese oberflächenassoziierten Proteine verhalten sich
wie Lektine und binden an Kohlenhydratstrukturen des Oviduktepithels. Sie werden
nach DOSTALOVA et al. (1995) während des Kapazitationsprozesses entfernt; damit
sind die Spermatozoen in der Lage, sich vom Epithel des Oviduktes zu lösen. Nach der
Ablösung bzw. nach der Kapazitation können die Spermien nicht mehr an das
Eileiterepithel binden (FAZELI et al. 1999). Untersuchungen von GEHLHAAR et al.
(2000) ergaben, dass epididymale Spermien eine verminderte Bindungsfähigkeit
gegenüber ejakulierten Spermatozoen besitzen. Daher lag die Schlußfolgerung nahe,
dass während der Ejakulation durch den Kontakt mit dem Seminalplasma aus den
akzessorischen Geschlechtsorganen Substanzen auf die Spermienoberfläche gelangen,
die die Bindung an das Eileiterepithel ermöglichen.
Bei verschiedenen Tierarten konnte gezeigt werden, dass ein
Kohlenhydraterkennungsmechanismus für die Bildung des funktionellen
Spermienreservoirs beim Säuger verantwortlich ist. Grundlegende Arbeiten sind von
IGNOTZ et al. (2001) beim Rind durchgeführt worden, die bei dieser Spezies eine
Beteiligung von Fukose nachweisen konnten. Entsprechende Untersuchungen von
WAGNER et al. (2001) konnten für das Schwein Oligomannosylstrukturen als
dominantes Signal zeigen. Die lektinhistochemischen Studien von WAGNER
et al. (2001) werden als Hinweis gewertet, dass ähnlich wie beim Rind auch beim
Schwein lektinähnliche Proteine für die Spermien-Oviduktbindung verantwortlich
sind.
Durch TÖPFER-PETERSEN et al. (2002) wurde festgestellt, dass Mannosyl-
Oligosaccharide von den Epithelzellen im weiblichen Genitaltrakt exprimiert werden,
die eine hohe Affinität zu spermienassoziierten Lektinen aufweisen. Diese
Diskussion
7070
Untersuchungen gaben den Anstoß, die Spermadhäsine auf ihre
Mannosebindungsfähigkeit hin zu untersuchen.
Spermadhäsine gehören zu einem neuartigen Typ von Lektinen, deren
Kohlenhydraterkennungsdomäne bisher nicht eindeutig geklärt ist. Die Einteilung der
Lektine erfolgt über ihre Erkennungsdomäne (CRD Carbohydrate Recognition
Domain). Lektine gehören zu den kohlenhydratbindenden Proteinen ohne
enzymatische Aktivität. Erstmalig wurden sie im Pflanzenreich gefunden. In letzter
Zeit wurde zunehmend erkannt, dass sie auch bei biologischen Vorgängen im
Tierreich eine große Rolle spielen (CALVETE et al. 1995).
Die Spermadhäsine assozieren bei der Ejakulation an die Spermatozoenmembran.
Durch die Kohlenhydratbindungseigenschaft nehmen sie eine sehr wichtige Stellung
bei den kohlenhydratvermittelten Interaktionen der Zellen beim Befruchtungsvorgang
ein. Die Oviduktzellbindung und die Interaktion zwischen den Gameten scheint durch
verschiedene Spermadhäsine vermittelt zu sein (GABIUS 1997).
EKHLASI-HUNDRIESER (2000) und VON RAD (2002) konnten bei in vitro
Versuchen beobachten, dass das Spermadhäsin AQN-1 α-D-Mannose erkennt und mit
einer Dissoziationskonstanten im Bereich von 10-7 M bindet.
Die eigenen gelelektrophoretischen Untersuchungen mit anschließender Western-
Ligand-Blot Analyse weisen mannosebindende Proteine im Seminalplasma des Ebers
nach. Das stärkste Signal der untersuchten Spermadhäsine zeigt AQN-1.
IGNOTZ et al. (2001) ist es gelungen, ein analoges Protein (PDC 109) mit einer
Zuckerspezifität für Fukose aus dem Seminalplasma des Bullen zu isolieren. Dieses
Protein zeichnet sich durch eine Homologie zu der heparin- und gelatinbindenden
Domäne des Fibronectin Typ II (FnII) aus. Es wird in der Samenblase sezerniert und
assoziiert während der Ejakulation mit der Spermienoberfläche (TÖPFER-PETERSEN
et al. 1998). MÜLLER et al. (2002) untersuchten die Funktion des PDC 109 als
Hauptkomponente des bovinen Seminalplasmas. PDC 109 spielt bei den
Reifungsprozessen der Spermien, insbesondere bei der Kapazitation, eine Rolle. Es ist
in der Lage, mit seiner heparinbindenden Domäne spezifisch die Lipide
Diskussion
7171
Phosphatidylcholin und Cholesterol aus der Plasmamembran von Spermien zu
extrahieren. Durch das Herauslösen des Cholesterols aus der Plasmamembran von
Spermienzellen kommt es zur Induktion der Signaltransduktionskaskaden
(ZARINTASH u. CROSS 1996), die zur Hyperaktivierung (CROSS u. RAZY-
FAULKNER 1997) und Akrosomreaktion führen. Die Fn Typ II Domäne des PDC
109 Proteins besteht aus einer zentralen Kerneinheit, die sich aus zwei antiparallelen
„β-sheets“, die nahezu rechtwinklig zueinander stehen, und zwei irregulären „Loop“-
Regionen zusammensetzt. Demgegenüber zeigt die CUB-Domäne der Spermadhäsine
zwei sandwichförmig angeordnete Faltblätter mit jeweils zwei parallelen und vier
antiparallen „β-strands“.
Das Spermadhäsin AQN-1 besitzt als sogenanntes CUB-Protein genau wie die
Proteine vom Fn Typ II sowohl eine Glykan- als auch eine Heparin-Bindungsdomäne.
Durch den Vergleich der Domänenstruktur beider Proteine kann die Hypothese
aufgestellt werden, dass AQN-1 neben der Rolle bei der Interaktion von Kohlenhydrat-
und Protein-Bindung im Spermienreservoir nach erfolgter Ovulation in die Einleitung
des Kapazitationsprozesses involviert sein könnte.
Diskussion
7272
5.2 Die Rolle der Spermadhäsine
Beim Schwein sind die Hauptkomponenten des Seminalplasmas Proteine, die als
Spermadhäsine bezeichnet werden und sich durch ihre
Kohlenhydratbindungsfähigkeiten auszeichnen. Beim Eber konnten bisher die
Spermadhäsine AQN-1, AQN-3, AWN-1, AWN-2, PSP-1 und PSP-2 isoliert werden.
Den einzelnen Gruppen der Spermadhäsine werden verschiedene Aufgaben
zugeschrieben. Sie sollen akrosomstabilisierend sein und als Dekapazitationsfaktoren
sowie als Zona pellucida-bindende Moleküle fungieren.
Das Spermadhäsin PSP-2 bildet mit bestimmten N-Glycoformen des PSP-1 ein
Heterodimer und stellt die Hauptkomponente im Seminalplasma des Ebers dar. Die
einzelnen PSP-Proteine besitzen die Fähigkeit Heparin zu binden, wobei diese
Fähigkeit als Heterodimer verloren geht (CALVETE et al. 1995a). Untersuchungen
von ASSREUY et al. (2002) haben ergeben, dass PSP-1 und PSP-2
immunmodulatorische Aufgaben besitzen. Bei der Injektion von PSP-1/PSP-2
Heterodimeren in die Peritonäalhöhle von Ratten konnte ein Einstrom von
neutrophilen Granulozyten nachgewiesen werden. PSP-1 könnte nach Aussagen von
ASSREUY et al. (2002) über Protein-Protein-Interaktion bei der Immunmodulation
beteiligt sein. Beim Bindungsverhalten der Spermien im Spermienreservoir spielen
PSP-1 und PSP-2 daher vermutlich keine Rolle.
Das Spermadhäsin AWN bildet in seinem Syntheseort eine Ausnahme zu den anderen
Spermadhäsinen, denn es wird bereits in den Tubuli recti des Rete testis des Hodens
sowie später wieder in der Samenblase gebildet (SINOWATZ et al. 1995). Auf
molekularbiologischer und proteinbiochemischer Ebene wurde AWN von EKHLASI-
HUNDRIESER et al. (2002) zusätzlich im Nebenhodenschwanz und Prostata
nachgewiesen. Während der Nebenhodenpassage assoziiert AWN über seine
Phospholipidbindungsdomäne an die Membran der Spermien. SINOWATZ et al.
(1995) konnten mittels Western Blot Analyse AWN als einziges Spermadhäsin an
epididymalen Spermien nachweisen.
Diskussion
7373
Von AWN sind bereits zwei Isoformen (AWN-1 und AWN-2) identifiziert worden
(SANZ et al. 1992b). Beide Polypeptidketten sind identisch, AWN-2 besitzt zusätzlich
einen N-terminalen Acetylrest. DOSTALOVA et al. (1995a) erhielten Hinweise auf
eine Beteiligung von AWN bei der Bindung der Spermatozoen an die Eizelle. In
Studien von DOSTALOVA et al. (1995a) konnte eine Bindungsfähigkeit von AWN an
solubilisierte, biotinylierte porcine Zona pellucida festgestellt werden. Die
Oligosaccharidstrukturen der Zona pellucida enthalten Galaktosestrukturen, die von
AWN erkannt werden können. AWN konnte als einziges Spermadhäsin durch eine
elektronenmikroskopische Darstellung nach einer in vivo Insemination identifiziert
werden (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1998). AWN weist nach Untersuchungen
von TÖPFER-PETERSEN et al. (1998) eine Hauptbindungsdomäne für Galaktose
sowie eine Unterdomäne für Sialsäure und N- Acetylhexosamin auf.
In der Samenblase sowie in der Prostata des Ebers werden AQN-1 und AQN-3
zusammen mit anderen Spermadhäsinen sezerniert. AQN-1 bildet Aggregate, die
während der Ejakulation als eine Schutzschicht um den akrosomalen Bereich des
Spermienkopfes gelagert und bei der Kapazitation wieder abgelöst werden. Durch die
Anlagerung der Spermadhäsine wird das Spermium vor vorzeitiger Akrosomreaktion
geschützt. AQN-3 bindet nach DOSTALOVA et al. (1995b) direkt an Lipide der
Spermienmembran und wird danach von anderen Spermadhäsinen wie AQN-1
überlagert und spielt daher bei der Bindung im Spermienreservoir keine entscheidene
Rolle.
AQN-1 und AWN-2 schienen als Spermadhäsine in bezug auf die
Kohlenhydratbindungseigenschaften interessant zu sein. Bei der eigenen Western-
Ligand-Blot Analyse zeichnete sich AWN-2 im Vergleich zu AQN-1 allerdings durch
eine geringere Affinität zu Mannose aus. Daher lag die Vermutung nahe, das AWN bei
der Etablierung des Spermienreservoirs nicht beteiligt zu sein scheint. Um diese
Hypothese zu überprüfen, wurden AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay eingesetzt.
Die Ergebnisse des Explant-Assays bestätigen die Vermutung, dass AWN nicht an der
Bildung des Spermienreservoirs beteiligt ist, da sich die Bindung zwischen
Diskussion
7474
Oviduktepithelzellen und Spermatozoen durch Zugabe von AWN nicht hemmen läßt.
Demgegenüber zeigt AQN-1 eine signifikante inhibitorische Aktivität bei einer IC50
von 4,6 µM. Da epididymale Spermien nach Aussagen von PETRUNKINA et al.
(2001b) nur vermindert in der Lage sind, an das Eileiterepithel zu binden, liegt die
Vermutung nahe, dass AQN-1 der putative Rezeptor ist, der an der Etablierung des
Spermienreservoirs beteiligt ist.
5.3 Nachweis von AQN-1 auf percollgewaschenen Spermien
Bisher wurden wenige Untersuchungen an Spermien nach einer
Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll® durchgeführt Untersuchungen an
humanen Spermien von TANPHAICHITR et al. (1988) zeigten, dass in bezug auf die
Fertilisationsrate keinerlei Unterschiede bestehen zwischen percollgewaschenen und
solchen Spermien die im Swim-up Verfahren aufgereinigt wurden. Da unklar war, ob
die Spermadhäsine sich nach dem Percollverfahren noch auf der Spermienoberfläche
befinden wurden Western-Ligand-Blot Analysen durchgeführt.
Der Nachweis von AQN-1 auf percollgewaschenen Spermien konnte durch die eigene
Western-Ligand-Blot Analyse eines Spermienextraktes erbracht werden. In der Dot
Blot Analyse konnte nachgewiesen werden, dass die Spermienextrakte mit α-D-
Mannose, α-Galaktose und β-Galaktose eine Bindung eingehen. Bevorzugt wurde
bereits bei niedrigen Konzentrationen α-D-Mannose gebunden. Im Spermienextrakt
percollgewaschener Spermien sind demnach kohlenhydratbindende Proteine
nachzuweisen, die in der Lage sind, Mannose zu binden. Eine Aufarbeitung mittels
reverse phase HPLC des Spermienextraktes diente zur Isolierung eines Proteins, das
sich nach der massenspektrometrischen Analyse als AQN-1 mit einer relativen
Molekülmasse von 11.823 kDa herausstellte. Diese Untersuchung hat gezeigt, das die
Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll eine schonende und effektive
Waschmethode darstellt, die die für die Etablierung des Spermienreservoirs
funktionelle Spermienoberfläche erhält.
Diskussion
7575
5.4 Kohlenhydratbindungsstellen des Spermatozoens während der
Kapazitation
Um die Spermien nach der Ejakulation in die Lage zu versetzen, die Befruchtung
durchzuführen, sind zahlreiche physiologische und biochemische Veränderungen
essentiell. Die Kapazitation kann nur eingeleitet werden, wenn Proteine des
Seminalplasmas, die den Spermien aufliegen, entfernt oder umgewandelt werden
(YANAGIMACHI 1994). Diese Proteine werden als Dekapazitationsfaktoren
bezeichnet. Nach der Ejakulation ist ein Spermium mit 12 – 60 Millionen Molekülen
Spermadhäsinen AQN-1, AQN-3, PSP-1, AWN-1 und AWN-2 überzogen. Während
der in-vitro Kapazitation reduziert sich die Anzahl der Moleküle auf 5 - 6 Millionen
pro Spermatozoon (DOSTALOVA et al. 1994).
Durch Untersuchungen, bei denen die Kapazitation durch spezielle Medien
herbeigeführt wird, können die durch Umbauprozesse veränderten Protein-
Kohlenhydrat-Bindungsstellen der Spermienmembran deutlich gemacht werden.
Durch lektinhistochemische Studien von WAGNER et al. (2001) lagen Hinweise vor,
dass Glykanstrukturen vom Mannose- und Galaktosetyp sowie
N-Acetylglucosamin - Typ vom gesamten weiblichen Genitaltrakt exprimiert werden.
Der Nachweis verschiedener Zuckerstrukturen führte zu der Überlegung, dass die
Proteinrezeptoren der Spermienoberfläche sich während der Kapazitation verändern.
Da die eigene Dot Blot - Analyse des Spermienextraktes bereits Anhaltspunkte auf die
bevorzugten Zucker lieferte, wurde die durchflusszytometrische Analyse unter
Kapazitationsbedingungen ausschließlich mit α-D-Mannose, α-Galaktose sowie β-
Galaktose durchgeführt. Die Untersuchungen von WAGNER et al. (2001) trugen zur
Auswahl der in der durchflußzytometrischen Untersuchung eingesetzten Zucker bei.
Durch die Ergebnisse des Explant-Assays wurde bestätigt, dass N-Acetylglucosamin
in bezug auf die Spermienbindung im Spermienreservoir vernachlässigt werden
konnte, denn besonders Mannopentaose mit Mannosylrest war in der Lage, die
Spermienbindung an das Epithel kompetitiv zu hemmen.
Diskussion
7676
Die durchflusszytometrische Analyse während der Kapazitation ergab eine 50 % ige
Verminderung der Fluoreszenz der mit Mannose markierten Spermienzellen im
Zeitraum von 30 Minuten im Vergleich zu unkapazitierten Spermatozoen. Im
Gegensatz dazu vergrößerten sich die Bindungsstellen für β-Galaktose kontinuierlich,
während die Intensitätskurve für α-Galaktose das Maximum nach ca. 15 Minuten
erreichte.
Diese Ergebnisse unterstreichen die Hypothese, dass die Bindung im
Spermienreservoir durch Mannosestrukturen herbeigeführt wird und dass nach der
Ablösung vom Epithel Galaktosestrukturen bei der Interaktion mit der Zona pellucida
der Eizelle eine Rolle spielen. Anhand der eigenen Experimente kann postuliert
werden, dass bei kapazitierten Spermien eine hohe Bindungsfähigkeit für Galaktose
bzw. eine niedrige Bindungsaffinität für Mannose vorliegt.
Mit den fluoreszenzmikroskopischen Versuchen konnten mannosebindende Strukturen
am apikalen Rand ejakulierter, percollgewaschener Spermien durch
Mannose-PAA-FITC nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass sich die
Fluoreszenz im Laufe der Kapazitation verlor.
Mittels durchflußzytometrischer Untersuchungen an Bullenspermien konnten von
REVAH et al. (2000) kohlenhydratbindende Strukturen auf der apikalen Membran des
Spermiums detektiert werden. Beim Spermienreservoir des Bullen konnte Fukose als
proteinbindende Zuckerstruktur identifiziert werden (IGNOTZ et al. 2001). Eine
intensive Fluoreszenz im Bereich der akrosomalen Region wurde durch REVAH et al.
(2000) ebenfalls beobachtet. IGNOTZ et al. (2001) konnten nachweisen, dass die bei
lebenden, unkapazitierten Spermien vorhandene Fluoreszenz im Bereich des
Akrosoms nach der Kapazitation nicht mehr vorhanden ist.
Diskussion
7777
5.5 Abschlussbetrachtung
Ohne eine genaue Kenntnis der Bindungspartner, die für die Etablierung des
Spermienreservoirs eine Rolle spielen, kann der Mechanismus der Steuerung der
Modulation der Spermienfunktion nicht bestimmt werden. Um die Spermien-Ovidukt-
Interaktion des Schweines näher zu charakterisieren, wurde diese Arbeit angefertigt.
Aus den vorliegenden Daten ist es möglich, ein Bindungsmodell (Abb. 17) beim
Schwein zu entwickeln.
Im Verlauf der Spermienreifung assoziiert AWN mit der Membran der Spermatozoen.
Zusätzlich bilden weitere Spermadhäsine wie AQN-1 eine Schutzschicht, indem sie
den direkt mit der Membran verbundenen Spermadhäsinen (AWN) aufgelagert
werden. Die akrosomintakten, nicht kapazitierten Spermien binden über AQN-1 an das
Epithel des Eileiters. Um den Ovulationszeitpunkt herum wird durch noch unbekannte
Signale die Kapazitation induziert und AQN-1 Bindungsstellen gehen verloren.
Dadurch wird AWN „demaskiert“ und steht für die Interaktion mit der Zona pellucida
zur Verfügung.
Abb. 17: Modell der Assoziation von AQN-1 auf der Spermienoberfläche (siehe
5.5,Abschlussbetrachtung); nach der Loslösung werden Bindungsstellen für Galaktose
exprimiert (AWN).
Diskussion
7878
Da die Rolle von AQN-1 bei der Spermien-Ovidukt-Interaktion nur zu einem kleinen
Teil beleuchtet werden konnte, ist es notwendig, die Funktion der Spermadhäsine
weiter zu untersuchen, um das Rezeptorsystem vollständig zu identifizieren. Einige
Forschergruppen (BALL et al. 1997, IGNOTZ et al. 2001, GREEN et al. 2001)
konnten bei verschiedenen Spezies unterschiedliche Kohlenhydrate beschreiben, die
an der Interaktion von Spermatozoen und Epithelzellen des weiblichen Genitaltraktes
beteiligt sind. Durch die Ergebnisse von HESS (1998) und SIMON (2002) sind
tierartübergreifende Bindungen von Spermatozoen an Oviduktzellkulturen des
Schweins erzielt worden. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass sich der
Bindungsmechanismus zwischen den einzelnen Spezies in den Grundlagen ähnelt.
Um die Beteiligung von AQN-1 im Kapazitationsprozess näher zu charakterisieren,
sollten in weiteren Untersuchungen Spermienextrakte vor und nach der Kapazitation in
vitro mittels HPLC und anschließender Massenspektrometrie analysiert werden. Sollte
sich die oben beschriebene Hypothese durch diese Untersuchungen bestätigen, könnte
die Funktion von AQN-1 im Explant-Assay unter Kapazitationsbedingungen mit Hilfe
monoklonaler Antikörper (Anti-AQN-1) detailliert charakterisiert werden. Die vom
Ovidukt exprimierten Spermienrezeptoren können mit Hilfe moderner Proteom-
analytik weiter charakterisiert werden, damit beide Seiten des Rezeptorsystems
identifiziert werden können.
Zusammenfassung
7979
6 Zusammenfassung
Katrin Gohr: Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro zur
Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell.
Bei den höheren Säugetieren müssen die Spermatozoen für eine erfolgreiche
Befruchtung umfassende Zell-Zell-Interaktionen im weiblichen Genitaltrakt eingehen.
Die beteiligten molekularen Zielstrukturen, die in diesem komplexen Geschehen als
Ligand bzw. Rezeptor fungieren, sind bisher noch nicht identifiziert und
charakterisiert.
Aus physiologischer Sicht ist bekannt, dass die Spermatozoen an das Oviduktepithel
des kaudalen Isthmus des Eileiters binden und dort das Spermienreservoir bilden, um
bis zum Zeitpunkt der Ovulation ihre Vitalität aufrechtzuerhalten. Gleichzeitig kommt
es durch die Bindung zu einer Selektion intakter, befruchtungsfähiger Spermien und zu
einer Begrenzung der Spermienzahl am Befruchtungsort durch gezielte Loslösung
sowie zu einer Regulation der Hyperaktivierung und Kapazitation.
Unterschiedliche molekulare Strukturen sind an diesen zellulären Wechselwirkungen
beteiligt. So exprimiert das Epithel des weiblichen Genitaltraktes auf der
Zelloberfläche Oligosaccharidstrukturen, während auf der Spermienmembran
kohlenhydratbindende Proteine assoziiert vorliegen.
Am Aufbau der Oligosaccharidstrukturen ist Mannose beteiligt, hinsichtlich des
Rezeptorsystems der Spermatozoen gibt es bisher wenige Hinweise. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit sollte im porcinen Tiermodell daher die physiologische und
funktionelle Bedeutung von Ligand und Rezeptor näher untersucht werden.
Zu diesem Zweck wurden zunächst Seminalplasmaproteine aus porcinen Ejakulaten
isoliert. Nach der SDS-Poylacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und
anschließendem Western-Ligand-Blot erfolgte die Identifizierung
kohlenhydratbindender Proteine. Um zu klären, ob die identifizierten Proteine nach der
Dichtegradrientenzentrifugation mit Percoll weiterhin auf der Spermienmembran
Zusammenfassung
8080
assoziiert vorliegen, wurden Spermienextrakte angefertigt. Anschließend erfolgte die
Untersuchung der Spermienextrakte über SDS-PAGE und Western-Ligand-Blot auf
ihre Kohlenhydratbindungsfähigkeit. Zur Identifizierung der kohlenhydratbindenden
Proteine wurden die Spermienextrakte über reverse phase HPLC entwickelt und die
resultierenden Fraktionen der massenspektrosmetrischen Analyse zugeführt. Mit dem
Verfahren der Durchflusszytometrie wurden die kohlenhydratbindenden Eigenschaften
von Spermien-assoziierten Proteinen unter Kapazitationsbedingungen untersucht. Sie
wurden durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ergänzt. Mit dem Ziel die
in vivo Bedingungen zu imitieren, wurden kompetitive Hemmversuche mit den
Spermadhäsinen AQN-1 und AWN-2 in Explant-Assays durchgeführt.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt.
1. Die Seminalplasmaproteine des Ebers konnten isoliert und mittels
massenspektrometrischer Analyse als Spermadhäsine identifiziert werden.
2. Die Untersuchung des Spermienextraktes resultierte im Nachweis einer
Proteinbande mit 12 kDa. Über Massenspektrometrie wurde das Spermadhäsin
AQN-1 identifiziert.
3. Durchflusszytometrische Messungen unter Kapazitationsbedingungen zeigten in
einem Zeitraum von 30 Minuten einen massiven Verlust der
Mannosebindungsstellen auf den Spermatozoen sowie eine Zunahme der α- und
β-galaktosebindenden Strukturen.
4. In den fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen konnten mannosebindende
Strukturen im apikalen Bereich der Spermienköpfe ejakulierter,
percollgewaschener Spermien lokalisiert werden. Während des
Kapazitationsprozesses verschwanden die Mannosebindungsstellen völlig.
Zusammenfassung
8181
5. Im Explant-Assay konnte festgestellt werden, dass eine signifikante Hemmung
der Spermienbindung durch AQN-1 an das Oviduktepithel erreicht wird. Die
inhibitorische Aktivität von AQN-1 konnte mit einer IC 50 von 4,6 µM berechnet
werden. Bei der Verwendung verschiedener Modellzucker wurde die
Spermienbindung an das Oviduktepithel ausschließlich durch Mannopentaose
(Mannosylrest) inhibiert.
Die vorliegenden Daten verdeutlichen die besonderen
Kohlenhydratbindungseigenschaften von AQN-1 im weiblichen Genitaltrakt und
stützen die Vorstellung, dass AQN-1 als putativer Rezeptor die Bindung der Spermien
an das Oviduktepithel im Bereich des porcinen Spermienreservoirs vermittelt.
Summary
8282
7 Summary
Katrin Gohr: Identification of the receptor system involved in the interaction between
spermatozoa and epithelial cells of the porcine oviduct in vitro.
In higher mammals cell-cell-interactions within the female genital tract are of crucial
importance for a successful fertilisation. So far the molecular nature of the
orchestrating ligand and receptor molecules involved in this tightly regulated scheme
are neither identified nor characterised.
In the pig it is well documented that spermatozoa are bound to the epithelial layer of
the caudal isthmus of the oviduct, thus generating a reservoir of sperm cells and in
addition maintaining their vitality until the point of ovulation. Simultaneously, intact
and fertile spermatozoa are selected, a local restriction of the number of spermatozoa
is achieved by the mechanism of controlled release of adhered spermatozoa, and,
finally, the processes of hyperactivation as well as capacitation is initiated.
The surface molecules involved in the cellular interaction and recognition processes
differ with respect to their molecular structures. Whereas mannose residues containing
oligosaccharides are expressed on the surface of the epithelial cells of the female
genital tract, carbohydrate binding proteins are associated with the outer membrane of
spermatozoa. However, data detailing the nature of the receptor molecules attached to
the spermatozoa are rare. It was the aim of the present investigation to characterise
ligand and receptor molecules biochemically and to analyse their physiological and
functional role in the porcine model in greater detail.
Initially, seminal plasma proteins were isolated from porcine ejaculates. Following
size fractionation by electrophoresis in SDS-polyacrylamidgels (SDS-PAGE)
carbohydrate binding proteins were identified by Western blotting. Protein extracts
were obtained from spermatozoa centrifuged in a Percoll density gradient in order to
clarify whether these proteins are associated to the sperm membrane. Subsequently, by
SDS-PAGE and Western-blotting these extracts were tested for their capacity to bind
Summary
8383
carbohydrates. For further analysis, sperm protein extracts were run by reverse phase
HPLC and the resulting peak fractions exhibiting carbohydrate binding activity were
analysed by mass spectrometry. Flow cytometric techniques were used to measure
alterations of the carbohydrate binding activity of spermatozoa associated proteins
during the process of capacitation. These analyses were supplemented by fluorescence
microscopy. Using explant assays imitating in vivo conditions competitive inhibition
experiments were performed with the spermadhesins AQN-1 and AWN-2.
The following results were obtained:
1. Boar sperm seminal plasma proteins were isolated from ejaculates.
Subsequently, mass spectrometry resulted in the identification of spermadhesins.
2. Analysis of protein extracts isolated from spermatozoa by SDS-PAGE revealed
a protein of 12 kDa. After further analysis by mass spectrometry this protein was
identified as spermadhesin AQN-1.
3. Using the technique of flow cytometry a rapid decline of mannose binding sites
paralleled by an increase of binding sites for α- and β-galactose was observed within a
time period of 30 minutes after initiating the capacitation process of spermatozoa.
4. The data obtained by flow cytometric analysis are consistent with results
generated by fluorescence microscopy. Whereas mannose binding sites were localised
within the apical part of sperm heads of ejaculated and Percoll purified spermatozoa,
these mannose binding sites, however, disappeared completely during the capacitation
process.
5. In explant assays it was demonstrated that spermadhesin AQN-1 is able to
significantly. inhibit the binding of spermatozoa to the epithelial layer of the oviduct
Its inhibitory activity was estimated to be IC50 ~ 4,6 µM. Additionally, among the
various sugar compound tested herein only mannopentaose inhibited the binding of
spermatozoa to the epithelial layer of the oviduct.
These data show in detail the binding properties of spermadhesin AQN-1 for different
carbohydrates within the porcine female genital tract. Further, they strongly suggest
Summary
8484
that AQN-1 functions as a putative receptor mediating binding of spermatozoa to the
epithelial layer of the oviduct at the site of the sperm reservoir.
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Anhang
104104
9 Anhang
9.1 Rezeptverzeichnis
Percoll® -Lösungen (Sigma-Aldrich, P-1644, Deisenhofen), 35 % und 70 %
Zusammensetzung nach HARRISON et al. (1982)
1.) 10-fach konzentrierte Saline-Hepes-Stammlösung:
1,4 M Natriumchlorid
200 mM Hepes
90 mM Glucose
25 mM Kaliumhydroxid (1M KOH)
Alle Substanzen werden in 70 ml Aqua dest. gelöst und der pH-Wert auf 7,4
eingestellt. Danach wird mit Aqua dest. auf 100 ml Lösung aufgefüllt und der pH-
Wert bei 7,6 festgelegt. Die Stammlösung kann eingefroren gelagert werden.
2.) Lösung M
10,8 g der Saline-Hepes-Stammlösung werden sterilfiltriert und mit Aqua dest. auf
100 ml aufgefüllt. Zu dieser Lösung werden 250 µl Gentamycinsulfat in einer
Konzentration von 20 mg/ml hinzugegeben. Der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt und
die Osmolarität gemessen. Der Messwert wird als m in die Formel [ siehe 5.)]
eingesetzt (mOsm/kg ~ 295).
3.) Percoll®-Lösung in unverdünnter Form
Percoll ® sollte vor dem Messen der Osmolarität Raumtemperatur erreicht haben.
Der Messwert wird als p in die Formel [siehe 5.)] eingesetzt (mOsm/kg ~ 15).
Anhang
105105
4.) Lösung 1+9
5,4 g der Saline-Hepes-Stammlösung werden sterilfiltriert und mit 50,9 g unverdünnter
Percoll®-Lösung aufgefüllt. Die Osmolarität wird gemessen und der gemessene Wert
als dp in die Formel [siehe 5.)] eingesetzt (mOsm/kg ~ 350).
5.) Rechnung
I.) Oa = 0,1 x (10 m + 9 p)
= ~ 310
II.) R = [Oa - (0,1 x dp)] / (0,9 x dp)
= ~ 0,85
III.) Vp = (10 m - 295) / [R x (295 - p)]
= ~ 11
6.) Herstellung der Percoll®-Gebrauchslösungen
I. 100 %ige Percoll®-Gebrauchslösung:
= (Vp - 9) x 1,13 x 5 g Percoll® +Lsg. 1+9
=(Vp - 9) x 5,65 g Percoll®-Lösung + Lsg. 1 +9
Lösung vorsichtig schwenken
Osmolarität messen; Wert sollte bei~ 295 mOsm/kg liegen.
II. 35 %ige Percoll®-Gebrauchslösung:
•Eine Hälfte der 100 % igen Gebrauchslösung nehmen(= V1)
• Mit Lösung M auf V2 auffüllen
• V2 = V1 x 100 / 35
Lösung vorsichtig schwenken
III. 70 % ige Percoll®-Gebrauchslösung:
• andere Hälfte der 100 % igen Gebrauchslösung nehmen ( = V1 )
•Mit Lösung M auf V3 auffüllen
• V3 = V1 x 100 / 70
Lösung vorsichtig schwenken
Die hergestelltenGebrauchslösungen sind im Kühlschrank ungefähr 14 Tage haltbar.
Anhang
106106
9.1.1 Spermienextrakte
Extraktionspuffer/1 % Chaps:
10 mM Tris/HCl
10 % Saccharose
1 % SDS
1 mM PMSF
1 mM EDTA
1 % Chaps
OGP-(N-Octyl ß-D Glucopyranoside) Extraktionspuffer:
10 mM Tris/HCl
10 % Saccharose
2 % OGP
1 mM PMSF
1 mM EDTA
pH 7,2
Anhang
107107
Tab. 6: Polyacrylamidgele
18 % Trenngel:
10 ml
30 % Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe): 6,0 ml
1,5 M Tris/HCl pH 8,8: 2,5 ml
10 % SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe): 100µl
Aqua bidest.: 1,3ml
TEMED (Serva, Heidelberg): 4,0 µl
10 % Ammoniumpersulfat (Serva, Heidelberg) 100µl
4,5 % Sammelgel:
3 ml
30 % Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe): 0,5 ml
1,0 M Tris/HCl pH 6,8: 0,38 ml
10 % SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe): 30 µl
Aqua bidest.: 2,1 ml
TEMED (Serva, Heidelberg): 3,0 µl
10 % Ammoniumpersulfat (Serva, Heidelberg) 30 µl
Elektrodenlauf-Puffer:
25 mM Tris
192 mM Glycin
0,1 % SDS (w/v)
Anhang
108108
Laemmli-Auftragspuffer (nach LAEMMLI 1970):
50 mM Tris
2 % SDS (w/v)
10 % Glycerin
1 Spatelspitze Bromphenolblau
pH 6,8
Ponceaufärbelösung:
0,5 % Ponceau Rot (Roth, Karlsruhe) in 1 % Essigsäure
Blotting-Puffer:
0,039 M Glycin
0,048 M Tris
0,0375 % SDS (w/v)
20 % Methanol (v/v)
TBS/0,1 % Tween :
50 mM Tris/HCL
150 mM Na Cl
5 mM EDTA
0,025 % Sodiumazid
pH 7,4
Detektionspuffer:
0,1 M Tris
0,1 M Na Cl
pH 9,5
Anhang
109109
NBT-Lösung (Nitroblautetrazoliumchlorid) :
75 mg/ml NBT (Applichem, Darmstadt) in 70 % Dimethylformamid
BCIP-Lösung (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl Phosphat p-toluidine salt) :
50 mg/ml BCIP (Applichem, Darmstadt) in 100 % DMF
NBT/BCIP Farbreaktionslösung:
50 µl NBT-Lösung
40 µl BCIP-Lösung
20 ml Detektionspuffer
Coomassie Brilliant Blue-Färbung (CBB) :
2g/l Coomassie Blue R 250 (Serva, Heidelberg 35051)
0,5 g/l Coomassie Blue G 250
426 ml/ l Ethanol ( 96 %)
50 ml/ l Methanol
100 ml/ l Eisessig
CBB-Entfärbelösung:
20 % Methanol
10 % Eisessig
Anhang
110110
9.1.2 Durchflusszytometrie
Tyrode-Medium, mod. (Kapazitationsmedium):
Zusammensetzung nach HARRISON (1993)
96 mM NaCl
3,1 mM KCl
2,0 mM CaCl2
0,4 mM MgSO4 x 6 H2O
0,3 mM Na2PO4
5,0 mM Glucose
21,6 mM Na-Lactat
1,0 mM Na-Pyruvat
15 mM NaHCO3
20 mM Hepes
0,3 % BSA,
0,001 % Phenolrot
pH 7,4
9.1.3 Fluoreszenzmikroskopie
Paraformaldehydlösung:
5 g Paraformaldehyd auf 40 ml H2O (10 % ige Lösung) + 3 Tropfen 0,75 M NaOH zur
Lösung und auf 50 ml mit Aqua dest. Auffüllen.
Fixation mit 2 % Paraformaldehydlösung und 0,2 % Glutaraldehyd.
Stoppen mit 0,1 M Glycin
Anhang
111111
9.1.4 Explant-Assay
TALP-Medium (Tyrode-Albumin-Laktat-Pyruvat-Medium):
Zusammensetzung nach PARRISH et al. (1988)
Tab. 7: TALP-Medium
Substanz Stammlösung
(100 ml)
Gebrauchslösung (500 ml)
Menge der Stammlösung in ml
Natriumchlorid
NaCl
2,3 M 99 mM
21,7 ml
Kaliumchlorid
KCl
158 mM 3,1 mM
9,8 ml
Natriumhydrogencarbonat
NaHCO3
150 mM 15 mM
50 ml
Hepes 9,2 mM 5 ml
Natriumdihydrogenphosphat
NaH2PO4 x H2O
35 mM 0,35 mM
5 ml
Natriumlaktat 21,6 mM
Kalziumchlorid
CaCl2 x 2H2O
200 mM 2 mM
5 ml
Magnesiumchlorid
MgCl2 x 6H2O
100 mM 1,1 mM
5,5 ml
500 ml TALP-Medium werden auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, sterilfiltriert
und in 50 ml Portionen bei –20 °C eingefroren. Am Versuchstag werden nach dem
Auftauen zu einer 50 ml Portion TALP-Medium 500 µl Gentamycin (50 mg/ml), 55 µl
Natriumpyruvat (2,2 mg/ml) und 0,3 g Bovines Serum Albumin (Cohn`s Fraktion V)
hinzugegeben. Die Osmolarität der Gebrauchslösung liegt bei 280-320 mOsm/kg.
Anhang
112112
HBS-Puffer (Hepes-Buffered-Saline):
10 mM Glucose
20 mM Hepes
2,5 mM Kaliumhydroxid (1M KOH)
ph-Wert 7,5
TBS-Puffer (Tris buffered saline):
50 mM Tris
150 mM Natriumchlorid
pH-Wert 7,5
PBS-Puffer (Phosphat buffered saline):
150 mM Natriumchlorid
9,1 mM Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat
2,49 mM Kaliumdihydrogenphosphat
pH-Wert 7,4
Natriumchloridlösung 10 %:
1,7 M Natriumchlorid
1000 ml Aqua dest.
Formolcitrat :
modifiziert nach HANCOCK (1956)
37 %ige Formalinlösung
2,9 %ige Natriumcitratlösung , Mischungsverhältnis 1:24
Eidesstattliche Erklärung
113113
10 Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel:
Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro
zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell
selbstständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
1. Am Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
habe ich die Versuche mit dem im Kapitel Material und Methoden aufgeführten
Hilfen und Hilfsmitteln durchgeführt.
2. Die statistische Auswertung der Ergebnisse wurde nach Beratung mit und unter
Anleitung von Frau Dipl.-Phys. Dr. Anna Petrunkina unter Verwendung des
Statistikprogrammes SAS vorgenommen.
3. Die fachliche Beratung wurde von Frau Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda
Töpfer-Petersen und Frau Dr. rer. nat. Mahnaz Ekhlasi-Hundrieser – Institut für
Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover übernommen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in
Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:
- Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Eidesstattliche Erklärung
114114
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Katrin Gohr
Danksagung
115115
11 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei Frau Prof. Dr. Dr. Edda Töpfer-
Petersen für die Überlassung des interessanten Themas, die sehr freundliche
Aufnahme im Institut für Reproduktionsmedizin, die persönliche Betreuung und die
motivierende Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.
Mein besonderer Dank geht an Frau Dr. Anna M. Petrunkina für ihr Engagement und
ihre tatkräftige Unterstützung bei der statistischen Auswertung der entsprechenden
Versuchsteile.
Mein persönlicher und herzlichster Dank gilt Frau Dr. Mahnaz Ekhlasi-Hundrieser und
Frau Christiane Hettel ohne deren fachliche und persönliche Betreuung ich diese
Arbeit nicht hätte anfertigen können.
Bei allen Mitarbeitern des Institutes für Reproduktionsmedizin besonders bei Frau Dr.
Silja Ebeling, Frau Christine Kochel und Frau Bianca Oldendorf möchte ich mich für
die gute Zusammenarbeit und große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und
Fertigstellung der Arbeit bedanken.
Den Doktoranden des gesamten Instiutes, besonders Dr. Bettina von Rad,
Dr. Frank Magnus, Eyke Jebe, Erik Olaf Piehler und Gabi Volker danke ich für die
tatkräftige Unterstützung und die angenehme Arbeitsatmosphäre. Die mir
entgegengebrachte Freundlichkeit über die reine Zusammenarbeit hinaus und die
unterhaltsamen zusammen verbrachten Stunden werde ich in guter Erinnerung
behalten.
Mein ganz großer Dank gilt meinen Eltern für ihre Anteilnahme und bereitwillige
Unterstützung in jeglicher Form, die es mir ermöglichte, mein Studium und die
Promotion in dieser Form zu absolvieren.
Mein Dank gilt auch meinem Sohn Bastian, der mich während der Fertigstellung
dieser Arbeit oft ins Labor begleitet hat und viel Geduld bewiesen hat.
Schließlich und endlich danke ich der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die
Unterstützung des Projektes.