Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-HPLC

Dr. Hans Werner Bilke

SANDOZ GmbH / Novartis Gruppe

2

Robustheitsprüfung von RPLC-Methoden

Unzureichende Robustheit ist oftmals Ursache für Probleme in derchromatographischen Praxis (Routineanalytik, Methodentransfer…).

In welcher Art und Weise ändert sich die Auflösung, wenn bestimmteSchwankungen in der Einstellung der experimentellen Parameter zu-gelassen werden sollten ?

Ohne Robustheitsangaben keine Methodenvalidierung !

Validierte RPLC-Methoden müssen sich über viele Jahre in der Praxis bewähren.

Eine Revalidierung aufgrund mangelnder Robustheit ist zeitauf-wendig und teuer.

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Wege zur Gewinnung von Robustheitsaussagen

Robustheitstest mittels systematischer Methodenentwicklung

Computergestützte Methodenentwicklung

Robustheitstest mittels Versuchsplanung (DoE)

Statistische Versuchsplanung

Eine gute Praxis ist die systematische Veränderung der wichtigenchromatographischen Parameter und das Messen ihrer Effekte aufdie Trennung.

Diese Vorgangsweise gilt für beide Wege.

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Robustheitstest mittels systematischer MethodenentwicklungEine computergestützte Methodenentwicklung durch den Einsatz vom Simulationsprogrammen (z.B. DryLab) kann sehr nützlich sein zur Unter-suchung des Einflusses der jeweiligen chromatographischen Parameter auf die Trennung und somit auf die Robustheit der RP-HPLC-Methode

% der organischen mobilen Phase B

pH der wässrigen mobilen Phase A

Säulenofentemperatur

Pufferkonzentration oder Ionenstärke der wässrigen mobilen Phase A

für eine isokratische Arbeitsweise und zusätzlichGradientenlaufzeit

für eine Gradientenarbeitsweise.

Gradientensteigung

Die wichtigsten chromatographischen Parameter sind:

Menge organisches Lösungsmittel in der mobilen Phase am Anfang des Gradienten (%B)

Menge organisches Lösungsmittel in der mobilen Phase am Ende des Gradienten (%B)

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Karte der kritischen Auflösung

6-Läufe zur simultanen Optimierung von pH und Gradientenlaufzeit4-Läufe zur simultanen Optimierung von Temperatur und Gradientenlaufzeit

Eine solche Karte wird auf Basis weniger chromatographischer Läufe be-rechnet und stellt die kritische Auflösung als Funktion von zwei experimen-tellen Parametern (simultan variiert) dar.

Genaue Kenntnisse der Peakbewegung erleichtern das Anpassen der RP-HPLC-Methode bei gezielten und aber auch bei zufälligen Veränderungendieser exerimentellen Parameter und lassen sich ohne zusätzlichen expe-rimentellen Aufwand aus einer sogenannten „Karte der kritischen Auflö-sung“ gewinnen.

In der Karte der kritischen Auflösung ist die kritische Auflösung über Farb-werte beschrieben, während an den Achsen die Werte der variierten expe-rimentellen Parameter aufgetragen sind.In dieser Karte lassen sich sofort anhand der Farben die optimalen Para-meterwerte für eine maximale Auflösung ablesen.Eine Einschätzung der Methodenrobustheit für ein Variablenpaar ergibt sich aus der Farbänderung am entsprechenden Punkt in der Auflösungs-karte.

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Beispiel: Optimierte Trennung einer pharmazeutischen Probe

Verwandte SubstanzenNeben- und Abbauprodukte

0 10 20 30time(min)

1 23

45

6

7

8 9

10

11 12

1314 15

16

Aktive Substanzen

BekannteUnbekannte

Aromastoffe Konservie-rungsmittel

Süßstoff

7

Simultane Optimierung von Gradientenlaufzeit und pH

5

1

6

2

pH 4.0

pH 2.5

70 min [6n (min)]

6 Grundläufe3 4pH pH 3.25

n = Anzahl der Peaks

35min [2n (min)]tG

8

Zweidimensionale Auflösungskarte für Gradientenlaufzeit gegen pH

Bereiche für robuste Trennungen des kritischen Peakpaares (Rs >2.0)

robuster Bereich für schnellen Analysen

(ökonomisch)

robuster Bereich für Analysen mit der besten Auflösung

(aber unökonomisch)

Rs-Skala

pH

Gradientenlaufzeit (min)

9

Beste Trennung bei einem Gradientenanstieg von 1.364 % MeOH/min und pH 2.5 für die wässrige mobile Phase

0 10 20 30Zeit (min)

3.28

7

4.51

9

8.87

5

10.2

4610

.745

11.9

28

13.4

21

15.9

2316

.481

18.2

52

22.3

4323

.150

23.8

33

26.1

88

27.0

95

30.4

2031

.277

0 10 20 30Zeit (min)

3.27

5

4.48

3

8.83

3

9.98

310

.508

11.6

00

13.4

75

15.8

9216

.450 18

.208

22.3

0823

.108

23.8

67

26.1

5027

.075

30.4

2531

.242

Simulationslauf

Realer Laborlauf

kritisches Peakpaar 4,5

kritisches Peakpaar 4,5

10

Simultane Optimierung von Gradientenlaufzeit und Temperatur

5

1

6

2

75 °C

25 °C

70 min [6n (min)]

4/6 Grundläufe3 4Temp.50 °C

n = Anzahl der Peaks

35min [2n (min)] tG

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Zweidimensionale Auflösungskarte für Gradientenlaufzeit gegen Temperatur

Bereiche für robuste Trennungen des kritischen Peakpaares (Rs >2.0)

Temp.( °C)

Rs-Skala Gradientenzeit (min)

Robuster Bereich für schnelle Analysen

(ökonomischl) Robuster Bereich für Analyse mit bester

Auflösung(aber unökonomisch)

12

0 10 20 30Zeit (min)

3.28

6

4.52

1

8.84

8

9.87

610

.347

11.4

10

13.4

65

15.9

0416

.474 18.2

32

22.3

2323

.128

23.8

92

26.1

72

27.0

87

30.4

0531

.270

Beste Trennung bei einem Gradientenanstieg von 1.364 % MeOH/min und einer Temperatur von 50 °C

Simulationslauf

0 10 20 30Zeit (min)

3.27

5

4.48

3

8.83

3

9.98

310

.508

11.6

00

13.4

75

15.8

9216

.450 18

.208

22.3

0823

.108

23.8

67

26.1

5027

.075

30.4

2531

.242

kritisches Peakpaar 4,5

kritisches Peakpaar 4,5

Realer Laborlauf

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Zweidimensionale Auflösungskarte für Gradientenlaufzeit gegen Temperatur

Quantifizierte Darstellung der Ergebnisse der Robustheit, ableitend aus der Karte der kritischen Auflösung (Programm „PeakMatch“)

Schwankungen der Temperatur und der Gradientenlaufzeit wirken sich in den angege-benen Bereichen kaum auf die Auflösung aus !

Die Methode ist robust !

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Aussagen zur Optimierung und Robustheit mittels einer computergestützten RP-HPLC-Methodenentwicklung

Durch Anwendung einer systematischen, rechnergestützten Methodenent-wicklung lassen sich ohne zusätzlichen experimentellen Aufwand

nicht nur optimale chromatographische Bedingungen für eine beste und/oder ökonomische Trennung finden

sondern es lassen sich

auch Aussagen zur Methodenrobustheit gewinnen.

Die gewonnen Informationen verschaffen dem HPLC-Anwender eine tiefereEinsicht in seine RP-HPLC-Methode.

Sie geben ihm die Möglichkeit, die kritischen Parameter zu erkennen.

Sie zeigen ihm die Grenzen der erlaubten Veränderungen bei der Einstellungder chromatographischen Bedingungen auf.

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Robustheitstest mittels Versuchsplanung (DoE)

Die statistische Versuchsplanung ist ein strategisches Hilfsmittel bei der Optimierung von Prozessen. Die statistische Versuchsplanung liefert ein empirisches Prozeßmodell für den Zusammenhang zwischen den Einfluß- und Störgrößen im Prozess und den resultierenden Zielgrößen.

Hier gibt es eine ausgeprägte Unterscheidung zwischen Zielgrößen (res-ponses) und Einflussgrößen (factors).

Statistische Versuchsplanung ohne entsprechende Software zu betreibenist mühsam, zeitraubend und nicht zeitgemäß. In den letzten Jahren hat es enorme Fortschritte bei den Algorithmen beider Funktionalität und bei der Bedienbarkeit von Versuchsplanungssoft-ware gegeben.

Es gibt Lösungen, die in allgemeine Statistik-Pakete eingebunden sind,andere sind allein und ausschließlich auf Versuchsplanung ausgerichtet.Einige Pakete richten sich an Anwender ohne große Vorkenntnisse, andere an Spezialisten mit profunden Statistik-Kenntnissen.

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Empirisches Prozeßmodell (dargestellt als Black-Box-Modell nach Wember)

Gra

dien

tenl

aufz

eit

Puffe

r-pH

-Wer

t

% M

odifi

er

Fluß

rate

Tren

nsäu

le

Tem

pera

tur

Einflussgrößen

Störgrößen unbekannte + bekannte

Meßfehler ±σ

x

e e

Prozeß

Zielgrößen y

Tailin

gfak

tor

Res

olut

ion

Rel

ativ

e R

eten

tion

Die Zielgröße y ist eine Funktion f() der Einflußgröße(n) x.

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Unbestrittenes Ziel des Robustheitstests mit Hilfe statistischer Versuchs-planung ist es, mit möglichst wenigen Versuchen eine systematische Un-tersuchung der Zusammenhänge zwischen Zielgröße(n) y und Einfluß-größe(xn) x1, x2,… xp zu schaffen.

y = c Konstante oder y-Achsenabschnitt+ a1*x1 + a2*x2 + a3*x3 +…ap*xp Haupteffekte oder lineare Terme+ b12*x1*x2 + b13*x1*x3 +… Zweifach-Wechselwirkungen+ b23*x2*x3 + b24*x2*x4 +… + bp-1p*p-1*xp (insgesamt p*(p-1) Terme)+ e Fehler

Die Robustheit einer analytischen RP-HPLC-Methode kann durch Ausfüh-rung nachfolgender sechs Schritte bestimmt werden:

Ziel des Robustheitstests

Diese Zusammenhänge sind in den meisten Fällen gut durch ein linearesModell (Plan erster Ordnung) zu beschreiben:

Auswahl der Einflussgrößen (chemische und physikalische)Festsetzung der Nivaus der Einflussgrößen und deren StufenAuswahl des Modells der VersuchsplanungDurchführung experimenteller Versuche und Messung analytischer ZielgrößenAufzeigen von Effekten der EinflussgrößenStatistische Analyse und Interpretation der Resultate

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Die Einflußgrößen können quantitativ (kontinuierlich einstellbar) oder qualitativ (nicht kontinuierlich einstellbar) sein.

Einflußgrößen

Die Einflußgrößen können für den Robustheitstest in zwei Gruppen ein-geteilt werden:

Methoden-verwandte Einflußgrößen und nicht-Methoden-verwandteEinflußgrößenMethoden-verwandte Einflußgrößen umfassen generell quantitative EinflußgrößenpH des Eluenten, Temperatur der Trennsäule, Pufferkonzentration oder Ionen-stärke des Eluenten, Menge an organischem Lösungsmittel im Eluenten.

Nicht-Methoden-verwandte Einflußgrößen sind häufig qualitative Einflussgrößen wie z. B. die Trennsäulen-Einflußgrößen Charge, Alter, Hersteller.

Die für den Robustheitstest auszuwählenden Einflußgrößen sollten gleichjenen sein, die sich in der täglichen Routinearbeit verändern können oderwenn eine RP-HPLC-Methode übertragen wird z.B. in ein anderes Labor oder auf ein anderes Gerät.

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Für eine RP-HPLC-Methode sollten nachfolgend aufgeführte Einfluß-größen möglichst immer untersucht werden:

Einflußgrößen

pH der PufferlösungSäulenofentemperatur% organisches Lösungsmittel am Anfang des Gradienten oder isokratischeBedingungen% organisches Lösungsmittel am Ende des GradientenSteigung des Gradienten, ausgedrückt in Gradientenlaufzeit tGSäule (zwei verschiedene Chargen, benutzte und unbenutzte Säule)Dummy-Faktoren

Die „Dummy“-Faktoren sind scheinbare Variablen und beinhalten die nominalen Parameterwerte der zu testenden RP-HPLC-Methode, d.h. sie verursachen keine Änderung in der Methode.

Die geschätzten Effekte der „Dummy“ können verwendet werden als eine Messung des experimentellen Fehlers von einem Effekt.

20

Zusätzliche Einflußgrößen sind:

Einflußgrößen

Konzentration an Zusätzen zur mobilen Phase, z.B. Ionenpaarreagenzien (mM)FlußrateDetektorwellenlänge

Die maximale Differenz der Einflußgrößenwerte ist in Robustheitstudienrelativ klein.

Das Niveau einer jeden Einflußgröße sollte so gewählt werden, das es diemaximale Differenz in den Werten für die Einflußgrößen einschliesst, diein der täglichen Routinearbeit oder bei einer Methodenübertragung auf-treten kann.Das Testniveau der Einflußgrößen ist immer abhängig vom Zweck der Methode und sollte immer praxisbezogen sein.

Die Wahl von zwei Einstellstufen (two-level-design) für jede einzelne Ein-flußgröße (low/high level) ist somit vollkommen ausreichend.

Ein linearer Zusammenhang der Zielgrößenfunktion y der meisten Ein-flußgrößen (Faktoren) in den zuprüfenden Intervallen kann als gegeben angenommen werden.

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Zusätzliche Einflußgrößen sind:

Einflußgrößen

Konzentration an Zusätzen zur mobilen Phase, z.B. Ionenpaarreagenzien (mM)FlußrateDetektorwellenlänge

Die maximale Differenz der Einflußgrößenwerte ist in Robustheitstudienrelativ klein.

Das Niveau einer jeden Einflußgröße sollte so gewählt werden, das es diemaximale Differenz in den Werten für die Einflußgrößen einschliesst, diein der täglichen Routinearbeit oder bei einer Methodenübertragung auf-treten kann.Das Testniveau der Einflußgrößen ist immer abhängig vom Zweck der Methode und sollte immer praxisbezogen sein.

Die Wahl von zwei Einstellstufen (two-level-design) für jede einzelne Ein-flußgröße (low/high level) ist somit vollkommen ausreichend.

Ein linearer Zusammenhang der Zielgrößenfunktion y der meisten Ein-flußgrößen (Faktoren) in den zuprüfenden Intervallen kann als gegeben angenommen werden.

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Einflußgrößen (Einstellbereiche)

pH der Pufferlösung:nominal ± 0.1 Einheitennominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.3 Einheiten nominal ± 0.5 Einheiten

Säulenofentemperatur:nominal ± 10 % rel. nominal ± 14 % rel. nominal ± 5 % rel. nominal ± 10 % rel. nominal ± 17 % rel. nominal ± 17 % rel. nominal ± 7 % rel.

Einstellbereiche für den Test auf Robustheit

23

Einflußgrößen (Einstellbereiche)

Pufferkonzentration:nominal ± 10 % rel.nominal ± 10 % rel.nominal ± 10 % rel.nominal ± 7 % rel.nominal ± 10 % rel.nominal ± 20 % rel.

Konzentration an Zusätzen (u.a. Ionenpaarbildner):nominal ± 10 % rel. nominal ± 8 % rel.

Einstellbereiche für den Test auf Robustheit

24

Einflußgrößen (Einstellbereiche)

% organisches Lösungsmittel am Anfang des Gradienten oder isokratischeBedingungen:

nominal ± 10 % rel.nominal ± 10 % rel.nominal ± 7 % rel.nominal ± 4 % rel.nominal ± 3 % rel.

% organisches Lösungsmittel am Ende des Gradienten:nominal ± 10 % rel. nominal ± 4 % rel.

Einstellbereiche für den Test auf Robustheit

Gradientensteigung, ausgedrückt in Gradientenzeit tG:nominal ± 10 % rel. nominal ± 5 % rel.

25

Einflußgrößen (Einstellbereiche)

Flußrate:nominal ± 0.1 ml/minnominal ± 0.1 ml/minnominal ± 0.1 ml/minnominal ± 0.1 ml/min und 0.2 ml/minnominal ± 0.05 ml/min

Detektorwellenlänge:nominal ± 3 nm nominal ± 2 nm und 3 nmnominal ± 5 nmnominal ± 5 nmnominal ± 1 nm

Einstellbereiche für den Test auf Robustheit

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VersuchspläneVerschiedene Typen der statistischen Versuchsplanung (DoE) können fürden Robustheitstest einer HPLC-Methode verwendet werden

Aber nur einige sind wirklich in Form von teilfaktoriellen Versuchsplänenund Plackett-Burman-Versuchsplänen praktikabel.

Für faktorielle Versuchspläne (factorial designs) in Form von vollfaktoriel-len Versuchsplänen (full factorial designs) spricht, dass mit solchen Ver-suchsplänen Regressionsmodelle mit Haupteffekten und Wechselwirkun-gen behandelt werden können. Dieser Typ von Versuchsplan, im dem alle möglichen Kombinationen derEinflußgrößen auf meist 2 Stufen (jeweils auf oberer und unterer Stufe)

miteinander varriiert werden, wird in den meisten Fällen nur bei der Wahl von wenigen Einflußgrößen (z.B. 2 oder 3) eingesetzt; da die Anzahl der Ecken im (hochdimensionalen) Quader exponentiell mit der Anzahl der Ein-flussgrössen wächst. So ergeben z.B. 7 Einflußgrößen bereits 27 = 128 Versuche.Eine Reduzierung der Anzahl notwendiger Versuchsläufe, auch mit der Möglichkeit der Wahl einer größeren Anzahl von Einflussgrößen (z.B. 11)erreicht man mit teilfaktoriellen Versuchsplänen (fractional factorialdesigns), die aus den vollfaktoriellen Plänen abgeleitet werden.

27

Versuchspläne

Eckpunkte des Versuchsplanungsbereichs in Abhängigkeit von der Anzahl der Einflußgrößen

28

Versuchspläne

29

VersuchspläneMan kann mit solchen Versuchsplänen erster Ordnung nur Regressionsmodelle mit Haupteffekten untersuchen und muss voraussetzen, dass es keine Wechselwirkungen gibt.Die wichtigste Alternative zu den teilfaktoriellen Versuchsplänen sind Plackett-Burman-Versuchspläne

Als Nachteil erweist sich wiederum, wie bei den teilfaktoriellen Versuchs-plänen, daß nur Haupteffekten schätzbar sind.

Mit den Plackett-Burman-Versuchsplänen sind nun Versuchspläne gege-ben, die ähnliche Eigenschaften wie die voll- und teilfaktorierten Versuchs-pläne zeigen, aber auch für alle Vielfache von 4 (12, 20, 24, 28,…), die keine Zweierpotenzen sind, konstruierbar sind.

Eine Vermischung zwischen Haupteffekten und Wechselwirkungen ist nicht so einfach zu ermitteln, da wenigsten eine Zweifachwechselwirkung mit einer Hauptwirkung vermengt ist und es somit in der Praxis zu Fehlin-terpretationen kommen kann

30

Beispiel: Versuchsplanung zur Robustheit der RP-HPLC

Versuchsplan-Typ : Plackett-Burmann

Zahl der Einflußgrößen: 5

Zahl der Zielgröße: 1 (Auflösung des kritischen Peakpaares)

Zahl der Versuche: 12 (+ 3 „Dummi“)

(-1) (+1) 0pH [pH Einheit] 2.4 2.6 2.5Temperatur [° C] 47.5 52.5 50Steigung (tG) [min] 31.25 34.65 33Modifier Konz. [% MeOH] 4.5 5.5 5Flußrate [ml/min] 0.9 1.1 1

Einflußgröße Einheit untere Stufe Nominalwertobere Stufe

31

Experimentelle Läufe (randomisiert)

Plackett-Burman-Versuchsplan

pH -Wert Temperatur Steigung (tG) Konz. Mod. Flußrate

[pH Einheit] [° C] [min] [% MeOH] [ml/min]1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,12 2,4 52,5 34,65 4,5 1,13 2,4 52,5 31,35 5,5 0,94 2,6 47,5 34,65 4,5 0,95 2,5 50 33 5 16 2,4 47,5 34,65 5,5 0,97 2,6 47,5 31,35 5,5 1,18 2,4 47,5 34,65 5,5 1,19 2,4 47,5 31,35 4,5 0,910 2,4 52,5 31,35 4,5 1,111 2,5 50 33 5 112 2,6 52,5 34,65 5,5 1,113 2,6 52,5 31,35 5,5 0,914 2,6 52,5 34,65 4,5 0,915 2,5 50 33 5 1

Versuch

32

Analysenresultate und graphische Auswertung

Graphische Auswertung der Daten mittels Paretodiagramm und Darstel-lung der Haupteffekte

Das Paretodiagramm zeigt die wesentlichen Einflußgrößen für die Ziel-größe (Auflösung des kritischen Peakpaares). Die Stärke der Effektekann im Paretodiagramm gut beurteilt werden.

Der wesentliche Einfluß auf die Zielgröße erfolgt meist durch die Wirkungdieser einzelnen Einflußgrößen. Deshalb nennt man diese Effekte derEinflußgrößen auch Haupteffekte. Die Darstellung der Haupteffekte gibtdie Stärke und die Richtung, also die Wirkung, der Einflußgrößen für dieZielgröße wieder und beschreibt so einen geradlinigen Zusammenhangzwischen Ziel- und Einflußgröße.

33

Analysenresultate für die Trennung der aktiven Substanzen

Plackett-Burmanph-Versuchsplan (randomisiert) und Analysenresultate

pH -Wert Temperatur Steigung (tG) Konz. Mod. Flußrate

[pH Einheit] [° C] [min] [% MeOH] [ml/min]

1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,12 2,4 52,5 34,65 4,5 1,13 2,4 52,5 31,35 5,5 0,94 2,6 47,5 34,65 4,5 0,95 2,5 50 33 5 16 2,4 47,5 34,65 5,5 0,97 2,6 47,5 31,35 5,5 1,18 2,4 47,5 34,65 5,5 1,19 2,4 47,5 31,35 4,5 0,910 2,4 52,5 31,35 4,5 1,111 2,5 50 33 5 112 2,6 52,5 34,65 5,5 1,113 2,6 52,5 31,35 5,5 0,914 2,6 52,5 34,65 4,5 0,915 2,5 50 33 5 1

3,02,9

2,83,03,02,8

3,02,83,22,7

3,02,72,93,0

Versuch

kritische Auflösung Rs für die Trennung

der aktiven Substanzen

[Peak 11-12]

3,0

34

Graphische Auswertung der Daten für die Trennung der aktiven Substanzen

ParetodiagrammStandardized Pareto Chart for Resolution

Standardized effect0 1 2 3 4 5

B:pH value

F:Conc. Modifier

C:Temperature

H:Flowrate

E:Slope_tG

Signifikanzlinie

nur die Einflußgrößen E und H haben einen signi-fikant von Null verschie-denen Effekt

nicht signifikant von Null verschiedene Einflußgrö-ßen (C, F, B)

HaupteffekteMain Effects Plot for Resolution

Res

olut

ion

pH valueTemperature

Slope_tGConc. Modifier

Flowrate

2,82,842,882,922,96

33,043,083,12

35

Chromatogramm bei schlechtester Kombination der Einflußgrößenauf die Trennung der aktiven Substanzen

Laborlauf

0 10 20 30Zeit (min)

11 12

Auflösung RspH-Wert 2.6 (2.5)Temperatur 52.5 °C (50)Steigung (tG) 31.35 min (33)Modifier Konz. 4.5 % MeOH (5)Flußrate 0.9 ml/min (1.0)

20.6 20.8 21.0 21.2 21.4 21.6 21.8Zeit (min)

11

12

kritisches Peakpaar 11,12= 2.7

36

Analysenresultate für die Trennung der aktiven- und verwandten Substanzen

Plackett-Burman-Versuchsplan (randomisiert) und Analysenresultate

pH -Wert Temperatur Steigung (tG) Konz. Mod. Flußrate

[pH Einheit] [° C] [min] [% MeOH] [ml/min]

1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,12 2,4 52,5 34,65 4,5 1,13 2,4 52,5 31,35 5,5 0,94 2,6 47,5 34,65 4,5 0,95 2,5 50 33 5 16 2,4 47,5 34,65 5,5 0,97 2,6 47,5 31,35 5,5 1,18 2,4 47,5 34,65 5,5 1,19 2,4 47,5 31,35 4,5 0,910 2,4 52,5 31,35 4,5 1,111 2,5 50 33 5 112 2,6 52,5 34,65 5,5 1,113 2,6 52,5 31,35 5,5 0,914 2,6 52,5 34,65 4,5 0,915 2,5 50 33 5 1

1,91,8

1,61,81,71,8

1,81,72,01,7

1,71,71,81,8

Versuch

kritische Auflösung Rs für die Trennung der aktiven

und verwandten Substanzen

[Peak 12-13]

1,7

37

Graphische Auswertung der Daten für die Trennung der aktiven-und verwandten Substanzen

ParetodiagrammStandardized Pareto Chart for Resolution

Standardized effect0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4

B:pH value

F:Conc. Modifier

H:Flowrate

C:Temperature

E:Slope_tG

Signifikanzlinie

nicht signifikant von Null verschiedene Einflußgrö-ßen (E, C, H, F, B)

HaupteffekteMain Effects Plot for Resolution

Res

olut

ion

pH valueTemperature

Slope_tGConc. Modifier

Flowrate

1,71,721,741,761,781,8

1,821,84

38

Chromatogramm bei schlechtester Kombination der Einflußgrößenauf die Trennung der aktiven und verwandten Substanzen

Laborlauf

0 10 20 30Zeit (min)

12

13

Auflösung RspH-Wert 2.6 (2.5)Temperatur 52.5 °C (50)Steigung (tG) 31.35 min (33)Modifier Konz. 4.5 % MeOH (5)Flussrate 1.1 ml/min (1.0)

21.1 21.3 21.5 21.7 21.9 22.0 22.1Zeit (min)

12

13

kritisches Peakpaar 12,13= 1.6

39

Analysenresultate für die Trennung der verwandten Substanzen

Plackett-Burman-Versuchsplan (randomisiert) und Analysenresultate

pH -Wert Temperatur Steigung (tG) Konz. Mod. Flußrate

[pH Einheit] [° C] [min] [% MeOH] [ml/min]

1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,12 2,4 52,5 34,65 4,5 1,13 2,4 52,5 31,35 5,5 0,94 2,6 47,5 34,65 4,5 0,95 2,5 50 33 5 16 2,4 47,5 34,65 5,5 0,97 2,6 47,5 31,35 5,5 1,18 2,4 47,5 34,65 5,5 1,19 2,4 47,5 31,35 4,5 0,910 2,4 52,5 31,35 4,5 1,111 2,5 50 33 5 112 2,6 52,5 34,65 5,5 1,113 2,6 52,5 31,35 5,5 0,914 2,6 52,5 34,65 4,5 0,915 2,5 50 33 5 1

Versuch

kritische Auflösung Rs für die Trennung

der verwandten Substanzen

[Peak 4-5]

1,71,71,71,81,81,81,72,01,7

1,91,8

1,61,81,71,8

40

Graphische Auswertung der Daten für die Trennung der verwandten Substanzen

ParetodiagrammStandardized Pareto Chart for Resolution

Standardized effect0 1 2 3 4 5 6

E:Slope_tG

F:Conc. Modifier

C:Temperature

H:Flowrate

B:pH value

Signifikanzlinie

nur die Einflußgrößen B und H haben einen signi-fikant von Null verschie-denen Effekt

nicht signifikant von Null verschiedene Einflußgrö-ßen (C, F, E)

HaupteffekteMain Effects Plot for Resolution

Res

olut

ion

pH valueTemperature

Slope_tGConc. Modifier

Flowrate

2,12,22,32,42,52,62,72,8

41

Chromatogramm bei schlechtester Kombination der Einflußgrößenauf die Trennung der verwandten Substanzen

0 10 20 30Zeit (min)

45

pH-Wert 2.6 (2.5)Temperatur 52.5 °C (50)Steigung (tG) 31.35 min (33)Modifier Konz. 4.5% MeOH (5)Flussrate 1.1 ml/min (1.0)

8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0Zeit (min)

4

5

kritisches Peakpaar 4,5Auflösung Rs = 1.6

Laborlauf

42

RP-HPLC-Methodenentwicklung und Test auf Robustheit

ZusammenfassungDie Entwicklung einer RP-HPLC-Methode für ein neues pharmazeu-tisches Produkt ist ebenso wie die Entwicklung der Arzneimittelformu-lierung eine Kette von Optimierungsproblemen.

Für die RPLC-Methodenentwicklung ist das vielfach bewährte Software-Werkzeug „DryLab 2000“ eingesetzt worden.

Die Anwendung dieses Software-Werkzeuges in der RPLC-Methodenent-wicklung erlaubt effizient Lösungen zu finden, auch unerwartete, und hilft, robuste Arbeitsbedingungen schneller zu erarbeiten.

Nach Beendigung der Modellierungsphase, wenn es darum geht, sowohl die Selektivität und/oder die Spezifität als auch die robuste Trennungdes kritischen Peakpaares im Arbeitspunkt zu bestätigen, ist zum Testauf Robustheit der entwickelten RPLC-Methode auf Methoden der sta-tistischen Versuchsplanung (Plackett-Burman-Versuchsplan) zu-rückgegriffen worden.

43

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