Aus dem
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Severine Tobias (geb. Gerber) aus Stadthagen
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 25.November 2004
„Mit dem Doping ist es genauso wie mit der Liebe.
Jeder weiß, was es ist, aber niemand vermag es klar zu umschreiben.“
Anonym
Meiner Mutter & Christoph
in Liebe und Dankbarkeit
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ........................................................................................................... 1
2 Literaturübersicht .............................................................................................. 3
2.1 Doping........................................................................................................... 3
2.1.1 Definition und Geschichtliches .............................................................. 3
2.1.2 Notwendigkeit der Dopingbestimmungen.............................................. 4
2.1.3 Doping im Pferdesport........................................................................... 5
2.1.3.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände....................................... 7
2.1.3.2 Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. (Stand 2004) ...................................................... 7
2.1.3.3 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (Stand Januar 2002) ......................................................... 8
2.1.3.4 Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –Rennen e. V. (HVT) vom 01. Februar 2003........................... 8
2.1.4 Dopingformen........................................................................................ 9
2.1.4.1 Positives Doping............................................................................. 9
2.1.4.2 Negatives Doping oder Doping auf Niederlage ............................ 11
2.1.4.3 Unabsichtliches Doping ................................................................ 11
2.1.4.4 Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises................ 12
2.1.5 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in Deutschland ...................... 13
2.1.6 Beurteilung von Analyseergebnissen .................................................. 13
2.1.6.1 Null-Lösung und Grenzwerte........................................................ 13
2.2 Physiologie und Pharmakologie von α2-Rezeptoren ................................... 16
2.2.1 Rezeptorklassifizierung ....................................................................... 17
2.2.2 α2-Agonisten und Antagonisten beim Pferd......................................... 17
2.2.3 Wirkungsmechanismus ....................................................................... 18
2.2.4 α2-Antagonisten................................................................................... 19
2.3 Detomidin .................................................................................................... 20
2.3.1 Chemie................................................................................................ 20
2.3.2 Pharmakokinetik.................................................................................. 21
2.3.3 Pharmakodynamische Wirkung........................................................... 22
2.3.4 Applikationsformen.............................................................................. 27
2.3.5 Klinische Anwendung von Detomidin .................................................. 27
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.6 Einsatz von Detomidin im Pferdesport zur Beeinflussung der Leistung............................................................................................... 27
2.4 Analytik........................................................................................................ 28
2.5 Analytischer Nachweis von Detomidin ........................................................ 29
2.5.1 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Tandem-Massenspektrometer (MS/MS)............................................................ 29
2.6 Pharmakokinetik.......................................................................................... 32
2.6.1 Allgemeine Pharmakokinetik ............................................................... 32
2.6.2 Eliminationskinetische Parameter ....................................................... 36
3 Material und Methoden.................................................................................... 38
3.1 Versuchsplanung ........................................................................................ 38
3.2 Versuchsdurchführung ................................................................................ 38
3.2.1 Versuchstiere ...................................................................................... 38
3.2.2 Konditionierungsphase und Vorbereitung des Versuches................... 40
3.2.2.1 Substanz und Dosierung .............................................................. 42
3.2.3 Applikation des Medikamentes (Vor- und Hauptversuch).................... 42
3.2.4 Erhebung der Messdaten .................................................................... 43
3.2.4.1 Abnahme, Verarbeitung und Aufbewahrung der Blutproben ........ 43
3.2.4.2 Herzfrequenz................................................................................ 44
3.2.4.3 Atemfrequenz ............................................................................... 45
3.2.4.4 Körpertemperatur ......................................................................... 45
3.2.4.5 Feststellung des Sedationsgrades ............................................... 45
3.2.4.6 Überprüfung der Analgesie........................................................... 47
3.2.4.7 Andere Beobachtungen................................................................ 51
3.2.4.8 Gewinnung, Messung und Aufbewahrung von Urinproben .......... 51
3.2.4.9 Transport der Plasma- und Urinproben ........................................ 52
3.3 Analytik........................................................................................................ 52
3.3.1 Methodenentwicklung Plasma und Urin .............................................. 52
3.3.1.1 Herstellung der Standardlösungen im Plasma ............................. 53
3.3.1.2 Herstellung der Standardlösungen im Urin................................... 54
3.3.1.3 Variation der Messmethode.......................................................... 55
3.3.1.4 Variation der Aufarbeitung und Extraktionsmethode .................... 56
3.3.2 Validierung der Methode in Plasma und Urin ...................................... 59
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2.1 Selektivität und Spezifität ............................................................. 59
3.3.2.2 Überprüfung auf Linearität............................................................ 60
3.3.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection = LOD) ... 61
3.3.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification = LOQ oder Sensitivität)................................................................................... 62
3.3.2.5 Richtigkeit (Accuracy)................................................................... 62
3.3.2.6 Präzision....................................................................................... 63
3.3.2.7 Stabilität........................................................................................ 64
3.3.2.8 Wiederfindung (Recovery)............................................................ 65
3.3.3 Chromatographische Trennung und Detektion von Detomidin und seinen Metaboliten .............................................................................. 66
3.3.3.1 Gerät und Gerätebedingungen..................................................... 66
3.3.3.2 Reagenzien und Lösungsmittel .................................................... 68
3.3.4 Messung der Proben aus dem Hauptversuch ..................................... 69
3.3.4.1 Erstellung der Kalibrationskurven im Plasma des Hauptversuches ........................................................................... 69
3.3.4.2 Erstellung der Kalibrationskurven im Urin..................................... 71
3.3.4.3 Aufarbeitung der Plasmaproben................................................... 73
3.3.4.4 Aufarbeitung der Urinproben ohne und mit Hydrolyse.................. 74
3.4 Pharmakokinetische Auswertung (Methode und Software)......................... 80
3.5 Statistische Auswertung.............................................................................. 81
4 Ergebnisse ....................................................................................................... 82
4.1 Massenspektren und Strukturformeln der zu analysierenden Substanzen und der internen Standards......................................................................... 82
4.1.1 Detomidin ............................................................................................ 82
4.1.2 3-Hydroxydetomidin ............................................................................ 83
4.1.3 Medetomidin........................................................................................ 83
4.1.4 Carboxydetomidin ............................................................................... 84
4.1.5 Imidazolylbenzoesäure........................................................................ 85
4.2 Ergebnisse der Validierung ......................................................................... 85
4.2.1 Selektivität und Spezifität .................................................................... 85
4.2.2 Überprüfung auf Linearität................................................................... 87
4.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD) ............ 90
4.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) ............................. 90
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.5 Richtigkeit (Accuracy).......................................................................... 91
4.2.6 Präzision ............................................................................................. 92
4.2.7 Stabilität .............................................................................................. 94
4.2.8 Wiederfindung (Recovery)................................................................... 95
4.3 Ergebnisse des Hauptversuchs................................................................... 96
4.3.1 Konzentration von Detomidin im Plasma............................................. 96
4.3.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma ...................................... 100
4.3.3 Detomidin im Urin.............................................................................. 102
4.3.4 3-Hydroxydetomidin im Urin .............................................................. 102
4.3.4.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergleichend ................... 104
4.3.5 Carboxydetomidin im Urin ................................................................. 105
4.3.5.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergeichend .................... 107
4.4 Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urin-konzentrationen.............. 108
4.5 Berechnung von Ausscheidungszeiten ..................................................... 110
4.6 Pharmakodynamik von Detomidin............................................................. 113
4.6.1 Herzfrequenz..................................................................................... 113
4.6.2 Atemfrequenz.................................................................................... 115
4.6.3 Körperinnentemperatur ..................................................................... 116
4.6.4 Grad der Sedation ............................................................................. 117
4.6.4.1 Ptosis.......................................................................................... 118
4.6.4.2 Akustischer Reiz......................................................................... 120
4.6.4.3 Visueller Reiz ............................................................................. 121
4.6.4.4 Individueller Sedationsgrad der einzelnen Pferde ...................... 122
4.6.5 Grad der Reaktion auf einen definierten Stromreiz ........................... 123
4.6.6 Andere Beobachtungen..................................................................... 125
5 Diskussion ..................................................................................................... 126
5.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Detomidin und seinen Metaboliten in Plasma und Urin...... 126
5.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma .............................................. 129
5.3 Pharmakokinetik von Detomidin im Urin.................................................... 131
5.4 Effektive und irrelevante Plasmakonzentration, irrelevante Urinkonzentration nach TOUTAIN und LASSOURD (2002), Ausscheidungszeit .................................................................................... 134
INHALTSVERZEICHNIS
5.5 Vergleich der pharmakodynamischen Daten mit den Ergebnissen der pharmakokinetischen Berechnungen ........................................................ 137
5.6 Bewertung der Ergebnisse ........................................................................ 142
6 Zusammenfassung........................................................................................ 144
7 Summary ........................................................................................................ 146
8 Literaturverzeichnis....................................................................................... 148
9 Anhang ........................................................................................................... 163
Danksagung .......................................................................................................... 173
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation AUC Area under the curve b1 Geschwindigkeitskonstante der Elimination C Konzentration Cl Clearance Cmax(gem) maximale gemessene Plasmakonzentration CPlasmaØ durchschnittliche Plasmakonzentration CUrinØ durchschnittliche Urinkonzentration D Dosierung DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee EPC effektive Plasmakonzentration FEI Fédération Équestre International FN Fédération National, Deutsche Reiterliche Vereinigung e.
V., Warendorf g Gramm GC Gaschromatographie h Stunde HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HQC High Quality Control Standard HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V. HWZ Halbwertszeit i. m. intramuskulär IPC irrelevante Plasmakonzentration ISTD interner Standard IUC irrelevante Urinkonzentration i.v. intravenös kg Kilogramm KM Körpermasse l Liter ln natürlicher Logarithmus LOD Limit of detection LOQ Limit of quantification
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
LPO Leistungsprüfungsordnung der FN LQC Lower Quality Control Standard µg Mikrogramm µl Mikroliter m Meter max. maximal mg Milligramm min Minute ml Milliliter mm Millimeter mmol Millimol MM Molekülmasse MQC Midrange Quality Control Standard MRT Mean Residence Time, mittlere Verweildauer MS Massenspektrometrie m/z Quotient aus Masse und Ladung ng Nanogramm p. a. post applikationem PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch QC Qualitätskontrolle R2 Regressionskoeffizient RE relativer Fehler, relative Abweichung RO Rennordnung des DIR Rss Urin/Plasmaverhältnis im steady state S Standardabweichung SIM single ion monitoring t Zeit t50(b1) Halbwertszeit für die Eliminationsphase tA(IPC) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der IPC tA(LOD) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOD tA(LOQ) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOQ Tab. Tabelle tmax(gem) Zeitpunkt der max. gemessenen Plasmakonzentration Vc Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment Vss Verteilungsvolumen im steady state
EINLEITUNG 1
1 EINLEITUNG
Detomidin ist ein potenter α2-Agonist mit starken sedativen und analgetischen
Eigenschaften (JÖCHLE u. HAMM, 1986). Es hat weite klinische Anwendung in
Europa und den USA gefunden. Durch die komplikationslose therapeutische
Anwendbarkeit steht Detomidin im Verdacht, nicht nur nach tierärztlicher Indikation,
sondern auch illegal vor Wettkämpfen verabreicht zu werden. Dabei ist besonders an
nervöse und ängstliche Tiere sowie den Einsatz beim Doping auf Niederlage zu
denken (WOOD et al., 1989; SEYMOR et al., 1990B).
Der Einsatz von Detomidin unmittelbar vor einem Wettkampf ist durch die
Bestimmungen der großen deutschen Pferdesportverbände und des
Tierschutzgesetzes verboten. Die Deutsche Reiterliche Vereinigung, das Direktorium
für Vollblutzucht und der Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen verbieten
nahezu jede Anwendung pharmakologisch wirksamer Stoffe in einem Wettkampf,
auch wenn eine therapeutische Indikation besteht. Nur für einige wenige
Substanzen, für die Grenzwerte festgelegt wurden, gelten Ausnahmen. Die
Problematik besteht in der Unterscheidung zwischen der Verabreichung von
Arzneimitteln im Rahmen der tierärztlichen Therapie und einem vorsätzlichen Einsatz
dieser Substanzen im Sinne des Dopings. Auch wenn keine bewusste
Leistungsbeeinflussung vorliegt, ist der Nachweis eines verbotenen Stoffes
dopingrelevant. Aufgrund der fast unüberschaubaren Vielfalt des Arzneimittelmarktes
und wegen des häufig noch lückenhaften Wissens über Pharmakokinetik und
Pharmakodynamik ist es für Tierärzte, die Sportpferde behandeln, häufig schwierig,
alle möglichen Folgewirkungen einer Arzneimittelanwendung im Hinblick auf die
Dopingbestimmungen zu überblicken (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).
Aufgrund dieser Problematik wurde im Rahmen dieser Arbeit das
Ausscheidungsverhalten der Wirkstoffes Detomidin bei der Spezies Pferd untersucht.
Die Studie ist Teil eines europaweiten Vorhabens, an dem insgesamt fünf Länder
(Irland, Frankreich, Italien, Großbritannien, Deutschland) teilnehmen. Neben der
Ermittlung der pharmakokinetischen Daten für Detomidin ist die internationale
2 EINLEITUNG
Harmonisierung der Analysemethoden ein zusätzlicher Kernpunkt des Projekts. Das
Ziel dieser Untersuchung war die Erarbeitung einer geeigneten Analysemethode und
die Gewinnung validen Datenmaterials zur Abschätzung der Ausscheidungszeit von
Muttersubstanz und Metaboliten. Grundlage für die Entwicklung der HPLC/MS/MS-
Analysemethode waren Routineverfahren im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln. Die pharmakokinetische Studie wurde begleitet von der
zeitabhängigen Erfassung der pharmakodynamischen Wirkung anhand geeigneter
Parameter (PK/PD-Modell). Diese Kombination ermöglichte einen direkten Vergleich
von Detomidinkonzentration in Plasma und Urin zur pharmakologischen Wirkung am
Pferd.
Einen theoretischen Ansatz zum Vergleich verfolgt das pharmako-
kinetische/pharmakodynamische Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002). Die
durch diese Arbeit ermittelten pharmakokinetischen Daten wurden verwendet, um
Plasma- und Urinkonzentrationen zu errechnen, bei denen keine relevante
pharmakologische Wirkung mehr zu erwarten ist.
LITERATURÜBERSICHT 3
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Doping
2.1.1 Definition und Geschichtliches
UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) definierten den Begriff des Dopings als „die
Verabreichung von Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel einer
Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen
Wettkämpfen“. Dopingfälle bei Tieren stellen vor allen Dingen ein Problem bei den
Tierarten Pferden, Hunden und Reisetauben dar.
Das Wort „Doping“ stammt aus dem Niederländischen, wo das Verb „doopen“
eintauchen beziehungsweise tauchen bedeutet (DEBACKERE, 1989). Von dort aus
gelangte der Begriff durch die Buren nach Südafrika und bezeichnete einen
hochprozentigen, dickflüssigen Likör (Dop), der von den Bantus in Südostafrika als
Stimulans bei religiösen Feierlichkeiten getrunken wurde (BERSCHNEIDER u.
RICHTER, 1980). Erst später wurde der Begriff auf andere stimulierende Getränke
ausgedehnt (PROKOP, 1965). In den amerikanischen Sprachgebrauch
übergegangen, beschrieb „to dope“ später das trickreiche Betäuben und
anschließende Ausrauben von Reisenden (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980).
Durch den Bezug zum Rauschgift erschien der Begriff „Doping“ 1899 das erste Mal
in einem englischen Wörterbuch, wo es als ein Gemisch aus Opium und Narkotika
zur Verabreichung an Pferde bezeichnet wurde (HERMLE, 1996). Damit hatte sich
das Wort Doping im internationalen Sprachgebrauch als Begriff für die
missbräuchliche Einnahme von Mitteln zur Leistungssteigerung und damit
Wettbewerbsbeinflussung durchgesetzt.
Die ersten Hinweise auf den Gebrauch solcher Mittel gehen bis in das Altertum
zurück. Damals versuchten Krieger durch Drogen und zusätzliche Nährstoffe ihren
Gegnern überlegen zu sein (CROISIER, 1948), und auch Pferde wurden dem
Einfluss leistungssteigernder Mittel ausgesetzt. Aus dem alten Rom ist bekannt, dass
eine als „Hydromel“ bezeichnete wässrige Honiglösung zur Verbesserung der
4 LITERATURÜBERSICHT
Geschwindigkeit und Ausdauer bei Rennpferden verabreicht wurde (MORGAN,
1957; PICK, 1993). Um vermeintliche Konkurrenten aus dem Weg zu schaffen,
wurden Wagenrennpferde vergiftet (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980), was im
kaiserlichen Rom mit der Strafe der Kreuzigung belegt wurde. UNGEMACH (1985)
beschreibt, dass 1881 in Preußen alkoholische Lösungen an „feige“ Pferde
verabreicht wurden.
Die ersten Dopingreglementierungen wurden am 14. Juni 1666 in England
verabschiedet. In dieser ersten „Anti-Doping-Bestimmung“ wurde die Anwendung
anregender Stoffe bei Pferden verboten, wobei diese aber nicht näher definiert
wurden (CROISIER, 1948). Eine zielgerichtete Bekämpfung des Dopings setzte erst
im 20. Jahrhundert ein, da es einerseits durch die Entwicklungen im
Arzneimittelbereich möglich war, immer gezielter zu manipulieren und andererseits
die Analytikmethoden für den Nachweis unerlaubter Substanzen stetig verbessert
wurden (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).
2.1.2 Notwendigkeit der Dopingbestimmungen
Es ist unumgänglich, Tiere, die in der Obhut des Menschen leben und in allen
Hinsichten von ihm abhängig sind, vor Schmerzen, Leiden und Schäden zu
bewahren. Die gesetzliche Grundlage hierfür bilden das Grundgesetz und das
Tierschutzgesetz in seiner Fassung von Juni 2001.
Artikel 20a des Grundgesetzes wurde am 17.Mai 2002 nach langen Diskussionen
erweitert und lautet nun: „Der Staat schützt auch in Verantwortung für die künftigen
Generationen die natürlichen Lebensgrundlagen und die Tiere im Rahmen der
verfassungsmäßigen Ordnung durch die Gesetzgebung und nach Maßgabe von
Gesetz und Recht durch die vollziehende Kraft und Gewalt und die Rechtsprechung.“
Dadurch garantiert das Grundgesetz nun nicht mehr nur die Rechte der Menschen,
sondern auch den Schutz der Tiere und steht damit im Synergismus zum
Tierschutzgesetz.
LITERATURÜBERSICHT 5
Dort ist es nach § 3, Absatz 1 „verboten, einem Tier außer in Notfällen Leistungen
abzuverlangen, denen es wegen seines Zustandes offensichtlich nicht gewachsen ist
oder die offensichtlich seine Kräfte übersteigen“. Absatz 1a verbietet es, einem Tier
Leistungen abzuverlangen, wenn an ihm Eingriffe oder Behandlungen vorgenommen
worden sind, die einen leistungsmindernden körperlichen Zustand verdecken.
Absatz 1b untersagt klar, „an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen [...]
Dopingmittel anzuwenden“. Absatz 11 nimmt Bezug auf das physikalische Doping
und verbietet sogar „ein Gerät anzuwenden, das durch elektrische Reize das
artgerechte Verhalten des Pferdes beeinflusst und insbesondere [...]
außergewöhnliche Bewegungen erzwingt, die dem Tier Schmerzen, Leiden oder
Schäden zufügen können“. Nach § 17 Tierschutzgesetz kann die Anwendung von
Dopingmitteln als Straftat gewertet werden, wenn einem Wirbeltier länger anhaltende
und sich wiederholende Schmerzen zugefügt werden. Dem Berufsstand der Tierärzte
kommt hierbei eine besondere Bedeutung zu, da sie schon laut ihrer Berufsordnung
die „berufenen Schützer der Tiere“ sind. Somit stellen sie ein Bindeglied zwischen
Sport und Tierschutz dar.
Neben dem Aspekt des Tierschutzes ist es Sinn und Zweck der Anti-Doping–
Bestimmungen zu gewährleisten, dass der sportliche Vergleich unter gleichen
Bedingungen für alle Teilnehmer abläuft und somit der ethische Sportgedanke
erhalten bleibt (PICK, 1993). Weitere Gesichtspunkte sind der Schutz vor einer
Gefährdung anderer Teilnehmer oder Pferde durch gedopte Tiere (UNGEMACH,
1985), der Schutz der Interessen des wettenden Publikums (KLAUS u. HAPKE,
1994), die Vermeidung einer falschen Zuchtauslese (PICK, 1993) und der Schutz
des Ansehens der Sportart (PICK 1993).
2.1.3 Doping im Pferdesport
Doping im Pferdesport ist ein internationales Problem. Bereits 1977 definierte die
internationale Konferenz der westlichen Pferdesportverbände in Rom, dass alle
Substanzen äußeren Ursprunges, auch wenn sie im Pferd natürlicherweise
6 LITERATURÜBERSICHT
vorkommen können, verboten sind, wenn sie zu den in einer Dopingliste
veröffentlichten unerlaubten Mitteln zu rechnen sind (UNGEMACH, 1985).
Auf einem Kongress in Kentucky 1994 wurden spezifische Fragestellungen zur
Analytik von Dopingproben im Bereich des Pferdesports diskutiert und speziell die
Zusammenarbeit aller Pferdesportverbände gefordert. Die Internationale Reiterliche
Vereinigung (FEI) stellt dabei einen internationalen Pferdesportverband dar, dem mit
Deutschland 111 Nationen angeschlossen sind (DÜE, 1998). So wird ausgeführt,
dass es „der Sinn aller FEI-Wettkämpfe ist, die Talente von Pferden und Reitern im
Vergleich unter gleichen Bedingungen und auf der Grundlage ihrer Fähigkeiten
durchzuführen. Der Gebrauch von verbotenen Substanzen kann die Leistung
beeinflussen oder ein vorliegendes Gesundheitsproblem überdecken und zusätzlich
das Ergebnis eines Wettkampfes verfälschen. Daher ist die Liste der verbotenen
Substanzen so zusammengesetzt worden, dass sie alle Kategorien
pharmakologischer Wirksamkeit umfasst“. Als verbotene Substanzen gelten die
Substanz selbst, ihre Metaboliten, ihre Isomere oder die Isomere der Metaboliten,
unabhängig davon, ob die Substanz auch endogen im Pferd vorkommt. Damit ist
praktisch jede Anwendung von Arzneimitteln im Zusammenhang mit der Teilnahme
am Wettkampf nicht statthaft, unabhängig davon, ob dadurch eine
Leistungsbeeinflussung möglich ist oder nicht (KLAUS u. HAPKE, 1994).
In Deutschland wird die Verabreichung von Substanzen über die
Leistungsprüfungsordnungen der drei großen deutschen Pferdesportverbände
(Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V. [FN], Direktorium für Vollblutzucht und
Rennen e. V. [DVR] und Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e. V. [HVT])
geregelt. Besonders seitens der FN wird eine möglichst große Übereinstimmung mit
den Bestimmungen der FEI angestrebt, aber auch DVR und HVT stimmen
hinsichtlich des generellen Verbots jeglicher körperfremder Substanzen mit der FN
überein.
Nachfolgend werden Ausschnitte aus den Dopingbestimmungen der einzelnen
deutschen Pferdesportverbände dargestellt.
LITERATURÜBERSICHT 7
2.1.3.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände
2.1.3.2 Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen
Vereinigung e. V. (Stand 2004)
Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt A VIII, §§ 66 – 67a.
§ 66 verbietet die Teilnahme von Pferden und Ponys nach zum Beispiel
Neurektomie, lokaler Schmerzausschaltung, implantiertem Tracheotubus oder
sonstigen Eingriffen beziehungsweise Manipulationen, die zur Beeinflussung der
Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft geeignet sind.
In § 67 werden Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferdekontrollen in
Prüfungen geregelt, wobei sich detaillierte Anweisungen zu deren Ablauf in den
angehängten Durchführungsbestimmungen finden. Ebenfalls in den
Durchführungsbestimmungen geregelt ist die Ahndung bei Nachweis einer gemäß §
67a LPO verbotenen Substanz. Platzierte, positiv getestete Teilnehmer werden
disqualifiziert, der Verstoß nach den Bestimmungen der Rechtsordnung der LPO
geahndet und es besteht die Möglichkeit, die Tat als Verstoß gegen das
Tierschutzgesetz der zuständigen Behörde zu melden.
§ 67a enthält die Liste der kontrollierten Substanzen. Dabei wird zwischen „Punkt 1
Dopingsubstanzen“ und „Punkt 2 Verbotene Arzneimittel“ unterschieden, sowie unter
Punkt 3 die Ausnahmen hiervon geregelt.
Hierbei werden Dopingsubstanzen als Substanzen bezeichnet, die geeignet sind, die
Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen. Dabei werden nicht
einzelne Arzneimittel, sondern Stoffgruppen wie zum Beispiel Sedativa und
Narkotika, Stimulantien, Diuretika oder Anabolika aufgeführt. Lediglich für einzelne
Substanzen (Testosteron, Nandrolon, Theobromin und Cortisol) gelten Grenzwerte
(Grenzwerte siehe Punkt 2.1.7.1) .
8 LITERATURÜBERSICHT
Auch die verbotenen Arzneimittel sind nicht einzeln, sondern als ganze Stoffgruppen
reglementiert. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die zwar als Arzneimittel
eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind (zum Beispiel solche mit
Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System, auf das Atmungssystem, auf die Haut,
gegen Infektionserreger). Auch hier gibt es nur für wenige Mittel (Salizylsäure, Arsen,
Dimethylsulfoxyd und verfügbares CO2) Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt
2.1.7.1).
Ausnahmen von oben genannten Bestimmungen bilden Substanzen zur Pflege und
Vorbeugung wie zum Beispiel Impfstoffe, die bis spätestens 14 Tage vor der Prüfung
appliziert werden oder Insektenschutzmittel.
2.1.3.3 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen
(Stand Januar 2002)
Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt XIV der Rennordnung
unter Unerlaubte Mittel - Doping. Die Punkte 529 bis 561 regeln das allgemeine
Verbot der Anwendung unerlaubter Mittel, definieren Gruppen erlaubter und
unerlaubter Mittel, Substanzen mit Grenzwerten, sowie die Entnahme, Vorbereitung
und Auswertung von Dopingproben. Im Unterschied zur LPO behält sich das
Direktorium vor, Kontrollen nicht nur während Prüfungen durchzuführen, sondern
auch Trainingsproben entnehmen zu lassen.
2.1.3.4 Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht
und –Rennen e. V. (HVT) vom 01. Februar 2003
Die Dopingbestimmungen dieses Pferdesportverbandes werden im Teil B II § 93 und
den Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping
geregelt. Entsprechend der oben genannten Rennordnung darf ein Pferd von Beginn
LITERATURÜBERSICHT 9
bis zum Ende des Rennens keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen in
seinen Geweben, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen aufweisen.
Entgegen der LPO oder RO werden keine Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt
2.1.7.1) für einzelne Mittel angegeben, so dass jeglicher Nachweis verbotener Stoffe
positiv berichtet wird. In den Durchführungsbestimmungen finden sich die Dopingliste
mit Verboten von Substanzen beziehungsweise Stoffgruppen (Diuretika, Herz-
Kreislaufwirksame Mittel, Substanzen, die auf das zentrale oder periphere
Nervensystem wirken usw.) und detaillierten Bestimmungen zur Entnahme, dem
Versand und Auswertung von Proben.
Allen drei Pferdesportverbänden ist in der Reglementierung des Dopings gemein,
dass hauptsächlich Stoffgruppen auf den Verbotslisten aufgeführt werden. Eine
Auflistung einzelner Stoffe oder sogar Warennamen wäre bei der Vielfalt der zur
Verfügung stehenden Medikamente nicht möglich und könnte niemals vollständig
sein.
2.1.4 Dopingformen
UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) unterscheiden verschiedene Formen der
unerlaubten Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit für den
Pferdesport. Die Manipulationen teilen sich in positives, negatives und
unabsichtliches Doping, sowie in Maßnahmen zur Erschwerung des
Dopingnachweises.
2.1.4.1 Positives Doping
Doping auf Sieg
Es werden verbotene Substanzen zum Zwecke der Leistungssteigerung und
Überwindung der natürlichen und autonom geschützten Leistungsbarrieren,
10 LITERATURÜBERSICHT
entweder über Tage und Wochen (chronisches Doping) oder kurz vor dem
Rennen/der Prüfung (akutes Doping), verabreicht. Eine paradoxe Form des Doping
stellt die Verabreichung geringer Mengen Sedativa dar, um übererregte Pferde
startfähig zu machen (UNGEMACH, 1985). Mit den modernen Psychopharmaka ist
es möglich, Angst und Erregungszustände zu lindern, ohne eine wesentliche
Änderung des Wachzustandes oder der Leistungsfähigkeit zu provozieren.
Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit
Diese Form des Dopings zielt darauf ab, die genetisch determinierte
Leistungsfähigkeit des Tieres, die durch den aktuellen Gesundheitszustand
eingeschränkt wird, durch medikamentelle, therapeutische Maßnahmen
wiederherzustellen (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Das hat zur Folge, dass
kranke oder nicht voll belastungsfähige Pferde den extremen physischen
Belastungen einer Prüfung ausgesetzt werden. Dabei ist in erster Linie an den
Einsatz von Schmerzmitteln oder antibakteriell wirksamen Substanzen zu denken.
Doping mit körpereigenen Substanzen
Unter diese Form des Dopings fällt unter anderem die Verabreichung von Eigenblut
beziehungsweise dessen Bestandteilen, wie zum Beispiel Erythrozyten oder
Erythropoetin. Dieses in der Niere gebildete Hormon reguliert die Erythropoese
(BERGLUND et al. 1988; Müller, 1999), was genau wie die Verabreichung von
Erythrozytenkonzentrat eine Erhöhung des Anteils der roten Blutkörperchen im
Körper und damit verbesserte Sauerstofftransportkapazität des Blutes zur Folge hat.
LITERATURÜBERSICHT 11
Physikalisch-technisches Doping
Darunter versteht man alle Maßnahmen zur Manipulation der Leistungsfähigkeit, die
nicht durch die Applikation chemischer Substanzen, sondern in Form von zum
Beispiel elektrischen Reizen, Akupunktur, Ultraschall oder UV-Strahlen
vorgenommen werden (LOEFFLER, 2000). Die invasivste Form des Dopings sind
Eingriffe, wie der Einsatz eines ständigen Tracheotubus zur Überwindung von
Atemwegsobstruktionen oder Neurektomien im Bereich der distalen Gliedmaßen zur
Desensibilisierung insbesondere des Hufs (SCHOENE, 1996).
2.1.4.2 Negatives Doping oder Doping auf Niederlage
Bei negativem Doping handelt es sich um eine Form der Leistungsminderung, bei
der davon auszugehen ist, dass sie meistens von Außenstehenden,
beziehungsweise Konkurrenten, durchgeführt wird. Sie wird deshalb auch als
„outside job“ bezeichnet (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980). Häufig wird dabei
auf die Wirkung von Sedativa oder Tranquilizern zurückgegriffen, die nur in niedriger
Dosierung und bei nervösen Pferden einen positiven Effekt hervorrufen. Eine
normale therapeutische Dosierung führt zu lokomotorischen Hemmungen sowie dem
Ausfall bedingter Reflexe, wie dem Fluchtreflex bei Rennpferden, und damit zur
Leistungsminderung (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).
2.1.4.3 Unabsichtliches Doping
Durch unzureichende Kenntnis der Pharmakokinetik und -dynamik in der Masse der
Arzneimittel, die bei der Therapie erkrankter Pferde zum Einsatz kommen, kann es
zu positiven Dopingbefunden ohne konkreten Vorsatz kommen. Dabei stehen die
behandelnden Tierärzte häufig vor dem Problem, therapeutisch notwendige
Arzneimittelgaben mit der Forderung „kein Nachweis von therapeutisch
wirksamen/leistungsbeeinflussenden Substanzen zum Rennzeitpunkt in Blut
12 LITERATURÜBERSICHT
oder/und Urin“ vereinbaren zu müssen (KLAUS u. HAPKE, 1994). Dabei können und
dürfen sie sich nicht an den Wartezeiten für Medikamente für lebensmittelliefernde
Tiere orientieren, da nach Ablauf dieser keine Rückstandsfreiheit gewährleistet wird
(LOEFFLER, 2000). Zusätzlich hängt die Dauer der Nachweisbarkeit von
Medikamenten im Körper des Pferdes neben der Dosis und dem
pharmakokinetischen Verhalten des Arzneimittels von der Sensitivität des
Nachweisverfahrens und von der biologischen Variabilität der Eliminations-
geschwindigkeit des Individuums ab (TOBIN et al., 1989). Ein weiteres Problem
können Wirkstoffkombinationen beziehungsweise -verbindungen wie zum Beispiel
Procain-Penicillin darstellen, da das Lokalanästhetikum in dieser Formulierung über
einen viel längeren Zeitraum verfügbar bleibt als als Monopräparat (UNGEMACH,
1988). Auch bei Einreibungen zum Beispiel mit Kampfer kann es über perkutane
Resorption (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999) zu positiven Blutspiegeln
kommen. Weiterhin tragen pharmazeutische Hilfsstoffe, wie zum Beispiel
Kakaopulver als Trägerstoff eines oral zu verabreichenden Aufbaumittels zu dieser
Problematik bei. Kakao als Bestandteil von Industriefutter enthält Theobromin und in
geringer Menge auch Coffein, was in England bei Kontrollen mehrfach zu positiven
Dopingbefunden führte (TOBIN, 1981).
2.1.4.4 Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises
Hierbei wird versucht, den analytischen Nachweis der verabreichten Substanz durch
sogenannte Maskierungsmittel zu erschweren. Die verwendeten Stoffe führen nicht
zu einer Leistungssteigerung, besitzen aber die Fähigkeit, die verbotene Substanz in
der Analyse zu überlagern. So wird durch den Einsatz von Diuretika versucht, die
Konzentration eines verbotenerweise applizierten Arzneimittels oder Stoffes durch
Verdünnung des Urins zu senken (TOBIN u. WOOD, 1989). Urikostatika (zum
Beispiel Probenicid) auf der anderen Seite hemmen den Sekretionsprozess zum
Beispiel von Benzylpenicillin in den Nierentubuli, da sie eine Affinität zum selben
Carriersystem besitzen (FREY, 1996). Dadurch kann eine Urinprobe trotz
Verabreichung von Benzylpenicillin ein negatives Analyseergebnis bringen.
LITERATURÜBERSICHT 13
2.1.5 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in Deutschland
Systematische Dopingkontrollen der großen deutschen Pferdesportverbände werden
etwa seit Anfang der 1970er Jahre durchgeführt. Die Auswahl der Pferde, von denen
Urin oder Blut auf das Vorhandensein verbotener Substanzen untersucht wird, erfolgt
nach dem Zufallsprinzip und aufgrund von Verdachtsfällen. Laut DÜE (1998) werden
jährlich etwa 380 000 Analysen von Medikationskontrollen weltweit unter dem Dach
der Association of Official Racing Chemists durchgeführt. Davon entfallen ungefähr
3300 Medikationskontrollen auf den Galopp-, Trab-, Reit- und Fahrsport in
Deutschland, wobei die FN etwa 1000 Proben zur Untersuchung an Laboratorien
sendete. Der Hauptanteil der Proben wird im Institut für Biochemie der deutschen
Sporthochschule Köln analysiert. Eine Übersicht über die Jahre 2000 bis 2003 gibt
Tabelle 1:
Jahr Verband Gesamtzahl der Proben positiv getestete Proben [absolut]
positiv gestestete Proben [%]
FN 707 16 2,26
DIR 1011 20 1,98
FN 469 8 1,70
DIR 1166 8 0,69
FN 456 7 1,54
DIR 1070 15 1,40
FN 358 3 0,83
DIR 883 8 0,91
2000
2001
2002
2003
Tabelle 1: Übersicht der im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln in den Jahren
2000 bis 2003 zur Untersuchung gelangten Pferdeproben
2.1.6 Beurteilung von Analyseergebnissen
2.1.6.1 Null-Lösung und Grenzwerte
Für praktizierende Tierärzte ist die Maxime, Doping im Pferdesport nicht zu dulden,
in einigen Fällen therapeutisch unbefriedigend (KLAUS u. HAPKE, 1994), da bei
Sportpferden von einer hohen Behandlungshäufigkeit auszugehen ist. Dieses
14 LITERATURÜBERSICHT
untersuchten ROBINSON und GORDON (1988) in der Rennsaison 1987 an 100
Pferden, die mindestens einmal in Rennen starteten. Von diesen Tieren fielen 47
wegen muskuloskeletaler Verletzungen im Training oder Rennen aus und mussten
sogar teilweise aufgrund der Schwere der Verletzung euthanasiert werden. Der
Therapiebedarf bei Sportpferden ist also offensichtlich. Für die meisten Wirkstoffe gilt
derzeit, dass ihr Nachweis unabhängig von der gefundenen Konzentration als
Doping gewertet wird (vergleiche Punkt 2.1.4). Dies wird auch als sogenannte Null-
Lösung bezeichnet (UNGEMACH, 1988).
Lediglich für einige endogene oder im Futter vorkommende Substanzen sind
Grenzwerte in den Listen der Pferdesportverbände aufgeführt (siehe Tabelle 2).
Verband Grenzwert fürTestosteron
Nandrolon
Theobromin
Cortisol
Salizylsäure
Arsen
Dimethylsulfoxyd
verfügbares CO2
Arsen
Salicylsäure
Nandrolon
Theobromin
Dimethylsulfoxyd
Cortisol
Peptidhormone u. Analoga
Hordenin
Testosteron
verfügbares CO2
Methoxytyramin
Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V.
Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V.
Tabelle 2: Auflistung von Stoffen, für die in den Bestimmungen der Pferdesportverbände Grenzwerte
gelten (Stand Juni 2004)
LITERATURÜBERSICHT 15
Sowohl die Null- als auch die Grenzwert-Lösung stellen behandelnde Tierärzte vor
die Frage, ab welchem Zeitpunkt vor einer Prüfung ein Medikament nicht mehr
eingesetzt werden darf, um nicht einen Dopingfall (unabsichtliches Doping) im Sinne
der Bestimmungen zu provozieren. Bis heute liegen diesbezüglich über
Ausscheidungszeiten von Substanzen nur unzureichende Daten vor. Zur Sicherung
der notwendigen medikamentellen Behandlung von Sportpferden halten es KLAUS
und HAPKE (1994) für sinnvoll, für jedes anzuwendende Arzneimittel Karenzzeiten
festzulegen. Dabei ist die Karenzzeit definiert als Zeitraum zwischen dem letzten Tag
der Arzneimittelgabe und dem Tag der Prüfung, nach dessen Ablauf nicht mehr mit
einem positiven Ergebnis einer Dopinganalyse zu rechnen ist. Problematisch ist die
Abhängigkeit der Anwesenheit von Medikamenten von der verabreichten Dosis, der
Pharmakokinetik der Substanz, der Sensitivität der Nachweismethode und der
biologischen Variabilität der Individuen (TOBIN u. WOODS, 1989). Zusätzlich sind
individuelle Eliminationszeiten abhängig vom ausgeschiedenen Urinvolumen, dem
pH-Wert des Urins, der Stoffwechselkapazität der Leber, dem Gesundheitszustand
der Pferde und der Form der Anwendung (zum Beispiel peroral, parenteral,
äußerlich) (PICK, 1993; DYKE u. SAMS, 1994B).
Nach UNGEMACH (1985) erscheint es sinnvoll, für Arzneimittel maximal zulässige
Blutspiegel (Grenzwerte) festzulegen, um zu verhindern, dass der Nachweis
minimaler, mit Sicherheit unwirksamer Mengen als dopingrelevant bezeichnet
werden muss und notwendige Therapien verhindert werden. Allerdings liegen über
den Zusammenhang von Nachweis und Wirkkonzentration bis heute ebenfalls nur
sehr wenige oder unterschiedliche Daten vor (DÜE, 1998; SAMS, 1996).
Blutspiegelverlaufskurven für Dopingmittel gelten nur unter den bei den Messungen
vorherrschenden Bedingungen (UNGEMACH, 1985), was für die quantitative
Analyse eine gleiche Behandlung aller Proben bei ihrer Entnahme, ihrem Transport,
ihrer Aufbewahrung, Aufarbeitung und Messmethode voraussetzt (BEYER, 1998).
TOBIN und WOOD (1989) sowie SAMS (1996) sind der Meinung, dass die
quantitative Analyse im Zuge der Grenzwert-Lösung keinen Vorteil bietet, weil der
individuellen und intraindividuellen Variabilität in Bezug auf Wirkung und
16 LITERATURÜBERSICHT
Verstoffwechselung, die beim Pferd sehr groß ist, keine Rechnung getragen wird.
Nach DYKE und SAMS (1994A) steht auch die Harnkonzentration (durch zum
Beispiel starke Belastung in einem Wettkampf) in keinem konstanten Verhältnis zur
Blutkonzentration, so dass Urin schlecht für quantitative Analysen geeignet ist.
Diese Problematik und der Umstand, dass immer sensiblere Analysemethoden
entwickelt werden, veranlasste TOUTAIN und LASSOURD (2002) dazu, ein neues
Modell zu entwickeln. Durch ein Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Modell (PK/PD-
Modell) setzen sie die Konzentration einer Substanz und ihre Wirkung mathematisch
miteinander in Beziehung und ermitteln so effektive und irrelevante Plasma- (IPC)
und Urinkonzentrationen (IUC). Hierbei soll bestimmt werden, ab welcher
Konzentration einer Substanz in Blut und Urin keine pharmakodynamischen
Wirkungen mehr im Tier vorliegen, obwohl eventuell ein analytischer Nachweis
möglich ist. Um diese Berechnungen durchzuführen, müssen von der jeweiligen
Substanz genügend pharmakologische und pharmakokinetische Daten vorliegen
(siehe auch Punkt 4.4).
2.2 Physiologie und Pharmakologie von α2-Rezeptoren
Das autonome Nervensystem besteht funktionell aus sympathischen und
parasympathischen Fasern. Das sympatho-adrenale System ermöglicht dem
Organismus eine graduelle Anpassung an wechselnde äußere oder innere
Erfordernisse. Hierbei vermitteln die körpereigenen Transmitter Noradenalin und
Adrenalin die physiologischen Wirkungen an den Adrenorezeptoren und wirken als
direkte Sympathomimetika (STARKE, 1981). α2-Rezeptoren findet man im
Organismus sowohl zentral als auch peripher; dabei sind sie sowohl prä- als auch
postsynaptisch lokalisiert (CLARKE u. TAYLOR, 1986).
LITERATURÜBERSICHT 17
2.2.1 Rezeptorklassifizierung
Im Jahre 1948 klassifizierte AHLQUIST Adrenorezeptoren anhand hämodynamischer
Effekte verschiedener Katecholamine in α und ß-Typen. Die ß-Adrenorezeptoren
wurden mit Hilfe selektiver Agonisten und Antagonisten in ß1- und ß2-Rezeptoren
unterteilt (LANDS et al., 1967). Auch die α-Adrenozeptoren lassen sich weiter
unterteilen. Nach anatomischen Gesichtspunkten gliedern sie sich in postsynaptische
α1- und präsynaptische α2-Rezeptoren (LANGER, 1974). Die pharmakologische
Unterteilung wurde notwendig, als BERTHELSEN und PETTINGER (1977) auch
postsynaptisch lokalisierte α2-Rezeptoren fanden. Daraufhin wurde die Bezeichnung
α1 oder α2-Adrenozeptor auf die Präferenz von Agonist oder Antagonist für den
Rezeptor bezogen und nicht mehr auf die Lokalisation (MACDONALD u. VIRTANEN,
1992). Für α2-Rezeptoren werden zusätzlich vier Subtypen unterschieden: α2a, α2b,
α2c und α2d (RUFFOLO et al., 1994; VAINIO, 1997).
2.2.2 α2-Agonisten und Antagonisten beim Pferd
α2-Agonisten werden seit vielen Jahren aufgrund ihrer sedativen und analgetischen
Eigenschaften beim Pferd eingesetzt (VIRTANEN, 1986). Durch die
pharmakologische Einteilung der α-Rezeptoren wurden die Entwicklung spezifischer
Pharmaka und der gezielte Einsatz der bisher verfügbaren α-Adrenozeptoragonisten
möglich (SCHEININ u. MACDONALD, 1989). Im Gegensatz zu einigen anderen
Sympathomimetika besitzen die im Folgenden aufgeführten Substanzen die
Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren (LÖSCHER, 2002), was zu
vielfältigen und komplexen Reaktionen im Bereich des zentralen Nervensystems
führt.
Clonidin war 1977 der erste Vertreter dieser Gruppe. Es wird als Prototyp der α2-
Agonisten mit Wirkung auf das zentrale Nervensystem angesehen (BISCHOFF u.
KOCHS, 1993). Seine Selektivität gegenüber den α2-Rezeptoren war allerdings nicht
so ausgeprägt wie die moderner Pharmaka (SHORT, 1992). Im Laufe der Zeit
18 LITERATURÜBERSICHT
wurden Substanzen wie Romifidin oder Detomidin mit einer höheren Selektivität
entwickelt.
1962 wurde Xylazin als Antihypertensivum entwickelt. Da man während der
klinischen Studien jedoch eine stark depressive Wirkung auf das zentrale
Nervensystem feststellte, wurde es 1968 als Sedativum, Analgetikum und
Muskelrelaxans in die Veterinärmedizin eingeführt (GREENE u. THURMON, 1988).
Bei Romifidin handelt es sich um einen neueren Vertreter der Gruppe der α2-
Agonisten. Dabei ist es in den sedativen Wirkungen vergleichbar mit Xylazin
(BROWNING u. COLLINS, 1994); über seine analgetischen Eigenschaften wird
kontrovers diskutiert (HAMM et al., 1995; MOENS et al., 2003).
Medetomidin ist als Sedativum für Hunde und Katzen zugelassen. Durch seine
lipophilen Eigenschaften diffundiert es schneller ins Gehirn als Xylazin und führt zu
einer ausgeprägteren zentralen Wirkung (VIRTANEN, 1986). Es besitzt ähnliche
analgetische Potenz wie Xylazin und Detomidin, jedoch können mit Medetomidin
vergleichbare Wirkungen schon in geringeren Dosen erzielt werden.
Detomidin ist ein potenter und selektiver α2-Agonist mit geringer Wirkung auf α1-
Rezeptoren (VAINIO, 1985; VIRTANEN et al., 1985). Es ist als Sedativum und
Analgetikum für Pferde und Rinder zugelassen. Es wird als Testsubstanz der in
dieser Arbeit beschriebenen Studie unter Punkt 2.3 eingehender besprochen.
2.2.3 Wirkungsmechanismus
α2-Sympathomimetika wie Clonidin, Xylazin, Romifidin und Detomidin entfalten ihre
Wirkung vornehmlich im zentralen Nervensystem. Die α2-Rezeptoren im Gehirn
befinden sich hauptsächlich im Gebiet des Locus coerulus (Hirnstammkern) und des
Nucleus tractus solitarius. Sie kontrollieren dort den Noradrenalinhaushalt. Als
Ursprung aufsteigender und absteigender noradrenerger Bahnen nimmt der Locus
coerulus in der Regulation der Vigilanz eine zentrale Stellung ein (STENBERG,
LITERATURÜBERSICHT 19
1986), während der Nucleus tractus solitarius an der Kontrolle des Blutdrucks
beteiligt ist (STARKE u. PALM, 1996). α2-Agonisten greifen an peripheren und
zentralen α2-Rezeptoren an und hemmen dort die noradrenalingesteuerte
Übertragung von Nervenimpulsen.
Auf molekularbiologischer Ebene handelt es sich bei α2-Adrenozeptoren um G-
Protein-gekoppelte Rezeptoren in der zytoplasmatischen Membran (MAZE u.
TRANQUILLI, 1991; AANTAA u. SCHEININ, 1993). Durch ein die Synapse
erreichendes Aktionspotential kommt es über einen Ca2+-Einstrom zur Freisetzung
von Noradrenalin in den synaptischen Spalt. Die Aktivierung der Rezeptoren durch
endogene Transmitter oder die oben genannten Substanzen führt zu einer G-Protein
vermittelten Hemmung der Ca2+-Kanäle (LAMMINTAUSTA, 1986; DAUNT u. MAZE,
1992). Einerseits wird dadurch die weitere Freisetzung von Noradrenalin im Sinne
eines negativen Feed-Back-Mechanismus gehemmt (LANGER et al., 1977; Starke,
1977). Andererseits wird durch die Hyperpolarisation der Membran eine
Desensibilisierung erreicht (MAZE u. TRANQUILLI, 1991). Zentral führt die
Aktivitätsabnahme dieser Neurone zur Sedation der Tiere (STENBERG, 1986),
Bradykardie und Hypotension (SHORT et al., 1986). Peripher bedingt die
postsynaptische Stimulation eine initiale Vasokonstriktion mit daraus resultierendem
transientem peripheren Bluthochdruck (CLARKE u. TAYLOR, 1986). Die
analgetischen Effekte von α2-Agonisten nehmen ihren Ursprung sowohl im
Hirnstamm als auch im Rückenmark (STENBERG, 1986; ALITALO u. VAINIO, 1982).
Es wird eine synergistische Wirkung von α2-adrenergen und opioidergen
Rezeptormechanismen angenommen (AANTAA u. SCHEININ, 1993).
2.2.4 α2-Antagonisten
Die Wirkung der α2-Sympathomimetika kann durch α2-Rezeptorblocker wie Idazoxan,
Tolazolin, Yohimbin und Atipamezol aufgehoben werden (VIRTANEN, 1986;
VIRTANEN et al., 1985). Dabei verdrängen diese endogene (Adrenalin,
Noradrenalin) oder exogene (Xylazin, Romifidin, Detomidin) Agonisten vom Rezeptor
20 LITERATURÜBERSICHT
(STARKE u. PALM, 1996). Die Wirkung von Detomidin lässt sich beim Pferd durch
den spezifischen α2-Antagonisten Atipamezol aufheben (RAMSEYER et al., 1998;
RAEKALLIO et al., 1990). Atipamezol hat eine Bindungsaffinität α2/α1-Rezeptoren
von 8526:1 (ZIEGLER, 2003). Allerdings ist eine Antagonisierung beim Pferd kaum
notwendig, da die Wirkungsdauer der α2-Agonisten nur kurz ist und beim Pferd in der
Regel nicht zum Niedergehen führt. Auch beim Kleintier wird Atipamezol als
Antagonist eingesetzt (SCHATZMANN, 1995).
2.3 Detomidin
2.3.1 Chemie
Bei Detomidin handelt es sich chemisch um das schwach basische, lipophile 4-[(2,3-
Dimethylphenyl)-methyl]-Imidazol (SALONEN, 1986). Es gehört zur Gruppe der 4
(5)-substituierten Arylalkylimidazole (RUSKOAHO, 1986). Detomidin ist ein weißes,
kristallines und geruchloses Pulver, mit einem Molekulargewicht von 186,25. Es ist
gut wasserlöslich, frei von Isomeren und weitgehend stabil (SALONEN, 1986). Sein
Schmelzpunkt liegt bei 156 – 161°C. Es ist seit 1983 als wässrige Detomidin-
Hydrochlorid-Lösung (Domosedan®, Orion Pharma, Espoo, Finnland, vertrieben
durch Pfizer, Karlsruhe) in Deutschland beim Pferd und Rind zur intravenösen,
intramuskulären und epiduralen Injektion zugelassen. 1 ml Domosedan®
Injektionslösung enthält 10 mg Detomidin-Hydrochlorid. Abbildung 1 zeigt die
Strukturformel, die Summenformel und die Molekülmasse von Detomidin.
LITERATURÜBERSICHT 21
CH3
CH3
HNN
DetomidinC12H14N2
186.25
Abbildung 1: Strukturformel, Summenformel und Molekülmasse von Detomidin
2.3.2 Pharmakokinetik
Um seine zentralen α2-agonistischen Wirkungen an präsynaptischen, in höheren
Konzentrationen auch an den postsynaptischen α2-Adrenorezeptoren zu entfalten
(VIRTANEN, 1986), wird Detomidin nach der Applikation schnell und vollständig
resorbiert (JÖCHLE, 1986; SALONEN, 1986). Nach der intravenösen Applikation
werden innerhalb der ersten Minuten die höchsten Plasmakonzentrationen erreicht
(SALONEN, 1986). Beim Pferd werden annähernd 85 % (SALONEN, 1986)
beziehungsweise 68 % (SINGH et al., 1987) an Plasmaproteine gebunden. Durch
seinen lipophilen Charakter verteilt sich Detomidin schnell in die gut durchbluteten
Gewebe (Leber und Niere); es passiert rasch die Blut-Hirn-Schranke (SALONEN,
1992; JÖCHLE, 1986). Die Eliminationshalbwertszeit liegt beim Pferd nach
intravenöser Injektion zwischen einer und zwei Stunden (SALONEN, 1992, DYKE,
1993; Orion Pharma, 2003). Eine Metabolisierung (Hydroxylierung, Dehydro-
genierung, Oxidation und Glukoronidierung) findet in der Leber statt (SALONEN u.
SUOLINNA, 1988; GEISER, 1990). Beim Pferd entstehen bei der
Verstoffwechselung die Metaboliten Carboxydetomidin, 3-3-Hydroxydetomidin und 4-
Hydroxydetomidin (CHUI et al., 1991), die pharmakologisch unwirksam sind (MAC
DONALD u. VIRTANEN, 1992; SALONEN, 1992). Dabei stellen das freie
22 LITERATURÜBERSICHT
Carboxydetomidin und das sowohl glukoronidiert als auch frei vorliegende 3-
Hydroxydetomidin die Hauptmetaboliten dar (SEYMOR et al., 1990A; SALONEN et
al., 1992). Da die Metaboliten weniger lipophil sind als Detomidin, werden sie
schneller als die ursprüngliche Substanz ausgeschieden. Detomidin selbst wird im
Urin nur in sehr kleinen Mengen gefunden (VAKKURI et al., 1987; SALONEN, 1988).
Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich renal, ein geringer Teil wird als Glukoronid
über die Faeces ausgeschieden (SALONEN, 1992). Beim Pferd sind nach einer
einmaligen intravenösen Applikation von 80 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM nach
24 Stunden nur in Leber und Lunge noch geringe Mengen Detomidin nachweisbar
(VAKKURI et al., 1987; SALONEN et al., 1989). Nach der Applikation von 20 mg
Detomidin-Hydrochlorid wird 3-Hydroxydetomidin über 48 Stunden im Urin detektiert
(CHUI et al., 1991). Carboxydetomidin hingegen wird nach einer Dosierung von 5
µg/kg KM i. m. bis 23 Stunden p. a. im Urin gefunden (SEYMOR et al., 1991).
2.3.3 Pharmakodynamische Wirkung
Die Applikation von Detomidin bedingt eine Vielzahl von zu beobachtenden Effekten.
Sedation und Analgesie: Detomidin verfügt über potente sedative und analgetische
Eigenschaften (VAINIO, 1985). Sowohl Sedation als auch Analgesie sind beim Pferd
dosisabhängig (LOWE u. HILFIGER, 1984; JÖCHLE u. HAMM, 1986). Die niedrigste
angewendete Dosierung für die intravenöse Applikation liegt bei 5 µg/kg KM. LOWE
und HILFIGER (1984) und GEISER (1990) empfehlen eine Dosis von 10 – 40 µg/kg
KM, um eine ausreichende Sedation und Analgesie zu erreichen. Für eine tiefere
Sedation und bessere Analgesie wird eine Dosierung von 40 bis 80 µg/kg KM
empfohlen (Orion Pharma, 2003). 20 µg/kg KM ergaben in den Studien von HAMM u.
JÖCHLE (1986) eine sehr tiefe und zufriedenstellende Sedation in der ersten Stunde
nach Applikation mit deutlicher Sedation bis 3 zu Stunden Dauer. Zwischen 5 und 20
µg/kg KM wird eine dosisabhängige Verstärkung der Sedation beobachtet; bei
höheren Dosierungen steigt nur noch die Dauer der Sedation, nicht mehr die Tiefe
(JÖCHLE u. HAMM, 1986; ENGLAND u. CLARKE, 1996). Nach der intravenösen
LITERATURÜBERSICHT 23
Applikation tritt die Wirkung zwischen 0,5 und 5 Minuten später ein (LOWE u.
HILFIGER, 1984; CLARKE u. TAYLOR, 1986; OHNESORGE, 1991). Maximale
Effekte werden 15 Minuten nach der Applikation beobachtet (JÖCHLE u. HAMM,
1986). Nach der intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM
berichten CLARKE u. TAYLOR (1986) von einer tiefen Sedation über eine Dauer von
50 bis 60 Minuten, die Studien von HAMM u. JÖCHLE (1986) ergaben sogar eine
deutliche Sedation mit einer Dauer von bis zu drei Stunden. Nach oraler
Verabreichung von 60 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM war nach 30 Minuten eine
signifikante Tiefhaltung des Kopfes über eine Dauer von 45 Minuten zu beobachten
(RAMSEY et al., 2002). Die Sedation äußert sich durch Hängenlassen des Kopfes,
der Lippen und der Augenlider, verminderte Reaktion auf akustische und visuelle
Reize sowie Ataxie (FEDDERN, 1986; SHORT et al., 1986, ALITALO, 1986;
OHNESORGE, 1991).
Die spontane Bewegungsaktivität geht nach der Applikation von Detomidin-
Hydrochlorid für 4 bis 6 Stunden deutlich zurück (KAMERLING et al., 1988;
HARKINS et al., 1997). VIRTANEN et al. (1985) stellten fest, dass die sedative
Potenz von Detomidin der von Clonidin sehr ähnlich ist. Im Vergleich zu den
Wirkungen von Xylazin ist sowohl der Grad der Sedation als auch die Analgesie,
bedingt durch eine höhere α2-Rezeptorselektivität, bei Detomidin ausgeprägter
(HAMM et al., 1995), so dass 100 µg Detomidin/kg KM eine vergleichbare Wirkung
wie 1200 µg Xylazin/kg KM haben (VAINIO, 1985) Trotz starker Sedationsanzeichen
kann es, bedingt durch äußere Reize, leicht zu einem Durchbrechen der Sedation in
Form plötzlicher Abwehrbewegungen kommen (ROHR et al., 1986; ALITALO, 1986).
Anschließend fallen die Tiere wieder in einen somnolenten Zustand.
Die analgetische Wirksamkeit von Detomidin ist in verschiedenen Studien bewiesen
worden. Trotz der Verwendung unterschiedlicher Schmerzmodelle stimmen die
Ergebnisse der Untersuchungen im wesentlichen überein. VAINIO (1985) überprüfte
die Reaktion auf Nadelstiche an den Gliedmaßen, JÖCHLE und HAMM (1986),
ermittelten die Schmerzschwelle mittels Stromapplikation über Hautelektroden und
CHAMBERS et al. (1990) arbeiteten mit einem druckgasbetriebenen Zylinder, der am
24 LITERATURÜBERSICHT
Bein von Pferden montiert wurde. Die analgetische Wirkung von Detomidin war 5 bis
15 Minuten nach der Applikation voll ausgeprägt (ALITALO u. VAINIO, 1982). Die
Dauer der Analgesie richtete sich nach der Dosierung, hält jedoch kürzer an als die
Sedation (VAINIO, 1985). Bei 20 µg/kg KM waren die Gliedmaßen mit etwa 15 bis 60
Minuten am Längsten von der analgetischen Wirkung betroffen (JÖCHLE und
HAMM, 1986). LOWE u. HILFIGER (1984) bescheinigten Detomidin eine
dosisabhängige, analgetische Wirksamkeit bei viszeralen Schmerzen. Sie stellten
mittels ins Zaekum implantierten, luftgefüllten Gummiballons eine analgetische
Wirkung von Detomidin fest, die annähernd gleichzeitig mit der Sedierung einsetzte,
aber früher wieder abklang. CLARKE u. TAYLOR (1986) ermittelten hingegen bei
Dosierungen von 10-20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM keine signifikante
Analgesie.
Laut SCHATZMANN (1995) kann es ein Problem darstellen, die Analgesie von der
Sedation zu unterscheiden. Durch eine Sedation wird die Spontanaktivität und die
Reaktion auf äußere Reize gesenkt, so dass fraglich ist, ob die Tiere bei
schmerzhaften Manipulationen tatsächlich eine verlangsamte Schmerzleitung oder
nur eine verlangsamte Reaktion auf den Schmerz zeigen. Die Studien von HAMM et
al. (1995) hingegen weisen keinen Zusammenhang zwischen Sedation und
Analgesie nach.
Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System: Nach der Applikation von
Detomidin-Hydrochlorid führt die Stimulation peripherer postsynaptischer α-
Adrenozeptoren zu einer vaskulären Vasokonstriktion. Dies bedingt einen initialen
Blutdruckanstieg, mit einem Maximum eine Minute nach Applikation (CLARKE u.
TAYLOR, 1986; SHORT et al., 1986). Die Stimulation zentraler α-Rezeptoren im
Bereich des Nucleus tractus solitarii führt jedoch zu einer Senkung des
Sympathikotonus (Überwiegen des Vagotonus) und Hypotension (GASTHUYS et al.,
1990; ENGLAND u. CLARKE, 1996; LÖSCHER, 2002). Der resultierende Blutdruck
ist also eine Mischung aus peripheren und zentralen Effekten (RUSKOAHA, 1986).
LITERATURÜBERSICHT 25
Die Herzfrequenz fällt kurz nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid deutlich
ab (VAINIO, 1985; SHORT et al., 1986). Bei einer Dosis von 20 µg/kg KM ist diese
Herzfrequenzabnahme bereits innerhalb der ersten 5 Minuten (SHORT et al., 1986;
BENSON u. THURMON, 1990) und über einen Zeitraum von 70 Minuten
(FEDDERN, 1986) beziehungsweise 120 Minuten (SRAZAN et al., 1989) zu
beobachten. Diese ist bedingt durch einen Baroceptorreflex, ausgelöst durch den
transienten Hypertonus nach Detomidingabe, die zentrale Dämpfung des
Sympathikotonus und die Verstärkung der vagalen Reflexe (KAMERLING et al.,
1988).
Zusätzlich werden im Elektrokardiogramm Arrhythmien ab der ersten Minute p. a. für
die Dauer von ein bis drei Stunden registriert (CLARKE et al., 1986; FEDDERN,
1986; DAUNT et al., 1991). Dabei handelt es sich in der Mehrzahl der Fälle um
Atrioventrikularblöcke (AV-Blöcke) 2. Grades, seltener um sinuatriale Leitungs-
störungen (CLARK u. TAYLOR, 1986; FEDDERN, 1986; JÖCHLE, 1986). Im
Vergleich zu Xylazin ist bei der Anwendung von Detomidin eher mit dem Auftreten
kardialer Reizleitungsstörungen in Form von AV- und Sinusblöcken zu rechnen
(DYSON et al., 1987).
Auswirkungen auf die Atmung: Über die Veränderung der Atemfrequenz nach der
Applikation von Detomidin-Hydrochlorid wird in der Literatur kontrovers diskutiert.
SHORT et al. (1986) und WAGNER et al. (1991) stellten einen Abfall der
Atemfrequenz innerhalb einiger Sekunden fest. Dieser dauerte einige Minuten an,
bevor wieder die Ruhewerte erreicht wurden. In anderen Studien (REITMEYER et
al., 1986; DAUNT et al., 1993) wurde keine signifikante Veränderung der
Atemfrequenz gemessen. VAINIO (1985) und JÖCHLE (1986) berichteten über
einen kurzen initialen Abfall der Atemfrequenz, gefolgt von einem geringgradigen
Anstieg über die Ruhewerte hinaus. Beide Autoren beschrieben allerdings starke
Schwankungen der Atemfrequenz während der Messungen. Nach einer einmaligen
intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM stellte FEDDERN
(1986) einen signifikanten Anstieg der Atemfrequenz über eine Dauer von 10
26 LITERATURÜBERSICHT
Minuten fest. In den folgenden 70 Minuten erfolgte eine graduelle Anpassung zurück
auf das Ruheniveau.
Nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid sinkt der Sauerstoffpartialdruck
(pO2) ab, während der Kohlendioxidpartialdruck (pCO2) geringgradig ansteigt (ROHR
et al., 1986; REITMEYER et al., 1986). FEDDERN (1986) und SHORT et al. (1986)
berichteten nach der intravenösen Injektion von 20 µg/kg KM über einen nicht
signifikanten Abfall des pO2 in einem Zeitraum von 15 Minuten p. a. Gleichzeitig
steigt der pCO2 über 45 Minuten p. a. an (FEDDERN, 1986). In einer weiteren Studie
wurden keine signifikanten Veränderungen des pO2, allerdings ein Anstieg des pCO2
beobachtet (DAUNT et al., 1991). Weiterhin berichtete FEDDERN (1986) über das
Auftreten von in- und expiratorischen Geräuschen während der ersten Stunde nach
der Detomidinapplikation. Ein inspiratorisches Atemgeräusch kann durch eine
Entspannung des Larynx bei sedierten, mit gesenktem Kopf stehenden Pferden
auftreten (REITEMEYER et al., 1986).
Auswirkungen auf die Körpertemperatur: VIRTANEN und MACDONALD (1985)
und VIRTANEN (1986) zeigten in Versuchen mit Ratten eine Detomidin-induzierte
Hypothermie, während FEDDERN (1986) bei Pferden keine signifikanten
Veränderungen feststellen konnte. Dosen von 20 und 40 µg Detomidin-
Hydrochlorid/kg KM führen zu einer Hyperthermie 45 Minuten p. a. (KAMERLING et
al., 1988).
Andere Wirkungen: Als weitere Wirkungen von Detomidin wird über das Auftreten
von reversiblen Penisvorfällen (ALITALO, 1986; JÖCHLE, 1986; DYSON et al., 1987;
HAMM et al., 1995) und verstärktem Schwitzen der Tiere (CLARKE u. TAYLOR,
1986; JÖCHLE, 1986; JÖCHLE u. HAMM, 1986; SHORT et al., 1986) berichtet.
Detomidin führte in der Mehrzahl der Studien zu einem diuretischen Effekt
(FEDDERN, 1986; JÖCHLE, 1986; JÖCHLE u. HAMM, 1986; LOWE u. HILFIGER,
LITERATURÜBERSICHT 27
1986; SHORT, 1992). SHORT et al. (1986) beschrieb beim Pferd eine deutlich
verstärkte Diurese ab etwa 60 Minuten nach der Applikation von Detomidin-
Hydrochlorid. Diskutiert wird eine Verringerung von zirkulierendem Antidiuretischen
Hormon, was zu einer vermehrten Harnproduktion führt (ENGLAND et al., 1992). Die
Harndichte sinkt signifikant mit Beginn der verstärkten Diurese ab (GASTHUYS et
al., 1987). CLARKE und TAYLOR (1986) hingegen konnten keine erhöhte
Harnproduktion feststellen.
2.3.4 Applikationsformen
Domosedan® ist in Deutschland wegen guter Gewebeverträglichkeit (SALONEN,
1986) zur intravenösen, intramuskulären und epiduralen Applikation zugelassen.
2.3.5 Klinische Anwendung von Detomidin
Detomidin ist als Sedativum und Analgetikum sowie zur Prämedikation von
Injektions- und Inhalationsnarkosen für Pferde und Rinder im Handel und
zugelassen. Es eignet sich sowohl zur Erleichterung von klinischen Untersuchungen
und Behandlungen (Laryngoskopie, Zahnbehandlungen) als auch für kleinere
chirurgische Eingriffe (Wundnähte). Bei sehr schmerzhaften Eingriffen wird eine
zusätzliche Analgesie empfohlen. Die angeratene Dosierung liegt zwischen 20 und
40 µg/kg Körpermasse. Die Wirksamkeit von Detomidin ist auch bei jungen (OIJALA
u. KATILA, 1988) oder aufgeregten Tieren (MARTIN et al., 1995) nachgewiesen.
2.3.6 Einsatz von Detomidin im Pferdesport zur Beeinflussung der Leistung
Die pharmakologischen Eigenschaften von Detomidin machen seine klinischen
Einsatzmöglichkeiten deutlich. Durch den großflächigen Einsatz in den USA und
28 LITERATURÜBERSICHT
Europa steht Detomidin im Verdacht, auch illegal an Pferde verabreicht zu werden
(WOOD et al., 1989), um nervöse und ängstliche Tiere kurz vor einem Wettkampf zu
beruhigen. Subklinische Dosen von 1 mg/Tier oder weniger können geringgradige
sedative Effekte auf die Tiere haben (WOOD et al., 1989), wodurch der Umgang mit
ihnen im Wettkampf erleichtert sein kann. Aufgrund seiner analgetischen Wirkung bei
viszeralen Schmerzen ist sein Einsatz zur Maskierung von Koliksymptomen
(JÖCHLE et al., 1989) oder im Sinne des negativen Dopings als „stopping drug“
möglich (SEYMOR et al., 1990B).
Da die geringen Mengen Detomidin nur schwer nachzuweisen sind, wurden im Laufe
der Zeit verschiedene analytische Methoden entwickelt, um den illegalen Einsatz von
Domosedan® aufzudecken.
2.4 Analytik
Für den Analytiker ist die enorme Zahl an Arzneimitteln beziehungsweise
chemischen Substanzen, die dopingrelevant sind, problematisch (TOBIN, 1989).
Deshalb werden Urin- und Plasmaproben zuerst Screeningprozeduren unterzogen,
die einen Hinweis auf das Vorhandensein bestimmter Substanzgruppen geben
(DÜE, 1998). Der spezifische Nachweis einer körperfremden und/oder verbotenen
Substanz erfolgt dann in einem zweiten Schritt. Der Nachweis und die Identifizierung
einer pharmakologisch wirksamen Substanz und/oder ihrer Metaboliten erfolgt
anhand physikalischer Messmethoden (SCHÄNZER u. SEINSCH, 1997). In der
modernen Dopinganalytik werden hierbei hauptsächlich chromatographische
Analysemethoden verwendet (DYKE u. SAMS, 1994A), die dazu dienen, die
gesuchten Substanzen aus den biologischen Matrices Urin und Plasma
herauszutrennen und von anderen Substanzen zu unterscheiden.
LITERATURÜBERSICHT 29
2.5 Analytischer Nachweis von Detomidin
Für den Nachweis von Detomidin werden verschiedene Verfahren in der Literatur
beschrieben.
Der Nachweis von Detomidin im Plasma erfolgte erstmals mittels Radioimmunassay
(RIA) (SALONEN et al., 1989). Eine weitere Möglichkeit für den Nachweis von
Detomidin im Plasma bietet ein ELISA (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay),
(CHUI et al., 1991).
Die Detektion von Domosedan® im Urin beschränkt sich in allen Studien auf den
Nachweis der Metaboliten. Um genauere pharmakokinetische Daten zu erhalten,
quantifizierten SINGH et al. (1987) Detomidin mittlels Gaschromatographie (GC/MS),
während SEYMOR et al. (1991) radioaktiv markiertes Detomidin benutzten. Ebenfalls
zum Einsatz kamen HPLC/MS/MS-Verfahren (CHUI et al., 1991), in denen teilweise
ebenfalls radioaktiv markiertes Material verwendet wurde (SALONEN u. SUOLINNA,
1988). SEYMOR et al. (1990B) benutzten ein GC/MS/MS-System, um den
Hauptmetaboliten Carboxydetomidin nach Anwendung von Domosedan® zu
identifizieren.
2.5.1 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Tandem-Massenspektrometer (MS/MS)
Die Analytik erfolgte in der vorliegenden Studie mittels Hochdruck-Flüssigkeits-
chromatographie in Kombination mit einem Tandem-Massenspektrometer-System.
Als Chromatographie bezeichnet man eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen
einer ruhenden (stationären) Phase und einer sich bewegenden (mobilen) Phase, die
nicht miteinander mischbar sind. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ist eine
besonders schnelle und leistungsfähige Chromatographiemethode und trennt
innerhalb von Minuten einen umfassenden Bereich von Stoffgruppen (SCHWEDT,
1986). Dazu gehören stark polare und ionische Substanzen, Substanzen mit hoher
30 LITERATURÜBERSICHT
Molmasse sowie thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen (UNGER et
al., 1995). Jede HPLC-Apparatur besteht aus einer Serie von Bausteinen, die
miteinander gekoppelt sind. Ein sogenanntes chromatographisches System enthält
folgende Bausteine:
Die stationäre Phase wird von einer sogenannten „Säule“, als langgestrecktes
Trennbrett in einem Rohr gebildet. Das Innere der Trennsäule wird aus einem
stabilen und dichten Verband aus kleinen, porösen Teilchen gebildet (Säulenbett),
was eine große Oberfläche und hohe Druckstabilität garantiert (UNGER et al., 1995).
Die Trennsäule ist charakteristisch durch ihre Länge, ihren Innendurchmesser und
durch den mittleren Teilchendurchmesser des Packungsmaterials. Sie besteht aus
einem Probenaufgabeteil, durch den auch die Zufuhr der mobilen Phase erfolgt, der
chromatographischen Trennstrecke und dem Säulenende, das in den Detektor
übergeht. Die Trennung der einzelnen Substanzen ist aufgrund ihrer
unterschiedlichen Polaritäten mit unterschiedlichen Sorptions- und Desorptions-
vorgängen auf der Säule möglich.
Die mobile Phase entspricht einem Lösungsmittelgemisch. Es wird infolge der
Schwerkraft oder mittels einer Pumpe unter Überdruck aus dem Fließmittelreservoir
in die Säule eingebracht. Möchte man ein Substanzgemisch mit verschiedenen
polaren Substanzen trennen, so verwendet man zur Trennung die Gradientenelution.
Bei dieser Arbeitsweise wird die Fließmittelstärke kontinuierlich erhöht und damit die
Empfindlichkeit der Detektion im hinteren Teil der Zeitachse erhöht (siehe Punkt
3.3.3.1).
Die Pumpe dient der Erzeugung eines konstanten und regelbaren Flusses des
Lösungsmittels. Für analytische Säulen werden Volumina von 0,5 bis 5 ml/min
angegeben.
Die Dosiervorrichtung oder das Einspritzsystem gibt reproduzierbar ein im Volumen
wählbares, definiertes Aliquot des zu trennenden Gemisches (Probe) aus dem
Probenröhrchen direkt in den Strom der mobilen Phase. So gelangen Probe und
LITERATURÜBERSICHT 31
Lösungsmittel über das Probenaufgabeende in die thermostatierte Säule und werden
durch sie hindurch geleitet (SCHWEDT, 1986).
Das Detektionssystem schließt sich der Säule direkt an und macht das
chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Dabei ist das
Signal proportional zur Menge der Substanz und wird in Abhängigkeit zur Zeit in
Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm zeigt die Retentionszeit der
Substanz sowie Höhe und Fläche des Peaks an. Die Retentionszeit entspricht der
Zeitspanne von der Injektion bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Über
den Vergleich der Fläche der Substanz zur Fläche des internen Standards kann auf
die Konzentration der Probe geschlossen werden (MASSMANN, 2004).
In der vorliegenden Studie wurde das HPLC-System direkt mit einem Tandem-Massenspektrometer als Detektionssystem gekoppelt. Es ist sensibler und
spezifischer als alle anderen flüssigkeitschromatographischen Detektoren und dient
der Darstellung und Identifizierung von Substanzen. Die substanzspezifischen
Fragmentierungsmuster lassen Rückschlüsse auf die Strukturformeln der zu
identifizierenden Substanzen zu, denn unter gleichbleibenden Bedingungen zerfällt
ein Molekül immer in die gleichen Fragmente. Das Massenspektrometer erzeugt
nach der Trennung der Substanzen im Flüssigkeitschromatographen einen Strahl
gasförmiger Ionen. Hierfür werden die Substanzmoleküle unter atmosphärischem
Druck in für die Substanz charakteristische Ionen zerlegt und von den Molekülen des
Lösungsmittels getrennt. Die in der Zeiteinheit gebildeten Mengen an Ionen
bezeichnet man als Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt-
ionenstrom (BUDZIKIEWICZ, 1998).
In dieser Studie wurde als Ionisationsverfahren die chemische Ionisation unter
atmosphärischem Druck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation)
verwendet. Dabei wird der aus der HPLC-Säule austretende flüssige Eluent bei einer
Temperatur von 350 bis 550°C in einer evakuierten Verdampfungskammer vernebelt.
An einer Glühkathode werden die gasförmigen Teilchen ionisiert und dem
Massenspektrometer zugeleitet. In dem verwendeten Triple-Quadrupole-
Massenspektrometer werden die Ionen dreimal hintereinander mittels
32 LITERATURÜBERSICHT
Beschleunigung im elektrischen Feld nach Masse und Ladung getrennt und durch
Kollision mit Stickstoffmolekülen in typische Fragmente zersprengt. Andere Ionen
werden aus dem Feld hinaus in die Umgebung abgeleitet, was eine Aufreinigung und
Konzentration der gesuchten Ionen bedeutet. Diese werden schließlich durch einen
Kollektorspalt in einen Detektor geleitet und dort entladen. Die Ströme führen zur
Aufzeichnung des Massenpektrums (BUDZIKIEWICZ, 1998). Dabei gibt das
Massenspektrum alle Ionen eines Substanzgemisches, das „single ion monitoring“
(SIM) hingegen nur das ausgewählte Spektrum eines Ions an.
Vor Beginn dieser Studie stand im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln kein geeignetes Analyseverfahren für Detomidin oder seine
Metaboliten zur Verfügung. Es ist geplant, den analytischen Nachweis von Detomidin
in den Routineuntersuchungen von Pferdedopingproben zu etablieren.
2.6 Pharmakokinetik
Unter Pharmakokinetik versteht man die Lehre von der quantitativen
Auseinandersetzung zwischen Organismus und Pharmakon (GLADTKE u. von
HATTINGBERG, 1977). Als Teilgebiet der Pharmakologie befasst sie sich mit der
Wirkung des Organismus auf den Arzneistoff. Dabei wird die Konzentration einer
Substanz im Körper von den Faktoren Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und
Ausscheidung in Abhängigkeit von der Zeit beeinflusst (KOCH u. RITSCHEL, 1986).
2.6.1 Allgemeine Pharmakokinetik
Als „Dogma der Pharmazie“ bezeichnet, macht das Merkwort „LADME“ (siehe
Abbildung 2) den Weg eines Arzneistoffes im Organismus deutlich (KOCH u.
RITSCHEL, 1986):
LITERATURÜBERSICHT 33
Invasion (Anfluten) Liberation (Freisetzung)
Absorption (Resorption)
Distribution (Verteilung)
Elimination (Abfluten) Metabolismus (Biotransformation)
Exkretion (Ausscheidung)
Abbildung 2: LADME – Das „Dogma der Pharmazie“ nach KOCH und RITSCHEL (1986)
Danach lässt sich der Verlauf einer Arzneimittelkonzentrationskurve in die Invasion
und die Elimination einteilen. Die Anflutung des Arzneimittels beginnt mit der
Liberation, also der Freigabe des Wirkstoffes aus seiner galenischen Arzneiform und
Verteilung in den Körperflüssigkeiten, das heißt Verteilung an den
Resorptionsflächen. Es folgt die Aufnahme des Wirkstoffes durch biologische
Membranen in die Blutbahn oder die Resorption. Im Falle der intravenösen
Applikation entfällt dieser Schritt, da bereits der gesamte Stoff im Blut vorliegt und
verfügbar ist. Die Geschwindigkeit, mit der die Substanz im Blut erscheint, hängt
lediglich von der Applikationsgeschwindigkeit ab. Dadurch kann der Vorgang der
Resorption bei intravenöser Applikation aus den pharmakokinetischen Berechnungen
ausgeklammert werden (GLADTKE u. von HATTINGBERG, 1977). Im Fall einer
nicht-intravasalen Applikation hängt die Resorption von der Liberations-
geschwindigkeit, der Applikationsform und -ort, den physikalisch-chemischen
Eigenschaften und der Stoffkonzentration am Applikationsort ab (KOCH u.
RITSCHEL, 1986). Auch die Distribution, also die weitere Verteilung der Substanz in
den Körperflüssigkeiten, wird von den substanzspezifischen Eigenschaften bestimmt.
Dazu gehören zum Beispiel die Molekülgröße, die Lipidlöslichkeit, der pH-Wert oder
die Bindung an Plasmaproteine. Nur der freie, ungebundene Teil des Wirkstoffes
34 LITERATURÜBERSICHT
kann bis zum Rezeptor und damit dem Ort seiner Wirkung permeieren, während der
an Plasmaproteine oder andere Blutbestandteile gebundene Anteil im Blutplasma
fixiert ist. Die Plasmaproteinbindung ist zwar reversibel, kann jedoch die Aktivität
eines Arzneistoffes deutlich beeinflussen. Weiterhin kann auch eine Bindung an
Gewebsproteine oder im Fettgewebe stattfinden. Diese Ablagerung ist ebenfalls
temporär, kann sich aber verzögernd auf die Ausscheidung, beziehungsweise
verlängernd auf die Arzneimittelwirkung auswirken, weil der Wirkstoff nicht durch die
Ausscheidungsorgane filtriert werden kann. Der Metabolisierung unterliegen alle
chemischen Verbindungen im Körper. Schon beim Durchtritt durch die
Darmschleimhaut und beim ersten Durchgang durch die Leber werden viele
Arzneistoffe in ihrer Struktur verändert und büßen ihre Wirksamkeit teilweise oder
völlig ein (englisch: first-pass-Effekt). Gleichzeitig stellt die Metabolisierung die
Vorbereitung des Pharmakons auf die Exkretion dar. Dabei werden zum Beispiel aus
lipophilen Substanzen gut wasserlösliche gebildet, um eine bessere Ausscheidung
über die Nieren (mit dem Urin) oder die Galle (mit der Faeces) zu erreichen. Die
Exkretion über Sekrete wie Speichel, Milch oder Schweiß, sowie die Ausatmungsluft,
spielt zumeist nur eine untergeordnete Rolle (SCHLINGLOFF, 1997).
Metabolisierung und Exkretion werden unter dem Begriff der Elimination
zusammengefasst, weil beide Vorgänge Voraussetzung für die endgültige
Entfernung von Arzneistoffen und Metaboliten aus dem Körper sind (KOCH u.
RITSCHEL, 1986).
Die Vorgänge der Invasion und der Elimination verlaufen zeitgleich nebeneinander.
Der zeitliche Verlauf der Konzentration eines Wirkstoffes, der durch die oben
genannten komplexen Verteilungs- und Eliminationsvorgänge im Körper beeinflusst
wird, lässt sich mathematisch unter Annahme sogenannter Kompartimente
(imaginäre Verteilungsräume) beschreiben (DYKE u. SAMS, 1994B). Als
Kompartimente bezeichnet man Räume, die kinetisch einheitlich sind, wie zum
Beispiel den Magen-Darm-Trakt, das Blut oder bestimmte Gewebe (DOST, 1968). Es
werden verschiedene Kompartiment-Modelle für die pharmakokinetischen
Berechnungen beschrieben.
LITERATURÜBERSICHT 35
Beim Ein-Kompartiment-Modell wird der gesamte Organismus als zentraler
Verteilungsraum angesehen. Dabei stehen alle Organe und Gewebe mit dem
Blutkreislauf in direktem Gleichgewicht (JOCHHEIM, 2002). Die Verteilung des
Wirkstoffes in einem solchen System erfolgt in einer vernachlässigbaren Zeit und die
Ausscheidung folgt einer Kinetik 1. Ordnung (GLADTKE u. von HATTINGBERG,
1977). Das bedeutet, das konzentrationsabhängig pro Zeiteinheit ein konstanter
prozentualer Anteil der Stoffmenge transportiert wird (exponentieller Verlauf der
Konzentrations-Zeit-Kurve). Aus der Steigung der Geraden sind die Eliminations-
konstanten und die Halbwertszeit zu ermitteln.
Mehr-Kompartiment-Systeme stellen die Vorgänge im Körper anhand von
mindestens zwei Verteilungsräumen dar. Für die meisten Wirkstoffe ist das Zwei-Kompartiment-System für die Beschreibung der Kinetik am Besten geeignet
(BAGGOT, 1978). Dabei verteilt sich der Wirkstoff zuerst in einem zentralen
Kompartiment, womit in der Regel das Plasma oder aufgrund ihrer starken Perfusion
mit dem Blut in Gleichgewicht stehende Gewebe wie Lunge, Leber oder Nieren
gemeint sind (BAGGOT, 1978). Von dort diffundiert das Arzneimittel in periphere
Räume, wie zum Beispiel Haut, Unterhaut, Muskulatur und Fettgewebe (KLOTZ,
1988). Da jedoch die Ausscheidung der Stoffe ausschließlich über das zentrale
Kompartiment stattfindet, erfolgt zeitgleich auch ein Austausch zurück von
peripherem zu zentralem Kompartiment. Stofftransporte in, aus und zwischen den
verschiedenen Kompartimenten werden durch Geschwindigkeitskonstanten
beschrieben. Die Konzentrations-Zeit-Kurve eines Zwei-Kompartiment-Modells zeigt
in halblogarithmischer Darstellung einen biexponentiellen Verlauf. In der initialen
Verteilungsphase fällt die Konzentration im zentralen Kompartiment schnell ab und
geht nach Erreichen des Gleichgewichts in eine lineare Eliminationsphase über, die
durch einen flacheren Verlauf gekennzeichnet ist (DERENDORF et al., 2002).
Nach welchem Modell die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter erfolgt,
hängt von den Messwerten ab. Zeigen diese in halblogarithmischer Darstellung über
einen genügend langen Zeitraum einen monoexponentiellen Verlauf, so ist das Ein-
Kompartiment-Modell anzuwenden. Ist der Verlauf jedoch biexponentiell, findet das
36 LITERATURÜBERSICHT
Zwei-Kompartiment-Modell Anwendung. Dabei sollten mindestens vier Messpunkte
pro Kurvenanteil vorhanden sein (KLOTZ, 1984).
2.6.2 Eliminationskinetische Parameter
Pharmakokinetische Parameter beschreiben den zeitlichen Verlauf eines
Arzneimittels im Organismus. Im Folgenden werden einige Parameter genauer
beschrieben, die im Zuge dieser Arbeit bestimmt wurden.
Als Halbwertszeit (HWZ) wird die Zeit bezeichnet, nach der die Konzentration um
die Hälfte ihres ursprünglichen Wertes abgenommen hat (DERENDORF et al.,
2002). Sie wird aus der Eliminationskonstanten errechnet und ist für jeden Stoff
charakteristisch, unabhängig von der verabreichten Dosis. Sie ist ein wichtiger
Parameter zur Berechnung von Dosierungsintervallen und der Berechnung der
Ausscheidungszeit. Im allgemeinen werden etwa 5 Halbwertszeiten benötigt, um
einen Stoff zu 97 % aus dem Organismus eliminiert zu haben (KAMERLING und
OWENS, 1994).
Das Verteilungsvolumen (Vc) beschreibt als fiktive Größe das Flüssigkeitsvolumen,
das erforderlich wäre, um die gesamte im Körper befindliche Arzneistoffmenge in
gleicher Konzentration zu lösen, in der sie im Blut vorliegt (SCHLINGLOFF, 1997).
Die Clearance (Cl) ist ein hypothetisches Volumen der Kreislaufflüssigkeit, welches
pro Zeiteinheit durch die Funktion eines beziehungsweise aller Ausscheidungs-
organe von einem Arzneistoff befreit wird. Die totale Clearance ist also ein Maß für
die Eliminationsleistung des Organismus. Sie setzt sich additiv aus den
Ausscheidungsraten der einzelnen beteiligten Organe zusammen (SAMS, 1992).
Solange keine Sättigung der Prozesse der Elimination vorliegt, verhält sich die
Clearance dosisunabhängig.
LITERATURÜBERSICHT 37
Unter der Bioverfügbarkeit versteht man den Anteil des Arzneimittels, der
unverändert im Blut zur Verfügung steht. Diese beträgt bei intravasaler Applikation
100 %, während nach zum Beispiel oraler Applikation die Bioverfügbarkeit vermindert
ist, da durch Darm- und Leberpassage nur noch ein Teil der Dosis zur Verfügung
steht (FICHTL et al., 2001). Zur Berechnung der Bioverfügbarkeit wird die Fläche
unter der Plasmakonzentrationskurve (AUC) herangezogen. Zusammen sind die
Bioverfügbarkeit, die maximale Konzentration (Cmax) und der Zeitpunkt der
maximalen Konzentration (tmax) bedeutende Größen, um die Bioäquivalenz einer
Arzneiform zu bestimmen.
38 MATERIAL UND METHODEN
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Versuchsplanung
Zur Untersuchung der Eliminationskinetik von Detomidin im Pferdeblut und -urin
wurde die Substanz einmalig in therapeutischer Dosis (20 µg/kg KM Detomidin-
Hydrochlorid entsprechen 16,76 µg/kg KM Detomidin) intravenös appliziert.
Außerdem wurden Effekte der Substanz auf ausgewählte Kreislauf- und
Atemparameter sowie seine sedative und analgetische Wirksamkeit überprüft.
Die Studie teilte sich in einen Vorversuch und in einen Hauptversuch. Im Vorversuch
erfolgte an Blut- und Urinproben eines Pferdes die Entwicklung und Validierung der
Analysemethode, sowie eine Auswahl der pharmakodynamischen Parameter. Im
Hauptversuch wurde 10 Pferden Detomidinhydrochlorid appliziert. Während der
Dauer der Versuche wurden den Pferden in festgelegten Zeitabständen Blutproben
entnommen. Ebenfalls zeitlich kontrolliert wurde Spontanurin aufgefangen.
Die Plasma– und Urinproben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln aufgearbeitet. Mittels High-Performance-Liquid-
Chromatography/Tandem Mass Spectrometry (HPLC/MS/MS) wurden sie
labortechnisch untersucht und die Ergebnisse pharmakokinetischen Berechnungen
unterzogen. Die Werte der Kreislauf- und Atemparameter sowie der sedativen und
analgetischen Wirkung wurden zusätzlich statistisch ausgewertet.
3.2 Versuchsdurchführung
3.2.1 Versuchstiere
Für die Versuche wurde eine Gruppe von 10 Wallachen im Alter von 3 bis 10 Jahren
verwendet. Es handelte sich dabei um 7 Warmblutpferde und 4 Vollblüter. Ihr
mittleres Gewicht betrug 599 kg. Pferd 1 wurde sowohl im Vorversuch als auch im
Hauptversuch eingesetzt, wobei zwischen diesen Versuchen ein zeitlicher Abstand
MATERIAL UND METHODEN 39
von 8 Monaten lag. Rasse, Alter und Gewicht der einzelnen Tiere sind in Tabelle 3
zusammengefasst.
Pferd 1 Warmblut 7 622Pferd 2 Warmblut 9 618Pferd 3 Warmblut 10 640Pferd 4 Warmblut 7 762Pferd 5 Warmblut 9 658Pferd 6 Warmblut 9 730Pferd 7 Vollblut 8 441Pferd 8 Warmblut 7 552Pferd 9 Vollblut 4 538
Pferd 10 Vollblut 3 540
Pferd Rasse Alter [Jahre]
Gewicht [kg]
Tabelle 3: Rasse, Alter und Gewicht der Versuchstiere
Die Pferde waren im Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft
(FAL) in Mariensee untergebracht. Seit März 2003 befanden sich die Tiere in einem
festen Herdenverband. Die Gruppe wurde in einem Laufstall auf Stroh mit
unbegrenztem Zugang auf ein Paddock sowie täglichem Weidegang gehalten.
Morgens bekamen alle Tiere Hafer und Mineralfutter in Einzelfressständen. Die
Menge der Ration richtete sich nach dem Ernährungs- und Trainingszustand des
einzelnen Tieres. Tagsüber hatten alle Pferde ad libitum Zugang zu Grassilage und
Wasser.
Alle Tiere waren entwurmt und gegen Tetanus, Equines Herpesvirus und Influenza
geimpft. Vor Versuchsbeginn wurden die Pferde einer kurzen klinischen
Allgemeinuntersuchung unterzogen. Zusätzlich wurden der Ernährungszustand, das
Temperament und der klinische Gesamteindruck beurteilt. Alle Tiere waren klinisch
unauffällig.
40 MATERIAL UND METHODEN
Um zu gewährleisten, dass es nicht zu Wechselwirkungen mit anderen
Medikamenten kommt, wurde sichergestellt, dass den Tieren ab 4 Wochen vor
Studienbeginn keine Medikamente mehr verabreicht worden waren. Bei einem Pferd
wurde während des Versuches eine Behandlung aufgrund eines Hufabszesses nötig.
Dafür musste das Tier mit 15 ml Xylazin® und 15 ml Polamivet® sediert werden. Da
die Behandlung aber erst 4 Tage nach der Applikation von Detomidin stattfand, war
ein Einfluss auf die Eliminationskinetik des zu untersuchenden Stoffes nicht zu
erwarten.
3.2.2 Konditionierungsphase und Vorbereitung des Versuches
Im Zuge der Vorbereitung auf die Studie wurden alle Pferde darauf konditioniert, kurz
nach dem Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles Spontanurin abzusetzen.
Dabei macht man sich das Phänomen zunutze, dass Pferde meist spontan „stallen“,
sobald sie sich in mit Stroh eingestreuten Boxen befinden. Um dieses Verhalten zu
verstärken, wurden die Tiere zuerst über mehrere Stunden ausgesperrt, dann in den
Laufstall gelassen und für das Absetzen von Urin gelobt. Im Laufe der
Konditionierung konnten die Intervalle für die Urinabgabe auf bis zu 15 Minuten
verringert werden.
Unmittelbar vor Beginn der Versuche wurde das Gewicht der Tiere mittels einer
Zurich Tru-Test AG 500 Viehwaage (Messbereich bis 2000 kg) ermittelt. Nach der
klinischen Allgemeinuntersuchung wurden den Pferden je eine Braunüle MT® (Firma
Braun, Melsungen) in die linke und rechte Vena jugularis externa gelegt und mit
einem Mandrin Vasofix® (Firma Braun, Melsungen) verschlossen. An der linken
Vordergliedmaße wurden medial und lateral zwei jeweils etwa 2 x 2 cm große Stellen
rasiert und mit Kontaktgel befeuchtet. Zwei Elektroden wurden mit Klebeband daran
befestigt. Die Kabelverbindung führte an der Vordergliedmaße nach oben durch
einen Bauchgurt und wurde dann am Stromgerät zur Überprüfung der Analgesie
angeschlossen.
MATERIAL UND METHODEN 41
Während der Dauer des Versuches wurden die Pferde nur am Strick gehalten, um
ihnen volle Kopffreiheit zur Beurteilung der Kopftiefhaltung zu gewähren.
Durch den Katheter in der linken Vena jugularis wurde vor der Applikation des
Detomidins mittels vier Monovetten® (á 9 ml, Lithium heparinisiert, Firma Sarstedt,
Nümbrecht) eine Blutprobe von 36 ml entnommen. Spontanurin wurde aufgefangen.
Beide Proben dienten als Nullproben.
Nach einer Eingewöhnungszeit von etwa 30 Minuten wurden die Herz- und
Atemfrequenz sowie die Körperinnentemperatur (dreimalig im Abstand von etwa 10
Minuten) bestimmt. Diese Daten gingen als Basiswerte in das Versuchsprotokoll ein.
Es fand ebenfalls eine Einstufung der Reaktion auf einen visuellen und akustischen
Reiz zur späteren Überprüfung des Sedationsgrades (siehe Punkt 3.2.5.5) statt. Die
Empfindlichkeit gegenüber der Anwendung von Strom mittels zwei Elektroden am
Kronsaum wurde ebenfalls in dreifacher Wiederholung gemessen und die erhaltenen
Werte als Basiswerte vermerkt. Abbildung 3 zeigt ein vollständig vorbereitetes Pferd
vor der Applikation.
Abbildung 3: Für den Versuch vorbereitetes Pferd mit vollständig angeschlossener Apparatur
42 MATERIAL UND METHODEN
3.2.2.1 Substanz und Dosierung
Zur Untersuchung der Pharmakokinetik von Detomidin wurde den Versuchstieren
Detomidinhydrochlorid in einer Dosierung von 20 µg pro Kilogramm KM verabreicht.
20 µg Domosedan® (Firma Orion Pharma, Espoo, Finnland, vertrieben durch die
Firma Pfizer, Karlsruhe) entsprechen 16,76 µg Detomidin/kg KM. Die genaue Dosis
für jedes Pferd ist in Tabelle 4 festgehalten.
Pferd 1 12,44 1,20 10,43Pferd 2 12,36 1,20 10,36Pferd 3 12,80 1,30 10,73Pferd 4 15,24 1,50 12,77Pferd 5 13,16 1,30 11,03Pferd 6 14,60 1,50 12,24Pferd 7 8,82 0,90 7,39Pferd 8 11,04 1,10 9,25Pferd 9 10,76 1,10 9,02Pferd 10 10,80 1,10 9,05
Pferd Dosis
Detomidinhydrochlorid [mg/Pferd]
Dosis Detomidinhydrochlorid
[ml/Pferd]
Dosis Detomidin [mg/Pferd]
Tabelle 4: Intravenös verabreichte Dosis von Detomidinhydrochlorid in mg und ml pro Pferd und
entsprechend umgerechnete Menge Detomidin bei den einzelnen Tieren
3.2.3 Applikation des Medikamentes (Vor- und Hauptversuch)
Nach den Vorgaben des EHSLC (2002) erfolgte die Applikation des Arzneimittels
sowohl im Vorversuch als auch im Hauptversuch durch den Venenverweilkatheter in
die rechte Vena jugularis externa.
Die in einer sterilen Einmalspritze aufgezogene Dosis wurde im Vor- und im
Hauptversuch innerhalb von 20 Sekunden langsam durch den Venenverweilkatheter
intravenös gespritzt. Durch zweimalige Aspiration von Blut wurde ein Verbleiben der
Substanz in der Spritze oder im Katheter weitgehend verhindert.
MATERIAL UND METHODEN 43
3.2.4 Erhebung der Messdaten
Um eine Beeinflussung der Werte durch Manipulationen am Pferd gering zu halten,
wurden die Behandlungen und Messungen im Vorversuch und im Hauptversuch
immer in folgender Reihenfolge vorgenommen:
• Blutentnahme
• Messung der Herzfrequenz
• Messung der Atemfrequenz
• Messung der Körperinnentemperatur
• Feststellung des Sedationsgrades durch
1. Überprüfung der Kopfhaltung (Ptosis)
2. Reaktion auf akustischen Reiz
3. Reaktion auf visuellen Reiz
• Überprüfung der Analgesie durch die Reaktion auf Strom
• Auffangen von Urin
3.2.4.1 Abnahme, Verarbeitung und Aufbewahrung der Blutproben
Über den Katheter in der linken Halsseite und ab Stunde 24 mittels Einmalkanülen
wurden den Pferden zu den folgenden Zeitpunkten Blutproben von je 45 ml
entnommen: 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 Minuten sowie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24
und 36 Stunden nach der Applikation von Detomidin. Hierfür wurden Lithium-
heparinisierte Monovetten® benutzt (EHSLC 2002).
44 MATERIAL UND METHODEN
Da die Blutentnahme pro Probe insgesamt etwa 50 Sekunden in Anspruch nahm,
wurde 25 Sekunden vor der genauen Probenentnahmezeit begonnen, so dass die
Gesamtprobe die Konzentration zum exakten Zeitpunkt enthält.
In einem Zeitraum von 2 bis maximal 30 Minuten nach der Entnahme wurden die mit
Vollblut gefüllten Monovetten® bei 2500 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten
zentrifugiert. Die Plasmafraktion wurde in Einmalspritzen (20 ml) mit aufgesetzter
Kanüle gepoolt und nach mehrmaligem Schwenken in je drei Glasröhrchen (8 ml,
Wheaton, Millvill) zu je 6 ml überführt. Um eine Verwechslung der Proben zu jedem
Zeitpunkt zu verhindern, waren die Monovetten® mit dem jeweiligen Pferdenamen
und der Probennummer beschriftet. Die Glasröhrchen zur Aufbewahrung des
Plasmas wurden mit Etiketten gekennzeichnet, die mit Codenummern bedruckt
waren.
Nach der Überführung in die Plasmaröhrchen wurden alle Proben im Kühlschrank bei
8°C vorgekühlt, bevor sie am jeweiligen Versuchsabend in einen Kühlraum mit einer
Temperatur von –20°C verbracht wurden (EHSLC 2002).
3.2.4.2 Herzfrequenz
Die Bestimmung der Herzfrequenz erfolgte durch Auskultation des Herzens an der
linken Brustwand im Bereich des 5. Intercostalraumes. Dazu wurden die Herzschläge
über eine Minute gezählt und der Rhythmus beurteilt. Die Messungen wurden zu
folgenden Zeitpunkten durchgeführt: 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 Minuten; 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 10 und 12 Stunden nach der Applikation von Detomidin.
MATERIAL UND METHODEN 45
3.2.4.3 Atemfrequenz
Die Atemfrequenz wurde durch Adspektion des Abdomens und der Flanken über
jeweils 30 Sekunden hinweg bestimmt. Ebenfalls im Protokoll vermerkt wurden
Atemgeräusche. Die Zeitpunkte der Messungen sind unter 3.2.4.2 aufgeführt.
3.2.4.4 Körpertemperatur
Die Messung der Körpertemperatur erfolgte rektal mit einem digitalen Thermometer
(Medizintechnik GmbH) mit einer Messgenauigkeit von ± 0,1°C. Die Messungen
wurden zu folgenden Zeitpunkten durchgeführt: 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 Minuten; 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 und 12 Stunden nach der Applikation von Detomidin.
3.2.4.5 Feststellung des Sedationsgrades
Der Grad der Sedation der Pferde wurde allein vom Untersucher beurteilt. Bewertet
wurden hierbei die Haltung des Kopfes sowie die Reaktion auf einen akustischen und
auf einen visuellen Reiz. Für die genannten Parameter wurde ein Punkte-
Bewertungsschema ausgearbeitet, das basierend auf der Summe der Punkte der
einzelnen Parameter den Sedationsgrad jedes Pferdes gesamtheitlich möglichst
objektiv beurteilt.
Grad der Kopftiefhaltung (Ptosis) von 0 – 3
Grad der Reaktion auf akustischen Reiz von 0 – 3
Grad der Reaktion auf visuellen Reiz von 0 – 3
Daraus ergibt sich eine Punktsumme von 0 – 9. Diese wurden folgenden
Sedationsgraden zugeteilt:
46 MATERIAL UND METHODEN
0 Punkte = keine Sedation
1 – 3 Punkte = geringgradige Sedation
4 – 6 Punkte = mittelgradige Sedation
7 – 9 Punkte = hochgradige Sedation
Ein nicht sediertes Pferd mit normalen Reaktionen wird demnach immer mit 0
Punkten bewertet; bei einer hochgradigen Sedation ohne Reizantwort ergeben sich
maximal 9 Punkte.
Kopfhöhe
Das Herabsenken des Kopfes (Ptosis) im Verlauf der Zeit nach der Applikation von
Detomidin ist ein Anzeichen für einen zunehmenden Grad der Sedation. Der Grad
der Ptosis wurde im Vor- und Hauptversuch anhand der Tiefe des Kopfes in Relation
zu prominenten Knochenpunkten des jeweiligen Tieres beurteilt. Hierbei wurde als
tiefster Punkt die Unterlippe als Messpunkt ausgewählt.
Die Tiefe des Kopfes wurde wie folgt bewertet:
Grad 0 = Unterlippe oberhalb einer waagerechten Linie vom
Buggelenk des Pferdes ausgehend
Grad 1 = Unterlippe auf der Höhe zwischen Bug- und
Ellenbogengelenk
Grad 2 = Höhe der Unterlippe zwischen Ellenbogen und
Karpalgelenk
Grad 3 = Unterlippe an oder unterhalb des Karpalgelenkes
MATERIAL UND METHODEN 47
Akustischer Reiz
Der Grad der Reaktion auf ein Geräusch wurde im Vorversuch und im Hauptversuch
bestimmt. Dafür wurde ein Rasselgeräusch verwendet, das in circa 1 m Abstand,
hinter dem Körper verdeckt, für 2 Sekunden erzeugt wurde. Um die individuell
unterschiedlichen Reaktionen der einzelnen Pferde zu berücksichtigen, wurde die
Reaktion vor der Applikation als Basiswert im Protokoll vermerkt. Folgendes
Beurteilungsschema wurde verwendet:
Grad 0 = volle, normale Reaktion (Erschrecken und Zurückweichen)
Grad 1 = geringgradig gedämpfte Reaktion (leichtes Heben des Kopfes)
Grad 2 = deutlich gedämpfte Reaktion (nur noch Bewegung der Ohren)
Grad 3 = Reaktion vollständig erloschen
Visueller Reiz
Die Reaktion der Pferde auf visuelle Reize unter dem Einfluss von Detomidin wurde
im Vorversuch und Hauptversuch bestimmt. Dabei wurde eine 50 x 50 cm große,
rote Tüte in circa 50 cm Abstand vor dem Kopf des Pferde einmal hin und
hergeschwenkt. Eine Berührung der Tiere wurde streng vermieden. Individuelle
Reaktionen wie Zurückweichen und Hochreißen des Kopfes wurden wiederum als
Basiswert im Protokoll vermerkt und dasselbe Beurteilungsschema wie für den
akustischen Reiz verwendet.
3.2.4.6 Überprüfung der Analgesie
Um die analgetische Wirkung von Detomidin beim Pferd zu erfassen, wurde eigens
für diesen Versuch ein Reizgenerator (Abbildung 4) in Anlehnung an JÖCHLE und
HAMM (1986) sowie HAMM et al. (1995) entwickelt.
48 MATERIAL UND METHODEN
Abbildung 4: Reizgenerator zu Überprüfung der Analgesie
Funktionsprinzip:
Durch den Vorwiderstand (Rv) wird mit Hilfe einer Diode (D) und einer Zenerdiode
(ZD) eine konstante Spannung (UB) an der Basis des Transistors (Tr) bereitgestellt.
Zenerdioden sind im Bereich um 6 Volt Durchbruchspannung temperaturunabhängig.
Der P-N-Übergang der Diode verhält sich bei Temperaturänderung entsprechend
dem P-N-Übergang der Basis-Emitter-Strecke des Transistors, wodurch die
Stromquelle in weiten Bereichen von der Außentemperatur und einer
Eigenerwärmung unabhängig ist.
Der Transistor verfügt über eine 100 – 200fache Stromverstärkung, das heißt, ein
Basisstrom IB = 1 mA kann einen Kollektorstrom IC ≈ 100 – 200 mA fließen lassen.
Der Emitterstrom (IE) setzt sich aus Basisstrom IB und Kollektorstrom IC zusammen:
IE = IB + IC
Wird der Basisstrom vernachlässigt, so gilt: IE ≈ IC
Der Transistor benötigt eine Basis-Emitterspannung (UB) von circa 0,6 V um leitend
zu werden. Steigt der Strom durch den Emitterwiderstand RE an, so steigt auch die
Spannung am Emitter:
MATERIAL UND METHODEN 49
UE = RE * IE
Die Spannung UB an der Basis ist konstant:
UB = UZD + UD = konst.
UBE = UD ≈ 0,6 V ; UZD = 5,6 V (Zenerdiode)
UB – UBE – UE = 0
UZD + UD – UBE – UE = 0
UZD + 0,6 V – 0,6 V – UE = 0
Bei UE = UZD = 5,6 V stellt sich ein Gleichgewicht ein, bei dem der Strom durch den
Transistor durch den Widerstand RE = UE / IE bestimmt wird. Setzt sich RE aus einer
Serienschaltung eines Festwiderstandes und eines veränderbaren Widerstandes
(Potentiometer) zusammen, lässt sich der Kollektorstrom wie in Abbildung 5
dargestellt justieren:
IE = IC
R (fest)
UE
R (einstellbar)
Abbildung 5: Schaltbild des Reizgenerators zu Überprüfung der Analgesie
50 MATERIAL UND METHODEN
UE = UZ = 5,6 V
IE ≈ IC = 5 mA
Wählt man nun den Festwiderstand mit 1 kΩ ergibt sich für UE = 5,6 V ein Einstell-
bereich von Ic = 5 mA ± 0,6.
Um 10 mA Laststrom zu erhalten, muss man einen Festwiderstand von 470 wählen
und so weiter.
Durchführung der Tests:
An der linken Vordergliedmaße direkt oberhalb des Kronsaumes wurden zwei
Elektroden von 2 x 2 cm mittels eines Klebeverbandes jeweils medial und lateral
befestigt (siehe Abbildung 6). Auf die vorher rasierte, gereinigte und gut getrocknete
wurde Kontaktgel aufgetragen.
Abbildung 6: Sitz der Elektroden am Huf
MATERIAL UND METHODEN 51
Die Kabelverbindung von den Elektroden führte an der Gliedmaße nach oben, wurde
in der Mähne fixiert und über einen Bauchgurt zum Gerät gelegt (siehe Abbildung 3).
Über die beiden Elektroden wurde zu definierten Zeitpunkten ein Stromreiz gesetzt,
dessen Stärke in 5 mA-Stufen erhöht wurde. In jeder Stufe dauerte der Stromfluss 2
Sekunden. Sobald das Pferd eine Reaktion in Form von Abheben der betroffenen
Gliedmaße vom Boden zeigte, wurde die entsprechende Milliamperezahl im Protokoll
festgehalten.
Zur Evaluierung der individuellen Schmerzschwelle wurde vor der Applikation des
Detomidins mittels dreimaliger Messung die kleinste Strommenge bestimmt, die beim
Pferd zum Anheben der Gliedmaße führte. Der arithmetische Mittelwert dieser drei
Messungen wurde als Basiswert im Protokoll vermerkt.
3.2.4.7 Andere Beobachtungen
Zusätzliche Beobachtungen wurden nach ihrem Auftreten im Protokoll vermerkt.
Dazu zählten die Ataxie im Stand, Hängenlassen der Lippen, der Zunge, der
Augenlider, Ausschachten des Penis, Schwitzen, Speicheln sowie Tremor in
einzelnen Muskelgruppen.
3.2.4.8 Gewinnung, Messung und Aufbewahrung von Urinproben
Zu den im Anhang in den Tabellen 39 bis 42 angegebenen Zeitpunkten wurden die
Pferde zur Gewinnung von Spontanurin von der Stallgasse in den Laufstall geführt.
Die genaue Uhrzeit der Probennahme wurde im Versuchsprotokoll notiert.
Urinproben wurden bis zum 7. Tag p. a. gesammelt.
Für das Auffangen des Urins wurde eine Kunststoffhalterung verwendet, die an
einem etwa ein Meter langen Stiel befestigt war und in die für jede Probe ein
Einmalplastikbecher eingesetzt wurde. Dadurch konnte eine Kontamination der
Proben verhindert werden. Direkt anschließend fand die Messung des pH-Wertes
52 MATERIAL UND METHODEN
mittels Universalindikatorstäbchen 0 – 14® (Merck) und die Bestimmung der
Harndichte durch einen Urinprober (Urinometer®, Heiland, Hamburg) statt. Die
Ergebnisse wurden im Protokoll zur Zeit der jeweiligen Probe vermerkt.
Nach Durchmischen durch Schwenken wurden 100 ml der Probe in ein etikettiertes
Kunststoffgefäß überführt und verschlossen. Die Urinbehälter wurden im
Kühlschrank auf 8°C heruntergekühlt und am jeweiligen Versuchsabend in einen
Kühlraum mit –20°C eingelagert.
3.2.4.9 Transport der Plasma- und Urinproben
Der Transport der Plasma- und Urinproben in das Institut für Biochemie in Köln fand
in gefrorenem Zustand statt, wobei eine Temperatur von –15°C nicht überschritten
wurde.
3.3 Analytik
3.3.1 Methodenentwicklung Plasma und Urin
Da für die Untersuchung von Pferdeproben auf Detomidin kein Analyseverfahren zur
Verfügung stand, wurde im Rahmen dieser Studie eine Methode zur quantitativen
Bestimmung von Detomidin in den Matrices Pferdeplasma und -urin entwickelt. Dafür
standen die Proben aus dem Vorversuch zur Verfügung. Die Entwicklung und
Validierung der Methode sowie die Messung der Proben aus dem Vor- und
Hauptversuch erfolgte auf einem HPLC-System. Die Versuche zur
Methodenentwicklung wurden an einem LC-System mit UV-Detektion durchgeführt
(Hewlett Packard HP 1090 Liquid Chromatograph).
Zur Quantifizierung der Proben wurde mit einem HPLC/MS/MS-System (API 2000,
Perkin Elmer Sciex Instruments, gekoppelt mit einem Agilent Series 1100 Liquid
Chromatographen) gearbeitet.
MATERIAL UND METHODEN 53
3.3.1.1 Herstellung der Standardlösungen im Plasma
Für die quantitative Bestimmung wurden Lösungen von Detomidin und Medetomidin
(als interner Standard) benötigt. Als Einwaage für den Referenzstandard von
Detomidin wurde Detomidin-Hydrochlorid verwendet und alle Ausscheidungsproben
mit einem Korrekturfaktor von 0,8362967 multipliziert, da in der Messung durch das
HPLC/MS/MS-System das freie Detomidin (siehe Abbildung 7) angezeigt wird.
Dieser ergibt sich aus dem Verhältnis der Molekülmassen von Detomidin (M =
186,26) zu Detomidin-Hydrochlorid (M = 222,72).
Durch Einwiegen von 10 mg Detomidin-Hydrochlorid in einen 10 ml Messkolben
wurde eine 0,1 %ige Stammlösung in Methanol hergestellt. Durch wiederholte 1:10
Verdünnung mit Methanol entstanden aus der Stammlösung Arbeitslösungen mit
Konzentrationen von 1 µg/ml bis 100 µg/ml.
Für den internen Standard wurde eine 0,1 %ige Lösung (1 mg/ml) des Detomidin-
Derivates Medetomidin (siehe Abbildung 7) in Methanol hergestellt.
Ausgangssubstanz hierfür war die Injektionslösung Domitor® der Firma Pfizer,
Karlsruhe in einer Konzentration von 1 mg/ml. Daraus wurden durch zweifache 1:10
Verdünnungen mit Methanol eine Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 µg/ml
hergestellt.
CH3
CH3
HNN
DetomidinC12H14N2
186.25
CH3
CH3
HNN
CH3
MedetomidinC13H16N2
200.28
Abbildung 7: Struktur- und Summenformel, sowie molare Masse von Detomidin und Medetomidin
54 MATERIAL UND METHODEN
3.3.1.2 Herstellung der Standardlösungen im Urin
Für die quantitative Bestimmung im Urin wurden Lösungen von Detomidin,
Medetomidin, 3-Hydroxydetomidin (siehe Abbildung 8), Carboxydetomidin (siehe
Abbildung 8) und Imidazolylbenzoesäure (IBS, als interner Standard für
Carboxydetomidin, siehe Abbildung 8) benötigt. Die Lösungen von Detomidin und
Medetomidin wurden wie unter 3.3.1.1 beschrieben angefertigt. Aus 1 mg/ml
Stammlösungen des Hydroxy- und Carboxydetomidins wurden durch mehrfache 1:10
Verdünnungen Arbeitslösungen von 100 µg/ml bis 1 µg/ml in Methanol hergestellt.
Für den internen Standard des Carboxydetomidins wurde eine Stammlösung
(1 mg/ml) der strukturverwandten Imidazolylbenzoesäure in H2O, mit Salzsäure
angesäuert, hergestellt. Daraus wurden durch zweifache 1:10 Verdünnungen mit
H2O eine Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 µg/ml hergestellt.
CH3
OH
HNN
Hydroxy-DetomidinC12H14N2O
202.253-alpha-
Hydroxy-detomidin
CH3
O OH
HNN
Carboxy-DetomidinC12H12N2O2
216.233-Nor-3-
carboxy-detomidin
N
N
O OH
4-(1-Imidazolyl)-benzoesäureC10H8N2O2
188.18
Abbildung 8: Struktur- und Summenformel, sowie molare Masse von Hydroxy-, Carboxydetomidin
und Imidazolylbenzoesäure
MATERIAL UND METHODEN 55
3.3.1.3 Variation der Messmethode
Die Messungen am HPLC/UV-System dienten der Optimierung der Bedingungen für
die Identifizierung von Detomidin in der Flüssigkeitschromatographie. Hierzu wurden
unterschiedliche Säulen verwendet. Zum Einsatz kamen die LC-Säule CC125/3
Nucleosil 120-3 C18 (Machery und Nagel), die 5 µm LiChroCART® 250-4 RP-18
encapped Säule (Merck) und die Supercosil® LC-18-DB Säule mit den Maßen 7,5 x
4,6 x 3.
Die Wellenlänge wurde abhängig vom UV-Spektrum des jeweiligen Analyten
zwischen 200 und 280 nm gewählt, wobei Detomidin bei einer Wellenlänge von 210
nm am besten nachzuweisen war.
Als Lösungsmittel wurden zuerst Acetonitril und deionisiertes Wasser benutzt. Dabei
wurde ein Gemisch von 30 % Acetonitril und 70 % Wasser gewählt. Innerhalb von 15
Minuten wurde ein linearer Gradient auf 100 % Acetonitril gefahren. Weitere 3
Minuten wurde das System mit 100 % Acetonitril gespült bevor nach 2 Minuten der
Ausgangsgradient wieder erreicht wurde. Vor jeder Messung erfolgte eine
Equilibrierung des Gerätes über 4 Minuten mit dem Anfangsgradienten. Das
Injektionsvolumen der zu messenden Probenextrakte betrug 25 µl.
Die gewünschten Konzentrationen wurden durch Zusatz der entsprechenden
Volumina aus den Stammlösungen (siehe Punkt 3.3.1.1) in die Proben hergestellt.
Nach dem Einengen der methanolischen Phase am Rotationsvakuumverdampfer
über einem Wasserbad (50°C) wurde der Rückstand in 100 µl deionisiertem Wasser
aufgenommen, in Autosamplervials mit Inlet überführt und zur Messung in den
Autosampler des HPLC-Gerätes gestellt.
Keine der oben erwähnten Säulen erbrachte unter Verwendung der oben
aufgeführten Lösungsmittel eine eindeutige und reproduzierbare Darstellung von
Detomidin, woraufhin eine 3 µm LiChroCart® 55-4 Purpospher® STAR Säule (Merck)
zum Einsatz kam. Als Lösungsmittel wurde anstatt deionisiertem Wasser ein
Ammoniumacetatpuffer verwendet. Das Mischungsverhältnis betrug 95 %
56 MATERIAL UND METHODEN
Ammoniumacetatpuffer und 5 % Acetonitril. Nach 5 Minuten wurde das Verhältnis
auf 10 % Ammoniumacetat-Puffer und 90 % Acetonitril verändert, um nach 7 Minuten
die Ausgangszusammensetzung wieder zu erreichen. Die Veränderung der
Mischungsverhältnisse erfolgte linear. Nach 8 Minuten stoppte die Messung. Der
Lösungsmittelfluss wurde auf 1 ml/Minute eingestellt.
Durch den Wechsel der Säule sowie die Änderung des Lösungsmittels konnten die
Chromatographieeigenschaften von Detomidin verbessert werden. Störende Signale
aus der Biomatrix wurden abgetrennt und nahezu symmetrische Peakformen für
Detomidin erzielt.
3.3.1.4 Variation der Aufarbeitung und Extraktionsmethode
Plasma:
Um eine möglichst gute Ausbeute von Detomidin im Plasma zu erzielen, wurden die
Ergebnisse mehrerer Extraktionsmethoden miteinander verglichen. Zuerst wurde
versucht, Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen an Detomidin und
Medetomidin (als interner Standard) mittels Festphasenextraktion aufzuarbeiten.
Dabei wurden mit 1,5 ml Methanol und 1,5 ml deionisiertem Wasser konditionierte
Kartuschen (Chromabond® C18, Macherey und Nagel) verwendet. Nach Aufgeben
der Probe wurde mit 1,5 ml deionisiertem Wasser gespült. Die darauf folgenden
1,5 ml Methanol wurden in Spitzgläsern aufgefangen und am Rotations-
vakuumverdampfer über dem Wasserbad (50°C) eingeengt. Der Rückstand wurde in
100 µl Ammoniumacetatpuffer gelöst und am HPLC/UV-Gerät gemessen.
Versuche zu Flüssig-Flüssig-Extraktionen sollten zeigen, ob Ether ein geeignetes
organisches Lösungsmittel für die apolaren, basischen Verbindungen Detomidin und
Medetomidin darstellt. Um die Extraktionsausbeute zu optimieren, wurde der pH-
Wert variiert. Dabei wurde Proben auf drei verschiedene pH-Werte (7, 9.6, 14)
eingestellt und die Ausbeuten nach Messung im HPLC/UV miteinander verglichen.
MATERIAL UND METHODEN 57
Im Vergleich Festphasenextraktion zu Flüssig-Flüssig-Extraktion ergab sich für die
Flüssig-Flüssig-Methode ein besseres Extraktionsergebnis, vor allem bei pH 9,6 und
14. Allerdings wiesen die Chromatogramme der Proben bei pH 9,6 ein hohes
Untergrundrauschen auf, was auf endogene Substanzen zurückzuführen ist, die
überwiegend im neutralen bis schwach basischen pH-Bereich mit in die Etherphase
übergehen. Da diese Störsignale im pH-Bereich 14 wesentlich geringer ausfielen,
wurde dieser als optimaler pH-Wert für die Extraktionsmethode angesehen.
Mit diesen Ergebnissen wechselte die Messung der Proben auf eine HPLC/MS/MS,
die auch für die Messung der Hauptversuchsproben vorgesehen war, wobei die
Probenaufarbeitungsprozedur und Chromatographiebedingungen übernommen
wurden.
Urin:
Im Urin wurde eine Extraktionsmethode benötigt, die spezifisch für die Metaboliten
von Detomidin ist, da Detomidin fast vollständig zu zwei Metaboliten verstoffwechselt
wird. Der erste Metabolit (3-Hydroxydetomidin) stellt genau wie Detomidin eine
basische Verbindung dar, die basisch mit tertiärem Buthylmethylether extrahiert
werden könnte. Bei Carboxydetomidin, dem Hauptmetaboliten im Urin des Pferdes,
handelt es sich um eine saure Verbindung, so dass sowohl ein eigener interner
Standard gefunden werden als auch eine spezielle Extraktion erfolgen musste.
Als interne Standards wurden zuerst Furosemid, Ethacrynsäure und Probenecid
herangezogen. Für die Isolierung der sauren Verbindungen wurden Festphasen aus
unterschiedlichen Materialien getestet. Zunächst wurde der Urin über PAD-1-Säulen
(in Methanol gewaschen und in deionisiertem Wasser gelöst) ohne pH-
Werteinstellung aufgereinigt. Nach Aufgabe der entsprechenden Proben auf die
Säulen wurde ein Spülschritt mit deionisiertem Wasser vorgenommen und dann mit
Methanol versucht, die Substanzen von der Säule zu eluieren. Nach Einengung am
Rotationsvakuumverdampfer über dem Wasserbad (50°C) erfolgte die Aufnahme in
58 MATERIAL UND METHODEN
100 µl Ammoniumacetatpuffer und Messung im HPLC/MS/MS. Hierbei konnte keine
der sauren Substanzen detektiert werden. Auch nach Ansäuerung der Proben auf pH
2, 3 und 4 wurde keine Verbesserung der Ausbeute erreicht.
In einem weiteren Versuch kamen 3 ml Oasis® HLB Extraktionskartuschen (Waters,
Deutschland) zum Einsatz. Diese wurden nach einer Konditionierung mit Methanol
und deionisiertem Wasser mit 1 ml der Probenlösung beladen und mit 2 ml 5%igem
Methanol gewaschen. Eine Eluierung mit 4 ml Methanol führte nach Einengung und
Messung im HPLC/MS/MS zu einer guten Wiederfindung von Detomidin,
Medetomidin und 3-Hydroxydetomidin sowie einer geringen Menge
Carboxydetomidin. Furosemid, Ethacrynsäure und Probenicid waren nicht zu
messen. Um die Extraktionsausbeute für Carboxydetomidin zu verbessern, wurden
jetzt 6 ml Oasis® MCX Extraktionskartuschen (Waters, Deutschland) verwendet
(siehe Punkt 3.3.4 .4). Mit Hilfe dieser Ionenaustauschermatrix wurden hohe
Ausbeuten von Detomidin, Medetomidin und 3-Hydroxydetomidin in den ersten
beiden und von Carboxydetomidin im dritten Eluierschritt erzielt.
Furosemid, Ethacrynsäure und Probenecid waren als interner Standard für
Carboxydetomidin ungeeignet, da sie nicht zusammen mit Carboxydetomidin
eluierten. Um einen geeigneten internen Standard für Carboxydetomidin zu
bekommen, begann man am Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule
in Köln mit der Synthese von Carboxymedetomidin. Leider erwies sich diese als sehr
aufwendig, weshalb letztlich auf Imidazolylbenzoesäure zurückgegriffen wurde.
Diese zeigte aufgrund ihrer Strukturverwandtheit ein ähnliches Extraktionsverhalten
wie Carboxydetomidin und konnte ebenfalls im dritten Eluat mittels HPLC/MS/MS
detektiert werden.
Plasma und Urin:
Nach Aufarbeitung aller im Vorversuch genommenen Plasma- und Urinproben eines
Pferdes konnte eine Festlegung bezüglich der Dauer und Frequenz der
MATERIAL UND METHODEN 59
Probenentnahme für den Hauptversuch vorgenommen werden. Nach den
Ergebnissen des Vorversuches wurde die Probennahme für Blut auf 24 Stunden und
die für Urin auf Tag 7 p. a. beschränkt.
Die Voruntersuchungen gaben außerdem Aufschluss über die zu erwartenden Urin-
beziehungsweise Plasmakonzentrationen der einzelnen Analyten.
3.3.2 Validierung der Methode in Plasma und Urin
Unter Validierung versteht man den Nachweis und die Dokumentation der
Zuverlässigkeit einer analytischen Methode. Als ein Arbeitsinstrument der
Qualitätssicherung ist sie Voraussetzung für die quantitative Bestimmung der
Analyten. Zielstellung der Validierung ist letztendlich das Erreichen der notwendigen
Ergebnissicherheit innerhalb des Bestimmungsverfahrens. Voraussetzung für eine
Methodenvalidierung ist das Vorliegen einer bereits optimierten Methode. Im
Folgenden sind die Elemente der Validierung aufgeführt, wobei im Plasma Detomidin
und im Urin Hydroxy- und Carboxydetomidin validiert wurden.
3.3.2.1 Selektivität und Spezifität
Um die Spezifität der Methode für Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und
Carboxydetomidin sowie der internen Standards Medetomidin und
Imidazolylbenzoesäure zu überprüfen, wurden Leerproben mit Proben, denen die
Substanzen zugesetzt waren, verglichen. Dabei wurde überprüft, ob die Analyten
ohne Verfälschung durch Matrixinhaltsstoffe (Spezifität) und ohne gegenseitige
Störungen bei ausreichender Trennung (Selektivität) erfasst werden konnten.
60 MATERIAL UND METHODEN
3.3.2.2 Überprüfung auf Linearität
Die Linearität einer Analysenmethode beschreibt die Proportionalität zwischen den
Messergebnissen und den theoretischen Konzentrationen. Sie gilt für einen
bestimmten Konzentrationsbereich. Durch die Untersuchung der Proben aus dem
Vorversuch konnte der zu erwartende Konzentrationsbereich abgeschätzt werden.
Die Aufarbeitung erfolgte mit Leermatrixproben, die mit unterschiedlichen
Konzentrationen der Analyten dotiert wurden. Dabei war die Abdeckung des
gesamten Messbereiches sowie die Äquidistanz der einzelnen Konzentrationsstufen
zu berücksichtigen. Jede Konzentration wurde doppelt und an drei unterschiedlichen
Tagen aufgearbeitet und gemessen. Die gewählten Konzentrationen für die Matrices
Plasma und Urin sind in Tabelle 5, 6 und 7 aufgeführt:
Matrix Konzentration von Detomidin in ng/ml
Plasma 2.5, 5, 10, 18, 25, 38, 50
Tabelle 5: Konzentration für Detomidin im Plasma zur Bestimmung der Kalibrationskurve
Matrix Konzentration von Hydroxydetomidin in ng/ml
Urin 10, 25, 50, 80, 100, 130, 160
Tabelle 6: Konzentration für 3-Hydroxydetomidin im Urin zur Bestimmung der Kalibrationskurve
Matrix Konzentration von Carboxydetomidin in ng/ml
Urin 50, 130, 250, 500, 800, 1200, 1600
Tabelle 7: Konzentration für Carboxydetomidin im Urin zur Bestimmung der Kalibrationskurve
MATERIAL UND METHODEN 61
Die erhaltenen Peakflächenverhältnisse von Analyt zu internem Standard wurden
gegen die Konzentration der Kalibratoren aufgetragen. Aus diesen Datenpunkten
wurden nach der Methode der kleinsten Abstandsquadrate die Kalibriergeraden
ermittelt und visuell auf Ausreißer und Linearität untersucht. Dabei durfte die aus den
Geraden zurückgerechnete Konzentration (back calculation) höchstens 15 %, die an
der unteren Bestimmungsgrenze (LLQC) höchstens 20 % von der theoretischen
Konzentration der Proben abweichen (EHSLC 2002).
3.3.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection = LOD)
Die Nachweisgrenze beschreibt die niedrigste Konzentration eines Analyten, die
unter den beschriebenen Bedingungen ein vom Leerwert unterscheidbares
Instrumentensignal ergibt. Mit Hilfe der Kalibrationskurvenmethode nach DIN 32645
wird aus den Residuen der linearen Regression zunächst die Rest-
standardabweichung sx0 aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den
Freiheitsgraden der linearen Kalibration f berechnet:
fQ
s xx =0
Mit Hilfe dieser Standardabweichung sx0 und dem Mittelwert X aller
Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null
errechnet werden:
112
,00 ++⋅⋅=x
fx QX
ntsVB α
Der Term tf,α kann aus statistischen Tabellen entnommen errechnet werden:
);(, fTINVt f αα =
62 MATERIAL UND METHODEN
Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden kann die Nachweisgrenze
(NG) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet werden:
α0VB
NG =
3.3.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification = LOQ oder
Sensitivität)
Die Bestimmungsgrenze legt die niedrigste quantitativ bestimmbare Konzentration
einer zu analysierenden Substanz fest, wobei die unter Richtigkeit und Präzision
(siehe Punkt 3.3.2.5 und 3.3.2.6) behandelten Anforderungen gelten. Dabei darf die
Abweichung zwischen den gemittelten Messergebnissen der Konzentration und dem
theoretischen Wert nicht größer als 20 % sein. Zur Bestimmung des LOQ sind im
gewählten Konzentrationsbereich mindestens fünf Proben aufzuarbeiten und zu
quantifizieren.
3.3.2.5 Richtigkeit (Accuracy)
Richtigkeit ist das Maß der Übereinstimmung zwischen dem ermittelten Wert und
einem als richtig angesehenen Wert. Sie hängt von der Größe systematischer Fehler
ab. Ein Beispiel für einen systematischen Fehler wäre eine inkorrekte Einwaage bei
der Herstellung der Stammlösung des Analyten.
Zur Überprüfung der Richtigkeit wurden an drei Tagen jeweils 5 Leermatrixproben
mit einer hohen (HQC = High Quality Control Standard), einer niedrigen (LQC = Low
Quality Control Standard) sowie einer mittleren Kalibrationskonzentration (MQC =
Midrange Quality Control Standard) der Analyten dotiert und quantifiziert. Die
verwendeten Konzentrationen in Plasma und Urin sind Tabelle 8, 9 und 10 zu
entnehmen.
MATERIAL UND METHODEN 63
Matrix Konzentration von Detomidin in ng/ml
Plasma 2.5, 25, 50
Tabelle 8: Konzentrationen von Detomidin im Plasma zur Überprüfung der Richtigkeit
Matrix Konzentration von Hydroxydetomidin in ng/ml
Urin 25, 80, 130
Tabelle 9: Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin im Urin zur Überprüfung der Richtigkeit
Matrix Konzentration von Carboxydetomidin in ng/ml
Urin 50, 500, 1200
Tabelle 10: Konzentrationen von Carboxydetomidin im Urin zur Überprüfung der Richtigkeit
Abweichungen der Ergebnisse vom erwarteten Wert sind bis zu einem gewissen
Maß akzeptabel. Als Grenzen gelten eine Abweichung von 15 % des gemessenen
vom erwarteten Wert im Bereich der hohen und mittleren Kalibrationskonzentration
und eine Abweichung von 20 % bei den niedrigen Konzentrationen (EHSLC 2002).
Zur Ermittlung der relativen Abweichung (= relativer Fehler = RE) des gemessenen
vom erwarteten Wert wird die mittlere berechnete Konzentration (A) aus n = 5 mit der
theoretischen Konzentration (B) nach folgender Formel berechnet (EHSLC 2002):
RE (%) = (A-B)/B x 100
3.3.2.6 Präzision
Präzision ist das Maß für die Streuung von Analysenergebnissen. Als Streuungsmaß
und damit als Präzisionsmaß wird die Standardabweichung s, die relative
Standardabweichung srel, die identisch mit dem Variationskoeffizienten Vk ist,
64 MATERIAL UND METHODEN
bezeichnet. Dabei unterscheidet man Wiederholpräzision sw (Tagespräzision oder
intraday repeatability) und Zwischenpräzision sb (interday reproducibility).
Zur Bestimmung der Präzision werden jeweils 5 HQC-, MQC- und LQC-Proben an 3
unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet und quantifiziert.
Relativ zum gemessenen Mittelwert dürfen die Präzisionen um nicht mehr als 15 %
im Bereich der hohen und mittleren Kalibrationskonzentration beziehungsweise um
nicht mehr als 20 % bei den LQCs abweichen (EHSLC 2002).
HERBOLD und SCHMITT (2000) berechnen die Präzisionen wie folgt:
∑
∑ ⋅=
Tagesserie
TagesserieTagesseriew f
sfs
)( 2
Tage
gesamtTagesserie
b fXX
s ∑ −=
2)(
In den Formeln entspricht f den Freiheitsgraden, X dem Mittelwert und s der
Standardabweichung.
3.3.2.7 Stabilität
Um die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum
des Versuches, der Probenlagerung sowie der Analyse gewährleisten zu können,
wurden jeweils drei Konzentrationen (niedrig, mittel, hoch) durch Zusatz von
Leerplasma- und Leerurinproben mit Arbeitslösungen hergestellt. Am Tag der
Herstellung sowie nach 5 Wochen (Plasma) beziehungsweise nach 8 Wochen (Urin)
wurden jeweils eine Plasma- und Urinprobe der niedrigen, mittleren und hohen
Konzentration aufgearbeitet und zusammen mit einer entsprechenden
Kalibrationskurve quantifiziert. Die Proben werden unter denselben Bedingungen wie
die Proben des Ausscheidungsversuches bei –20°C gelagert.
MATERIAL UND METHODEN 65
In den Tabellen 11, 12 und 13 sind die Konzentrationen der Aliquote für die
Bestimmung der Stabilität aufgeführt:
Matrix Konzentration von Detomidin in ng/ml
Plasma 10, 50, 100
Urin 10, 40, 50
Tabelle 11: Konzentrationen von Detomidin in Plasma und Urin zur Untersuchung der Stabilität
Matrix Konzentration von Hydroxydetomidin in ng/ml
Urin 50, 100, 250
Tabelle 12: Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin im Urin zur Untersuchung der Stabilität
Matrix Konzentration von Carboxydetomidin in ng/ml
Urin 100, 500, 1000
Tabelle 13: Konzentrationen von Carboxydetomidin im Urin zur Untersuchung der Stabilität
3.3.2.8 Wiederfindung (Recovery)
Die Wiederfindungsrate gibt den Prozentsatz der nach der Probenaufarbeitung und
Messung tatsächlich „wiedergefundenen“ Substanzmenge im Vergleich zur
theoretisch vorhandenen Menge an.
In der vorliegenden Studie wurde die Wiederfindung anhand einer mittleren
Konzentration des jeweiligen Analyten ermittelt. Dabei handelte es sich um 25 ng
Detomidin/ml Plasma und Urin, 50 ng 3-Hydroxydetomidin/ml Urin sowie 500 ng
Carboxydetomidin/ml Urin. Insgesamt wurden 12 Plasmaproben und 12 Urinproben
aufgearbeitet.
66 MATERIAL UND METHODEN
Dabei wurde den Proben 1 bis 6 der Analytenstandard in der ausgewählten
Konzentration vor Beginn der Aufarbeitung (siehe Punkt 3.3.4.3 für Plasma und
Punkt 3.3.4.4 für Urin) zugesetzt, während der entsprechende interne Standard erst
nach dem Einengen der Etherphase beziehungsweise des 3. Eluates am
Rotationsvakuumverdampfer hinzugegeben wurde. Um eine möglichst schonende
und verlustfreie Einengung des Methanols aus dem internen Standard zu erreichen,
wurden die Proben für ca. 30 Minuten in einen Exsikkator verbracht. Nach
vollständiger Trocknung wurden die Proben in 100 µl Ammoniumacetatpuffer
angelöst, in ein Autosamplervial überführt und am HPLC/MS/MS gemessen.
Die Plasma- beziehungsweise Urinproben 7 bis 12 wurden wie unter Punkt 3.3.4.3
und Punkt 3.3.4.4 beschrieben aufgearbeitet. Jedoch wurden die Analytenstandards
in der gewählten Konzentration sowie die internen Standards erst nach dem letzten
Aufarbeitungsschritt zum trockenen Probenextrakt hinzugegeben und wiederum im
Exsikkator getrocknet, aufgenommen und gemessen (DIN 17025). Die Berechnung
der Wiederfindung erfolgte nach nachfolgender Formel:
MW (Area d. Analyten/Area d. int. Std.) Proben 1 - 6MW (Area d. Analyten/Area d. int. Std.) Proben 7 - 12Wiederfindung [%] = x 100
3.3.3 Chromatographische Trennung und Detektion von Detomidin und seinen Metaboliten
3.3.3.1 Gerät und Gerätebedingungen
Zur Generierung der Massenspektren von Detomidin, 3-Hydroxydetomidin,
Medetomidin, Carboxydetomidin und Imidazolylbenzoesäure wurden Lösungen in
Ammoniumacetatpuffer hergestellt und mittels direkter Einspritzung auf einem API
2000 Triple-Quadrupole Massenspektrometer (Perkin-Elmer Sciex Instruments)
vermessen. Die Messung der Proben erfolgte durch Flüssigkeitschromatographie
MATERIAL UND METHODEN 67
(Agilent Series 1100 Liquid Chromatograph) und Tandem–Massenspektrometrie
unter folgenden Parametern:
Flüssigkeitschromatograph:
Säule: Li Chro CART® 55 x 4 Purospher® STAR 18e, 3 µm (Merck, Darmstadt)
Eluenten: A = 5 mM Ammoniumacetat in H2O, 0,1%ige Essigsäure
B = Acetonitril
Gradienten: 5 % B → 50 % B in 5 min.,
50 % B→100 % B in 4 min.,
Reinigung mit 100 % B für 1 min.,
Reequilibrierung mit 5 % B für 2 min.
Flussrate d. Gradienten: 1 ml/min.
Injektionsvolumen: 10 µl
Massenspektrometer:
Interface / Ionisierung: Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)
Interface Temperatur: 400°C
Polarität: positiv
Scan-Modus: Multiple Reaction Monitoring (MRM)
Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10e-5 torr aus einem Whatman 75 –
72 K 727 Stickstoffgenerator
Kollisionsenergie: optimiert für jedes Produktion (siehe Tabelle 8)
68 MATERIAL UND METHODEN
In Tabelle 14 sind alle Analyten einschließlich zur Identifizierung ausgewählter
Ionenübergänge mit entsprechender Kollisionsenergie dargestellt.
Analyt Molekular-gewicht
Ionen-übergang
Kollisions-energie [eV]
Detomidin 186 187-81 373-Hydroxydetomidin 202 203-81 30
Medetomidin 200 201-95 35Carboxydetomidin 216 217-144 30
Imidazolylbenzoesäure 188 189-91 30
Tabelle 14: Molekulargewicht, Ionenübergang und Kollisionsenergie für die Substanzen Detomidin,
3-Hydroxydetomidin, Medetomidin, Carboxydetomidin und Imidazolylbenzoesäure
3.3.3.2 Reagenzien und Lösungsmittel
Sämtliche verwendeten Chemikalien sind Tabelle 15 zu entnehmen.
MATERIAL UND METHODEN 69
Reagenzien u. Lösungsmittel Bemerkungen HerstellerAcetonitril HPLC Grade Mallinckrodt Baker, Deventer
Ammoniaklösung 25%, p.a. Merck, DarmstadtAmmoniumacetat p.a. Merck, Darmstadt
2-Butanol p.a. Merck, Darmstadt
deionisiertes Wasser Elix Wasseraufbereitungssystem, Inst. f. Biochemie, DSHS
Detomidin Carboxysäure Farmos Group, Finland
Detomidin-Hydrochlorid European Pharmacopoeia, Strassbourg
Domitor Injektionslösung Pfizer, KarlsruheEssigsäure 100%, p.a. Merck, DarmstadtEthylacetat HPLC Grade Merck, Darmstadt
3-Hydroxydetomidin Farmos Group, Finland
Imidazolylbenzoesäure 97% Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Kaliumdihydrogenphosphat reinst Merck, DarmstadtKaliumdihydroxidplätzchen p.a. Merck, Darmstadt
Methanol destilliert Inst. f. BiochemieNatriumacetat p.a. Merck, Darmstadt
Salzsäure 100%, p.a. Merck, Darmstadt
tertiärer Butylmethylether destilliert KMF Laborchemie Handels GmbH, St. Augustin
Tabelle 15: Zur Aufarbeitung verwendete Chemikalien
3.3.4 Messung der Proben aus dem Hauptversuch
3.3.4.1 Erstellung der Kalibrationskurven im Plasma des Hauptversuches
Für jede Messung von Ausscheidungsproben des Hauptversuches wurde eine
Kalibrationskurve mit 9 Konzentrationen erstellt, wobei der gesamte in den Proben zu
erwartende Konzentrationsbereich abgedeckt wurde (EHSLC 2002). Die gewählten
Konzentrationen, die zugegebene Menge und die verwendeten Arbeitslösungen sind
in Tabelle 16 aufgeführt.
70 MATERIAL UND METHODEN
Konzentration in Zugabe Detomidin verwendete Lösung Eichkurve Detomidin
[ng/ml Plasma] [µl] [µg/ml]0 0 0
2,5 12,5 15 25 1
10 50 125 12,5 1050 25 1075 37,5 10
100 50 10130 62,5 10
Tabelle 16: Konzentrationen, verwendete Lösungen und Volumina zu Erstellung der
Kalibrationskurve von Detomidin im Plasma
Zur Überprüfung der Eichkurve auf ihre Tauglichkeit wurden in derselben
Aufarbeitungsprozedur jeweils 3 Konzentrationen als Qualitätskontrollen (QC)
doppelt aufgearbeitet und über die Kalibrationskurve quantifiziert (siehe Tabelle 17).
Konzentration in Zugabe Detomidin verwendete Lösung Eichkurve Detomidin
[ng/ml Plasma] [ng] [µg/ml]20 100 160 30 1090 45 10
Tabelle 17: Qualitätskontrollen zur Überprüfung der Kalibrationskurve von Detomidin im Plasma
Zu jeder Probe wurden 50 ng Medetomidin (10 ng/ml Plasmaprobe) als interner
Standard zugegeben. Die Medetomidinlösung lag in einer Konzentration von 1 µg/ml
Methanol vor, von der 50 µl zugegeben wurden.
Die Konzentrationsreihen wurde gemäß Punkt 3.3.4.3 aufgearbeitet und gemäß
Punkt 3.3.3.1 gemessen.
MATERIAL UND METHODEN 71
3.3.4.2 Erstellung der Kalibrationskurven im Urin
Mit Urin wurden Kalibrationskurven für Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und
Carboxydetomidin hergestellt. Für Detomidin wurde eine Kurve mit 6
Konzentrationswerten 0, 10, 20, 30, 40 und 50 ng Detomidin/ml Urin erstellt. Die
Konzentrationen wurden in je 5 ml Pferdeurin wie in Tabelle 18 gezeigt hergestellt:
Konzentration Zugabe Detomidin verwendete Lösung Eichkurve Detomidin[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]
0 0 010 50 120 100 130 15 1040 20 1050 25 10
Tabelle 18: Konzentrationen, verwendete Lösungen und Volumina zu Erstellung der
Kalibrationskurve von Detomidin im Urin
Für 3-Hydroxydetomidin wurde eine Kalibrationskurve mit 6 Konzentrationswerten 0,
25, 50, 100, 160, und 200 ng 3-Hydroxydetomidin/ml Urin nach folgendem Prinzip
(Tabelle 19) erstellt.
Konzentration Zugabe Hydroxy- verwendete Lösung Eichkurve Detomidin Hydroxydetomidin[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]
0 0 025 12,5 1050 25 10100 50 10160 80 10200 100 10
Tabelle 19: Konzentrationen, verwendete Lösungen und Volumina zu Erstellung
der Kalibrationskurve von 3-Hydroxydetomidin im Urin
72 MATERIAL UND METHODEN
Zur Überprüfung der Kalibrationskurven wurden in derselben Aufarbeitungsprozedur
zusätzlich jeweils die Konzentrationen 80, 120 und 180 ng 3-Hydroxydetomidin/ml
Urin als Qualitätskontrollen doppelt aufgearbeitet (siehe Tabelle 20).
Konzentration Zugabe Hydroxy- verwandte Lösung QC Detomidin Hydroxydetomidin
[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]80 40 10
120 60 10180 90 10
Tabelle 20: Qualitätskontrollen zur Überprüfung der Kalibrationskurven von 3-Hydroxydetomidin
Zu jeder dieser Proben wurden 50 ng Medetomidin (10 ng/ml Urinprobe) als interner
Standard zugegeben. Die Medetomidinlösung lag in einer Konzentration von 1 µg/ml
Methanol vor, von der 50 µl zugegeben wurden.
Für Carboxydetomidin wurden, wie in Tabelle 21 dargestellt, Kalibrationskurven mit 6
Konzentrationen 0, 50, 150, 500, 1000 und 1600 ng Carboxydetomidin/ml Urin
erstellt.
Konzentration Zugabe Carboxy- verwendete Lösung Eichkurve Detomidin Carboxydetomidin[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]
0 0 050 25 10
150 75 10500 25 100
1000 50 1001600 80 100
Tabelle 21: Konzentrationen, verwendete Lösungen und Volumina zu Erstellung der
Kalibrationskurve von Carboxydetomidin im Urin
Auch hier wurden drei zusätzliche Konzentrationen als Qualitätskontrollen der
Kalibrationskurven zweifach in je 5 ml Pferdeurin aufgearbeitet (siehe Tabelle 22).
MATERIAL UND METHODEN 73
Konzentration Zugabe Carboxy- verwendete Lösung QC Detomidin Carboxydetomidin
[ng/ml Urin] [µl] [µg/ml]100 50 10300 15 100800 40 100
Tabelle 22: Qualitätskontrollen zur Überprüfung der Kalibrationskurven von Carboxydetomidin
Zu jeder Probe Carboxydetomidin wurden 1000 ng Imidazolylbenzoesäure (200
ng/ml Urinprobe) als interner Standard zugegeben. Die Imidazolylbenzoesäurelösung
lag in einer Konzentration von 10 µg/ml deionisiertem Wasser vor, von der 100 µl
zugegeben wurden.
3.3.4.3 Aufarbeitung der Plasmaproben
Alle Plasmaproben des Hauptversuches wurden innerhalb von 7 Tagen nach
Probennahme im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln nach
dem in Abbildung 9 dargestellten Schema aufgearbeitet.
74 MATERIAL UND METHODEN
Probenvorbereitung:
⇓ 5 ml Plasma im Zentrifugenschliffglas
⇓
+ 10 ng Medetomidin pro ml Probe als interner Standard (=50 µl einer methanolischen Lösung, die
1µg/ml Medetomidin enthält)
+ 400 µl 5 M KOH, schütteln (Vortex), mit pH-Papier überprüfen, gegebenenfalls mit KOH (5 M ) auf pH 14
einstellen
+ 5 ml tertiären Butylmethylether mit Stopfen versehen
⇓
20 Minuten schütteln und anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren
⇓ Etherphase mit Pasteurpipette in Spitzglas überführen,
am Rotationsvakuumverdampfer einengen ⇓
Etherphase trocknen, in 100 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex)
in Autosamplervials überführen und in das HPLC/MS-System stellen
Abbildung 9: Aufarbeitungschema für Detomidin im Plasma
3.3.4.4 Aufarbeitung der Urinproben ohne und mit Hydrolyse
Alle Urinproben des Hauptversuches wurden innerhalb von 8 Wochen nach
Probennahme im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln
aufgearbeitet. Da 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin teilweise als
Glucuronide vorliegen, wurden Urinproben auch vergleichend mit und ohne
Hydrolyse aufgearbeitet, um den Anteil an konjugiertem und freiem Detomidin, 3-
Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin erfassen zu können.
MATERIAL UND METHODEN 75
Aufarbeitung ohne Hydrolyse
Die Aufarbeitung des Urins ohne Hydrolyse dient der Messung des unkonjugierten
Anteils von Detomidin, Hydroxy- und Carboxydetomidin und ist in Abbildung 10
dargestellt.
Probenvorbereitung: ⇓
5 ml Urin im Zentrifugenschliffglas ⇓
+ 10 ng Medetomidin pro ml Probe als
basischer interner Standard (= 50 µl einer methanolischen Lösung, die
1 µg/ml Medetomidin enthält)
+ 200 ng Imidazolylbenzoesäure pro ml Probe als saurer interner Standard
(= 100 µl einer wässrigen Lösung, die 10 µg/ml Imidazolylbenzoesäure enthält)
+ 200 µl HCl (6 M) hinzugeben, gegebenenfalls weiter je
50 µl hinzugeben um auf pH 3 einzustellen
⇓
10 Minuten bei 3000 rpm zentrifugieren
Überstand abnehmen, Sediment verwerfen
⇓
Waters Oasis MCX Cartridge mit 2 ml Methanol und 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 3 konditionieren
Urinprobe mit 1,5 ml pro Minute über die Säule laufen
lassen Durchlauf verwerfen
⇓
Abbildung 10: Aufarbeitungsschema von Urin ohne Hydrolyse
76 MATERIAL UND METHODEN
Cartridge mit 1 ml Essigsäure 1M waschen
Durchlauf verwerfen
⇓
Cartridge mit 6 ml Methanol waschen Durchlauf verwerfen
⇓
Cartridge mit 1ml deionisiertem H2O waschen Durchlauf verwerfen
Säulen in Vakuumkammer 2 min trockenziehen
⇓
Gemisch 1:
5 ml Ethylacetat-Ammoniak-Gemisch (97:3) über die Säule laufen lassen und im Zentrifugenschliffglas
auffangen
Am Rotationsvakuumverdampfer oder in der Vakuumzentrifuge einengen
⇓
Gemisch 2:
5 ml Acetonitril-Ammoniak-Gemisch (95:5) über die Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas
auffangen
Am Rotationsvakuumverdampfer oder in der Vakuumzentrifuge einengen
⇓
Gemisch 3:
5 ml Butanol-Ammoniak-Gemisch (90:10) über die Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas
auffangen
Am Rotationsvakuumverdampfer oder in der Vakuumzentrifuge einengen
⇓
weiter Abbildung 10
MATERIAL UND METHODEN 77
Eluat 1, 2 und 3
im o.g. Zentrifugenschliffglas in 100µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex), mit
Glasspritze aufnehmen und in Autosamplervials überführen
weiter Abbildung 10
Aufarbeitung mit Hydrolyse durch ß-Glucoronidase/Arylsulfatase
Die Aufarbeitung des Urins mit Hydrolyse dient der Darstellung des freien und des
konjugierten Detomidins, Hydroxy- und Carboxydetomidins und erfolgte nach dem in
Abbildung 11 dargestelltem Schema:
Probenvorbereitung: ⇓
5 ml Urin im Zentrifugenschliffglas ⇓
+ 10 ng Medetomidin pro ml Probe als
basischer interner Standard (=50 µl einer methanolischen Lösung, die
1 µg/ml Medetomidin enthält)
+ 200 ng Imidazolylbenzoesäure pro ml Probe als saurer interner Standard
(= 100 µl einer wässrigen Lösung, die 10 µg/ml Imidazolylbenzoesäure enthält)
⇓
Abbildung 11: Aufarbeitungsschema von Urin mit Hydrolyse
78 MATERIAL UND METHODEN
+ 400 µl Na-Acetatpuffer,
schütteln (Vortex), mit pH-Papier auf pH 5 überprüfen,
gegebenenfalls mit Eisessig weiter einstellen
+ 50 µl ß-Glucoronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia
schütteln (Vortex)
⇓
2 Stunden bei 50°C ins Wasserbad
abkühlen lassen
⇓
+ 200 µl HCl (6 M) hinzugeben, gegebenenfalls tropfenweise weiter hinzugeben um auf pH 3
einzustellen
⇓
5 Minuten bei 2100 rpm zentrifugieren
⇓
Waters Oasis® Cartridge mit 2 ml MeOH und 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 3 konditionieren
Durchlauf verwerfen
⇓
Urinprobe über die Säule geben und durchlaufen lassen
Durchlauf verwerfen
⇓
Cartridge mit 1 ml Essigsäure 1 M waschen
Durchlauf verwerfen
⇓ weiter Abbildung 11
MATERIAL UND METHODEN 79
Cartridge mit 6 ml Methanol waschen
Durchlauf verwerfen
⇓
Cartridge mit 1ml deionisiertem H2O waschen
Durchlauf verwerfen
⇓
Vakuumkammer ausleeren
Säulen auf Vakuumkammer 2 Minuten trockenziehen
⇓
Gemisch 1:
5 ml Ethylacetat-Ammoniak-Gemisch (97:3) über die Säule laufen lassen und im Zentrifugenschliffglas
auffangen
In der Vakuumzentrifuge für 40 Minuten bei 80°C einengen
⇓
Gemisch 2: 5 ml Acetonitril-Ammoniak-Gemisch (95:5) über die
Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas auffangen
In der Vakuumzentrifuge für 40 Minuten bei 80°C
einengen
⇓
Gemisch 3: 5 ml Butanol-Ammoniak-Gemisch (90:10) über die
Säule laufen lassen und im o.g. Zentrifugenschliffglas auffangen
Am Rotationsverdampfer ohne Wasserbad 60 Minuten
einengen, über Nacht im Exsikkator vollständig trocknen
⇓ weiter Abbildung 11
80 MATERIAL UND METHODEN
Eluat 1, 2 und 3
in 100 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex),
bei Trübung für 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren, in Autosamplervials überführen
für die Messung in das HPLC/MS/MS stellen
weiter Abbildung 11
3.4 Pharmakokinetische Auswertung (Methode und Software)
Alle pharmakokinetischen Auswertungen basieren auf den durch Einfachbestimmung
ermittelten Konzentrationswerten der einzelnen Plasmaproben von Cmax bis zur
Quantifizierungsgrenze. Die Bestimmung der kinetischen Parameter im Plasma
erfolgte mit Hilfe des Computerprogrammes TOPFIT® 2.0 (HEINZEL et al., 1993).
Aufgrund der Anzahl der Messdaten wurde ein Ein-Kompartiment-Modell für die
Berechnung verwendet und folgende Parameter angegeben:
b1 [1/h] = Eliminationskonstante
t50(b1) [h] = Eliminationshalbwertszeit
MRT(tot) [h] = Mean Residue Time (totale Verweildauer eines Moleküls im Organismus)
Cl [ml/min] = totale Clearance
Vc [l] = Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment
AUC [ng/ml*h] = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve
Cmax(gem) [ng/ml] = maximale gemessene Plasmakonzentration
tmax(gem) [ng/ml] = Zeitpunkt der maximalen gemessenen Plasma-konzentration
MATERIAL UND METHODEN 81
Weiterhin dienten die erhaltenen Daten zur Berechnung der effektiven und
irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen nach dem Modell von TOUTAIN und
LASSOURD (2002) und der Bestimmung von Ausscheidungszeiten.
3.5 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm SAS®. Die Daten
für Herzfrequenz, Atemfrequenz und Körpertemperatur, sowie die Ergebnisse der
Kopftiefhaltung, des akustischen, visuellen und des Stromreizes wurden mittels
Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung überprüft.
Für die normalverteilten Parameter wurden die Werte nach Applikation des
Arzneimittels mittels T-Test für verbundene Stichproben gegen den jeweiligen
Basiswert (dreifach gemessen zum Zeitpunkt p0) verglichen und auf Signifikanz
überprüft.
Die nicht normalverteilten Parameter wurden mittels Signed-Rank-Test gegen den
p0-Wert verglichen und auf Signifikanz überprüft.
Die Signifikanzschwelle sämtlicher statistischer Tests wurde auf p ≤ 0,01 festgelegt.
82 ERGEBNISSE
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100% 81.2
187.2
119.2
91.1 117.2
m/z
Rel
ativ
e In
tens
ität
N N
CH2m/z 81
4 ERGEBNISSE
4.1 Massenspektren und Strukturformeln der zu analysierenden Substanzen und der internen Standards
Nachfolgend sind die Massenspektren und Strukturformeln einschließlich der
Fragmentation der einzelnen Analyten Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und
Carboxydetomidin aufgeführt. Die als interne Standards verwendeten Substanzen
Medetomidin und Imidazolylbenzoesäure werden mit ihren Strukturformeln
dargestellt.
4.1.1 Detomidin
Unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-Bedingungen lag die Retentionszeit
von Detomidin bei 4,1 Minuten. Das Massenspektrum in Abbildung 12 zeigt das
typische Fragmentierungsverhalten von Detomidin mit charakteristischen Ionen bei
m/z 187,2 und 81,2 sowie die Strukturformel von Detomidin.
Abbildung 12: ESI-Produktionenspektrum des Detomidins (Molekülmasse = 186)
ERGEBNISSE 83
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Rel
ativ
e In
tens
ität
185.3
81.2 170.2203.3173.2158.3143.2117.2 183.2141.1
N N
CH2
OH
m/z 81
4.1.2 3-Hydroxydetomidin
Unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-Bedingungen lag die Retentionszeit
von 3-Hydroxydetomidin bei 2,6 Minuten. Es wird mit den charakteristischen Ionen
bei m/z 203,3 und 81,2 registriert. Abbildung 13 zeigt das Massenspektrum und die
Strukturformel.
Abbildung 13: ESI-Produktionenspektrum des 3-Hydroxydetomidins (Molekülmasse = 202)
4.1.3 Medetomidin
Das als interner Standard verwendete Medetomidin zeigt unter den in Kapitel 3.3.3.1
angegebenen HPLC-Bedingungen eine Retentionszeit von 4,4 Minuten und wird mit
den charakteristischen Ionen m/z 201,0 und 95,0 aufgezeichnet. Abbildung 14 zeigt
die Strukturformel von Medetomidin. Es diente als interner Standard in der Methode
für Detomidin im Plasma und 3-Hydroxydetomidin im Urin.
84 ERGEBNISSE
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
81.1
199.1
144.0217.1
103.2 171.0111.0 154.9
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
m/z
Rel
ativ
e In
tens
ität
N N
CH2
COOH
m/z 81
CH3
CH3
HNN
CH3
MedetomidinC13H16N2
200.28
Abbildung 14: Strukturformel von Medetomidin mit Summenformel und Molekülmasse
4.1.4 Carboxydetomidin
Carboxydetomidin zeigt unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-
Bedingungen eine Retentionszeit von 1,8 Minuten und wird mit den
charakteristischen Ionen m/z 217,1 und 144,0 aufgezeichnet. Abbildung 15 zeigt das
Massenspektrum von Carboxydetomidin mit Strukturformel.
Abbildung 15: ESI-Produktionenspektrum des Carboxydetomidins (Molekülmasse 216)
ERGEBNISSE 85
4.1.5 Imidazolylbenzoesäure
Imidazolylbenzoesäure diente als interner Standard in der Methode für
Carboxydetomidin im Urin. Unter den in Kapitel 3.3.3.1 angegebenen HPLC-
Bedingungen lag die Retentionszeit von Imidazolylbenzoesäure bei 1,3 Minuten.
Abbildung 16 zeigt die Strukturformel von Imidazolylbenzoesäure. Sie wurde mit den
charakterisitschen Ionen m/z 189,0 und 91,0 aufgezeichnet.
N
N
O OH
4-(1-Imidazolyl)-benzoesäureC10H8N2O2
188.18
Abbildung 16: Strukturformel von Imidazolylbenzoesäure mit Summenformel und Molekülmasse
4.2 Ergebnisse der Validierung
4.2.1 Selektivität und Spezifität
Um die Spezifität der Methode für Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und
Carboxydetomidin sowie für die internen Standards Medetomidin und
Imidazolylbenzoesäure zu überprüfen, wurden Plasma- und Urinproben, denen die
Substanzen zugesetzt waren, untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass die
Analyten ohne Verfälschung durch Matrixinhaltsstoffe (Spezifität) und ohne
gegenseitige Störungen bei ausreichender Trennung (Selektivität) erfasst werden.
86 ERGEBNISSE
Unter den Messbedingungen waren die Retentionszeiten über den gesamten Verlauf
der Studie in einer Schwankungsbreite von ≤ 2 % konstant.
Abbildung 17 und 18 zeigen Ausschnitte aus Chromatogrammen zum Zeitpunkt der
Retentionszeit von Detomidin (als Beispiel einer Substanz im Plasma) bei 4,1
Minuten sowie zur Retentionszeit von Carboxydetomidin (als Beispiel einer Substanz
im Urin) bei 1,4 Minuten und Leerwertmatrixproben im Vergleich.
Abbildung 17: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Plasmaproben zur Retentionszeit von 4,1
Minuten, denen kein Detomidin, 2,5 ng Detomidin/ml und 50 ng Detomidin/ml
zugegeben wurden (von l. nach r.)
Abbildung 18: PLC/MS/MS-Chromatogramme von Urinproben zur Retentionszeit von 1,4 Minuten,
denen kein Carboxydetomidin, 50 ng Carboxydetomidin/ml und 1200 ng
Carboxydetomidin/ml zugegeben wurden (von l. nach r.)
ERGEBNISSE 87
4.2.2 Überprüfung auf Linearität
Plasma
Die Linearität der Kalibrationskurven für Detomidin im Plasma wurde im
Konzentrationsbereich von 2,5 bis 50 ng/ml an verschiedenen Tagen überprüft und
festgestellt. Dabei wurde die erwartete Konzentration des Analyten gegen den
Quotienten der Peakflächen von Detomidin zu internem Standard (Medetomidin)
aufgetragen. Die Funktion wurde mit linearer Regression errechnet. Abbildung 19
zeigt beispielhaft eine Kalibrationskurve, die Kalibrationsgleichung und den
Korrelationskoeffizienten (Bestimmtheitsmaß = R2) eines Messtages. Die Ab-
weichungen der gemessenen von der erwarteten Konzentration betrugen an allen
Messtagen im Durchschnitt weniger als 15 %, im Bereich der Quantifizierungsgrenze
weniger als 20 %. Das Bestimmtheitsmaß der linearen Regression (R2) lag bei allen
Kalibrationskurven oberhalb von 0.995.
y = 0,1304x - 0,0622R2 = 0,9984
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50Detomidin-Hydrochlorid [ng/ml Plasma]
Quo
tient
[187
/201
]
Abbildung 19: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient zur Überprüfung
der Linearität für Detomidin im Plasma, ermittelt mit 2 Messungen pro
Kalibrationskonzentration
88 ERGEBNISSE
Urin
Die Linearität der Kalibrationskurven für 3-Hydroxydetomidin im Urin wurde im
Konzentrationsbereich von 10 bis 160 ng/ml und die von Carboxydetomidin im
Bereich von 50 bis 1600 ng/ml Urin an Kalibrationskurven an verschiedenen Tagen
überprüft und festgestellt. Dabei wurde die erwartete Konzentration der Analyten
gegen den Quotienten der Peakflächen von 3-Hydroxydetomidin und
Carboxydetomidin zu internem Standard (Medetomidin beziehungsweise
Imidazolylbenzoesäure) aufgetragen. Die Funktion wurde mit linearer Regression
errechnet.
Abbildung 20 und 21 zeigen beispielhaft eine Kalibrationskurve, die Kalibrations-
gleichung und den Korrelationskoeffizienten von Hydroxy- und Carboxydetomidin
eines Messtages. Die Abweichungen der gemessenen von der erwarteten
Konzentration betrugen an allen Messtagen im Durchschnitt weniger als 15 %, im
Bereich der Quantifizierungsgrenze weniger als 20 %. Das Bestimmtheits-maß (R2)
der Regression lag bei allen Kalibrationskurven von 3-Hydroxydetomidin oberhalb
von 0.993, bei denen von Carboxydetomidin oberhalb von 0.996.
ERGEBNISSE 89
y = 0,0834x + 0,3278R2 = 0,9954
0
2
4
6
8
10
12
14
0 40 80 120 160Hydroxydetomidin [ng/ml Urin]
Quo
tient
[203
/201
]
Abbildung 20: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient zur Überprüfung
der Linearität für 3-Hydroxydetomidin im Urin, ermittelt mit 2 Messungen pro
Kalibrationskonzentration
y = 0,0032x + 0,0164R2 = 0,9976
0
1
2
3
4
5
6
0 400 800 1200 1600Carboxydetomidin [ng/ml Urin]
Quo
tient
[217
/188
]
Abbildung 21: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient zur Überprüfung
der Linearität für Carboxydetomidin im Urin; ermittelt mit 2 Messungen pro
Kalibrationskonzentration
90 ERGEBNISSE
4.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD)
Plasma
Die Nachweisgrenze von Detomidin im Plasma wurde wie unter Punkt 3.3.2.3
beschrieben ermittelt. Sie liegt bei der in der Studie verwendeten Methode bei
1,67 ng/ml Plasma.
Urin
Die Nachweisgrenze von 3-Hydroxydetomidin im Urin beträgt bei der in der Studie
verwendeten Methode 10 ng/ml. Für Carboxydetomidin wurde eine Nachweisgrenze
von 50 ng/ml Urin ermittelt.
4.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ)
Plasma
Aufgrund der Ergebnisse von Präzision und Richtigkeit wurde die
Bestimmungsgrenze für Detomidin im Plasma in der angewandten Methode auf
2,09 ng/ml festgelegt.
Urin
Aufgrund der Ergebnisse von Präzision und Richtigkeit wurde die
Bestimmungsgrenze für 3-Hydroxydetomidin im Urin auf 10 ng/ml und für
Carboxydetomidin auf 50 ng/ml festgelegt.
ERGEBNISSE 91
4.2.5 Richtigkeit (Accuracy)
Plasma
Die Ergebnisse zur Überprüfung der Richtigkeit der Analysemethode im Plasma sind
in Tabelle 23 angegeben. Dabei wurden jeweils die relative Abweichung (RE in %)
der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages von den erwarteten
Konzentrationen bestimmt. Alle Ergebnisse liegen unterhalb der vorgegebenen
maximalen Abweichung von 15 %, beziehungsweise unterhalb 20 % an der Quanti-
fizierungsgrenze.
Tag
Erwartete Konzentration
Detomidin-Hydrochlorid
[ng/ml]
Erwartete Konzentration
Detomidin [ng/ml]
Anzahl der
Proben
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen Detomidin
[ng/ml]
Relative Abweichung
RE [%]
2,5 2,09 5 2,03 2,9225 20,91 5 20,81 0,4650 41,82 5 40,67 2,742,5 2,09 5 1,78 14,8425 20,91 5 20,88 0,1350 41,82 5 44,53 6,502,5 2,09 5 2,18 4,4025 20,91 5 19,95 4,5550 41,82 5 42,25 1,05
2
3
1
Tabelle 23: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit der Methode für Detomidin
im Plasma
Urin
Die Ergebnisse zur Überprüfung der Richtigkeit im Urin sind in den Tabellen 24 und
25 angegeben. Auch hier wurden jeweils die relative Abweichung (RE in %) der
Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages von den erwarteten
Konzentrationen bestimmt. Alle Ergebnisse bis auf eines liegen unterhalb der
92 ERGEBNISSE
vorgegebenen maximalen Abweichung von 15 % beziehungsweise maximal 20 % an
der Quantifizierungsgrenze.
TagErwartete
Konzentration [ng/ml]
Anzahl der Proben
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen [ng/ml]
Relative Abweichung
RE [%]
25 5 22,58 9,6780 5 85,11 6,39
130 5 123,65 4,8825 5 25,85 3,4080 5 85,30 6,63
130 5 137,13 14,2825 5 26,21 4,8480 5 80,99 1,24
130 5 130,89 0,69
1
2
3
Tabelle 24: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit der Methode für
3-Hydroxydetomidin im Urin
TagErwartete
Konzentration [ng/ml]
Anzahl der Proben
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen [ng/ml]
Relative Abweichung
RE [%]
50 5 51,36 2,72500 5 522,68 4,54
1200 5 1298,78 8,2350 5 50,53 1,06
500 5 590,24 18,051200 5 1272,21 6,02
50 5 50,80 1,60500 5 529,68 5,94
1200 5 1296,25 8,02
1
2
3
Tabelle 25: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit der Methode für
Carboxydetomidin im Urin
4.2.6 Präzision
ERGEBNISSE 93
Plasma
Die Ergebnisse zur Bestimmung der Präzision der Methode für Plasma sind Tabelle
26 zu entnehmen. Die Wiederholpräzision und die Zwischenpräzision wurden wie
unter Punkt 3.3.2.6 beschrieben ermittelt. Die Werte liegen unterhalb der
vorgeschriebenen Abweichungen von nicht mehr als 15 %, an der Quantifi-
zierungsgrenze nicht mehr als 20 %, vom gemessenen Mittelwert.
Erwartete Konzentration
[ng/ml]
Wiederholpräzision [%]
Zwischenpräzision [%]
2,5 3,99 10,16
25 5,15 2,5
50 5,01 4,57
Tabelle 36: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für Plasma
Urin
Die Ergebnisse zur Bestimmung der Präzision der Methode für Urin sind den
Tabellen 27 und 28 zu entnehmen. Die Wiederholpräzision und die Zwischen-
präzision wurden wie unter Punkt 3.3.2.6 beschrieben ermittelt. Die Werte liegen
unterhalb der vorgeschriebenen Abweichungen von nicht mehr als 15 %, an der
Quantifizierungsgrenze nicht mehr als 20 %, vom gemessenen Mittelwert.
Erwartete Konzentration [ng/ml]
Wiederholpräzision [%]
Zwischenpräzision [%]
25 9,57 8,03
80 8,85 2,91
120 6,81 5,17
Tabelle 27: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für 3-Hydroxydetomidin im Urin
94 ERGEBNISSE
Erwartete Konzentration [ng/ml]
Wiederholpräzision [%]
Zwischenpräzision [%]
50 13,93 0,84
500 7,46 6,79
1200 4,50 1,14
Tabelle 28: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für Carboxydetomidin im Urin
4.2.7 Stabilität
Plasma
Am Tag der Herstellung sowie nach 5 Wochen wurden Plasmaproben, denen
Detomidin jeweils in einer niedrigen, einer mittleren und einer hohen Konzentration
zugegeben worden war, aufgearbeitet und zusammen mit einer entsprechenden
Kalibrationskurve quantifiziert. Die Ergebnisse sind Tabelle 29 zu entnehmen.
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
10 10,22 2,21 9,01 9,92
50 45,89 8,22 48,74 2,52
100 97,37 2,63 92,64 7,36
Woche 5Woche 0erwartete
Konzentration [ng/ml]
Tabelle 29: Stabilitätsdaten für Detomidin im Plasma in Woche 0 und Woche 5
Urin
Am Tag der Herstellung sowie nach 8 Wochen wurde Urinproben, denen Detomidin,
Hydroxy- beziehungsweise Carboxydetomidin jeweils in einer niedrigen, einer
mittleren und einer hohen Konzentration zugegeben worden war, aufgearbeitet und
zusammen mit einer entsprechenden Kalibrationskurve quantifiziert. Die Tabellen 30,
ERGEBNISSE 95
31 und 32 zeigen die Ergebnisse des Stabilitätstests für Detomidin, 3-
Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin.
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
10 10,91 9,15 10,77 7,67
40 36,74 8,16 43,08 7,69
50 47,17 5,66 55,14 10,29
erwartete Konzentration
[ng/ml]
Woche 0 Woche 8
Tabelle 30: Stabilitätsdaten für Detomidin im Urin in Woche 0 und Woche 8
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
50 52,17 4,35 47,94 4,11
100 95,13 4,87 107,11 7,11
250 265,65 6,26 246,08 1,57
erwartete Konzentration
[ng/ml]
Woche 0 Woche 8
Tabelle 31: Stabilitätsdaten für 3-Hydroxydetomidin im Urin in Woche 0 und Woche 8
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
gemessene Konzentration
[ng/ml]Abweichung [%]
100 104,45 4,45 85,69 14,31
500 507,8 1,56 622,47 24,49
1000 966,02 3,4 1044,35 4,44
erwartete Konzentration
[ng/ml]
Woche 0 Woche 8
Tabelle 32: Stabilitätsdaten für Carboxydetomidin im Urin in Woche 0 und Woche 8
4.2.8 Wiederfindung (Recovery)
96 ERGEBNISSE
Die Wiederfindungsrate von Detomidin im Plasma beziehungsweise Urin und von
Hydroxy-, sowie Carboxydetomidin im Urin sind in Tabelle 33 dargestellt.
Matrix Substanz Anzahl der Proben
Mittlere Wiederfindungsrate
[%]
Standard-abweichung [%]
Variations-koeffizient [%]
Plasma Detomidin 6 49,41 7,86 15,87
Detomidin 6 69,49 5,59 8,04
Hydroxy-detomidin 6 63,74 8,83 13,78
Carboxy-detomidin 6 63,44 10,96 17,08
Urin
Tabelle 33: Wiederfindungsrate für Detomidin in Plasma und Urin sowie Hydroxy- und Carboxy-
detomidin im Urin
4.3 Ergebnisse des Hauptversuchs
4.3.1 Konzentration von Detomidin im Plasma
Abbildung 22 zeigt den Konzentrationsverlauf von Detomidin im Plasma nach
einmaliger intravenöser Gabe von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei allen 10
Versuchspferden. Die Quantifizierung erfolgte jeweils anhand einer tagesaktuellen
Kalibrationskurve. Die rote Querlinie stellt die Bestimmungsgrenze (LOQ) von 2,09
ng/ml Plasma dar. Die Ausschnittsgraphik verdeutlicht den Konzentrationsverlauf in
den ersten 30 Minuten. Nach einer Stunde ist die Konzentration von Detomidin
bereits fast bis in den Bereich der Quantifizierungsgrenze abgesunken. Nach 3
Stunden lagen die Konzentrationen bei allen Pferden unterhalb der Nachweisgrenze.
Die bei den einzelnen Pferden gemessenen Konzentrationen zu den jeweiligen
Messzeitpunkten sind im Anhang in Tabelle 38 dargestellt.
ERGEBNISSE 97
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l Pla
sma]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10LOQ
Abbildung 22: Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden
Maximale Plasmakonzentrationen werden während der ersten beiden
Messzeitpunkte (2 und 5 Minuten p. a.) gemessen und liegen zwischen 12 und 35
ng/ml Plasma. Auffällig hierbei ist, dass bei fünf Pferden die maximale individuelle
Konzentration nach 2 Minuten, bei den anderen Pferden aber erst nach 5 Minuten
erreicht ist.
Zur übersichtlicheren Darstellung dieses Ergebnisses zeigen die Abbildungen 23 und
24 die Plasmakonzentrationsverläufe der Pferde getrennt nach dem Zeitpunkt der
maximalen Konzentration von Detomidin. Auch hier verdeutlichen die Ausschnitte die
Konzentrationsverläufe in den ersten 30 Minuten nach der Applikation des
Arzneistoffes.
05
10152025303540
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
98 ERGEBNISSE
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l Pla
sma]
Pferd 4
Pferd 5Pferd 6
Pferd 8Pferd 10
LOQ
Abbildung 23: Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 5 Pferden mit maximaler Plasma-
konzentration 2 Minuten p.a.
05
10152025303540
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
ERGEBNISSE 99
0
5
10
15
20
25
30
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l Pla
sma]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 7Pferd 9LOQ
Abbildung 24: Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 5 Pferden mit maximaler Plasma-
konzentration 5 Minuten p.a.
Abbildung 25 zeigt zusätzlich den Plasmakonzentrationsverlauf aller Pferde in
halblogarithmischer Darstellung.
0
5
10
15
20
25
30
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
100 ERGEBNISSE
1
10
100
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10LOQ
Abbildung 25: Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg Körpermasse bei 10 Pferden in halb-
logarithmischer Darstellung
4.3.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma
Aufgrund des monoexponentiellen Verlaufs erfolgte die pharmakokinetische
Berechnung mit dem Ein-Kompartiment-Modell. Die Daten der pharmakokinetischen
Berechnung für Detomidin im Plasma sind in Tabelle 34 aufgeführt. Die Berechnung
erfolgte mit den Konzentrationswerten von Cmax bis zur Quantifizierungsgrenze.
In Tabelle 34 ist jeweils der niedrigste und höchste erreichte Wert durch Fettdruck
gekennzeichnet.
ERGEBNISSE 101
Parameter Einheit Pferd 1
Pferd 2
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Pferd 9
Pferd 10
b1 [1/h] 2,10 2,20 2,59 1,79 2,22 1,89 2,14 2,79 2,79 2,83t50 (b1) [h] 0,33 0,32 0,27 0,39 0,31 0,37 0,32 0,25 0,25 0,25MRT(tot) [h] 0,52 0,49 0,43 0,59 0,47 0,55 0,51 0,37 0,39 0,37
Vc [l/kg] 0,78 0,83 0,55 0,78 0,62 0,78 0,83 0,72 0,66 0,46Clearance [ml/min] 27,20 30,40 23,90 23,20 22,90 24,70 29,60 33,50 30,60 21,80
AUC [ng/ml*h] 10,30 9,19 11,70 12,10 12,20 11,30 9,44 8,33 9,13 12,80Cmaxgem [ng/ml] 20 18 28 22 27 22 18 22 22 35Tmaxgem [min] 5 5 5 2 2 2 5 2 5 2
Tabelle 34: Pharmakokinetische Daten nach einmaliger Applikation von 20 µg/kg Detomidin-
Hydrochlorid bei 10 Pferden (der niedrigste und der höchste Wert sind jeweils durch
Fettdruck hervorgehoben)
Erläuterungen zu den Abkürzungen in Tabelle 34 und 35
b1 Eliminationskonstante
t50 (b1) Halbwertszeit für die Eliminationsphase
MRT mittlere Verweildauer
Vc Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment
Clearance Plasmamenge, die pro Minute von Detomidin befreit wird
AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve
Cmaxgem maximale gemessene Plasmakonzentration
Tmaxgem gemessenerZeitpunkt der maximalen Plasmakonzentration
In Tabelle 35 sind die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnung für
Detomidin im Plasma als Mittelwert, Standardabweichung und der
Variationskoeffizient angegeben.
102 ERGEBNISSE
Parameter Einheit Mittelwert [n=10]
Standard-abweichung
Variations-koeffizient
b1 [1/h] 2,33 0,39 16,56
t50 (b1) [h] 0,30 0,05 16,71
MRT(tot) [h] 0,47 0,08 16,39
Vc [l/kg] 0,70 0,12 17,77
Clearance [ml/min] 26,78 4,03 15,05
AUC [ng/ml*h] 10,65 1,57 14,70
Cmaxgem [ng/ml] 23,40 5,23 22,36
Tmaxgem [min] 3,50 1,58 45,18
Tabelle 35: Pharmakokinetische Daten nach einmaliger Applikation von 20 µg/kg Detomidin-
Hydrochlorid bei 10 Pferden mit Darstellung von Mittelwert, Standardabweichung und
Korrelationskoeffizient (Erläuterungen zu den Abkürzungen siehe Tabelle 34)
4.3.3 Detomidin im Urin
Bereits im Vorversuch wurde deutlich, dass Detomidin nicht oder nur in nicht
quantifizierbaren Mengen im Urin des Pferdes messbar ist. Auf Grund dessen wurde
auf eine Validierung der Methode für Detomidin im Urin verzichtet. Während des
Hauptversuches wiesen nur frühe Urinproben gelegentlich Spuren von Detomidin
auf. Diese Mengen waren nicht quantifizierbar.
4.3.4 3-Hydroxydetomidin im Urin
Abbildung 26 stellt den Konzentrationsverlauf von 3-Hydroxydetomidin im Urin bis 50
Stunden nach der einmaligen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM
dar. Der Ausschnitt verdeutlicht den Verlauf der Konzentrationskurven in den ersten
25 Stunden. Die rote Querlinie stellt die Quantifizierungsgrenze von 10 ng/ml dar.
ERGEBNISSE 103
0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l Urin
]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10LOQ
Abbildung 26: Konzentrationsverlauf von 3-Hydroxydetomidin im Urin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden (Auf-
arbeitung mit Hydrolyse)
Die maximalen Konzentrationen liegen zwischen 31 und 130 ng/ml Urin und werden
zwischen der dritten beziehungsweise sechsten Stunde p. a. erreicht. Bis zur 12.
Stunde zeigte sich bei allen Pferden ein rascher Abfall der Konzentration. Bei Pferd 1
und 2 ist bereits nach 12 Stunden kein 3-Hydroxydetomidin mehr im Urin
detektierbar. Nach 24 Stunden liegen die Konzentrationen bei allen Pferden im
Bereich der Quantifizierungsgrenze.
Abbildung 27 zeigt die Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin in kumulativer
Darstellung über einen Zeitraum von 48 Stunden.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20 25
104 ERGEBNISSE
0
100
200
300
400
500
0 10 20 30 40Zeit [h]
Men
ge H
ydro
xyde
tom
idin
[µg]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10
Abbildung 27: Kumulative Darstellung der im Urin ausgeschiedenen Menge 3-Hydroxydetomidin
nach einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM
bis 48 Stunden p. a.
Die Einzelwerte sind für jedes Pferd im Anhang in den Tabellen 43 und 44
aufgeführt.
4.3.4.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergleichend
Abbildung 28 zeigt die Konzentration von 3-Hydroxydetomidin im Urin nach
Aufarbeitung mit ohne und Hydrolyse vergleichend am Beispiel eines Pferdes.
ERGEBNISSE 105
0
20
40
60
80
100
120
140
2,1 4,03 4,66 6,83 7,9Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l Urin
]
mit Hydrolyse aufgearbeitetohne Hydrolyse aufgearbeitet
Abbildung 28: Konzentrationen von 3-Hydroxydetomidin im Urin eines Pferdes mit und ohne
Hydrolyse
Es ist deutlich zu erkennen, dass die Aufarbeitung der Urinproben mit Hydrolyse die
Extraktionsausbeute von 3-Hydroxydetomidin verbessert.
4.3.5 Carboxydetomidin im Urin
In Abbildung 29 ist der Konzentrationsverlauf von Carboxydetomidin im Urin bis 50
Stunden nach der einmaligen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM
dar. Die rote Querlinie stellt die Quantifizierungsgrenze von 50 ng/ml dar.
106 ERGEBNISSE
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 10 20 30 40 50Zeit [h]
Kon
zent
rario
n [n
g/m
l Urin
]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10LOQ
Abbildung 29: Konzentrationsverlauf von Carboxydetomidin im Urin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden
Die maximalen Konzentrationen liegen zwischen 450 und 1550 ng/ml Urin und
werden zwischen der fünften beziehungsweise achten Stunde p. a. erreicht. In den
ersten 20 Stunden zeigte sich bei allen Pferden ein rascher Abfall der Konzentration.
Nach 30 Stunden sind die Konzentrationen bei acht Pferden unterhalb der
Quantifizierungsgrenze angelangt.
Abbildung 30 zeigt die Konzentrationen von Carboxydetomidin in kumulativer
Darstellung über einen Zeitraum von 48 Stunden.
ERGEBNISSE 107
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 12 24 36 48Zeit [h]
Men
ge C
arbo
xyde
tom
idin
[µg]
Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6Pferd 7Pferd 8Pferd 9Pferd 10
Abbildung 30: Kumulative Darstellung der im Urin ausgeschiedenen Menge Carboxydetomidin nach
einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bis 48
Stunden p. a.
Die Einzelwerte sind für jedes Pferd im Anhang in den Tabellen 45 und 46
aufgeführt.
4.3.5.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergeichend
Abbildung 31 zeigt die Konzentration von Carboxydetomidin im Urin nach der
Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergleichend am Beispiel eines Pferdes.
108 ERGEBNISSE
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
3,25 4,82 6,08 8,08 9,95Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l Urin
]
mit Hydrolyse aufgearbeitetohne Hydrolyse aufgearbeitet
Abbildung 31: Konzentrationen von Carboxydetomidin im Urin eines Pferdes mit und ohne Hydrolyse
Auch hier ist deutlich zu erkennen, dass die Aufarbeitung der Urinproben mit
Hydrolyse die Extraktionsausbeute von Carboxydetomidin deutlich verbessert.
4.4 Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urin-konzentrationen
Zur Berechnung effektiver beziehungsweise irrelevanter Plasma- und
Urinkonzentrationen wird ein von TOUTAIN und LASSOURD (2002) entwickeltes
PK/PD-Modell (siehe auch Punkt 2.1.7.1) auf die erhaltenen pharmakokinetischen
Parameter angewendet. Anhand der nachstehenden Gleichung wird mit Hilfe der
ERGEBNISSE 109
Dosierung (D) und der ermittelten Clearance (Cl) die effektive
Plasmakonzentration (EPC) pro Dosierungsintervall ermittelt:
Clearance
DosierungEPC = [ng/ml]
Aus der EPC wird durch Einbeziehung eines Sicherheitsfaktors (SF) die irrelevante
Plasmakonzentration (IPC) abgeleitet. Der von TOUTAIN und LASSOURD (2002)
vorgeschlagene Sicherheitsfaktor setzt sich für viele Wirkstoffe aus den Faktoren 10
und 50 zum Ausgleich interindividueller Schwankungen und Gewährleistung der
Validität der Daten zusammen.
SF
EPCIPC = [ng/ml]
Zur Berechnung der irrelevanten Urinkonzentration (IUC) entwickelten TOUTAIN
und LASSOURD (2002) folgende Formel:
ssRIPCIUC ×= [ng/ml]
Dabei stellt Rss das Konzentrationsverhältnis von Urin zu Plasma im Steady State
dar.
entrationPlasmakonz ttlichedurchschnitrationUrinkonzen ttlichedurchschniRss =
Zur Ermittlung der durchschnittlichen Urin- und Plasmakonzentration wurden in
eigenen Untersuchungen folgende Berechnungen angestellt:
Die durchschnittliche Urinkonzentration (CurinØ) wird für ein festgelegtes
Dosierungsintervall durch die Addition aller in diesem Zeitraum gemessenen
Konzentrationen von Carboxydetomidin und anschließender Division durch die
Anzahl der addierten Konzentrationen ermittelt.
110 ERGEBNISSE
Die durchschnittliche Plasmakonzentration (CPlasmaØ) für das Dosierungsintervall
wurde mittels folgender Gleichung unter Verwendung der maximalen
Plasmakonzentration (Cmax) sowie der Eliminationskonstante (b1) errechnet (KIETZ-
MANN, 1983):
CPlasmaØ intervallDosierungsb
C
1
max×
= [ng/ml]
4.5 Berechnung von Ausscheidungszeiten
Zusätzlich wurden weitere Parameter wie die Ausscheidungszeit von Detomidin bis
zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (tA(IPC)), der
Bestimmungsgrenze (tA(LOQ)) beziehungsweise der Nachweisgrenze (tA(LOD))
bestimmt.
Die Ausscheidungszeit von Detomidin aus dem Plasma bis zum Erreichen der
irrelevanten Plasmakonzentration wurde mit folgender Formel berechnet (KIETZ-
MANN, 1983):
tA(IPC)1
IPCmax
blnlnC −= [h]
Zur Berechnung der Zeitspanne bis zum Erreichen der Bestimmungsgrenze tA(LOQ)
und der Nachweisgrenze tA(LOD) können ähnliche Formeln eingesetzt werden:
ta (LOQ) 1
(LOQ)max
b lnClnC −= [h]
ERGEBNISSE 111
ta (LOQ) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen des LOQ
C (LOQ) = Konzentration der Bestimmungsgrenze
ta (LOD) 1
(LOD)max
b lnClnC −= [h]
ta (LOD) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der LOD
C (LOD) = Konzentration der Nachweisgrenze
Unter Verwendung des oben genannten Berechnungsweges wurden die effektiven
Plasma- sowie die irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen anhand der
ermittelten pharmakokinetischen Daten (siehe Tabelle 34) für alle 10 Pferde
berechnet. Dabei stellt die Dosierung (D) die Menge verwendeter Reinsubstanz dar,
was in diesem Fall 20 µg/kg Detomidin-Hydrochlorid abzüglich des Hydrochlorid-
Anteils, also 16,76 µg/kg Detomidin entspricht.
Bei Detomidin als Sedativum kann nicht von einem Dosierungsintervall ausgegangen
werden, da die Substanzen dieser Wirkstoffgruppe im allgemeinen nur einmalig
verabreicht werden. Deshalb schlagen TOUTAIN und LASSOURD (2002) vor, als
Dosierungsintervall den Zeitraum zu bestimmen, nach dem die Substanz ihre
pharmakodynamische Wirkung verloren hat (siehe Kapitel 4.6). Nach den
Ergebnissen dieser Studie hat Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM nach 4 Stunden bei 10 Pferden keine
Wirkung mehr (vergleiche Punkt 4.6.4.4). Auf Grund dessen erfolgte die Berechnung
auf der Basis eines Dosierungsintervalles von 4 Stunden.
Tabelle 36 zeigt die Ergebnisse der wie unter Punkt 4.4 angegebenen Berechnung
der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentration für 10 Pferde.
112 ERGEBNISSE
Pferd 1
Pferd 2
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Pferd 9
Pferd 10
Mittel-wert S
EPC (4h)
[ng/ml] 2,96 2,21 3,19 3,01 3,05 2,83 2,64 2,08 2,47 3,20 2,76 0,40
IPC (4h)
[ng/ml] 0,0059 0,0044 0,0064 0,0060 0,0061 0,0057 0,0053 0,0042 0,0049 0,0064 0,0055 0,0008
IUC (4h)
[ng/ml] 0,25 0,67 0,47 0,29 0,70 0,33 0,22 0,67 0,12 0,59 0,43 0,22
Para-meter
Tabelle 36: Ergebnisse der Berechnungen von EPC, IPC und IUC nach TOUTAIN und
LASSOURD (2002) von 10 Pferden und im Mittel nach einer Dosierung von 16,76 µg
Detomidin-Hydrochlorid/kg KM und einem Dosierungsintervall von 4 Stunden
Erläuterungen zu den Abkürzungen in Tabelle 36:
EPC effektive Plasmakonzentration
IPC irrelevante Plasmakonzentration
IUC irrelevante Urinkonzentration
S Standardabweichung
Nach diesen Berechnungen liegt die effektive Plasma Konzentration nur knapp über
der Bestimmungsgrenze von 2,09 ng/ml Plasma (siehe Kapitel 4.2.4). Die irrelevante
Plasmakonzentration liegt immer deutlich unter der Nachweisgrenze von 1,67 ng/ml
Plasma (siehe Kapitel 4.2.3).
In Tabelle 37 sind die Ergebnisse der Berechnungen der Ausscheidungszeiten von
Detomidin bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (tA(IPC)) sowie der
Bestimmungs- (tA(LOQ)) und Nachweisgrenze (tA(LOD)) dargestellt.
ERGEBNISSE 113
Pferd 1
Pferd 2
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Pferd 9
Pferd 10
Mittel-wert S
ta
(IPC)[h] 5,36 3,90 3,17 4,57 3,78 4,36 4,48 3,09 3,64 3,05 3,94 0,75
ta
(LOQ)[h] 1,43 1,03 1,03 1,30 1,15 1,23 1,21 0,86 1,03 1,01 1,13 0,17
ta
(LOD)[h] 1,58 1,13 1,12 1,43 1,25 1,35 1,33 0,94 1,12 1,09 1,23 0,19
Parameter
Tabelle 37: Ergebnisse der Berechnungen nach Kietzmann (1983) von ta (IPC), ta (LOQ) und ta (LOD)
von allen Pferden und im Mittel nach einer Dosierung von 16,76 µg Detomidin-
Hydrochlorid/kg KM und einem Dosierungsintervall von 4 Stunden
Erläuterungen zu den Abkürzungen in Tabelle 37:
ta (IPC) Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der IPC
ta (LOQ) Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen des LOQ
ta (LOD) Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen des LOD
S Standardabweichung
4.6 Pharmakodynamik von Detomidin
Als Ausdruck der Wirkung von Detomidin werden die Daten für Herzfrequenz,
Atemfrequenz und Körpertemperatur sowie die Ergebnisse der Kopftiefhaltung, des
akustischen, visuellen und des Stromreizes wie unter Punkt 3.2.5 ermittelt und
dokumentiert. Dadurch ist ein direkter Vergleich von Pharmakokinetik und
Pharmakodynamik möglich.
4.6.1 Herzfrequenz
Abbildung 32 zeigt den durchschnittlichen Verlauf der Herzfrequenz über 12 Stunden
nach der einmaligen intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg
KM.
114 ERGEBNISSE
10
20
30
40
50
Her
zfre
q uen
z [S
chlä
g e/m
in]
0 2 4 6 8 10 12Zeit [h]
Abbildung 32: Herzfrequenz von 10 Pferden, Mittelwert mit Standardabweichung zu jedem
Messzeitpunkt vor und nach der intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-
Hydrochlorid/kg KM (signifikante Abweichungen bis drei Stunden p. a.)
Die gemittelten Ruhewerte aller 10 Pferde liegen bei 41 Schlägen pro Minute.
Innerhalb der ersten zwei Minuten nach der Applikation von Detomidin fallen die
Herzfrequenzen auf 17 Schläge pro Minute ab und bleiben über 45 Minuten
signifikant erniedrigt. Auffällig ist hierbei der Abfall der Herzfrequenz eines Pferdes
auf 6 Schläge pro Minute zwei Minuten p. a. Im Zeitraum zwischen 1 und 3 Stunden
nach Detomidinapplikation konnte statistisch noch eine signifikante Abweichung der
durchschnittlichen Herzfrequenz von den Ruhewerten ermittelt werden. 6 Stunden p.
a. werden die Basiswerte der Herzfrequenz wieder erreicht.
ERGEBNISSE 115
4.6.2 Atemfrequenz
Abbildung 33 zeigt den Verlauf der Atemfrequenz über 12 Stunden als Mittelwert
aller 10 Pferde sowie die Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt.
4
8
12
16
20
Ate
mfre
q uen
z [A
tem
züg e
/min
]
0 2 4 6 8 10 12Zeit [h]
Abbildung 33: Darstellung des Verlaufes der Atemfrequenz von 10 Pferden im Mittel mit
Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt vor und nach der intravenösen
Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM (signifikante Abweichungen
bis 3 Stunden p. a.)
Die gemittelten Ruhewerte aller 10 Pferde liegen bei 11 Atemzügen pro Minute.
Innerhalb von 30 Minuten p. a. erfolgt ein leichter Abfall der Atemfrequenz. Im
Zeitraum 45 Minuten bis 3 Stunden nach Detomidinapplikation wurden signifikante
Abweichungen vom Ruhewert erreicht. Anschließend kommt es zu einem Anstieg
der Frequenz, bis nach 7 Stunden der Basiswert wieder erreicht ist. Die
Schwankungen der Atemfrequenz über den Zeitraum von 24 Stunden belaufen sich
116 ERGEBNISSE
im Mittel auf einen Bereich zwischen 8 und 12 Atemzügen pro Minute. Die niedrigste
Atemfrequenz wird 1,5 Stunden p. a. mit 4 Atemzügen pro Minute bei einem Pferd
ermittelt.
4.6.3 Körperinnentemperatur
Abbildung 34 zeigt den Verlauf der Körperinnentemperatur über 12 Stunden als
Mittelwert aller 10 Pferde sowie die Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt.
36.6
36.8
37.0
37.2
37.4
37.6
37.8
38.0
38.2
38.4
Kör
perte
mpe
r atu
r [°C
]
0 2 4 6 8 10 12Zeit [h]
Abbildung 24: Darstellung des Verlaufes der Körpertemperatur von 10 Pferden im Mittel mit
Standardabweichung zu jedem Messzeitpunkt vor und nach der intravenösen
Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM (signifikante Abweichungen 1,5
bis 4 Stunden p. a.)
ERGEBNISSE 117
Die gemittelten Ruhewerte aller 10 Pferde liegen bei 37,4°C mit einer
Schwankungsbreite von 37,0 – 37,8°C. Im Verlauf der ersten 2 Stunden p. a. fällt die
gemittelte Körpertemperatur erst bis auf 36,8°C und damit vergleichsbezogen
signifikant ab. Die niedrigste Temperatur wird mit 36,2°C bei einem Pferd nach 90
Minuten festgestellt. Im weiteren Verlauf kommt es zu einem Wiederanstieg der
Körperinnentemperatur, wobei nach etwa 6 Stunden der Basiswert erreicht wird.
Auffällig ist ein weiterer signifikanter Anstieg der Temperatur über den Ruhewert
hinaus bis auf 38°C.
4.6.4 Grad der Sedation
Der Grad der Sedation wurde jeweils einzeln für die Parameter Kopftiefhaltung,
Reaktion auf einen akustischen sowie auf einen visuellen Reiz als auch gesamthaft
als individueller Sedationsgrad aus der Summe der Einzelparameter für jedes Pferd
beurteilt.
118 ERGEBNISSE
4.6.4.1 Ptosis
Abbildung 35 zeigt eines der Versuchspferde circa 20 Minuten nach der Applikation
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM. Diese Kopftiefhaltung wurde mit Grad 3
(Unterlippe an oder unterhalb des Karpus) beurteilt und im Protokoll vermerkt.
Abbildung 35: Kopftiefhaltung eines Versuchspferdes circa 20 Minuten nach der Applikation von 20
µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei vollständig angeschlossener Apparatur für die
Messung der Analgesie
In Abbildung 36 ist der Verlauf der Veränderung der Kopfhaltung nach Applikation
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel und mit dem
jeweilig niedrigsten und höchsten Wert pro Messzeitpunkt dargestellt.
ERGEBNISSE 119
1
2
3
Pto
s is
[Gra
d]
0 1 2 3 4 5Zeit [h]
Abbildung 36: Beurteilung der Veränderung der Kopfhaltung nach Applikation von 20 µg Detomidin-
Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel und mit dem jeweilig niedrigsten und
höchsten Wert pro Messzeitpunkt, erstellt mit Hilfe eines Score-Systems (0 =
Unterlippe oberhalb Buggelenk, 1 = Unterlippe zwischen Bug- und Ellenbogengelenk,
2 = Unterlippe zwischen Ellenbogen- und Karpalgelenk, 3 = Unterlippe an oder unter
Karpalgelenk)
Innerhalb der ersten 2 Minuten p. a. sinkt der Kopf bei allen Pferden mindestens bis
zwischen das Ellenbogen- und Karpalgelenk ab. Nach 30 Minuten ist das Maximum
erreicht, alle 10 Pferde lassen den Kopf bis an oder unter das Karpalgelenk hängen.
Statistische Test für gepaarte hierarchische Daten ergaben bis 120 Minuten p. a.
eine hohe Signifikanz für die Veränderung der Kopfhaltung verglichen mit dem
Ruhewert. Im Anschluss nimmt die Höhe der Kopfhaltung wieder zu und erreicht
nach 4 Stunden wieder den Basiswert.
120 ERGEBNISSE
4.6.4.2 Akustischer Reiz
Abbildung 37 zeigt die Änderung der Empfindlichkeit gegenüber einem akustischen
Reiz vor und nach der Applikation von Detomidin.
1
2
3
Rea
ktio
n au
f aku
stis
c hen
Rei
z [G
rad]
0 1 2 3 4 5Zeit [h]
Abbildung 37: Beurteilung der Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber einem akustischen Reiz
nach Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel
und mit dem jeweilig niedrigsten und höchsten Wert pro Messzeitpunkt, erstellt mit
Hilfe eines Score-Systems (0 = volle Reaktion, 1 = Reaktion geringgradig gedämpft,
2 = Reaktion deutlich gedämpft, 3 = Reaktion vollständig erloschen)
Unmittelbar nach Applikation der Substanz ist die Reaktion fast aller Pferde auf einen
akustischen Reiz, bezogen auf den Ruhewert, deutlich herabgesetzt. Während der
Messzeitpunkte 15 und 30 Minuten p. a. ist die maximale Unempfindlichkeit
festzustellen, danach nimmt die Empfindlichkeit langsam wieder zu und hat bei allen
Pferden nach 4 Stunden wieder den Ausgangswert erreicht. Die statistische
ERGEBNISSE 121
Auswertung der Tests ergab eine hohe signifikante Abweichung für alle
Messzeitpunkte bis einschließlich der 90. Minute verglichen mit den Basiswerten.
4.6.4.3 Visueller Reiz
In Abbildung 38 ist die Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber einem visuellen
Reiz vor und nach der Applikation von Detomidin dargestellt.
1
2
3
Rea
ktio
n au
f vis
uelle
n R
eiz
[Gra
d]
0 1 2 3 4 5Zeit [h]
Abbildung 38: Beurteilung der Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber einem visuellen Reiz
nach Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel
und mit dem jeweilig niedrigsten und höchsten Wert pro Messzeitpunkt, erstellt mit
Hilfe eines Score-Systems (0 = volle Reaktion, 1 = Reaktion geringgradig gedämpft,
2 = Reaktion deutlich gedämpft, 3 = Reaktion vollständig erloschen)
122 ERGEBNISSE
Direkt nach Applikation von Detomidin kam es bei allen Pferden zu einer deutlich
verminderten Reaktion auf das Schwenken einer roten Tüte vor dem Kopf der Tiere.
Die höchste Herabsetzung der Empfindlichkeit wurde 30 Minuten p. a. erreicht. Die
statistische Auswertung der Tests ergab eine hohe signifikante Abweichung für alle
Messzeitpunkte bis 90 Minuten nach der Applikation verglichen mit den Basiswerten.
4.6.4.4 Individueller Sedationsgrad der einzelnen Pferde
Abbildung 39 zeigt den Verlauf des Sedationsgrades im Mittel für alle 10 Pferde der
Studie.
3
6
9
Sed
ati o
nsgr
ad [P
unkt
e ]
0
5
10
15
20
Det
o mid
inko
nzen
tratio
n [n
g/m
l]
0 1 2 3 4 5Zeit [h]
Abbildung 39: linke Größenachse: Grad der Sedation aller Pferde im Mittel im Verlauf des
Versuches, erstellt mit einem Score-System für Ptosis, Reaktion auf einen
akustischen Reiz und die Reaktion auf einen visuellen Reiz (0 = keine Sedation,
1-3 = geringgradige Sedation, 4-6 = mittelgradige Sedation, 7-9 = hochgradige
Sedation)
rechte Größenachse: Plasmakonzentrationsverlauf nach einmaliger intravenöser
Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im Mittel
ERGEBNISSE 123
Der individuelle Sedationsgrad der einzelnen Pferde wird aus der Summe der
Einzelparameter (Ptosis, Reaktion auf einen akustischen Reiz Reaktion auf einen
visuellen Reiz) für jedes Pferd zu jedem Messzeitpunkt bestimmt. Zusätzlich wurde
der Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Gabe
von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM aller 10 Pferde im Mittel in der Abbildung
dargestellt, um einen direkten Vergleich von Pharmakokinetik und Pharmakodynamik
zu ermöglichen.
Es wird deutlich, dass das Konzentrationsmaximum bereits nach 2 Minuten p. a.
erreicht wird, während der maximale sedative Effekt erst nach 30 Minuten eintritt. Der
Abfall der beiden Kurven verläuft zeitversetzt nahezu parallel, wobei die
Plasmakonzentration von Detomidin bereits nach 2 Stunden in den Bereich der
Quantifizierungsgrenze absinkt und zu diesem Zeitpunkt noch ein deutlicher
sedativer Effekt zu messen ist.
4.6.5 Grad der Reaktion auf einen definierten Stromreiz
In Abbildung 40 ist der Verlauf der Reaktion auf einen definierten Stromreiz vor und
nach der einmaligen intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg
KM dargestellt.
124 ERGEBNISSE
10
20
30
40
Rea
ktio
n a u
f Stro
mre
iz [m
A]
0 1 2 3 4 5Zeit [h]
Abbildung 40: Verlauf der Reaktion auf einen definierten Stromreiz vor und nach der einmaligen
intravenösen Applikation von 20µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden im
MIttel
Bereits 2 Minuten p. a. ist die Toleranzgrenze gegenüber dem Stromreiz deutlich
angestiegen. Bei diesem Modell wird die erhöhte Toleranz mit
Schmerzunempfindlichkeit gleichgesetzt. 10 Minuten nach der Detomidinapplikation
ist die Unempfindlichkeit im Mittel bei 10 Pferden am stärksten. Danach kommt es
langsam wieder zu einer verstärkten Reaktion auf den Stromreiz. Allerdings ist die
volle Reaktion bei allen Pferden im Mittel erst wieder nach 4 Stunden auslösbar.
Nach diesem Zeitpunkt ist die analgetische Wirkung von Detomidin bei allen Pferden
wieder völlig aufgehoben.
ERGEBNISSE 125
4.6.6 Andere Beobachtungen
Nach der Applikation des Detomidins wurde bei 4 Pferden circa 100 bis 180 Minuten
p. a. ein mittelgradiger bis hochgradiger Muskeltremor vor allem in den Muskel-
gruppen von Schulter und Oberschenkel beobachtet. Neun der zehn Pferde zeigten
in der tiefsten Phase der Sedation neben der Kopftiefhaltung auch ein extremes
Hängenlassen von Augenlidern, Lippen und in einem Fall sogar der Zunge (siehe
Abbildung 35). Bei sechs dieser neun Pferde ging dieses mit einem schnarchenden
Atemgeräusch einher. In vier Fällen konnte ein geringradiger bis mittelgradiger
Penisprolaps etwa 40 bis 80 Minuten p. a. beobachtet werden (siehe Abbildung 35).
Bei fünf Pferden konnte übermäßiges Schwitzen, vor allem im Bereich der Flanken,
bei zwei Pferden aber besonders ausgeprägt am Kopf festgestellt werden.
126 DISKUSSION
5 DISKUSSION
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung pharmakokinetischer und
pharmakodynamischer Parameter nach einmaliger intravenöser Applikation von
Detomidin beim Pferd, um zu prüfen ob die Schaffung von Grenzwerten anstatt der
bisher verwendeten Null-Lösung möglich sei. Im ersten Schritt wurde eine geeignete
HPLC/MS/MS-Analysemethode für die Detektion von Detomidin und seinen
Metaboliten in Plasma und Urin entwickelt und validiert. In der folgenden
Ausscheidungsstudie an 10 Pferden wurden nicht nur Plasma- und Urinproben zur
Errechnung pharmakokinetischer Parameter, sondern auch Daten zur Pharmako-
dynamik gewonnen. Dazu gehörten die Ermittlung der Herz- und Atemfrequenz, die
rektale Körpertemperatur, sowie das Erfassen der Sedationstiefe und der Grad der
Analgesie. Mittels pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Modelle wurden
die Daten mathematisch verknüpft. Spezielle Beachtung fand das PK/PD-Modell
nach TOUTAIN und LASSOURD (2002), mit dem Plasma- und Urinkonzentrationen
errechnet wurden, bei denen keine pharmakologische Wirkung der Substanz mehr
zu erwarten ist.
5.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Detomidin und seinen Metaboliten in Plasma und Urin
Vor Beginn dieser Studie stand im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln kein geeignetes Analyseverfahren zum Nachweis von
Detomidin und seinen Metaboliten zur Verfügung. Die in dieser Arbeit entwickelte
Aufarbeitungsprozedur im Plasma basiert auf einer Routinemethode zur Extraktion
basischer Verbindungen. Ether stellt dabei ein geeignetes organisches Lösungsmittel
für die apolaren, basischen Verbindungen Detomidin und Medetomidin dar. Im
Vergleich von Festphasen- und Flüssig-Flüssig-Extraktion, ergab sich für die Flüssig-
Flüssig-Methode ein besseres Extraktionsergebnis, vor allem bei pH 9,6 und 14.
DISKUSSION 127
Allerdings wiesen die Chromatogramme der bei pH 9,6 aufgearbeiteten Proben ein
hohes Untergrundrauschen auf, was auf endogene Substanzen zurückzuführen war.
Diese sauren oder neutralen Verbindungen gehen überwiegend im neutralen bis
schwach basischen pH-Bereich mit in die Etherphase über. Da die Störsignale im
pH-Bereich 14 wesentlich geringer ausfielen, wurde dieser als optimaler pH-Wert für
die Extraktionsmethode im Plasma angesehen.
In der Literatur wurde die Bildung von Metaboliten des Detomidins im Urin eingehend
an Ratten und Pferden untersucht (SEYMOR et al., 1990; CHUI et al., 1991;
SALONEN, 1992; SALONEN et al., 1992). Aus diesen Studien ging ebenfalls hervor,
dass Detomidin selbst im Urin nicht oder nur in sehr geringen Mengen nachgewiesen
werden kann (VAKKURI et al., 1987; SALONEN, 1988). In den eigenen
Untersuchungen konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Es ist deshalb davon
auszugehen, dass Detomidin fast vollständig metabolisiert zur Ausscheidung
gelangt. Da geplant ist, den analytischen Nachweis von Detomidin bei die
Routineuntersuchungen von Pferdedopingproben im Institut für Biochemie der
Deutschen Sporthochschule Köln zu etablieren, war die Entwicklung einer Methode
für den Nachweis von Detomidin im Urin somit nicht angezeigt. Stattdessen wurde
anhand laborinterner Dokumente eine Aufarbeitungsmethode für die Metaboliten 3-
Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin entwickelt. Das von CHUI et al. (1991)
erwähnte 4-Hydroxydetomidin wurde nicht in die Messungen mit einbezogen, da das
Hauptaugenmerk auf Carboxydetomidin, den Hauptmetaboliten des Detomidin beim
Pferd, gerichtet wurde. Bei Carboxydetomidin handelt es sich um eine saure
Verbindung, so dass für dessen Analyse und Quantifizierung sowohl ein eigener
interner Standard gefunden werden, als auch eine spezielle Extraktion erfolgen
mussten. Erst Imidazolylbenzoesäure zeigte aufgrund ihrer Strukturverwandtheit ein
ähnliches Extraktionsverhalten wie Carboxydetomidin und wurde deshalb als interner
Standard eingesetzt. Obwohl Detomidin und 3-Hydroxydetomidin von ihren
Extraktionseigenschaften auch in einer Flüssig-Flüssig-Extraktion hätten gewonnen
werden können, wurden erst mit Hilfe einer Ionenaustauschermatrix für alle
Substanzen (Detomidin, Medetomidin, 3-Hydroxydetomidin, Carboxydetomidin,
Imidazolylbenzoesäure) akzeptabel hohe Ausbeuten erzielt. Mittels Oasis® MCX-
128 DISKUSSION
Extraktionskartuschen (Waters, Deutschland) wurden Detomidin, Medetomidin und
3-Hydroxydetomidin in den ersten beiden und Carboxydetomidin sowie
Imidazolylbenzoesäure im dritten Eluierschritt extrahiert (siehe Punkt 3.3.4.4) und mit
einer HPLC/MS/MS-Methode detektiert.
In den an Pferden durchgeführten Studien von SEYMOR et al. (1990) und SALONEN
et al. (1992) lagen Carboxydetomidin frei und 3-Hydroxydetomidin sowohl gluko-
ronidiert, als auch frei vor. Aufgrund der eigenen Untersuchungen konnte bestätigt
werden, dass 3-Hydroxydetomidin im Urin sowohl glukoronidiert, als auch frei
vorliegt. Allerdings wurde durch die Hydrolyse auch der Anteil von Carboxydetomidin
im Vergleich zur Aufarbeitung ohne enzymatische Spaltung erhöht. Das bedeutet,
dass beide Metaboliten im Urin sowohl frei als auch konjugiert vorliegen. 3-
Hydroxydetomidin wird besonders in den ersten vier Stunden, Carboxydetomidin
sechs Stunden p. a. glukoronidiert ausgeschieden, so dass eine enzymatische
Hydrolyse mit ß-Glucoronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia die Extraktions-
ausbeute beider Metaboliten deutlich erhöht. Aufgrunddessen wurden alle
Urinausscheidungsproben mit Hydrolyse aufgearbeitet.
Die Wiederfindungsraten von Detomidin im Plasma und Detomidin, 3-
Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin zeigen, dass die
Extraktionsprozedur mit Verlusten verbunden ist. Auffällig ist hierbei die geringere
Wiederfindungsrate von etwa 50 % bei Detomidin im Plasma im Gegensatz zu 63 bis
69 % bei Detomidin und seinen Metaboliten im Urin. Die relativ gesehen einfachere
Aufarbeitungsmethode von Plasma hätte ein umgekehrtes Verhältnis vermuten
lassen.
Die Ergebnisse der Validierung belegen die Eignung der HPLC/MS/MS-
Analysemethode für den Nachweis von Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und
Carboxydetomidin. Bei der Überprüfung der Selektivität konnten in Leermatrixproben
keine Störpeaks zu den Retentionszeiten der Analyten oder internen Standards
ermittelt werden. Die Linearität der Methode für Detomidin wurde im Plasma über
einen Konzentrationsbereich von 2,5 bis 50 ng/ml überprüft. Für 3-Hydroxydetomidin
lag der Konzentrationsbereich zwischen 10 und 160 ng/ml, für Caboxydetomidin
DISKUSSION 129
zwischen 50 und 1600 ng/ml Urin. Für jede Kalibrationskurve konnte ein
Regressionskoeffizient von mehr als 0,99 eingehalten werden. Die Kriterien für
Richtigkeit und Präzision, eine Abweichung von 15 %, an der unteren Bestimmungs-
grenze von 20 %, nicht zu überschreiten, wurden an allen Messtagen, für alle
Substanzen erfüllt (EHSLC, 2002). Mit der angewandten Methode liegt die
Nachweisgrenze für Detomidin im Plasma bei 1,67 ng/ml, während CHUI et al.
(1991) über eine Nachweisgrenze von 0,5 ng/ml berichten. Die Nachweisgrenze von
3-Hydroxydetomidin im Urin beträgt bei der in der Studie verwendeten Methode 10
ng/ml. Für Carboxydetomidin wurde eine Nachweisgrenze von 50 ng/ml Urin
ermittelt. Bisher wurde Carboxydetomidin in keiner Studie quantifiziert, weshalb keine
vergleichenden Daten zur Nachweis- und Bestimmunggrenze in der Literatur
vorliegen. Die untere Bestimmungs- oder Quantifizierungsgrenze von Detomidin im
Plasma liegt bei 2,09 ng/ml. Aufgrund der Ergebnisse von Präzision und Richtigkeit
wurde die Bestimmungsgrenze für 3-Hydroxydetomidin im Urin auf 10 ng/ml
festgelegt. Die Stabilität von Detomidin und seinen Metaboliten in den jeweiligen
Matrices wurde für den Zeitraum der Lagerung der Ausscheidungsproben bei
identischen Lagerbedingungen von –20°C überprüft. Der Stabilitätstest der
Substanzen im Urin musste über einen längeren Zeitraum erfolgen, da die
Aufarbeitung und Messung aller Proben knapp 8 Wochen in Anspruch nahm. Die
Plasmaproben wurden innerhalb von 30 Tagen aufgearbeitet, was die Dauer des
Stabilitätstestes auf 5 Wochen verkürzte. Es konnte gezeigt werden, dass Detomidin
und seine Metaboliten in Plasma und Urin über diese Zeiträume stabil und damit
lagerfähig sind.
5.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma
Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten für Detomidin im Plasma erfolgte bei
10 Pferden. Die maximalen Konzentrationen wurden zwei und fünf Minuten nach der
Applikation gemessen, es zeigen sich jedoch interindividuelle Schwankungen in
Bezug auf den Zeitpunkt der Höchstkonzentration. Bei fünf Pferden wird die
130 DISKUSSION
individuell gemessene maximale Konzentration bereits nach 2 Minuten, bei den
anderen fünf Tieren erst 5 Minuten nach der Applikation erreicht. Zusätzlich variieren
die Konzentrationen zum ersten Messzeitpunkt zwischen 12 und 35 ng/ml. Auffällig
ist hierbei, dass die niedrigeren Konzentrationen von den Pferden gestellt werden,
die erst am zweiten Messzeitpunkt ihre individuelle Höchstkonzentration erreichen.
Zum Zeitpunkt 5 Minuten p. a. werden Konzentrationen zwischen 15 und 30 ng/ml
gemessen.
Als Ursache für die Schwankungen der Höchstkonzentration zwischen den ersten
beiden Messzeitpunkten könnte eine paravenöse Applikation vermutet werden.
Aufgrund der Verwendung von Venenkathetern, die jeweils kurz vor der
Verabreichung des Arzneimittels auf ihren intravasalen Sitz geprüft wurden, wird
diese Möglichkeit jedoch als unwahrscheinlich angesehen. Es kann vielmehr der
starke negativ chronotrope Einfluss des Detomidins für dieses Phänomen
verantwortlich gemacht werden. Am deutlichsten tritt dieser Effekt bei Pferd 7 ein,
dessen Herzfrequenz von einer durchschnittlichen Ruhefrequenz von 37 auf 6
Schläge pro Minute innerhalb der ersten 2 Minuten nach der Applikation absank.
Berechnet man den prozentualen Abfall der durchschnittlichen Herzfrequenz für die
fünf Pferde mit frühem Konzentrationsmaximum (Ruhewerte im Vergleich der
Herzfrequenz zum ersten Probennahmezeitpunkt 2 Minuten p. a.) so sinkt die
Schlagfrequenz um 53 %, in Bezug auf den zweiten Probennahmezeitpunkt (5
Minuten p. a.), wird ein Abfall der Herzfrequenz um immernoch 38 % ermittelt. Im
Vergleich dazu hatte die Herzfrequenz der Pferde mit Konzentrationsmaximum nach
5 Minuten um 65 % nach 2 Minuten um 43 %, also wesentlich stärker, abgenommen.
Durch die verminderte Schlagfrequenz kann von einer verminderten Herzzeitvolumen
(l/min) ausgegangen werden, was zu einem langsameren Transport aller Stoffe im
Blut führt. Dies kann bei den fünf Pferden mit spätem Konzentrationsmaximum eine
verlangsamte Verteilung des Detomidins im gesamten Blutvolumen zur Folge gehabt
haben. Es konnte hingegen keine Auswirkung des unterschiedlichen Absinkens der
Herzfrequenz auf die absolute Dauer der Ausscheidung festgestellt werden, da bei
allen Pferden innerhalb der ersten halben Stunde nach der Applikation ein deutlicher
DISKUSSION 131
Abfall der Plasmakonzentration erfolgte. Auch die Quantifizierungsgrenze war nach
1,5 Stunden von allen Pferden einheitlich unterschritten.
Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten erfolgte nur mit den Werten der
höchsten Plasmakonzentration bis einschließlich der Konzentrationen oberhalb der
Quantifizierungsgrenze. Obwohl von SALONEN (1986) ein 2-Kompartiment-Modell
zur Berechnung pharmakokinetischer Daten für Detomidin herangezogen wurde, war
in der vorliegenden Studie aufgrund der Datenlage nur eine Berechnung im 1-
Kompartiment-Modell möglich. Als Halbwertszeit wurde eine Zeit von durchschnittlich
18 Minuten errechnet. Damit liegen die Ergebnisse dieser Studie unter den
ermittelten Halbwertszeiten von SALONEN (1992) und DYKE (1993), die bei 72
Minuten lagen. Entsprechend ergibt sich eine mittlere Clearance von 26,8 ± 6,7 ml
/min. Das Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment beläuft sich im Mittel auf
0,7 ± 0,2 l/kg KM. Dies lässt auf eine gute Verteilung der Substanz im intra- und
extrazellulären Raum schließen.
5.3 Pharmakokinetik von Detomidin im Urin
Die Konzentrationen von 3-Hydroxy- und Carboxydetomidin im Urin zeigen starke
interindividuelle Schwankungen in Bezug auf die maximale Konzentration und auf die
Dauer der Ausscheidung. Die maximalen Konzentrationswerte für 3-Hydroxy-
detomidin erreichen Werte zwischen 31 und 130 ng/ml Urin. Sie wurden im Zeitraum
von 3 bis 6 Stunden nach der Applikation erreicht. Bei Carboxydetomidin liegen die
Werte zwischen 448 und 1547 ng/ml Urin und erreichen im Zeitraum von 4 bis 8
Stunden p. a. ihr Maximum. In beiden Fällen erreicht Pferd 2 eine besonders hohe
Konzentration, obwohl dieses Pferd dieselbe Dosierung erhalten hat wie die anderen
Tiere. Die individuelle Ausscheidungszeit von 3-Hydroxydetomidin war bei diesem
Pferd – wie auch bei Pferd 1 - deutlich kürzer als bei den acht anderen Tieren. So
erreichten Pferd 1 und 2 die Nachweisgrenze für 3-Hydroxydetomidin im
Durchschnitt schon nach 7,25 Stunden, während die anderen Pferde durchschnittlich
14,9 ± 9,1 Stunden benötigten. Die Clearance und die Eliminationshalbwertszeit
132 DISKUSSION
lagen bei Pferd 1 und 2 ebenfalls höher als bei den Anderen. Nach FREY (2002) ist
eine hohe Claerance gleichbedeutend mit einer raschen Ausscheidung der Substanz
aus dem Plasma und bietet so einen Erklärungsansatz für das überdurchschnittlich
schnelle Absinken der Konzentrationen dieser beiden Pferde. Die Nachweisgrenze
für Carboxydetomidin wurde relativ einheitlich nach durchschnittlich 31 ± 6 Stunden
unterschritten. In der Studie von CHUI et al. (1991) wurde 3-Hydroxydetomidin nach
der Applikation von 20 mg Detomidin-Hydrochlorid/Tier bis 48 Stunden p. a. im Urin
detektiert. Da in der vorliegenden Arbeit aber selbst das schwerste Tier mit 15,24 mg
Detomidin-Hydrochlorid eine niedrigere Konzentration erhalten hatte, ist die kürzere
Detektionszeit nicht verwunderlich. Carboxydetomidin hingegen wurde nach einer
Dosierung von 5 µg/kg KM i. m. bis 23 Stunden p. a. im Urin gefunden (SEYMOR et
al., 1991). Die längere Ausscheidungszeit in der vorliegenden Arbeit ist also durch
die 4 mal höhere Dosierung erklärbar.
Die interindividuellen Unterschiede in der Ausscheidungszeit machen deutlich, dass
die Beurteilung des Ausscheidungsverhaltens einer Substanz anhand ihrer
Konzentration im Urin mit erheblichen Unsicherheiten verbunden ist. Hierfür ist vor
allem die unterschiedliche Harnproduktion der einzelnen Individuen verantwortlich zu
machen. Sie variiert aufgrund des Einflusses verschiedener physiologischer und
exogener Faktoren erheblich. Dazu gehören die diurale Kapazität der Nieren, das
Nahrungsangebot und die Wasseraufnahme, körperliche Belastung, Haltungs-
bedingungen und auch der Gesundheitszustand der Pferde (SAMS, 1992; DYKE u.
SAMS, 1994B). Zusätzlich können Änderungen des pH-Wertes in den sauren oder
basischen Bereich die Ausscheidung von Arzneimitteln erheblich beeinflussen (PICK,
1993). Im Vorfeld dieser Arbeit war deshalb überlegt worden, den gesamten Urin
aller Pferde über die Dauer der Probennahme mittels Urinauffangschürzen zu
sammeln. Dies hätte die Ermittlung der ausgeschiedenen Menge Hydroxy- und
Carboxydetomidin pro Zeiteinheit ermöglicht. Aufgrund der schlechten praktischen
Durchführbarkeit und der erhöhten Belastung für die Tiere sowie die Einschränkung
der pharmakodynamischen Untersuchungen war auf diesen Ansatz jedoch verzichtet
worden. Dennoch ermöglicht die kumulative Darstellung der im Urin
ausgeschiedenen Mengen der Metaboliten einen anschaulichen Vergleich zwischen
DISKUSSION 133
ursprünglich verabreichter Dosis und Ausscheidungsmenge pro Pferd. Zur
Urinmenge werden 24 bis 48 ml/kg KM/Tag angegeben (SCHÄFER, 1999). In
Abbildung 27 beziehungsweise 30 wurden die ausgeschiedenen Mengen Hydroxy-
und Carboxydetomidin für eine Urinmenge von 24 ml/kg KM/Tag errechnet. So hat
Pferd 4 nach 30 Stunden 502 µg 3-Hydroxydetomidin und nach 36 Stunden 11469
µg Carboxydetomidin mit dem Urin ausgeschieden. Pferd 4 war mit 762 kg zugleich
das schwerste Tier der Studie und scheidet nach einer absolut verabreichten Menge
von 15240 µg Detomidin-Hydrochlorid auch die größte Menge Hydroxy- und
Carboxydetomidin mit dem Urin aus. Vergleichend hierzu stellt Pferd 7 das leichteste
Tier der Studie dar. Mit 441 kg KM erhielt dieses Tier eine Menge von 8820 µg
Detomidin-Hydrochlorid und schied kumulativ 194 µg 3-Hydroxydetomidin in den
ersten 30 Stunden und 2340 µg Carboxydetomidin in den ersten 36 Stunden p. a. mit
dem Urin aus. Auch aus der graphischen Darstellung wird deutlich, dass dieses
Pferd damit die geringste Menge Substanz im Vergleich zu den anderen Pferden der
Studie ausscheidet. Es muss jedoch klar sein, dass die Rückberechnung der
ausgeschiedenen Substanzmenge nicht präzise sein kann, da nicht der gesamte
Urin gesammelt und analysiert wurde. Weiterhin werden geringe Mengen von
Detomidin und seinen Metaboliten auf andere Weise eliminiert (BENET et al., 1996).
Hierbei kommt eine Verstoffwechselung in der Leber, eine längerfristige Ablagerung
in andere Gewebe oder die Ausscheidung mit dem Schweiß oder über die
Ausatemluft in Betracht. Zusätzlich ist mit dem Absinken der Konzentration unter die
Nachweisgrenze zwar keine Detektion der Substanzen mehr möglich, jedoch ist auch
zu diesem Zeitpunkt noch ein beachtenswerter Teil des Arzneimittels im Organismus
vorhanden. TOBIN et al. (1982) berechnet die im Organismus befindliche Zahl an
Wirkstoffmolekülen und beschreibt, dass Substanzen allgemein über einen Zeitraum
von circa 66 Halbwertszeiten aus dem Organismus ausgeschieden werden, bevor
das letzte Molekül eliminiert ist. Im vorliegenden Fall entspricht das einer Dauer von
etwa 20 Stunden.
Für Urin konnten die besten Ergebnisse nach der Aufarbeitung mit Hydrolyse durch
ß-Glukoronidase/Arylsulfatase erzielt werden. Messungen ohne Hydrolyse, die
beispielhaft an zwei Pferden durchgeführt wurden, wiesen darauf hin, dass
134 DISKUSSION
3-Hydroxydetomidin zu etwa 58 % frei und zu etwa 42 % glukoronidiert im Urin
vorliegt. Bei Carboxydetomidin ist das Verhältnis nahezu umgekehrt. Etwa 68 % der
Substanz liegen im Urin frei und nur 32 % konjugiert vor. Aufgrund der geringen
Anzahl Pferde, die an einem Vergleich der Aufarbeitung ohne und mit Hydrolyse
teilgenommen haben, sind die Werte jedoch nur als richtungsweisend einzuschätzen.
In der Literatur wurde noch nicht von einer Konjugation des Carboxymetaboliten
berichtet und freies 3-Hydroxydetomidin wurde nach Dünnschichtchromatographie
nur in geringeren Mengen im Urin des Pferdes gefunden (SEYMOUR et al., 1990).
5.4 Effektive und irrelevante Plasmakonzentration, irrelevante Urinkonzentration nach TOUTAIN und LASSOURD (2002), Ausscheidungszeit
Das pharmakokinetische/pharmakodynamische Modell von TOUTAIN und
LASSOURD (2002) führt zur Ermittlung von effektiven und irrelevanten
Plamsmakonzentrationen, sowie irrelevanten Urinkonzentrationen von Detomidin.
Denkansatz zu diesem Modell ist die Problematik, das mit der aktuellen Regelung,
alle Urin- und Plasmaproben, in denen Substanzen gefunden werden für die keine
Grenzwerte bestehen oder die ihren Grenzwert überschreiten, positiv im Sinne von
Doping eingestuft werden. Dabei ist die Entscheidung unabhängig davon, ob noch
eine pharmakologische Wirkung bei dieser Konzentration vorliegt oder nicht. Da die
üblichen Analysemethoden für Wirkstoffe in Urin und Plasma jedoch sehr sensibel
sind (TOBIN et al., 1999) und ihre Weiterentwicklung dazu führt, dass in Zukunft
immer geringere Konzentrationennachgewiesen werden können, wird von TOBIN et
al. (1999) der Lösungsansatz eines Wirkungs-Schwellenwertes für einzelne
Substanzen vorgeschlagen.
Auch TOUTAIN und LASSOURD (2002) erscheint es sinnvoller, die Auswirkungen
eines Wirkstoffes auf den Körper zu prüfen, als seine reine Anwesenheit als Doping
zu bezeichnen. Daher berechnen sie irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen,
bei denen ein Wirkstoff keine relevante pharmakologische Wirksamkeit mehr besitzt.
DISKUSSION 135
Sind diese Konzentrationen bei einer Dopingprobe unterschritten, müsste keine
Reglementierung vorgenommen werden, da ein relevanter Effekt auf den Körper
ausgeschlossen werden kann. Zur Berechnung dieser Konzentrationen werden
pharmakokinetische und pharmakodynamische Daten der Wirkstoffe an der
Zielspezies benötigt. Da Detomidin meistens einmalig für einen bestimmten Zweck
verabreicht wird, kann das von TOUTAIN u. LASSOURD (2002) in der Berechnung
verwendete Dosierungsintervall für Detomidin nur anhand der in der vorliegenden
Studie beobachteten pharmakodynamischen Effekte abgeschätzt werden. Es wird
ein Dosierungsintervall von 4 Stunden angenommen, da Detomidin nach diesem
Zeitpunk keine signifikanten Wirkungen mehr an den Pferden zeigte (siehe 4.6).
Damit beträgt die für Detomidin berechnete effektive Plasmakonzentration (EPC)
durchschnittlich 2,76 ± 0,68 ng/ml, sie liegt somit knapp über der Bestimmungs-
grenze von 2,09 ng/ml. In der vorliegenden Arbeit wird die EPC im Durchschnitt nach
60 – 90 Minuten unterschritten.
Zur Berechnung der irrelevanten Plasmakonzentration (IPC) wurde ein
Sicherheitsfaktor einbezogen. Dieser setzt sich nach TOUTAIN und LASSOURD
(2002) für viele Wirkstoffe aus den Faktoren 10 und 50 zum Ausgleich
interindividueller Schwankungen und Gewährleistung der Validität der Daten
zusammen. Auch in den eigenen Berechnungen wurde ein Sicherheitsfaktor von 500
angenommen. Dadurch ergab sich für die IPC eine Wert von durchschnittlich 0,0055
ng/ml. Dieser liegt weit unter der Nachweisgrenze von 1,67 ng/ml Plasma. Es muss
also davon ausgegangen werden, dass für keine unter der Quantifizierungsgrenze
liegende Konzentration eine Unterscheidung zwischen effektiver und nicht effektiver
Konzentration möglich ist. Der Einsatz dieses Grenzwertes ist daher wenig sinnvoll,
da eine nachweisbare Menge Detomidin im Plasma nach TOUTAIN und LASSOURD
(2002) immer im Bereich einer effektiven Plasmakonzentration liegen würde. In
diesem Fall würde jede detektierbare Menge Detomidin als Doping angesehen und
positiv berichtet werden.
Zur Berechnung einer irrelevanten Urinkonzentration (IUC) nach TOUTAIN und
LASSOURD (2002) wurde die IPC mit dem Urin/Plasma-Konzentrationsverhältnis im
136 DISKUSSION
Steady State (Rss) multipliziert. Hierfür wurde in eigenen Untersuchungen die
durchschnittliche Plasmakonzentration und die durchschnittliche Urinkonzentration
im Dosierungsintervall von 4 Stunden ermittelt. Danach ergab die Rss einen Wert von
durchschnittlich 80,62 was eine IUC von 0,43 ng/ml (siehe Tabelle 36) bedingt. Das
Verhältnis von Plasma- zu Urinkonzentration ist aber vielen Einflüssen unterworfen.
Deshalb kann der Wert der Rss erheblich schwanken. Beeinflussende Parameter sind
hierbei beispielsweise der pH-Wert des Urins oder die diuretische Leistung der
Nieren (SAMS, 1992). Auch TOUTAIN und LASSOURD (2002) weisen darauf hin,
dass der Einsatz der Rss als nicht konstanter Faktor, eine zusätzliche Unsicherheit in
der Berechnung der IUC darstellt und Urin damit eine eher ungeeignete Matrix zur
Bestimmung irrelevanter Wirkstoffkonzentrationen ist.
Mit einer Gleichung nach KIETZMANN (1983) wurden zusätzlich die
Ausscheidungszeiten von Detomidin bis zum Erreichen der IPC, der
Quantifizierungsgrenze (LOQ) und Nachweisgrenze (LOD) bestimmt (siehe Tabelle
37). Die Zeit bis zum Erreichen der IPC lag durchschnittlich bei allen Pferden bei 3,9
± 1,4 Stunden, was mit der Annahme einer Wirkdauer von etwa vier Stunden
korreliert (siehe 4.6). Die interindividuellen Schwankungen von über einer Stunde
verdeutlichen auch hier die Problematik, auf Grundlage dieser Berechnungen
allgemeingültige Aussagen zu treffen. Die Ausscheidungszeit von Detomidin bis zum
Erreichen der Quantifizierungsgrenze (LOQ) unterliegt weniger großen Variationen,
der berechnete Zeitpunkt ist jedoch, verglichen mit der durchschnittlichen
Konzentrations-Zeit-Kurve als zu früh einzuschätzen. Die berechnete ta(LOQ) liegt im
Durchschnitt bei 1,1 ± 0,3 Stunden, während die visuelle Überprüfung der
Konzentrations-Zeit-Kurve eine Ausscheidungszeit von etwa 1,5 Stunden bis zum
Erreichen der Bestimmungsgrenze ergibt. Dasselbe gilt für die mit 1,2 ± 0,4 Stunden
errechnete Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der Detektionsgrenze. Anhand der
visuellen Überprüfung liegt sie eher im Bereich um 2 Stunden nach der Applikation
und ist mittels der Berechnung zu vorsichtig angegeben.
DISKUSSION 137
5.5 Vergleich der pharmakodynamischen Daten mit den Ergebnissen der pharmakokinetischen Berechnungen
In der vorliegenden Arbeit wurden zusätzlich die Parameter Herzfrequenz,
Atemfrequenz, Körpertemperatur, der Grad der Sedation und das Ausmaß der
analgetischen Wirksamkeit von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM ermittelt. Sie
dienen dem Vergleich zwischen praktisch ermittelten und theoretischen, anhand
mathematischer Berechnungen erstellter, Aussagen über die Wirkdauer dieses
Arzneistoffes.
Die Bewertung der Sedation erfolgte über den gesamten Versuch lediglich von einer
Person, was eine einheitliche Bewertungsgrundlage für die Parameter
Kopftiefhaltung, Reaktion auf einen akustischen und einen visuellen Reiz bedeutete.
Die Kopftiefhaltung wird von vielen Autoren als objektives Anzeichen einer Sedation
angesehen (FEDDERN, 1986; SHORT et al., 1986; ALITALO, 1986; HAMM et al.,
1995). In der vorliegenden Studie erzeugte Detomidin innerhalb von 2 Minuten nach
der Applikation ein deutliches Hängenlassen des Kopfes bei allen Pferden. Im Mittel
hielten alle Pferde ihre Köpfe innerhalb der ersten Stunde p. a. tief gesenkt. Danach
ließ die sedierende Wirkung langsam nach, bis nach 4 Stunden alle Tiere wieder
eine normale Kopfhaltung zeigten. Ein akustischer Reiz erfolgte immer möglichst
einheitlich von einer Person in definiertem Abstand vom Pferd. Problematisch war die
individuelle Reaktivität der Tiere auf den Reiz. Während schreckhafte Tiere eine
deutlichere Reaktion auf das Geräusch zeigten, begegneten zwei der Tiere dem
Rasseln eher mit Neugier. Deshalb wurde die Reaktion während des Versuches auf
den Reaktionszustand vor der Applikation bezogen. Trotz dieser Schwierigkeit
konnte bei allen Pferden eine deutlich verminderte bis erloschene Reaktionsfähigkeit
innerhalb der ersten Stunde p. a. ermittelt werden. Die Basiswerte wurden erst 4
Stunden nach der Applikation wieder erreicht. In Anlehnung an ein Modell von
HAMM et al. (1995) wurde die Reaktion auf einen visuellen Reiz mittels einer roten
Tüte, die vor dem Kopf der Tiere hin und her geschwungen wurde, ermittelt. Es
wurde strikt darauf geachtet, immer denselben Abstand zum Pferd einzuhalten und
während der Bewegung keine zusätzlichen Geräusche zu verursachen. Die Reaktion
138 DISKUSSION
der Tiere war insgesamt intensiver als auf den akustischen Reiz. Bei der Ermittlung
der Ruhewerte war das Schwenken der Tüte in allen Fällen mit einem deutlichen
Zurückweichen und Anzeichen von Nervosität verbunden. Nach der Applikation von
Detomidin-Hydrochlorid konnte eine deutliche Verminderung der Reaktivität
innerhalb der ersten Stunde festgestellt werden, was die sedierende Wirkung von
Detomidin verdeutlicht. Weder in Bezug auf den akustischen Reiz, noch im Fall der
visuellen Provokation, ist von einer Gewöhnung an die Stimuli auszugehen, da alle
Tiere nach etwa vier Stunden wieder ihre Ausgangsreaktivität ohne Anzeichen einer
Konditionierung erreichten.
Für die genannten Parameter wurde ein Punkte-Bewertungsschema ausgearbeitet,
das basierend auf der Summe der Punkte der einzelnen Parameter den
Sedationsgrad jedes Pferdes gesamtheitlich beurteilt. Es wurden sowohl für die
Kopftiefhaltung, als auch für die Reaktion auf den akustischen, beziehungsweise den
visuellen Reiz jeweils 0 – 3 Punkte vergeben. Daraus ergibt sich eine Gesamt-
punktsumme für den Sedationsgrad von 0 – 9. Bei 0 Punkten liegt keine Sedation
vor. Bei einer hochgradigen Sedation ohne Reizantwort ergeben sich maximal 9
Punkte. Der Vergleich des durchschnittlichen Sedationsgrades mit der
Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (Abbildung 39) macht deutlich, dass die sedative
Wirkung von Detomidin praktisch zeitgleich mit der Applikation einsetzt. Diese für
den Wirkungseintritt ermittelten Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen von
LOWE und HILFIGER (1984), CLARKE und TAYLOR (1986) und JÖCHLE und
HAMM (1986) überein. Über eine Stunde kann eine hochgradige Sedation bei allen
Tieren beobachtet werden, wobei die maximalen Effekte hier nicht nach 15, sondern
nach 30 Minuten zu beobachten waren. Nach zwei Stunden waren immer noch
deutliche Anzeichen der Sedation bei allen Pferden für alle drei Parameter im Mittel
vorhanden. Erst vier Stunden p. a. konnte keine sedative Wirkung mehr festgestellt
werden. Vergleichbar zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit führten 20 µg
Detomidin-Hydrochlorid/kg KM in Studien von HAMM und JÖCHLE (1986) zu einer
sehr tiefen und zufriedenstellenden Sedation in der ersten Stunde p. a. mit deutlicher
Sedation von bis 3 zu Stunden Dauer. Auch CLARKE und TAYLOR (1986) sprechen
von einer tiefen Sedation über eine Dauer von etwa 1 Stunde. Vergleicht man die
DISKUSSION 139
Dauer dieser Wirkung mit dem Zeitpunkt des Unterschreitens der nach TOUTAIN
und LASSOURD (2002) ermittelten effektiven Plasmakonzentration von
durchschnittlich 2,76 ± 0,68 ng/ml, so ist ersichtlich, dass bei Erreichen dieser
Konzentration nach 60 bis 90 Minuten noch ein pharmakologischer Effekt
festzustellen ist. Hier sind theoretische Ermittlung und praktische Überprüfung zu
demselben Ergebnis gelangt. Die ineffektive Plasmakonzentration (IPC) hingegen
liegt mit durchschnittlich 0,0055 ng/ml weit unterhalb der Nachweisgrenze von 1,67
ng/ml Plasma.
Alternativ erfolgte die Berechnung der Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der IPC
nach KIETZMANN (1983). Sie liegt bei allen Pferden durchschnittlich bei 4 Stunden
und damit in dem Bereich, der auch praktisch für die Dauer der sedativen Effekte
ermittelt wurde. Der Vergleich der ineffektiven Urinkonzentration (IUC) mit der
ermittelten Dauer der sedativen Effekte ist schwierig, weil der theoretisch ermittelte
Wert der IUC von 0,43 ng/ml weit unterhalb der Nachweisgrenze liegt.
Der Schmerzbeurteilung beim Tier sind enge Grenzen gesetzt, da Schmerz als
subjektives Empfinden einer objektiven Erfassung nicht zugänglich gemacht werden
kann (LANZ, 1998). In der vorliegenden Arbeit wurde in Anlehnung an den von
JÖCHLE und HAMM (1986) sowie HAMM et al. (1995) entwickelten Reizgenerator
ein Stromreiz zur Überprüfung der analgetischen Wirksamkeit von Detomidin
verwendet. Dieses Schmerzmodell wurde ausgewählt, weil es wichtige
Voraussetzungen erfüllt, um aussagekräftige Resultate zu liefern (KAMERLING et
al., 1985; JÖCHLE u. HAMM, 1986; BRUNSON et al., 1987). Dazu gehört, dass der
Stimulus, der eine Antwort auslöst, so gering wie möglich sein soll. Die Antwort soll
möglichst natürlich, schnell und wiederholbar sein und sowohl der Reiz als auch die
Reaktion müssen quantifizierbar sein. Bei einer Reaktion muss der Stimulus sofort
beendet werden können, und es darf keine Gewebeschädigung eintreten. Nach
LANZ (1998) erfüllt ein Stromtestmodell die genannten Anforderungen und liefert
objektivierbare Ergebnisse. In der vorliegenden Studie reagierten alle 10 Pferde im
Ruhezustand schon bei 5 mA mit dem Anheben der gereizten Gliedmaße. Nach der
Applikation von Detomidin wurden individuell stark variierende Stromstärken
140 DISKUSSION
benötigt, um zu einer Reizantwort zu führen. Während Pferd 1 nach 10 Minuten auf
den maximalen Reiz von 40 mA gerade noch reagierte, war es bei Pferd 9 lediglich
einmal nach 30 Minuten möglich, eine erhöhte Reizschwelle von 10 mA zu erreichen.
Dieses Tier verhielt sich in Bezug auf die analgetische Wirksamkeit deutlich anders
als die übrigen 9 Tiere. Da jedoch bei Schmerzmodellen individuelle Grenzen
innerhalb einer Population durchaus zu erwarten waren, wurde Pferd 9 mit in die
durchschnittliche Berechnung für eine Reizantwort einbezogen. Durchschnittlich war
die analgetische Wirksamkeit 2 Minuten p. a. bereits deutlich ausgeprägt und
erreichte nach 30 Minuten ihr Maximum. Diese Ergebnisse bestätigen Resultate von
ALITALO und VAINIO (1982). JÖCHLE und HAMM (1986) beschrieben nach einer
Dosierung von 20 µg/kg KM eine 15 bis 60 Minuten andauernde Analgesie der
Gliedmaßen. In der eigenen Studie sind nach 2 Stunden bereits fast wieder die
Basiswerte erreicht, so dass von einer kürzeren Dauer der Analgesie im Vergleich
zur sedativen Wirkung von Detomidin gesprochen werden kann. Vergleicht man das
Ergebniss der analgetischen Wirkung mit der nach TOUTAIN und LASSOURD
(2002) ermittelten EPC, so ist ersichtlich, dass bei Erreichen dieser Konzentration
bereits kein analgetischer Effekt mehr erkennbar ist. Die theoretische Berechnung
der Parameter EPC, IPC und IUC trifft also nicht für die analgetische Wirksamkeit
von Detomidin zu.
Detomidin führt, wie auch die meisten anderen α2-Adrenozeptor-Agonisten zu einem
deutlichen Absinken der Herzfrequenz. Dies wird sowohl beim Pferd (VAINIO, 1985;
SHORT et al., 1986) als auch beim Rind (ALITALO u. VAINIO, 1982) beschrieben.
Die in dieser Studie für den Wirkungseintritt ermittelte Zeit von 2 Minuten stimmt mit
Ergebnissen von VAINIO (1985) und SHORT et al. (1986) überein. Über einen
Zeitraum von 3 Stunden blieben die Werte für alle Pferde im Mittel signifikant
erniedrigt. Die Ruhewerte wurden erst wieder 6 Stunden p. a. erreicht. FEDDERN
(1986) berichtet über eine signifikante Veränderung der Herzfrequenz über 70
Minuten, während SARAZAN et al. (1989) eine über 120 Minuten anhaltende
Bradykardie feststellten. Eventuell wurde durch die unter Punkt 3.2.4 beschriebene
Versuchsanordnung mit möglichst wenig Irritationen der Tiere durch Personen oder
Handling ein verstärkter vagaler Tonus, verglichen mit anderen Studien,
DISKUSSION 141
aufrechterhalten, was zu einer verlängerten Erniedrigung der Herzfrequenz geführt
haben kann.
Trotz der kontroversen Angaben in der Literatur zur Veränderung der Atemfrequenz
unter dem Einfluss von Detomidin, konnte in der vorliegenden Arbeit eine signifikante
Abnahme der Atemfrequenz über einen Zeitraum von 3 Stunden festgestellt werden.
Dieses Ergebnis widerspricht damit den Angaben von FEDDERN (1986),
REITMEYER et al. (1986) und DAUNT et al. (1993), die einen signifikanten Anstieg
beziehungsweise keine signifikante Veränderung der Atemfrequenz beschrieben.
Die Körperinnentemperatur fiel für die Dauer von zwei Stunden nach der Applikation
signifikant bei allen Pferden ab. Dieses Phänomen war bis dahin nur an Ratten
festgestellt worden (VIRTANEN u. MACDONALD, 1985; VIRTANEN, 1986).
Beachtenswert ist der Anstieg der Temperatur über den Ausgangswert hinaus. Nach
etwa 7 Stunden p. a. erreicht sie 38°C. Eventuell ist dieser Anstieg über den
Basiswert hinaus durch die erhöhte Bewegungsaktivität der Tiere nach der langen
Phase des Stehens im Beobachtungsstand zu erklären. Vergleicht man die Dauer
der signifikanten Veränderungen von Herzfrequenz, Atemfrequenz und Körper-
temperatur mit der nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) ermittelten EPC kann
festgestellt werden, dass für alle drei Parameter der theoretische Wert der EPC
durch die praktische Ermittlung bestätigt werden kann. Für die IPC und IUC ergeben
sich die unter der Bewertung des Sedationsgrades genannten Probleme.
Das Ausmaß der pharmakologischen Wirkung einer Substanz wird durch die Anzahl
an Rezeptoren für den Wirkstoff, sowie dessen Affinität zum Rezeptor bestimmt
(SAMS, 1992; KAMERLING u. OWENS, 1994). Nach intravenöser Applikation wird
für alle überprüften Parameter schnell das Wirkungsmaximum erreicht. Durch die
Verteilung im Organismus und die abhängige Veränderung der Wirkstoff-
konzentration im Zielgewebe, kann die unterschiedliche Dauer verschiedener
pharmakologischer Wirkungen durch verschieden lange Besetzung der Rezeptoren
erklärt werden.
142 DISKUSSION
5.6 Bewertung der Ergebnisse
Mit dieser Arbeit wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis von
Detomidin und seinen Metaboliten in Plasma und Urin entwickelt und validiert. Die
Etablierung dieser Methode in die internationale Routinediagnosik kann zum
vereinheitlichten Nachweis von Detomidin in Dopingproben genutzt werden.
Die Ermittlung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Detomidin nach
TOUTAIN und LASSOURD (2002) sollte der Prüfung der Möglichkeit der
Bestimmung von Grenzwerten dienen. Im Gegensatz zur aktuellen sogenannten
„Null-Lösung“ könnten Grenzwerte den Einsatz von Detomidin zu therapeutischen
Zwecken vor einem Wettkampf ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass
theoretische Werte nicht immer mit den praktisch erhaltenen Ergebnissen
übereinstimmen. Während die effektive Plasmakonzentration nach TOUTAIN und
LASSOURD (2002) durch die Resultate dieser Studie bestätigt wird, liegen die
irrelevante Plasma- und Urinkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze der
entwickelten Methode und können daher als nicht praxixsrelevant beurteilt werden.
Die nach KIETZMANN (1983) ermittelte Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der
IPC stellt sich als praktikables Werkzeug für die Bestimmung von Eliminationszeiten
im Plasma dar. Die berechneten Ausscheidungszeiten bis zum Erreichen der
Bestimmungs- und Nachweisgrenze hingegen können durch die Ergebnisse der
Analyse nicht bestätigt werden.
Ein großer Vorteil der erhaltenen Ergebnisse dieser Studie ist die Möglichkeit des
direkten Vergleichs zwischen theoretischer Berechnung und gleichzeitiger
praktischer Überprüfung der Ergebnisse. Es wird deutlich, dass bei der Berechnung
kinetischer Daten interindividuelle Variationen berücksichtigt werden und in die
Interpretation der Ergebnisse einfließen müssen. Aufgrund der relativ zur
Gesamtpopulation noch immer geringen Anzahl von Versuchstieren, können die
ermittelten Daten nicht einfach auf alle Pferde übertragen werden. Um den Schutz
der Tiere vor den Folgen eines missbräuchlichen Einsatzes von Detomidin zum
Zwecke des Dopings zu schützen, müssen klare, auf die Gesamtpopulation
DISKUSSION 143
zutreffende Bestimmungen geschaffen werden. Eine Ermittlung von Grenzwerten für
Detomidin in Dopingproben ist daher zur Zeit nicht sinnvoll. Das bedeutet, dass jeder
Nachweis von Detomidin oder seinen Metaboliten in Plasma oder Urin als positiver
Dopingbefund bewertet werden muss.
144 ZUSAMMENFASSUNG
6 ZUSAMMENFASSUNG
Severine Tobias (2004):
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer geeigneten
Analysemethode für Detomidin in Pferdeplasma- und -urinproben, um pharmako-
kinetische Berechnungen sowie pharmakodynamische Untersuchungen an Pferden
durchzuführen.
Grundlage für die Entwicklung der Methode waren im Institut für Biochemie der
Deutschen Sporthochschule Köln etablierte Routineverfahren, die durch in einem
Vorversuch gewonnene Proben speziell für Detomidin modifiziert wurden. Sowohl im
Vor- als auch im Hauptversuch wurde Pferden Detomidin-Hydrochlorid in einer
mittleren therapeutischen Dosierung von 20 µg/kg KM einmalig intravenös appliziert.
Der Nachweis von Detomidin im Plasma erfolgte nach einer Flüssig-Flüssig-
Extraktion mittels HPLC/MS/MS-Methode. Für die Detektion von Detomidin und
seinen Metaboliten 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin wurde eine
Aufarbeitung mit Ionenaustauschersäulen entwickelt. Auch diese Proben wurden
nach Einengung des Volumens der Messung im HPLC/MS/MS zugeführt.
Vergleichsweise wurden Urinproben mit und ohne Hydrolyse aufgearbeitet, um den
Anteil an frei ausgeschiedenem 3-Hydroxy- und Carboxydetomidin bestimmen zu
können. Als interne Standards wurden Medetomidin und Imidazolylbenzoesäure
verwendet.
Die Validierung der Methode umfasste die Parameter Selektivität und Spezifität,
Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Bestimmungs-
grenze lag im Plasma bei 2,09 ng/ml und im Urin bei 10 ng/ml für 3-
Hydroxydetomidin und 50 ng/ml für Carboxydetomidin. Die Nachweisgrenze für
Detomidin im Plasma betrug 1,67 ng/ml. Für 3-Hydroxydetomidin lag die
Nachweisgrenze bei 10 ng/ml und für Carboxydetomidin bei 50 ng/ml.
ZUSAMMENFASSUNG 145
Maximale Konzentrationen von Detomidin im Plasma wurden 2 beziehungsweise 5
Minuten p. a. ermittelt und lagen zwischen 12 und 35 ng/ml Plasma. Die maximalen
Konzentration von 3-Hydroxydetomidin wurden mit 31 bis 130 ng/ml Urin 3 bis 6
Stunden p. a. gemessen. Carboxydetomidin erreichte seine höchsten Konzen-
trationen von 450 bis 1550 ng/ml Urin im Zeitraum 5 bis 8 Stunden p. a. Die
Nachweisgrenze wurde im Plasma nach 3 Stunden, im Urin nach 24 Stunden (3-
Hydroxydetomidin) beziehungsweise 30 Stunden (Carboxydetomidin) unterschritten.
Die ermittelten pharmakokinetischen Daten wurden zur Berechnung der effektiven
beziehungsweise irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen nach dem PK/PD-
Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) herangezogen. Bei einem
angenommenen Dosierungsintervall von vier Stunden liegen die irrelevante Plasma-
und Urinkonzentration deutlich unterhalb der Nachweisgrenze für die verwendete
Methode. Es ist daher davon auszugehen, dass jeglicher Nachweis von Detomidin
oder seinen Metaboliten als positiver Dopingbefund zu bewerten ist.
Neben der Gewinnung von Plasma- und Urinproben für die pharmakokinetischen
Untersuchungen wurden pharmakodynamische Parameter wie Herz- und
Atemfrequenz, Körpertemperatur, Sedationsgrad und Grad der analgetischen
Wirkung erfasst und mit den berechneten irrelevanten Plasma- und
Urinkonzentrationen nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) und zusätzlich
berechneten Ausscheidungszeiten verglichen. Durch den in dieser Studie
ermöglichten Vergleich zwischen praktischer und theoretischer Ermittlung von
Ausscheidungszeiten und pharmakologischen Wirkungen wurde deutlich, dass
theoretische Berechnungen der irrelvanten Plasma- und Urinkonzentrationen, sowie
verschiedener Ausscheidungszeiten nicht immer mit den im Tierversuch ermittelten
Ergebnissen übereinstimmen. Aufgrund der relativ zu Gasamtpopulation noch immer
geringen Anzahl von Versuchstieren und beachtenswerter interindividueller
Variabilität sollte keine, auf die Gesamtpopulation übertragbare, Aussage zu
Ausscheidungszeiten getroffen und jeder Nachweis von Detomidin oder seinen
Metaboliten als positiver Dopingbefund betrachtet und geahndet werden.
146 SUMMARY
7 SUMMARY
Severine Tobias (2004):
Investigation of pharmacocinetic mechanisms of the drug detomidine with respect to ist relevance in horse-doping
The aim of this study was to develop and validate a suitable method for the analysis
of detomidine in equine plasma and urinesamples and evaluate its application for
pharmacocinetic calculations and pharmacodynamic examinations on horses.
The analytical method was based upon some established routine procedures at the
Institute of Biochemistry at the Deutsche Sporthochschule in Cologne, which were
specially modified for the substance detomidine using samples collected in a
preliminary study. The horses in the preliminary experiment as well as in the main
expermiment received detomidine-hydrochloride in a middle-ranged therapeutical
dose of 20 µg/kg body weight intravenously. The detection of detomidine in plasma
was performed using a HPLC/MS/MS-method after liquid-liquid-extraction. For the
diagnosis of detomidine and its metabolites 3-hydroxydetomidine and
carboxydetomidine in urine an additional recondition step using cation-exchange-
cartridges was developed. Following evaporation of the liquid volume these samples
were prepared for analysis in the HPLC/MS/MS as well. In comparison urinesamples
were prepared with or without hydrolysis to determine the unconjugated 3-hydroxy-
and carboxydetomidine. Medetomidine and imidazolylbencoicacid were used as
internal standards.
The validation of the analytical method was performed on the parameters selectivity
and specitivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The limit of
quantification was 2,09 ng/ml in plasma, 10 ng/ml for 3-hydroxydetomidine and 50
ng/ml for carboxydetomidine. The limit of detection was fixed at 1,67 ng/ml in plasma,
at 10 ng/ml for 3-hydroxydetomidine and 50 ng/ml for carboxydetomidine.
SUMMARY 147
Maximum concentrations of detomidine in plasma were detected 2 to 5 minutes p. a.
within the range of 12 and 35 ng/ml plasma. The maximum concentrations for 3-
hydroxydetomidine in urine were measured between 3 to 6 hours p. a. and varied
between 31 to 130 ng/ml. For carboxydetomidine the highest concentrations ranged
from 450 to 1550 ng/ml urine at 5 to 8 hours p. a. Detomidine in plasma samples was
detectable for only three hours p. a., while the concentration of 3-hydroxydetomdine
and carboxydetomidine were below the limit of detection after 24 and 30 hours
respectively.
The calculated pharmacocinetic data were integrated into a pharmacocinetic/
pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the
effective and irrelevant plasma and urine concentrations. Given a dosage interval of 4
hours within this study, it came clear that irrelevant plasma and urinconcentrations
were far below the detection-limit of the analytical method applied in this study.
Therefore, it has been concluded that any detection of detomidine or its metabolites
has to be considered as a positive dopingresult.
Additionally to sampling plasma and urine for the pharmacocinetic approach there
were investigated some pharmacodynamic parameters such as heart rate, respiration
rate, body temperature, level of sedation and analgesia were recorded and compared
to the effective and irrelevant plasma and urine concentrations calculated by the
pharmacocinetic/pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) as
well as calculated excretion times. With the opportunity of this study to compare
between practically and theoretically investigated data regarding excretion times and
pharmacological effects, it was shown that the thoretical calclation is not always
comparable to the data achieved in an animal experiment. Due to the fact that every
animal experiment has to compromise in the number of animals included, therefore
representing only a small part of the population, and with regards to notable
individual variation, no defined statement can be made for general excretion times.
Thus, every detection of either detomidine or its metabolites can be counted as a
positive doping result and should be punished according to the law.
148 LITERATURVERZEICHNIS
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ANHANG 163
9 ANHANG
Im Anhang finden sich folgende Tabellen:
Tabelle 38 Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben und ermittelte Konzentrationen
in ng/ml der Pferde 1 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)
Tabelle 39 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin
in ng/ml der Pferde 1 – 5 (n.n. = nicht nachweisbar)
Tabelle 40 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin
in ng/ml der Pferde 6 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)
Tabelle 41 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in
ng/ml der Pferde 1 – 5 (n.n. = nicht nachweisbar)
Tabelle 42 Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in
ng/ml der Pferde 6 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)
Tabelle 43 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-
Hydroxydetomidin in ng/ml der Pferde 1 – 5
Tabelle 44 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-
Hydroxydetomidin in ng/ml der Pferde 6 – 10
Tabelle 45 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge
Carboxydetomidin in ng/ml der Pferde 1 – 5
Tabelle 46 Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge
Carboxydetomidin in ng/ml der Pferde 6 – 10
164 ANHANG
p19 36 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p18 24 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p17 12 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p16 10 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p15 8 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p14 7 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p13 6 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p12 5 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p11 4 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p10 3 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n.
p9 2 1 n.n. 2 2 2 2 n.n. n.n. 1 n.n.
p8 1,5 2 1 2 2 3 2 1 1 1 2
p7 1 3 3 3 4 3 4 2 2 2 3
p6 0,75 5 4 5 6 6 6 4 3 3 5
p5 0,5 8 7 10 8 9 7 8 6 7 8
p4 0,25 14 12 16 16 14 14 12 11 14 19
p3 0,17 16 16 22 17 21 18 17 16 17 24
p2 0,08 20 18 28 18 23 17 18 19 22 30
p1 0,03 12 16 21 22 27 22 17 22 20 35
p0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Pferd 8 [ng/ml]
Pferd 9 [ng/ml]
Pferd 10 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkt
[h]
Pferd 4 [ng/ml]
Pferd 5 [ng/ml]
Pferd 6 [ng/ml]
Pferd 7 [ng/ml]Probe Pferd 2
[ng/ml]Pferd 1 [ng/ml]
Pferd 3 [ng/ml]
Tabelle 38: Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben und ermittelte Konzentrationen in ng/ml der
Pferde 1 – 10 (n. n. = nicht nachweisbar)
ANHANG 165
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 1 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 2 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 3 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 4 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 5 [ng/ml]
u17 144 n.n.
u16 120 n.n.
u15 96 n.n. 144 n.n.
u14 72 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 144,00 n.n.
u13 48 n.n. 96 n.n. 144,00 n.n. 120 n.n. 120,00 n.n.
u12 36,03 n.n. 69,33 n.n. 120,00 n.n. 96 n.n. 96,00 n.n.
u11 30 n.n. 48 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 72 n.n.
u10 24,6 n.n. 35,9 n.n. 70,64 n.n. 48 n.n. 48 n.n.
u9 12,6 n.n. 30 n.n. 46,63 n.n. 35,93 n.n. 36,03 n.n.
u8 11,88 2 23,95 n.n. 36 n.n. 30 n.n. 30 n.n.
u7 8,75 5 12,08 n.n. 30 n.n. 23,9 n.n. 24,03 2
u6 6,6 13 10,08 8 24 1 11,93 16 12,08 32
u5 5,95 28 7,9 18 11,9 21 9,75 26 9,98 47
u4 4,5 32 6,83 24 9,2 37 7,72 45 8,03 41
u3 3,25 56 4,66 47 5,77 63 5,58 59 5,95 76
u2 2,25 5 4,03 130 4,07 101 3,5 48 4,01 106
u1 1,58 10 2,1 114 1,98 42 1,82 22 1,63 23
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 39: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin in ng/ml der
Pferde 1 – 5 (n.n. = nicht nachweisbar)
166 ANHANG
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 6 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 7 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 8 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 9 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 10
[ng/ml]
u17
u16
u15 144 n.n. 144 n.n.
u14 144 n.n. 144 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 120 n.n.
u13 120 n.n. 120 n.n. 96 n.n. 120 n.n. 96 n.n.
u12 96 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 96 n.n. 72 n.n.
u11 72 n.n. 72 n.n. 48 n.n. 72 n.n. 48 n.n.
u10 48 n.n. 48 n.n. 36,5 10 48 7 35,93 n.n.
u9 36,07 n.n. 35,93 n.n. 30 8 35,88 7 30 n.n.
u8 30 n.n. 30 6 23,97 8 30 8 24 9
u7 23,85 n.n. 23,95 10 11,95 35 24 11 11,95 26
u6 11,92 28 11,93 27 9,95 26 12,12 13 9,98 40
u5 9,92 38 10 29 8,08 27 9,82 25 7,97 47
u4 8,03 55 8,25 23 6,08 34 7,92 23 6,08 73
u3 5,90 66 7,05 25 4,82 33 5,95 31 4,08 95
u2 4,00 85 5,12 49 3,25 22 4,03 27 2,62 78
u1 1,95 8 3,23 5 1,67 14 2,2 19 1,23 34
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 40: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen 3-Hydroxydetomidin im Urin in ng/ml der
Pferde 6 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)
ANHANG 167
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 1 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 2 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 3 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 4 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 5 [ng/ml]
u17 144 n.n.
u16 120 n.n.
u15 96 n.n. 144 n.n.
u14 72 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 144,00 n.n.
u13 48 n.n. 96 n.n. 144,00 n.n. 120 n.n. 120,00 n.n.
u12 36,03 22 69,33 n.n. 120,00 n.n. 96 n.n. 96,00 n.n.
u11 30 35 48 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 72 n.n.
u10 24,6 59 35,9 16 70,64 n.n. 48 n.n. 48 n.n.
u9 12,6 369 30 26 46,63 n.n. 35,93 n.n. 36,03 n.n.
u8 11,88 605 23,95 39 36 4 30 340 30 n.n.
u7 8,75 601 12,08 317 30 21 23,9 405 24,03 245
u6 6,6 633 10,08 736 24 53 11,93 454 12,08 682
u5 5,95 223 7,9 1547 11,9 595 9,75 540 9,98 818
u4 4,5 282 6,83 1528 9,2 521 7,72 580 8,03 1253
u3 3,25 159 4,66 830 5,77 960 5,58 621 5,95 1246
u2 2,25 24 4,03 143 4,07 443 3,5 153 4,01 689
u1 1,58 25 2,1 19 1,98 23 1,82 135 1,63 11
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 41: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in ng/ml der Pferde
1 – 5 (n.n. = nicht nachweisbar)
168 ANHANG
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 6 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 7 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 8 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 9 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 10
[ng/ml]
u17
u16
u15 144 n.n. 144 n.n.
u14 144 n.n. 144 n.n. 120 n.n. 144 n.n. 120 n.n.
u13 120 n.n. 120 n.n. 96 n.n. 120 n.n. 96 n.n.
u12 96 n.n. 96 n.n. 72 n.n. 96 n.n. 72 n.n.
u11 72 n.n. 72 n.n. 48 n.n. 72 n.n. 48 n.n.
u10 48 n.n. 48 n.n. 36,5 n.n. 48 n.n. 35,93 n.n.
u9 36,07 n.n. 35,93 n.n. 30 216 35,88 n.n. 30 27
u8 30 n.n. 30 n.n. 23,97 301 30 21 24 19
u7 23,85 86 23,95 40 11,95 1188 24 31 11,95 419
u6 11,92 223 11,93 153 9,95 1365 12,12 366 9,98 479
u5 9,92 394 10 156 8,08 1504 9,82 456 7,97 615
u4 8,03 358 8,25 388 6,08 1143 7,92 516 6,08 834
u3 5,90 448 7,05 1038 4,82 683 5,95 426 4,08 659
u2 4,00 283 5,12 761 3,25 274 4,03 73 2,62 189
u1 1,95 45 3,23 107 1,67 37 2,2 50 1,23 41
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 42: Entnahmezeitpunkte und Konzentrationen Carboxydetomidin im Urin in ng/ml der Pferde
6 – 10 (n.n. = nicht nachweisbar)
ANHANG 169
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 1 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 2 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 3 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 4 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 5 [ng/ml]
u17 144 418
u16 120 418
u15 96 418 144 377
u14 72 418 120 377 144 502 144,00 464
u13 48 418 96 377 144,00 386 120 502 120,00 464
u12 36,03 418 69,33 377 120,00 386 96 502 96,00 464
u11 30 418 48 377 96 386 72 502 72 464
u10 24,6 418 35,9 377 70,64 386 48 502 48 464
u9 12,6 418 30 377 46,63 386 35,93 502 36,03 464
u8 11,88 418 23,95 377 36 386 30 502 30 464
u7 8,75 402 12,08 377 30 386 23,9 502 24,03 464
u6 6,6 377 10,08 377 24 386 11,93 501 12,08 448
u5 5,95 325 7,9 366 11,9 376 9,75 356 9,98 404
u4 4,5 222 6,83 354 9,2 339 7,72 303 8,03 344
u3 3,25 131 4,66 321 5,77 258 5,58 185 5,95 287
u2 2,25 17 4,03 303 4,07 189 3,5 109 4,01 190
u1 1,58 10 2,1 148 1,98 53 1,82 33 1,63 25
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 43: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-Hydroxydetomidin in
ng/ml der Pferde 1 – 5
170 ANHANG
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 6 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 7 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 8 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 9 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 10
[ng/ml]
u17
u16
u15 144 230 144 413
u14 144 410 144 194 120 230 144 313 120 413
u13 120 410 120 194 96 230 120 313 96 413
u12 96 410 96 194 72 230 96 313 72 413
u11 72 410 72 194 48 230 72 313 48 413
u10 48 410 48 194 36,5 230 48 313 35,93 413
u9 36,07 410 35,93 194 30 230 35,88 267 30 413
u8 30 410 30 194 23,97 230 30 243 24 413
u7 23,85 410 23,95 178 11,95 179 24 217 11,95 355
u6 11,92 408 11,93 127 9,95 141 12,12 147 9,98 327
u5 9,92 368 10 104 8,08 114 9,82 131 7,97 283
u4 8,03 316 8,25 82 6,08 84 7,92 105 6,08 235
u3 5,90 230 7,05 69 4,82 61 5,95 80 4,08 157
u2 4,00 139 5,12 48 3,25 32 4,03 48 2,62 82
u1 1,95 12 3,23 8 1,67 13 2,2 22 1,23 23
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 44: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge 3-Hydroxydetomidin in
ng/ml der Pferde 6 – 10
ANHANG 171
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 1 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 2 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 3 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 4 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 5 [ng/ml]
u17 144 3600
u16 120 3600
u15 96 3600 144 5421
u14 72 3600 120 5421 144 9178 144,00 8316
u13 48 3600 96 5421 144,00 4345 120 9178 120,00 8316
u12 36,03 3600 69,33 5421 120,00 4345 96 9178 96,00 8316
u11 30 3516 48 5421 96 4345 72 9178 72 8316
u10 24,6 3400 35,9 5421 70,64 4345 48 9178 48 8316
u9 12,6 2958 30 5360 46,63 4345 35,93 9178 36,03 8316
u8 11,88 2792 23,95 5262 36 4345 30 9178 30 8316
u7 8,75 1614 12,08 4973 30 4331 23,9 7595 24,03 8316
u6 6,6 810 10,08 4582 24 4249 11,93 3902 12,08 6389
u5 5,95 554 7,9 3591 11,9 3839 9,75 3148 9,98 5447
u4 4,5 352 6,83 2568 9,2 2811 7,72 2313 8,03 4397
u3 3,25 133 4,66 518 5,77 1666 5,58 1367 5,95 2682
u2 2,25 34 4,03 195 4,07 622 3,5 384 4,01 1092
u1 1,58 24 2,1 25 1,98 29 1,82 187 1,63 12
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 45: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge Carboxydetomidin in ng/ml
der Pferde 1 – 5
172 ANHANG
ProbeEntnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 6 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 7 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 8 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 9 [ng/ml]
Entnahme-zeitpunkte
[h]
Pferd 10
[ng/ml]
u17
u16
u15 144 8755 144 3397
u14 144 3285 144 2340 120 8755 144 2302 120 3397
u13 120 3285 120 2340 96 8755 120 2302 96 3397
u12 96 3285 96 2340 72 8755 96 2302 72 3397
u11 72 3285 72 2340 48 8755 72 2302 48 3397
u10 48 3285 48 2340 36,5 8755 48 2302 35,93 3397
u9 36,07 3285 35,93 2340 30 8755 35,88 2302 30 3397
u8 30 3285 30 2340 23,97 8037 30 2302 24 3309
u7 23,85 3285 23,95 2340 11,95 6040 24 2236 11,95 3183
u6 11,92 2536 11,93 2127 9,95 4729 12,12 2037 9,98 2736
u5 9,92 2210 10 1997 8,08 3320 9,82 1584 7,97 2216
u4 8,03 1667 8,25 1876 6,08 1659 7,92 1118 6,08 1589
u3 5,90 1109 7,05 1670 4,82 864 5,95 571 4,08 688
u2 4,00 488 5,12 787 3,25 272 4,03 131 2,62 169
u1 1,95 64 3,23 152 1,67 34 2,2 60 1,23 27
u0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabelle 46: Entnahmezeitpunkte und kumulative ausgeschiedene Menge Carboxydetomidin in ng/ml
der Pferde 6 – 10
174
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für das Überlassen
des Themas, die stete Unterstützung und die außerordentlich gute Betreuung mit
Motivationsschüben zu allen Zeitpunkten.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für
Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln, wo insbesondere Herr Prof. Dr. W.
Schänzer, Dr. Marc Machnik, Dr. Mario Thevis, Herrn Opfermann und Sven Guddert
durch ihren fachlichen Beistand und die freundliche Aufnahme und Unterstützung im
Labor zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Mein Dank gilt weiterhin der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. in Warendorf,
im Besonderen Herrn Dr. Michael Düe für die Organisation der Versuchspferde und
die finanzielle Abdeckung der Kosten.
Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff der FAL Mariensee für die
freundliche und bereitwillige Überlassung der Versuchspferde und Einrichtungen der
FAL, sowie Herrn Jonny Meyer für seine unersetzliche Hilfe mit den Pferden und
allem was dazugehörte.
Ebenso bedanke ich mich bei Herrn Dr. Frank Niedorf und Herrn Dr. Karl Rohn für
den Einsatz und die Durchsicht der statistischen Auswertung der Ergebnisse, sowie
bei Herrn Hans-Herbert Bohr für die Beseitigung aller kurzfristig auftretenden
logistischen Probleme.
Ein besonderer Dank gilt meiner Mutter und meinen Großeltern, denn sie haben
durch ihre Unterstützung mein Studium, diese Arbeit und unzählige andere Dinge in
meinem Leben erst möglich gemacht und immer an mich geglaubt. Was wäre ich nur
ohne Euch?
Für die liebevolle und moralische Unterstützung, aber besonders die Tatsache, dass
Du mich in dieser stressigen Phase unseres Lebens zu Deiner Frau genommen hast,
möchte ich mich besonders herzlich bei meinem Mann Christoph bedanken.
175
Schließlich danke ich auch allen Freunden, Bekannten und Verwandten, die immer
an meiner Seite waren, wenn Not am Mann war und auf die ich mich immer
verlassen kann. Vor allem aber danke ich Suse und Irene - ohne Euch hätte ich nicht
durchgehalten; Christiane – Du bist und bleibst mein Computerheld; Karin, Ilka,
Marcus, Andi Fischer, Niko, Charlotte und allen, die ich jetzt noch vergessen habe.