Zielkomponenten- und Profiling-Analysen in der der modernen Weinaromaanalytik: Spielwiesen

für den Einsatz mehrdimensionaler (gas)chromatographischer Techniken?

Dr. Hans-Georg SchmarrAnalytisch-chemisches Kolloquium an der Universität Duisburg-Essen, 16.07.2012

Kompetenzzentrum Weinforschung

Hans-Georg Schmarr

Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum – RheinpfalzAbteilung Weinbau und OenologieBreitenweg 71 D-67435 Neustadt an der Weinstraße, Germany

Überblick 1

• Weinaroma: Zielkomponentenanalyse - Problematik und Bedarf für High-End Analytik

• Beispiele: Methoxypyrazine (MPs), Haloanisole

• HS-SPME-GC(×GC)-MS (SIM)

• SPE // on-line-LC-MDGC-MS (SIM)

• SPE // LV-OC-MDGC-MS (SIM)

• SPE // LV-PTV-OC-MDGC-MSMS

Überblick 2

• Weinaroma: Profiling-Analysen - Erfassung molekularer Veränderungen durch

weinbauliche und oenologische Massnahmen

• Beispiele: Alterung; Micro-Oxygenierung

• HS-SPME-GC(×GC)-MS

• Klassische und pixel-based Verfahren

• Statistische Auswertung; Korrelationen

• Zusammenfassung und Ausblick

Weinaroma für den Analytiker

Matthias Wüst, Chem. in Unserer Zeit 37 (2003) 8-17

Zur Biochemie des sortentypischen Weinaromas

Wein – Qualität entscheidet sichin Nanogramm

• Weinaroma ist sehr komplex zusammengesetzt• Aromastoffe in sub-ng/L bis mg/L Konzentrationen• Organische Chemie in breiter Abdeckung• Matrixzusammensetzung oft problematisch für Extraktion,

Chromatographie und Detektion• Störungen – gerade bei (sub-)ng/L Bestimmungen

3-Isopropyl-2- Methoxypyrazin

Methoxypyrazine im Sauvignon Blanc

Aromastoff Struktur Geruchs- eigenschaft

Geruchs- schwellenwert

[ng/ l] 2-Methoxy-3-isobutyl

N

N O

grüner Paprika, Pfeffer

2

2-Methoxy-3-sec. butyl

N

N O

grüne Erbsen, grüner Paprika

1

2-Methoxy-3-isopropyl

N

N O

grüner Paprika, Pfeffer, erdig

2

2-Methoxy-3-ethyl

N

N O

grüner Paprika, erdig

400

Enger – angenehmer – Konzentrationsbereich von etwa 8-15 ng/L

Wüst, M., Chemie in Unserer Zeit. 37 (2003) 8 - 17

• Dominierendes MP ist IBMP

0

5

10

15

20

25

IBMP IPMP SBMP

[ng/

l] Sauvignon BlancCabernet Sauvignon

Allen, M.S., Lacey, M.J., ACS Symp. Ser. 714 (1998) 31 - 38

MPs in Vitis vinifera var.

MP-Konzentration hoch in unreifen Trauben und geringer werdend mit zunehmender Reife

Methoxypyrazine mal nicht aus Trauben

Klimawandel und das Vordringen des Asiatischen Marienkäfers Harmonia axyridis (nicht nur) in pfälzischen Weinbergen ...

1 Cai, L. et al., J. Chromatogr. A 1147 (2007) 66 - 782 Galvan, T. L. et al., Am. J. Enol. Viticul. 58 (2007) 518 - 5223 Godelmann, R. et al., Eur. Food Res. Technol. 227 (2007) 449 - 461

• Käfer enthalten (in der Hämolymphe) IPMB, IBMP, SBMP und DMMP

• Gehalte [ng/g Käfer] gefunden in (lebenden) Käfern: IPMP (4.2); SBMP (1.9); IBMP (<0.01)1

• Sensorisch bestimmter Schwellenwert für off-flavor durch H. axyridis (in der Lit. auch “ladybug taint; LBT” genannt) liegt bei 0.3 bis 1.9 Käfer/kg Trauben2

Interesse der amtlichen Lebensmittelüberwachung an der Analytik von Methoxypyrazingehalten in Weinen (insbesondere Sauvignon Blanc und Cabernet Sauvignon) ... --> IBMP (173 ng/l südafrikanischer S. Blanc3)

11th Int. Symp. on Hyphenated Techniques in Chromatography (HTC-11), Bruge, Belgium, 26-29 January 2010

Methoxypyrazine

Harmonia axyridis ...

3-Isopropyl-2- methoxypyrazin

Analyse mit einer oft beschriebenen Methode:

HS-SPME-GC-MS

• pH Einstellung auf 6.6

• SIDA für Quantifizierung der MPs (d3 -MPs)

• HS-SPME-GC-MS (SIM); Divinylbenzene/Carboxen/PDMS Faser, HP-5MS column, SIM-MS1

• In unserer Situation ergaben dotierte Proben (Most) nicht die erwarteten Resultate !?

• Spektren bzw. “Quantifier/Qualifier” Ionenverhältnisse auffällig

• GC×GC-qMS für Fehlersuche (Trace GC×GC-DSQ)

1 Kotseridis, Y.S. et al., J. Chromatogr. A, 1190 (2008) 294-301

m/z 137(extracted ion plot)

base peak von IPMP

IPMPKritische

Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung

GC×GC contour plot

m/z 140base peak von d3 -IPMP

d3 -IPMPKritische

Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung

m/z 138base peak von SBMPSBMP

Kritische Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung

m/z 141base peak von d3 -SBMPd3 -SBMP

Kritische Quantifizierung:Co-Elution bei 1D Trennung

m/z 124base peak von IBMP

IBMPunkritische

Quantifizierung:kaum Co-Elution

bei 1D Trennung

m/z 127base peak von d3 -IBMP

d3 -IBMP

ABER !Nicht erklärbares Peaktailing

sichtbar nicht typisch für d3 -IBMP

unkritische Quantifizierung:Keine Co-Elution

bei 1D Trennung

Alternative Analysenideen ...

• GC×GC-ToF-MS eventuell mit anderen Ionen und/oder Spektrendekonvolution

evtl. mit hochauflösendem ToF-MS (beide) nicht verfügbar (in unserer Gruppe)

• GC×GC-NPD - evtl. aber dann SIDA Quantifizierung problematisch mit d3 -MPs

• Probenvorbereitung SPE mit LiChrolut® EN als Sorbenz1

• Anderer chromatographischer Ansatz - andere stationäre Phase(n), Säulendimension, Gasfluss, ...

on-line LC-(MD)GC statt GC×GC

1 Culleré, L. et al., J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 4040-4045

on-line LC-(MD)GC

Schmarr, H.-G. et al. J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 6769-6777

MCSS – Moving Capillary Stream Switching;H. Sulzbach, C.E. Instruments patent

transfer volume: 500 µl

Probenvorbereitung: SPE (LiChrolut EN, Merck); 100 ml Most, 1 ml Extrakt

HPLC: Phoenix20 (Thermo) + TM 486 (Waters); UV (277 nm)

Trennsäule: 12 cm x 2 mm i.d. HyperSil Si (3µm); 20 µl Inj.vol.

Eluent: n-Hexan/MTBE (70/30; v/v) @ 200 µl/min

Transfervolumen: 0.5 ml

Abdampfrate: 172 µl/min @ 72 °C, 100 kPa He

GC Vorsäulen: 10 m x 0.53 mm i.d. unbelegt, desaktiviert (Phesil) + 2 m x 0.32 mm i.d., 1.5 µm PS-255 Y-Stück, early solvent vapor exit

1D Säule: 20 m x 0.25 mm i.d. ZB-Wax, 0.5 µm 72 °C (8 min), 8°/min to 250 °C (10 min)

Säulenschaltung: MCSS (Domdruck @ 25 kPa)2D Säule: 15 m x 0.25 µm i.d. ZB-35, 0.5 µm

55 °C (3 min), 10°/min to 250 °C (10 min)

Detektion: Quadrupol MS (MD800, Thermo); EI+, SIM

Quantifizierung: SIDA mit d3 -IPMP, d3 -SBMP, d3 -IBMP

SPE // on–line LC–MDGC–MS (SIM)

RT: 7.60 - 10.20

7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0Time (min)

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

8.50

9.868.06 8.11 9.50 9.698.19 9.248.36 10.189.427.71 9.11 10.137.78 7.95

8.50

9.868.05 9.508.20 9.68

8.36 9.249.11 9.427.70 10.1810.027.79 7.97

8.19 9.50 9.688.50

9.86

8.06

9.238.25 8.357.71 9.11 9.41 10.1810.067.78 7.95

9.688.20 9.50

8.50

9.868.068.05

8.35 9.249.12 9.417.71 10.197.79 10.037.96

NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_b

NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS lcgc_mdgc_sim_m_5ngl

NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS lcgc_mdgc_sim_m_25ngl

NL: 1.00E6m/z= 123.50-124.50+136.50-137.50+137.50-138.50 F: MS lcgc_mdgc_sim_m_100ngl

Erste Ergebnisse

V. vinifera Riesling Traubensaft

extracted ion Chromatogramme nach SPE // on-line-LC-MDGC-MS (SIM)

IPMP

SBMP

IBMP

Standard- Addition:nD MPs [ng/l]

0

5

25

100

MPs in Riesling

MPs in Vitis Vinifera c.v. Riesling (Traubensaft); Neustadt, Pfalz

Quantifizierungsmethode: Standard Addition

spike level [ng/L] [ng/L]5 25 100 av. std.dev. cov [%]

IPMP 2.5 2.6 2.5 2.5 0.1 3.9SBMP 5.8 5.3 5.6 5.6 0.3 4.6IBMP 4.3 4.3 4.0 4.2 0.2 4.2

Bisher waren kaum Daten für Riesling publiziert: <0.2-6 ng IPMP oder 0.3- 55 IBMP in ng/L Saft oder ng/kg in unreifen Beeren.

Hashizume und Samuta, Am. J. Enol. Vitic. 50 (1999) 194-198

Kalibrierung (SIDA)ar

eara

tio IP

MP

/d3-

IPM

P

concentration IPMP/d3 -IPMP

IPMPY = 0.0932835+0.299805*X R^2 = 0.9991 W: Equal

0 1 2 3 4 5 6 7 8ng/L

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Area

Rat

io

Kalibrierungsbereich: 0.4 – 8 ng/l IBMPY = 0.0962654+0.0388926*X R^2 = 0.9986 W: 1/X

0 10 20 30 40 50 60 70 80ng/L

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Area

Rat

io

IBMPY = 0.0962654+0.0388926*X R^2 = 0.9986 W: 1/X

0 10 20 30 40 50 60 70 80ng/L

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

eaat

o

Kalibrierungsbereich: 0.2 – 8 ng/l

area

ratio

SB

MP

/d3-

SB

MP

area

ratio

IBM

P/d

3-IB

MP

concentration IBMP/d3 -IBMP

concentration SBMP/d3 -SBMP

Kalibrierungsbereich: 1 – 80 ng/l

Mosta Weinb

[ng L-1] [ng L-1]

Lesetermin IPMP SBMP IBMP IPMP SBMP IBMP

Serie A c 08.08.07 <0.4 nd 9.6 - - - 14.08.07 <0.4 nd 6.9 - - - 23.08.07 <0.4 nd 4.6 1.0 nd 5.3 28.08.07 <0.4 nd 1.2 0.5 nd 4.0 09.09.07 <0.4 nd <1.1 <0.4 nd 3.1 10.09.07 d 0.6 nd 3.6 0.5 nd 2.9

Serie B c 14.08.07 <0.4 nd 5.3 - - - 23.08.07 <0.4 nd 3.5 0.7 nd 5.5 28.08.07 <0.4 nd 3.4 0.5 nd 3.6 05.09.07 <0.4 nd 2.4 <0.4 nd 4.6 11.09.07 <0.4 5.7 1.4 0.7 nd 2.9 17.09.07 <0.4 5.0 1.8 0.6 nd 3.3

a Most nach SPE mit LiChrolut® EN b c Serie A von Weisenheim (Sand/Lehm; warm), Serie B von Hochstadt

(Löß/Lehm; kalt ), 2 unterschiedliche Standorte (Boden, Mikroklima) d Lese zuvor für Reifemessungen , hier komplette Lese

MP-Gehalte in Sauvignon Blanc Most

cMPsReife

MPs in Sauvignon Blanc Wein

MPs in Sauvignon Blanc (Wein); aus Neuseeland, Marlborough Region (2007)

Probe[ng/L]

IPMP SBMP IBMPSB_NZ ? ? ?

RT: 8.07 - 11.11

8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0 10.2 10.4 10.6 10.8 11.0Time (min)

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Relative Abu

ndan

ce

0

20

40

60

80

100 9.96

9.61

10.4210.34 10.58 10.71 10.8310.21 10.919.758.59 9.018.928.68 9.118.318.21 8.458.59

9.01

8.68

9.11 9.15

8.558.31 8.768.22

10.369.96

10.56 10.7110.2110.089.61 10.82 10.849.83

9.96

10.3710.17 10.56 10.829.618.96 10.919.749.118.848.688.31 8.548.21 8.40

NL:4.79E8TIC F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ

NL:9.04E5m/z= 136.50-137.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ

NL:2.93E6m/z= 137.50-138.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ

NL:6.83E7m/z= 123.50-124.50 F: MS LCGC_MDGC_SIM_M_SB_NZ

IPMP m/z=137

SBMP m/z=138

IBMP m/z=124

TIC

SPE mit Kationenaustauscher

Plexa PCX™-Säulen (200mg):• Wein (75 ml) + MPs-D3, einstellen auf pH=2

• Konditionierung: Dichlormethan (DCM)Methanolmilli-Q Wasser

• 1. Waschschritt: milli-Q H2 O/Methanol(30%) pH=2

• Trocknung: Argon

• 2. Waschschritt: DCM

• Elution: Triethylamin in DCM (10g/L)• 3.Waschschritt: milli-Q-H2 O (pH=3 mit Weinsäure einstellen)

R. Lopez et al. J. Chromatogr. A 1218 (2011) 842

MPs in Sauvignon blanc

MPs in Vitis Vinifera c.v. Sauvignon blanc (Wein); Herkunft Neuseeland, Marlborough Region

Quantifizierung: SIDA

sample[ng/L]

IPMP SBMP IBMPsv_nz 2.3 0.4 17.1

Problem gelöst !SPE mit Mischbett Material (Bond Elut Plexa PCX™, Varian) welches auch starke Kationenaustausch-Funktionalität enthält1

Ermöglicht wesentlich selektivere Extraktion der MPs, durch die Ausnutzung der N-Protonierung bei saurem pH.Zur Analyse von MPs in vergorenem Most (Weinen) ist dies unbedingt angeraten!

Peter Schoenmakers: Thank God for the matrix!

... asking for expert(s) hyphenated techniques ...

1 R. Lopez et al.: J. Chromatogr. A 1218 (2011) 842

On-line LC-MDGC-MS

HPLC2. GC

Massenspektrometer 1. GC

Verbesserte SPE und LV-OC-MDGC-MS

(HPLC)2. GCMassenspektrometer

1. GC

Maskottchen

Modernes Equipment: Triplus RSH & MDGC-QqQ-MS

Methodenvergleich

DPC: uncoated, deactivated pre-column (3 m x 0.53 mm i.d. phenylmethyl silylated) 1D AC: analytical column Rtx-200MS (15 m x 0.25 mm i.d., 0.25 µm)2D AC: analytical column TG-5SilMS (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 µm) RC: restrictor column (~0.75 m x 0.10 mm i.d. phenylmethyl silylated) FID: flame ionisation detector, EPC: electronic pressure controller

MDGC-QqQ-MS: Schematics

Variable Injektionstools

Ansteuerung der Deans-Schaltung

3-Wege Ventil für Deans-Switch Ansteuerung

On-line LC-MDGC-MS

RT: 0.00 - 25.00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

10000000

11000000

12000000

13000000

14000000

15000000

16000000

17000000

18000000

19000000

20000000

21000000

22000000

23000000

24000000

25000000

26000000

27000000

28000000

Cou

nts

20.33

19.88

19.61

12.47 19.28 20.5411.03 13.8320.7418.86

16.2815.09

18.30

17.41

13.1011.72

10.63

14.40 21.5823.36 23.49

0.04 2.15

NL:1.41E8FID Analog 120425_MP_PTV_OC_20ng_d

59˚C (8 min iso); He @ 2ml/min const. flow 20µl @ 2µl/sec (last 3µl w 10µl/sec)

bad chromatography, severe flooting

Question:too much liquidortoo fast injection speed

MPs und Alkanreihe in DCM (Sdp. 40°C)

20µl DCM

RT: 0.00 - 24.29

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time (min)

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

10000000

11000000

12000000

13000000

14000000

15000000

16000000

17000000

18000000

19000000

20000000

21000000

22000000

23000000

24000000

25000000

Cou

nts

18.5818.16 18.91

17.59

19.8515.4914.20 20.0612.74

11.016.6916.67

8.91

11.829.95

20.905.78 21.13 22.708.73 13.517.010.09 2.13

NL:1.41E8FID Analog 120425_MP_PTV_OC_10ng_g

59˚C (8 min iso); He @ 2ml/min const. flow 10µl @ 2µl/sec (last 3µl w 10µl/sec)

good chromatography, no flooting

IPMP

SBMP, IBMP

RT: 0.00 - 23.90

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Time (min)

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

10000000

11000000

12000000

13000000

14000000

15000000

16000000

17000000

18000000

Cou

nts

17.5716.88

18.8119.3714.45

15.7313.01 19.62

11.37

7.08

9.39

9.808.18

20.8421.246.54 22.907.29 8.88 12.20 13.271.20

NL:1.40E8FID Analog 120427_MP_PTV_OC_20ul_a

70˚C (8 min iso); 270kPa He constant pressure 20µl @ 0.5µl/sec (last 3µl w 10µl/sec)

RT: 7.85 - 13.54

8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5Time (min)

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

Cou

nts

0

2

4

6

8

10

12

14

Rel

ativ

e A

bund

ance

NL:1.07E9TIC MS 120427_MP_PTV_OC_20ul_ad

NL:1.29E7FID Analog 120427_MP_PTV_OC_20ul_ad

1D column (FID)(RTX-200MS)

2D column (MS)(TG5-SilMS)

IPMP

SBMP

IBMP

cut-signals

Definition der Schnittfenster

Full scan und product scan Spektren der MPs. Qualifier und Quantifier ions für MS-MS mit entsprechenden Farben unterlegt. Strukturvorschläge für die relevanten parent ions.

MPs: MS-MS Fragmentierung

Single reaction monitoring (SRM)

Mit dem Quantum Ultra geht auch Ultra Selective SRM (U-SRM).

Die hyperbolischen Stäbe erlauben eine Auflösung bis zu 0.1 Da.

120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC 5/7/2012 8:27:46 PM

RT: 11.52 - 11.93

11.55 11.60 11.65 11.70 11.75 11.80 11.85 11.90Time (min)

0

50

1000

50

100

0

50

10011.75 11.7511.7511.7211.71

11.7611.7111.7711.70

11.7811.69 11.7911.68 11.81 11.82 11.84

11.75

11.84

11.72

11.83

NL: 7.10E4TIC MS 120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC

NL: 7.10E4TIC F: + c EI SRM ms2 152.090 [109.059-109.061, 124.099-124.101, 137.069-137.071] MS 120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC

NL: 6.83E4TIC F: + c EI SRM ms2 155.090 [112.059-112.061, 127.099-127.101, 140.069-140.071] MS 120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC

100 105 110 115 120 125 130 135 140m/z

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

109124

137

112 127

140

NL: 5.28E4120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC#9874 RT: 11.75 AV: 1 SB: 2 10.43 , 10.67 F: + c EI SRM ms2 152.090 [109.059-109.061, 124.099-124.101, 137.069-137.071]

NL: 4.49E4120507_Kalib_1p0000-1_MSMS-nD-D_LVI-OC#9816 RT: 11.71 AV: 1 SB: 1 10.39 , 10.68 F: + c EI SRM ms2 155.090 [112.059-112.061, 127.099-127.101, 140.069-140.071]

IPMP: Quan: 152 137Qual: 152 109,124

IPMP

D3 -IPMP

Probe: IPMP

Probe: SBMP

Probe: IBMP

1D GC Trennung (FID) mit heart-cuts eines Weinextraktes, spiked mit 4 ng/L (IPMP, SBMP) und 40 ng/L (IBMP) sowie den Deuterierten MPs (unten). Im Bild oben sind die Ionenspuren dargestellt (m/z; Quantifier und Qualifier) für MPs: a) 140, 127, 112; b) 137, 124, 109; c) 126, 119, 98; d) 123, 119, 95

MDGC-QqQ-MS: MPs-Analysenbeispiel

MDGC-SIM-MS versus MDGC-QqQ-MS

In der Regel ergaben beide Verfahren vergleichbare Ergebnisse für die in einer weinbaulichen und oenologischen Studie untersuchten Proben !(Ergebnisse z.T. in das deutsche weinmagazin, Juni 2012, S. 30-34)

Allerdings wurden mit SIM-MS einige Proben mit auffälligen und unplausiblen SBMP-Gehalten gemessen. Hier ergab die MS-MS Messung, dass es sich um falsch-positive Werte handelte !

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD / QqQ-MS

• 2,4,6-Trichloranisol (TCA) als Leitsubstanz für muffige Korktöne; daneben auch Tetrachloranisol und 2,4,6- Tribromanisol (TeCA und TBA)

• Routineanalytik mit HS-SPME-1D-GC-ECD, jüngst wegen Matrixproblemen in Wein umgestellt auf HS-SPME-MDGC-ECD (Poster ISCC 2012, Riva del Garda)

• Quantifizierung über D5 -Isotopenstandards (SIDA)

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD

Stable Isotope Dilution Analysis of Corky Off-Flavour Compounds at Ultra Trace Level with Multidimensional Gas Chromatography–Electron Capture Detection

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD

Geruchsschwellenwerte z.T. bei 1-3 ng/L Wein; Qualitätskontrolle bis < 1 ng/L

Standard-Chromatogramm

Kalibration

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD

Kork-Extrakt (10% vol. Ethanol)

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD

Wein (ca. 12% vol. Ethanol)

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-ECD

RT: 11.00 - 16.00

11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0Time (min)

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100 NL: 6.50E3TIC F: + c EI SRM ms2 209.870 [195.100-195.500] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756

NL: 7.53E3TIC F: + c EI SRM ms2 216.930 [198.920-199.320] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756

NL: 7.89E3TIC F: + c EI SRM ms2 245.860 [230.630-231.030] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756

NL: 9.66E2TIC F: + c EI SRM ms2 343.810 [328.980-329.380] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756

NL: 1.79E2TIC F: + c EI SRM ms2 348.850 [331.010-331.410] MS 120320_TCA_mix_nd_d5_srm_g_SPME_50C_120320130756

TCA (210 195)

TCA-d5 (217 199)

TeCA (246 231)

TBA (344 329)

TBA-d5 (349 331)

60˚C (2 min)10˚/min / 210˚C / 50˚/min / 270˚C (5min)

SPME: PDMS (100µm)2 min incubation20 min extraction @ 50˚C2 min desorption (splitless)

2 ng/L in 10%Vol EtOH

collision energy 15V

Vorteil: U-SRMQ1 0.3 DaQ3 0.7 Da

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-QqQ-MS

RT: 11.00 - 16.00

11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0Time (min)

0

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

1000

20

40

60

80

100 NL: 2.58E3TIC F: + c EI SRM ms2 209.870 [195.100-195.500] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g

NL: 9.49E3TIC F: + c EI SRM ms2 216.930 [198.920-199.320] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g

NL: 6.90E3TIC F: + c EI SRM ms2 245.860 [230.630-231.030] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g

NL: 2.04E3TIC F: + c EI SRM ms2 343.810 [328.980-329.380] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g

NL: 1.28E3TIC F: + c EI SRM ms2 348.850 [331.010-331.410] MS 120315_TCA_mix_nd_d5_srm_g

Liquid-Injection: 1µl splitless (0.5pg/µl)

TBA-d5 (349 331)

TBA (344 329)

TeCA (246 231)

TCA-d5 (217 199)

TCA (210 195)

60˚C (2 min)10˚/min / 210˚C / 50˚/min / 270˚C (5min) collision energy 15V

U-SRMQ1 0.3 DaQ3 0.7 Da

Haloanisole mit HS-SPME-MDGC-QqQ-MS

• Oenologie ... die Wissenschaft vom Weinmachen (ausser weinbaulichen Aspekten)

• Wein-Aroma Flüchtige Stoffe, die unseren Sinnen (Nase) und den analytischen Methoden (GC) zugänglich sind

• (Multivariate) Statistische Analysen Principal Component Analysis (PCA): Linear Discriminant Analysis (LDA) Partial Least Squares Regression (PLSR) Analysis of Variance (ANOVA)

• Applikationen Alterung, Mikro-Oxygenierung (MOX)

Profiling-Analysen

38 samples10 origins4 vintages

analysis viaGC×GC-qMSorGC×GC-TOF-MS

quantification via internal standards

HS-SPMEinternal standards

Analysis: HS-SPME-GC×GC-MS

ToF-MS in co-operation with

subset of a larger number of samples from the Palatinate Terroir project

esters

alcoholsacids

Analysis: Reversed column set-up

polyethylene glycol

5% p

heny

lmet

hyl s

ilico

ne separation space

• Nach Ende der Gärung, umfasst die einsetzende Reife (Alterung) viele komplexe substanzielle Veränderungen

• Farbe, Mundgefühl, Aroma und Geschmack unterliegen z.T. drastischen Veränderungen

• Sauerstoff und konzentrations- abhängige molekulare Veränderungen (MWG), aber auch Zersetzungs- und andere Reaktionen

• Neben individueller Präfe- renzen für alte Weine ist die Kenntnis des Alterungspoten- tiales wichtig für die Industrie

Alterung von (Riesling) Wein

-6

-4

-2

0

2

4

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6

• 1200 peaks detected

• 300 peaks identified according to their mass spectra and retention indices

• random selection of a chromatogram as reference

• 130 analytes present in all samples

• quantification relative to a reference standard (2,6-dimethylhept-6-en-2-ol, [2H5 ]-ethyl cyclohexanoate)

• statistics with individual peak areas — the classical workflow, based on integrated peaks

Aging of Riesling Wine

Non-Targeted Multi-Component Profiling

… biased …

-10

-5

0

5

-10 -5 0 5 10

F 1 (78.48 %)

F 2

(16.

18 %

)

2005200620072008

Riesling Aging (ChromaToF), LDA, F1 F2, 15 most relevant signals

confidence intervals @ 95%

2005 2006 2007 2008

2005 95 % 0 % 5 % 0 %

2006 0 % 84 % 16 % 0 %

2007 6 % 6 % 89 % 0 %

2008 0 % 8 % 21 % 71 %

Confusion matrix

Validation: ~15 % Test data set85 % Model data set20x Repetition

~ 84 % correct correlation (differing sample number in individual groups, due to randomization of vintages)

Riesling Aging (ChromaToF), LDA, 15 most relevant signals

Riesling Aging (ChromaToF), LDA, F1 F2, 15 most relevant signals, loadings

Styrol

Anhydrolinalooloxide

Decanol

Ethyl 3-phenyl-pentanoateTerpinolene

p-Cymol

Linalool

Octan-3-olEthyl heptanoate

5-Methylfurfural

Phenyl acetateTDN Hexyl acetate

Furfural

-1

-0.75

-0.5

-0.25

0

0.25

0.5

0.75

1

-1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1

F1 (78.48 %)

F2 (1

6.18

%)

1,1-Diethoxyethan

CH2

CH3 CH3

CH3 OH

CH3 CH3

OH

CH3

CH3 CH3

CH3 OH

OH

O CH3

CH2CH3

OH CH3CH2

CH3 CH3

CH3 OH

OH

CH2

CH3 CH3

CH3 OH

OH

CH2

CH3 CH2

CH3 OH

α-Terpineol

Linalool

1,8-Terpin

Hydroxylinalool Linalooloxide (f.)

Terpendiol I Hotrienol

Aging – Chemical Issues

O O

H

O

OH+

pH 3-3.5; time

1,1-Diethoxyethane,Acetaldehyde diethyl acetal

Riesling Aging: Petrol or Kerosine note

OH

OOH

O

OH

OH

1,1,6-Trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN)

Proposed pathway of TDN formation (from Winterhalter, JAFC 39 (1991) 1825)

- H2O

- 2 H2O

Profiling – via Fingerprint Analysis

Clearly non-targeted: Visual comparison

only for limited sample numbers

Advanced Image Processing

Image warping compensates for fluctuations in signal position

H.-G. Schmarr, J. Bernhardt, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 565

... image/pixel-based analysis ...

Advanced Image Processing

Rolling ball model applied for background substraction

H.-G. Schmarr, J. Bernhardt, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 565

Volatile (aroma) - Profilingfingerprint analysis;approach is based on image processing techniques

Delta2D software,well established in 2D gel electrophoresisDecodon, Greifswald, Germany

-10

-5

0

5

10

-10 -5 0 5 10 15

F 1 (54.04 %)

F 2

(29.

42 %

)

2005

2006

2007

2008

Riesling Aging (Delta2D), LDA F1 F2, 15 most relevant signals

confidence intervals @ 95%

2005 2006 2007 2008

2005 100 % 0 % 0 % 0 %

2006 0 % 100 % 0 % 0 %

2007 0 % 0 % 100 % 0 %

2008 0 % 0 % 0 % 100 %

Confusion matrix

Validation: ~15 % Test data set85 % Model data set10x Repetition

Riesling Aging (Delta2D), LDA F1 F2, 15 most relevant signals

Potential explanation for better validation of the model: ANOVA yielded 15 most relevant signals - but considering all signal information (unbiased)

MOXtreatment of

red wines

Enology,Winemaking

MOX: Changes in composition

"Fermentation-Metabolom" dependend on - oxygen dosage and timing- grape variety (polyphenol structure)

loadings on PC1-PC3 were multiplied by their per- centage of explained vari- ance, summed, and arran- ged according to size

Image Analysis and Signal Labeling

cut-out (amplified)Delta2D Analyzing 2D-Gels

Drawback: Off-line Signal Identification

Zusammenfassung

Komplexe Matrices (z.B. Wein) erfordern mitunter besondere Behandlung für Zielkomponentenanalytik! Ansonsten drohen falsche Resultate!

• Möglichkeiten für verbesserte Analytik seitens: - Probenvorbereitung - Separation (Chromatographie) - Detektion

• MDGC (Deans-Switch oder MCSS)

• TriPlus RSH - Variable Injektionsmöglichkeiten

• Quantum Ultra - QqQ-MS und evtl. U-SRM

Ausblick und Erwartungen

• Profiling – Analysen und Statistische Auswerteverfahren zur Erfassung komplexer Veränderungen im Weinaroma (Oenologie)

• Advanved Image Processing für GC x GC-Daten sehr vielversprechend (stoffliche Zuordnung derzeit off-line)

• Korrelation oenologischer/sensorischer Daten mit chromatographischer und spektroskopischer (UV/Vis, IR, NMR) Information

• Oenometabolomics

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

Dr. Hans-Georg Schmarr

Competence Center of Wine Research

Dank an das MULEWF, Rheinland-Pfalz, für finanzielle Unterstützung

Dank an:Stefan Koschinski,Petra Slabizki,Theodoros Potouridis,Johannes Langen,Elisa Garcia-Morenou.a.für Ihre Mitarbeit

Analytisch-chemisches Kolloquium an der Universität Duisburg-Essen, 16.07.2012

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