Geochemische Analytik

HPLC

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (eng. high performance

liquid chromatographie (HPLC)) ist ein analytisches Verfahren mit

dem nicht flüchtige Substanzgemische getrennt und mit Hilfe von

Detektoren bestimmt und quantifiziert werden können.

HPLC

A = Lösungsmittelreservoir

B = Mischventil mit

Pumpensystem

C = 6-Wege Ventil

D = Druckkompensations-

schleife

E = Mischkammer

F = Injektionsventil

G = Trennsäule

I = Detektor (z.B. UV/VIS)

J = Computer-Interface

K = PC

L = Drucker

polarity

Gradient Mixer

Pumpe Autosampler Säule

Injektor

Säulenofen

Chromatogramm

Detektor • Druck: 20-400 bar • Eluentenflussrate: < 1ml/min • Phases for separation:

normal phase/reversed phase • Gradient elution vs. Isocratic • Eluents compatible to column

& MS

HPLC flow chart niedere Polarität höhere Polarität

HPLC Säulen

Typ der Säule,

Lösungsmittelzusammensetzung

und Flussrate bestimmen den

Druck der Applikation

Typische Partikelgröße bewegt

sich zwischen 1.3 und 5 µm und

einer Länge zwischen 7 und 40

cm bei einem Durchmesser von

2.1 bzw 4.6 mm

Innendurchmesser.

HPLC Säulen

HPLC (Agilent 1200) UHPLC (Agilent 1290 Infinity)

Ultra HPLCs erlauben einen Betrieb bis

ca. 1200 bar und damit die Verwendung von

Säulen mit kleinerer Partikelgröße und

gleichzeig schnellerem und effizienterem

Betrieb.

Ultra HPLCs erlauben einen Betrieb bis ~400

bar

HPLC-Modi

• Normalphasenchromatographie (normal-phase chromatography)

Chromatographisches Verfahren bei dem ein polarer Säulentyp (z.B. Silikasäule)

eingesetzt wird und das Stoffgemisch mit einem überwiegend apolaren

Lösungsmittel von der Säule gespült wird. Zusätzlich ist die Beimengung von

polaren Lösungsmittel während des Laufes möglich.

• Reversed- Phasen Chromatographie (reversed-phase chromatography)

Chromatographisches Verfahren bei dem ein apolarer Säulentyp (z.B. C8 oder C18-

Phasen) eingesetzt wird und das Stoffgemisch mit einem überwiegend polaren

Lösungsmittel von der Säule gespült wird. Zusätzlich ist die Beimengung von

apolaren Lösungsmittel während des Laufes möglich.

HPLC flow chart

• Normalphasenchromatographie (normal-phase chromatography)

polar apolar

Pola

ritä

t

apolare Substanz

polare Substanz

z.B. Silica-Säule

• Reversed- Phasen Chromatographie (reversed-phase chromatography)

polar

Pola

ritä

t

apolar

apolare Substanz

polare Substanz

z.B. C8 oder C18-Säule

UV/VIS-Detektor:

Nicht-destruktives Messverfahren, das die Absorption der

elektromagnetischen Wellen des ultravioletten (UV) und des sichtbaren Lichts

(VIS) nutzt. Variante des UV/VIS Detektors ist der Photodiodenzeilendetektor

(PDA = photo diode array detector) → Pigmente, Toxine

Fluoreszenz-Detektor:

Sehr sensitive und selektiv für Analyten, die fluoreszieren. Nicht einsetzbar für

andere Substanzen →

Brechungsindex-Detektor (RI-Detektor):

Messgerät zur Ermittlung der veränderlichen Konzentration gelöster Stoffe im

Fluss eines Lösungsmittels. Geringere Nachweisgrenze als UV/VIS oder

Fluoresenzdetektoren → Zucker

Massenspektrometer (MS):

Destruktives Verfahren in dem Moleküle durch einen Elektronenstrahl in Ionen

fragmentiert werden und Informationen hinsichtlich der Struktur organischer

Verbindungen gewonnen werden können → z.B. Lipide, Zucker, Proteine

Detektoren

Massenspektrometer

Wang et al. (2015) RCS

GC-MS

EI = electron-impact ionization

CI = chemical ionization

HPLC-MS

APCI = Atmopheric pressure chemical ionization

ESI = electrospray ionization

MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization

neutral bis schwach polare Komponenten polare Komponenten

Sample introduction

Interface to vacuum

Ion source Mass

analyzer Detector

Sample introduction

Interface to vacuum

Ion source Mass

analyzer Detector

high vacuum

high vacuum

Atmospheric Pressure Ionization (API)

GC/MS

HPLC/MS ESI, APCI, APPI

EI, CI

Sector, Quadrupole, TOF

(triple) Quadrupole, ion trap, TOF, sector

MS Detektoren

MS Detektoreninterfaces

APCI

ESI

Anwendungen

Anwendungen

• Pigmente: Chlorophylle, Carotenoide

• Bacteriohopanepolyols (BHPs)

• Glycerol dialkyl glycerol tetraethers (GDGTs)

• Intact Polar Lipids (IPLs)

• Ladderanes

O

OO

O

OH

OH

OH

OHOH

NH2

HPLC erlaubt die Detektion von hochmolekularen und/oder (hoch)polaren

Komponenten, die mit Hilfe von GC-MS nicht zu bestimmen sind.

Klassische Anwendungsbeispiel in den Geowissenschaften sind:

GDGT-0

Pigmente

Lake Taihu (China)

Lake Erie (USA

Lake Barkenberg (Germany)

Chlorophyll: Chlorophyll a,

Chlorophyll c1, Chlorophyll c2

Gruppe von Tetrapyrrolen, die

als primäre Pigmente in der

Photosynthese von Bedeutung

sind

Chlorophyll a ubiquitär in Algen,

Landpflanzen und

Cyanobakterien

Photosynthetische Bakterien

enthalten Bakteriochlorophyll

Pigmente

Carotine: β-Carotin, ε-Carotin

Carotine: sekundäre Pflanzenstoffe mit der Summenformel C40H56, die zu

den Tetraterpenen gerechnet werden. Sie bestehen aus ein bis zwei Ionen-

Ringen, die durch eine Kohlenstoffkette mit neun Doppelbindungen

verbunden sind.

Pigmente - Carotine

Xanthophylle: Echinenon, Canthaxanthin, Fucoxanthin, Neofucoxanthin,

Diatoxanthin, Diadinoxanthin, Neoxanthin

Xanthophylle: gehören zu den Tetraterpenen, die jedoch sauerstoffhaltige

Gruppen (Hydroxy-, Carbonyl-, Carboxylgruppen) enthalten

Pigmente - Xanthphylle

Pigmente – Chlorophyll a

Pigmente – Chlorophyll a

Pigmente

Cyanobakterien

Grünalgen

Pigmente

Cyanobacteria

Zeaxanthin (E161h) Canthaxanthin (E161g)

Phycoerythrin

Phycocyanin

Anwendungen

Pigmente

GDGTs

HPLC-APCI-MS

GDGTs

Archaeen als Quelle von

isoprenoidalen Diethern (Archaeol)

und isoprenoidalen Tetraethern

(glycerol dialkyl glycerol

tetraethern)

GDGT-0

Archaeol

GDGTs

Intaktes polares Lipid (IPL):

Biologisches Molekül, dass aus einer Kopfgruppe (z.B. Glukose) besteht, das an ein

Core Lipid gebunden ist. Sehr polar durch Kopfgruppe → HPLC-ESI-MS,

(~1,300-1,900 Da)

Core

Dihexose-GDGT

Kopfgruppe

Core Lipid (CL):

Geomolekül, das seine Kopfgruppe verloren hat und über geologische Zeiträume in

sedimentären Sequenzen stabil ist. Neutral bis schwach polar → HPLC-APCI-MS,

(Molekulargewicht in der Regel zwischen 1292-1304 Da) Crenarchaeol

GDGTs

GTGT-0

GDGT-0

GDGT-1

GDGT-2

GDGT-3

GDGT-4

Crenarchaeol

GDGTs

GDGT-0

GDGT-1

Crenarchaeol

GC-MS Chappe et al. (1980)

GDGTs zu hohes Molekular-

gewicht für GC-MS Messung!

→ HPLC-MS

Aber Bruchstücke

detektierbar mit Hilfe von

GC-MS!

Hopmans et al. (2000)

GDGTs

Messung von GDGTs (als core lipide) mit Hilfe eines HPLC-MS Systems erstmals im

Jahr 2000 an dem thermophilen Archaeon Metallosphaera sedula.

GTGT-0

GDGT-0

GDGT-1

GDGT-2

GDGT-3

GDGT-4

Crenarchaeol

GTGT-0

GDGT-0

GDGT-1

GDGT-2

GDGT-3

GDGT-4

Crenarchaeol

M. sedula

Halley Bay Station (Antarctica) Arabian Sea

Schouten et al. (2002)

TEX86

Im folgenden Analyse von GDGTs in globalen marinen Sedimenten und Entdeckung

von unterschiedlichen GDGT-Verteilungsmustern in Abhängigkeit der geographischen

Breite.

TEX86

Ste

igende A

nzahl

an R

ingen

(Kim et al. 2010)

Red Sea

TEX86

(Kim et al. 2010)

Red Sea

TEX86