Aus der Klinik
für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
der Universität zu Lübeck
Direktor : Prof. Dr. med. K. Diedrich
Effekte des Gonadotropin-Releasing Hormon-Antagonisten Ganirelix
auf die cAMP-Produktion sowie die Steroidbiosynthese
humaner Granulosaluteinzellen
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
-Aus der Medizinischen Fakultät-
Vorgelegt von
Eva-Maria Gürke
aus Fulda
Lübeck 2003
Angefertigt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Lübeck
1.Berichterstatter : Prof. Dr. med. Olaf Ortmann
2.Berichterstatter :Prof. Dr. med. Olaf Hiort
Tag der mündlichen Prüfung : 20.09.2004
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 20.09.2004
gez. Prof. Dr. med. Peter Dominiak
-Dekan der medizinischen Fakultät-
1
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 3
1.1 Die neuroendokrine Kontrolle der Reproduktion 3
1.1.1 Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse 3
1.1.2 Die Steuerung der GnRH-Sekretion 4
1.1.3 Die Regulation des ovariellen Zyklus 5
1.1.4 Die ovarielle Steroidbiosynthese 7
1.2 Das Dekapeptid GnRH 9
1.3 Der GnRH-Rezeptor 10
1.3.1 Der hypophysäre GnRH-Rezeptor 11
1.3.2 Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors 14
1.3.3 Die Expression des GnRH-Rezeptors 17
1.3.4 Der ovarielle GnRH-Rezeptor 18
1.3.5 Der GnRH II-Rezeptor 20
1.4 GnRH-Analoga 22
1.4.1 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Agonisten 23
1.4.2 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Antagonisten 25
1.4.2.1 Der GnRH-Antagonist Ganirelix 26
1.4.3 Einsatz von GnRH-Analoga in der Reproduktionsmedizin 28
1.5 Signaltransduktionsmechanismen im Ovar 30
2 Problemstellung 36
3 Material und Methoden 38
3.1 Stimulationsmethode 38
3.1.1 Das lange Protokoll 38
3.1.2 Das Lübecker Protokoll 39
3.2 Patientinnen 40
3.3 Zellgewinnung und-präparation 41
3.3.1 Die Follikelpunktion 41
3.3.2 Die Granulosazellpräparation 41
2
3.4 Experimente mit humanen Granulosaluteinzellen 43
3.4.1 Genereller Versuchsaufbau 43
3.4.2 Experimentelles Design 44
3.5 Steroidassays 47
3.6 cAMP-Radioimmunoassay 47
3.7 Datenpräsentation und Statistik 48
4 Ergebnisse 49
4.1 Patientinnencharakteristika 49
4.2 Effekte der in-vivo-Behandlung mit GnRH-Analoga
auf die Steroidbiosynthese kultivierter humaner Granulosaluteinzellen 49
4.3 Effekte der in-vitro-Behandlung von GnRH-Analoga
auf die Steroidbiosynthese kultivierter humaner Granulosaluteinzellen 53
4.4 Effekte der in-vitro-Gabe von GnRH-Analoga auf die
cAMP-Akkumulation kultivierter humaner Granulosaluteinzellen 56
5 Diskussion 59
5.1 Wirkung der GnRH-Analoga auf die Steroidbiosynthese 59
5.2 Wirkung der GnRH-Analoga auf die cAMP-Produktion 66
6 Zusammenfassung 70
7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen 72
8 Literaturverzeichnis 74
9 Danksagung 93
10 Lebenslauf 94
3
1 Einleitung
1.1 Die neuroendokrine Kontrolle der Reproduktion
1.1.1 Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse
Die Steuerung reproduktiver Funktionen unterliegt einem komplexen Regelkreissystem,
welches auf dem funktionellen Zusammenspiel zwischen Ovar, Adenohypophyse und
Hypothalamus basiert. Durch die permanente gegenseitige Kontrolle und Beeinflussung
aller beteiligten Zentren läßt sich eine perfekt aufeinander abgestimmte Steuerung
realisieren.
Knobil erläuterte zu Beginn der 80er Jahre in mehreren Arbeiten die zentrale Bedeutung
des Gonadotropin-Releasing Hormons (GnRH) für die physiologische Ovarialfunktion bei
Primaten (Knobil, 1980 und 1981). Es gilt als gesichert, daß Impulse aus höheren Zentren
des zentralen Nervensystems unter Mitbeteiligung von Neurotransmittern sowie
opioidähnlich wirkenden Peptiden die Freisetzung des GnRH steuern. Das in den
hypothalamischen Kerngebieten Nucleus arcuatus und Nucleus paraventricularis durch
sog. Neuroaxone synthetisierte Neuropeptid GnRH wird in einem pulsatilen
Sekretionsmodus im Abstand von Minuten bis wenigen Stunden freigesetzt (Knobil, 1990).
Den Pfortaderkreislauf der Hypophyse erreicht GnRH über den aus den Axonen der
hypothalamischen Neuronen gebildeten Tractus infundibularis, der den Hypophysenstiel
durchzieht und somit eine Verbindung zwischen Hypothalamus und Hypophyse herstellt
(Fink, 1988). Im Bereich des Hypophysenvorderlappens, der Adenohypophyse, bindet
GnRH an spezifische Rezeptoren. Dieser Vorgang bewirkt die Freisetzung der
Gonadotropine Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikelstimulierendes Hormon (FSH)
aus den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse. Die sezernierten Gonadotropine
fungieren als hormonale Botenstoffe in extrahypophysären Organen. Sie regulieren über
die Bindung an spezifische Rezeptoren die Funktion der Ovarien. Zu ihren Aufgaben
zählen die Steuerung des Gonadenwachstums und der Gametogenese
(Follikelreifung/Spermatogenese). Sie sind auch an der Bildung und Sekretion der in der
Nebennierenrinde produzierten Steroide mitbeteiligt (Counis und Justiz, 1991; Conn,
1994). Zusätzlich ist das Ovar in der Lage, die übergeordneten Zentren Hypothalamus und
Hypophyse zu beeinflussen. Durch die sowohl vom Follikel als auch vom Corpus luteum
4
sezernierten Hormonprodukte Östradiol und Progesteron werden diese im Sinne eines
positiven bzw. negativen Feedbackmechanismus reguliert. Auf dieser Rückkopplung
basiert der Verlauf der Gonadotropinsekretion während des normalen Menstruationszyklus
der Frau.
Gehirn
Hypothalamus
GnRH Inhibition
(Stimulation)
Adeno-
hypophyse
Östrogene FSH / LH
Gestagene (Stimulation)
(Inhibition +
Stimulation)
Ovar
Östrogene /
Gestagene
weibl. Geschlechtsorgane
(Mamma, Uterus, Vagina)
Abb. 1: Die Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse
1.1.2 Die Steuerung der GnRH-Sekretion
Das Zusammenspiel der GnRH-Konzentration im hypothalamo-hypophysären
Portalkreislauf, die Frequenz der GnRH-Freisetzung und die Anzahl der GnRH-Rezeptoren
auf den gonadotropen Zellen des Hypophysenvorderlappens wirkt regulatorisch auf die
Sekretion des GnRH (Knobil 1981, 1990).
5
Die Freisetzung des GnRH erfolgt pusatil, d.h. in periodischen Abständen, durch einen
Impuls aus dem hypothalamischen Nucleus arcuatus. Der dort lokalisierte Impulsgeber
setzt sich aus der funktionellen Verschaltung verschiedener Bezirke zusammen, die in ihrer
Gesamtheit den sog. GnRH-Pulsgenerator bilden (Knobil, 1990; Stojilkovic et al., 1994).
Der Name dieser hypothalamischen Region beschreibt ihre Fähigkeit, durch synchron
erzeugte elektrophysiologische Aktivität den Stimulus für die Sekretion von GnRH zu
bilden (Knobil, 1990). Die Frequenz der GnRH-Freisetzung wird von einer Reihe
unterschiedlicher Faktoren beeinflußt. Die Steuerung der Impulsdauer wird vornehmlich
über den Serumspiegel der Sexualsteroidhormone reguliert: Während sie bei Frauen in der
Reproduktionphase aufgrund der Östradiolwirkung etwa 1-3 Minuten beträgt, ist sie in der
Postmenopause und nach Ovarektomie auf ca. 20 Minuten verlängert (Knobil, 1990). Auch
äußere Einflüsse bedingen die Pulsfrequenz: So ist sie aufgrund der Lichteinwirkung
tagsüber höher als während der Nacht (Rossmanith und Lauritzen, 1991). Desweiteren
unterscheiden sich die Abstände zwischen zwei Sekretionsimpulsen in den Phasen des
Menstruationszyklus: In der Follikelphase führt der überwiegende Östradioleinfluss alle
1-2 Stunden zu einer GnRH-Freisetzung, wohingegen die Pulsationen in der
progesterongeprägten Lutealphase nur etwa alle 2-5 Stunden erfolgen (Manesh und
Muldoon, 1987; Knobil, 1990). Hungerzustände (z.B. bei Anorexia nervosa), physischer
wie emotionaler Streß und starkes körperliches Training wirken sich hemmend auf die
GnRH-Sekretion aus (Knobil, 1990).
1.1.3 Die Regulation des ovariellen Zyklus
Der etwa 28 Tage umfassende Zyklus der geschlechtsreifen Frau kann in eine Follikel-und
eine Lutealphase unterteilt werden. In der Zyklusmitte um den 14. Tag findet der Eisprung
statt. In der Follikelphase bewirkt Östradiol zunächst eine Supression der
Gonadotropinausschüttung (negativer Feedback), welche aber mit zunehmender
Steroidhormonproduktion in einen stimulierenden Effekt umgewandelt wird (positiver
Feedback). Der Anstieg der Gonadotropinsekretion kulminiert in der Mitte des Zyklus im
sog. LH-Gipfel (LH-Peak), woraufhin die Ovulation induziert wird. Das vom Corpus
luteum in der zweiten Zyklusphase, der Lutealphase, sezernierte Progesteron wirkt
hemmmend auf die Gonadotropinausschüttung (negativer Feedback). Knobil erkannte
6
1980 den zyklischen Verlauf der Gonadotropinsekretion als essentielle Voraussetzung für
die Entwicklung befruchtungsfähiger Oozyten. Die beschriebenen Feedbackmechanismen
regulieren den Menstruationszyklus auf hypothalamischer sowie hypophysärer Ebene,
allerdings ist die direkte Beeinflussung der gonadotropen Zellen der Adenohypophyse von
zentraler Bedeutung für die Funktion des Regelkreises (Ortmann et al., 1988, 1989 a, 1989
b, 1990).
In der Follikelphase induziert FSH die Bildung von Östradiol aus Androgenen durch
aromatisierende Enzyme, stimuliert zusammen mit Östradiol die Ausbildung von FSH-
Rezeptoren und sorgt für eine gesteigerte Granulosazellproliferation. Ebenso unterstützt
eine verstärkte Angiogenese das Wachstum des Follikels. Aufgrund der ständig
zunehmenden Granulosazellzahl kommt es ab etwa dem 7. Zyklustag zu einem raschen
Anstieg des Östradiolspiegels, der unmittelbar vor der Ovulation sein Maximum erreicht.
Der präovulatorische LH-Anstieg wird durch Östradiolkonzentrationen jenseits eines
bestimmten Schwellenwertes ausgelöst. Dieser Wert liegt bei etwa 150 pg/ml und muß
über mindestens 36 Stunden aufrecht erhalten werden. Neben der ovulationsinduzierenden
Wirkung sorgt der mittzyklische LH-Gipfel (LH-Peak) auch für die Luteinisierung des
Leitfollikels. Damit führt er zu einer funktionellen und strukturellen Umwandlung der
Granulosa- und der Thekazellen, um wichtige Vorraussetzungen für eine mögliche
Konzeption und eine folgende Implantation zu schaffen. Essentieller Bestandteil der
Lutealphase ist die verstärkte Progesteronsekretion, die im Vergleich zur Follikelphase um
das 10-20-fache erhöht sein kann. Der Serumspiegel beträgt während der Follikelphase ca.
0,5-1 ng/ml, steigt jedoch in der Lutealphase auf Werte zwischen 10 und 20 ng/ml. Dieser
deutliche Progesteronanstieg beginnt bereits vor der Ovulation und ist mitverantwortlich
für den steilen präovulatorischen LH-Anstieg, welcher seinerseits die Empfindlichkeit der
Granulosa-und Thekazellen für LH steigert (Ortmann et al., 1989 a, 1989 b). Aufgrund der
Progesteronwirkung ist die hypothalamische GnRH-Ausschüttung während der
Lutealphase des Zyklus vermindert (Knobil, 1990).
Das kennzeichnende Phänomen in der Lutealphase ist die Bildung des Corpus luteum. Es
besteht aus eine Reihe verschiedener Zelltypen, die sich unter Progesteroneinfluß von
Granulosa-und Thekazellen ableiten. Unter der Einwirkung von FSH synthetisieren die
großen Luteinzellen Östradiol, die kleinen Luteinzellen unter dem Einfluß von LH
Progesteron und Androgene. Das Corpus luteum atrophiert nach etwa 10-12 Tagen zum
7
Corpus albicans, falls die anhaltende, auf eine Empfängnis folgende hormonelle
Stimulierung durch das humane Choriongonadotropin (HCG) ausbleibt. Das im
Trophoblast gebildete HCG, ein Hormon mit LH-ähnlicher Wirkung, stimuliert das Corpus
luteum gravidate zu einer vermehrten Steroidbiosynthese und wirkt damit dem nach
ausgebliebener Konzeption typischen prämenstruellen Abfall von Östradiol und
Progesteron entgegen. Tritt keine Konzeption ein, kommt es zur Lyse des Progesteron-
produzierenden Corpus luteum. Der damit abfallende Progesteronspiegel löst die
Menstruation aus.
Abb. 2: Sexualhormonspiegel im ovariellen Zyklus
1.1.4 Die ovarielle Steroidbiosynthese
Die Zwei Kompartiment-/ Zwei Hormon-Theorie
Im Ovar bilden Granulosa- und Theka-interna-Zellen zwei verschiedene
Funktionseinheiten, die jedoch im Bereich der Steroidbiosynthese eng miteinander
kooperieren. Räumlich durch eine Basallamina getrennt sind beide Zelltypen an der
Produktion der ovariellen Sexualsteroide beteiligt. Unter der Stimulation von FSH bilden
und sezernieren die Granulosazellen Steroidhormone, die Theka-interna-Zellen werden
durch LH zur Steroidproduktion und- ausschüttung angeregt. Dabei sind beide
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
100
200
300
LH [mIE/ml]
FSH [mIE/ml]
Östradiol
Progesteron
0
10
20
30
40
50
[pg/ml]
[ng/ml]
Zyklustag
Östrad
io
l
LH
/F
SH
/P
ro
ge
stero
n
8
Produktionsstätten voneinander abhängig, um einen reibungslosen Ablauf der Synthese
gewährleisten zu können. In den Theka-interna-Zellen werden durch LH-Induktion
Cholesterinester hydrolysiert, um in mehreren Zwischenschritten über Pregnenolon und
17α-OH-Pregnenolon Dehydroepiandrosteron zu erhalten. Aus diesem Ausgangsprodukt
entstehen die Androgene Androstendion und Testosteron. Da die Granulosazellen zur de
novo-Androgensynthese nicht in der Lage sind, diese aber die essentielle Vorstufe des
Östradiols darstellen, ist die Diffusion der Androgene aus der Thekazellschicht
erforderlich. In den Granulosazellen angelangt werden die Androgene mittels eines
speziellen Enzymsystemkomplexes - des Aromatase-Systems- in Östrogene überführt
(Gore-Langton et al., 1988; Adashi, 1991). Androstendion wird dabei entweder direkt
durch das Aromatase-System in das biologisch weniger aktive Östrogen Östron
umgewandelt oder zunächst über den durch die 17-β- Hydroxylase katalysierten
Zwischenschritt in Testosteron überführt. Unter Aromataseeinwirkung erfolgt anschließend
die Umwandlung von Testosteron in Östradiol.
9
Acetyl-CoA
Zwischenprodukte
Cholesterin
20, 22-
Desmolase
Pregnenolon Progesteron
17 α- 17 α-
Hydroxylase Hydroxylase
3 α -ol-
17 α-OH- Dehydro- 17 α-OH-
Pregnenolon genase/ Progesteron
17, 20- ∆ 4,5- Iso- 17, 20-
Desmolase merase Desmolase
Dehydroepi- Androstendion Östron
androsteron 17 β- Aromati-
Hydroxylase sierendes
Theca interna System
Testosteron Östradiol
Zona granulosa
Abb. 3: Die Zwei-Kompartiment-Theorie
Die Regulation der Steroidbiosynthese
In beiden Zellkompartimenten wird die Steroidbiosynthese via Feedback-Mechanismen
reguliert: Der von den Granulosazellen sezernierte Insulinähnliche Wachstumsfaktor-II
(insulin like growth factor-II [IGF-II]) wirkt in Kombination mit FSH verstärkend auf die
Aromataseproduktion. Ebenfalls durch FSH stimuliert fördert ein weiteres ovarielles
Enzym, das Inhibin, in Verbindung mit LH die Androgenproduktion in den Theka-interna-
Zellen. Somit führen bereits kleine Mengen von LH aufgrund der Wirkungsverstärkung
von Inhibin zu einer deutlich ansteigenden Androgensynthese. Die daraufhin sezernierten
und in das Granulosazellkompartiment diffundierten Androgene können außerdem
suffizient durch das IGF-I unterstützte Aromatase-System in Östradiol überführt werden
(Chappel und Howles, 1991).
1.2 Das Dekapeptid GnRH
10
Das native Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH) ist ein im Gebiet des
hypothalamischen Nucleus arcuatus gebildetes Dekapeptid. 1971 konnte das auch als
luteinisierendes Hormon-Releasing Hormon (LH-RH) bezeichnete Peptid von zwei
unabhängig voneinander arbeitenden Gruppen isoliert und charakterisiert werden (Burgus,
1971; Matsuo, 1971).
Das aus einer Sequenz von 10 Aminosäuren bestehende GnRH besitzt eine
Pyroglutaminsäure am N-terminalen Ende der Peptidkette und hat ein Molekulargewicht
von 1181 Dalton.
Die einzelnen Aminosäuren des GnRH-Moleküls haben unterschiedliche Funktionen, die
teilweise entschlüsselt werden konnten: Für die Rezeptorbindung und die räumliche
Struktur sind die Positionen 1, 6 und 10 verantwortlich. Die Positionen 2 und 3 spielen die
wesentliche Rolle bei der Regulation der Gonadotropinfreisetzung. Die enzymatische
Inaktivierung des Dekapeptids wird über die Position 6 vermittelt, indem sie den
Angriffspunkt für die Endopeptidase darstellt (Clayton und Catt, 1981).
11
pGlu-His-Trp-Ser-Ty-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Abb. 4: Aminosäuresequenz von GnRH
Die biologische Halbwertszeit von GnRH beträgt 2-10 Minuten und ist damit relativ kurz.
Dadurch ist der Hypothalamus in der Lage, GnRH pulsatil als Reaktion auf positive
Feedbackmechanismen zu sezernieren. Für die enzymatische Inaktivierung des
Dekapeptids sorgen spezifische Peptidasen. Die auf diesem Wege entstehenden
Abbauprodukte werden renal eliminiert.
Nach Sezernierung in das hypophysäre Pfortadersystem bindet es an spezifische
Rezeptoren, die von den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse exprimiert werden.
Aufgrund von Sensibilisierung bzw. Desensibilisierung steuert GnRH die Zahl seiner
eigenen Rezeptoren, indem kontinuierliche GnRH-Spiegel über Transmitter vermittelte
Signaltransduktion zu einer Verringerung der Rezeptorzahl führen, dagegen die pusatile
Freisetzung von GnRH ein vermehrtes Rezeptorangebot zur Folge hat.
1.3 Der GnRH-Rezeptor
In der neuroendokrinen Kontrolle der Reproduktion stellt der Gonadotropin- Releasing
Hormon-(GnRH) Rezeptor eine zentrale Schaltstelle dar.
Durch die Bindung des im Hypothalamus gebildeten GnRH an seinen spezifischen
Rezeptor der gonadotropen Zellen im Hypophysenvorderlappen reguliert das GnRH die
Synthese und Freisetzung der Gonadotropine FSH und LH (Knobil, 1981).
Neben den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse konnte die Genexpression des
GnRH-Rezeptors außerdem in verschiedenen extrahypophysären Geweben nachgewiesen
werden. So wird er in den Granulosazellen des Ovars, in den Leydig-Zellen des Hodens, in
Plazenta und Prostata, in hippokampalen Zellen sowie in den GnRH sezernierenden Zellen
des Hypothalamus exprimiert (Clayton und Catt, 1981; Ban et al., 1990; Kakar et al.,
1992).
12
1.3.1 Der hypophysäre GnRH-Rezeptor
Aufgrund seiner Bedeutung für die normale Reproduktionsfunktion sowie für
Therapieansätze benigner und maligner Prozesse ist der GnRH-Rezeptor hinsichtlich
seiner Ausbildungorte, der molekularbiologischen Struktur und seiner biochemischen
Eigenschaften eingehend untersucht worden.
Strukturaufklärung
Der humane GnRH-Rezeptor zählt zur Familie der G-(GTP-bindendes) Protein
gekoppelten Rezeptoren (Sealfon et al., 1997). Er ist somit seiner Primärstruktur nach ein
Glykoprotein mit charakteristischerweise sieben Transmembran-Domänen neben
extrazellulär gelegenen hydrophilen Anteilen. Allerdings fehlt das für andere G-Protein
gekoppelten Rezeptoren typische lange intrazelluläre Carboxylende. Dieser
Strukturbestandteil ist an der Desensibilisierung und reduzierten Synthese der Rezeptoren
beteiligt (Dohlmann et al., 1991).
Zunächst konnte ein muriner GnRH-Rezeptor-Klon isoliert werden, indem die messenger
RNA (mRNA) einer gonadotropen Zellinie von Mäusen (alpha-T3-1-Zellen) benutzt
wurde (Tsutsumi et al., 1992). Die isolierte komplementäre DNA (cDNA) des GnRH-
Rezeptors der Maus diente nun als Sonde für die Clonierung der cDNA verschiedener
anderer Spezies. So ergab sich mit Hilfe markierter Oligonukleotide und der
Polymerasekettenreaktion auf Grundlage der Mäusesequenz die cDNA der Ratte (Eidne et
al.,1992; Kaiser et al.,1992) und später dann auch die menschliche cDNA-Sequenz (Kakar
et al., 1992; Chi et al., 1993). Die bisher isolierten Säugetier-GnRH-Rezeptoren weisen ein
hohes Maß an Homologie bezüglich ihrer Sequenz auf. Unterschiedlich ist jedoch die
molekulare Größe. Die cDNA des Nagetier-GnRH-Rezeptors codiert für 327 Aminosäuren
(AS), die humane cDNA für 328 AS (Conn, 1994; Stojilkovic et al., 1994; Kaiser et al.,
1997). Das errechnete Molekulargewicht beträgt 37,684 (Stojilkovic et al., 1994).
Internalisierung
Im Anschluß an die Bindung des GnRH-Moleküls an seinen Rezeptor wird der gesamte
Ligand-Rezeptor-Komplex durch eine rezeptorvermittelte Endozytose in die Zelle
aufgenommen. Die Internalisierung ist jedoch nicht essentielle Voraussetzung für die
Sekretion der Gonadotropine, ebenso erfolgt die Desensibilisierung der Zelle für GnRH
13
unabhängig von der Internalisierung des Rezeptorkomplexes. Dort erfolgt daraufhin die
Dissoziation des Komplexes (Hopkins und Gregory, 1977; Naor et al., 1981; Suarez-
Quinan et al., 1986).
Abb. 5: Struktur des humanen GnRH-Rezeptors. Die bekannten Glykosilierungsorte
(Y), die PKC-assoziierten Phosphorylierungsstellen (∗) und die Cysteinreste in
den extrazellulär verlaufenden Rezeptoranteilen (t) sind markiert.
(Kakar et al, 1992)
Extrazellulärer Bereich
Intrazellulärer Bereich
14
Desensibilisierung des GnRH-Rezeptor
Ein wichtiger Aspekt im Wirkmechanismus der GnRH-Agonisten ist der
Desensibilisierungs-Prozeß des Rezeptors. Werden die gonadotropen Zellen der
Adenohypophyse ununterbrochen hohen Dosen des nativen GnRH ausgesetzt, verringert
sich die zelluläre Reaktion auf eine sich anschließende erneute Stimulation mit GnRH.
Dieses Phänomen, auch als homologe Desensibilisierung bezeichnet, führt zu einer
verminderten Ausschüttung von Gonadotropinen und ist damit als der primär wirksame
Effekt der GnRH-Agonisten anzusehen. Allerdings ist der genaue Funktionsmechanismus
der homologen Desensibilisierung noch nicht bekannt.
Viele der G-Protein gekoppelten Rezeptoren sind durch einen schnellen
Desensibilisierungsprozeß gekennzeichnet, der die Dissoziation des Rezeptors vom
gekoppelten Proteinkomplex mit der dadurch angestoßenen Signaltransduktionskaskade
beinhaltet (Hausdorff et al., 1990). Als hauptverantwortlich für das Anstoßen des
Desensibilisierungsprozesses haben sich neben dem Carboxylende auch die dritte
intrazellulär verlaufende Schleife der Rezeptoren gezeigt. Allerdings fehlen beide
Elemente in der Struktur des GnRH-Rezeptors (Kaiser et al., 1997, Sealfon et al., 1997).
Daher könnte eine Erklärung für die schnelle Desensibilisierung des GnRH-Rezeptors
durch GnRH in einer verminderten Mobilisation von Calciumionen begründet sein. So
konnte eine Arbeitsgruppe um Anderson 1995 nachweisen, daß weder die Rezeptoranzahl
noch die Entkopplung des Rezeptors vom Proteinkomplex eine wesentliche Rolle im
Desensibilisierungsprozeß zu übernehmen scheint. Dagegen stellten sie eine geringfügig
verminderte Produktion von Inositolposphat fest. Eine andere Forschergruppe wies später
eine über GnRH-vermittelte down regulation der Inositoltrisphosphat assoziierten
Rezeptoren sowie den Rückgang der durch GnRH ausgelösten Calciumionen-Mobilisation
nach (Willars et al., 2001).
Dagegen wird die auf einer längeren Einwirkzeit von GnRH basierende homologe
Desensibilisierung unter Einbeziehung der Proteinkinase C-Signaltransduktion reguliert.
Die Rückregulierung des raschen Calciumionen-Einstroms ist im direkten Vergleich zur
Produktion von Inositoltrisphophat sehr viel schneller steuerbar. Es ist bekannt, daß hohe
Dosen von GnRH oder eines GnRH-Agonisten zu einer Verminderung der Rezeptoranzahl
führen, ohne einen direkten Einfluß über eine Veränderung der Rezeptoraffinität
15
auszuüben. Daher könnte dieser Mechanismus zum Teil der Langzeitregulierung der
homologen Desensibilisierung zu Grunde liegen.
Abschließend ist festzuhalten, daß bekannterweise eine veränderte Anzahl von GnRH-
Rezeptoren unabhängig von einer veränderten Bereitschaft der gonadotropen Zelle der
Adenohypophyse, auf den GnRH-Stimulus zu reagieren, funktioniert. Deshalb ist davon
auszugehen, daß in den Desensibilisierungsprozeß am GnRH-Rezeptor mehrere
zusätzliche Mechanismen wie beispielsweise die Entleerung der gonadotropen
Rezeptorspeicher nach anhaltender Exposition mit einem GnRH-Agonisten involviert sind
(Conn and Crowley, 1991, Stojilkovic et al., 1994, Kaiser et al., 1997).
1.3.2 Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors
Für die Steroidhormone Östradiol und Progesteron stellt die Plasmamembran kein
Hindernis dar. Sie überwinden mit Hilfe ihres hydrophoben Aufbaus die
Phospholipidschichten der Membran und binden an zytoplasmatische Rezeptoren.
Hydrophile Botenstoffe wie das Dekapeptid GnRH binden dagegen an Rezeptoren, welche
sich in der Zellmembran befinden, da es ihnen aufgrund ihrer biochemischen
Beschaffenheit nicht möglich ist, die hydrophoben Schichten der Zellmembran selbst zu
durchdringen. Der GnRH-Rezeptor löst nach der Bindung eines Liganden verschiedene
Signaltransduktionskaskaden aus. Über die an ihn gekoppelten G-Proteine aktiviert der
Rezeptor unterschiedliche Enzymsysteme, die zu einer vermehrten Bildung sog. ‘second
messenger’ führen. Diese zweiten Boten sind nun wiederum für die Aktivierung inaktiver
Enzyme verantwortlich. Am Ende dieser Regulierungskette steht das eigentliche Ziel der
Ligandenbindung: Eine verstärkte oder verminderte Transkriptionsaktivität bestimmter
Gene und damit die Induktion oder Repression der RNA-Synthese bzw. der
Proteinbiosynthese. Auf diesem Weg nimmt GnRH beispielsweise Einfluß auf die
hypophysäre Gonadotropinsynthese und -sekretion.
Die Bindung von GnRH an seinen Rezeptor resultiert in einer Konformationsänderung der
Rezeptoranteile. Dies ermöglicht eine Interaktion mit den assoziierten G-Proteinen, wobei
es zum Austausch eines Guaninnukleotids innerhalb der α-Untereinheit des jeweiligen G-
16
Proteins kommt. Eine damit zusammenhängende Neuordnung der G-Protein-
Untereinheiten sorgt für die Aktivierung zugeordneter Zwischenschritte.
Andere Effektorsysteme werden aktiviert, um die Bildung weiterer Substanzen als ‘second
messenger’ zu ermöglichen. Um eine optimale Synthese- und Sekretionsleistung der Zelle
zu gewährleisten, scheinen diese Kaskaden untereinander verknüpft zu sein (Conn, 1994;
Stojilkovic et al., 1994; McArdle und Counis, 1996).
Hsieh und Martin zeigten 1992 eine primäre Aktivierung der Phospholipase C (PLC) durch
einen bestimmten Teil der alpha-Untereinheit (G alpha q/11) des Rezeptors. Nachfolgend
hydrolisiert das membrangebundene Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2).
Katalysator dieser Reaktion ist die Phospholipase C. Als Produkte der Hydrolyse entstehen
Inositol-1,4,5-Trisphosphat (InsP3) und Diazylglyzerol (DAG). Beide führen nun in ihrer
Aufgabe als ‘second messenger’ zur Aktivierung anderer Bestandteile der
Signaltransduktionskaskade (Hsieh und Martin, 1992). So bewirkt InsP3 eine rasche
Freisetzung von intrazellulär gespeicherten Ca 2+
-Ionen, welche hauptsächlich an der
frühen Zellantwort beteiligt sind (Conn et al., 1995). DAG sorgt auf den GnRH-Stimulus
hin durch die Aktivierung der Proteinkinase C für eine länger anhaltende Zellantwort
(Shah und Milligan, 1994; Stanislaus et al., 1997).
Unter den im Zusammenhang mit der GnRH-Rezeptor-Bindung aktivierten
Phospholipasen stellt die PLC die hauptsächlich involvierte Phospholipase dar, jedoch gibt
es Hinweise auf eine Mitbeteiligung der Phospholipasen A2 und -D sowie auch der
Mitogenaktivierten Protein-(MAP) Kinase (Stojilkovic et al., 1994; Sim et al., 1995).
Letztere führen sehr wahrscheinlich zu einem Anstieg der als second messenger
agierenden zyklischen Nukleotide cAMP und/oder cGMP (Conn et al., 1979). Die
zugrunde liegenden Mechanismen sind in ihrer Gesamtheit noch nicht vollständig
aufgeklärt. Durch eine Veränderung der Rezeptordichte an der Plasmamembran der
gonadotropen Zellen wird die Synthese sowie auch die Ausschüttung der Gonadotropine
gesteuert (Conn et al., 1995). Diesem Effekt liegen zu einem großen Teil
Regulationsvorgänge auf Ebene der Transkription zu Grunde (Bauer-Dantoin et al., 1993;
Brooks et al.,1993).
Ein wichtiger second messenger mit zentraler Funktion innerhalb vieler
Signaltransduktionswege ist das zyklische 3’, 5’-Adenosinmonophosphat (cAMP). Es wird
17
unter Einwirkung der Adenylatcyclase aus Adenosintriphosphat (ATP) gebildet, wobei die
Aktivierung der Adenylatcyclase wiederum durch eine Konformationsänderung der G-
Protein-Untereinheiten des Rezeptors bewirkt wird. Das synthetisierte cAMP überführt ein
weiteres intrazelluläres Regulator-Enzym, die Proteinkinase A (PKA) in seine aktive Form.
Die PKA unterstützt als Katalysator die Phosphorylierung unterschiedlicher
zytoplasmatischer und nukleärer Proteine. Das Ziel aller Zwischenschritte der cAMP-
gesteuerten Signaltransduktion ist ebenfalls die Ebene der Transkription. Dort beeinflußt
der ‘second messenger’ cAMP letztendlich das Ablesen bestimmter Gene über cAMP-
induzierte Promoterregionen (Sassone-Corsi, 1995).
GnRH-Rezeptor
G Protein
Aktivierung der Aktivierung der
Phospholipase C Adenylatcyclase
Hydrolyse des
Phosphatidylinositol-
4-5-biphosphonat (PIP2)
cAMP-Bildung
Bildung von Bildung von aus ATP
Inositol-1,4,5 Diacyl-
-trisphosphat glycerol
(INSP3) (DAG)
Mobilisierung Aktivierung Aktivierung der
intrazellulärer von Proteinkinase A
Ca2+
-Ionen Proteinkinase C
Phosphorylierung verschiedener
zytoplasmatischer und nukleärer Proteine
Regulierung der Zellantw ort durch
Steuerung der Genexpression auf
Transkriptionsebene
Abb. 6: Signaltransduktionswege am GnRH-Rezeptor
18
Auch für die Befehlsübermittlung am GnRH-Rezeptor scheint cAMP von großer
Bedeutung zu sein. So konnte unter Einwirkung von cAMP sowohl eine vermehrte
Genexpression und Synthese von Gonadotropinanteilen als auch eine stärkere Freisetzung
von FSH und LH gesehen werden (Ishizaka et al., 1993; Haisenleder et al., 1994).
Delahaye et al. zeigten in Insektenzellen, die mittels eines Baculovirus mit dem Ratten-
GnRH-Rezeptor transfiziert worden waren und diesen exprimierten, die Aktivierung der
Adenylatcyclase und einen raschen Anstieg der cAMP-Bildung in Anwesenheit von
GnRH. Ebenso kam es durch den GnRH-Stimulus zu einem dosisabhängigen Anstieg der
Inositoltrisphosphat-Produktion. Folglich scheint der Ratten-GnRH-Rezeptor die Fähigkeit
zu besitzen, beide Signaltransduktionskaskaden zu aktivieren (Delahaye et al., 1997).
In kultivierten Rattenhypophysenzellen gelang es, für cAMP und verwandte Substanzen
einen GnRH-ähnlichen Effekt nachzuweisen. Die Anzahl der GnRH-Rezeptoren stieg nach
Gabe der ‘second messenger’ deutlich an, eine vergleichbare Reaktion der gonadotropen
Zellen ist nach GnRH-Stimulation bekannt. Diese Beobachtungen legten die Vermutung
nahe, daß cAMP GnRH-typische Wirkungen imitieren und somit eine Rolle in der
Regulation des GnRH-Rezeptors spielen könnte (Young et al., 1984 und 1985). Dafür
spricht auch der Nachweis erhöhter cAMP-Spiegel in den gonadotropen Zellen nach
GnRH-Gabe (Borgeat et al., 1972; Bourne, 1988).
1.3.3 Die Expression des GnRH-Rezeptors
Des weiteren zeigten verschiedene Studien die bedeutende Rolle von GnRH innerhalb der
Regulation seiner eigenen Rezeptorzahl auf. Es konnte nachgewiesen werden, daß die
GnRH-Rezeptorzahl (Conn et al.,1995) und die Menge gebildeter GnRH-Rezeptor-mRNA
(Bauer-Dantoin et al., 1993; Brooks et al., 1993) während des Menstruationszyklus
biphasischen Veränderungen (up-bzw. down-regulation) unterworfen ist. Ebenso verändert
sich in diesem Zusammenhang die Ansprechbarkeit der gonadotropen Zellen in der
Hypophyse auf GnRH, was zu unterschiedlichen Gonadotropinspiegeln im Serum führt.
Diese Ergebnisse präsentieren den GnRH-Rezeptor als wichtiges Steuerungselement bei
der Ausschüttung der hypophysär gebildeten Hormone FSH und LH. Clayton
demonstrierte 1989 den direktem Einfluß von GnRH auf den mRNA-Spiegel seines
19
Rezeptors und somit auch auf die Syntheseleistung des GnRH-Rezeptors. Es konnte
gezeigt werden, daß die Rezeptordichte bei pulsatilem (episodischem) Stimulus durch
GnRH in niedriger Konzentration deutlich anstieg, allerdings das langandauernde
gleichmäßige Angebot eines GnRH-Agonisten zunächst zu einer Desensibilisierung der
Rezeptoren und später zu einem Abfall der Rezeptordichte führte (Marian et al., 1981;
Loumaye und Catt, 1982; Clayton, 1989). Übereinstimmend damit ergab sich auch für
exogen zugeführtes GnRH eine Verringerung des mRNA-Spiegels bei kontinuierlicher
Gabe und demgegenüber erhöhte Spiegel nach pulsatiler Applikation (Kakar et al., 1997).
Die Exprimierung des Rezeptorgens ist somit ein essentieller Regelmechanismus für die
Affinität des Plasmamembran-Rezeptors der gonadotropen Zellen.
1.3.4 Der ovarielle GnRH-Rezeptor
Außerhalb der hypothalamischen Kerngebiete konnte eine GnRH-Genexpression auch in
extrahypophysären Geweben verschiedener Säugetierspezies nachgewiesen werden. Hsueh
demonstrierte zu Beginn der 80er Jahre eine modulierende Wirkung für GnRH an Ovarien
von Ratten (Hsueh und Jones, 1981; Hsueh et al., 1984). In diesen Studien ergab sich eine
ambivalente Wirkungsweise für GnRH: Die basale Steroidbiosynthese wurde unter GnRH-
Wirkung stimuliert, die Gonadotropin-induzierte Steroidsyntheseleistung fiel ab.
Desweiteren fielen inhibitorische Effekte von GnRH und GnRH-Agonisten im Ovar auf.
So blieb nach Behandlung mit einem GnRH-Agonisten die durch Gonadotropine
gesteuerte ovarielle Gewichtszunahme aus (Rippel und Johnson, 1976). Ebenso
unterdrückte die Gabe von GnRH-Agonisten die normale Follikelreifung (Ying und
Guillemin, 1979), wie auch die regulatorische Aktivität des LH in der Lutealphase ausblieb
(Clayton et al., 1979; Harwood et al., 1980). An isolierten Granulosazellkulturen von
Ratten zeigten Knecht et al. 1981, daß unter GnRH-Agonisten-Applikation sowohl die
Zahl der ovariellen Rezeptoren sinkt als auch die Produktion des second messenger cAMP
unterdrückt wird.
20
Diese und andere Effekte an Rattenovarien werden durch spezifische hochaffine
Rezeptoren vermittelt (Clayton et al., 1979; Harwood et al., 1980; Jones et al., 1980). Die
Konzentration dieser Rezeptoren ist während der Follikelphase höher als in der
Lutealphase des Zyklus und ihre Bindungsaffinität für GnRH steigt nach GnRH-
Stimulation an (Pieper et al., 1981). Die Interaktion zwischen GnRH und seinen Agonisten
auf der einen und dem spezifischen Rezeptor auf der anderen Seite ist ausführlich bei
Ratten und einigen anderen Säugetieren untersucht worden.
Der humane ovarielle GnRH-Rezeptor
Dagegen war bis vor kurzem über GnRH-assozierte Effekte im menschlichen Körper nur
relativ wenig bekannt. Eine geringe Zahl von Experimenten brachte uneinheitliche
Ergebnisse. Es wurde angenommen, daß GnRH im menschlichen Ovar sowohl autokrine
als auch parakrine Regulationsvorgänge steuert. Allerdings herrschte über die Existenz
spezifischer GnRH-Rezeptoren im humanen Ovar wie auch über ihr Vorkommen in den
verschiedenen ovariellen Kompartimenten lange Unklarheit.
Zunächst wurde das vollständige Fehlen spezifischer Bindungsstellen für GnRH im
menschlichen Ovar berichtet (Clayton und Huhtaniemi, 1982). Dann erbrachten Popkin et
al. 1983 und auch Bramley et al. 1985 den Nachweis von niedrigaffine Bindungsstellen im
Corpus luteum. Zum ersten Mal konnten GnRH-Rezeptoren im humanen Ovar 1989 mit
Hilfe der in-situ Autoradiographie dargestellt werden. In Granulosazellen des dominanten
Follikels fanden sich hochaffine Bindungsstellen (Latouche et al., 1989). Durch
Rezeptorassays wurden GnRH-Rezeptoren in bei Follikelpunktionen gewonnenen
Granulosaluteinzellen nachgewiesen. So konnte in humanen Granulosaluteinzellen , die bei
IVF-Zyklen ohne HMG-Stimulation gewonnen wurden, hohe Rezeptoraffinität bezüglich
des verwendeten GnRH-Agonisten demonstriert werden, dieselbe Arbeitsgruppe fand
jedoch im präovulatorischen Follikel keine Hinweise auf das Vorhandensein von
Bindungsstellen (Brus et al.,1997). Auch im Bezug auf die möglichen Effekte von GnRH-
Agonisten in menschlichen Ovarien sind widersprüchliche Ergebnisse beschrieben worden.
So beobachteten Casper et al. keinerlei Beeinflussung der Steroidbiosynthese nach
Applikation von GnRH-Agonisten (Casper et al., 1982, 1984). Dagegen wiesen Tureck et
al. 1982 in vitro inhibitorische Effekte auf die Steroidproduktion durch GnRH-Agonisten
nach. Sowohl stimulierende als auch hemmende Wirkung auf die Gonadotropine in
Abhängigkeit von der Konzentration des GnRH-Agonisten konnten gezeigt werden, wobei
21
niedrige Konzentrationen einen stimulatorischen Effekt nach sich zogen (Parinaud et al.,
1988). Für das Rattenovar konnte der Nachweis spezifischer GnRH-Rezeptoren bereits
erbracht (Hsueh und Schäfer, 1985) und die Transkription des GnRH-Gens dargestellt
werden (Oikawa et al., 1990; Goubau et al.,1992). Desgleichen ist die Regulation der
mRNA des GnRH-Rezeptors im Ovar der Ratte aufgedeckt worden (Olofsson et al., 1994;
Kakar et al., 1994).
Nach der Clonierung und Charakterisierung des menschlichen GnRH-Rezeptors durch
Kakar et al. 1992 wurde in einigen Studien das Vorhandensein der GnRH-Rezeptor mRNA
untersucht. Ohno et al. fanden GnRH-Rezeptor-mRNA in menschlichen epithelialen
Ovarialkarzinom-Zellen unter Verwendung der Reversen-Transkriptase
Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), waren aber nicht in der Lage, sie im gesunden Ovar
nachzuweisen (Ohno et al., 1993). Nachdem die komplementäre DNA (cDNA) des GnRH-
Rezeptors kloniert worden war, gelang es ebenfalls mithilfe der RT-PCR die Transkription
von mRNA des GnRH-Rezeptors in humanen Granulosaluteinzellen darzustellen (Kakar et
al., 1992; Peng et al., 1994, Minaretzis et al., 1995). Desgleichen gelang es mit Hilfe
molekularbiologischer Verfahren wie Northern Blot und RT-PCR, die Expression von
mRNA des GnRH-Rezeptors auch in anderen Organsystemen darzustellen. So zeigten sich
neben der Hypophyse auch in Gewebeproben von Ovarien bzw. Hoden, der Prostata und
der Brustdrüse Produkte in der PCR, die in ihrer Länge exakt der für den GnRH-Rezeptor
bestimmmten 800 Basenpaare entsprachen. Allerdings war die mRNA-Expression im
Hypophysengewebe am stärksten ausgeprägt (Kakar et al., 1992).
1.3.5 Der GnRH II-Rezeptor
GnRH stimuliert die hypophysäre Gonadotropinausschüttung und beeinflußt auf diesem
Wege auch die gonadale Funktion. Neben der seit längerem bekannten hypothalamischen
Form des GnRH (GnRH I: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2), das seine
Wirkung innerhalb der Reproduktion über einen spezifischen GnRH I-Rezeptor reguliert,
konnten in jüngster Zeit durch den Nachweis von strukturell abgewandelten Formen des
GnRH in Säugetieren 14 strukturähnliche Peptide dargestellt werden. Es fiel auf, daß bei
den meisten der untersuchten Wirbeltiere mehrere Formen von GnRH vorhanden waren
22
(Sherwood et al., 1993, Sealfon et al., 1997). Darüberhinaus konnte eine Form des GnRH,
welche ursprünglich aus Hypothalamuszellen des Huhns isoliert worden war, in
gleicherweise vom Fisch bis zum Menschen nachgewiesen werden (White et al., 1998). Im
Hinblick auf Studien, die sich mit der Struktur der GnRH-Gene beschäftigt haben, ist
davon auszugehen, daß dieses Peptid das Ergebnis aus einer frühen Genduplikation im
Rahmen der Evolution darstellt. Dieses aufgrund seines universellen Vorkommens als
GnRH II (pGlu-His-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2) bezeichnete Peptid scheint
aufgrund seiner unveränderten Erhaltung im Verlauf der Evolution und der weiten
Verbeitung in unterschiedlichen Gewebearten eine bedeutende Funktion zu übernehmen.
So konnte zum Beispiel seine Beteiligung an der Regulierung spezifischer Kaliumkanäle
innerhalb sympathischer Ganglien und ebenso innerhalb der Stimulation sexueller
Erregung nachgewiesen werden (Maney et al., 1997).
Eine andere Arbeit beschreibt die Expression von vier unterschiedlichen GnRH-Formen
sowie eines GnRH-Rezeptors bei verschiedenen Säugetieren, dagegen konnten 13
unterschiedliche Formen von GnRH und eine Vielzahl von GnRH-Rezeptoren bei
mehreren anderen Wirbeltieren nachgewiesen werden (Neill, 2002). Mit Vollendung der
Sequenzierung des menschlichen Genoms ergab sich die Möglichkeit, das Vorkommen der
unterschiedlichen GnRH-Formen und –Rezeptoren innerhalb der Primaten genau zu
untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß von den bisher bei Säugetieren nachgewiesenen
vier unterschiedlichen Formen nur das schon länger bekannte GnRH I und das erstmalig
im Hühnerhypothalamus nachgewiesene GnRH II im menschlichen Genom identifiziert
werden konnten. Ferner wurden drei GnRH-Rezeptor Gene identifiziert: zum einen das
schon gut bekannte GnRH I-Rezeptor Gen auf Chromosom 4, zum zweiten das GnRH II-
Rezeptor Gen auf Chromosom 1 sowie zum dritten ein dem GnRH II Rezeptor Gen
homologes Gen auf Chromosom 14 (Neill, 2002). Allerdings gibt es Hinweise, die auf eine
übergeordnete Bedeutung des Gens auf Chromosom 1 gegenüber dem homologen Gen auf
Chromosom 14 hindeuten (van Biljon et al., 2002).
Der durch das Gen auf Chromosom 1 codierte ebenfalls G-Protein-gekoppelte Rezeptor
weist eine größere Übereinstimmung mit dem bei anderen Wirbeltieren gefundenen GnRH
II-Rezeptor auf als mit dem bekannten menschlichen GnRH I-Rezeptor (55% zu 39%
Übereinstimmung). Durch Verwendung der cDNA des GnRH II-Rezeptors aus der
Hypophyse von Menschenaffen konnte ein aus 379 Aminosäuren bestehender Rezeptor
dargestellt werden, der im Gegensatz zum GnRH I-Rezeptor eine terminale intrazelluläre
23
Carboxylgruppe aufweist. Dieser experimentell exprimierte GnRH II-Rezeptor zeigte sich
hochspezifisch für GnRH II. Auch konnte die Expression der GnRH II-Rezeptor mRNA
ubiquitär im menschlichen Gewebe nachgewiesen werden (Neill, 2002). Der GnRH II-
Rezeptor bindet wie auch der GnRH I-Rezeptor an die alpha q/11-Untereinheit des
assozierten G-Proteins und aktiviert ebenfalls spezifische Protein-Kinasen innerhalb der
Signaltransduktionskaskade. Allerdings unterscheidet er sich vom GnRH I-Rezeptor durch
Aktivierung anderer MAP-Kinasen im weiteren Verlauf der Signaltransduktion. Für den
GnRH II-Rezeptor ergibt sich insgesamt eine ausgedehntere Verbreitung im menschlichen
Gewebe als für den GnRH I-Rezeptor, überraschenderweise fand sich eine Exprimierung
des GnRH II-Rezeptors neben vielen Bereichen des Gehirns auch für die meisten
gonadotropen Zellen der Hypophyse. Daher könnte das parallele Vorkommen zwei
verschiedener GnRH-Rezeptoren auf den gonadotropen Zellen in Verbindung mit den
unterschiedlichen Effekten innerhalb der Signaltransduktion für eine unterschiedliche
Bedeutung beider GnRH Typen und ihrer Rezeptoren innerhalb der Reproduktion sprechen
(Millar et al., 2001).
1.4 GnRH-Analoga
Neben der Entdeckung und Erforschung der physiologischen Bedeutung sowie des
Wirkungsmechanismus von GnRH wurden auch die klinischen Anwendungsmöglichkeiten
überprüft. Allerdings spielt GnRH selbst im klinischen Alltag keine große Rolle, sondern
kommt nur bei wenigen Indikationen wie z.B. der hypothalamischen Amenorrhoe oder
dem Kallmann-Syndrom zum Einsatz. Der hypothalamischen Amenorrhoe liegt eine
verminderte oder gänzlich fehlende hypothalamische GnRH-Sekretion zu Grunde.
Synthese und Sekretion von FSH und LH bleiben daher weitgehend aus. Durch die
Substitution von GnRH wird der ursächliche Mangel behoben und normale Zyklen treten
ein. Ist der Maldescensus testis durch eine Störung auf hypothalamisch-hypophysärer
Ebene begründet, führt ebenfalls die GnRH-Gabe zum Therapieerfolg.
24
1.4.1 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Agonisten
Von sehr viel größerer Bedeutung ist die Verwendung von GnRH-Agonisten. Nachdem die
Struktur des GnRH-Moleküls aufgeklärt und seine Synthese möglich war, konnte es im
Hinblick auf seinen therapeutischen Nutzen modifiziert werden. Die auf diesem Wege
synthetisierten Peptide ähneln ihrer Struktur nach dem nativen GnRH, allerdings besitzen
die GnRH-Agonisten eine deutlich verbesserte Bioverfügbarkeit sowie eine verlängerte
Wirkdauer. Eine 100-200fach höhere Rezeptoraffinität ergab sich aus einem Austausch der
Aminosäuren an den Positionen 6 und 10. Dadurch wurde der für das natürliche GnRH
typische rapide Enzymabbau verhindert, was zu einer weit besseren Bioverfügbarkeit der
GnRH-Agonisten und damit zu einer besseren Rezeptorbelegung führte. Bei
kontinuierlicher Applikation führen sie zu einer reversiblen Entkopplung der
Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse, indem sie einen Abfall der GnRH-Rezeptoren
(down-Regulation) und eine Desensibilisierung der gonadotropen Adenohypophysenzellen
hervorrufen. Konsekutiv kommt es aufgrund der verringerten Gonadotropinbildung und-
sekretion zu einer Suppression der ovariellen Steroidbiosynthese. Daher liegt der
medizinische Nutzen der GnRH-Agonisten in der Therapie von sexualhormonabhängigen
Erkrankungen. Dort werden sie in der klinischen Routine eingesetzt.
Nach ihrer Applikation bewirken sie zunächst eine gesteigerte Gonadotropinfreisetzung
aus dem Hypophysenvorderlappen (sog. flare-up-Effekt). Gleichzeitig kommt es zu einer
transienten Vermehrung der membranständigen Rezeptoren der gonadotropen Zellen (sog.
up-Regulation). Die längerfristige Anwendung der GnRH-Agonisten führt jedoch aufgrund
der Internalisierung des Agonisten-Rezeptorkomplexes zu einer Abnahme der Rezeptoren-
dichte. Da die Zellen nicht in der Lage sind, den Rezeptorverlust mittels Neusynthese
schnell genug auszugleichen, bleibt die absolute Anzahl der Rezeptoren vermindert (sog.
down-Regulation). Vor der Supression der hypophysären Gonadotropinproduktion und-
sekretion liegt eine Phase der Stimulation, die etwa 12 Stunden nach der ersten Gabe
einsetzt. Dabei steigen die FSH-Konzentration im Serum auf ca. das Fünffache des
Ausgangswertes, die LH-Konzentration sogar auf das beinahe Zehnfache an. Ebenso
kommt es zu einer kurzfristigen Erhöhung des Östradiolwertes um das Vierfache der
Norm. Eine die Behandlung ermöglichende Suppression der Hypophyse setzt erst nach
einer Anwendungszeit von etwa 14 Tagen ein (Lemay et al., 1984).
25
Parallel dazu werden die Signaltransduktionswege der Zellen gehemmt (Conn und
Crowley, 1991). Als Folge der entstandenen Desensibilisierung sind die gonadotropen
Hypophysenzellen gegenüber dem nativen GnRH wie auch dem GnRH-Agonisten
refraktär. Desweiteren wird durch das Absinken der FSH-und LH-Spiegel im Serum die
ovarielle Steroidbiosynthese vermindert, was wiederum ein Ausbleiben der Follikelreifung
nach sich zieht. Die Serumspiegel des Östradiols liegen im postmenopausalen Bereich. Die
beschriebene Entkopplung der Hypophyse ist allerdings nach Beendigung der Therapie
vollständig reversibel, wobei sich die physiologische Zyklusfunktion nach durchschnittlich
sechs Wochen wieder etabliert hat (Gordon und Hodgen, 1993).
Im klinischen Alltag kommen GnRH-Agonisten bei Erkrankungen zum Einsatz, die eine
Suppression der hypophysären Gonadotropine erforden. Zum einen kann die
Unterdrückung der FSH- und LH-Sekretion, zum anderen aber auch der daraus
resultierende Sexualsteroidmangel zu therapeutischen Zwecken genutzt werden.
So sind im Bereich der gutartigen Erkrankungen vor allem der Einsatz bei Endometriose,
uterinen Myomen, Pubertas präcox, einigen Hypophysenadenomen und nicht zuletzt der
endogen Gonadotropinsuppression im Rahmen der kontrollierten ovariellen
Hyperstimulation zu nennen. Die Unterdrückung der Steroidhormonsynthese wird im
Bereich der Onkologie zur ablativen Therapie von Mamma-, Ovarial-, Endometrium- und
Prostatakarzinomen genutzt (Fekete et al., 1989; Emons et al., 1989; Pahwa et al., 1991;
Limonta et al., 1992).
Der therapeutisch erzeugte Östradiolmangel bringt einige unerwünschte Nebenwirkungen
mit sich, die dem Beschwerdebild der Postmenopause ähneln. Allerdings ist als
folgenschwerste Mangelerscheinung in der Langzeittherapie mit GnRH-Agonisten der
osteoporotisch bedingte Verlust der Knochenmasse anzusehen. Östrogene hemmen den
von den Osteoklasten ausgehenden Knochenabbau sowie die typischerweise unter
Östrogenmagel auftretende Kollagenolyse (Conn und Crowley, 1991).
26
1.4.2 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Antagonisten
Die andere Substanzgruppe aus dem Formenkreis der GnRH-Analoga bilden die erst seit
wenigen Jahren zur Verfügung stehenden GnRH-Antagonisten. Diese konkurrieren im
Gegensatz zu den Agonisten mit dem nativen GnRH an den Rezeptorbindungsstellen und
führen so zu einer kompetitiven Hemmung der GnRH-Wirkung. Der supprimierende
Effekt auf die Gonadotropinausschüttung und damit auch auf die Steroidbiosynthese setzt
innerhalb von Stunden ein (Coy et al, 1982). Dagegen benötigen GnRH-Agonisten zum
Erreichen desselben Resultates 7-14 Tage (Lemay et al, 1984). Erste klinische
Untersuchungen mit GnRH-Antagonisten wurden im Rahmen der kontrollierten ovariellen
Hyperstimulation innerhalb der IVF-Therapie durchgeführt.
Der bei der Applikation von GnRH-Agonisten auftretende flare-up-Effekt ist ein
unerwünschter Anfangseffekt. Im Gegensatz dazu erzeugen die zeitgleich zur Entwicklung
der GnRH-Agonisten synthetisierten GnRH-Antagonisten eine sofortige Unterdrückung
der Gonadotropinproduktion ohne die unerwünschte vorherige Stimulation (Klingmüller et
al., 1993). Bereits wenige Stunden nach der Erstapplikation können im Serum stark
verminderte LH und FSH-Werte gemessen werden (Coy et al, 1982). Bei der Entwicklung
und frühen Erprobung der ersten GnRH-Antagonisten fielen allerdings eine Reihe von
unerwünschten Nebenwirkungen auf, die von leichten allergischen Reaktionen wie einer
Ödembildung in der Umgebung der Injektionsstelle bis hin zu schweren anaphylaktischen
Schockzuständen reichten (Schmidt et al., 1984). Diesen Reaktionen liegt mit hoher
Wahrscheinlichkeit ein systemisch histaminliberierender Effekt der GnRH-Antagonisten
im Anschluß an die Bindung von mit GnRH-Rezeptoren besetzten Mastzellen zugrunde
(Kiesel und Runnebaum, 1993). Ferner kam es in einigen Fällen eventuell aufgrund der
hydrophoben Eigenschaften der ersten Antagonisten zu einem Gelieren des Medikaments
nach der Applikation. Die klinische Erprobung im Rahmen der Phase III Studien wurde
erst mit der dritten Generation von GnRH-Antagonisten möglich, die bezüglich ihrer
Verträglichkeit und Bioverfügbarkeit entscheidend verbessert werden konnten.
Die Erklärung für den raschen Wirkungseintritt der Antagonisten liegt in ihrem völlig
anderen Funktionsprinzip. Sie konkurrieren mit dem natürlichen GnRH um die
Bindungsstellen an den spezifischen Rezeptoren der gonadotropen Zellen, besetzen diese
irrevesibel und unterbinden damit sowohl die Internalisierung als auch die
27
Signaltransduktionsmechanismen. Auf diese Weise führen sie zu einer kompetitiven
Hemmung der GnRH-Wirkung. Durch die exogene Zufuhr von GnRH bzw. seiner
Agonisten ist es möglich, die Hemmwirkung wieder aufzuheben. Da die GnRH-
Antagonisten eine klassische, d.h. den Grundlagen des Massenwirkungsgesetzes folgende
kompetitive Hemmung hervorrufen, ist die teilweise oder komplette Aufhebung der
antagonistischen Wirkung durch genaue Dosierung von GnRH gut steuerbar. So kann
beispielsweise unter der Behandlung mit GnRH-Antagonisten durch pulsatile Gabe von
GnRH ein Wiedereinsetzen des normalen Zyklus erreicht werden (Olivennes et al., 1994).
Auch können typische durch den Östrogenmangel bedingte Nebenwirkungen der
Agonistentherapie wie Hitzewallungen und Trockenheit der Vaginalschleimhaut
vermieden werden, indem durch exakte Dosisfindung des Antagonisten ein geringer
Östradiolspiegel im Serum beibehalten wird (Bouchard et al., 1990). Da es unter der
Behandlung mit GnRH-Antagonisten nicht wie bei agonistischer Therapie zu einer
Entspeicherung der Hypophysenzellen kommt, ist die normale Funktion der gonadotropen
Zellen innerhalb weniger Tage nach dem Absetzen der Substanzen wiederhergestellt.
1.4.2.1 Der GnRH-Antagonist Ganirelix
Für den in der vorliegenden Arbeit untersuchten GnRH-Antagonist Ganirelix liegen im
Gegensatz zu anderen Antagonisten der dritten Generation wie Nal-Glu, Antide und
Cetrorelix noch relativ wenige klinische Daten vor.
Ganirelixacetat (Antagon, Firma Organon, Oss, Niederlande) ist ein synthetisch
hergestelltes Dekapeptid. Es zählt zu den GnRH-Antagonisten der dritten Generation.
Daher war nun ein Einsatz im Rahmen klinischer Studien zur Erprobung des
therapeutischen Nutzens möglich. Wie alle Antagonisten des nativen Gonadotropin-
Releasing Hormons konkurriert es im Sinne einer kompetitiven Hemmung mit dem
körpereigenen GnRH am hypophysären GnRH-Rezeptor um die vorhandenen
Bindungsstellen. Dadurch ist Ganirelix in der Lage, die GnRH-Wirkung innerhalb des
Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Regelkreises zu blockieren. Es kommt zu einer
deutlichen Verminderung der LH- und FSH-Auschüttung, wobei Ganirelix eine stärkere
Unterdrückung der LH-Sekretion zur Folge hat.
28
pGlu1
-His2
-Trp3
-Ser4
-Tyr5
-Gly6
-Leu7
-Arg8
-Pro9
-Gly10
-NH2
Aminosäuresequenz von GnRH
pGlu1
-His2
-Trp3
-Ser4
-Tyr5
-D-Trp6
-Leu7
-Arg8
-Pro9
-Gly10
-NH2
Aminosäuresequenz des GnRH-Agonisten Triptorelin
Ac-D-Nal1
-DCpa2
-D-Pal3
-D-Ser4
-Tyr5
-D-hArg(Et2)6
-Leu7
-hArg(Et2)8
-Pro9
-D-
Ala10
-NH2
Aminosäuresequenz des GnRH-Antagonisten Ganirelix
Abb. 7: Aminosäuresequenzen von GnRH, Triptorelin und Ganirelix
Der therapeutische Nutzen der spezifisch antagonistischen Effekte ist in einigen frühen
klinischen Studien nachgewiesen worden. Denn obwohl sie bezüglich ihrer Indikationen
weitgehende Kongruenz mit den Einsatzgebieten der Agonisten zeigen, bieten sie doch
gewisse Vorteile. Gerade in der Behandlung von Krankheiten, die durch den initialen flare-
up Effekt der Agonisten negativ beeinflusst werden, hat der sofortige Suppressionseffekt
der Antagonisten günstige Auswirkungen. So könnte beispielsweise bei
sexualsteroidsensitiven Tumorerkrankungen eine zu Beginn der agonistischen Therapie
vermeintlich auftretende Tumorzellproliferation verhindert werden.
Große Bedeutung haben die GnRH-Antagonisten ebenfalls für die Behandlungsstrategien
innerhalb der Reproduktionsmedizin aufgrund ihres raschen Wirkungseintritts und ihrer
guten Dosierbarkeit.
29
1.4.3 Einsatz von GnRH-Analoga in der Reproduktionsmedizin
Zur Zeit stellt die Reproduktionsmedizin eines der wichtigen Einsatzfelder der GnRH-
Analoga dar. Sie werden in unterschiedlichen Therapieregimen mit dem Ziel der
kontrollierten ovariellen Hyperstimulation (controlled ovarian hyperstimulation [COH])
angewendet. Die COH bildet die Voraussetzung für die Durchführung der in-vitro-
Fertilisation (IVF) im Rahmen der Sterilitätsbehandlung. Da zur Durchführung der IVF
mehrere Oozyten bei einer Follikelpunktion gewonnen werden müssen, stellt die
Stimulation der Ovarien eine wesentliche Voraussetzung der Behandlung dar.
Ovarielle Stimulation
Über die Gabe von Gonadotropinen wird das Ovar zur Bildung mehrerer Follikel innerhalb
eines einzigen Zyklus angeregt. Zusätzlich werden GnRH-Analoga auf der Basis
verschiedener Therapieprotokolle appliziert. Ihre Aufgabe besteht in der hypophysären
Entkopplung aus dem Hypothalamus-Hypophyse-Ovar-Regelkreis, was eine
Unterdrückung der FSH-und LH-Produktion und -Ausschüttung zur Folge hat. Dadurch
sinken die Gonadotropinspiegel im Serum auf kaum nachweisbare Werte und lassen eine
exogen gesteuerte Stimulation und Ovulationsauslösung zu. Aufgrund dieses
Wirkmechanismus der GnRH-Analoga gelingt es, den für die Anwendung der IVF
schädlichen vorzeitigen LH-Anstieg zu verhindern. Tritt ein endogen ausgelöster LH-
Anstieg bei noch kleinem dominanten Follikel auf, kommt es zur vorzeitigen
Luteinisierung des Follikels und damit zu einer gestörten Eizellentwicklung. Die während
der Follikelpunktion gewonnenen Oozyten weisen als Folge der Luteinisierung eine
schlechtere Qualität auf, die sich im weiteren Ablauf der Behandlung negativ auf die
Fertilisierungs-und Implantationsrate sowie auf die Überlebensfähigkeit des Embryos
auswirkt (Stanger und Yovich, 1985; Loumaye, 1990). Analog dazu steigt die Abortrate
an. Das klassische Stimulationsschema mit alleiniger Gabe von humanem
Menopausengonadotropin (HMG) bzw. rekombinanten Gonadotropinen resultiert bei etwa
20% der Patientinnen in einem vorzeitigen LH-Peak, der zumeist durch Luteinisierung und
anschließender Follikelatresie den Abbruch der IVF-Therapie zur Folge hat (Diedrich et
al., 1994).
30
Die zunächst in die Behandlung eingeführten GnRH-Agonisten reduzierten die Rate der
vorzeitigen Therapieabbrüche aufgrund des zu frühen LH-Anstieg auf weniger als 2% der
Fälle, was sich auch in einer gesteigerten Erfolgsrate der IVF-Therapie widerspiegelte.
Einen Nachteil der Agonistenapplikation stellte allerdings die relativ lange
Verabreichungsdauer dar. Nach dem sog. langen Protokoll, das sich als optimale Form für
den Einsatz der GnRH-Agonisten etabliert hat, beginnt die agonistische Behandlung
aufgrund des initialen flare-up Effekts 14 Tage bevor mit der Gonadotropinstimulation
begonnen werden kann. Erst nach Ablauf dieser Behandlungszeit kann von einer völligen
Entkopplung der Hypophyse als Voraussetzung für den Beginn der exogenen
Gonadotropinzufuhr ausgegangen werden.
Mit der Entdeckung der GnRH-Antagonisten ergaben sich völlig neue Möglichkeiten in
der Sterilitätsbehandlung. Durch die Fähigkeit der Antagonisten, die Gonadotropinsynthese
und -sekretion innerhalb weniger Stunden zu supprimieren, konnte der
Behandlungszeitraum der Patientinnen deutlich verkürzt werden. Dies bedeutete auch eine
Verringerung der therapieassoziierten Belastung der Frauen und eine einfachere
medikamentöse Einstellung durch den behandelnden Arzt. Die im Laufe der letzten Jahre
in klinischen Studien eingesetzten GnRH-Antagonisten der dritten Generation Cetrorelix
und Ganirelix riefen keinerlei allergische Reaktionen hervor (Klingmüller et al., 1993;
Diedrich et al., 1994) und zeigten sich bezüglich der Fähigkeit, den vorzeitigen LH-
Anstieg zu verhindern, ebenso potent wie die schon länger etablierten Agonisten (Diedrich
et al., 1994; Albano et al., 1999; Rongières-Betrand et al., 1999). Innerhalb des langen
Protokolls erfolgt die Applikation des GnRH-Agonisten in Depotform einmalig in der
Dosierung 3,75 mg am 22. Tag des Zyklus, der dem Stimulationszyklus unmittelbar
vorausgeht. Dagegen wird der GnRH-Antagonist nach dem Lübecker Protokoll erst ab dem
7. Tag des Stimulationszyklus bis zur Ovulationsinduktion in der Dosierung von 0,25
mg/die (Felberbaum und Diedrich, 1999) gegeben.
Unter Einsatz der GnRH-Antagonisten innerhalb der IVF traten schwerere Formen eines
ovariellen Überstimulationssyndroms seltener auf als bei Anwendung des langen
Stimulationsprotokolls. In einer neueren Studie gelang es sogar durch eine Steigerung der
täglichen Ganirelix-Dosis ein bereits manifestes ovarielles Hyperstimulationssyndrom zu
beseitigen (de Jong et al., 1998).
31
Zusammenfassend läßt sich festhalten, daß die bisher untersuchten GnRH-Antagonisten
der dritten Generation ebenso potent einen unerwünschten vorzeitigen LH-Anstieg
unterdrücken wie die schon länger zu diesem Zweck eingesetzten GnRH-Agonisten. Damit
erhöht sich deutlich die Qualität der gewonnenen Eizellen und nachfolgend die
Fertilisationsrate wie auch die Schwangerschaftsrate im Vergleich zur alleinigen Gabe von
HMG. Somit können Agonisten wie auch Antagonisten im Bereich der
Reproduktionsmedizin gleichwertig eingesetzt werden, wobei GnRH-Antagonisten in der
Behandlung des ovariellen Überstimulationssynsdroms wahrscheinlich durch die geringere
Zahl antraler Follikel bessere Resultate erzielen.
1.5 Signaltransduktionsmechanismen im Ovar
Die in den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse gebildeten Gonadotropine FSH und
LH steuern die Funktion der Gonaden. Sie binden als Proteohormone und damit hydrophile
Substanzen ebenfalls an Rezeptoren, die in der Zellmembran lokalisiert sind. Ihre
spezifischen Rezeptoren werden allerdings nur von besonderen Zellen, den sog. Zielzellen
(target cells) exprimiert (Leung und Steele, 1992). Wird ein Gonadotropinrezeptor im Ovar
durch den spezifischen Liganden besetzt, erfolgt im Rahmen der
Signaltransduktionskaskade zunächst die Aktivierung der Adenylatcyclase und daraufhin
die Bildung des ‘second messenger’ cAMP (Hunzicker-Dunne und Birnbaumer, 1985;
Richards et al., 1995). Ein Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels hat die Aktivierung
der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (PKA) zur Folge (Taylor et al., 1990; Meinkoth et
al., 1990), welche als Katalysator bei der Phosphorylierung anderer intrazellulärer
Substrate wirkt. Aufgrund dieses Mechanismus modulieren FSH und LH die Expression
gonadaler Gene (Tilly et al., 1992; Richards et al., 1995).
Ein Substrat, welches durch die PKA in den biochemisch aktiven Zustand überführt wird,
ist das cAMP-Antwort Element-Bindungs-Protein (cAMP response element binding
protein [CREB]) (Gonzalez et al., 1989). Dies ist ein über cAMP gesteuertes Protein,
welches regulatorische Aufgaben während des Transkriptionsvorgangs übernimmt. CREB
ist verantwortlich für die Umsetzung vieler cAMP-spezifischer Effekte innerhalb der Zelle.
Dabei bindet es an sog. cAMP-empfindliche Abschnitte der DNA (cAMP responsive DNA
elements [CRE]), auf denen sich die Loci der target-Gene befinden. Im Anschluß daran
32
kann es modulierend in die Transkription dieser Gene eingreifen. CREB vermittelt die
Expression cAMP-abhängiger Gene in verschiedenen Zellarten. Ebenso wird es durch
unterschiedliche Substrate in der Signalkette aktiviert. Im Ovar ist CREB beispielsweise an
der regulatorischen Wirkung der Gonadotropine FSH und LH auf die trankriptorische
Aktivität einiger ovarieller Enzym-Gene beteiligt (Richards et al., 1995). So bindet es im
Falle des Aromatase-Gens an cAMP-empfindliche DNA-Abschnitte, die Promotorregionen
für das genannte Gen enthalten. In kultivierten Ratten-Granulosazellen wird die
Transkription dieser Genabschnitte nach der Bindung des CREB durch cAMP induziert
(Fitzpatrick und Richards, 1994).
Abb. 8.a: Nach Bindung der Gonadotropine an den membranständigen Rezeptor
und der daraus resultierenden Konformationsänderung innerhalb des G-
Proteins kann GTP gebunden werden. Die GTP-aktivierte α-Untereinheit
des G-Proteins spaltet sich ab und lagert sich an der auf der
Membraninnenseite liegende Adenylatcyclase an. Diese wird dadurch
aktiviert und wandelt unter Abspaltung von P-P ATP in cAMP um.
LH/FSH
Rezeptor
Gγ β
GTP
G α
Adenylat-
cyclase
cAMP + PPi
ATP
Regulatorisches
Protein
KinaseR
R K
K
Nucleus
cAMP
33
Abb. 8.b: cAMP bindet nun an die Proteinkinase A, die aus zwei regulatorischen
Proteinen und zwei Kinasen besteht. Die regulatorischen Proteine
inaktivieren die Proteinkinase im Ruhezustand.
Abb. 8.c: Durch die Bindung von cAMP an die regulatorischen Einheiten werden
die A-Kinasen freigesetzt.
R
R
K
K
Nucleus
K
P
ZielgeneCRE
CREB
34
Abb. 8.d: Die A-Kinase diffundiert durch die Kernporen in das Kernplasma. Dort
befindet sich CREB (cAMP-response-element-binding-protein), welches
zunächst (in unphosphoryliertem Zustand) inaktiv ist. Die A-Kinase
phophoryliert CREB und überführt es damit in den aktiven Zustand..
Abb. 8.e: Das aktivierte CREB bindet an eine bestimmte DNA-Sequenz, das CRE
(cAMP-response-element).
CREB
Transkription
P
CREZielgene
CREB
CRE Zielgene
CBP
mRNA
P
35
Abb. 8.f: Im Anschluß wird an CREB das CBP (CREB-binding-protein) gebunden.
Dieses Protein leitet die Transkription der Zielgene (hier beispielsweise für
die Steroidbiosynthese) ein.
1996 untersuchten Mukherjee et al. die Expression der CREB-mRNA und des CREB
Proteins im Rattenovar und in isolierten Granulosazellen nach Behandlung mit
Gonadotropinen mit dem Ziel, näheren Aufschluß über die hormonabhängigen Schritte
innerhalb der Synthese des CREB Proteins zu erhalten. Um eventuelle Unterschiede in der
Regulation des CREB Proteins durch die Gonadotropine in verschiedenen Zellgruppen des
Ovars nachweisen zu können, wurde die genaue Lokalisation der CREB mRNA und des
CREB Proteins im Ovar detektiert sowie die Reaktion der aktivierten CREB-Form auf eine
Gonadotropinstimulation beobachtet.
Durch in situ-Hybridisierung, RNA-blot-Analyse und RT-PCR konnte gezeigt werden, daß
die mRNA des CREB Proteins in sämtlichen Kompartimenten des Ovars in geringer
Menge exprimiert wurde. Allerdings kam es zu keiner signifikanten Änderung der mRNA-
Spiegel unter Gonadotropin-Gabe. Im Gegensatz dazu reagierte das phosphorylierte und
damit in die aktive Form überführte CREB in den Granulosazellen mit einem transienten
drastischen Anstieg der mRNA-Transkription. Die verwendeten Granulosazellen hatten
entweder rekombinantes FSH (rFSH) in vitro erhalten oder stammten von in vivo mit
humanem Menopausen-Gonadotropin (HMG) vorbehandelten Frauen. Die zweite
Zellgruppe wurde in der Kultur mit humanem Choriongonadotropin (HCG) stimuliert. Die
Ergebnisse legten dar, daß beide Gonadotropine zu einem raschen Anstieg des aktivierten
36
CREB in den Granulosazellen führten. Sie übermitteln einige ihrer Effekte über die
Expression sog. Zielgene (target genes), wobei die direkt über cAMP gesteuerte
Phosphorylierung und Aktivierung des Regulatorproteins CREB eine zentrale Bedeutung
hat.
Generell vermittelt der ovarielle GnRH-Rezeptor seine intrazellulären Befehle über die
Aktivierung zweier Signaltransduktionwege: Phospholipase C und Inositolphosphat oder
Adenylatcyclase und cAMP. Der für die Aktivierung des cAMP-Signalweges
verantwortliche Teil des Rezeptors konnte auf der ersten intrazellulär verlaufenden
Schleife lokalisiert werden. Modifizierungen durch Aminosäurenaustausch besonders am
C-terminalen Ende dieses Rezeptoranteils führten zu einer drastischen Verminderung der
Adenylatcyclaseaktivität nach Gabe von GnRH. Dagegen zeigte sich der Phospholipase C-
Signalweg unabhängig von Veränderungen auf der ersten intrazellulär verlaufenden
Schleife des GnRH-Rezeptors (Arora et al., 1998).
Aufgrund der zentralen Bedeutung des second messenger cAMP für die
Postrezeptormechanismen am hypophysären wie auch am ovariellen GnRH-Rezeptor
beschäftigt sich die vorliegende Arbeit neben der Beobachtung der durch GnRH-Analoga
hevorgerufenen Effekte auf die ovarielle Steroidbiosynthese ebenfalls mit den GnRH-
Analoga spezifischen Wirkung auf die cAMP-Produktion humaner Granulosaluteinzellen.
37
2 Problemstellung
Die vorliegende Arbeit untersucht die potenzielle Beeinflussung der ovariellen
Steroidbiosynthese sowie der Signaltransduktionsmechanismen durch GnRH-Analoga. Die
genaue Erforschung dieser Zusammenhänge ist von klinischer Relevanz, da bei
therapeutischem Einsatz von GnRH-Agonisten und GnRH-Antagonisten unphysiologisch
hohe Konzentrationen dieser Substanzen im systemischen Kreislauf vorliegen. So könnten
über die Bindung an spezifische GnRH-Rezeptoren im Ovar eventuell Einflüsse auf die
Sexualhormonbiosynthese und die Follikelreifung ausgelöst werden. Gerade für die noch
relativ junge Substanzgruppe der GnRH-Antagonisten liegen bezüglich ihrer Wirkung auf
das Ovar bisher wenige Erkenntnisse vor. In klinischen Studien wurden GnRH-
Antagonisten bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, den vorzeitigen LH-Anstieg innerhalb
der kontrollierten ovariellen Hyperstimulation zu unterdrücken. Es stellte sich heraus, daß
GnRH-Antagonisten ebenso wirksam und effektiv zur Verhinderung des vorzeitigen LH-
Anstieges im Rahmen der IVF-Therapie einzusetzen sind wie die schon länger für den
klinischen Alltag zugelassenen agonistisch wirkenden Präparate. Bei der Vermeidung des
ovariellen Überstimulationssyndroms scheinen die Antagonisten sogar überlegen zu sein.
Die wenigen bisher publizierten klinisch-experimentellen Studien zur Wirkungsweise
verschiedener GnRH-Antagonisten stimmen bezüglich ihrer Effekte auf die
Gonadotropinsekretion überein. Allerdings bestehen kontroverse Ansichten über die
Funktion der GnRH-Antagonisten am Ovar. Kultivierte humane Granulosaluteinzellen, die
von antagonistisch vorbehandelten Frauen stammten, wiesen bezüglich ihrer
Progesteronakkumulation keinen signifikanten Unterschied zu Zellen der Kontrollgruppe
auf. Lediglich die Aromataseaktivität war innerhalb der ersten 6 Stunden der Kulturzeit in
den Zellen etwas niedriger, die von in vivo mit einem GnRH-Antagonisten behandelten
Frauen gewonnen worden waren (Minaretzis et al., 1995). Ebenso konnte in einer anderen
Studie unter in vitro-Bedingungen keine statistisch signifikante Differenz in der
Steroidhormonproduktion humaner Granulosaluteinzellen nach in vivo antagonistischer
bzw. agonistischer Behandlung nachgewiesen werden. Es fiel jedoch nach
Gonadotropinstimulation ein früheres Einsetzen der Hormonproduktion in der
antagonistisch vorbehandelten Zellgruppe auf (Lin et al., 1999). Übereinstimmend konnte
in einer neueren Arbeit gezeigt werden, daß der GnRH-Antagonist Cetrorelix sowohl unter
in vivo- wie auch in vitro-Bedingungen keine signifikant nachweisbaren Effekte auf die
38
native oder die HCG-stimulierte Streoidhormonsynthese humaner Granulosaluteinzellen
hat (Weiss et al., 2001). Über eine direkte Beeinflussung der ovariellen Hormonproduktion
durch den GnRH-Antagonisten Ganirelix sowie eines möglichen Effekts von Ganirelix auf
die cAMP-Synthese liegen bisher noch keine gesicherten Erkenntnisse vor.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird deshalb ein möglicher Effekt des GnRH-Antagonisten
Ganirelix auf die ovarielle Steroidbiosynthese geprüft. Zum Vergleich dienen dabei die
bereits genauer erforschten Wirkungen von GnRH-Agonisten. Die für die Untersuchungen
kultivierten Granulosaluteinzellen stammen von Patientinnen, die im Rahmen einer IVF-
Therapie nach verschiedenen Protokollen zur kontrollierten ovariellen Hyperstimulation
behandelt wurden. Sie erhielten entweder den GnRH-Antagonisten Ganirelix nach dem
sog. Lübecker Protokoll oder den GnRH-Agonisten Triptorelin nach dem langen Protokoll.
Um die Möglichkeit auszuschließen, daß ein Ausbleiben von GnRH-Analoga assoziierten
Wirkungen auf einer zu geringen Konzentration der Proteohormone nach in vivo-
Applikation der Substanzen basieren könnte, wurden parallel Versuche mit in vitro-Gabe
von Ganirelix bzw. Triptorelin durchgeführt.
Desweiteren haben zurückliegende Experimente die Vermutung nahegelegt, daß GnRH
selbst die Synthese seines eigenen Rezeptors reguliert. Dabei nutzt es vor allem den Weg
der Signaltransduktion über den ‘second messenger’ cAMP, um direkten Einfluß auf die
Expression der GnRH-Rezeptor-mRNA und damit auf die Zahl der Rezeptoren ausüben zu
können (Lin und Conn, 1998 und 1999). GnRH selbst und seine Analoga binden an
spezifische GnRH-Rezeptoren, deren Genexpression auch in ovariellen
Granulosaluteinzellen nachgewiesen werden konnte (Minaretzis et al., 1995). Aufgrund der
wichtigen Bedeutung von cAMP in der Signalvermittlung auf zellulärer Ebene wurde im
zweiten Teil dieser Arbeit überprüft, ob der GnRH-Antagonist Ganirelix die cAMP-
Bildung humaner Granulosaluteinzellen beeinflußt.
39
3 Material und Methoden
3.1 Stimulationsmethode
3.1.1 Das lange Protokoll
Das lange Protokoll ist das weltweit am weitesten verbreitete Stimulationsregime für die
IVF (Rjiosk et al., 1996). Das angestrebte Ziel stellt die Synchronisation der
Follikelreifung dar. Durch die Gabe eines GnRH-Agonisten vor Beginn der Stimulation
mit humanem Menopausen Gonadotropin (HMG) wird eine vollständige Desensitisierung
der Hypophyse angestrebt. Um dies zu erreichen, erhalten die Patientinnen in der Mitte der
Lutealphase des Vorzyklus, d.h. am 22. Zyklustag 3,75 mg eines GnRH-Agonisten (z.B.
Triptorelin) zur subkutanen Injektion. Nach 14 Tagen sollte die Hypothalamus-
Hypophysen-Achse entkoppelt sein. Eine Basissonographie wird durchgeführt zum
Ausschluß von Ovarialzysten, die durch den sogenannten flare-up Effekt während der
Behandlung mit einem GnRH-Agonisten entstehen können. Nun erfolgt die Stimulation
durch die gestaffelte Gabe von je 2 Ampullen HMG an den ersten vier Tagen des Zyklus
und 3 Ampullen täglich an den weiteren 4 Tagen. Sobald die Östradiolwerte kontinuierlich
ansteigen, kann die HMG-Dosierung beibehalten werden. Über Blutentnahmen wird die
Entwicklung des Hormonstatus überwacht. Wenn die Patientin sich noch nicht in der
aktiven Phase befindet, wird die HMG-Dosis individuell gesteigert.
Ab dem 8. Tag des Zyklus werden neben der Bestimmung der LH- und Östradiolwerte im
Serum auch transvaginal-sonographische Untersuchungen der Ovarien durchgeführt, um
die Größe der einzelnen Follikel zu messen. Bei einem Durchmesser des führenden
Follikels von ca. 18 mm und Östradiolwerten von 300-400 pg/ml pro Follikel > 17 mm
wird die Ovulation mittels Gabe von 10.000 IU humanem Choriongonadotropin (HCG)
intramuskulär induziert. 36 Stunden später erfolgt die transvaginal-sonographisch
gesteuerte Follikelpunktion.
Nach Durchführung der IVF bzw. der intrazytoplasmatischen Spermatozoeninjektion
(ICSI) findet der Embryonentransfer (ET) 48 Stunden später statt. Zur Unterstützung der
Lutealphase werden am 2., 5. und 8.Tag nach der Follikelpunktion 2500 bzw. 5000 IU
HCG verabreicht oder Progesteron täglich über 14 Tage gegeben.
40
10.000 IE HCG
Follikelpunktion
GnRH-Agonist Embryotransfer
HMG / FSH
Lutealphasen
unterstützung
22. 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tag
Follikulometrie (mm) 10 14 18
Abb.9: Das lange Protokoll
3.1.2 Das Lübecker Protokoll
Das sogenannte Lübecker Protokoll wurde von Diedrich und seiner Arbeitsgruppe
entwickelt und basiert auf der kompetitiven Antagonisierung des nativen GnRH durch
einen synthetisch hergestellten GnRH-Antagonisten (Diedrich et al., 1994).
Ab dem 2. Zyklustag erhalten die Patientinnen täglich 2 Ampullen HMG zur Stimulation.
Zusätzlich werden vom 7. Zyklustag an 0,25 mg/die des GnRH-Antagonisten subkutan
verabreicht. Die relativ späte Gabe des GnRH-Antagonisten wird dadurch ermöglicht, daß
es nicht wie bei Gabe eines GnRH-Agonisten zunächst zum sog. Flare-up Effekt kommt,
sondern durch die direkt kompetitive Wirkung des GnRH-Antagonisten am Rezeptor eine
Suppression der körpereigenen GnRH-Wirkung bereits nach einigen Stunden auftritt.
Aufgrund seiner besseren Steuerbarkeit muß der GnRH-Antagonist erst bei drohender
Gefahr eines vorzeitigen LH-Anstieges gegeben werden. Ab dem 8. Zyklustag erfolgen
analog zum langen Protokoll transvaginal-sonographische Follikulometrie sowie
Östradiolbestimmungen, wobei die Ergebnisse der Untersuchungen eine exakte Anpassung
der HMG-Dosis ermöglichen. Die Kriterien für eine Ovulationsauslösung durch Gabe von
10.000 IU HCG entsprechen denen des langen Protokolls. Ebenso identisch verlaufen die
41
Durchführung der transvaginalen Follikelpunktion, des IVF bzw. ICSI, der
Embryonentransfer sowie die hormonelle Unterstützung der Lutealphase.
10.000 IE HCG
Follikelpunktion
Embryotransfer
Ganirelix
HMG / FSH
Lutealphasen
unterstützung
Tag 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Follikulometrie (mm) 10 14 18
Abb. 10: Das Lübecker Protokoll
3.2 Patientinnen
Für den ersten Teil der Experimente, an deren Ende die Messung der
Steroidbiosyntheseleistung humaner Granulosaluteinzellen stand, wurden Zellkulturen aus
den bei Follikelpunktionen gewonnenen Zellen von insgesamt 41 Patientinnen angelegt.
Von diesen Frauen erhielten 34 eine in-vitro Fertilisations (IVF)- Behandlung mit
intrazytoplasmatischer Spermatozoen-Injektion (ICSI) aufgrund von männlicher
Subfertilität, bei 7 wurde konventionelles IVF wegen tubarer Sterilität durchgeführt.
Im Rahmen der IVF-Therapie kamen bei oben genannten Patientinnen zwei verschiedene
Behandlungsprotokolle zur Anwendung. Eine Gruppe (n=21) wurde im Rahmen des
etablierten langen Protokolls behandelt und erhielt den GnRH-Agonisten Triptorelin zur
Suppression der endogenen LH-Ausschüttung vor Stimulation mit HMG. Die zweite
Gruppe (n=20) wurde nach dem sog. Lübecker Protokoll stimuliert und bekam zusätzlich
42
zu HMG den GnRH-Antagonisten Ganirelix. Die Patientinnen innerhalb dieser Gruppe
wurden im Rahmen einer klinischen Studie behandelt.
Im zweiten Teil der Experimente wurde wiederum mit humanen Granulosazellen
gearbeitet, allerdings stand hier nicht die Steroidhormonbiosynthese, sondern die cAMP-
Produktion der Zellen im Vordergrund. Alle Patientinnen dieses Kollektivs (n=7) sind
gleich behandelt worden. Sie hatten nach dem langen Protokoll Triptorelin und HMG
sowie zum Auslösen der Ovulation HCG erhalten.
3.3 Zellgewinnung und-präparation
3.3.1. Die Follikelpunktion
Die transvaginal durchgeführte Follikelpunktion unter sonographischer Sicht stellt zur Zeit
die Methode der Wahl zur Oozytengewinnung in der Reproduktionsmedizin dar. Das
Verfahren wurde Mitte der 80er Jahre etabliert und seither ständig modifiziert und
optimiert. Bei diesem zumeist in Vollnarkose oder Analgosedierung durchgeführten
Eingriff wird unter transvaginal-sonographischer Darstellung des jeweiligen Ovars eine
Punktionsnadel durch das hintere Scheidengewölbe zum abgebildeten Follikel
vorgeschoben und dieser abpunktiert. Die dabei anfallende Follikelflüssigkeit beträgt pro
Punktat ca. 5-10 ml. Jeder Follikel wird einzeln abpunktiert und die Flüssigkeit gesammelt
(Rabe et al., 1997).
3.3.2 Granulosaluteinzellpräparation
Die bei den Follikelpunktionen gewonnene Follikelflüssigkeit wurde nach Entnahme der
Oozyten zunächst bei 900 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, der entstehende Überstand
dekantiert und das verbliebene Pellet mit PBS-Dulbecco ohne Ca2+
und Mg2+
(Firma
Biochrom, Berlin, Deutschland) suspendiert. Nach Sammlung aller suspendierten
Flüssigkeiten in einem Röhrchen erfolgte nochmals eine zehnminütige Zentrifugation bei
43
ebenfalls 900 rpm. Auch dieser Überstand wurde dekantiert, das Pellet mit PBS
suspendiert und auf 5 ml Ficoll (Biotech, Uppsala, Schweden) aufgetragen.
Um eine Phasentrennung zu erreichen, folgte nun eine Zentrifugation über 20 Minuten bei
1200 rpm. Aus der mittleren der sich ergebenden drei Phasen wurden die
Granulosaluteinzellen mittels einer Glaspipette entnommen und in 10 ml PBS eingebracht.
Nach gründlicher Vermischung der Zellen mit der Pufferlösung wurde die Suspension
durch ein Zellsieb mit einer Durchlaßgröße von maximal 100 µm gegeben, um
Verunreinigungen zu beseitigen. Eine weitere Zentrifugation bei 900 rpm schloß sich an,
der Überstand wurde wiederum dekantiert und die zurückbleibenden Zellen mit 5ml
Inkubationsmedium suspendiert. Das Inkubationsmedium setzte sich aus 90% Nutrient
Mixture Ham`s F10 (Gibco, Paisley, Schottland), 10% fetalem Kälberserum (Firma
Biochrom) und 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma, St.Louis, USA) zusammen.
50 µl der Zellen/Medium-Suspension wurden mit der gleichen Menge Trypanblau (Sigma)
vermischt und die angefärbten Zellen mittels einer Neubauerzählkammer bezüglich ihrer
Vitalität geprüft und anschließend ausgezählt. Die Vitalität der Zellen lag stets > 90%.
Nach Auszählung der Zellen wurde die gut durchmischte Zellen/Medium-Suspension mit
Inkubationsmedium verdünnt, um eine Zellkonzentration von 100.000 Zellen/ml zu
erhalten. Es erfolgte die Zugabe von Testosteron in der Konzentration 5 µmol/l als
Aromatasesubstrat. Dies ist notwendig, da die Granulosazellen zur de novo-
Androgensynthese nicht in der Lage sind, sondern erst nach Diffusion der in den
Thekazellen gebildeten Androgene in die Granulosazellen diese aromatisieren, so daß
Östrogene entstehen. Schließlich wurden die suspendierten Zellen auf einer 24-well-Platte
(1ml/well, Greiner, Frickenhausen, Deutschland) ausgesät und bei 37°C unter 5% CO2
inkubiert.
44
Schema der Granulosaluteinzellpräparation
1. Zweimalige Zentrifugation der gewonnenen Follikelflüssigkeit,
jeweils im Anschluß Resuspension in PBS-Puffer
2. Zur Phasenauftrennung Zentrifugation auf Ficoll
3. Isolierung der Granulosaluteinzellen durch Abpipettieren der
mittleren Phase
4. Eine weitere Resuspension mit PBS und Zentrifugation zum Auswaschen
der Zellen
5. Anschließende Resuspension mit vorgewärmtem Inkubationsmedium
und Zellzählung
6. Verdünnung des Zell-Mediumgemischs auf 100.000 Zellen/ml Medium
und Aussaat der Zellen nach Testosteronapplikation auf 24-well-Kulturplatte
3.4 Experimente mit humanen Granulosaluteinzellen
3.4.1 Genereller Versuchsaufbau
Zur Untersuchung der Fragestellungen wurden kultivierte humane Granulosaluteinzellen
verwendet, die während der Follikelpunktionen im Ablauf der IVF-Therapie behandelter
Patientinnen gewonnen werden konnten. Diese Vorgehensweise eröffnete zweierlei
Vorteile: Zum einen waren die Zellen durch die routinemäßige Durchführung der IVF-
Therapie relativ leicht verfügbar, zum anderen konnte so der in vivo Einfluß von GnRH-
Analoga an den nachfolgend inkubierten Zellen geprüft werden.
Im Versuchsteil A lag das Augenmerk auf einer potentiellen Beeinflussung der in
kultivierten humanen Granulosaluteinzellen ablaufenden Steroidhormonbiosynthese durch
den GnRH-Antagonist Ganirelix. Nach der Zellpräparation wurden die Kulturen unter den
45
bereits erwähnten Bedingungen bis zu 72 Stunden inkubiert. In 24-stündigen Intervallen
erfolgte ein Mediumwechsel, wobei im jeweils abgezogenen Medium die Basalsekretion
von Östradiol und Progesteron gemessen wurde.
Bei der Untersuchung des Einflusses von GnRH-Analoga auf die ovarielle
Signaltransduktion im Versuchsteil B verliefen Zellgewinnung und-präparation identisch
zu den Steroidbiosyntheseversuchen, alle verwendeten Follikelpunktate stammten von in
gleicher Weise mit dem GnRH-Agonisten Triptorelin und HMG vorbehandelten Frauen.
Ziel dieser Versuchsreihe war die Messung der totalen cAMP-Produktion durch die
Granulosaluteinzellen während einer 48-stündigen Inkubationszeit. Dabei war dem
Medium entweder Ganirelix in der Konzentration von 1 nM, Triptorelin in gleicher
Konzentration oder kein GnRH-Analogon zugesetzt worden. Außerdem wurden die basale
Steroidbiosyntheseleistung in Versuchsteil A bzw. die basale cAMP-Bildung der Zellen im
Versuchsteil B mit der Syntheserate unter Gonadotropinstimulation verglichen, da ein
unterschiedlicher Effekt der GnRH-Analoga-Behandlung auf beide Sekretionsformen nicht
auszuschließen war.
3.4.2 Experimentelles Design
Die erste Experimentenreihe innerhalb des Versuchsteils A zeigte, daß eine in vivo-
Behandlung mit GnRH-Analoga im Rahmen der IVF-Therapie keinen signifikanten Effekt
auf die Steroidbiosynthese von kultivierten humanen Granulosaluteinzellen hatte. Um zu
prüfen, ob diese Beobachtung auf geringe GnRH-Analoga-Konzentration in den Kulturen
nach der in-vivo-Applikation der Substanzen zurückzuführen war, wurde den Zellkulturen
in einer weiteren Reihe von Experimenten entweder Ganirelix-haltiges oder Triptorelin-
haltiges Medium zugesetzt. Dabei betrug die Konzentration des GnRH-Antagonisten bzw.
-Agonisten 1 nM. Alle hierfür verwendeten Granulosaluteinzellen stammten von zuvor mit
dem GnRH-Agonisten Triptorelin stimulierten Frauen. Dies war möglich, da wir zeigen
konnten, daß der GnRH-Agonist die Steroidsynthese der Zellen nicht beeinflusste. Nach
Anlegen der Kulturen wurde ein Teil der Zellen mit nM Ganirelix-haltigem Medium und
eine andere Gruppe von Zellen mit Kontrollmedium inkubiert. Das weitere Vorgehen war
identisch zum in vivo-Versuchsmodell. Alle 24 Stunden wurde das Medium abgesaugt und
die darin enthaltene Basalsekretion von Östradiol und Progesteron gemessen. Für eine
46
Gruppe der inkubierten Zellen folgte eine 6-stündige Stimulation mit 5 IU HCG/ml, analog
dazu erfolgte die Bestimmung der Basalsekretion nicht stimulierter Zellen. Die
Bestimmung der basalen sowie der stimulierten Steroidhormonsynthese erfolgte mittels
eines enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA).
Für die Serie von Experimenten zur Beobachtung der second messenger cAMP Bildung
unter Einfluß von GnRH-Analoga im Rahmen des Versuchsteil B wurden ebenfalls
Granulosaluteinzellen aus den Follikelpunktaten von Patientinnen verwendet, die sich im
Rahmen einer IVF-Therapie in Behandlung befanden. Alle Patientinnen waren in gleicher
Weise mit dem GnRH-Agonisten Triptorelin und HMG nach dem langen Protokoll
vorbehandelt. Die Zellgewinnung und -präparation wurden analog zu den
vorausgegangenen Experimenten durchgeführt, deren Untersuchungsschwerpunkt die
Steroidbiosyntheseleistung unter GnRH-Analoga Einfluß war. Die präparierten Zellen
wurden durch Hinzugabe des vorbereiteten Mediums auf eine Konzentration von 100.000
Zellen/ml verdünnt und im Anschluß auf eine 24-well-Platte (1 ml/well) ausgesät. Eine
Inkubation über Nacht bei 37 °C und 5% CO2
schloß sich an. Dieser Schritt ermöglichte
den Ausgleich eines eventuellen Effektes auf die Zellen durch den GnRH-Agonisten und
HMG in vivo während der kontrollierten ovariellen Stimulation. Nach einem
Mediumwechsel wurden die Zellen für 48 Stunden inkubiert, wobei dem Medium
entweder Ganirelix in der Konzentration 1 nM oder Triptorelin in gleicher Konzentration
zugesetzt wurde. Eine dritte Zellgruppe erhielt zur Inkubation Medium ohne Zusatz von
GnRH-Analoga. Während der letzten 6 Stunden der Inkubationszeit wurde die Hälfte der
kultivierten Zellen mit 5 IU HCG stimuliert. Da die Konzentrationen der GnRH-Analoga
im Medium nicht verändert werden sollten, wurde auf einen Wechsel des Mediums vor der
HCG-Stimulation verzichtet. Nach Ablauf der 48-stündigen Inkubationszeit wurden die
Zellmembranen durch kräftiges Pipettieren unter Addition von 20 µl einer 10%igen
Dodecyltrimethyl-Ammonium-Bromid-Lösung zerstört. Die komplette Lyse aller
Zellpopulationen konnte nach Zusatz von Tryptanblau unter mikroskopischer Einstellung
der einzelnen wells nachgewiesen werden. Die Konzentration des auf diese Weise
extrahierten cAMP wurde unter Einsatz eines Radioimmunoassays gemessen (siehe 3.5).
47
+6h HCG Kontrolle
+6h ohne Stimulation
Ganirelix
+6h HCG
+6h ohne Stimulation
+6h HCG
+6h ohne Stimulation
0 24 48 72 Inkubationszeit (h)
Abb. 11: Aufbau Versuch A-in vivo-Modell
+6h HCG Kontrolle
+6h ohne Stimulation
Ganirelix
+6h HCG
+6h ohne Stimulation
+6h HCG
+6h ohne Stimulation
0 24 48 72 Inkubationszeit (h)
Abb. 12: Aufbau Versuch A-in vitro-Modell
Kontrollmedium
Zugabe v. 1nM Triptorelin zum Medium
Zugabe v. 1nM Ganirelix zum Medium
Kontrollmedium +6h
Zugabe v. 1nM Triptorelin zum Medium +6h HCG Stimulation
Zugabe v. 1nM Ganirelix zum Medium +6h
0 24 48 Inkubationszeit (h)
48
Abb. 13: Aufbau Versuch B
3.5 Steroidassays
Die Messung der Steroidhormone Östradiol und Progesteron erfolgte durch einen ELISA
(SR-1 von der Firma Serono, Freiburg, Deutschland) im Hormonlabor der
Universitätsfrauenklinik zu Lübeck. Das Nachweisprinzip beruht beim ELISA auf der
photometrischen Darstellung einer enzym- bzw. fluorchrommarkierten Proteinbindung.
Dabei wird zunächst mit Hilfe von Trennmitteln Östradiol bzw. Progesteron aus seiner
Bindung an Trägerproteine freigesetzt. Anschließend bindet ein Fluorescein-markierter
polyklonaler Anti-Östradiol-Antikörper bzw. Anti-Progesteron-Antikörper (aus
Kaninchenserum) das freie Sexualsteroid, welches in dieser Form durch Photometrie
quantitativ bestimmt werden kann.
Östradiol Progesteron
Meßbereich: 5-3000 pg/ml 0,2-40 ng/ml
Intraassay-
Variationskoeffizient: 10,7 % (210±22 pg/ml) 9,7 % (8,6±0,84 ng/ml)
Interassay-
Variationskoeffizient: 10,3 % (237±24 pg/ml) 12,3 % (5,4±0,66 ng/ml)
Sensitivität 5 pg/ml 0,2 ng/ml
Tabelle 1: Meßbereiche und Variationskoeffizienten der Steroidassays
3.6 cAMP-Radioimmunoassay
Der quantitative Nachweis der second messenger cAMP-Produktion in den angelegten
Zellkulturen wurde durch einen Radioimmunoassay (Biotrak cAMP Scintillation
Proximity Assay [SPA] System der Firma Amersham Pharmacia Biotech,
Buckinghamshire, England) im Isotopenlabor der Medizinischen Universität zu Lübeck
geführt. Der Assay basiert auf der konkurrierenden Bindung zwischen unmarkiertem
cAMP und einer festgelegten Menge an mit 125
I-markiertem cAMP an einer begrenzten
Zahl von Bindungstellen auf einem für cAMP spezifischen Antikörper. Da sowohl die
49
Menge des Antikörper als auch die des radioaktiv-markierten Liganden bekannt ist,
spiegelt die Anzahl des vom Antikörper gebundenen radioaktiv-markierten cAMP
umgekehrt proportional die Konzentration des hinzugefügten nicht radioaktiv-markierten
cAMP wieder. Zum Nachweis des an den Antikörper gebundenen cAMP wird ein zweiter
Antikörper hinzugegeben, der das bereits gebundene 125
I-markierte cAMP durch
Fluormikrosphären immobilisiert. Die bei diesem Vorgang zerfallenden
Fluormikrosphären erzeugen Licht, das mit Hilfe eines β-Szintillation-Zählers gemessen
wird. Dadurch kann indirekt ein Rückschluß auf die Menge an gebundenem radioaktiv-
markiertem cAMP gezogen werden. Die Konzentration des unmarkierten cAMP erhält
man durch Extrapolieren einer Standardkurve, die zuvor aus Verdünnungen bekannter
cAMP-Konzentrationen erstellt wurde.
Meßbereich: 0,2-12,8 pmol/Röhrchen (66-4214 pg/ Röhrchen)
Intraassay-Variationskoeffizient: 5,6 % (6,4 pmol/ Röhrchen)
Interassay-Variationskoeffizient: 10,5 % (1,7 pmol/ Röhrchen)
Sensitivität: 78 fmol/tube (26 pg/ Röhrchen)
Tabelle 2: Meßbereich und Variationskoeffizienten des cAMP-Radioimmunoassay
3.7 Datenpräsentation und Statistik
Die Daten der Experimente wurden bei den Versuchen zur Steroidhormon-Basalsekretion
als Absolutwerte angegeben. Die Ergebnisse der mit HCG-stimulierten Zellkulturen
wurden in % des Basalwertes angegeben. Dabei wurde der Basalwert als 100% definiert.
Ebenfalls in Absolutwerten aufgeführt sind die Resultate der totalen cAMP-Produktion.
Die Abbildungen zeigen Mittelwerte und Standardfehler [x + standard error of the mean
(SEM)] von 11-20 Experimenten. Die Unterschiede zwischen den einzelnen
Behandlungsgruppen wurde durch den Mann-Whitney U-Test bzw. bei mehr als zwei
Behandlungsgruppen durch eine Varianzanalyse mit anschließendem Newman-Keuls -Test
geprüft. Es wurden aufgrund der großen Anzahl von Testzeitpunkten für die Abbildungen
repräsentative Daten ausgewählt.
50
4 Ergebnisse
4.1 Patientinnencharakteristik
Das Patientinnenalter reichte von 21 bis 41 Jahre, im Durchschnitt 33,2 Jahre. Die am Tage
der Ovulationsinduktion durch HCG-Gabe gemessenen Serumöstradiolwerte lagen im
Durchschnitt bei 1374 pg/ml. Es ergab sich eine durchschnittliche Zellausbeute von etwa
1.825.000 Zellen/ml. Von den 41 Frauen des Versuchsteils A erhielten 34 eine IVF-
Behandlung mit ICSI aufgrund von männlicher Subfertilität, bei 7 Frauen wurde ein
konventionelles IVF wegen tubarer Sterilität durchgeführt. In den Versuchsteil B wurden
insgesamt 10 Frauen aufgenommen, wobei sich 7 aufgrund männlicher Subfertilität und 3
wegen tubarer Sterilität der Therapie unterzogen.
4.2 Effekte der in-vivo-Behandlung mit GnRH-Analoga auf die Steroidbiosynthese
kultivierter humaner Granulosaluteinzellen
Bei der Auswertung der Meßergebnisse für die Syntheseleistung von Progesteron und
Östradiol richtete sich das Augenmerk zunächst auf die möglichen Effekte der GnRH-
Analoga auf die basale Akkumulation der beiden Sexualsteroide. Im Laufe der 72-
stündigen Kulturzeit stieg die Akkumulation der Steroidhormone stetig an. Dabei ließ sich
zu keinem der verschieden Zeitpunkte ein signifikanter Einfluß auf die Hormonproduktion
der kultivierten Zellen erkennen, die von in vivo mit Ganirelix behandelten Patientinnen
stammten (Verweis auf Abb. 14 und 15). Als Kontrolle dienten die Zellkulturen von
Patientinnen, welche zuvor den GnRH-Agonisten Triptorelin erhalten hatten. Dies war
möglich, da sich in früheren Experimenten herausgestellt hatte, daß Triptorelin keinen
signifikanten Einfluß auf die Steroidbiosynthese humaner Granulosaluteinzellen hat. Die
Progesteronauschüttung zeigte sich in den Zellen tendenziell etwas niedriger, die durch
Follikelpunktionen von Frauen gewonnen worden waren, welche in vivo den GnRH-
Antagonisten Ganirelix erhalten hatten. Ein ähnlicher Effekt im Bezug auf die
Östradiolproduktion ließ sich nicht nachweisen.
51
Die Hormonsyntheseleistung unter der Stimulation mit 5 IU HCG über 6 Stunden wurde
ebenfalls nicht signifikant durch Gabe von GnRH-Analoga beeinflußt ( Abb. 14 und 15,
unterer Graph). Innerhalb der ersten 48 Stunden der Inkubationszeit wiesen die Zellen der
in vivo mit Ganirelix behandelten Frauen eine minimal stärkere Progesteron- und
Östradiolsynthese unter HCG-Stimulation auf als die korrespondierenden Zellkulturen der
Patientinnen, die eine agonistische Behandlung erhalten hatten. Nach 72-stündiger
Kulturdauer zeigte sich ein gegenteiliger Effekt; die Produktionsleistung beider
Steroidhormone war in den aus antagonistischer Behandlung stammenden Zellen
geringfügig schwächer als die Hormonsynthese in den Zellkulturen von agonistisch
behandelten Frauen (Abb. 14 und 15, unterer Graph). Beide Effekte lagen allerdings nicht
im Bereich statistischer Signifikanz.
52
Abb. 14: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die basale
und HCG-stimulierte Progesteronausschüttung (P) kultivierter humaner
Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit
Triptorelin oder Ganirelix vorbehandelt wurden. Die
Progesteronakkumulation wurde in 24-stündigen Intervallen gemessen
(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6
Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20
Versuchen sind abgebildet (x+SEM).
24h 48h 72h
0
100
200
300
Triptorelin
Ganirelix
Kulturdauer
P[%
d
er B
asa
lse
kre
tio
n]
24h 48h 72h
0
100
200
Triptorelin
Ganirelix
Kulturdauer
P [n
g/m
l]
53
Abb. 15: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die basale
und HCG-stimulierte Östradiolausschüttung (E) kultivierter humaner
Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit
Triptorelin oder Ganirelix vorbehandelt wurden. Die
Östradiolakkumulation wurde in 24-stündigen Intervallen gemessen
(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6
Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20
Versuchen sind abgebildet (x+SEM).
24h 48h 72h
0
1000
2000
Triptorelin
Ganirelix
Kulturdauer
E [p
g/m
l]
24h 48h 72h
0
50
100
150
Triptorelin
Ganirelix
Kulturdauer
E [%
de
r B
as
alse
kre
tio
n]
54
4.3 Effekte der in vitro-Behandlung mit Ganirelix auf die Steroidbiosynthese kultivierter
humaner Granulosaluteinzellen
Nachdem in einer Reihe von Experimenten das Verhalten der Granulosaluteinzellen auf
die in vivo-Behandlung mit GnRH-Analoga untersucht worden war, wurde in weiteren
Versuchen ein möglicher Effekt von Ganirelix auf die Steroidbiosynthese nach in vitro-
Behandlung geprüft. Ergebnisse aus früheren Experimenten hatten gezeigt, daß eine in
vivo-Behandlung mit dem GnRH-Agonisten Triptorelin keinen signifikanten Einfluß auf
die Steroidhormonproduktion der Zellen mit sich brachte. Daher konnten nun derartig
vorbehandelte Zellen für die weiteren Untersuchungen verwendet werden. Bezüglich der
basalen Progesteron-und Östradiolakkumulation waren in der 72 Stunden lang
durchgeführten Kulturzeit keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zellen, deren
Medium Ganirelix in der Konzentration 1nM enthielt, und den mit Kontrollmedium
inkubierten Zellen festzustellen (Abb. 16 und 17, oberer Graph). Die gemessenen Werte
für die Östradiolakkumulation unter in vitro-Gabe von Ganirelix waren nach 48 Stunden
sowie nach 72 Stunden Inkubationszeit sogar nahezu identisch mit den für die
Kontrollgruppe ermittelten Werten.
Auch für die Hormonproduktion unter HCG-Stimulation konnte kein signifikanter Effekt
auf die Granulosaluteinzellen durch in vitro-Gabe des GnRH-Antagonisten nachgewiesen
werden. Dabei wurde ein Teil der Zellen ebenfalls mit 5 IU HCG für 6 Stunden stimuliert
(Abb. 16 und 17, unterer Graph). In den ersten 48 Stunden der Inkubationszeit lagen
sowohl die stimulierte Progesteron- als auch die stimulierte Östradiolausschüttung etwas
über der Hormonsekretion der im Kontrollmedium kultivierten Zellen. Ebenso wie schon
in den Experimenten zum Einfluß der in vivo-Applikation von GnRH-Analoga
beschrieben, ergaben sich für die Steroidbiosyntheseleistung der in vitro antagonistisch
behandelten Zellen nach 72 stündiger Kulturzeit geringfügig kleinere Meßwerte als für die
Produktionsleistung der Zellen in der Kontrollgruppe (Abb. 16 und 17, unterer Graph).
Auch diese Beobachtungen waren allerdings nicht signifikant.
55
Abb. 16: Effekte der in vitro-Behandlung mit Ganirelix auf die basale und HCG-
stimulierte Progesteronausschüttung (P) kultivierter humaner
Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit
Triptorelin behandelt wurden. Unter direkter Applikation von Ganirelix in
das Kulturmedium wurde die Progesteronakkumulation in 24-stündigen
Intervallen gemessen, als Kontrolle diente die in vitro Gabe von Triptorelin
(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6
Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20
Versuchen sind abgebildet (x+SEM).
24 h 48 h 72 h
0
50
100
150
Kontrolle
Ganirelix
Kulturdauer
P[n
g/m
l]
24 h 48 h 72 h
0
100
200
300
Kontrolle
Ganirelix
Kulturdauer
P[%
d
er B
asa
lse
kre
tio
n]
56
Abb. 17: Effekte der in vitro-Behandlung mit Ganirelix auf die basale und HCG-
stimulierte Östradiolausschüttung (E) kultivierter humaner
Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit
Triptorelin behandelt wurden. Unter direkter Applikation von Ganirelix in
das Kulturmedium wurde die Östradiolakkumulation in 24-stündigen
Intervallen gemessen, als Kontrolle diente die in vitro Gabe von Triptorelin
(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6
Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20
Versuchen sind abgebildet (x+SEM).
24 h 48 h 72 h
0
2500
5000
7500
10000
Kontrolle
Ganirelix
Kulturdauer
E [p
g/m
l]
24 48 72
0
100
200
Kontrolle
Ganirelix
Kulturdauer
E[%
d
er B
asalsek
re
tio
n]
57
4.4 Effekte der in vitro-Gabe von GnRH-Analoga auf die cAMP-Akkumulation
kultivierter
humaner Granulosaluteinzellen
Aufgrund der bereits beschriebenen zentralen Bedeutung des ‘second messenger’ cAMP
für die Signaltransduktion innerhalb der Steuerung von ovarieller Steroidhormonsynthese-
und sekretion lag es nah, auch einen eventuellen Einfluß der GnRH-Analoga auf die
cAMP-Produktion von Granulosaluteinzellen zu untersuchen. Die für 48 Stunden
inkubierten Zellen stammten von Patientinnen, die ausschließlich mit dem GnRH-
Agonisten Triptorelin und HMG vorbehandelt waren. In früheren Studien konnte bewiesen
werden, daß eine derartige Behandlung keinen Effekt auf die Steroidbiosynthese der Zellen
hat. Daher bestand die Möglichkeit, diese Zellen für die Untersuchung der oben genannten
Fragestellung zu verwenden. Weder die Zellkulturen, deren Medium den GnRH-
Antagonisten Ganirelix in der Konzentration 1 nM enthielt, noch die Zellen, in deren
Medium der GnRH-Agonist Triptorelin in gleicher Konzentration appliziert worden war,
zeigten signifikante Unterschiede in ihrer totalen cAMP-Akkumulation verglichen mit
einer unbehandelten Kontrollgruppe über 48 Stunden Inkubationszeit (Abb. 18).
Auch die in den letzten 6 Stunden durchgeführte Stimulation mit 5 IU HCG erbrachte
keine signifikante Beeinflussung der cAMP-Produktion. Als Basalwert wurde die cAMP-
Bildung einer Kontrollgruppe eingesetzt, die weder GnRH-Agonisten noch -Antagonisten
erhalten hatte (Abb.19 B). Ebenso ergaben sich bezüglich der cAMP-Bildung von
Granulosaluteinzellen unter Stimulation ähnliche Werte wie für die unstimulierten
Kulturen (Abb. 19 A und B).
Die in vitro agonistisch behandelten Zellen erreichten sowohl mit als auch ohne HCG-
Stimulation prozentual etwas höhere Werte für die cAMP-Produktion als die in vitro mit
Ganirelix behandelten Zellen (Abb. 19 A und B). Dieser Effekt war jedoch zu gering
ausgeprägt, als daß der Nachweis einer statistischen Signifikanz zu führen gewesen wäre.
58
Abb. 18: Absolute cAMP-Produktion kultivierter humaner Granulosaluteinzellen in
48 Stunden.
Die Zellen wurden mit 1nmolar Ganirelix bzw. 1nmolar Triptorelin
behandelt oder blieben unbehhandelt (oberer Graph). In den letzten 6
Stunden der Kulturzeit wurde ein Teil der Zellen mit 5 IU HCG stimuliert
(unterer Graph). Alle Zellen stammen von Patientinnen, die mit Triptorelin
und HMG vorbehandelt wurden. Es ist ein repräsentatives Experiment von
insgesamt sieben Versuchen abgebildet (x+SEM).
Ohne Stimulation
unbehandelt 48 h Gani 48 h Tripto
0
10
20
30
pm
ol/m
l cA
MP
5U hCG
unbehandelt 48 h Gani 48 h Tripto
0
100
200
300
pm
ol/m
l cA
MP
Keine Stimulation
5 IU hCG
59
Abb. 19: Basale cAMP-Produktion (A) bzw. cAMP-Produktion unter HCG
Stimulation (B) für 6 Stunden.
Alle kultivierten Zellen stammen von Patientinnen, die mit dem GnRH-
Agonisten Triptorelin sowie HMG vorbehandelt wurden. Repräsentative
Daten von sieben Experimenten sind abgebildet (x+SEM).
Ohne Stimulation
Kontrolle Ganirelix Triptorelin
0
50
100
150
% d
er K
on
tro
lle
5U hCG
Kontrolle Ganirelix Triptorelin
0
50
100
150
% der K
ontro
lle
A
B
Keine Stimulation
5 IU hCG
60
5 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit werden erstmalig ausführliche Untersuchungen zu den
möglichen Effekten des GnRH-Antagonisten Ganirelix auf die Steroidbiosynthese
humaner Granulosaluteinzellen präsentiert. Zusätzlich wurden im in vitro-Modell die
Wirkungen von GnRH-Analoga auf die Akkumulation des second messenger cAMP in
Granulosaluteinzellen untersucht. Auch unter variierenden Behandlungsschemata konnte
keinerlei signifikante Beeinflussung der Steroidhormonproduktion sowie der cAMP-
Bildung durch den Einsatz der GnRH-Analoga festgestellt werden.
5.1 Wirkungen von GnRH-Analoga auf die Steroidbiosynthese
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche legen dar, daß der GnRH-
Antagonist Ganirelix nach einer in vivo-Verabreichung keine signifikanten Effekte auf die
Steroidbiosynthese humaner Granulosaluteinzellen hervorruft. Da in früheren
Experimenten ebenfalls keine signifikante Beeinflussung der Hormonproduktion im
Anschluß an eine in vivo Applikation des GnRH-Agonisten Triptorelin nachgewiesen
werden konnte, kamen Granulosaluteinzellen von zuvor mit Triptorelin behandelten
Frauen als Kontrollgruppe zum Einsatz. Die Zellen der in vivo antagonistisch stimulierten
Frauen zeigten bezüglich der basalen Hormonsynthese geringfügig niedrigere Meßwerte
für Progesteron und Östradiol als die parallel beobachtete Kontrollgrupppe. Allerdings
erreichten die Ergebnisse nicht den Bereich statistischer Signifikanz. Unter sechsstündiger
HCG-Stimulation fanden sich für beide Sexualsteroide übereinstimmende Tendenzen. Die
gonadotropinstimulierte Östrogen- wie auch die Progesteronsynthese der antagonistisch
vorbehandelten Zellen lag nach 24-stündiger Kulturzeit über der Syntheserate der
agonistisch behandelten Gruppe. Nach 48 sowie 72 Stunden zeigten sich wiederum
übereinstimmend für beide Hormone eine geringere Produktionsleistung im antagonistisch
vorbehandelten Zellkollektiv. Auch diese Differenzen waren nicht signifikant.
61
Eine mögliche Erklärung für die gemachten Beobachtungen könnte eine zu geringe
Konzentration der GnRH-Analoga im Kulturmedium während der Inkubationsphase sein.
Daher wurden in weiteren Versuchen zur Überprüfung dieser Hypothese die GnRH-
Analoga in 1 nM Konzentration direkt dem Kulturmedium zugegeben. Jedoch ergab sich
auch für die in vitro-Applikation der Substanzen keinerlei Hinweis auf eine signifikante
Beeinflussung der ovariellen Hormonproduktion. Sowohl die basale Östradiol- bzw.
Progesteron-Akkumulation wie auch die Hormonsekretion unter HCG-Stimulation zeigten
keine relevanten Unterschiede nach Gabe des GnRH-Antagonisten im Vergleich zur
Kontrolle.
Eine direkte Einflussnahme der GnRH-Analoga hat das Vorhandensein spezifischer
GnRH-Rezeptoren zur Voraussetzung. Die Expression von GnRH-Rezeptoren im
Nagetierovar gilt mittlerweile als sichergestellt (Gore-Langton et al., 1981; Clayton und
Catt, 1981; Pieper et al., 1981; Huesh et al., 1984). Demgegenüber gibt es
widersprüchliche Erkenntnisse über ein Vorkommen spezifischer GnRH-Rezeptoren im
menschlichen Ovar. Zwar konnten Clayton und Huhtaniemi 1982 keine spezifische GnRH-
Bindung im Corpus luteum nachweisen, aber mittels in situ-Autoradiographie gelang es
einer französischen Arbeitsgruppe 1989 hochaffine Bindungsstellen in Granulosazellen des
dominanten Follikels darzustellen (Latouche et al., 1989). Zuvor waren niedrigaffine
Bindungsstellen im humanen Corpus luteum nachgewiesen worden (Bramley et al., 1985).
In einer jüngeren Studie waren Brus et al. 1997 durch die Verwendung von Rezeptorassays
in der Lage, GnRH-Rezeptoren in via Follikelpunktionen gewonnenen
Granulosaluteinzellen zu dokumentieren. Da die Rezeptordarstellung in präovulatorischen
Follikeln nicht glückte, ist davon auszugehen, daß es in humanen Granulosazellen erst im
Anschluß an den mittzyklischen LH-Gipfel zur Ausprägung von GnRH-Rezeptoren
kommt.
Nachdem die Klonierung und Charakterisierung des humanen GnRH-Rezeptors gelungen
war (Kakar et al., 1992), wurden vermehrt Versuche unternommen, die GnRH-Rezeptor
mRNA zur Darstellung zu bringen. Unter Verwendung der Reverse Transkriptase-
Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), wodurch die mRNA zunächst in DNA
umgeschrieben und anschließend mittels der PCR amplifiziert werden konnte, wurde die
Detektierung der GnRH-Rezeptor mRNA im humanen Ovar möglich (Kakar et al., 1994;
Peng et al., 1994).
62
Minaretzis et al. beschrieben daraufhin die unterschiedliche Expression der GnRH-
Rezeptor mRNA in Zusammenhang mit verschiedenen Stadien des Menstruationszyklus
(Minaretzis et al., 1995). Auch im humanen Corpus luteum gelang es durch in-situ-
Hybridisierung eine sehr schwach ausgeprägte Expression aufzuzeigen (Fraser et al.,
1996). Als besonders aufschlußreich erwies sich eine Veröffentlichung von Peng et al. aus
dem Jahre 1994, in der erstmalig die Expression der GnRH- und GnRH-Rezeptor mRNA
in humanen Granulosaluteinzellen belegt werden konnte. Ferner wurde die direkte
Steuerfunktion von GnRH auf die mRNA-Spiegel und damit die Syntheseleistung seines
eigenen Rezeptors offenbart. Es zeigte sich, daß die Anwesenheit des Gonadotropin-
Releasing Hormons zu einer gesteigerten Expression der mRNA seines Rezeptors führte,
wohingegen HCG die mRNA-Spiegel abfallen ließ. Diese Beobachtungen verdeutlichen
die Rolle des GnRH als autokriner und auch parakriner Regulator im menschlichen Ovar.
Der Nachweis von GnRH-Rezeptoren in menschlichen Granulosaluteinzellen legt die
Vermutung nah, daß sie GnRH-gesteuerte Regulationsvorgänge innerhalb der Zellen
vermitteln. Allerdings ist die Konzentration des hypothalamisch gebildeten GnRH im
peripheren Kreislauf so gering, daß eine Aktivierung der ovariellen GnRH-Rezeptoren
eher unwahrscheinlich ist. Die Anwendung von GnRH-Analoga im Rahmen einer
kontrollierten ovariellen Hyperstimulation führt dagegen zu weit höheren Konzentrationen
der Substanzen im Serum, wodurch die Aktivierung der Rezeptoren möglich wird. Im
Gegensatz zu den wenigen bislang veröffentlichten Untersuchungen über eine mögliche
direkte Einflußnahme der GnRH-Antagonisten auf das menschliche Ovar liegen eine
Vielzahl von Berichten bezüglich agonistischer Effekte auf die ovarielle
Steroidbiosynthese vor. Einige Studien befassten sich mit den Auswirkungen einer in vivo-
Applikation agonistischer Präparate auf die ovarielle Steroidbiosynthese kultivierter
Granulosaluteinzellen. Dabei fand sich übereinstimmend eine verminderte
Progesteronproduktion der agonistisch vorbehandelten Zellen, wobei verschiedene COH-
Regime sowie unterschiedliche GnRH-Agonisten eingesetzt wurden (Hamori et al., 1992;
Dirnfeld et al., 1993).
Dagegen liegen deutlich mehr Veröffentlichungen zum direkten Einfluß von GnRH-
Agonisten auf die ovarielle Hormonproduktion vor. So postulierten Casper et al. für GnRH
selbst wie auch für einen GnRH-Agonisten keinen direkten Einfluß auf humane
63
Granulosazellen aus präovulatorischen Follikeln, da sie keine inhibitorische Wirkung auf
die Steroidbildung aufwiesen (Casper et al., 1982). Des weiteren war es Fabbri et al. 1996
nicht möglich, einen Effekt des GnRH-Agonisten Leuprorelin auf die Östradiolbildung
humaner präovulatorischer Granulosazellen zu demonstrieren. Die Zellen hatten
Leuprorelin in verschiedenen Konzentrationen über eine Kulturdauer von 24 bis zu 72
Stunden erhalten, jedoch unterschieden sich die für das jeweilige Inkubationsintervall
gemessenen Östradiolwerte nicht signifikant von den zum Vergleich herangezogenen
basalen Akkumulationswerten. Dagegen konnte ein deutlicher Anstieg der
Östradiolproduktion in Granulosazellen beobachtet werden, die zuvor FSH in vitro
erhalten hatten (Fabbri et al., 1996). Eine andere Studie deckte den Zusammenhang
zwischen der agonistischen Wirkung auf die Steroidbiosynthese humaner Granulosazellen
und dem Grad der Follikelreifung auf. Unter Zugabe eines GnRH-Agonisten zum
Kulturmedium unterschieden sich die basale und gonadotropinstimulierte
Progesteronsekretion kultivierter humaner Granulosazellen der frühen bzw. mittleren
Follikelphase signifikant von der Hormonproduktion der Zellen, die in der späten
Follikelphase kultiviert worden waren (Olsson et al., 1990).
Die Mehrheit der Studien, die sich mit direkten Wirkungen von GnRH und seinen Analoga
auf die Hormonsynthese präovulatorischer Granulosazellen beschäftigt haben, weist auf
eine inhibitorische Wirkung der GnRH-Analoga auf die Hormonproduktion hin (Tureck et
al., 1982; Bussenot et al., 1993; Uemura et al., 1994). Diese Ergebnisse überraschen, da
mittlerweile das Fehlen von ovariellen GnRH-Rezeptoren während der Follikelphase
nachgewiesen werden konnte (Brus et al., 1997). Für Granulosaluteinzellen, die von
Frauen innerhalb der IVF-Therapie gewonnen wurden, ergaben sich für die basale sowie
die gonadotropinstimulierte Steroidbiosynthese neben stimulatorischen und inhibitorischen
auch keinerlei Effekte nach GnRH-Agonisten-Applikation. Eine französische
Arbeitsgruppe belegte die dosisabhängige Wirkung des Agonisten Buserelin auf die
Sexualsteroidsynthese kultivierter präovulatorischer Granulosazellen. Die Zugabe von
Buserelin in der Konzentration 1 ng/ml in das Kulturmedium hatte einen Anstieg der
Östradiol- und Progesteronsekretion zur Folge. Dagegen war ein vergleichbarer Effekt bei
höheren Konzentrationen nicht mehr nachweisbar (Parinaud et al., 1988). Guerrero et al.
fanden 1993 eine gesteigerte Progesteronproduktion nach agonistischer in vitro-
Stimulation, die Östradiolsynthese aber zeigte sich vermindert. Dieselbe Gruppe beschrieb
eine verminderte Progesteronproduktion bei in vivo agonistisch vorbehandelten Corpus
64
luteum-Zellen von Ratten sowie eine Verringerung der lutealen LH-Rezeptorzahl nach 48-
stündiger Inkubationszeit in Anwesenheit des Agonisten. Diese inhibitorischen Wirkungen
könnten eine Erklärung für den relativ hohen Verbrauch an Gonadotropinen zur Erzeugung
der kontrollierten ovariellen Hyperstimulation sein (Guerreo et al., 1993). Eine andere
Studie wies eine direkte Inhibition der ovariellen Steroidbiosynthese durch GnRH-
Agonisten sowohl im in vitro-Modell als auch unter in vivo Bedingungen nach (Uemura et
al., 1994). Im gleichen Jahr beschrieb Gaetje eine dosisabhängige Verminderung der
Progesteron- und Östradiolsekretion humaner Granulosaluteinzellen nach Addition von
GnRH oder eines GnRH-Agonisten in das Kulturmedium (Gaetje, 1994). Dagegen führte
der Einsatz des GnRH-Agonisten Leuprorelin an kultivierten humanen
Granulosaluteinzellen und Thekazellen in vitro weder zu einer Steigerung noch zu einer
Verminderung der Östradiol-und Progesteronwerte bzw. der Androstendionproduktion.
Allerdings reagierten die Zellen auf die Gabe von HCG mit einem deutlichen Anstieg
beider Sexualhormonspiegel (Frederick et al., 1991). Eine 1992 veröffentlichte Studie
vermutete sogar das völlige Fehlen von ovariellen GnRH-Rezeptoren, da die
Progesteronssynthese der kultivierten humanen Granulosazellen keine Unterschiede
aufwies, nachdem die Zellen neben GnRH auch FSH, LH und cAMP zur Stimulation
erhalten hatten (Torok et al., 1992). Interessanterweise scheinen die GnRH-Agonisten
Buserelin und Leuprorelin eine stimulierende Wirkung auf die ovarielle
Östradiolproduktion zu haben, wohingegen GnRH selbst sowie der GnRH Agonist
Triptorelin keinerlei aktive Rolle im Hinblick auf die Steroidbiosynthese erkennen lassen
(Bussenot et al., 1993).
Über die Wirkungsweise von GnRH-Antagonisten am menschliche Ovar gibt es bisher nur
sehr wenige Informationen. Neben den hier vorgetragenen Ergebnissen liegen wenige
Veröffentlichungen vor, die in ihren Beobachtungen differieren. In einer Studie, die dieser
Fragestellung nachging, wurden Granulosaluteinzellkulturen von Patientinnen angelegt,
welche mit dem Ziel einer kontrollierten ovariellen Hyperstimulation in vivo entweder den
GnRH-Agonisten Leuprorelin oder den Antagonisten Nal-Glu erhalten hatten. Die sich
anschließende Messung der Steroidsyntheseleistung ergab keine Unterschiede zwischen
beiden Zellgruppen für die basale Progesteronakkumulation und die Progesteronproduktion
nach Gonadotropinstimulation. Allerdings waren in der antagonistisch vorbehandelten
65
Zellgruppe signifikant niedrigere Östradiolwerte und eine geringere Aromatasaktivität
innerhalb der ersten 6 Stunden der Kulturzeit nachweisbar (Minaretzis et al., 1995).
Dagegen fanden Lin et al. 1999 in einer ähnlich angelegten Studie, wobei zur ovariellen
Stimulation der Agonist Buserelin und der Antagonist Cetrorelix verwendet worden waren,
keine Differenzen für die basale Progesteron- und Östradiolakkumulation nach 48-
stündiger Inkubationszeit. Allerdings fiel eine früher einsetzende Reaktion und eine stärker
ausgeprägte Ansprechbarkeit der antagonistisch vorbehandelten Granulosaluteinzellen auf
den Reiz der Gonadotropinstimulation auf, die eventuell mit der sehr viel kürzeren
Applikationsdauer des GnRH-Antagonisten in vivo zu erklären ist. Als mögliche Gründe
für die uneinheitlichen Ergebnisse beider Studien sind zum einen der Einsatz
unterschiedlicher GnRH-Analoga, zum anderen aber ebenso die verschiedenartigen
Gegebenheiten während der Kulturphase (Addition von Testosteron bzw. cAMP mit und
ohne HCG-Zusatz in das Kulturmedium durch Lin et al.) zu nennen. Ferner ist auch die
deutlich größere Fallzahl der neueren Studie zu berücksichtigen (25 Patientinnen vs. 12
Patientinnen in der ersten Untersuchung).
In einer aktuellen Studie wurden die Konzentrationen von Östradiol, Progesteron und
Testosteron in der Follikelflüssigkeit von Frauen gemessen, die im Rahmen der COH
entweder mit einem Agonisten oder dem GnRH-Antagonisten Cetrorelix vorbehandelt
wurden. Es fiel auf, daß die durchschnittliche Östradiolkonzentration der
Follikelflüssigkeit signifikant niedriger in der Gruppe der antagonistisch behandelten
Frauen war. Dieses Ergebnis korrelierte mit den durchschnittlich gemessenen
Serumöstradiolkonzentrationen in beiden Gruppen. Allerdings fanden sich keine
signifikanten Unterschiede für die Progesteron- und Testosteronkonzentrationen in der
Follikelflüssigkeit nach agonistischer und antagonistischer Behandlung. Des weiteren war
der Quotient aus Östradiol- und Testosteronkonzentration bei der antagonistisch
vorbehandelten Gruppe deutlich reduziert, dagegen ergaben sich für den
Progesteron/Testosteron-Quotienten und den Östradiol/Progesteron-Quotienten keine
signifikanten Unterschiede. Aufgrund ihrer Beobachtungen vermutete diese
Forschergruppe, daß die Behandlung mit GnRH-Antagonisten im Rahmen der COH einen
Effekt auf die follikuläre Steroidhormonproduktion haben könnte (Garcia-Velasco et al.,
2001).
In den hier dargelegten Untersuchungen hatte der verwendete Antagonist Ganirelix weder
nach in vivo- noch unter in vitro-Applikation einen Einfluß auf die basale und die HCG-
66
stimulierte Östradiol- bzw. Progesteronproduktion von humanen Granulosaluteinzellen.
Wenn also den bisherigen Studien zufolge GnRH als parakriner und autokriner Regulator
mit inhibitorischer Wirkung am Ovar fungiert, ist bei kultivierten Granulosaluteinzellen,
die von antagonistisch stimulierten Frauen stammen, in vitro ein Anstieg der
Steroidhormonproduktion zu erwarten. Die hier präsentierten Daten schließen diese
Reaktion nicht aus, das es durch die große Menge an exogen zugeführten Gonadotropinen
im Verlauf der COH zu einer Minderexpression der GnRH-Rezeptoren im Ovar kommen
könnte (Peng et al., 1994).
Andererseits muß man davon ausgehen, daß es nach 48-stündiger Inkubationszeit zu einer
Normalisierung der Rezeptorexpression gekommen ist. Um einen eventuell zu kurz
angelegten Beobachtungszeitraum ausschließen zu können, wurde die Inkubationszeit der
Granulosaluteinzellkulturen in den vorliegenden Untersuchungen auf 72 Stunden
ausgedehnt. Aber auch nach dieser Zeit zeigt der GnRH-Antagonist keinerlei Effekt auf die
Steroidbiosynthese. In humanen Granulosaluteinzellen, die bei IVF-Zyklen ohne HMG-
Stimulation gewonnen worden waren, wurde eine hohe Rezeptoraffinität für den
verwendeten GnRH-Agonisten Buserelin nachgewiesen. Ebenso konnte von derselben
Arbeitsgruppe gezeigt werden, daß ovarielle GnRH-Rezeptoren den GnRH-Antagonisten
Antide spezifisch binden (Brus et al., 1997). Da ein anderer GnRH-Antagonist an diese
GnRH-Rezeptoren binden konnte, bindet wahrscheinlich auch der hier verwendete
Antagonist Ganirelix. Wenn Granulosaluteinzellen GnRH-Rezeptoren exprimieren, so
müssen diese aber nicht ausschließlich über GnRH und seine Analoga die
Steroidbiosynthese steuern. Von Ovarial-und Endometriumkarzinomzellen ist bekannt, daß
eine Aktivierung ihrer GnRH-Rezeptoren durch GnRH oder -Analoga zur einer
Wachstumshemmung führt. Außerdem kommt es nach Aktivierung des GnRH-Rezeptor zu
einer Verminderung der Zellteilungsaktivität und nicht wie beim hypophysären Rezeptor
zu einer Induktion der Phospholipase C-abhängigen Signaltransduktionskaskade (Emons et
al., 1996 und 1997). Folglich schließt die fehlende Beeinflussung der ovariellen
Steroidbiosynthese durch Ganirelix in der vorliegenden Arbeit generelle Reaktionen im
Ovar auf GnRH-Antagonisten nicht aus.
Demnach sind weiterführende Untersuchungen nötig, um die Wirkungsweise der GnRH-
Antagonisten im Ovar vollständig aufklären zu können. Dies gilt besonders in der Frage
der Auswirkungen verschiedener Behandlungsprotokolle. Jedoch kann anhand der
67
Resultate im Rahmen der vorliegenden Arbeit, eine Beeinflussung der ovariellen
Steroidbiosynthese durch den GnRH-Antagonisten Ganirelix nicht nachgewiesen werden
(Weiss et al., 2001).
68
5.2 Wirkungen der GnRH-Analoga auf die cAMP-Produktion
Der intrazellulär agierende second messenger cAMP spielt eine zentrale Rolle innerhalb
der rezeptorgesteuerten Signaltransduktionswege im menschlichen Ovar (Leung und
Steele, 1992; Zeleznik, 2001). Er ist in seiner Funktion als Bindeglied zwischen einem
extrazellulären Stimulus und den daraus resultierenden intrazellulären
Regulationsmechanismen auch am Prozeß der Steroidbiosynthese im Ovar beteiligt
(Amsterdam et al., 1994; Mukherjee et al., 1996; Thomson, 1998; Conti, 2002). Folglich
standen im zweiten Teil dieser Studie die Auswirkungen der in vitro-Applikation von
GnRH-Analoga auf die cAMP-Produktion kultivierter humaner Granulosaluteinzellen im
Vordergrund.
Die im Anschluß an die Experimente mittels Radioimmunoassay durchgeführte
Bestimmung der zellulären cAMP-Produktion ergab für die basale cAMP-Bildung keine
signifikante Differenz zwischen der antagonistisch bzw. agonistisch behandelten Zell- und
der Kontrollgruppe. Nach sechsstündiger Gonadotropinstimulation zeigte sich ebenso kein
Effekt auf die cAMP-Produktion. Alle Zellen reagierten mit einer deutlichen Steigerung
der cAMP-Bildung auf das applizierte HCG, allerdings ließen die Gruppen untereinander
keine signifikanten Kontraste im Bezug auf die HCG-stimulierte cAMP-Bildung erkennen.
Die vorgenannten Ergebnisse machen zum einen deutlich, daß der GnRH-Antagonist
Ganirelix bei in vitro-Applikation keinen Effekt auf die basale cAMP-Bildung humaner
Granulosaluteinzellen ausübt. Zum anderen wird die HCG-stimulierte cAMP-
Akkumulation durch die Anwesenheit des Antagonisten ebenfalls nicht beeinflusst. Somit
ist davon auszugehen, daß der physiologische Ablauf der Signaltransduktion im Anschluß
an seine Aktivierung durch die Gonadotropine nicht durch die Anwesenheit von GnRH-
Analoga gestört wird. Bereits seit den frühen achtziger Jahren ist bekannt, daß die
Gonadotropine LH und FSH ihre regulatorischen Aufgaben im Ovar über eine Steuerung
der cAMP-assozierten Postrezeptormechanismen erreichen (Knecht et al., 1981; Nimrod,
1981). Daher wurden schon frühzeitig die Zusammenhänge zwischen Gonadotropinspiegel
und second messenger Akkumulation untersucht. Ein für diese Fragestellung besonders
geeignetes Modell stellt die Granulosazellkultur dar. Die unter relativ geringem Aufwand
verfügbaren Granulosazellen eignen sich besonders gut für die Erforschung des
Zusammenspiels der beteiligten Faktoren. In mehreren voneinander unabhängig
69
durchgeführten Studien wurden in Gegenwart von Gonadotropinen eine vermehrte second
messenger-Produktion und eine gesteigerte Steroidbiosynthese in Granulosazellen erfaßt.
Knecht et al. dokumentierten bereits 1981 in einer über 48 Stunden angelegten
Granulosazellkultur unter Zugabe von FSH eine deutlich gesteigerte cAMP- bzw. cGMP-
Akkumulation. Zugleich war die Progesteronproduktion der Zellen erhöht. Derselbe
gonadotropinassoziierte Effekt wurde in anderen Untersuchungen vergleichbaren Aufbaus
nachgewiesen (Nimrod, 1981; Ranta et al., 1982).
Parallel dazu stellte die Analyse der GnRH-spezifischen Wirkungen auf die ovarielle
Signaltransduktion einen weiteren Forschungsschwerpunkt dar. Die Ergebnisse aus
mehreren Studien legten die Vermutung nahe, daß GnRH durch eine Suppression der
gonadotropinvermittelten cAMP-Bildung die Steroidbiosynthese in den Granulosazellen
hemmen könnte. In Experimenten ergab sich sowohl für kultivierte Granulosazellen vom
Schwein als auch für Granulosazellen der Ratte eine Verminderung der
gonadotropinvermittelten cAMP-Akkumulation, nachdem den Kulturen GnRH oder ein
GnRH-Agonist zugegeben worden war. Der hemmende Effekt erstreckte sich ebenso auf
den Bereich der Steroidbiosynthese (Knecht et al., 1981; Ranta et al., 1983). In einer
Rattengranulosazellkultur hatte die in vitro-Applikation eines GnRH-Agonisten eine
Hemmung der Adenylatcyclaseaktivität und eine verstärkte Mobilisierung von
Phosphodiesterasen zur Folge. Der antigonadale Effekt des GnRH bzw. der GnRH-
Agonisten scheint somit auf der additiven Wirkung aus einer verminderten Bildungsrate
und einem gleichzeitig forciertem Abbau von cAMP zu beruhen (Knecht und Catt, 1981).
Ranta et al. testeten den in vivo-Effekt eines GnRH-Agonisten an Granulosazellen, die
zuvor hypophysektomierten Ratten entnommen worden waren. Sie entdeckten, daß die
Fähigkeit des Agonisten zur Inhibition der Adenylatcyclase im Zusammenhang mit einem
Verlust spezifischer FSH-Bindungsstellen stand (Ranta et al., 1983).
Im Bezug auf die Aktivierung ovarieller Postrezeptormechanismen unterscheidet sich
GnRH jedoch von den Gonadotropinen, deren Bindung an den Granulosazellrezeptor mit
der Aktivierung der Proteinkinase A und damit dem second messenger cAMP assoziiert
ist. Demgegenüber ist GnRH in der Lage, mehrere unterschiedliche
Signaltransduktionskaskaden zu aktivieren. Neben einer Stimulierung der Proteinkinase C-
abhängigen Enzyminduktion in Rattengranulosazellen (Naor und Yavin, 1982; Wang et al.,
70
1992) führte die Aktivierung des GnRH-Rezeptors in humanen Granulosazellen auch zu
einem erhöhten Ca2+
-Einstrom in die Zelle (Hori et al., 1998). Bei vergleichenden
Experimenten fielen nach in vitro-Stimulation mit einem GnRH-Analogon bzw. nach LH-
Applikation unterschiedliche Reaktionen kultivierter Ratten-Granulosazellen auf. Im
Anschluß an eine GnRH-Stimulation der Zellen konnte keine Veränderungen der cAMP-
Bildungsrate entdeckt werden (Hillensjo und LeMaire, 1980). Daher wurde angenommen,
daß das Gonadotropin-Releasing Hormon und seine Analoga ähnliche Reaktionen wie
Gonadotropine während der ovariellen Follikulogenese hervorrufen können, zur
Durchführung ihre Aufgaben jedoch unterschiedliche Mediatoren nutzen (Dekel et al.,
1985).
Allerdings ist in einer neueren Studie auf bestimmte posttranslationale Modifikationen bei
extrahypophysären GnRH-Rezeptoren hingewiesen worden. So führte in einigen Ovarial-
und Endometriumkarzinom-Zellreihen die Aktivierung des GnRH-Rezeptors nicht wie
beim hypophysären GnRH-Rezeptor zur Hydrolyse von Phosphoinositoltrisphosphat durch
die Phospholipase C (Emons et al., 1997). Aufgrund dieser Beobachtungen ist davon
auszugehen, daß auch im menschlichen Ovar alternative Funktionsformen des GnRH-
Rezeptors vorkommen könnten. Eine direkte Wirkung von GnRH bzw. GnRH-Agonisten
auf die Produktion des second messenger cAMP war dagegen bereits in früheren Studien
aufgefallen. In kultivierten Granulosazellen der Ratte führte die Applikation von GnRH
oder einem -Agonisten zu verringerten cAMP-Spiegeln, wofür einerseits eine verringerte
Adenylatcyclaseaktivität, andererseits ein verstärkter Abbau von cAMP verantwortlich
waren. Somit erklärt sich der in vitro nachweisbare antigonadale Effekt von GnRH und -
Analoga in Granulosazellen durch eine verminderte Reaktion des cAMP auf den
gonadotropinvermittelten Stimulus (Knecht et al., 1981; Knecht und Catt, 1981).
Um noch genauere Aussagen über die Funktionsmechanismen von GnRH und analogen
Substanzen innerhalb der intrazellulären Befehlsübermittlung im menschlichen Ovar
treffen zu können, müsen jedoch weitere Untersuchungen abgewartet werden. Deshalb ist
es wichtig festzuhalten, daß auf dem Boden der aktuellen Experimente dieser Arbeit kein
Anhalt für eine Beeinflussung der cAMP-Produktion humaner Granulosaluteinzellen durch
GnRH-Agonisten oder -Antagonisten besteht. Weder der hier verwendete GnRH-
Antagonist Ganirelix noch der GnRH-Agonist Triptorelin waren nach in vitro-Gabe in der
71
Lage, auf die basale oder HCG-stimulierte cAMP-Akkumulation humaner
Granulosaluteinzellen in signifikanter Weise einzuwirken (Demirel et al., 2000). Damit
konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die gonadotropinabhängige Induktion der
intrazellulären Signaltransduktionskette weder durch agonistische noch durch
antagonistische Stimulation der Zellen gestört wird.
72
6 Zusammenfassung
GnRH-Agonisten werden seit vielen Jahren im klinischen Alltag eingesetzt. Im Bereich der
Sterilitätsbehandlung nutzt man ihre Fähigkeit, die endogene Gonadotropinsekretion zu
supprimieren, zur Durchführung der In-Vitro-Fertilisationstherapie. In klinischen Studien
konnte gezeigt werden, daß GnRH-Antagonisten ebenfalls in der Lage sind, den
unerwünschten frühzeitig einsetzenden LH-Anstieg im Rahmen der kontrollierten
ovariellen Hyperstimulation zu vermeiden.
Da neben den GnRH-spezifischen Rezeptoren der Adenohypophyse auch GnRH-
Rezeptoren im Ovar vorhanden sind, geht diese Arbeit der Frage nach, ob der GnRH-
Antagonist Ganirelix Einfluß auf die Steroidbiosynthese humaner Granulosaluteinzellen
hat. Aufgrund der besonderen Bedeutung des second messenger cAMP innerhalb der
Signaltransduktionswege der Granulosazellen wurde im weiteren auch die Wirkungen von
Ganirelix und eines GnRH-Agonisten auf die cAMP-Produktion humaner
Granulosaluteinzellen untersucht. Die kultivierten Granulosaluteinzellen stammten von
Patientinnen, die im Rahmen einer kontrollierten ovariellen Überstimulation entweder den
Antagonisten Ganirelix oder den Agonisten Triptorelin erhalten hatten. Neben der basalen
wurde auch die gonadotropinstimulierte Östradiol-und Progesteronbildung bestimmt. Es
zeigte sich, daß die antagonistisch vorbehandelten Zellen keinen Unterschied im Bezug auf
die Steroidsyntheserate zur Kontrollgruppe aufwiesen. Dies galt für die unstimulierte wie
auch für die Hormonproduktion nach Gonadotropinstimulation. Um eine eventuell zu
geringe Konzentration der Substanzen in der Kultur ausschließen zu können, wurde in
weiteren Versuchen das Verhalten der Zellen nach direkter Applikation der GnRH-
Analoga in das Kulturmedium getestet. Auch hier konnten keinerlei Anhaltspunkte für eine
Einflußnahme des GnRH-Antagonisten Ganirelix auf die Steroidbiosynthese gefunden
werden.
Für die Experimente zur Untersuchung der cAMP-Produktion wurden
Granulosaluteinzellen von Frauen gesammelt, welche alle in vivo mit dem Agonisten
Triptorelin stimuliert worden waren. Die kultivierten Zellen erhielten entweder Ganirelix
oder Triptorelin im Medium oder nur das Kulturmedium. Des weiteren wurde die Hälfte
der Zellen einer Gonadotropinstimulation unterzogen. Die im Anschluß an die
73
Inkubationszeit durchgeführte Messung der cAMP-Akkumulation ergab auch hier keine
signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen bezüglich der basalen cAMP-
Bildung und der cAMP-Produktion nach Gonadotropinstimulus.
Die aufgeführten Ergebnisse machen deutlich, daß der GnRH-Antagonist Ganirelix keinen
Einfluß auf die ovarielle Steroidbiosynthese hat. Ferner konnten keine Veränderungen der
intrazellulären Postrezeptormechanismen durch GnRH-Analoga Behandlung festgestellt
werden. Daher erscheint ein negativer Effekt des Antagonisten im Rahmen der IVF-
Therapie unwahrscheinlich.
74
7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Abbildung 1: Die Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse...............................................4
Abbildung 2: Sexualhormonspiegel im ovariellen Zyklus...................................................7
Abbildung 3: Die Zwei-Kompartiment-Theorie................................................................8
Abbildung 4: Aminosäuresequenz von GnRH.................................................................10
Abbildung 5: Struktur des humanen GnRH-Rezeptors....................................................12
Abbildung 6: Signaltransduktionswege am GnRH-Rezeptor...........................................16
Abbildung 7: Aminosäuresequenz von GnRH, Triptorelin und Ganirelix im
Vergleich.....27
Abbildung 8: Schema zur Signaltransduktionskaskade am GnRH-Rezeptor...............31-34
Abbildund 9: Das Lange Protokoll.................................................................................39
Abbildung 10: Das Lübecker Protokoll...........................................................................40
Abbildung 11: Aufbau Versuch A-in vivo-Modell...........................................................46
Abbildung 12: Aufbau Versuch A-in vitro-Modell..........................................................46
Abbildung 13: Aufbau Versuch B...................................................................................46
Abbildung 14: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die
basale und HCG-stimulierte Progesteronausschüttung kultivierter
humaner Granulosaluteinzellen..................................................................51
Abbildung 15: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die
basale und HCG-stimulierte Östradiolausschüttung kultivierter
humaner Granulosaluteinzellen..................................................................52
Abbildung 16: Effekte der in vitro-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die
basale und HCG-stimulierte Progesteronausschüttung kultivierter
humaner Granulosaluteinzellen..................................................................54
Abbildung 17: Effekte der in vitro-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die
basale und HCG-stimulierte Östradiolausschüttung kultivierter
humaner Granulosaluteinzellen..................................................................55
Abbildung 18: Absolute cAMP-Produktion kultivierter humaner Granulosalutein-
zellen in 48 Stunden..................................................................................57
Abbildung 19: Basale cAMP-Produktion bzw. HCG-stimulierte cAMP-Produktion
über 6 Stunden..........................................................................................58
75
Tabelle 1: Meßbereiche und Variationskoeffizienten der Steroidassays............................47
Tabelle 2: Meßbereiche und Variationskoeffizienten des cAMP-
Radioimmunoassay........48
76
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8 Danksagung
Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Olaf Ortmann danke ich sehr für die Vergabe der
Arbeit, die umfangreiche Anleitung und für eine konstante konstruktive Zusammenarbeit.
Dem Betreuer meiner Doktorarbeit, Herrn Dr. Jürgen Weiss, gilt mein besonderer Dank für
seine unermüdliche Unterstützung sowohl während der Durchführung des praktischen
Teils der Arbeit als auch während der Überarbeitung der schriftlichen Abfassung.
Ein großes Dankeschön auch an Frau Rita Sturm und Herrn Stephan Polack, die mich mit
großer Geduld und unermüdlichem Engagement in die Welt der wissenschaftlichen
Laborarbeit aufnahmen.
Auch danke ich meinem Mann Martin, ohne dessen technische und moralische
Unterstützung Fertigstellung und Layout der Arbeit nicht geglückt wären.
Vor allem aber möchte ich meinen Eltern danken, die mir durch ihre großzügige
Unterstützung mein Studium und diese Doktorarbeit ermöglicht haben.
96
10 Lebenslauf
Angaben zur Person
Name: Eva-Maria Gürke
Geburtstag: 11.10.1974
Geburtsort: Fulda
Schulbildung
08.1981-07.1985 Grundschule Maberzell
09.1985-06.1994 Domgymnasium Fulda
15.06.1994 Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife
Studium
10.1994-09.1996 Vorklinisches Studium der Humanmedizin
Philippsuniversität Marburg
11.09.1996 Ärztliche Vorprüfung
10.1996-09.1997 Klinisches Studium der Humanmedizin
Philippsuniversität Marburg
28.08.1997 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
10.1997-09.2000 Klinisches Studium
Medizinische Universität zu Lübeck
26.09.2000 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04.1999-09.1999 Urlaubssemester nach Frühgeburt der Tochter
03.1998-03.2000 experimentelle Untersuchungen der Dissertation
12.02.2001 Beginn des Praktischen Jahres
Klinikum Fulda
15.01.2002 3.Abschnitt der ärztlichen Prüfung
ab 05/2002 Ärztin im Praktikum
Frauenklinik/Klinikum Fulda
Publikation Weiss JM, Oltmanns K, Gürke EM, Eick F,
Felberbaum R,Diedrich K, Ortmann O: Actions of
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