UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF
Institut für Neuropathologie
Direktor: Prof. Dr. med. Markus Glatzel
Untersuchungen zum Epidermal Growth Factor Receptor – Status
in Ependymomen: Vergleich von immunhistochemischen
Färbungen und Floureszenz-in-situ-Hybridisierung
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
vorgelegt von:
Larissa Kolevatova
aus Berdjansk/Ukraine
Hamburg 2011
II
Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 13.09.2011 Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg. Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. M. Glatzel Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: Prof. Dr. G. Sauter Prüfungsausschuss, dritte/r Gutachter/in: PD Dr. G. Thomalla
III
INHALTSVERZEICHNIS
1 FRAGESTELLUNG................................................................................................... 1 4
2 EINLEITUNG............................................................................................................ 2
2.1 Grundlagen zu Ependymomen ............................................................................. 2
2.2 Immunhistochemische Routinediagnostik............................................................. 3
2.3 Genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen...................................................... 4
2.4 Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor .............................................................. 4
3 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................. 6
3.1 Tumorkollektiv....................................................................................................... 6
3.2 Tissue-Microarray-Herstellung .............................................................................. 6
3.3 Immunhistochemische Färbungen ........................................................................ 7
3.3.1 EGFR......................................................................................................... 7
3.3.2 Mib-1.......................................................................................................... 8
3.3.3 p53............................................................................................................. 9
3.4 Floureszenz-in-situ-Hybridisierung........................................................................ 9
3.5 Statistische Analyse............................................................................................ 10
3.6 Isolierung von DNA und RNA.............................................................................. 11
3.7 EGFR-Mutationsanalyse..................................................................................... 12
4 ERGEBNISSE ........................................................................................................ 14
4.1 Demographische Charakteristik der Kohorte ...................................................... 14
4.2 Kontrolle des TMA mittels Mib-1 und p53 ........................................................... 15
4.3 Expression von EGFR......................................................................................... 16
4.4 EGFR-Genstatus-Analyse................................................................................... 16
4.5 Vergleich von immunhistochemischer EGFR-Expression und FISH................... 19
4.6 Nachweis einer EGFR-Mutation.......................................................................... 20
5 DISKUSSION ......................................................................................................... 21
6 ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................... 24
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................................................ 25
8 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................... 27
9 DANKSAGUNG...................................................................................................... 31
10 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG....................................................................... 32
1
1 FRAGESTELLUNG Ependymome sind vom Ependym ausgehende gliale Neoplasien ektodermalen
Ursprungs. Pathogenese und prognostische Faktoren von Ependymomen sind noch
nicht ausreichend geklärt. Man hat herausgefunden, dass der epidermale
Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) eine entscheidende Rolle in der Progression von
Gliomen, insbesondere Glioblastomen, spielt. (Sjostrom et al. 2010) In Anlehnung
dazu wollten wir den EGFR-Status bei Ependymomen untersuchen. Wir wollten
herausfinden, ob Ependymome EGFR vermehrt exprimieren, und welche Methode
am besten geeignet ist, den EGFR-Status zu ermitteln. Bis anhin wird er durch
semiquantitative Messung von immunhistochemischen Färbungen bestimmt. Diese
Methode ist zwar kostengünstig, jedoch auch anfällig für Störfaktoren. Deshalb
wollen wir zusätzlich zur immunhistochemischen Analyse auch den Genstatus des
EGFR-Gens mittels Floureszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) untersuchen. Für In-
situ-Analysen ist ein Tissue-Microarray (TMA) sehr nützlich, weil damit alle Proben
simultan mit einem Reagenz untersucht werden können. Damit bringt der TMA einen
hohen Grad an Standardisierung auf, die eine wichtige Rolle in der Analyse der
Proteinexpression oder des Genstatus spielt. Ferner wollten wir untersuchen, ob eine
EGFR-Expression mit einer Mutation im EGFR-Gen einhergeht.
2
2 EINLEITUNG
2.1 Grundlagen zu Ependymomen Ependymome sind neuroektodermale, vom Ependym der Ventrikel, des
Zentralkanals des Rückenmarks und Filum terminale ausgehende Tumoren.
(Massimino et al. 2009) Ependymome machen rund 2-9 % aller neuroepithelialer
Tumoren aus. Im Rückenmark lokalisierte Ependymome stellen die häufigste
neuroepitheliale Neoplasie der Erwachsenen dar. Spinale Ependymome haben eine
günstige Prognose. (Mendrzyk et al. 2006) Ependymome werden nach der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) in drei Grade unterteilt. Diese Klassifikation
beruht auf der Annahme einer Entdifferenzierung, deren einzelne Stufen den
Malignitätsgraden entsprechen. (Louis et al. 2007) WHO-Grad I Ependymome sind
gutartig und langsam wachsend. Sie kommen überwiegend im Conus-Cauda-Filum-
terminale–Bereich vor. WHO-Grad II Ependymome sind langsam wachsende,
differenzierte und gut begrenzte Tumore im Bereich der inneren Hirnkammern oder
des Rückenmarks. Typisches histologisches Merkmal sind perivaskuläre
Pseudorosetten. WHO-Grad III Ependymome sind schnell wachsend mit deutlichen
Zeichen der Malignität: erhöhte Zelldichte und Mitoserate, Kernpolymorphie,
invasives Wachstum, Gefässproliferation, Nekrosen. Histopathologisch unterscheidet
man myxopapilläre Ependymome und Subependymome (beide WHO-Grad I),
zelluläre, papilläre, klarzellige, tanyzytische (WHO-Grad II) und anaplastische
Ependymome (WHO-Grad III). (Louis et al. 2007) Mikroskopisch imponiert ein
heterogenes Bild mit dem Kriterium der perivaskulären Pseudorosettenbildung, die
jedoch in manchen Unterformen fehlen kann. (Burger et al. 2002) Daneben gehören
zum „klassischen Erscheinungsbild“ auch die echten Rosetten mit Orientierung der
Tumorzellen um ein virtuelles Zentrum. (Burger et al. 2002)
Klinisch stehen Hirndrucksymptome durch Liquorabflussstörungen im Vordergrund.
(Kleihues et al. 2004) Operation und Bestrahlung sind die wesentlichen
therapeutischen Optionen. (Timmermann et al. 2000) Da eine vollständige Resektion
insbesondere im IV. Ventrikel selten gelingt, ist die Prognose insgesamt ungünstig.
(Kleihues et al. 2004) Prognostische Faktoren wurden in Studien untersucht und
beschränken sich auf den WHO Grad und das Ausmass der chirurgischen
3
Resektion. (Rodriguez et al. 2009) Somit besteht Bedarf nach neuen
Prognosefaktoren und therapeutischen Optionen. (Green et al. 2009)
2.2 Immunhistochemische Routinediagnostik
Mit steigender Entdifferenzierung verlieren Ependymome ihr „klassisches“
Erscheinungsbild, sodass die Diagnose mittels immunhistochemischer Marker
bestätigt werden muss. (Burger et al. 2002) Zum Einsatz kommen das epitheliale
Membranantigen (EMA), welches an der Zelloberfläche der meisten epithelialen
Zellen exprimiert wird, und saures Gliafaserprotein (GFAP), ein Intermediärfilament,
welches vor allem in Astrozyten vorkommt. Dem Lumen zugewandte Zelloberflächen
der echten Rosetten stellen sich EMA-positiv dar. (Burger et al. 2002) GFAP-positiv
sind die Zellfortsätze, die die Tumorzellen der perivaskulären Pseudorosetten
umgeben. (Burger et al. 2002)
Zur Einschätzung der Zellproliferation bestimmt man die Expression von Ki-67, ein
nukleäres Protein, welches in Phasen G1 (Gap), S (Synthese), G2 (Gap) und M
(Mitose) des Zellzyklus exprimiert wird. Bei teilungsfähigen Zellen wird der Eintritt in
den Zellzyklus (G1-Phase) durch äussere Faktoren induziert, anschliessend kommt
es zur Verdoppelung der DNA (S-Phase) und Vorbereitung (G2-Phase) auf die
Mitose (M-Phase). Damit stellt Ki-67 einen Marker für Zellproliferation dar, die
Detektion erfolgt mithilfe des monoklonalen Antikörpers Mib-1. Zur besseren
Vergleichbarkeit wird der Mib-1-Proliferationsindex (Mib-1 LI) bestimmt. Er variiert in
unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors. (Burger et al. 2002)
Üblicherweise zeigen WHO-Grad III Ependymome einen höheren Mib-1 LI als WHO-
Grad II Ependymome. (Burger et al. 2002)
Der Zellzyklus wird durch zahlreiche Faktoren reguliert, hier spielt der
Tumorsuppressor p53 eine Schlüsselrolle. Seine Inaktivierung oder Mutation im p53-
Gen können zum unkontrollierten Wachstum und Tumorentwicklung führen. (Böcker
et al. 2004) Immunreaktivität ist sehr wahrscheinlich anzutreffen in WHO-Grad III
Ependymomen. (Burger et al. 2002)
4
2.3 Genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen
Zahlreiche genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen konnten mittels
Hybridisierungsmethoden aufgedeckt werden. Eine Studie untersuchte 26
Ependymome und fand eine 22q–Monosomie in 36 % der Fälle. Ferner fanden sie
amplifiziertes N-MYC in zwei spinalen Ependymomen. (Scheil et al. 2001) Bei MYC
handelt es sich um eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche die mRNA-
Synthese regulieren. Desweiteren fand eine Gruppe eine Deletion der
Chromosomen 17 und 22 bei Ependymomen. Dieser wurde eine entscheidende
Rolle in der Pathogenese der Ependymome zugeschrieben, nämlich in der
Inaktivierung der Tumorsuppressorgene. (Kramer et al. 1998) Ein wichtiger Vertreter
der Tumorsuppressorgene ist TP53, welches auf dem Chromosomenort 17p13
lokalisiert ist und für den Transkriptionsfaktor p53 kodiert, welches bei irreparablen
DNA-Schäden die Apoptose induziert. (Böcker et al. 2004) Bei spinalen
Ependymomen konnte häufig eine Mutation im Neurofibromatose-Typ-2-Gen (NF2)
beobachtet werden. (Kleihues et al. 2004) Eine andere Studie untersuchte die
Genamplifikation in Ependymomen. Sie fand eine 0,34 Mb grosse Region am
Chromosomenort 7p11.2, welcher den Genlocus von EGFR beinhaltet, hoch
amplifiziert in einem und diskret amplifiziert in 24 von 68 Ependymomen. (Mendrzyk
et al. 2006) Eine andere Studie untersuchte vier Ependymome mittels CISH
(chromogenic in-situ hybridization) und konnte keine EGFR-Amplifikation feststellen.
(Marquez et al. 2004)
2.4 Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor EGFR ist ein transmembraner
Tyrosinkinase-Rezeptor für verschiedene Wachstumsfaktoren. Die Bindung eines
Liganden an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors führt zu seiner Dimerisierung.
Dadurch kommt es zur Konformationsänderung des intrazellulären Teilabschnitts und
Aktivierung der Tyrosinkinase. Es kommt zur Phosphorylierung von intrazellulären
Substratproteinen, die eine intrazelluläre Signalkaskade (Ras, Raf, MAP-Kinase) in
Gang setzen. (Zatloukal et al. 2004) Das Ergebnis ist Zellwachstum und Zellteilung.
Daraus ist ersichtlich, dass EGFR eine ausschlaggebende Rolle bei der
5
Krebsentstehung spielt. (Girard et al. 2009) Amplifikationen im EGFR-Gen auf
Chromosom 7 oder Mutationen der für die Tyrosinkinase kodierenden Domäne sind
die Ursachen für eine gesteigerte Signalübertragung. (Ladanyi et al 2008) Die am
häufigsten bei Gliomen beschriebene EGFR-Alteration ist die Deletion der Exons 2-7,
die ein verändertes EGFR-Protein (EGFR variant III, EGFRvIII) zur Folge hat.
(Jeuken et al. 2009) Die Signalübertragung durch Rezeptoren mit Tyrosinkinase
kann auch pharmakologisch beeinflusst werden. Eine Therapie mit Tyrosinkinase-
Inhibitoren konnte erfolgreich bei kolorektalen und Lungenkarzinomen eingesetzt
werden. (Halatsch et al. 2006, Francoual et al. 2006) Deshalb wird die Identifikation
von EGFR in Tumorzellen eine zunehmende Rolle in der neuropathologischen
Diagnostik spielen.
Die Korrelation zwischen EGFR-Expression aus immunhistochemischer
Untersuchung und EGFR-Genstatus ermittelt mit FISH wurde bisher noch nicht
systematisch untersucht bei Epedymomen. Eine Gruppe fand eine diskrete
Amplifikation in der Chromosomenregion 7p11.2, die den Genlokus für EGFR
beinhaltet, in 24 von 68 Ependymomen und eine hohe Amplifikation bei einem
Ependymom. (Mendrzyk et al. 2006)
6
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Tumorkollektiv
Es wurden 55 Tumorproben untersucht, die aus dem Archiv des Instituts für
Neuropathologie stammen. Das Gewebe stammt von Biopsien, die zwischen den
Jahren 1991 und 2007 am Institut für Neuropathologie untersucht wurden. Alle
Diagnosen entsprechend den Kriterien der WHO-Klassifikation wurden gemeinsam
mit einem Neuropathologen bestätigt. (Louis et al. 2004) Davon entsprachen 40
Tumorproben dem WHO-Grad II Ependymom und 15 wurden als WHO-Grad III
Ependymome klassifiziert. Für alle Analysen wurden die Patientendaten
anonymisiert.
3.2 Tissue-Microarray-Herstellung Die von Forschern des Instituts für Pathologie in Basel und des National Human
Genome Research Institutes in Bethesda, USA (Olli Kallioniemi, Juha Kononen,
Guido Sauter) entwickelte Gewebearray-Technik macht es erstmals möglich, eine
standardisierte Untersuchung sämtlicher Tumorproben unter Verwendung eines
Protokolls und gleicher Antikörper durchzuführen. Mit diesem Verfahren kann eine
optimale Vergleichbarkeit der Daten erzielt werden. Für unsere Studie erfolgte die
TMA-Herstellung anhand des bereits veröffentlichten Protokolls. (Dancau et al. 2010)
Auf Basis der mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitte wurde die den Tumor
am besten repräsentierende Region ausgewählt. Das entsprechende Areal wurde
auf dem zugehörigen Paraffinblock markiert. Ein Gewebezylinder von 0,6 mm
Durchmesser wurde aus der zuvor markierten Region ausgestanzt und in einem
Empfängerblock aus Paraffin platziert. Zuvor wurden dafür im Empfängerblock
Löcher in einem Abstand von 0,8 mm vorgefertigt. Nach Komplettierung des
Tumorarrays wurden 3 µm dünne Schnitte mit dem Mikrotom für anstehende In-situ-
Analysen angefertigt.
7
3.3 Immunhistochemische Färbungen
Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurde eine standardisierte indirekte
Immunperoxidase-Methode verwendet. Dabei bindet ein unkonjugierter Primär-
Antikörper an das Antigen. Anschliessend wird ein zweiter enzymgekoppelter
Antikörper, der gegen das Fc-Fragment des Primär-Antikörpers gerichtet ist,
aufgetragen. Es folgt die Substrat-Chromogen-Reaktion. Ein Enzym wird eingesetzt,
das farblose Vorstufen von Chromogen in farbige Enzymprodukte umwandelt. Als
Enzym wird eine Meerrettich-Peroxidase (HRP), als Chromogen 3.3’-
Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) verwendet. Die endogene Peroxidase
wurde durch Inkubation des TMA in 3%igem Wasserstoffperoxid inaktiviert. Die
Kernfärbung erfolgte mit Hämalaun mit anschliessender Spülung unter Wasser. Bei
denen im Folgenden erwähnten Puffern handelte es sich um TBS- und TRIS-Puffer.
3.3.1 EGFR Für die immunhistochemische Färbung von EGFR wurden zwei verschiedene
Antikörper verwendet: EGFRpharmDX-Kit (Verdünnung 1:200, Dako, Glostrup,
Dänemark) und clone 31G7 (Verdünnung 1:300, Zymed Laboratories, San
Francisco, CA, USA). Die Vorgehensweise entsprach dem Protokoll der Hersteller.
Nach EGFRpharmDX-Kit-Vorgaben wurde der Objektträger zur Entparaffinierung für
5 Minuten (min) in einem Xylolbad inkubiert, die überschüssige Flüssigkeit abgeklopft
und für 3 min in reines Ethanol und danach für dieselbe Zeitdauer in 95%igen
Ethanol getaucht. Anschliessend erfolgte eine Rehydrierung in Wasser für 5 min. Der
TMA wurde mit Proteiniase K für 5 min vorbehandelt und anschliessend für 5 min im
Wasserbad gespült. Danach wurde der TMA ausreichend mit Antikörper bedeckt und
in der Feuchtigkeitskammer für 30 min inkubiert. Anschliessend erfolgte eine
Spülung und Waschung im Pufferbad für 5 min. Der sekundäre Antikörper wurde
dazu gegeben und der TMA erneut für 30 min in der Feuchigkeitskammer inkubiert
und im Anschluss wie bereits erwähnt gespült. Danach wurde DAB für eine
Einwirkzeit von 10 min dazu gegeben. Im Anschluss wurde der TMA wenige Minuten
im Wasserbad gespült und mit Deckgläschen versehen.
8
Für den Färbevorgang mit dem Antikörper von Zymed wurde der TMA zur
Entparaffinierung zuerst für 1 Stunde (h) in Xylol und anschliessend in absteigender
Alkoholreihe (100%–, 96%–, 80%iger Ethanol) bis Aqua dest. getaucht. Daran
schloss sich eine fünfminütige Pufferwaschung und Vorbehandlung mit dem Autoklav
für 5 min an. Nach wiederholter Waschung ließ man den TMA für 10 min in 3%igem
Wasserstoffperoxid inkubieren. Im Anschluss wurde der TMA erneut mit Puffer
gespült. Schliesslich wurde der primäre Antikörper dazu gegeben, den man für 2 h
bei 30 °C einwirken ließ. Danach wurde der TMA für 5 min im Puffer gewaschen und
anschliessend mit der Polymer-HRP für 30 min bei 30 °C inkubiert. Es schloss sich
zunächst eine zweimalige Spülung für je 5 min mit Puffer und dann mit Wasser an,
bevor das Chromogen hinzu gegeben wurde. Der TMA wurde mit DAB für 10 min
inkubiert und anschliessend mit Wasser und in aufsteigender Alkoholreihe (80%–,
96%–, 100%iger Ethanol) bis Xylol gespült, bevor er mit einem Deckgläschen
versorgt wurde.
Die Auswertung erfolgte semiquantitativ entsprechend eines weit gebräuchlichen
vierstufigen Scores mit (0): keine Membranfärbung; (1+): schwache, unvollständige
Membranfärbung; (2+): schwache bis mäßige vollständige Membranfärbung in
> 10 % der Tumorzellen; (3+): starke vollständige Membranfärbung in > 10 % der
Tumorzellen. Ein Score von 0 und 1+ wurde demnach als negative EGFR-
Expression, die Scores 2+ und 3+ als positive EGFR-Expression gewertet.
3.3.2 Mib-1
Für die Evaluierung des Proliferationsindex wurde der Antikörper für das
Proliferationsantigen Ki-67 (clone SP6, Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:50,
Neo Markers, Fremont, CA, USA) nach etabliertem Protokoll eingesetzt. Der TMA
wurde zunächst in einer Pufferlösung mit pH 2,5 und danach in der Mikrowelle für
20 min vorbehandelt. Nach Abkühlung wurde der TMA für 5 min im Puffer
gewaschen. Danach folgte die Inkubation in 3%igem Wasserstoffperoxid für 15 min.
Der Überschuss wurde zweimalig für je 5 min im Puffer gespült. Anschliessend
wurde der TMA mit im Puffer verdünntem Ziegenserum (1:10) für die Dauer von
30 min inkubiert. Danach wurde der primäre Antikörper, Mib-1, aufgetragen und für
2 h belassen, anschliessend wurde wieder im Puffer für 20 min gewaschen. Der
9
sekundäre Antikörper, ein biotinkonjugiertes Ziege-Anti-Maus-Ig, wurde in einer
Verdünnung mit Puffer von 1:60 unter Zugabe von 20 µm Human-IgG dazu gegeben
und für 40 min belassen. Anschliessend wurde der TMA für 10 min gewaschen. Im
nächsten Schritt folgte die Zugabe von Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex.
Nach 40 min wurde der TMA im Puffer erneut für 10 min gewaschen. Dann wurde
das Chromogen zugefügt und für die Dauer von 10 min belassen. Darauf folgte ein
zehnminütiger Waschvorgang mit Wasser.
Zur Bestimmung des Proliferationsindex (Mib-1 LI) wurden mindestens 200 Zellkerne
pro Gewebsstanze gezählt, wobei positiv gefärbte Zellen zu nicht gefärbten in
Verhältnis gesetzt wurden.
3.3.3 P53
Für die Markierung des p53 wurde folgender Antikörper verwendet: clone 318-6-11,
Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:200, Dako, Glostrup, Dänemark. Der TMA
wurde 20 min in der Mikrowelle unter Zugabe von 10 mM Zitrat und Pufferlösung
deparaffinisiert und rehydriert. Anschliessend wurde der primäre Antikörper dazu
gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde der TMA mit Puffer
gespült und anschliessend mit Peroxidase für 90 min bei 4 °C inkubiert. Im nächsten
Schritt wurde der TMA erneut mit Puffer gespült. Dann wurde DAB dazu gegeben
und für 30 min belassen. Nach dem Färbevorgang wurde der Rest mit Wasser
abgewaschen.
Analog der Bestimmung des Proliferationsindex wurden mindestens 200 Zellkerne
pro Gewebestanze gezählt und die Ratio positiv markiert zu nicht markiert gebildet.
3.4 Floureszenz-in-situ-Hybridisierung Für die FISH kamen folgende Sonden zum Einsatz: für das EGFR-Gen als
Zielsequenz eine Spectrum-Orange–Sonde für die Region 7p12 und eine
Centromersonde Spectrum-Green für die Region 7p11.1-q11.1 als Referenz
(Abbott/Vysis, Inc., Downers Grove, IL, USA). Vor der eigentlichen Hybridisierung
wurde der TMA entsprechend des FISH Kit-Protokolls (Abbott/Vysis, Downers Grove,
10
IL, USA) vorbehandelt. Zunächst wurde der TMA bei 56 °C über Nacht im
Brutschrank inkubiert. Zur Entparaffinierung wurde der TMA für 30 min in Xylol und
anschliessend 10 min in 96%igen Ethanol getaucht. Nach dreiminütiger Trocknung
auf der Heizplatte wurde das Pretreatment-Reagenz (Vysis, Downers Grove, IL,
USA) aufgetragen und bei 80 °C für 15 min inkubiert. Danach wurde der TMA mit
Wasser gespült. Im nächsten Schritt wurde Proteaselösung dazugegeben und bei
37 °C für 150 min belassen. Im Anschluss darauf erfolgte wieder eine Spülung mit
Wasser. Darauf wurde der TMA in aufsteigender Alkoholreihe (70%–, 80%–, 96%iger
Ethanol) jeweils 2 min gewaschen und anschliessend für 3 min auf der Heizplatte bei
48 °C getrocknet. Im nächsten Schritt wurde 10 µl DNA-Sonde auf das Gewebe
pipettiert, mit Deckgläschen versehen und mit Rubberzement versiegelt. Die Sonde
ist spezifisch für eine 300 kb lange Sequenz, welche das EGFR-Gen enthält. Die
Centromersonden (centromere enumeration probe, CEP) sind spezifisch für
hochrepetititve Sequenzen im Bereich der Centromeren. Im nächsten Schritt wurde
der TMA zunächst für 5 min bei 72 °C und anschliessend über Nacht bei 37 °C im
Hybrite-Gerät inkubiert. Am nächsten Tag wurden Kleber und Deckgläschen
vorsichtig entfernt und der TMA ins Wasserbad für 2 min bei 72 °C gestellt. Danach
wurde im Dunkeln für 15 min luftgetrocknet. Im nächsten Schritt wurde zur
Gegenfärbung 10 µl 4′,6-Diamino-2-Phenylindol (DAPI) auf den TMA pipettiert und
dieser mit Deckgläschen versehen.
Die Auswertung erfolgte manuell. Als Amplifikation wurde das Vorliegen von
> 2 EGFR-Gensignalen als Centromersignale (EGFR/CEP7-Ratio > 2) in mindestens
10 % der Tumorzellkerne definiert. Zugewinne wurden definiert als Vorliegen von
mehr EGFR– als CEP7-Signale in mindestens 50 % der Tumorzellkerne, wobei die
Definition der Amplifikation nicht erreicht wurde (1 < EGFR/CEP7-Ratio < 2). Ein
Normalbefund wurde dann angenommen, wenn keine der zwei oben genannten
Definitionen erfüllt wurde (EGFR/CEP7-Ratio ≤ 1).
3.5 Statistische Analysen
Für die Untersuchung der Beziehung zwischen immunhistochemisch
nachgewiesenem EGFR, dem EGFR-Genstatus ermittelt durch FISH und dem WHO-
Grad wurde der χ2-Test durchgeführt.
11
3.6 Isolierung von DNA und RNA
Die DNA-Extraktion erfolgte aus Paraffinmaterial. Dazu wurden vom Paraffinblock
drei bis fünf Scheiben von 8 µm Dicke mit einer sterilen Klinge geschnitten und in ein
2 ml Eppendorfgefäss gegeben. Nach Zugabe von 1 ml n-Oktan wurde das Gemisch
für 10 min bei 65 °C inkubiert. Anschliessend wurde die Suspension 5 min bei
14000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment mit
1 ml Ethanol gemischt und anschliessend für 1 min bei 14000 U/min zentrifugiert.
Auch dieser Überstand wurde verworfen und die Zentrifugation des Sediments unter
Zugabe von Ethanol wiederholt. Im Anschluss wurde das Gemisch 10 min bei 37 °C
getrocknet. Als nächstes wurde die Suspension in 100 µl Puffer und 10 µl
Proteinase K gelöst und das Ganze 24 h bei 50 °C inkubiert. Danach gab man 50 µl
Puffer und 5 µl Proteinase K dazu. Ausserdem wurde 450 µl Cleanmix binding
solution (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) und 50 µl Cleanmix high capacity
purification resin (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) hinzugefügt. Daraufhin wurde
das Untersuchungsmaterial in ein steriles 2 ml Eppendorfgefäss mit Filter umgefüllt
und 30 Sekunden (sec) bei 14000 U/min zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen,
250 µl Cleanmix washing solution (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) auf den Filter
gegeben und erneut 30 sec zentrifugiert. Dann wurde dieser Schritt wiederholt. Das
Filtrat wurde erneut verworfen. Als nächstes wurde 500 µl 80%igen Alkohol auf den
Filter gegeben und erneut zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Filter vorsichtig
herausgenommen und in ein steriles 2 ml Eppendorfgefäss gesteckt. Es wurden
50 µl Wasser auf 65-70 °C erhitzt und die DNA damit für 1 min eluiert und
anschliessend zentrifugiert. Nach Entfernen des Filters wurde die Konzentration der
DNA im Photometer bei 260 nm bestimmt.
Für die RNA-Isolierung wurden vom Paraffinblock Scheiben von 10 µm Dicke
geschnitten und in ein 2 ml Eppendorftube gegeben. Zur Entparaffinierung wurde
1 ml Xylol auf die Proben gegeben und das Ganze 10 sec auf dem Vortex
durchmischt. Das Gemisch wurde dann 2 min bei maximaler Umdrehungszahl
zentrifugiert und der Xylolüberstand anschliessend abpipettiert. Nach erneuter
Xylolzugabe und Zentrifugation wurden diese Schritte wiederholt. Nach Zugabe von
1 ml Ethanol wurde die Probe 2 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und die Zentrifugation nach erneuter Ethanolzugabe wiederholt. Danach wurde die
12
Probe bei 37 °C im Thermoblock mit offenem Deckel getrocknet, bis kein
Ethanolrückstand mehr vorhanden war. Dann wurde die Probe in 150 µl PKD-Puffer
(Qiagen, Venlo, Niederlande) aufgenommen. Im nächsten Schritt wurde der Tube
kurz in Stickstoff getaucht, sodass der Boden gefroren war, und anschliessend mit
Eppendorf-Pistille zermörsert. Nach Zugabe von 10 µl Proteinase K wurde die Probe
bei 55 °C im Wasserbad über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Gemisch
für 15 min bei 80 °C im Thermoblock belassen. Im letzten Schritt wurden die Proben
zusammen mit DNase in den QIAcube (Qiagen, Venlo, Niederlande) gegeben. Im
Anschluss wurde die gewonnene RNA-Menge photometrisch vermessen.
3.7 EGFR-Mutationsanalyse Für die EGFR-Sequenzierung wurde die zuvor aus dem in Paraffin eingebettetem
Material isolierte DNA verwand. Die Exons 18, 19, 20 und 21, welche die
Tyrosinkinase-Domäne des EGFR kodieren, wurden zunächst mittels Polymerase-
Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) nach gängigem Protokoll
amplifiziert. (Schlomm et al. 2007, Lynch et al. 2004) Folgende Primer fanden
Verwendung:
Exon 18: 5′-CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC-3′
3′-GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC-5′
Exon 19: 5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′
3′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-5′
Exon 20: 5′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3′
3′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-5′
Exon 21: 5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′
3′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-5′
Die Temperatur für Primerhybridisierung lag bei 58 °C. Im nächsten Schritt wurden
2 µl des Reaktionsgemisches unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
Exon 18: 5′-CAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC-3′
3′-CCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG-5′
Exon 19: 5′-CCTTAGGTGCGGCTCCACAGC-3′
3′-CATTTAGGATGTGGAGATGAGC-5′
13
Exon 20: 5′-GAAACTCAAGATCGCATTCATGC-3′
3′-GCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG-5′
Exon 21: 5′-CAGCCATAAGTCCTCGACGTGG-3′
3′-CATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC-5′
Im Anschluss wurde die aufgereinigte DNA mithilfe des ABI BigDye Terminator Kit
v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert und mit ABI PRISM
3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) genetisch ausgewertet.
Für die Untersuchung von EGFRvIII wurde die zuvor isolierte RNA einer Echtzeit-
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (real-time RT-PCR) unterzogen.
Folgende Primer über der Deletion wurden verwand:
3′-GGGCTCTGGAGGAAAAGAAA-5′
3′-TCCTCCATCTCATAGCTGTCG-5′
Zu diesem Zweck wurden 10 µl RNA mit 10 µl Mastermix, hergestellt entsprechend
dem High-capacity archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), für die
cDNA-Synthese eingesetzt. Die real-time RT-PCR erfolgte im Bio-Rad Cycler (Bio-
Rad, Hercules, CA, USA) nach Herstellerangaben.
14
4 ERGEBNISSE
4.1 Demographische Charakteristik der Kohorte
Tabelle 1 gibt einen Überblick über die demographischen Daten der untersuchten
Patienten. In Kürze, von den untersuchten 55 Ependymomen wurden 40 als WHO-
Grad II und 15 als WHO-Grad III Ependymome klassifiziert. Das Geschlechter-
verhältnis männlich zu weiblich betrug 6:5 in der Gruppe der WHO-Grad II
Ependymome und 3:2 unter den WHO-Grad III Ependymomen. Das Patientenalter
zum Diagnosezeitpunkt reichte von 2 bis 79 Jahren, der mittlere Wert lag bei 45
Jahren unter den WHO-Grad II und 26 Jahren unter den WHO-Grad III
Ependymomen. Von den 40 WHO-Grad II Ependymomen waren 11 (27,5 %)
intrakraniellen und 29 (72,5 %) intramedullären Ursprungs. Zwischen den 15 WHO-
Grad III Ependymomen wiesen 9 (60,0 %) eine intrakranielle und 6 (40,0 %) eine
Lokalisation im Rückenmark auf.
Tabelle 1. Demographische Charakteristik der Stichprobe.
Anzahl der Fälle (%)
WHO Grad II
WHO Grad III
Durchschnittsalter (st) 45 (21.0) 26 (17.4)
männlich : weiblich 6 : 5 3 : 2
supratentoriell 0 6 (40.0) infratentoriell 11 (27.5) 3 (20.0)
zervikal 12 (30.0) 5 (33.3) zerviko-thorakal 5 (12.5) 0
thorakal 7 (17.5) 0 lumbosakral 1 (2.5) 1 (6.7)
Tumor Lokalisation
Conus-Cauda-Region 4 (10.0) 0
15
4.2 Kontrolle des TMA mittels Mib-1 und p53
Wie bereits erwähnt, wurden die zu untersuchenden Tumorproben in einem TMA
zusammengestellt. Dieses Format erlaubt die simultane immunhistochemische
Untersuchung und den direkten Vergleich der Ergebnisse. Da ein kleines Areal
repräsentativ für den Tumor ausgewählt wird, sind Fehler bei der Probenauswahl
nicht auszuschliessen. Zur Kontrolle eignet sich die Gegenüberstellung der
Proliferationsindices des Gewebeschnittes vom Spenderparaffinblock und der daraus
entnommenen Gewebestanze auf dem TMA (Tabelle 2). Innerhalb der WHO-Grad II
Ependymome auf dem TMA betrug der Mib-1-Proliferationsindex im mittel 1,80 %
(Standardabweichung st 4,71) verglichen mit 2,85 % (st 6,45) auf den her-
kömmlichen Gewebeschnitten. Unter den WHO-Grad III Ependymomen lag dem
Mittelwert von 11,99 % (st 16,68) für die Gewebestanzen der mittlere Mib-1 LI von
25,55 % (st 15,38) für die Gewebeschnitte gegenüber.
Ergänzend haben wir den p53 LI für den TMA ermittelt. Innerhalb der WHO-Grad II
Ependymome lag der mittlere Wert bei 9,48 (st 14,15), während er für WHO-Grad III
Ependymome 16,06 (st 17,40) betrug.
Tabelle 2. Ergebnisse der Mib-1– und p53-Färbungen.
analysiert Intervall Mittelwert(st)
Mib-1 TMA 55 0 – 63.3 4.58 (11.29)
WHO-Grad II 40 0 – 21.2 1.80 (4.71)
WHO-Grad III 15 0 – 63.3 11.99 (18.69)
Mib-1 Gewebeschnitt 55 0 – 42.0 7.16 (11.36)
WHO-Grad II 40 0 – 33.5 2.85 (6.45)
WHO-Grad III 15 0 – 42.0 25.55 (15.38)
p53 TMA 54 0 – 45.0 11.31 (15.24)
WHO-Grad II 39 0 – 44.0 9.48 (14.15)
WHO-Grad III 15 0 – 45.0 16.06 (17.40)
16
4.3 Expression von EGFR
Erhebliche Unterschiede fanden sich in der Anzahl der EGFR-exprimierenden
Tumoren abhängig vom eingesetzten Antikörper. Insgesamt konnte in 33/55 (60 %)
Tumoren eine EGFR-Expression mit dem Antikörper von Dako nachgewiesen
werden, dagegen nur in 16/55 (30 %) Fällen mit dem Antikörper von Zymed. Im
Detail wurde eine Überexpression (Score 2+ oder 3+) von EGFR in 23 (57,5 %)
Ependymomen WHO-Grad II und 10 (66,7 %) Ependymomen WHO-Grad III mit dem
Antikörper von Dako nachgewiesen. Mit dem Antikörper von Zymed war EGFR
nachweisbar in 9 (23,1 %) Ependymomen WHO-Grad II und 7 (46,7 %)
Ependymomen WHO-Grad III. Hinsichtlich der Tumorlokalisation konnte eine
Überexpression von EGFR in 4/11 (36,4 %) intrakraniellen und 19/29 (65,5 %)
intramedullären WHO-Grad II sowie in 8/9 (88,9 %) intrakraniellen und 2/6 (33,3 %)
intramedullären WHO-Grad III Ependymomen mit dem Antikörper von Dako
nachgewiesen werden. Mit dem Antikörper von Zymed zeigten 2/11 (18,2 %)
zerebrale und 7/29 (24,1 %) spinale WHO-Grad II Ependymome sowie 5/9 (55,6 %)
zerebrale und 2/6 (33,3 %) spinale WHO-Grad III Ependymome eine Überexpression
von EGFR.
Die unterschiedlichen Stufen der EGFR-Expression mit Antikörpern von Dako und
Zymed zeigt Abbildung 1.
4.4 EGFR-Genstatus-Analyse
FISH konnte erfolgreich durchgeführt werden in 54 Fällen. In 3 (5,5 %) Fällen konnte
eine EGFR-Amplifikation nachgewiesen werden, davon war 1 (2,5 %) Ependymom
WHO-Grad II und 2 (13,3 %) Ependymome WHO-Grad III. (Tabelle 3) Dabei
handelte es sich um zwei spinale und einen zerebralen Tumor. In einem WHO-Grad
III Ependymom handelte es sich um eine starke Amplifikation mit mehr als 20 EGFR-
Gensignalen pro Zellkern. Ein Zugewinn vom EGFR-Gen wurde beobachtet in 7
(17,5 %) WHO-Grad II und 2 (13,3 %) WHO-Grad III Ependymomen. (Tabelle 3) Eine
Chromosom 7-Polysomie, das heisst das Vorhandensein von mehr als 3 Signalen für
EGFR und CEP 7 pro Zellkern, konnte in 25 (62,5 %) WHO-Grad II und 7 (46,7 %)
WHO-Grad III Ependymomen nachgewiesen werden. (Tabelle 3)
17
Abbildung 1. Immunohistochemische Färbung und FISH zum EGFR-Nachweis in
Ependymomen. A Repräsentative Fälle von Ependymomen mit unterschiedlichen
EGFR-Scores (0 bis 3+) unter Verwendung der Antikörper von Dako und Zymed.
Maßstabsbalken entspricht 50 µm. B Repräsentative Fälle mit normalem und
aplifiziertem EGFR-Gen, dabei entspricht rotes Signal dem EGFR-Gen und grünes
dem Centromer von Chromosom 7.
18
Tabelle 3. Ergebnisse der Immunohistochemie und FISH. (Zeichenerklärung: n.a. : nicht analysiert; ex20: Exon 20; wt: Wildtyp)
EGFR IHC SCORE FALL NR.
WHO GRAD
TUMOR LOKALISATION Zymed Dako
EGFR FISH EGFR Exon 18-
21
EGFRvIII
1 II intrakraniell 0 0 3 n.a. n.a. 2 II spinal 0 0 3 n.a. n.a. 3 II intrakraniell 0 2+ Zugewinn n.a. n.a. 4 II spinal 0 0 3 n.a. n.a. 5 II spinal 2+ 2+ Zugewinn n.a. n.a. 6 II spinal 1+ 3+ 4 – 5 silent ex20 n.a. 7 II spinal 1+ 2+ 3 – 5 n.a. n.a. 8 II spinal 1+ 2+ 4 n.a. n.a. 9 II spinal 1+ 3+ 3 wt n.a. 10 II intrakraniell 1+ 1+ 2 n.a. n.a. 11 II spinal 0 1+ Zugewinn n.a. n.a. 12 II intrakraniell 3+ 0 2 n.a. n.a. 13 II spinal 0 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 14 II spinal 0 2+ 3 n.a. n.a. 15 II intrakraniell 0 0 2 n.a. n.a. 16 II spinal 0 2+ Zugewinn n.a. n.a. 17 II intrakraniell 1+ 3+ 3 silent ex20 n.a. 18 II spinal 0 1+ 4 – 5 n.a. n.a. 19 II spinal 2+ 3+ 2 wt n.a. 20 II spinal 1+ 3+ 3 – 4 n.a. n.a. 21 II spinal 1+ 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 22 II spinal 3+ 3+ Zugewinn silent ex20 n.a. 23 II spinal 0 2+ 3 n.a. n.a. 24 II spinal 0 0 3 n.a. n.a. 25 II intrakraniell 0 2+ 3 n.a. n.a. 26 II spinal n.a. 0 n.a. n.a. n.a. 27 II intrakraniell 1+ 1+ 2 n.a. n.a. 28 II spinal 2+ 3+ Amplifikation silent ex20 wt 29 II intrakraniell 0 0 2 n.a. n.a. 30 II spinal 0 0 Zugewinn n.a. n.a. 31 II spinal 1+ 2+ 3 n.a. n.a. 32 II spinal 0 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 33 II spinal 0 0 Zugewinn n.a. wt 34 II spinal 3+ 3+ 5 n.a. wt 35 II spinal 1+ 1+ 3 – 4 n.a. n.a. 36 II spinal 3+ 3+ 3 – 4 n.a. n.a. 37 II spinal 1+ 1+ 3 n.a. wt 38 II intrakraniell 0 2+ 3 n.a. n.a. 39 II intrakraniell 3+ 1+ 3 n.a. n.a. 40 II spinal 3+ 3+ 4 wt n.a. 41 III spinal 1+ 0 Zugewinn n.a. n.a. 42 III intrakraniell 1+ 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 43 III spinal 2+ 2+ 3 n.a. n.a. 44 III spinal 0 1+ Amplifikation silent ex20 wt 45 III intrakraniell 1+ 3+ 3 n.a. n.a. 46 III spinal 1+ 1+ 2 n.a. n.a. 47 III spinal 3+ 3+ 3 – 4 silent ex20 n.a. 48 III intrakraniell 3+ 3+ 3 silent ex20 n.a. 49 III intrakraniell 0 1+ 2 n.a. n.a. 50 III intrakraniell 3+ 2+ Zugewinn n.a. n.a. 51 III intrakraniell 3+ 3+ Amplifikation S768I
wt 52 III intrakraniell 1+ 2+ 2 n.a. n.a. 53 III intrakraniell 3+ 3+ 3 – 4 silent ex20 n.a. 54 III spinal 0 0 2 n.a. wt 55 III intrakraniell 3+ 3+ 3 - 4 n.a. wt
19
4.5 Vergleich von immunhistochemischer EGFR-Expression und
FISH Von den drei Fällen mit amplifiziertem EGFR-Gen zeigten zwei Ependymome eine
starke EGFR-Expression unter beiden Antikörpern. Unter den 32 Fällen mit
Chromosom-7-Polysomie ohne Amplifikation zeigten 23 (71,9 %) Ependymome eine
Überexpression von EGFR mit dem Antikörper von Dako und 7 (21,9 %) mit dem
Antikörper von Zymed. Innerhalb der 10 Ependymome, die weder eine Amplifikation
noch eine Polysomie aufwiesen, waren 2 (20 %) positiv für EGFR mit beiden
Antikörpern.
Die Korrelation zwischen der immunhistochemisch ermittelten EGFR-Expression und
dem EGFR-Genstatus ermittelt mit FISH war statistisch nicht signifikant. (Tabelle 4)
Es gab ebenfalls keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der EGFR-
Expression bzw. dem EGFR-Genstatus und dem WHO-Grad. (Tabelle 4)
Tabelle 4. Korrelation der EGFR-Expression mit dem WHO Grad der Ependymome.
EGFR IHC Zymed Dako
WHO Grad EGFR FISH Anzahl n
Negativ (n)
Positiv (n)
Negativ (n)
Positiv (n)
II normal 31 25 6 13 18 Zugewinn 7 5 2 3 4 Amplifiziert 1 0 1 0 1 III normal 11 6 5 3 8 Zugewinn 2 1 1 1 1 Amplifiziert 2 1 1 1 1 χ2, p= 0.293 0.144 0.915 0.18 0.733
20
4.6 Nachweis einer EGFR-Mutation
Wir sequenzierten die Exons 18-21 des EGFR-Gens in denjenigen Tumoren, die
eine Amplifikation oder eine eindeutige Überexpression von EGFR aufwiesen (n=13).
Davon fand sich bei einem Tumor mit stark amplifiziertem EGFR und kräftiger EGFR-
Expression mit Antikörpern von Dako und Zymed eine Punktmutation in Exon 20
(Codon 768, AGC→ATC, Ser→Ile). (Paez et al. 2004) Bei dem Patienten handelte es
sich um eine zum Diagnosezeitpunkt 61-jährige Frau mit einem supratentoriellen,
anaplastischen (WHO-Grad III) Ependymom. (Abbildung 2)
Ferner wurde im Exon 20 eine silent mutation (Codon 787, CAG→CAA, Gln→Gln) in
8 (61,5 %) Fällen beobachtet.
Unter 8 repräsentativ ausgewählten Ependymomen, darunter auch diejenigen mit
amplifiziertem EGFR-Gen, wurde nach der Mutation EGFRvIII gefahndet, die in
keinem dieser Ependymome nachgewiesen werden konnte.
Abbildung 2. Morphologie des anaplastischen Ependymoms mit EGFR S768I
Mutation. Zu sehen sind repräsentative Ausschnitte mit A HE; B GFAP; C Mib-1; D EGFR-Expression mit dem Antikörper von Dako und E Zymed; F FISH. Die
Tumorzellen sind hoch polymorph, jedoch sind die architektonischen und
immunhistologischen Charakteristika eines Ependymoms erhalten. EGFR ist stark
exprimiert (D, E) und amplifiziert (F). Maßstabsbalken beträgt 50 µm.
21
5 DISKUSSION
Die Liganden-gesteuerte Aktivierung von EGFR, eines transmembranen
Tyrosinkinase-Rezeptors, setzt Signalkaskaden in Gang, welche das Zellwachstum
stimulieren und die Zellmotilität steigern. (Kari et al. 2003) EGFR ist überexprimiert,
mutiert oder amplifiziert in einer Vielzahl von Neoplasien. (Ciardiello et al. 2008) Für
Kolon- und Lungenkarzinome ist der EGFR-Status ein guter Parameter für die
Prognose und für das Ansprechen einer gezielten anti-EGFR-Therapie. (Janku et al.
2010) Für eine Subgruppe von Gliomen, nämlich für gewisse Glioblastome, kommt
EGFR eine wichtige Rolle für die Vorhersage des klinischen Verlaufs zu, doch haben
klinische Studien zur Untersuchung einer EGFR-gezielten Therapie enttäuschende
Ergebnisse zutage gebracht. (Huang et al. 2009, Felsberg et al. 2009, Thaker et al.
2009)
Der EGFR-Signalweg spielt eine Rolle bei Ependymomen und EGFR-
Überexpression wurde als unabhängiger prognostischer Faktor für ihre maligne
Entwicklung identifiziert. (Yi et al. 2009, Mendrzyk et al. 2006) Tatsächlich ist die
EGFR-Überexpression der einzige signifikante Vorhersageparameter für eine
schlechte Prognose bei Patienten mit intrakraniellen WHO-Grad II Ependymomen
und liefert damit wertvolle Information für Risikoeinschätzung und Behandlung.
(Massimino et al. 2009, Senetta et al. 2011)
In der vorliegenden Studie verglichen wir die immunhistochemisch gemessene
Proteinexpression mit dem EGFR-Genstatus. Wir stellten eine EGFR-
Überexpression bei der Mehrzahl der Tumoren fest, dennoch fanden wir nur
gelegentlich eine EGFR-Genamplifikation. Von 33 Ependymomen mit stark
exprimiertem EGFR unter Einsatz des Antikörpers von Dako zeigten 16 eine starke
EGFR-Expression mit dem Antikörper von Zymed und nur 2 eine Amplifikation.
Zusätzlich beobachteten wir eine EGFR-Amplifikation in einem Tumor ohne
markante EGFR-Expression in der Immunhistochemie. Wir konnten nicht den
Nachweis von EGFRvIII in ausgewählten Tumoren erbringen, welches häufig in
Glioblastomen vorzufinden ist. (Jeuken et al. 2009) Unsere Ergebnisse bezüglich der
EGFR-Amplifikation stehen im Einklang mit einer vorangehenden Studie, die einen
Zugewinn von 7p11.2, einer EGFR-enthaltenden genomischen Region, in einer
Teilmenge von Ependymomen beobachtet hat. (Mendrzyk et al. 2006) Jedoch
stützen sie nicht die Resultate einer Arbeit, die eine Stichprobe von 4 Ependymomen
22
einer CISH unterzog und keine EGFR-Amplifikation festgestellt hat. (Marquez et al.
2004) Die Diskrepanz zwischen EGFR-Genamplifikation und EGFR-Expression in
Ependymomen ist unerwartet, als sowohl balancierte Polysomie wie auch EGFR-
Amplifikation mit der immunhistochemisch ermittelten EGFR-Expression in anderen
Gliomen wie Astrozytomen zu korrelieren scheinen. (Marquez et al. 2004, Libermann
et al. 1985, Schober et al. 1995) Weil der Zusammenhang zwischen der EGFR-
Genamplifikation und EGFR-Expression uneinheitlich in anderen Neoplasien zu sein
scheint, insbesondere bei Plattenepithelkarzinomen, Kopf-Hals-Tumoren und
hepatozellulären Karzinomen als nicht korrelierend, jedoch eine gute Korrelation für
Adenokarzinome der Lunge beschrieben worden ist, könnten zellspezifische
Mechanismen dafür verantwortlich sein. (Buckley et al. 2008, Kearsley et al. 1991, Li
et al. 2008) In Fällen mit immunhistochemisch ermittelt starker EGFR-Expression bei
Abwesenheit von EGFR-Amplifikation oder Zugewinn wären andere ursächliche
Mechanismen wie erhöhtes Ligandenangebot, rezeptoraktivierende Mutationen oder
Heterodimerisation mit anderen transmembranen Tyrosinkinasen wie HER2 denkbar.
(Buckley et al. 2008)
Da wir ein gehäuftes Vorkommen von EGFR-Überexpression und das
Vorhandensein von EGFR-Amplifikation in unserer Stichprobe beobachtet haben,
würde man in EGFR – analog zu Astrozytomen – eine wichtige Rolle in der
Tumorprogression der Ependymome vermuten. Wir vermuten ein vermehrtes
Auftreten von EGFR-Genamplifikationen unter Ependymomen WHO-Grad III
(13,3 %) im Vergleich zu WHO Grad II (2,5 %), jedoch erreichte diese Korrelation
keine statistische Signifikanz. Die Korrelation zwischen immunhistochemisch
nachgewiesener EGFR-Expression und dem WHO-Grad ist schwach und vom
verwendeten Antikörper abhängig. Das deutet darauf hin, dass die Analyse der
EGFR-Genkopien mittels FISH oder die Kombination aus FISH und Immunhistologie
mehr klinisch relevante Ergebnisse einbringen als die Immunhistochemie allein. Die
Diskrepanz zwischen den Antikörpern von Dako und Zymed ist beschrieben worden.
(Buckley et al. 2007) Im Gegensatz zur Studie von Buckley et al., wo mehr positive
Ergebnisse mit dem Antikörper von Zymed ermittelt worden sind, befindet unsere
Datenlage den Antikörper von Dako sensitiver im Vergleich zu Zymed.
Mutationen im EGFR-Gen sind bei Glioblastomen beschrieben worden, die häufigste
unter ihnen ist EGFRvIII. (Fukushima et al. 2006) Bisher wurden keine EGFR-
Mutationen bei Ependymomen beobachtet. Wir analysierten sowohl die
23
Tyrosinkinase-Domäne des EGFR als auch das Vorhandensein von EGFRvIII und
berichten zum ersten Mal von einer Missense-Mutation in Exon 20 (Codon 768,
AGC→ATC, Ser→Ile) des EGFR-Gens in einem anaplastischen Ependymom.
Fukushima et al. konnten die identische Mutation in einem primären Glioblastom
nachweisen. Im Gegensatz zu unserem Patienten, bei dem zusätzlich eine EGFR-
Amplifikation vorlag, wurde dies nicht von Fukushima et al. untersucht. (Fukushima
et al. 2006) Es wäre interessant herauszufinden, ob die Genamplifikation der
Mutation vorausgeht, wie es im Falle von EGFRvIII bei Glioblastomen angenommen
wird. (Frederick et al. 2000)
Alle In-situ-Analysen führten wir auf einem TMA aus. Unser Gewebearray bestand
aus zwei repräsentativen Gewebestanzen von jedem Tumor. Wie bereits publiziert,
fanden wir eine gute Konkordanz zwischen großen histologischen Schnitten und dem
TMA, wie aus der deutlichen Diskriminierung der Wachstumsfraktion zwischen WHO-
Grad II und WHO-Grad III Ependymomen auf großen Gewebeschnitten verglichen
mit den Gewebestanzen hervorging. (Simon et al. 2003)
Abschliessend konnten wir die Wichtigkeit des EGF-Rezeptors in Ependymomen
untermauern, indem wir gezeigt haben, dass 1) EGFR in der Mehrzahl der
Ependymome überexprimiert wird, 2) eine EGFR-Genamplifikation bei
Ependymomen vorliegen kann, und 3) mutiertes EGFR einer Entstehung von
Ependymomen zugrunde liegen kann. Wir fanden keine Korrelation zwischen
amplifiziertem EGFR-Gen und exprimiertem EGFR. Weitere Untersuchungen sind
nötig, um klinische und molekulare Einzelheiten in der Rolle von EGFR und
Pathophysiologie der Ependymome aufzuklären.
24
6 ZUSAMMENFASSUNG
Die Pathogenese von Ependymomen und prognostische Faktoren sind unzureichend
verstanden. Es konnte gezeigt werden, dass dem EGF-Rezeptor eine wichtige Rolle
in der Entwicklung von Gliomen zukommt.
In vorliegender Studie untersuchten wir die immunhistologische Expression und
Genstatus mittels FISH von EGFR, die Wachstumsfraktion entsprechend Mib-1 und
die Expression von p53 in 40 WHO-Grad II und 15 WHO-Grad III Ependymomen.
Alle Tumorproben wurden in ein TMA-Format überführt, das EGFR-Gen wurde
sequenziert und die Ergebnisse miteinander verglichen.
Wir fanden ein immunhistochemisch überexprimiertes EGFR in 30-60 % der
Tumoren, in Abhängigkeit vom verwendeten Antikörper. Das EGFR-Gen war
amplifiziert in 5,5 % der Ependymome. Ausserdem fanden wir eine Missense-
Mutation in Exon 20 (S768I) in der Tyrosinkinase-Domäne des EGFR-Gens. Die
EGFR-Expression korrelierte nicht mit der Amplifikation.
Daraus folgern wir, dass die immunhistochemisch ermittelte EGFR-Expression häufig
bei Ependymomen auftritt. Es gibt einen schwachen Zusammenhang zwischen
amplifiziertem EGFR und seiner Expression. EGFR-Mutationen können in
ausgewählten Ependymomen vorhanden sein.
25
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
CA California
cDNA Copy-DNA
CEP centromere enumeration probe
CISH chromogenic in-situ hybridization
DAB 3.3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid
DAPI 4′,6-Diamino-2-Phenylindol
DNA Desoxyribonukleinsäure
EGFR epidermal growth factor receptor
EMA epitheliales Membranantigen
FISH Floureszenz-in-situ-Hybridisierung
Glu Glutaminsäure
HE Hämatoxylin-Eosin
HER2 human epidermal growth factor receptor
HRP horseredish peroxidase
Ig Immunglobulin
IL Illinois
Ile Isoleucin
kb Kilobasen
LI labeling index
MAP-Kinase mitogen-aktivierte Proteinkinase
Mb Megabasen
mM millimolar
mRNA Messenger-RNA
MYC avian myelocytomatosis virus
NF2 Neurofibromatose Typ 2
PCR plymerase chain reaction
PKD proteinase K digest
pH pondus hydrogenii (negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration)
Raf rat fibrosarcoma
Ras rat sarcoma
RNA Ribonukleinsäure
26
RT-PCR reverse transcriptase PCR
Ser Serin
st Standardabweichung
TBS Tris-buffered saline
TMA tissue microarray
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
WHO world health organization
27
8 LITERATURVERZEICHNIS
Böcker W, Kleihues P, Höfler HK, Lax S, Poremba C, Moll R (2004) Allgemeine
Tumorpathologie. In: Böcker, Denk, Heintz (Hrsg.) Pathologie. Urban & Fischer,
München Jena. 3. Auflage 2004 S. 190.
Buckley AF, Kakar S. Comparison of the Dako EGFR pharmDx kit and Zymed EGFR
antibody for assessment of EGFR status in colorectal adenocarcinoma. Appl
Immunhistochem Mol Morphol. 2007; 15:305-9.
Buckley AF, Burgart LJ, Sahai V, Kakar S. Epidermal growth factor receptor
expression and gene copy number in conventional hepatocellular carcinoma. Am J
Clin Pathol. 2008; 129:245-51.
Burger P, Scheithauer B, Vogel S (2002) Tumors of Ependyma and Related Cells. In:
Surgical Pathology of the Nervous System and Its Coverings. Churchill Livingstone,
Elsevier, Fourth Edition pp 241-250.
Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med. 2008;
358:1160-74.
Dancau AM, Simon R, Mirlacher M, Sauter G. Tissue microarrays. Methods Mol Biol.
2010; 576:49-60.
Felsberg J, Rapp M, Loeser S, Fimmers R, Stummer W, Goeppert M, et al.
Prognostic significance of molecular markers and extent of resection in primary
glioblastoma patients. Clin Cancer Res. 2009; 15:6683-93.
Francoul M, Etienne-Grimaldi MC, Formento JL, Benchimol D, Bourgeon A, Chazal
M, et al. EGFR in colorectal cancer: more than a simple receptor. Ann Oncol. 2006;
17: 962-7.
Frederick L, Wang XY, Eley G, James CD. Diversity and frequency of epidermal
growth factor receptor mutations in human glioblastomas. Cancer Res. 2000; 60:
1383-7.
Fukushima T, Favereaux A, Huang H, Shimizu T, Yonekawa Y, Nakazato Y, et al.
Genetic alterations in primary glioblastomas in Japan. J Neuropathol Exp Neurol.
2006; 65: 12-8.
Girard N, Shen R, Guo T, Zakowski MF, Heguy A, Riely GJ, et al. Comprehensive
genomic analysis reveals clinically relevant molecular distinctions between thymic
carcinomas and thymomas. Clin Cancer Res. 2009; 15: 6790-9.
28
Green RM, Coughesy TF, Stupp R, DeAngelis LM, Woyshner EA, Ney DE, et al.
Bevacizumab for recurrent ependymoma. Neurology. 2009; 73: 1677-80.
Halatsch ME, Schmidt U, Behnke-Mursch J, Unterberg A, Wirtz CR. Epidermal
growth factor receptor inhibition for the treatment of glioblastoma multiforme and
other malignant brain tumors. Cancer Treat Rev. 2006; 32: 74-89.
Huang PH, Xu AM, White FM. Oncogenetic EGFR signaling networks in glioma. Sci
Signal. 2009; 2: re6.
Janku F, Stewart DJ, Kurzrock R. Targeted therapy in non-small-cell lung cancer—is
it becoming a reality? Nat Rev Clin Oncol. 2010; 7: 401-14.
Jeuken J, Sijben A, Alenda C, Rijntjes J, Dekkers M, Boots-Sprenger S, et al. Robust
detection of EGFR copy number changes and EGFR variant III: technical aspects
and relevance for glioma diagnostics. Brain Pathol. 2009; 19: 661-71.
Kari C, Chan TO, Rocha de Quadros M, Rodeck U. Targeting the epidermal growth
factor receptor in cancer: apoptosis takes center stage. Cancer Res. 2003; 63: 1-5.
Kearsley JH Leonard JH, Walsh MD, Wright GR. A comparison of epidermal growth
factor receptor (EGFR) and c-erbB-2 oncogene expression in head and neck
squamous cell carcinomas. Pathology. 1991; 23: 189-94.
Kellner A, Matschke J, Bernreuther C, Moch H, Ferrer I, Glatzel M. Autoantibodies
against beta-amyloid are common in Alzheimer’s disease and help control plaque
burden. Ann Neurol. 2009; 65: 24-31.
Kleihues P, Kiessling M, Wiestler OD (2004) Tumoren des Nervensystems. In:
Böcker, Denk, Heintz (Hrsg.) Pathologie. Urban & Fischer, München Jena. 3. Auflage
2004 S 321.
Korshunov A, Golanov A, Timirgaz V. Immunhistochemical markers for intracranial
ependymoma recurrence. An analysis of 88 cases. J Neurol Sci. 2000; 177: 72-82.
Kramer DL, Parmiter AH, Rorke LB, Sutton LN, Biegel JA (1998) Molecular
cytogenetic studies of pediatric ependymomas. J Neurooncol 37:25-33.
Ladanyi M, Pao W. Lung adenocarcinoma: guiding EGFR-targeted therapy and
beyond. Mod Pathol. 2008; 21 Suppl 2: S16-22.
Li AR, Chitale D, Riely GJ, Pao W, Miller VA, Zakowski MF, et al. EGFR mutations in
lung adenocarcinomas: clinical testing experience and relationship to EGFR gene
copy number and immunhistochemical expression. J Mol Diagn. 2008; 10: 242-8.
29
Libermann TA, Nusbaum HR, Razon N, Kris R, Lax I, Soreq H, et al. Amplification,
enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary
human brain tumours of glial origin. Nature. 1985; 313: 144-7.
Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, et al. The
2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta
Neuropathol. 2007; 114: 97-109.
Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth
factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to
gefitinib.NEnglJMed 2004;350:2129-39.
Marquez A, Wu R, Zhao J, Tao J, Shi Z. Evaluation of epidermal growth factor
receptor (EGFR) by chromogenic in situ hybridization (CISH) and
immunhistochemistry (IHC) in archival gliomas using bright-field microscopy. Diagn
Mol Pathol. 2004; 13: 1-8.
Massimino M, Buttarelli FR, Antonelli M, Gandola L, Modena P, Giangaspero F.
Intracranial ependymoma: factors affecting outcome. Future Oncol. 2009; 5: 207-16.
Mendrzyk F, Korshunov A, Benner A, Toedt G, Pfister S, Radlwimmer B, et al.
Identification of gains on 1q and epidermal growth factor receptor overexpression as
independent prognostic markers in intracranial ependymoma. Clin Cancer Res. 2006;
12: 2070-9.
Paez JG, Janne PA, Lee JC, Tracy S, Greulich H, Gabriel S, et al. EGFR mutations
in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 2004;
304: 1497-500.
Rodriguez D, Cheung MC, Housri N, Quinones-Hinojosa A, Camphausen K, Koniaris
LG. Outcomes of malignant CNS ependymomas: an examination of 2408 cases
through the Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) database (1973-
2005). J Surg Res 2009; 156: 340-51.
Sauter G, Lee J, Bartlett JM, Slamon DJ, Press MF. Guidelines for human epidermal
growth factor receptor 2 testing: biologic and methodologic considerations. J Clin
Oncol. 2009; 27: 1323-33.
Scheil S, Bruderlein S, Eicker M, Herms J, Herold-Mende C, Steiner HH, Barth TF,
Moller P (2001) Low frequency of chromosomal imbalances in anaplastic
ependymomas as detected by comparative genomic hybridization. Brain Pathol
11:133-143.
30
Schlomm T, Kirstein P, Iwers L, Daniel B, Steuber T, Walz J, et al. Clinical
significance of epidermal growth factor receptor protein overexpression and gene
copy number gains in prostate cancer. Clin Cancer Res. 2007; 13: 6579-84.
Schober R, Bilzer T, Waha A, Reifenberger G, Wechsler W, von Deimling A, et al.
The epidermal growth factor receptor in glioblastoma: genomic amplification, protein
expression, and patient survival data in a therapeutic trial. Clin Neuropathol. 1995;
14: 169-74.
Senetta R, Miracco C, Lanzafame S, Chiusa L, Caltabiano R, Galia A, Stella G,
Cassoni P. Epidermal growth factor receptor and caveolin-1 coexpression identifies
adult supratentorial ependymomas with rapid unfavorable outcomes. Neuro Oncol.
2011; 13:176-83.
Simon R, Sauter G. Tissue microarray (TMA) applications: implications for molecular
medicine. Expert Rev Mol Med. 2003; 5: 1-12.
Sjostrom S, Andersson U, Liu Y, Brannstrom T, Broholm H, Johansen C, et al.
Genetic variations in EGF and EGFR and glioblastoma outcome. Neuro Oncol. 2010;
12: 815-21.
Thaker NG, Pollack IF. Molecularly targeted therapies for malignant glioma: rationale
for combinatorial strategies. Expert Rev Neurother. 2009; 9: 1815-36.
Timmermann B, Kortmann RD, Kuhl J, Meisner C, Slavc I, Pietsch T, et al. Combined
postoperative irradiation and chemotherapy for anaplastic ependymomas in
childhood: results of the German prospective trials HIT 88/89 and HIT 91. Int J Radiat
Oncol Biol Phys. 2000; 46: 287-95.
Yi W, Haapasalo H, Holmlund C, Jarvela S, Raheem O, Bergenheim AT, et al.
Expression of leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains (LRIG) proteins
in human ependymoma relates to tumor location, WHO grade, and patient age. Clin
Neuropathol 2009; 28: 21-7.
Yoshimoto K, Dang J, Zhu s, Nathanson D, Huang T, Dumont R, et al. Development
of a real-time RT-PCR assay for detecting EGFRvIII in glioblastoma samples. Clin
Cancer Res. 2008; 14: 488-93.
Zatloukal K, Roth J, Denk H (2004) Zell- und Gewebereaktionen. In: Böcker, Denk,
Heintz (Hrsg.) Pathologie. Urban & Fischer, München Jena. 3. Auflage 2004, S. 50.
31
9 DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die diese Arbeit
ermöglicht und zu ihrem Gelingen maßgeblich beigetragen haben.
Mein ganz besonderer Dank gilt dem Direktor des Instituts für Neuropathologie und
meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. Markus Glatzel, der mir die Gelegenheit
zu dieser Arbeit erst gegeben hat. Ich danke ihm insbesondere für die sehr gute
fachkundige und persönliche Betreuung, mit der ich stets sehr zufrieden war. Er hat
den Schaffungsprozess mit hilfreichen Ratschlägen, Anregungen und viel
Enthusiasmus begleitet.
Weiterhin danke ich den Herren Dr. med. Christian Bernreuther und Dr. med. Jakob
Matschke für die hilfreiche Unterstützung beim Mikroskopieren und bei der
Literaturrecherche. Ich bedanke mich für die kompetente Unterstützung bei
komplizierten Fragestellungen.
Martin Haberkorn und seinem Laborteam der Neuropathologie danke ich für die
technische Mithilfe bei der Anfertigung von histologischen Gewebeschnitten und
immunhistochemischen Färbungen. Herrn S. Eghtessadi danke ich für die Hilfe bei
der FISH und Frau A. Blaszczyk-Wewer für die Unterstützung bei der
Sequenzierung.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich während des Studiums stets nicht
nur finanziell, sondern auch emotional, unterstützt haben.
32
11 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG
Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe
verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt
und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen
einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des
benutzten Werkes kenntlich gemacht habe.
Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an
einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um
Zulassung zur Promotion beworben habe.
Unterschrift: ......................................................................