Synthese von industriell relevanten Alkohol-, Keton- und ...Svenja... · Synthese von industriell...

Synthese von industriell relevanten

Alkohol-, Keton- und Lacton-Verbindungen

durch Redoxreaktionen mit

Biokatalysatoren

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Dipl.-Chem. Svenja Staudt

aus Nürnberg

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg.

Tag der mündlichen Prüfung: 12. August 2014

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Johannes Barth

Gutachter: Prof. Dr. Harald Gröger

apl. Prof. Dr. Norbert Jux

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie des Departments Chemie und

Pharmazie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg unter Leitung von Prof. Dr. Harald

Gröger in der Zeit von März 2010 bis September 2013 erstellt.

Veröffentlichungen

Teile dieser Arbeit sind bereits veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht:

S. Staudt, C. A. Müller, J. Marienhagen, C. Böing, S. Buchholz, U. Schwaneberg, H. Gröger

“Biocatalytic hydroxylation of n-butane with in situ cofactor regeneration at low temperature and

under normal pressure”

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 186-191.

S. Staudt, E. Burda, C. Giese, C. A. Müller, J. Marienhagen, U. Schwaneberg, W. Hummel, K. Drauz,

H. Gröger

„Direktoxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen mit Sauerstoff in Wasser“

Angew. Chem. 2013, 125, 2415-2419, Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 2359-2363.

S. Staudt, U. T. Bornscheuer, U. Menyes, W. Hummel, H. Gröger

“Direct biocatalytic one-pot-transformation of cyclohexanol with molecular oxygen into ε-capro-

lactone”

Enzyme Microb. Technol. 2013, 53, 288-293.

C. A. Müller, B. Akkapurathu, S. Staudt, W. Hummel, H. Gröger, U. Schwaneberg

“In vitro double-oxidation of n-heptane with direct co-factor regeneration”

Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 1787-1798.

Poster:

S. Staudt, C. A. Müller, J. Marienhagen, C. Böing, S. Buchholz, U. Schwaneberg, H. Gröger

“Biocatalytic hydroxylation of n-butane with in situ cofactor regeneration at low temperature and

under normal pressure”

Biotrans 2011, 02. Oktober - 06. Oktober 2011, Giardini Naxos (Messina), Sizilien, Italien.

Danksagung

Ich möchte mich in erster Linie bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Harald Gröger für die

intensive und sehr kompetente Betreuung, seine große fachliche Unterstützung, sein Verständnis

und sein stetiges Interesse an meiner Forschungsarbeit während meiner Promotion danken.

Desweiteren danke ich der „Deutschen Bundesstiftung Umwelt“ für die großzügige Förderung des

Verbundprojekts „Nachhaltige, biokatalytische Oxidationsprozesse“ (AZ-13234-32) sowie allen

Kooperationspartnern dieses Projekts.

Vor allem danke ich Herrn Prof. Dr. Ulrich Schwaneberg von Institut für Biotechnologie von der

Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen, Herrn Prof. Dr. Werner Hummel vom

Institut für Molekulare Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf und der Firma

Enzymicals AG aus Greifswald für die Bereitstellung der Enzyme. Ganz besonders danke ich hierbei

Dr. Christina Müller, die zur gleichen Zeit Ihre Promotion unter der Leitung von Prof. Dr. Ulrich

Schwaneberg anfertigte. Sie stellte die verschiedenen P450-Monooxygenasen aus Bacillus

megaterium her, die meiner Arbeit zur Verfügung standen und betreute mich äußerst sympathisch

während des Forschungsaufenthalts in der Biotechnologie der RWTH Aachen.

Ich danke der Evonik Oxeno GmbH für die großzügige Hochschulspende in Form des gasförmigen

n-Butans und das Ermöglichen eines Forschungsaufenthalts im Industriepark Marl.

Mein Dank gilt allen derzeitigen und ehemaligen Labor- und Arbeitskollegen Dr. Sabine Simon,

Carolin Giese, Sonja Borchert, Dr. Giuseppe Rulli, Jürgen Wittmann, Marcel Heidlindemann,

Dr. Marina Krausser, Dr. Maria Alfaro Blasco, Dr. Philipp Böhm, Richard Metzner, Wilko Greschner,

Tina Ress, Dr. Edyta Burda, Dr. Friedrich Dietz, Dr. Markus Weiß, Tobias Huber, Dr. Stefan Huber,

Anna Reimann, Katharina Tenbrink, Ingo Schnapperelle, Xenia Kostrov, Oliver Pham für die große

Hilfsbereitschaft und die positive Laboratmosphäre.

Ganz besonders möchte ich mich bei Carolin, Bine und Sonja bedanken, die mir auch außerhalb des

Laboralltags sehr ans Herz gewachsen sind und die mir immer mit Rat und Tat zur Seite standen.

Ich möchte mich ganz herzlich bei den Angestellten des technischen Bereichs des Instituts der

Organischen Chemie der FAU Erlangen-Nürnberg für die Unterstützung im Laboralltag bedanken.

Mein Dank gilt hierbei Wilfried Schätzke, Christian Placht und Dr. Harald Maid (NMR-Spektroskopie),

Hannelore Oschmann, Detlef Schagen und Robert Panzer (Chemikalienausgabe), Erwin Schreier,

Eberhard Ruprecht und Horst Mayer (Mechanische Werkstatt), Holger Wohlfahrt (Elektriker), Stefan

Danksagung

Fronius und Bahram Saberi (Glasbläserei), Wolfgang Donaubauer und Margarete Dzialach

(Massenspektroskopie) und Eva Hergenröder (Elementaranalyse).

Ich möchte mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Jürgen Schatz und Dr. Michael Brettreich für die

Unterstützung in der Lehrtätigkeit bedanken.

Mein großer Dank gilt Dr. Marcus Speck, Dr. Frank Hampel und den Sekretärinnen Frau Erna Erhard,

Frau Christiane Brandl-Rittel, Frau Heike Fischer und Frau Pamela Hampel für die freundliche

Unterstützung in Verwaltungsangelegenheiten.

Vielen Dank an Steffi, André, Moni, Stephan, Steff, Lisa, Katrin, Jeannette, Simone, Birgit und Nina für

Eure tolle Freundschaft, die wunderbare Unterstützung und die schönen Stunden, die wir zusammen

verbracht haben.

Ich danke von ganzem Herzen meinem Papa, Gudrun, Christa und Gerd für den moralischen Beistand

und ein jederzeit offenes Ohr.

Und zuletzt und von ganzem Herzen möchte ich meiner Mama und meinem Lebensgefährten

Stephan für die immerwährende moralische Unterstützung, die Geduld, das Verständnis und den

Beistand danken.

I Inhaltsverzeichnis

I


I Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... I

II Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII

III Tabellenverzeichnis ............................................................................................... XVIII

IV Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... XXIII

1. Einleitung ................................................................................................................................. 1

2. Motivation und Zielsetzung....................................................................................................... 4

2.1 Enzymatische Oxidation von aliphatischen und cyclischen Alkanen zur Synthese der

entsprechenden Alkohole .................................................................................................................... 5

2.2 Enzymatische Doppeloxidation von cyclischen Alkanen zur Synthese der entsprechenden

Ketone und enzymatische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur Synthese von ε-Caprolacton ....... 6

2.3 Synthese eines enantiomerenreinen Biphenylalkohols durch die Kombination der Palladium-

katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit enzymatischer Reduktion .................................................... 8

3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als

Katalysatoren ............................................................................................................................... 9

3.1 Einleitung ...................................................................................................................................... 9

3.2 Stand der Wissenschaft ................................................................................................................ 9

3.2.1 Aufbau der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium (BM-3) ....................................... 9

3.2.2 Mechanismus der P450-Monooxygenase-katalysierten Reaktionen ...................................... 11

3.2.3 Natürliche Substrate und Eigenschaften der P450-Monooxygenase BM-3 ............................ 12

3.2.4 Oxidationsreaktionen .............................................................................................................. 13

3.2.5 Optimierung der P450-Monooxygenase BM-3 durch Mutation ............................................. 14

3.2.6 Hydroxylierung von gasförmigen n-Alkanen ........................................................................... 16

3.2.7 Syntheseanwendungen der P450-Monooxygenasen .............................................................. 17

3.2.7.1 Hydroxylierung von Alkanen, Cycloalkanen und Fettsäuren................................................ 17

3.2.7.2 Anwendung als Katalysator in der Steroid-Synthese ........................................................... 18

3.2.7.3 Epoxidierung von Alkenen und Aromaten ........................................................................... 20


II

3.2.7.4 Einsatz der P450-Monooxygenase bei der chemoenzymatischen Fluorierung von inaktiven

organischen Substanzen ..................................................................................................................... 21

3.2.7.5 Hydroxylierung von (monosubstituierten) Benzolen ........................................................... 21

3.2.8 Alkoholdehydrogenase ............................................................................................................ 22

3.2.8.1 Aufbau der Alkoholdehydrogenasen .................................................................................... 22

3.2.8.2 Anwendung .......................................................................................................................... 23

3.3 Aspekt der Zielprodukte: Alkohole und Cycloalkanone in der Bulkindustrie ............................. 26

3.3.1 Industrielle Herstellung der Verbindungen ............................................................................. 26

3.3.1.1 2-Butanol .............................................................................................................................. 26

3.3.1.2 Lineare sekundäre C6-C18-Alkohole ...................................................................................... 26

3.3.1.3 Cyclische Alkohole und Ketone ............................................................................................ 27

3.3.1.3.1 Industrielle Herstellung von Cycloalkanonen .................................................................... 28

3.3.2 Industrielle Verwendung der hergestellten Produkte ............................................................. 29

3.3.2.1 2-Butanol .............................................................................................................................. 31

3.3.2.2 Lineare C6-C18-Alkohole ........................................................................................................ 31

3.3.2.3 Cyclische Alkohole ................................................................................................................ 32

3.3.2.4 Cycloalkanone ...................................................................................................................... 33

3.4 Hydroxylierung von n-Alkanen durch eine Cytochrom P450-Monooxygenase mit einer in situ-

Cofaktorregenerierung unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase ................................................. 35

3.4.1 Ziel der Arbeit .......................................................................................................................... 35

3.4.2 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................................................... 36

3.4.2.1 Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen ........................................................... 36

3.4.2.2 Spektrophotometrische Vorarbeiten ................................................................................... 37

3.4.2.2.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium 37

3.4.2.2.2 Stabilitäten der 19A12- und F87V-Mutante der Cytochrom P450-Monooxygenase aus

Bacillus megaterium ........................................................................................................................... 39

3.4.2.3 Analytische Vorarbeiten ....................................................................................................... 42

3.4.2.3.1 Aufarbeitung mit Hilfe eines Schütteltrichters .................................................................. 43


III

3.4.2.3.2 Aufarbeitung mit Hilfe von Eppendorf-Gefäßen ............................................................... 44

3.4.2.4 Hydroxylierung von n-Oktan ................................................................................................ 45

3.4.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration ................................................................................... 45

3.4.2.4.2 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung .............................. 46

3.4.2.4.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ ............................................ 48

3.4.3.4.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 .................................................... 49

3.4.2.4.5 Einfluss der Reaktionstemperatur ..................................................................................... 50

3.4.2.5 Hydroxylierungsreaktion von n-Butan.................................................................................. 51

3.4.2.5.1 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 .................................................... 51

3.4.2.5.2 Einfluss der Reaktionstemperatur ..................................................................................... 52

3.4.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit .................................................................................................. 53

3.4.3 Zusammenfassung ................................................................................................................... 54

3.4.3.1 Hydroxylierung von n-Oktan ................................................................................................ 54

3.4.3.2 Hydroxylierung von n-Butan ................................................................................................. 56

3.5 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Synthese von Cycloalkanonen .............................. 57

3.5.1 Ziel der Arbeit .......................................................................................................................... 57

3.5.2 Ergebnisse und Diskussion ...................................................................................................... 58

3.5.2.1 Spektrophotometrische Vorarbeiten ................................................................................... 58

3.5.2.1.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium 58

3.5.2.2 Analytische Vorarbeiten ....................................................................................................... 59

3.5.2.3 Hydroxylierung von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanol ......................................... 60

3.5.2.3.1 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung .............................. 60

3.5.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung in Abhängigkeit vom

Reaktionsvolumen und der Menge der P450-Monooxygenase ......................................................... 62

3.5.2.4 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanon ............. 63

3.5.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation ............................................ 64

3.5.2.4.2 Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxy-

genase auf die Doppeloxidation ......................................................................................................... 65


IV

3.5.2.4.3 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase auf die Doppeloxidation ..... 66

3.5.2.5 Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv ............................................. 67

3.5.2.5.1 Einfluss des Additivs Isopropanol auf die Doppeloxidation .............................................. 69

3.5.2.5.2 Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropan-

ol als Additiv ....................................................................................................................................... 70

3.5.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als

Additiv ................................................................................................................................................ 71

3.5.2.5.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von

25 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv ................................... 72

3.5.2.5.5 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Iso-

propanol als Additiv ........................................................................................................................... 74


100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv ................................ 76

3.5.2.5.7 Einfluss der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium auf die Doppeloxidation von

Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv .............................................................................................. 77

3.5.2.5.8 Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von

Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv .............................................................................................. 78

3.5.3 Zusammenfassung ................................................................................................................... 79

3.5.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan ........................................................................................... 79

3.5.3.2 Doppeloxidation von Cyclooktan......................................................................................... 80

4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator

zur Herstellung von εεεε-Caprolacton .............................................................................................. 83

4.1 Einleitung .................................................................................................................................... 83

4.2 Stand der Wissenschaft .............................................................................................................. 84

4.2.1 Verwendung von ε-Caprolacton in der Industrie .................................................................... 84

4.2.1.1. Polycaprolacton (PCL) .......................................................................................................... 84

4.2.1.2 Herstellung von Polycaprolacton durch anionische Polymerisation von ε-Caprolacton .... 84

4.2.2 Herstellung von ε-Caprolacton ................................................................................................ 85

4.2.2.1 Baeyer-Villiger-Oxidation von Cyclohexanon unter Verwendung von Persäuren .............. 85


V

4.2.2.2 Industrielle Herstellung durch den UCC-Prozess .................................................................. 86

4.2.3 Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase ................................................................ 86

4.2.4 Präparative Anwendungen der BVMO .................................................................................... 87

4.2.4.1 Enantioselektive Sulfoxidation von prochiralen Thioestern ................................................ 87

4.2.4.2 Katalytische kinetische Racematspaltung von 4-Hydroxy-2-ketonen .................................. 89

4.2.4.3 Synthese von β-Aminosäuren und β-Aminoalkoholen durch Nutzen der Regioselektivität

der BVMO ........................................................................................................................................... 89

4.2.4.4 Verwendung in der Synthese von Esomeprazol ................................................................... 91

4.3 Ziel der Arbeit ............................................................................................................................. 91

4.4 Ergebnisse und Diskussion ......................................................................................................... 92

4.4.1 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Aktivitätsbestimmung der Alkoholdehydro-

genase aus Lactobacillus kefir für die Oxidation von Cyclohexanol zu Cyclohexanon....................... 92

4.4.2 Synthese von ε-Caprolacton ausgehend von Cyclohexanol unter Kombination einer Alkohol-

dehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase .............................................................. 93

4.4.2.1 Einfluss der Cofaktormenge ................................................................................................. 93

4.4.2.2 Einfluss der Substratkonzentration ...................................................................................... 94

4.4.3 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Inhibierung und Stabilität der Baeyer-Villiger-

Monooxygenase ................................................................................................................................. 96

4.4.3.1 Inhibierung ........................................................................................................................... 96

4.4.3.2 Stabilitätstests ...................................................................................................................... 98

4.4 Zusammenfassung .................................................................................................................... 100

5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktions-

reaktionen ................................................................................................................................ 102

5.1 Einleitung .................................................................................................................................. 102

5.2 Stand der Wissenschaft ............................................................................................................ 102

5.2.1 Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen .............................................................................. 102

5.2.1.1 Bekannte Palladium-katalysierte Kupplungsreaktionen .................................................... 103

5.2.1.2 Mechanismus der Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen ..................................... 103

5.2.1.3 Suzuki-Kreuzkupplung ........................................................................................................ 105


VI

5.2.2 Enzymatische Reduktion von Ketonen zur Synthese stereoselektiver Alkohole .................. 106

5.3 Ziel der Arbeit ........................................................................................................................... 107

5.4 Ergebnisse und Diskussion ....................................................................................................... 108

5.4.1 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von 4´-Iodacetophenon zur Synthese von 4´-Phenylaceto-

phenon ............................................................................................................................................. 108

5.4.1.1 Benchmark .......................................................................................................................... 109

5.4.1.2 Einfluss der Proteinkonzentration ...................................................................................... 110

5.4.1.3 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................... 111

5.4.1.4 pH-Verlauf der Reaktion ..................................................................................................... 112

5.4.2 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol zur Synthese von rac-4´-

Biphenylethan-1-ol ........................................................................................................................... 113

5.4.2.1 Natriumborhydrid-Reduktion zur Synthese von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol .................... 113

5.4.2.2 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................... 114

5.4.2.3 Einfluss der Proteinmenge ................................................................................................. 115

5.4.3 Enzymatische Reduktion von 4´-Iodacetophenon unter Verwendung einer Alkoholdehydro-

genase .............................................................................................................................................. 116

5.4.3.1 Einfluss der Proteinkonzentration ...................................................................................... 118

5.4.3.2 pH-Verlauf der Reaktion ..................................................................................................... 118

5.4.4 Enzymatische Reduktion von 4´-Phenylacetophenon unter Verwendung einer Alkohol-

dehydrogenase ................................................................................................................................. 120

5.4.5 Tandemreaktionen der Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen Reduktion ........... 122

5.4.5.1 Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration ................................................................ 124

5.4.5.2 pH-Verlauf der Reaktionen ................................................................................................. 125

5.4.5.3 Einfluss des einsetzten Cofaktors ....................................................................................... 127

5.6 Zusammenfassung .................................................................................................................... 129

5.6.1. Suzuki-Kupplung ................................................................................................................... 129

5.6.1.1 Benchmark-Versuch ........................................................................................................... 129

5.6.1.2 Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kupplung .......................................................... 129


VII

5.6.2 Enzymatische Reduktion ....................................................................................................... 130

5.6.3. Tandem-Reaktion .................................................................................................................. 130

6. Zusammenfassung ................................................................................................................. 132

6.1. Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen zur Synthese von Alkoholen durch Einsatz einer

P450-Monooxygenase ...................................................................................................................... 132

6.2. Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanon durch die

Kombination einer P450-Monooxygenase mit einer Alkoholdehydrogenase ................................. 134

6.3. Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur Synthese von ε-Caprolacton durch

Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase ................. 135

6.4. Kombination einer metallkatalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit einer enzymatischen Reduk-

tion zur Synthese eines Biarylalkohols aus 4‘-Iodacetophenon ....................................................... 137

7. Summary ............................................................................................................................... 141

7.1. Biocatalytic hydroxylation of n-alkanes by using a P450-monooxygenase ............................. 141

7.2. Biocatalytic double oxidation of cyclooctane to synthesize cyclooctanone by using a combi-

nation of a P450-monooxygenase and an alcohol dehydrogenase ................................................. 143

7.3. Biocatalytic double oxidation of cyclohexanol in order to synthesize ε-caprolactone by using a

combination of an alcohol dehydrogenase and a Baeyer-Villiger-monooxygenase ........................ 144

7.4. Combination of the metal-catalyzed Suzuki cross-coupling and an enzymatic reduction in order

to synthesize a biarylalcohol ............................................................................................................ 146

7.5. Outlook ..................................................................................................................................... 149

8. Experimenteller Teil ............................................................................................................... 150

8.1 Verwendete Chemikalien und Geräte ...................................................................................... 150

8.2 Synthesen und spektroskopische Daten .................................................................................. 152

8.2.1 Hydroxylierung von n-Alkanen zur Darstellung von Alkoholen ............................................. 152

8.2.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 für die Herstellung des LB-Mediums (AAV 1) ................... 152

8.2.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 für die Herstellung des TB-Mediums (AAV 2) ................... 152

8.2.1.2.1 Herstellung des TB-Mediums .......................................................................................... 152

8.2.1.2.2 Herstellung des TB-Mediums für einen Fermenter-Versuch .......................................... 152

8.2.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 für die Herstellung des M9-Minimal-Mediums (AAV 3) .. 153


VIII

8.2.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 für die Herstellung der Mutanten für die P450-

Monooxygenase BM-3 (AAV 4) ........................................................................................................ 153

8.2.1.4.1 Herstellung des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3............................................ 154

8.2.1.4.2 Herstellung der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ................................ 155

8.2.1.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 für die Fermentation der 19A12-Mutante der P450-

Monooxygenase BM-3 (AAV 5) ........................................................................................................ 155

8.2.1.6 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 zur spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der

P450-Monooxygenase BM-3 (AAV 6) ............................................................................................... 156

8.2.1.6.1 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung des Wildtyps der P450-Monooxygenase

BM-3 ................................................................................................................................................. 157

8.2.1.6.2 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der 19A12-Mutante der P450-Monooxy-

genase BM-3 ..................................................................................................................................... 157

8.2.1.6.3 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der F87V-Mutante der P450-Monooxy-

genase BM-3 ..................................................................................................................................... 158

8.2.1.7 Allgemeine Arbeitsvorschrift 7 zur spektrophotometrischen Bestimmung der Stabilität von

P450-Monooxygenasen BM-3 (AAV 7) ............................................................................................. 159

8.2.1.7.1 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über

24 Stunden ....................................................................................................................................... 159

8.2.1.7.2 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und

anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur .......................................................................... 160

8.2.1.7.3 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über

24 Stunden ....................................................................................................................................... 161

8.2.1.7.4 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und

anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur .......................................................................... 161

8.2.1.8 Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch

verschiedene Aufarbeitungsmethoden (AAV 8) .............................................................................. 162

8.2.1.8.1 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die Aufarbeitung mit

Hilfe eines Schütteltrichters ............................................................................................................. 163

8.2.1.8.2 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die Aufarbeitung mit

Eppendorf-Gefäßen .......................................................................................................................... 164


IX

8.2.1.9 Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 zur biokatalytischen Hydroxylierung von n-Oktan (AAV 9)

.......................................................................................................................................................... 165

8.2.1.9.1 Einfluss der Substratkonzentration ................................................................................. 166

8.2.1.9.2 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung ............................ 167

8.2.1.9.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ .......................................... 169

8.2.1.9.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 .................................................. 170

8.2.1.9.5 Einfluss der Reaktionstemperatur ................................................................................... 171

8.2.1.10 Allgemeine Arbeitsvorschrift 10 zur biokatalytischen Hydroxylierung von n-Butan (AAV 10)

.......................................................................................................................................................... 173

8.2.1.10.1 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 ................................................ 174

8.2.1.10.2 Einfluss der Reaktionstemperatur ................................................................................. 175

8.2.1.10.3 Einfluss der Reaktionszeit .............................................................................................. 177

8.2.2 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Darstellung von Cycloalkanonen ..................... 178

8.2.2.1 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung verschiedener P450-Monooxygenasen BM-3

.......................................................................................................................................................... 178

8.2.2.2. Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 zur Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards

(AAV 11)............................................................................................................................................ 179

8.2.2.2.1 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von

1 ml ................................................................................................................................................... 179


4 ml ................................................................................................................................................... 180


5 ml ................................................................................................................................................... 180

8.2.2.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 zur Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregener-

ierung zum Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der Monooxygenase (AAV 12) .... 181

8.2.2.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 1 ml Reaktionsvolumen

und 38.2 U/mmol Monooxygenase ................................................................................................. 182

8.2.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung in 4 ml Reaktionsvolumen



X

8.2.2.3.3 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 5 ml Reaktionsvolumen


8.2.2.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 13 zur Doppeloxidation von Cyclooktan (AAV 13) .............. 185

8.2.2.4.1 Einfluss des Substratkonzentration ................................................................................. 185

8.2.2.4.2 Doppeloxidation von Cyclooktan mit 4 ml Reaktionsvolumen und 7.64 U/mmol P450-

Monooxygenase ............................................................................................................................... 187

8.2.2.4.3 Doppeloxidation von Cyclooctan mit 5 ml Reaktionsvolumen und 38.2 U/mmol P450-

Monooxygenase ............................................................................................................................... 187

8.2.2.4.4 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase .......................................... 189

8.2.2.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 14 zur Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als

Additiv (AAV 14) ............................................................................................................................... 190

8.2.2.5.1 Einfluss der Reaktionstemperatur ................................................................................... 192

8.2.2.5.2 Einfluss der Reaktionszeit ................................................................................................ 194

8.2.2.5.3 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einem Reaktionsvolumen von 4 ml

.......................................................................................................................................................... 195

8.2.2.5.4 Einfluss der Substratkonzentration ................................................................................ 196


100 mM ............................................................................................................................................ 198

8.2.2.5.6 Einfluss von der Präsens der P450-Monooxygenase ...................................................... 199

8.2.2.5.7 Einfluss von der Präsens der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir ................ 201

8.2.3 Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator

zur Herstellung von ε-Caprolacton ................................................................................................... 203

8.2.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 15 für die spektrophotometrische Bestimmung der Alkohol-

dehydrogenase aus Lactobacillus kefir (AAV 15) ............................................................................. 203

8.2.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 16 für die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol

zur Synthese von ε-Caprolacton (AAV 16)........................................................................................ 203

8.2.3.2.1. Einfluss der Cofaktormenge ........................................................................................... 204

8.2.3.2.2 Abhängigkeit von der eingesetzten Substratkonzentration ........................................... 206

8.2.3.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 17 zur Inhibierung der BVMO ECS-MO1 durch Cyclohexanon

und das Produkt ε-Caprolacton (AAV 17) ......................................................................................... 208


XI

8.2.3.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 18 zur Stabilität der BVMO ECS-MO1 (AAV 18) .................. 209

8.2.4 Palladium-katalysierte Kreuzkupplung in Kombination mit einer enzymatischen Reduktions-

reaktion ............................................................................................................................................ 213

8.2.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 zur Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon zur

Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (AAV 19) ............................................................................... 213

8.2.4.1.1 Einfluss der Proteinkonzentration ................................................................................... 213


8.2.4.1.3 pH-Verlauf der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon............................................... 216

8.2.4.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 20 für die Synthese des rac-Iodphenylethan-1-ols durch

Reduktion mit Natriumborhydrid (AAV 20) ..................................................................................... 217

8.2.4.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 für die Suzuki-Kupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol zur

Synthese von rac-4'-Biphenylethan-1-ol (AAV 21) ........................................................................... 218


8.2.4.3.2 Einfluss der Proteinmenge .............................................................................................. 220

8.2.4.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 22 für die biokatalytische Reduktion (AAV 22) ................... 221

8.2.4.4.1 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon . 221

8.2.4.4.2 pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon ............................. 222

8.2.4.4.3 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon

.......................................................................................................................................................... 223

8.2.4.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 23 für die Tandem-Reaktion zur Synthese von (R)-4'-

Biphenylethan-1-ol (AAV 23) ............................................................................................................ 225

8.2.4.5.1 Einfluss der Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion ......................................... 225

8.2.4.5.2 pH-Verlauf der Tandem-Reaktion .................................................................................... 227

8.2.4.5.3 Einfluss des Cofaktors ...................................................................................................... 229

9. Literaturverzeichnis .............................................................................................................. 231

II Abbildungsverzeichnis

XII


Abbildung 1: Anwendungshäufigkeit der Enzymklassen [4b] ................................................................... 3

Abbildung 2: Unterschied der klassischen Synthese zur Eintopfsynthese ............................................. 4

Abbildung 3: Oxidation zu industriell wichtigen Produkten unter Cofaktorregenerierung in einer Ein-

topfreaktion............................................................................................................................................. 6

Abbildung 4: Doppeloxidation zu industriell relevanten Produkten in einer Eintopfreaktion ............... 6

Abbildung 5: Biokatalytische Doppeloxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen in einer Eintopf-

Zweistufen-Synthese [13] .......................................................................................................................... 7

Abbildung 6: Kombination einer metallkatalysierten Reaktion mit einer Biotransformation zur Syn-

these pharmazeutisch relevanter Bausteine in einer Eintopf-Reaktion ................................................. 8

Abbildung 7: Darstellung des aktiven Zentrums einer Cytochrom P450-Monooxygenase .................. 10

Abbildung 8: System bei der P450-Monooxygenase BM-3 [35] ............................................................. 10

Abbildung 9: Dreikomponenten-System [35] ......................................................................................... 10

Abbildung 10: Katalysezyklus einer P450-Monooxygenase [36] ............................................................ 11

Abbildung 11: Rebound-Mechanismus der Hydroxylierungsreaktion [36,40] ......................................... 12

Abbildung 12: Reaktionsprinzip einer Cytochrom P450-Monooxygenase ........................................... 13

Abbildung 13: Screening-Assay für die Aktivität bei der Oxidation von Alkanen mit

p-Nitrophenoxyoktan (9) [29] .................................................................................................................. 15

Abbildung 14: Die chemisch inerten Perfluorocarbonsäuren 13 und 14 [54] ........................................ 17

Abbildung 15: Hydroxylierung von Cyclohexan (15) zu Cyclohexanol (16) in einem Zweiphasen-

system[27] ............................................................................................................................................... 18

Abbildung 16: Konventionelle chemische Synthese von Cortison (18) [55] ........................................... 18

Abbildung 17: Chemisch-mikrobiologische Synthese von Cortison (18) [55] ......................................... 19

Abbildung 18: Abbau des Steroids 22 zu Androstendion (23) und Reduktion zu Testosteron (24) [55] 20

Abbildung 19: Biokatalytische, asymmetrische Epoxidierung von Styrol-Derivaten 25 durch eine

Pseudomonas sp. Styrol-Monooxygenase [45] ........................................................................................ 20

Abbildung 20: Chemoenzymatische Fluorierung von inaktiven organischen Substanzen [58] .............. 21

Abbildung 21: Röntgenstruktur der katalytischen Tetrade (in magenta) und des Protonenüber-

tragungssystems (gestrichelte Linien) von RADH-G37D [S] [64] ............................................................. 23

Abbildung 22: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen 27a zu sekundären chiralen

Alkoholen 28a ........................................................................................................................................ 24

Abbildung 23: Oxidation von sekundären chiralen Alkoholen 28a zu Ketonen 27a ............................ 24

Abbildung 24: Konzept der in situ-Cofaktorregenerierung durch Kombination einer Cytochrom P450-

Monooxygenase mit einer ADH [13] ....................................................................................................... 24


XIII

Abbildung 25: Konzept der substratgekoppelten Cofaktorregenerierung mit einer ADH [6,10,13,69] ...... 25

Abbildung 26: Konzept der enzymgekoppelten Cofaktorregenerierung durch Kombination einer

Cytochrom P450-Monooxygenase mit einer GDH [10,13,69] ..................................................................... 25

Abbildung 27: Säurekatalysierte Hydratisierung von 2-Buten (34) zur Synthese von 2-Butanol (35) [21]

............................................................................................................................................................... 26

Abbildung 28: Bruttoreaktionsgleichung der partiellen Oxidation von Paraffinen 36 nach

BASHKIROV [21] .......................................................................................................................................... 26

Abbildung 29: Partielle Oxidation von Paraffinen 36 nach BASHKIROV [21] ............................................. 27

Abbildung 30: Flüssigphasen-Luft-Oxidation von Cyclohexan 15 zu KA-Öl [21] ..................................... 27

Abbildung 31: Oxidation von Cyclohexan 15 nach BASHKIROV [21].......................................................... 28

Abbildung 32: Industriell wichtige Produkte, die aus 2-Butanol (35), linearen Alkoholen und dem

cyclischen Alkohol 16 hergestellt werden [21,22]..................................................................................... 29

Abbildung 33: Industriell wichtige Produkte, die aus den cyclischen Ketonen 41 und 50 und dem

Lacton 53 hergestellt werden [21]........................................................................................................... 30

Abbildung 34: Ethoxylierung von linearen Alkoholen zu Fettalkoholpolyglykolethern 45 [21,22] .......... 31

Abbildung 35: Darstellung von Fettalkoholsulfaten 47 aus linearen Alkoholen [21,22] .......................... 31

Abbildung 36: Darstellung von Fettalkoholethersulfaten 45 aus Fettalkoholpolyglykolethern 46 [21,22]

............................................................................................................................................................... 32

Abbildung 37: Darstellung von Adipinsäure (48) aus KA-Öl [21] ............................................................ 32

Abbildung 38: Darstellung von Nylon-6.6 52 und Nylon-6.8 58 [21] ...................................................... 33

Abbildung 39: Darstellung von Nylon-6 (51) aus Cyclohexanon (41) ................................................... 33

Abbildung 40: Retrosynthesen von Nylon-6 (51) und Nylon-12 (52) ................................................... 34

Abbildung 41: Die bei der biokatalytischen Hydrierung eingesetzten n-Alkane .................................. 35

Abbildung 42: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen unter Einsatz einer GDH und D-Glucose

............................................................................................................................................................... 35

Abbildung 43: Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen .................................................... 36

Abbildung 44: Strukturformeln der Referenzsubstanzen ..................................................................... 37

Abbildung 45: Reaktionsgleichungen der Photometertests mit einer P450-Monooxygenase BM-3 ... 40

Abbildung 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur 40

Abbildung 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden

und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ........................................................................ 41

Abbildung 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur . 41

Abbildung 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden

und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ........................................................................ 42


XIV

Abbildung 50: Strukturformeln der verschiedenen Oktanole und von Pyridin (72) ............................. 42

Abbildung 51: Formel für die Berechnung des Faktors ........................................................................ 43

Abbildung 52: Hydroxylierung von n-Oktan (64) .................................................................................. 45

Abbildung 53: Hydroxylierung von n-Oktan (64) unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur in

situ-Cofaktorregenerierung ................................................................................................................... 47

Abbildung 54: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) unter in situ-Cofaktorregenerierung

mit einer GDH ........................................................................................................................................ 51

Abbildung 55: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64) ......................................................... 56

Abbildung 56: Biokatalytische Hydroxylierung von gasförmigen n-Butan (65) .................................... 57

Abbildung 57: Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation von Cycloalkanen ............................... 58

Abbildung 58: Biokatalytische Reaktion, die mit Hilfe des UV/Vis-Spektrometers beobachtet wird .. 58

Abbildung 59: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) .................. 60

Abbildung 60: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) ohne Cofaktorregenerierung ..... 61

Abbildung 61: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) mit in situ-Cofaktorregenerierung

durch Einsatz einer GDH und D-Glucose ............................................................................................... 61

Abbildung 62: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) durch Kombination einer P450-

Monooxygenase aus Bacillus megaterium und einer ADH aus Lactobacillus kefir ............................... 64

Abbildung 63: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv

............................................................................................................................................................... 68

Abbildung 64: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase und der Substratkonzentration auf die

biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als

Additiv ................................................................................................................................................... 74

Abbildung 65: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) mit einer

Produktbildung von 0.328 g/l ................................................................................................................ 80

Abbildung 66: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) mit einer

Produktbildung im Bereich von 0.09 bis 0.14 g/l .................................................................................. 81

Abbildung 67: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) unter

Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung im Bereich von 0.80 g/l ................ 82

Abbildung 68: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) in einem Eintopf-Zweistufen-

Verfahren im wässrigen Medium zu ε-Caprolacton (53) ...................................................................... 83

Abbildung 69: Das Polymer Polycaprolacton (PCL, 54)......................................................................... 84

Abbildung 70: Anionische Polymerisation von ε-Caprolacton (53) zur Synthese von Polycapro-

lactonen [92] ............................................................................................................................................ 85


XV

Abbildung 71: Synthese von ε-Caprolacton (53) durch die Baeyer-Villiger-Oxidation von Cyclo-

hexanon (41) unter Verwendung von Persäuren 78 [94] ........................................................................ 85

Abbildung 72: Industrielle Herstellung von ε-Caprolacton (53) durch den UCC-Prozess [21] ................ 86

Abbildung 73: Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase [1,96,97] ............................................ 87

Abbildung 74: Enantioselektive Sulfoxidation eines prochiralen Thioesters 83 mit Hilfe einer

CHMO [98] ............................................................................................................................................... 88

Abbildung 75: Kinetische Spaltung des racemischen Sulfoxids rac-84 mit Hilfe einer CHMO [98] ........ 88

Abbildung 76: Kinetische Racematspaltung von racemischen 4-Hydroxyketonen rac-86 [89] .............. 89

Abbildung 77: BVMO-katalysierte kinetische Racematspaltung des N-geschützten β-Aminoketons .. 90

Abbildung 78: Synthese einer N-geschützten β-(+)-Aminosäure (+)-92 und eines N-geschützten β-

Aminoalkohols 93 [90] ............................................................................................................................. 90

Abbildung 79: Synthese des Protonenpumpenhemmers Esomeprazol (95) durch enantioselektive

Sulfoxidation aus Omeprazol (94) mit einer BVMO [99] ......................................................................... 91

Abbildung 80: Biokatalytische Doppeloxidation des Alkohols 16 unter Synthese von ε-Caprolacton

(53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium ....................................................... 92

Abbildung 81: Die bei der spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der LK-ADH eingesetzten

sekundären Alkohole 1-Phenylethanol (96) und Cyclohexanol (16) ..................................................... 92

Abbildung 82: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der

Stoffmenge des eingesetzten Substrats ................................................................................................ 96

Abbildung 83: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41) ......................................................... 97

Abbildung 84: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53) ......................................................... 97

Abbildung 85: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanol (16) ........ 98

Abbildung 86: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanon (41) ...... 99

Abbildung 87: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von ε-Caprolacton (53) .... 100

Abbildung 88: „Proof of Concept“ für die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu

ε-Caprolacton (53) ............................................................................................................................... 101

Abbildung 89: Der Kathepsin-K-Inhibitor Odanacatib (97) [104] ........................................................... 102

Abbildung 90: Allgemein gültiger Katalysezyklus der Palladium-katalysierten Kupplungsreak-

tionen [94,127] ......................................................................................................................................... 104

Abbildung 91: Allgemeine Reaktionsgleichung der Suzuki-Kreuzkupplung [94] .................................. 105

Abbildung 92: Katalysezyklus der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung [94] ....................... 105

Abbildung 93: Der wasserlösliche Ligand TPPTS (105) [129] ................................................................. 105

Abbildung 94: Mögliche Produkte aus der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bzw. rac-4'-

Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) ............................................................ 106


XVI

Abbildung 95: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen zu sekundären chiralen Alkoholen

............................................................................................................................................................. 106

Abbildung 96: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) durch die Verwendung der

(R)-selektiven LK-ADH.......................................................................................................................... 107

Abbildung 97: Enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (107) durch die Verwendung der

(R)-selektiven LK-ADH.......................................................................................................................... 107

Abbildung 98: Tandem-Reaktion durch Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer

Reduktion ............................................................................................................................................ 108

Abbildung 99: Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b) . 109

Abbildung 100: Benchmark der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenyl-

boronsäure (101b) ............................................................................................................................... 109

Abbildung 101: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodaceto-

phenon (106) mit Phenylboronsäure (101b) ....................................................................................... 111

Abbildung 102: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) ...................... 112

Abbildung 103: Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit Phenylboron-

säure (101b) ........................................................................................................................................ 113

Abbildung 104: Synthese des racemischen Alkohols rac-107 durch Reduktion des Ketons 106 mit

Natriumborhydrid (110) ...................................................................................................................... 114

Abbildung 105: Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol

(rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) .............................................................................................. 116

Abbildung 106: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Hilfe der LK-ADH ......... 117

Abbildung 107: Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ol

(rac-107) mit der Chiralcel® OJ-H-Säule .............................................................................................. 117

Abbildung 108: pH-Verlauf der enzymatischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) ................ 119

Abbildung 109: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm von racemischen 4‘-Biphenylethan-1-ol

(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule ............................................................................................ 122


Reduktion ............................................................................................................................................ 123


(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule ............................................................................................ 123

Abbildung 112: pH-Verläufe der Tandem-Reaktion bei unterschiedlichen Mengen an LK-ADH ....... 125

Abbildung 113: Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b)

unter Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem Umsatz von über 95% ......................... 129


XVII


phenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) ................ 130

Abbildung 115: Tandem-Reaktion mit 4‘-Iodacetophenon (106) als Substrat zur Herstellung des

gewünschten (R)-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) .............................................................................. 131

Abbildung 116: Biokatalytische Hydroxylierung der n-Alkane 64 und 65 zu den korrespondierenden

Alkoholen............................................................................................................................................. 132

Abbildung 117: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64) ..................................................... 133

Abbildung 118: Biokatalytische Hydroxylierung des Flüssiggases n-Butan (65) zu 2-Butanol (35) .... 133

Abbildung 119: Biokatalytische Doppeloxidation des Cycloalkans 73 zum Cycloalkanon 75 ............ 134

Abbildung 120: Optimierte biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon

(75) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung von 0.80 g/l ............... 135

Abbildung 121: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) unter Synthese von ε-Capro-

lacton (53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium .......................................... 136

Abbildung 122: „Proof of Concept“ der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu

ε-Caprolacton (53) (optimiertes Verfahren) ....................................................................................... 136

Abbildung 123: Einfluss der Konzentration des eingesetzten Cyclohexanols (16) auf den Umsatz ... 137

Abbildung 124: Konzept der Tandem-Reaktionen durch Kombination der Suzuki-Kreuzkupplung mit

einer biokatalytischen Reduktion ........................................................................................................ 138


phenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b) ................ 139

Abbildung 126: Ergebnisse der Tandemreaktion ............................................................................... 139

Abbildung 127: Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung ......................................... 156


situ-Cofaktorregenerierung ................................................................................................................. 167

Abbildung 129: Hydroxylierung von n-Oktan (64) ohne Cofaktorregenerierung ............................... 168

Abbildung 130: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit der 19A12-

Mutante und Isopropanol (30) als Additiv .......................................................................................... 192

Abbildung 131: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) ....................... 206

Abbildung 132: 1H-NMR-Spektrum der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenyl-

boronsäure (101b) (Benchmark-Versuch) ........................................................................................... 214

Abbildung 133: 1H-NMR-Spektrum der Natriumborhydrid-Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106)217

III Tabellenverzeichnis

XVIII


Tabelle 1: Übersicht über die sechs Enzymklassen [1,5] ........................................................................... 2

Tabelle 2: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3 ..................... 38

Tabelle 3: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3 .......... 38

Tabelle 4: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3 ............ 39

Tabelle 5: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Hilfe eines

Schütteltrichters .................................................................................................................................... 43

Tabelle 6: Überprüfung des Verlusts der möglichen Produkte durch die Aufarbeitung mit Eppendorf-

Gefäßen ................................................................................................................................................. 44

Tabelle 7: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)

............................................................................................................................................................... 46

Tabelle 8: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die biokatalytische

Hydroxylierung von n-Oktan (64) .......................................................................................................... 47

Tabelle 9: Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ auf die biokatalytische

Hydroxylierung von n-Oktan (64) .......................................................................................................... 48

Tabelle 10: Einfluss eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung von

n-Oktan (64) .......................................................................................................................................... 49

Tabelle 11: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)

............................................................................................................................................................... 50

Tabelle 12: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase auf die biokatalytische Hydroxylierung

von n-Butan (65) .................................................................................................................................... 51

Tabelle 13: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)

............................................................................................................................................................... 53

Tabelle 14: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) ........ 54

Tabelle 15: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der Substrat-

konzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase ............................................. 63

Tabelle 16: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-

oktan (73) .............................................................................................................................................. 65

Tabelle 17: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxy-

genase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ................................................. 66

Tabelle 18: Einfluss der eingesetzten Menge der P450-Monooxygenase auf die biokatalytische

Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ................................................................................................... 67

Tabelle 19: Unterschied von der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ohne Einsatz

des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz .......................................................................... 69


XIX

Tabelle 20: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-

oktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................. 71

Tabelle 21: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)

von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................... 72

Tabelle 22: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenasen bei einer Substratkonzentration von

25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol

(30) als Additiv ....................................................................................................................................... 73

Tabelle 23: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische

Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ......................... 75

Tabelle 24: Einfluss der F87V-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische

Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ......................... 75

Tabelle 25: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von

100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

............................................................................................................................................................... 76

Tabelle 26: Einfluss der P450-Monooxygenase auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter

Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................................... 77

Tabelle 27: Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von

Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ........................................................... 78

Tabelle 28: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH ............................................... 93

Tabelle 29: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der Stoff-

menge des eingesetzten Cofaktors ....................................................................................................... 94

Tabelle 30: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der Stoff-

menge des eingesetzten Substrats ........................................................................................................ 95

Tabelle 31: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon

(106) .................................................................................................................................................... 110

Tabelle 32: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) 111

Tabelle 33: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bei verschiedenen

Reaktionszeiten ................................................................................................................................... 112

Tabelle 34: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol

(rac-107) .............................................................................................................................................. 114

Tabelle 35: Einfluss der eingesetzten Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-

Iodphenylethanol (rac-107)................................................................................................................. 115

Tabelle 36: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodaceto-

phenon (106) ....................................................................................................................................... 118


XX

Tabelle 37: pH-Verläufe der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei unter-

schiedlichen Mengen von LK-ADH ...................................................................................................... 119

Tabelle 38: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylaceto-

phenon (108) ....................................................................................................................................... 121

Tabelle 39: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion .................... 124

Tabelle 40: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l................ 126


Tabelle 42: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion .................................................. 128

Tabelle 43: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3.................. 157

Tabelle 44: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3 ...... 158

Tabelle 45: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3 ........ 158

Tabelle 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über

24 Stunden .......................................................................................................................................... 160

Tabelle 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden

und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ...................................................................... 160

Tabelle 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über

24 Stunden .......................................................................................................................................... 161

Tabelle 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und

anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur ............................................................................. 162


Schütteltrichters .................................................................................................................................. 163


Gefäßen ............................................................................................................................................... 164

Tabelle 52: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von

n-Oktan (64) ........................................................................................................................................ 167

Tabelle 53: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die bio-

katalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64) .................................................................................... 169


Hydroxylierung von n-Oktan (64) ........................................................................................................ 170


n-Oktan (64) ........................................................................................................................................ 171


............................................................................................................................................................. 172


XXI


von n-Butan (65) .................................................................................................................................. 175


............................................................................................................................................................. 176

Tabelle 59: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) ...... 177

Tabelle 60: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten verschiedener P450-Monooxygenasen

bezogen auf Cyclooktan (73) ............................................................................................................... 178

Tabelle 61: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der Substrat-

konzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase ........................................... 184

Tabelle 62: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-

oktan (73) ............................................................................................................................................ 186

Tabelle 63: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxy-

genase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ............................................... 188


Doppeloxidation von Cyclooktan (73) ................................................................................................. 189


des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz ........................................................................ 191

Tabelle 66: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclo-

oktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ........................................................... 193


von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................. 194


25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Iso-

propanol (30) als Additiv ..................................................................................................................... 196

Tabelle 69: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische .... 197

Tabelle 70: Einfluss der F87V-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppel-

oxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv .................................. 198



............................................................................................................................................................. 199


Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ............................................................................................. 200


Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv ......................................................... 202


XXII

Tabelle 74: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH ............................................. 203

Tabelle 75: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der

Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors ............................................................................................. 205


Stoffmenge des eingesetzten Substrats .............................................................................................. 207

Tabelle 77: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41) ............................................................ 208

Tabelle 78: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53) ............................................................ 209

Tabelle 79: Stabilität der BVMO ohne Zusatz ..................................................................................... 210

Tabelle 80: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanol (16) ................. 210

Tabelle 81: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 50 mM Cyclohexanol (16) ................. 210

Tabelle 82: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 100 mM Cyclohexanol (16) ............... 211

Tabelle 83: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanon (41) ................ 211

Tabelle 84: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 50 mM Cyclohexanon (41) ................ 211

Tabelle 85: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 100 mM Cyclohexanon (41) .............. 212

Tabelle 86: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.1 M ε-Caprolacton (53)................... 212

Tabelle 87: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.25 M ε-Caprolacton (53) ................ 212


(106) .................................................................................................................................................... 214

Tabelle 89: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) 215

Tabelle 90: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) ............................. 216


(rac-107) .............................................................................................................................................. 219


Iodphenylethanol (rac-107)................................................................................................................. 220

Tabelle 93: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodaceto-

phenon (106) ....................................................................................................................................... 222

Tabelle 94: pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei unter-

schiedlichen Mengen von LK-ADH ...................................................................................................... 223

Tabelle 95: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylaceto-

phenon (108) ....................................................................................................................................... 224

Tabelle 96: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion .................... 226



Tabelle 99: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion .................................................. 229

IV Abkürzungsverzeichnis

XXIII


ADH Alkoholdehydrogenase

ADH-Säule CHIRALPAK® Amolyse tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat)

ALA Aminolävulinsäure

aq. wässrig

ATP Adenosintriphosphat

c Konzentration

CDCl3 deuteriertes Chloroform

d [cm] Küvettendicke

d Dublett

δ [ppm] chemische Verschiebung

DBU Deutsche Bundesstiftung Umwelt

ee Enantiomerenüberschuss (enantiomeric excess)

EC enzyme commission

EFB European Federation of Biotechnology

eq. equivalent

F Einbuchstabencode für Phenylalanin

f Probenverdünnungsfaktor

FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid

FMN Flavinmononukleotid

F87V an Position 87 wurde Phenylalanin durch Valin ersetzt

g Gramm

GDH Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.

h Stunde

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSA human serum albumin

Hz Hertz

IPA Isopropanol

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

J skalare Kopplungskonstante

jato Jahrestonnen

KA Keton - Alkohol

LB lysogeny broth

LK-ADH Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir


XXIV

m Multiplett

MeOD deuteriertes Methanol

mg Milligramm

MHz Megahertz

min Minute

ml Milliliter

mmol Millimol

n Stoffmenge

NADH, NAD+ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid

NADPH, NADP+ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat

NMR Kernmagnetische Resonanz

OJ-H-Säule CHIRALCEL®-Säule OJ-H, Cellulose tris-(4-methylbenzoat)

P450 BM-3 Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium

ppm parts per million

R Substituent

RF Retentionsfaktor

rac racemisch

rel. relativ

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RT Raumtemperatur

rt room temperature

s Singulett

Sdp. Siedepunkt

SEL Spurenelemente-Lösung

sp. species

T [°C] Temperatur

t Triplett

t Zeit

tr Retentionszeit

TB terrific broth

TPP Thiaminpyrophosphat

TPPTS Triphenylphosphin-3,3’,3’’-trisulfonsäure

U Units

U/ml volumetrische Enzymaktivität


XXV

U/mg Units/Stoffmenge n(Substrat)

UV/Vis Ultraviolett/Visible

V Volumen

µl Mikroliter

V Einbuchstabencode für Valin

Vg [ml] Gesamtprobenvolumen

Vp [ml] Probenvolumen

WT Wildtyp

1. Einleitung

1

1. Einleitung

Die Enzym-Technologie wurde 1989 gemäß der European Federation of Biotechnology (EFB) als ein

Teilbereich der Biotechnologie definiert.[1] Die Biotechnologie stellt eine Schnittstelle der Disziplinen

Mikro- und Molekularbiologie, Chemie, Biochemie, Bioverfahrenstechnik, Materialwissenschaften

und Bioinformatik dar.[2] Hierbei ist ein attraktives Anwendungsfeld die weiße oder auch industrielle

Biotechnologie, die eine nachhaltige Synthese von (Fein-)Chemikalien, Aminosäuren (v.a. L-Glutamat,

L-Lysin, L-Asparaginsäure, usw.), Vitamine (v.a. Ascorbinsäure), Antibiotika (v.a. Penicilline) und

Building Blocks unter Einsatz von Biokatalysatoren darstellt, was bedeutet, dass biologische

Stoffumwandlungen chemisch-industriell genutzt werden.[2]

Als Biokatalysatoren kommen intakte Mikroorganismen wie Ganzzellbiokatalysatoren oder auch

deren isolierte Enzyme in Betracht.[2,3] Dabei bedient man sich zweier unterschiedlicher Methoden:

der Biokatalyse und der Fermentation. Die Biokatalyse nutzt Enzyme als Katalysatoren bei der

Durchführung verschiedener Reaktionen wie z.B. bei der Hydroxylierung. Bei der Fermentation

werden lebende Mikroorganismen als Ganzzellbiokatalysatoren eingesetzt, um aus nachwachsenden

Rohstoffen Chemikalien oder die für die Biokatalyse benötigten Enzyme herzustellen, wobei der der

Metabolismus der Zelle genutzt wird.[2] Enzyme sind Proteine, die für alle Lebewesen notwendig sind.

Sie katalysieren alle chemischen Reaktionen, die das Überleben und die Reproduktion sichern.[1] Sie

bestehen aus L-Aminosäuren und sind daher chirale Katalysatoren.[4a] Der Einsatz von Bio-

katalysatoren bringt viele Vorteile. Biokatalysatoren sind sehr effiziente Katalysatoren, was sich in

deren katalytischen Aktivitäten widerspiegelt. Biokatalysierte Reaktionen sind 108-1010 mal schneller

als nicht-katalysierte Reaktionen, was zur Folge hat, dass in der Regel bezogen auf das Edukt nur 10-3

bis 10-4 mol% an Biokatalysatoren eingesetzt werden, während in der konventionellen chemischen

Synthese 0.1 bis 1 mol% an Katalysatoren zugefügt werden müssen.[4a] Biokatalysatoren sind im

Allgemeinen nicht so problematisch für die Umwelt wie beispielsweise Schwermetallkatalysatoren,

da sie komplett biologisch abbaubar sind.[4a] Die Biokatalyse kann unter milden

Reaktionsbedingungen durchgeführt werden.[1,3,4a.,5,6] Der pH-Bereich liegt für gewöhnlich bei pH 5

bis 8, wobei das Optimum oftmals bei pH 7 liegt.[4a] Es sind aber auch Biokatalysatoren bekannt, die

bei pH 2 bzw. pH 12 noch katalytisch aktiv sind.[1] Der Temperatur-Bereich liegt zwischen 20 und 40°C

mit einem Optimum bei 30°C,[4a] wobei es aber auch Biokatalysatoren gibt, die bei 0°C bzw. 110°C

noch aktiv sind.[1] Dadurch kann die Anzahl von Nebenreaktionen wie die Zersetzung oder die

Isomerisierung minimiert werden.[4a] Desweiteren sind Biokatalysatoren unter atmosphärischen

Druck katalytisch aktiv.[3] Biokatalysatoren zeichnen sich vor allem durch ihre hohe Enantio-, Chemo-,

Regio- und Diastereoselektvität aus,[1-5] was bei der Pharmaindustrie, die hochreine Produkte mit

1. Einleitung

2

einer Enantioselektivität von über 99% ee herstellt, zu einer Erhöhung der Produktsicherheit führt.[2]

Bei der Durchführung von Biokatalyse-Prozessen werden in der Regel weniger Schritte zur Synthese

des Zielprodukts benötigt als bei konventionellen Synthesen, da ein Schützen und Entschützen

funktioneller Gruppen meist nicht nötig ist.[6] Biokatalysatoren sind in der Regel bei richtiger

Handhabung ungiftig.[1] Der Einsatz von Biokatalysatoren hat auch einige Nachteile. Biokatalysatoren

können unter drastischeren Bedingungen wie hohe Temperatur, extreme pH-Werte, Verwendung

meist aggressiver Solventien nicht eingesetzt werden,[1,4a] da z.B. bei zu hoher Temperatur die

Proteine denaturiert werden.[4a] Manche Metallionen können inhibierend auf die Biokatalysatoren

wirken.[1] Bei der Verwendung von zahlreichen Enzymen wie z.B. aus der Klasse der Oxidoreduktasen

(Redoxenzyme) werden teure Cofaktoren eingesetzt.[1,4a] Ausgenommen sind hierbei die Hydrolasen,

die keine Cofaktoren benötigen. Desweiteren können manche Enzyme auch Allergien auslösen.[4a]

Enzyme werden nach dem EC-Nummern-System (Enzyme Commission) in sechs Klassen unterteilt.[1,5]

Das EC-Nummern-System beinhaltet je vier Zahlen, die durch Punkte voneinander getrennt sind

(1.2.3.4). Die erste Zahl gibt den Reaktionstyp an, der von den Enzymen katalysiert werden kann, die

zweite Zahl gibt Aufschluss über die funktionellen Gruppen, die während der Katalyse verändert

werden, während die dritte Zahl entweder weitere Charakteristika der Reaktion oder weitere

Eigenschaften des Enzyms angibt. Die vierte Zahl wird als laufende Nummer bezeichnet.[1,5] In

Tabelle 1 sind die sechs Klassen mit ihren jeweiligen Namen, Reaktionen und mit Beispielen gezeigt.

Tabelle 1: Übersicht über die sechs Enzymklassen [1,5]

EC Name Reaktion Beispiele

1 Oxidoreduktasen Redoxreaktionen Monooxygenasen

Alkoholdehydrogenasen

2 Transferasen Übertragung von funktionellen

Gruppen Alanin-Transaminase [7]

3 Hydrolasen Hydrolysen Esterasen, Peptidasen,

Lipasen

4 Lyasen Addition und Eliminierung von

kleinen Molekülen Aldolasen, Decarboxylasen

5 Isomerasen Isomerisierungsreaktionen Alanin-Racemase

6 Ligasen Bindungsbildungsreaktionen Dithiobiotinsynthase [8]

1. Einleitung

3

Die erste Klasse stellen die Oxidoreduktasen, die mit 25% Anwendungshäufigkeit in der organischen

Synthese von allen Enzymen am zweithäufigsten verwendet werden. Die in dieser Doktorarbeit

eingesetzten Monooxygenasen und Alkoholdehydrogenasen sind Oxidoreduktasen (in der obigen

Tabelle 1 grün unterlegt). Diese Enzyme katalysieren Redoxreaktionen und sind abhängig von

Cofaktoren NAD(P)+ und FAD. Die zweite Klasse beinhaltet die Transferasen und die dritte Klasse von

Enzymen sind die Hydrolasen, die mit 60% Anwendungshäufigkeit in der organischen Synthese die

meistverwendeten Enzyme sind. Sie besitzen als einzige Klasse keine Cofaktoren und katalysieren die

Hydrolyse verschiedenster Bindungen. Die Lyasen bilden die vierte Klasse von Enzymen, während die

fünfte Klasse die Isomerasen darstellt. Die mit 1% in der organischen Synthese am wenigsten

angewandte sechste Enzym-Klasse sind die Ligasen.[4b] Die Anwendungshäufigkeit der einzelnen

Enzymklassen ist ein Abbildung 1 graphisch dargestellt.

Abbildung 1: Anwendungshäufigkeit der Enzymklassen[4b]

2. Motivation und Zielsetzung

4


Die Motivation dieser Doktorarbeit war es, einen ökonomischen und ökologischen Zugangsweg zu

industriell wichtigen Produkten wie z. B. 2-Butanol, Cycloalkanone und ε-Caprolacton durch den

Einsatz von Biokatalysatoren in entsprechenden Reduktions- bzw. Oxidationsreaktionen zu

entwickeln. Am geeignetsten für ökologische und ökonomische Herstellungsprozesse hatte sich die

Eintopfreaktion in wässrigen Reaktionsmedien unter Einsatz von Biokatalysatoren erwiesen.[9-18] Ein

Beispiel für eine modulare chemoenzymatische Eintopfsynthese war die erfolgreiche Kombination

einer Palladium-katalysierten Kreuzkupplung mit einer asymmetrischen Biotransformation zur

Herstellung von chiralen Biarylalkoholen.[11,13] Desweiteren wurden alle vier Stereoisomere eines 1,3-

Diols durch die Kombination von organokatalytischer Aldolreaktion unter Zuhilfenahme chiraler

Katalysatoren und Reduktion mit Hilfe einer (R)-selektiven und einer (S)-selektiven

Alkoholdehydrogenase in einer Eintopfreaktion hergestellt.[9,12-16] Eine Eintopfreaktion konnte auch

erfolgreich für die Synthese von chiralen, allylischen Alkoholen aus allylischen Aldehyden durch

Kombination einer Wittig-Reaktion mit einer Enoatreduktase eingesetzt werden.[14,17]

Im Folgenden Abschnitt wird der Unterschied zwischen einer klassisch-chemischen Synthese und

einer Eintopfsynthese aufgezeigt und durch Abbildung 2 veranschaulicht.

Abbildung 2: Unterschied der klassischen Synthese zur Eintopfsynthese


5

Bei einer klassisch-chemischen Reaktion werden die verschiedenen Reaktionsschritte hintereinander

durchgeführt, wobei jeder einzelne Reaktionsschritt separat aufgearbeitet wird (Abbildung 2). Das

bringt einen großen Aufwand an Lösungsmitteln mit sich, die zur Extraktion der Produkte eingesetzt

werden. Daraus ergibt sich eine große Abfallmenge und hohe Kosten. Die klassisch-chemische

Reaktion hat sowohl in ökologischen als auch in ökonomischen Belangen seine Schwächen.[19,20] Der

Vorteil der Eintopfreaktion im Gegensatz zu einer klassischen Reaktion liegt u. a. in seiner

ökologischen Nachhaltigkeit. Die einzelnen Reaktionsschritte werden in einem Reaktionsgefäß

durchgeführt und ganz am Ende steht die Aufarbeitung des Zielprodukts (Abbildung 2). Die Menge an

Lösungsmitteln und deren Abfälle und somit hohen Kosten werden dadurch sehr reduziert.[19,20]

Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Durchführung von Eintopfreaktionen in einem wässrigen

Medium unter Zuhilfenahme von Biokatalysatoren für Redoxreaktionen, um industriell relevante

Produkte herzustellen. Es wurde dadurch auf gegebenenfalls giftige, umweltschädliche Katalysatoren

und Lösungsmittel verzichtet, was sich positiv auf die Umwelt auswirkte. Das langfristige Ziel besteht

in der Entwicklung von rentablen, technischen und ökologischen Prozessen aus dieser Biokatalyse-

Grundlagenforschung. Während dieser Doktorarbeit wurde der Schwerpunkt auf biokatalytische

Oxidationsreaktionen, vornehmlich von Alkanen im Bereich von C4 bis C8 gelegt. Es wurden aber auch

Oxidationsreaktionen von Alkoholen und Ketonen in diesem Kettenlängenbereich durchgeführt.

Dadurch ergeben sich als industriell wichtige Produkte die cyclischen und aliphatischen C4-C8-

Alkohole und –Ketone sowie ε-Caprolacton. Ein anderes Kapitel beschäftigt sich mit der Herstellung

von Biarylalkoholen aus Arylketonen, bei der eine biokatalytische Reduktionsreaktion eingesetzt

wird.

2.1 Enzymatische Oxidation von aliphatischen und cyclischen Alkanen zur Synthese

der entsprechenden Alkohole

Aliphatische und cyclische Alkohole können durch die Kombination einer Biotransformation, der

biokatalytischen Hydroxylierung durch Einsatz einer P450-Monooxygenase, mit einer in situ-

Cofaktorregenerierung in einem Eintopfverfahren erhalten werden (Abbildung 3).


6

Abbildung 3: Oxidation zu industriell wichtigen Produkten unter Cofaktorregenerierung in einer

Eintopfreaktion

Das Ziel bestand in der Etablierung und Durchführung eines Eintopfverfahrens für die präparative

Biotransformation von Alkanen zu Alkoholen im wässrigen Medium mit einer P450-Monooxygenase.

Das Flüssiggas n-Butan kann biokatalytisch zu 2-Butanol hydroxyliert werden, das industriell zu

Methylketon umgesetzt wird.[21] Auf diesem Wege können aus n-Alkanen auch weitere, lineare

Alkohole erhalten werden, die wichtige Bausteine für Tenside sind.[21,22] Cycloalkanole können mit

eben dieser Eintopfreaktion aus Cyclolkanen erhalten werden, die Ausgangsstoffe für Polymeren wie

Nylon-6.6 oder Nylon-6.8 sind.[21,22]

2.2 Enzymatische Doppeloxidation von cyclischen Alkanen zur Synthese der

entsprechenden Ketone und enzymatische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur

Synthese von εεεε-Caprolacton

Cycloalkanone und Lactone werden durch die Kombination von zwei biokatalytischen Reaktionen in

einem wässrigen Medium in einer Eintopfreaktion miteinander kombiniert (Abbildung 4).

Abbildung 4: Doppeloxidation zu industriell relevanten Produkten in einer Eintopfreaktion

In diesem Abschnitt standen sowohl die Durchführung von biokatalytischen Doppeloxidationen im

wässrigen Medium in einem Eintopfverfahren als auch deren Prozessentwicklungen im Vordergrund.

Hierbei können eine P450-Monooxygenase und eine Alkoholdehydrogenase für die Doppeloxidation

von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen sowie eine Alkoholdehydrogenase und eine Baeyer-Villiger-

Monooxygenase für die Doppeloxidation von Cyclohexanol zu ε-Caprolacton eingesetzt werden. Zur

Herstellung der Cycloalkanone wird die biokatalytische Hydroxylierung mit einer biokatalytischen


7

Oxidation kombiniert, die nachgeschaltet ist. Das Konzept dieser biokatalytischen Oxidation von

Cycloalkanen zu Cycloalkanonen im wässrigen Medium basiert auf einer Doppeloxidation durch

Zusammenspiel zweier Biokatalysatoren. Eine solche Umsetzung wurde bei Einsatz einer Cytochrom

P450-Monooxygenase sowie einer Alkoholdehydrogenase bereits demonstriert (Abbildung 5).[13]

Abbildung 5: Biokatalytische Doppeloxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen in einer Eintopf-

Zweistufen-Synthese[13]

Diese Anordnung gewährleistet eine vorteilhafte Cosubstrat-freie Cofaktorregenerierung, da das

eingesetzte NAD(P)H von der Monooxygenase zu NAD(P)+ oxidiert wird, das von der

Alkoholdehydrogenase wieder zu NAD(P)H reduziert wird. Der Katalysezyklus kann ab diesem Punkt

wieder von vorne starten. Der Cofaktor kann deshalb in katalytischen Mengen zugegeben werden

und wird nicht in stöchiometrischen Mengen benötigt. Die Monooxygenase ist für die Oxidation der

inaktiven Alkane zu reaktiveren Alkoholen verantwortlich, während die Aufgabe der

Alkoholdehydrogenase in der Oxidation der gebildeten Alkohole zu den gewünschten Ketonen

besteht. Dies soll in einer Eintopf-Zweistufen-Synthese im Reaktionsmedium Wasser erfolgen. Das

Konzept erfüllt Voraussetzungen einer sog. „Dream Reaction“.[6,19] Das Reaktionsmedium Wasser ist

kostengünstig und ökologisch unbedenklich. Die eingesetzten Enzyme sind biologischer Natur und

bei richtiger Handhabung meist ungiftig.[1] Der für die Reaktion benötigte Sauerstoff kann durch

Luftsauerstoff zugeführt werden. Desweiteren sind Enzyme oftmals in relativ großer Menge

herstellbar, insbesondere bei Anwendung der Hochzelldichtefermentation von rekombinanten

Stämmen. Die Vorteile solcher Mehrschritt-Eintopfreaktionen liegen in der Vermeidung der

ansonsten anfallenden zeitaufwendigen und vor allem kostenintensiven Aufarbeitungsschritte.[23,24]

Bei der Aufarbeitung und Reinigung häufen sich meist große Mengen an organischen Lösungsmitteln

an. Die Kosten für die Entsorgung der organischen Abfälle und die Beschaffung solcher organischer

Solventien fallen in Mehrschritt-Eintopfsynthesen im Reaktionsmedium Wasser sehr viel geringer

aus, was neben ökonomischen Vorteilen auch ökologische Vorteile mit sich bringt.[23] Im Gegensatz


8

zu einer sequenziellen Synthese werden hier keine weiteren Cosubstrate benötigt, was sich im

Bulkchemikalien-Bereich positiv auf die Kosten auswirkt. Dies wird durch die Cofaktorregenerierung

gewährleistet. Eintopfreaktionen steigern somit die Prozesseffizienz, verbessern die

Prozessökonomie und sind ökologisch viel unbedenklicher als organokatalysierte Prozesse. Cyclische

Ketone werden als Edukte für die Bildung von Polymeren wie Nylon-6 und Nylon-12, bei der

Darstellung von Lactonen oder in der Duftstoffindustrie eingesetzt.[25] Lactone können durch die

Kombination einer biokatalytischen Oxidation mit nachfolgender biokatalytischer Baeyer-Villiger-

Oxidation dargestellt werden. Hierbei spielt vor allem ε-Caprolacton eine Rolle, das zum Kunststoff

Polycaprolacton umgesetzt werden kann.[21]

2.3 Synthese eines enantiomerenreinen Biphenylalkohols durch die Kombination

der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit enzymatischer Reduktion

Ferner sollte die Synthese eines enantiomerenreinen Biphenylalkohols, der in einer bereits

etablierten Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung mit einer enzymatischen Reduktion hergestellt

wird, untersucht und verbessert werden.[11,13] Es handelt sich hierbei um eine Kombination einer

metallkatalysierten Reaktion und einer Biotransformation, die ebenfalls in einer Eintopfreaktion bzw.

Tandemreaktion durchgeführt wird (Abbildung 6).

Abbildung 6: Kombination einer metallkatalysierten Reaktion mit einer Biotransformation zur

Synthese pharmazeutisch relevanter Bausteine in einer Eintopf-Reaktion

Aus dem Biarylalkohol kann Odanacatib hergestellt werden. Hierbei handelt es sich um einen

selektiven Kathepsin-K-Inhibitor, der gegen Osteoporose eingesetzt wird.[26]

3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus Bacillus megaterium als Katalysatoren

9

3. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit P450-Monooxygenasen aus

Bacillus megaterium als Katalysatoren

3.1 Einleitung

Mit Hilfe der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium können lineare und cyclische Alkane

hydroxyliert werden. Die entstehenden Alkohole können dann mit Hilfe einer Alkoholdehydrogenase

zu Ketonen weiteroxidiert werden. Lineare C6-C12-Alkohole sind wichtige Bausteine für nichtionische

und anionische Tenside [21,22] und die jeweiligen cyclischen Alkohole aus dem KA-Öl sind Ausgangs-

stoffe für Polymere wie Nylon-6.6 oder Nylon-6.8. Cycloalkanone sind Edukte für die Bildung von

Polymeren wie Nylon-6 und Nylon-12.[21] Als Modellsubstrate wurden n-Butan, n-Oktan und

Cyclooktan ausgewählt. Die Reaktionen sollten ökologisch und durchführbar sein. Dafür bat sich die

Biokatalyse im wässrigen Medium in einer Eintopfreaktion an. Das Modellsubstrat Cyclooktan wurde

hierbei einer Doppeloxidation zum Cyclooktanon unterworfen.

3.2 Stand der Wissenschaft

3.2.1 Aufbau der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium (BM-3)

Cytochrom P450-Enzyme gehören zu der Häm-enthaltenden Enzymklasse der Monooxygenasen. Sie

kommen in der Natur häufig vor und spielen eine wichtige Rolle bei der Entgiftung von

xenobiotischen Komponenten.[27,28] Die Cytochrom P450-Monooxygenase kann z.B. aus Bacillus

megaterium (P450 BM-3) isoliert werden.[27,29] Diese Oxygenase ist ein farbiges Enzym mit einer Häm-

Gruppe und einem sechsfach koordinierten Eisen-Komplex, der ein Absorptionsmaximum bei 450 nm

aufweist.[28] Sie enthält im Ruhezustand ein low spin Eisen(III)-Ion in einer oktaedrischen

Koordinationsumgebung. Eine axiale Position wird von einem Cysteinyl-Thiolatoligand besetzt, die

andere axiale Position von einem Aqualiganden. Das aktive Zentrum einer P450-Monooxygenase ist

somit ein Eisen-Porphyrin mit einem Cystein-Rest als fünften Liganden (Abbildung 7).[29]


10

Abbildung 7: Darstellung des aktiven Zentrums einer Cytochrom P450-Monooxygenase

Die hier vorgestellten Biotransformationen und Anwendungen basieren auf der Cytochrom P450-

Monooxygenase aus Bacillus megaterium (EC 1.14.14.1).[29,30] Dieser Biokatalysator ist ein

wasserlösliches, 119 kDa schweres Enzym, das aus einer 55 kDa schweren Häm-enthaltenden

Monooxygenase Domäne und einer 66 kDa schweren FAD- und FMN-enthaltenden Reduktase-

Domäne besteht (Abbildung 8).[31,32] Diese Multi-Domänen-Anordnung gewährleistet die unab-

hängige Katalyse [33,34] bei dem Elektronentransfer vom Cofaktor NAD(P)H zu dem Eisen-Ion, da alle

funktionellen Domänen auf einem einzelnen Polypeptid-Strang angeordnet sind.[34]

Abbildung 8: System bei der P450-Monooxygenase BM-3 [35]

Im Gegensatz dazu steht ein Dreikomponenten-Protein-System mit einer Cytochrom P450-

Reduktase, einem Eisen-Schwefel-Elektronencarrier und einer Cytochrom P450-Monooxygenase vor

(Abbildung 9).[35]

Abbildung 9: Dreikomponenten-System [35]


11

In dieser Doktorarbeit wurde der Wildtyp der P450-Monooxygenase, die 19A12-, F87V- und P2B10-

Mutante der Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium verwendet.

3.2.2 Mechanismus der P450-Monooxygenase-katalysierten Reaktionen

Der Katalysezyklus der P450-Monooxygenase ist gut erforscht [36] und in Abbildung 10 dargestellt. Die

dicken Balken stehen, wie in Abbildung 7 gezeigt, für den Porpyhrin-Ring.

Abbildung 10: Katalysezyklus einer P450-Monooxygenase [36]

Im ersten Schritt erfolgt eine Substratanlagerung, d.h. aus dem sechsfach koordinierten Eisen(III)-

Komplex 1 wird der fünffach koordinierte Eisen(III)-Komplex 2 (Abbildung 10). Die Substratbindung

verdrängt alle in der substratbindenden Tasche vorhandenen Wassermoleküle und bewirkt durch

vorwiegend hydrophobe Wechselwirkungen innerhalb des Proteins in der Nähe der sechsten

Koordinationsstelle des Häm-Systems einen Übergang zur Eisen(III)-Form mit offener

Koordinationsstelle und einer stark ausgeprägten out-of-plane Struktur mit gewölbten Porphyrin-

Ring. Im zweiten Schritt nimmt der Eisen(III)-Komplex 2 unter Bildung des Eisen(II)-Komplexes 3 ein

Elektron auf und ermöglicht dadurch die Bindung des Sauerstoffs. Die Aufnahme des Sauerstoffs

findet im dritten Schritt statt und führt zu einem Eisen(III)-Superoxid 4. Der vierte Schritt ist

vermutlich der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Hier führt die Aufnahme eines Elektrons zu

einem Eisen(III)-Peroxid-Komplex 5. Anschließend erfolgt die Addition von Protonen, die zur Spaltung


12

der O-O-Bindung unter Bildung von Wasser benötigt werden, wobei der Eisen(III)-Hyperoxid-Komplex

6 erhalten wird. Darüber hinaus kann das π-System des Porphyrin-Rings selbst zu einem

Radikalkation oxidiert werden. Diese Einheit wird als Oxenoid 7 bezeichnet. Vor seiner Freisetzung in

die Lösung ist der Alkohol wahrscheinlich kurze Zeit an das Eisen(III)-Porphyrin-Zentrum unter

Ausbildung des Komplexes 8 koordiniert.[36,37,38] Neben dem regulären Katalysezyklus gibt es noch

drei Wege, durch die es zur Dissoziation der aktivierten Sauerstoffspezies vom katalytisch aktiven

Eisen kommen kann, die sogenannten „shunt pathways“. Beim „Peroxid Shunt“ kann aus dem

Komplex 2 durch externe starke Oxidationsmittel wie Periodat oder Peroxid schon der Komplex 6

erhalten werden.[36,39] Die Reaktionsprodukte können also auch ohne den Einsatz des Cofaktors

NAD(P)H erhalten werden. Die Rückreaktion führt zur Freisetzung von Wasserstoffperoxid. Beim

„Autooxidation Shunt“ entsteht der Komplex 2 durch Dissoziation eines Superoxid-Moleküls aus dem

Komplex 4. Komplex 2 kann aber auch über den „Oxidase Shunt“ aus dem Komplex 7 erhalten

werden. Hierbei wird der Sauerstoff durch Verbrauch von NAD(P)H zu Wasser reduziert.[40] Am

einfachsten kann die Hydroxylierung von C-H-Gruppen über einen Zweischritt-Mechanismus, dem

Rebound-Mechanismus (Abbildung 11) erklärt werden. Zuerst wird aus dem Substrat ein

Wasserstoffatom abstrahiert und auf den Sauerstoff des Oxenoids übertragen. Die Spaltung erfolgt

homolytisch, so dass ein Radikal im Substrat entsteht. Im zweiten Schritt, der auch Rebound-Schritt

genannt wird, bindet das Radikal im Substrat an das Eisen(IV)-OH-Intermediat, wodurch Komplex 8

entsteht, aus dem das hydroxylierte Produkt dissoziieren kann.[36,40]

Abbildung 11: Rebound-Mechanismus der Hydroxylierungsreaktion [36,40]

3.2.3 Natürliche Substrate und Eigenschaften der P450-Monooxygenase BM-3

Von der Cytochrom P450-Monooxygenase BM-3 ist bekannt, dass sie in der natürlich vorliegenden

Form Sauerstoff in subterminale C-H-Bindungen von Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C12 bis C18

[29,41] mit einer hohen Aktivität und einer guten Stereoselektivität an den Positionen ω-1, ω-2 oder

ω-3 [33,34,43] einfügt. Desweiteren hydroxyliert sie langkettige Fettsäureamide [29] und Fettsäure-

alkohole [29,33,34,42,43] vor allem in der Position ω-1 [44] und kann aus ungesättigten Fettsäuren und

Alkenen Epoxide bilden.[29,45,46] Die Eigenschaften der Cytochrom P450-Monooxygenase, die sie für


13

organisch-synthetische Anwendungen attraktiv macht, sind die Fähigkeit, ein Sauerstoff-Atom in

aktivierte und nicht-aktivierte C-H-Bindungen einzuführen (Abbildung 12), die gute Wasserlöslichkeit,

da sie nicht membran-gebunden sind und die Multi-Domänen-Anordnung. Desweiteren sind

bakterielle P450-Monooxygenasen im Gegensatz zu eukaryotischen P450-Monooxygenasen leichter

in rekombinanter Form in bakteriellen Wirtsorganismen herzustellen und zu reinigen.[28] Die

Reinigung erfolgt in einem Schritt über eine Anionen-Austausch-Chromatographie in großem

Maßstab.[47] Die Nachteile von P450-Monooxygenasen sind die NAD(P)H-Abhängigkeit, was die

Reaktionen sehr kostenintensiv machen kann und die relative Instabilität bei Temperaturen im nicht

physiologischen Temperaturbereich. Die immobilisierten P450-Monooxygenasen verlieren bei

Raumtemperatur die Hälfte ihrer Aktivität in 35 Tagen und bei 50°C sinkt ihre Aktivität auf ca. 30%.[33]

Die P450-Monooxygenasen reagieren auf Zusätze, die die Löslichkeit der unpolaren Alkane in

wässrigem Medium erhöhen sollen, mit einem Verlust der Aktivität, sobald die Konzentration von 2%

an organischen Solvens überschritten wurden.[29] So werden bei Zusatz von 14% (v/v) DMSO zur

gereinigten Monooxygenase 70% der ursprünglichen Aktivität erhalten und bei Zusatz von 28% (v/v)

DMSO waren nur noch 10% vorhanden.[48]

3.2.4 Oxidationsreaktionen

Die kontrollierte, selektive Oxidation von nicht-aktivierten C-H-Bindungen ist eine der am meisten

gewünschten Transformationen der Katalyse.[44,49] Die Forschung der letzten Jahre konzentrierte sich

auch zunehmend auf die Hydroxylierung von n-Alkanen, Cycloalkanen und Aromaten mit Hilfe der

P450-Monooxygenase BM-3 und abgeleiteten Mutanten gemäß Abbildung 12.

Abbildung 12: Reaktionsprinzip einer Cytochrom P450-Monooxygenase

Allerdings zeigte der natürliche Typ kaum Aktivität gegenüber n-Alkanen und Cycloalkanen.

ADAM et al. zeigten im Jahr 2000 zum ersten Mal, dass eine P450-Monooxygenase BM-3 offenkettige

Alkane von n-Hexan bis n-Nonan und Cycloalkane von Cyclohexan bis Cyclooktan hydroxylieren

kann.[44] Diese Arbeitsgruppe bestimmte keinen Umsatz, sondern eine Produktbildung und machte

Angaben über die Regio- und Stereoselektivität der P450-Monooxygenase BM-3. Die Produktbildung

kann in mol/l oder in g/l angegeben werden. Die Hydroxylierungen von Alkanen sind meist regio- und

stereoselektiv, wobei keine Hydroxylierung an der ersten Position beobachtet wurde und nur

(S)-Produkte gebildet wurden.[44] Die Regioselektivität hing von der Kettenlänge ab, wobei sterische


14

Effekte bei längerkettigen Alkanen mit einer Kettenlänge von mehr als sechs Kohlenstoffatomen als

Grund identifiziert wurden. Bei n-Hexan wurden beispielsweise nur die beiden Produkte Hexan-2-ol

mit einer Enantioselektivität von 93% ee und Hexan-3-ol mit 54% ee gebildet, wobei die

3-substituierte Verbindung mit einer Regioselektivität von 57% das Hauptprodukt war.[44] Mit

n-Oktan als Substrat wurden insgesamt drei Oxidationsprodukte erhalten: Oktan-2-ol und Oktan-3-ol

wurden mit einer Enantioselektivität von über 99% ee erhalten, während Oktan-4-ol nur mit einer

niedrigen Enantioselektivität von 6% ee isoliert wurde. Das Hauptprodukt war die 2-substituierte

Verbindung mit einer Regioselektivität von 53%. Die Enantioselektivität stieg mit zunehmender

Kettenlänge auf bis zu 99% ee an.[44] Die Untersuchungen zeigten, dass bei Cycloalkanen generell die

größeren Ringe und bei offenkettigen Alkanen die längeren Ketten als bessere Substrate gelten, da

sie den natürlichen Substraten der P450-Monooxygenase BM-3 mehr ähneln.[44]

3.2.5 Optimierung der P450-Monooxygenase BM-3 durch Mutation

In den letzten Jahren wurde daran geforscht, geeignete Monooxygenase-Mutanten zu finden, die

eine höhere Aktivität als der Wildtyp aufweisen. Zur Verbesserung der Aktivität gegenüber Alkanen

durch gerichtete Evolution wurde ein schneller und reproduzierbarer Test benötigt.[29] Dabei wurde

zuerst eine Bibliothek von Genen aus Mutanten der P450-Monooxygenase BM-3 in E. coli

transformiert und auf eine Agar-Platte aufgebracht. Die entstehenden Kolonien wurden einzeln auf

eine Mikrotiter-Platte übergeimpft, auf der sie über Nacht wachsen konnten. Die Kolonien wurden

anschließend zur Expression auf eine neue Mikrotiter-Platte gegeben.[29] Danach wurde ein

kolorimetrischer Assay durchgeführt. Hierzu wurde das n-Oktan-Derivat p-Nitrophenoxyoktan (9)

eingesetzt, das unter Bildung eines instabilen Hemiacetals 10 hydroxyliert wurde. Das Hemiacetal

zerfiel zum gelben p-Nitrophenolat (11) und dem korrespondierenden Aldehyd 12 (Abbildung 13).

Durch die Bildung des gelben Phenolats konnte die Aktivität der einzelnen Mutanten bezüglich 9

berechnet werden. Durch diesen Test fanden FARINAS et al. heraus, dass die besten Mutanten mehr

als fünfmal aktiver gegenüber n-Oktan sind als der Wildtyp.[29] Anstelle von 9 konnten auch p-

Nitrophenoxycarbonsäuren, wie z. B. p-Nitrophenoxydodekansäure oder –pentadekansäure [42]

eingesetzt werden, die ebenfalls zum Chromophor p-Nitrophenolat (11) zerfielen.[42,43]


15

Abbildung 13: Screening-Assay für die Aktivität bei der Oxidation von Alkanen mit

p-Nitrophenoxyoktan (9) [29]

ADAM et al. demonstrierten 2001, dass die P450-Monooxygenase BM-3 kürzerkettige, unverzweigte

Arylalkane wie Propylbenzol und Allylbenzol selektiv an der α-Position hydroxyliert. Bei

längerkettigen Arylalkanen wie Pentylbenzol wurde die Hydroxylierung an der α-, β-, γ- und δ-

Position beobachtet, was auf sterische Gründe zurückzuführen ist. Desweiteren zeigte diese

Arbeitsgruppe, dass die P450-Monooxygenase BM-3, die in Alginat-Gel immobilisiert wurde, eine

höhere Aktivität für die Oxidation dieser Substrate zeigte als das frei vorliegende Enzym.[50] Im

gleichen Jahr stellten APPEL et al. fest, dass eine dreifach mutierte P450-Monooxygenase aus Bacillus

megaterium (F87V/L188Q/A74G) eine hohe Aktivität gegenüber einigen Aromaten aufweist. Es ist

gelungen, den Heteroaromaten Indol zu hydroxylieren, der vom Wildtyp nicht akzeptiert wird. Als

weitere Beispiele sind Naphthalin und der Heteroaromat 8-Methylchinolin zu nennen.[32]

Die Mutante 139-3 der P450-Monooxygenase BM-3 wurde im Jahr 2003 von FARINAS et al. zur

Epoxidierung von Styrol, Benzol, Cyclohexen, 1-Hexen und Propylen eingesetzt. Die Substrate wurden

von dieser Mutante viel schneller umgesetzt als durch den Wildtyp.[46] Im selben Jahr setzte die

Arbeitsgruppe um ARNOLD die Mutante 1-12G ein, für die bei der Hydroxylierung von n-Oktan zu 2-

Oktanol eine Regioselektivität von 82% und 39% ee für das (R)-Enantiomer erhalten wurden.[51]

Eine Arbeit von WATANABE et al. aus dem Jahr 2007 beschrieb die Oxidation von acyclischen Terpenen

mit einer Dreifach-Mutanten der Cytochrom P450-Monooxygenase BM-3 (R47L/Y51F/F87V) mit einer

teilweise sehr hohen Effizienz.[52]


16

Im Jahr 2011 verwendete die Arbeitsgruppe von URLACHER die Mutante F87A/A328V, bei der die

Substitution der größeren Phenylalanin-Gruppe durch die kleinere Alanin-Gruppe sich als vorteilhaft

im Bezug auf die Hydroxylierung von cyclischen C8-bis C12-Alkanen erwies. [53] Desweiteren wurde das

Substrat durch weitere Mutation während der Katalyse besser stabilisiert, da die Form der

Substratbindungstasche passender ist.[53] Diese Mutante konnte sowohl Cyclooktan, als auch

Cyclodekan und Cyclododekan hydroxylieren. Hierbei wurden Umsätze von 80% für die Bildung von

Cyclooktanol, 60% für die Bildung von Cyclodekanol und 46% für die Bildung von Cyclododekanol

erhalten.[53] Die von der Arbeitsgruppe verwendete Mutante F87V/A328F zeigte hohe Aktivitäten

sowohl für das Substrat Cyclooktan als auch für das Substrat n-Oktan. Hierbei wurde Cyclooktanol

mit einem Umsatz von 75% erhalten und 2-(R)-Oktanol mit einem Umsatz von 15%, einem ee-Wert

von 46% und sehr guter Regioselektivität von 92%.[53]

Zusammenfassend ist die Hydroxylierung von Alkanen und Aromaten mit Hilfe der Cytochrom P450-

Monooxygenase aus Bacillus megaterium ein aktuelles Forschungsgebiet. Das Screening nach

wichtigen Mutanten ist eine gut etablierte Methode. Durch diese Mutanten konnten sogar nicht-

natürliche Substrate mit kurzer Kettenlänge umgesetzt werden.

3.2.6 Hydroxylierung von gasförmigen n-Alkanen

Im Jahr 2002 wurde von GLIEDER et al. gezeigt, dass eine modifizierte P450-Monooxygenase BM-3

auch gasförmige Alkane oxidieren konnte.[34] Das bis 2002 kleinste bisher hydroxylierte Alkan war

Propan, das mit einer Selektivität von über 95% an der zweiten Position unter Bildung von

Isopropanol von der Mutante 139-3 der P450-Monooxygenase BM-3 hydroxyliert wurde.[34] Die

Mutante hydroxylierte auch n-Butan mit einer Selektivität von 100% zu 2-Butanol, wobei

turnover rates von 1.830 erreicht wurden.[34] Die Reaktionen wurden ohne Cofaktorregenerierung

durchgeführt. Die Arbeitsgruppe um ARNOLD setzte im Jahr 2003 die Mutante 1-12G ein, die Propan

mit einer Regioselektivität von 97% zu 2-Propanol umsetzen konnte. Hierbei wurde eine TTN von

6000 erreicht.[51]

Eine 2011 erschiene Arbeit von ZILLY et al. beschäftigte sich mit der Oxidation von Methan, Propan

und n-Butan mit Hilfe der P450-Monooxygenase BM3 (CYP102A1) aus Bacillus megaterium.

Desweiteren wurde der Einfluss von chemisch inerten Perfluorocarbonsäuren auf das P450-Enzym

untersucht.[54] Die Gesamtproduktkonzentration von 2-Butanol lag ohne Zugabe von Perfluoro-

carbonsäuren bei 1.2 mM bei einer TON von 527 und einem ee-Wert von 24%.[54] Die katalytische

Aktivität erhöhte sich durch Zugabe eben dieser Säuren für das System mit n-Butan. Die Gründe


17

lagen im Übergang des Fe/Häms von einem Low-Spin- in einen High-Spin-Zustand und die

Verkleinerung der Bindungstasche, aufgrund der sterisch anspruchsvollen CF3-Gruppe.[54] Dadurch

wurden die kleinen Substratmoleküle in der Bindungstasche besser fixiert. Es wurde im besten Fall

mit der Perfluorocarbonsäure 13 eine Gesamtproduktkonzentration von 8.4 mM erreicht. Die TON

betrug 3632 und der ee-Wert lag bei ebenso niedrigen 22%, d.h. die Perfluorocarbonsäure verbessert

nicht die Stereoselektivität, aber Bildung des Produkts.[54] Diese Arbeitsgruppe konnte auch

erfolgreich die Oxidation von Methan durchführen. Hierbei wurde mit der Perfluorocarbonsäure 14

eine Gesamtproduktkonzentration von 3.31 mM und einer TON von 2472 erhalten.[54] Die

Perfluorocarbonsäuren 13 und 14 sind in Abbildung 14 dargestellt.

Abbildung 14: Die chemisch inerten Perfluorocarbonsäuren 13 und 14 [54]

3.2.7 Syntheseanwendungen der P450-Monooxygenasen

3.2.7.1 Hydroxylierung von Alkanen, Cycloalkanen und Fettsäuren

Es wurde gezeigt, dass Alkane und Cycloalkane von der P450-Monooxygenase aus Bacillus

megaterium (P450-BM3) hydroxyliert werden können, allerdings sind nur wenige organisch-

synthetische Arbeiten bekannt. Im Jahr 2000 experimentierten ADAM et al. mit dem Wildtyp dieser

Monooxygenase und testeten sie auf ihre Aktivität für die Oxidation von Alkanen.[44] Im Laufe der

Jahre erkannte man die Vorteile von Mutanten der P450-Monooxygenase BM-3, die viele Substrate,

oftmals auch nicht typische Substrate, schneller umsetzen konnten. Die erste bekannte Kombination

aus immobilisierter P450-Monooxygenase und einem kostengünstigeren Cofaktorregenerierungs-

system mit einer Formiatdehydrogenase (FDH) wurde 2003 durch MAURER et al. etabliert.[33] Bei

dieser Cofaktorregenerierung wurde Formiat unter Verbrauch von NADP+ zu Kohlendioxid abgebaut.

Dieses Gas wurde dem Gleichgewicht entzogen und somit das Gleichgewicht auf die Seite des

Alkohols verschoben.[33] Hier wurden sowohl Naphthalin als auch n-Oktan hydroxyliert.[33] Im Jahr

2005 verwendeten MAURER et al. ein Zweiphasen-System als Reaktionsmedium, wobei Cyclohexan 15

die organische Phase darstellte und auch als Solvens fungieren konnte.[27] Die eingesetzte Mutante

der P450-Monooxygenase BM-3 war NADH- und nicht NADPH-abhängig, weshalb für die enzym-

gekoppelte Cofaktorregenerierung eine NADH-abhängige Formiatdehydrogenase verwendet wurde.

Mit Hilfe dieses sehr stabilen Systems, das in Abbildung 15 dargestellt ist, konnten auch n-Oktan und

Myristinsäure umgesetzt werden. Die Aufarbeitung vereinfachte sich, da das Enzym und der Cofaktor


18

in der wässrigen Phase verblieben, während das Produkt in die organische Phase überging.[27] Die

Arbeitsgruppe bestimmte keinen Umsatz, sondern charakterisierte die Reaktion anhand der

Produktbildung.

Abbildung 15: Hydroxylierung von Cyclohexan (15) zu Cyclohexanol (16) in einem

Zweiphasensystem[27]

3.2.7.2 Anwendung als Katalysator in der Steroid-Synthese

Cortison (18) wird auf konventionellen, chemischen Wege aus der Gallensäure (17) über 30 Stufen

hergestellt (Abbildung 16).[55] Von diesen vielen Schritten benötigt man allein 12 Stufen, um die 12-

Hydroxyfunktion in die 11-Position umzulagern.

Abbildung 16: Konventionelle chemische Synthese von Cortison (18) [55]

In der Steroid-Synthese finden mehr als zehn verschiedene P450-Monooxygenasen Anwendung.

Besondere Bedeutung haben hierbei die 7α-, 9α-, 11α-, 11β- 14α- und 16α-Hydroxylierung

erlangt.[55] Das weibliche Sexualhormon Progesteron (20) [56] wird aus Diosgenin (19), das aus der


19

Barbasco-Wurzel isoliert wird, hergestellt. Progesteron (20) und seine 11α-hydroxylierte

Verbindung 21 sind Zwischenstufen in der chemisch-mikrobiologischen Synthese des Steroids 18

(Abbildung 17).

Abbildung 17: Chemisch-mikrobiologische Synthese von Cortison (18) [55]

Das Hormon 20 kann beispielsweise an der 11α-Position von P450-Monooxygenasen hydroxyliert

werden. Die Monooxygenasen, die diese Reaktion katalysieren, werden aus den Köpfchen-

schimmelpilzen Rhizopus nigrans und Rhizopus arrhizus gewonnen.[55] Durch die biokatalytische

Hydroxylierung von Progesteron (20) zu 11α-Hydroxyprogesteron (21) verkürzen sich die 30 Stufen

der konventionellen chemischen Synthese auf 15 Schritte, wodurch die Kosten erheblich reduziert

werden.[55]

Das C27-Steorid Cholesterin (22) ist eine Vorstufe von biologisch aktiven Steroidhormonen im

menschlichen Organismus.[57] Es wird zu Androstendion (23) abgebaut, das als Ausgangsbaustein

unterschiedlichster Synthesen verwendet wird. Es kann beispielsweise mikrobiologisch zum

Testosteron (24) reduziert werden (Abbildung 18).[55]


20

Abbildung 18: Abbau des Steroids 22 zu Androstendion (23) und Reduktion zu Testosteron (24) [55]

3.2.7.3 Epoxidierung von Alkenen und Aromaten

Desweiteren sind P450-Monooxygenasen fähig, Doppelbindungen zu epoxidieren. Chirale Epoxide 26

können durch Verwendung von chiralen MnII-Salen-Katalysatoren erhalten werden.[45] Der Nachteil

ist die geringe Stabilität bezüglich der Autooxidation, was sich in den niedrigeren turnover numbers

(TON) bemerkbar macht. Die TON errechnet sich aus dem Quotienten der Stoffmenge des gebildeten

Produkts und der Stoffmenge des eingesetzten Katalysators. Im Gegensatz dazu ist die turnover

frequency (TOF) der Quotient aus TON und der Reaktionszeit.[4a] Ein Ansatzpunkt zur Lösung des

Stabilitätsproblems, das auf Autooxidation zurückzuführen ist, ist der Einsatz einer P450-

Monooxygenase. Für die asymmetrische Epoxidierung von Styrol-Derivaten 25 wurde eine NADH-

abhängige Styrol-Monooxygenase (StyAB) von Pseudomonas sp. verwendet. Diese bestand aus einer

Oxygenase-Einheit (StyA) und einer Reduktase-Einheit (StyB) (Abbildung 19). Die Reaktion lief in

einem Zweiphasen-System ab und erzielt hohe TON. Die Monooxygenase und die FDH, die den

Cofaktor NADH regenerierte, verblieben in der wässrigen Phase, während das entstehende Epoxid in

die organische Phase überführt wurde.[45]

Abbildung 19: Biokatalytische, asymmetrische Epoxidierung von Styrol-Derivaten 25 durch eine

Pseudomonas sp. Styrol-Monooxygenase [45]


21

Eine Dreifach-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium wurde 2003 von FARINAS

et al. zur Epoxidierung von Styrol, Benzol, Cyclohexen, 1-Hexen und Propylen eingesetzt. Die

Substrate wurden von dieser Mutante viel schneller umgesetzt als vom Wildtyp.[46]

3.2.7.4 Einsatz der P450-Monooxygenase bei der chemoenzymatischen Fluorierung

von inaktiven organischen Substanzen

Ein neues Anwendungsgebiet von Monooxygenasen hatte sich 2009 in der Arbeitsgruppe um FASAN

in der chemoenzymatischen Fluorierung von inaktiven organischen Substanzen ergeben

(Abbildung 20). Hier wurde die Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium in einem

Zweistufen-Prozess eingesetzt. Der erste Schritt war die enzymatische Hydroxylierung durch die

Monooxygenase und der zweite Schritt war die Deoxofluorierung mit Hilfe einer Substanz, die Fluorid

abgeben kann.[58] Durch die Substitution eines Wasserstoffatoms durch ein Fluoratom erhoffte man

sich in der pharmazeutischen Industrie große Fortschritte. Die Fluorierung erhöht die

Bioverfügbarkeit, verbessert die Affinität des Rezeptors bezüglich des Arzneimittels und erniedrigt

die Toxizität, da fluorierte Moleküle stabiler gegenüber dem Metabolismus sind.[59]

Abbildung 20: Chemoenzymatische Fluorierung von inaktiven organischen Substanzen [58]

3.2.7.5 Hydroxylierung von (monosubstituierten) Benzolen

Monosubstituierte Benzole, wie Vanillin oder Guaicaol, werden in der Duftstoff- und in der

Pharmaindustrie verwendet.[60] Die Arbeitsgruppe um SCHWANEBERG entwickelte 2012 die P450 BM-3-

Variante M2 (R47S/Y51W/I401M) für die regioselektive und aromatische Hydroxylierung von p-

Xylol.[61] Mit dieser Mutante konnten die Kupplungseffizienzen gegenüber dem Wildtyp deutlich

gesteigert werden und sie setzte Anisol, Toluol, Fluor-, Chlor-, Brom- und Iodbenzol um, während der

Wildtyp Fluor- und Iodbenzol nicht hydroxylieren konnte.[60] Die Mutante erreichte für alle

monosubstituierten Benzole mit Ausnahme des Fluorbenzol exzellente Regioselektivitäten für die

o-Hydroxylierung mit über 90%. Das beste Ergebnis wurde mit dem Substrat Anisol erzielt.[60] Hier

erreichte man eine iTOF (Anfangsumsatzgeschwindigkeit) von 38.6 s-1 und eine spezifische Aktivität

von 19.5 U/mgP450, was zu diesem Zeitpunkt die höchste Produktbildungsgeschwindigkeit für diese

Art von Reaktion darstellte.[60]


22

Die Arbeitsgruppe um WATANABE beschäftigte sich mit der Hydroxylierung von Benzol mit Hilfe des

Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 durch Zugabe von Perfluorocarbonsäuren (PCF), die sich

nur in der Alkylkettenlängen unterschieden, und veröffentlichte im Jahr 2013 seine Ergebnisse.[62] Das

beste Ergebnis wurde durch Zugabe von PCF9 erhalten. Die Rate lag hier bei 120 min-1 bei einer

Kupplungseffizienz von 24%. Der Wildtyp wies im Gegensatz zu der Mutante F87A eine höhere

Regioselektivität zur Bildung des ortho-Produkts auf und erreichte für das Substrat Toluol TON von

220 min-1. Die Verschlechterung der ortho-Selektivität bei Einsatz der F87A-Mutante lag an den

Aminosäuren im aktiven Zentrum der Monooxygenase. Das auf der Distalseite des Häms liegende

Phe87 konnte mit Toluol reagieren und eine ortho-selektive Hydroxylierung induzieren. Durch den

Austausch der Mutante an Position 87 war das nicht mehr in dem Ausmaß gegeben.[62]

3.2.8 Alkoholdehydrogenase

Die Alkoholdehydrogenasen (ADH) zählen zur Gruppe der Dehydrogenasen. Diese verbrauchen bzw.

bilden NADH und NADPH. Die Alkoholdehydrogenasen, die die Oxidation von Alkoholen zu den

entsprechenden Aldehyden und Ketonen und die Reduktion der Ketone zu den entsprechenden

sekundären Alkoholen katalysieren, kann man grob in (S)- und (R)-selektive ADHs unterteilen.

Bekannte Vertreter von (S)-selektiven sind die Alkoholdehydrogenasen aus Rhodococcus erythropolis

bzw. aus Rhodococcus ruber. Die NADPH-abhängigen (R)-selektiven ADHs aus Lactobacillus brevis und

Lactobacillus kefir sind homotetramer und gehören zur Familie der kurzkettigen Dehydrogenasen /

Reduktasen (SDR).[63,64] In dieser Doktorarbeit wurde meist eine (R)-selektive Alkoholdehydrogenase

aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) verwendet.

3.2.8.1 Aufbau der Alkoholdehydrogenasen

Die beiden Alkoholdehydrogenasen aus Rhodococcus erythropolis und Lactobacillus kefir besitzen für

eine Reihe von Substraten eine sehr hohe spezifische Aktivität von mehr als 1000 U/mg.[65] Die

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) hat zwei Magnesium-Ionen, die von zwei (R)-

ADH-Ketten komplexiert werden, was eine Stabilisierung der Quartärstruktur zur Folge hat. Das

aktive Zentrum beinhaltet mehrere Wassermoleküle, die in einer hydrophilen Tasche zu finden sind.

Diese Tasche wird von mehreren Carbonyl-Sauerstoff-Atomen und den Hydroxy-Gruppen der

Seitenkette umgeben.[63] Die LK-ADH ist genau wie die LB-ADH (R)-selektiv und NADPH-abhängig. Die

beiden Alkoholdehydrogenasen besitzen verschiedene, gemeinsame Motive für die Cofaktor-

Bindungsstelle. Bei der LB-ADH kann durch Austausch von Glycin durch Asparaginsäure an

Position 37 die Abhängigkeit von NADPH in Richtung des billigeren Cofaktors NADH geschoben


23

werden (RADH-G37D). Die Reduktion vom Keton zum Alkohol erfolgt über die katalytische Tetrade

und das ausgedehnte Protonenübertragungssystem (Abbildung 21).[64]

Abbildung 21: Röntgenstruktur der katalytischen Tetrade (in magenta) und des

Protonenübertragungssystems (gestrichelte Linien) von RADH-G37D [S][64]

Die wichtigsten vier an der Reaktion beteiligten Aminosäuren sind hierbei Asn113 (Asparagin), Lys159

(Lysin), Ser142 (Serin) und Tyr155 (Tyrosin). Die Reaktion startet bei der katalytischen Säure Tyrosin,

die während der Reaktion deprotoniert wird und dadurch vom positiv geladenen Lysin stabilisiert

wird.[66] Die Seitenkette des Serins ist nötig, um das Substrat zu fixieren und darüber hinaus

beeinflusst Serin bei SDRs gemäß BLANKENFELDT et al. den pKa-Wert des Tyrosin-Rests und des

Substrats. Dadurch bildet sich eine energieärmere Wasserstoffbindung aus, in deren

Übergangszustand ein Wasserstoffatom von zwei Bindungspartnern geteilt wird.[67] FILLING et al.

zeigte, dass ein ausgedehntes Protonenübertragungssystem existiert, an dem die katalytische

Tetrade, Coenzyme, Wasser und das Substrat beteiligt sind. Bei der Alkoholdehydrogenase aus

Drosophila existiert ein großes wasserstoffgebundenes Lösungsmittelnetzwerk, in dem das Wasser

sowohl an den Asparagin-Rest als auch an den Lysin-Rest gebunden ist.[68]

3.2.8.2 Anwendung

Die wichtigste Funktion der Alkoholdehydrogenasen besteht in der Reduktion von prochiralen

Ketonen 27a zur Synthese chiraler sekundärer Alkohole 28a (Abbildung 22). Die Reduktionsreaktion

ist hochenantioselektiv. Hierbei werden ein Wasserstoffatom und zwei Elektronen von NADPH auf

das Keton übertragen.[1]


24

Abbildung 22: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen 27a zu sekundären chiralen

Alkoholen 28a

In dieser Doktorarbeit wird die Alkoholdehydrogenase aber meist als Katalysator für die Oxidation

eines sekundären Alkohols zum korrespondierenden Keton verwendet (Abbildung 23).

Abbildung 23: Oxidation von sekundären chiralen Alkoholen 28a zu Ketonen 27a

In dieser Doktorarbeit werden die Alkoholdehydrogenasen sowohl für die Oxidations- bzw.

Reduktionsreaktion als auch für eine in situ-Cofaktorregenerierung angewendet. Unter Anderem

wird die Alkoholdehydrogenase mit einer Cytochrom P450-Monooxygenase gekoppelt. Die P450-

Monooxygenase bildet aus einem Cycloalkan oder einem n-Alkan 29 unter Verbrauch von NAD(P)H

und Bildung von NAD(P)+ den entsprechenden Alkohol 28b. Der gebildete Alkohol 28b wird von der

Alkoholdehydrogenase zum Keton 27b unter Verbrauch von NAD(P)+ und Bildung von NAD(P)H

oxidiert. Der reduzierte Cofaktor steht somit für den nächsten Katalysezyklus zur Verfügung

(Abbildung 24). Basierend auf diesem Konzept konnte auf den Zusatz eines Cosubstrats verzichtet

werden.[13]

Abbildung 24: Konzept der in situ-Cofaktorregenerierung durch Kombination einer Cytochrom P450-

Monooxygenase mit einer ADH [13]


25

Bei dem Konzept der substratgekoppelten Cofaktorregenerierung [10,13,69] (Abbildung 25) wird die

Fähigkeit der Alkoholdehydrogenase ausgenutzt, dass sie sowohl ein Keton 27c reduzieren, als auch

einen Alkohol 28c oxidieren kann. Die Alkoholdehydrogenase bildet aus Isopropanol (30) unter

Verbrauch des Cofaktors NADP+ Aceton (31). Das dadurch gebildete NADPH wird von der

Alkoholdehydrogenase verwendet, um aus einem Keton 27c den chiralen sekundären Alkohol 28c zu

bilden. Das Keton 31 kann im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden, wodurch das

Gleichgewicht in Richtung von 28c geschoben wird. Zusammenfassend entsteht aus Isopropanol (30)

und einem Keton 27c unter Einsatz des Cofaktors NADP+ Aceton (31) und der gewünschte chirale

sekundäre Alkohol 28c.[6]

Abbildung 25: Konzept der substratgekoppelten Cofaktorregenerierung mit einer ADH [6,10,13,69]

Ein Beispiel für eine enzymgekoppelte Cofaktorregenerierung ist die Kombination einer

Glucosedehydrogenase (GDH) und D-Glucose (32) mit einer Cytochrom P450-Monooxygenase, die im

Laufe dieser Doktorarbeit auch Anwendung findet (Abbildung 26).

Abbildung 26: Konzept der enzymgekoppelten Cofaktorregenerierung durch Kombination einer

Cytochrom P450-Monooxygenase mit einer GDH [10,13,69]


26

3.3 Aspekt der Zielprodukte: Alkohole und Cycloalkanone in der Bulkindustrie

3.3.1 Industrielle Herstellung der Verbindungen

3.3.1.1 2-Butanol

Die Gesamtproduktion von Butanolen (1-Butanol, Isobutanol, 2-Butanol, tert-Butanol) lag 1999 in

den USA, Westeuropa, BRD und Japan bei insgesamt 3.14 Mio. Jahrestonnen (jato), wobei auf die

BRD im Jahr 1999 0.68 Mio. jato fallen.[21] 1-Butanol kann durch Propenhydroformylierung mit

anschließender Hydrierung, durch das REPPE-Verfahren (Umsetzung von Propen mit CO und Wasser

in Gegenwart einen modifizierten Eisenpentacarbonyl-Katalysators), durch eine Aldolkondensation

des Acetaldehyds mit nachfolgender Hydrierung des Crotonaldehyds und durch Fermentation von

Zucker oder Stärke gewonnen werden.[21] 2-Butanol (35) kann durch säurekatalysierte Hydratisierung

von 2-Buten (34), das durch Cracken aus dem Erdöl gewonnen wird, hergestellt werden

(Abbildung 27). Der sekundäre Alkohol 35 wird auch durch indirekte Hydratisierung aus 1-Buten und

der Verbindung 34 mit anschließender Hydrolyse hergestellt, kann aber auch durch die REPPE-

Hydrocarbonylierung hergestellt werden.[21]

Abbildung 27: Säurekatalysierte Hydratisierung von 2-Buten (34) zur Synthese von 2-Butanol (35) [21]

3.3.1.2 Lineare sekundäre C6-C18-Alkohole

Lineare sekundäre C6-C18-Alkohole 38 werden durch partielle Oxidation von Paraffinen 36, die aus

Kerosinfraktionen gewonnen werden, durch Einsatz von Borsäure (H3BO3, 37a) und Sauerstoff nach

BASHKIROV, erhalten (Abbildungen 28, 29). Die Oxidation verläuft ohne Kettenabbau oder Struktur-

isomerisierung und liefert bis zu 98% sekundäre Alkohole, die die gleiche Kettenlänge wie das

eingesetzte n-Alkan aufweisen. In der folgenden Abbildung 28 ist die Bruttoreaktionsgleichung der

partiellen Oxidation von Paraffinen 36 nach BASHKIROV zu sehen.[21]

Abbildung 28: Bruttoreaktionsgleichung der partiellen Oxidation von Paraffinen 36 nach

BASHKIROV [21]


27

Die Borsäure (37a) liegt bei den Reaktionsbedingungen zumeist als Metaborsäure (HBO2, 37b) vor.

Zuerst bildet das n-Alkan ein sekundäres Alkylhydroperoxid 39, das mit der Metaborsäure zum

Borsäureester 40 reagiert. Dadurch wird eine Folgeoxidation der Alkohole verhindert. Durch

anschließende Hydrolyse erhält man die sekundären Alkohole 38 und die Metaborsäure (37b), die

wieder dem Katalysezyklus zugeführt wird (Abbildung 29).[21]

Abbildung 29: Partielle Oxidation von Paraffinen 36 nach BASHKIROV [21]

3.3.1.3 Cyclische Alkohole und Ketone

In den 1940er wurde die Flüssigphasen-Luft-Oxidation von Cyclohexan (15) entwickelt. Hierbei

entstand ein Gemisch aus dem Alkohol Cyclohexanol (16) und dem Keton Cyclohexanon (41). Dieses

Gemisch nannte man KA-Öl, wobei das K für Keton und A für Alkohol stand. Als Katalysatoren wurden

z.B. Mangan- oder Cobalt-Salze eingesetzt (Abbildung 30).

Abbildung 30: Flüssigphasen-Luft-Oxidation von Cyclohexan 15 zu KA-Öl [21]

Bei leicht veränderten Reaktionsbedingungen (140-180°C, 8-20 bar) [70] wurde neben einem Cobalt-

Katalysator auch er Einsatz eines Chrom-Katalysators untersucht, wodurch das Verhältnis von


28

Cyclohexanol (16) zu Cyclohexanon (41) beeinflusst werden konnte.[70] Bei der Verwendung eines

Cobalt-Katalysators wurde ein höheres Verhältnis des Alkohols 16 zum Keton 41 erhalten als bei der

Verwendung eines Chrom-Katalysators, da der Chrom-Katalysator die Dehydratisierung des

Zwischenprodukts Cyclohexylhydroperoxid (42) zu Cyclohexanon (41) begünstigt.[70]

3.3.1.3.1 Industrielle Herstellung von Cycloalkanonen

In den 1950er wurde Borsäure dem Prozess zugesetzt, die sie Selektivität der Reaktion erhöht.[6,21] In

diesem BASHKIROV-Prozess wurde in Anwesenheit von Borsäure, das zuerst entstehende

Cyclohexylhydroperoxid (42) direkt zum Cyclohexanolborsäureester (43) umgesetzt, das vor weiterer

Oxidation zu offenkettigen Produkten geschützt ist (Abbildung 31).[6,70]

Abbildung 31: Oxidation von Cyclohexan 15 nach BASHKIROV [21]

Der BASHKIROV-Prozess wird heutzutage zur großtechnischen Herstellung von Cycloalkanonen, die

mehr meist mehr als acht C-Atome besitzen, angewendet. Die Nachteile dieses mehrstufigen

Verfahrens liegen an dem hohen Bedarf an Borsäure, die stöchiometrisch eingesetzt werden muss,

an der nur bei Umsätzen unter 40% akzeptablen Selektivität der Reaktion und dem sich dadurch

notwendigen aufwändigen Trennprozess mittels Destillation, der einen hohen Verbrauch an

organischen Lösungsmitteln erfordert.[71] Desweiteren sind die entstehenden Borverbindungen

schwer zu entsorgen. In den Jahren 2008 und 2009 wurde ein neuer Prozess zur großtechnischen

Herstellung von Cycloalkanonen beschrieben. Hierbei wurden Cycloalkene zu Cycloalkanonen

umgesetzt. Als Oxidationsmittel wurde hierbei Distickstoffmonoxid statt Sauerstoff eingesetzt.[72,73]


29

3.3.2 Industrielle Verwendung der hergestellten Produkte

Die in dieser Doktorarbeit hergestellten linearen und cyclischen Alkohole, Cycloalkanone und

ε-Caprolacton werden industriell als Edukte für weitere Verbindungen verwendet (Abbildung 32).

Abbildung 32: Industriell wichtige Produkte, die aus 2-Butanol (35), linearen Alkoholen und dem

cyclischen Alkohol 16 hergestellt werden [21,22]

Das n-Butan kann biokatalytisch zu 2-Butanol (35) hydroxyliert werden, das industriell zu Methyl-

keton (MEK, 44) umgesetzt wird. Lineare Alkohole sind wichtige Bausteine für Tenside und können


30

durch die biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen erhalten werden. Cycloalkanole können auf

dem gleichen Wege aus Cyclolkanen erhalten werden. Die Cycloalkanole können weiter zu

Dicarbonsäuren umgesetzt werden, die mit Diaminen zu Polymeren wie Nylon-6.6 (49) reagieren. So

kann aus Cyclohexanol (16) Adipinsäure (58) hergestellt werden, das weiter zum Polyamid 49

umgesetzt kann (Abbildung 32).[21,22] Cycloalkanone sind Ausgangsstoffe für die Bildung von Poly-

meren wie Nylon-6 51 und Nylon-12 52, Edukte bei der Darstellung von Lactonen oder Edukte in der

Duftstoffindustrie. Cyclododecanon (50) kann beispielsweise durch Behandlung mit elementarem

Brom zu 2-Bromcyclododecanon und 2-Dibromcyclododecanon umgesetzt werden, die als Ausgangs-

stoffe in der Duftstoff-Industrie verwendet werden.[25] Lactone können durch die Kombination einer

biokatalytischen Oxidation mit nachfolgender biokatalytischer Baeyer-Villiger-Oxidation dargestellt

werden. Hierbei ist als wichtigstes Lacton das ε-Caprolacton (53) zu nennen, das aus dem Cyclo-

alkanon 41 entsteht und zum Kunststoff Polycaprolacton (PCL, 54) umgesetzt werden kann

(Abbildung 33).[21]

Abbildung 33: Industriell wichtige Produkte, die aus den cyclischen Ketonen 41 und 50 und dem

Lacton 53 hergestellt werden[21]


31

3.3.2.1 2-Butanol

Das 2-Butanol wird vor allem als Zwischenprodukt verwendet. Die wichtigste Verwendung findet der

Alkohol 35 als Edukt für die Herstellung des Ketons 44 von dem 1992 in den USA, Westeuropa und

Japan 0.59 Mio. jato hergestellt wurden, während es 2004 schon 1.2 Mio. jato waren.[21] Das

Methylketon (44) wird vor allem als Lösemittel für Lacke und Harze und zur Entparaffinierung von

Schmierölen eingesetzt. Durch die Umsetzung mit Wasserstoffperoxid entsteht Methylethylketon-

peroxid, das zur Härtung von ungesättigten Polyesterharzen verwendet wird.[21]

3.3.2.2 Lineare C6-C18-Alkohole

Bei linearen Alkoholen erfolgt eine Ethoxylierung zu Fettalkoholpolyglykolethern (FAE) 45, die

nichtionische Tenside sind (Abbildung 34). Dabei entsteht in einem Zwischenschritt der

Hydroxyalkylether 55.[21,22]

Abbildung 34: Ethoxylierung von linearen Alkoholen zu Fettalkoholpolyglykolethern 45 [21,22]

Diese Art von Tensiden zeichnet sich durch ihre inverse Löslichkeit aus, d.h. diese Verbindungen

lösen sich in kaltem Wasser besser als im warmen Wasser. Dieser Effekt kommt durch die Entstehung

Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Sauerstoff der Etherbrücken und den Wasser-

molekülen zustande. Die Wasserstoffbrückenbindungen brechen bei höheren Temperaturen auf. Die

Fettalkoholpolyglykolether 45 finden deshalb vor allem Anwendung in Flüssigwaschmitteln bei

Niedrigtemperaturwäsche. Die linearen Alkohole können mit Schwefelsäure oder Schwefeltrioxid

direkt unter Darstellung von Fettalkoholsulfaten (FAS) 47 verestert werden (Abbildung 35). Die

entstehenden Sulfate sind als Alkalisalze anionischer Tenside.[21,22]

Abbildung 35: Darstellung von Fettalkoholsulfaten 47 aus linearen Alkoholen [21,22]


32

Eine andere Möglichkeit ist die Darstellung von Fettalkoholethersulfaten (FAES) 46, die ebenfalls als

Alkalisalze zu den anionischen Tensiden zählen. Hierzu wird der Alkohol erst ethoxyliert und

anschließend mit Schwefelsäure oder Schwefeltrioxid verestert (Abbildung 36).[21,22]

Abbildung 36: Darstellung von Fettalkoholethersulfaten 45 aus Fettalkoholpolyglykolethern 46 [21,22]

Anionische Tenside werden je nach Kettenlänge in Geschirrspülmitteln, in kosmetischen Produkten

oder in Waschmitteln eingesetzt werden.[21,22]

3.3.2.3 Cyclische Alkohole

Cyclische Alkohole spielen als Edukte für die Herstellung von Dicarbonsäuren, die für die

Polymerisation als Edukte eingesetzt werden, eine wichtige Rolle. Die größte Bedeutung hat hierbei

die Adipinsäure (48), die aus dem KA-Öl durch Verwendung eines Katalysators und Salpetersäure

hergestellt werden kann (Abbildung 37).[21]

Abbildung 37: Darstellung von Adipinsäure (48) aus KA-Öl [21]

Aus der Korksäure (56), die aus der Oxidation von Cyclooktan entsteht, kann Nylon-6.8 (58)

dargestellt werden. Allerdings geschieht das bisher in einem geringen Umfang.[21] Sowohl die

Verbindung 48 als auch die Dicarbonsäure 56 können in einer Kondensationsreaktion mit Hexa-

methylendiamin (57) polymerisieren. Die Dicarbonsäure 48 bildet mit dem Diamin 57 das sehr

bekannte Nylon-6.6 (49), das auch nur unter dem Namen Nylon bekannt ist und mit der

Dicarbonsäure 56 als Edukt wird das weniger bekannte Polymer 58 gebildet (Abbildung 38).[21] Aus

dem Polyamid 51 kann auch das für die Polymerisierung notwendige Hexamethylendiamin (57)

hergestellt werden. Das Polymer 51 wird in diesem Fall zum 1,6-Hexandiol hydriert, das mit


33

Ammoniak in Gegenwart von RANEY-Nickel mit einer Ausbeute von ca. 90% zu dem Polymer 58

reagiert.[21]

Abbildung 38: Darstellung von Nylon-6.6 52 und Nylon-6.8 58 [21]

3.3.2.4 Cycloalkanone

Es gibt noch einen zweiten Weg zur Herstellung von Polyamiden (Abbildung 39).

Abbildung 39: Darstellung von Nylon-6 (51) aus Cyclohexanon (41)


34

Das Lacton 41 wird zum Cyclooxim (59) umgesetzt, das in einer Beckmann-Umlagerung zu ε-

Caprolactam (60) umgesetzt wird. Durch Wassereinlagerung kommt es zur Ringöffnung, so dass die

lineare ε-Aminocapronsäure (61) gebildet wird, die die Amin-Gruppe und die Säure-Gruppe trägt.

Diese beiden Gruppen reagieren unter Kondensation zum Polymerisationsprodukt Nylon-6 (51)

(Abbildung 39).

Aus Cyclododecanon (50) kann analog Nylon-12 (52) hergestellt werden (Abbildung 40). Dazu wird

zuerst das Oxim 63 aus dem Keton 50 gebildet, das in einer Beckmann-Umlagerung zum Laurinlactam

(62) reagiert. Aus dem Lactam 62 kann dann das entsprechende Polyamid 52 hergestellt werden

(Abbildung 40).

Abbildung 40: Retrosynthesen von Nylon-6 (51) und Nylon-12 (52)


35

3.4 Hydroxylierung von n-Alkanen durch eine Cytochrom P450-Monooxygenase mit

einer in situ-Cofaktorregenerierung unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase

3.4.1 Ziel der Arbeit

Die Darstellung von Alkoholen sollte durch das Konzept der biokatalytischen Hydroxylierung von

n-Alkanen, hier n-Oktan (64) und n-Butan (65) (Abbildung 41), durch eine Cytochrom P450-Mono-

oxygenase aus Bacillus megaterium (P450 BM-3) unter in situ-Cofaktorregenerierung mit einer

Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (GDH) in wässrigem Medium realisiert werden.

Abbildung 41: Die bei der biokatalytischen Hydrierung eingesetzten n-Alkane

Die Cytochrom P450-Monooxygenase BM-3 ist NADPH-abhängig und dieser Cofaktor wird bei der

Hydroxylierungsreaktion zu NADP+ oxidiert. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass der oxidierte Cofaktor

NADP+ günstiger als NADPH ist. Die Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. setzte im ersten Schritt

die D-Glucose unter Reduktion des eingesetzten NADP+ zu NADPH zu D-Gluconolacton um, das weiter

zur D-Gluconsäure umgewandelt wurde. Der gebildete reduzierte Cofaktor NADPH stand nun für die

Hydroxylierung des n-Alkans mit Hilfe der Cytochrom P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium

zur Verfügung und wurde im Laufe dieser Reaktion zu NADP+ oxidiert, das wieder von der

Glucosedehydrogenase reduziert wurde. Somit konnte ein weiterer Katalysezyklus von Neuem

beginnen (Abbildung 42).

Abbildung 42: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen unter Einsatz einer GDH und D-Glucose


36

Desweiteren ist das Reaktionsmedium Wasser kostengünstig und ökologisch unbedenklich, was auch

für D-Glucose gilt. Die eingesetzten Enzyme sind biologischer Natur und bei richtiger Handhabung

meist ungiftig. Der für die Reaktion benötigte molekulare Sauerstoff wurde durch Luftsauerstoff

zugeführt. Alles in allem könnte das ein hocheffizienter Prozess werden, in dem später eventuell die

Ganzzellkatalyse eine wichtige Rolle spielen könnte.

3.4.2 Ergebnisse und Diskussion

3.4.2.1 Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen

Abbildung 43: Herstellung rekombinanter P450-Monooxygenasen

Im Rahmen dieser Doktorarbeit ergab sich die Gelegenheit, in den S1-Laboratorien der

Partnergruppe von Prof. Schwaneberg, die Herstellung der benötigten Enzyme zu erlernen

(Abbildung 43). Die Anzucht der Enzyme erfolgte unter sterilen Bedingungen und das eingesetzte

Antibiotikum Kanamycin, die Spurenelemente-Lösung (SEL), Aminolävulinsäure (ALA), Thiamin und

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurden steril über einen 0.2 μm-Filter filtriert. Die

eingesetzten Medien, das LB-Medium und das TB-Medium, wurden ebenfalls unter sterilen

Bedingungen hergestellt. Für die Herstellung der Übernachtkultur wurde ein Tropfen eines Glycerol-

Stocks der gewünschten P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium benötigt und das

Antibiotikum Kanamycin, die zum LB-Medium gegeben wurden. Diese Kultur wuchs über Nacht bei


37

37°C im Inkubationsschüttler. Die Übernachtkultur wurde am nächsten Tag zusammen mit

Kanamycin und SEL zum TB-Medium gegeben. Diese Vorkultur wuchs bei 30°C im

Inkubationsschüttler bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde. Anschließend wurden ALA,

Thiamin und IPTG zugegeben und die Enzyme ca. 20 Stunden bei 30°C im Inkubationsschüttler

exprimiert (Abbildung 43). Die anschließende Aufarbeitung erfolgte bei 4°C. Die Enzyme wurden am

Ende in Falcon Tubes lyophilisiert. Es wurden 584 mg der 19A12-Mutante [74,75] und 693 mg des

Wildtyps der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium erhalten Desweiteren wurde die 19A12-

Mutante auch in einem Fermenter-Ansatz hergestellt.

3.4.2.2 Spektrophotometrische Vorarbeiten

3.4.2.2.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus

megaterium

Zunächst wurden die Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen bezüglich n-Oktan

(64) als Substrat mit Hilfe eines UV/Vis-Spektrometers untersucht, um herauszufinden, welche

Monooxygenase am geeignetsten ist, um die Biotransformation zu den Oktanolen durchzuführen.

Hierzu wurden der Wildtyp, die 19A12-Mutante [74,75] und die F87V-Mutante der Cytochrom P450-

Monooxygenase getestet. Die gemessenen Aktivitäten für die jeweiligen Referenzsubstanzen

Dodekansäure (66) und n-Heptan (67) wurde auf 100% gesetzt und die relative Aktivität des

Substrats n-Oktan (64) darauf bezogen. Abbildung 44 zeigt die Strukturformeln der eingesetzten

Substanzen.

Abbildung 44: Strukturformeln der Referenzsubstanzen

Wildtyp der P450 BM-3

Als Referenzsubstrat für den Wildtyp der P450 BM-3 diente der C12-Körper Dodekansäure 66 und es

wurde eine Aktivität von 0.1748 U/mg bezüglich dieser Referenzsubstanz bestimmt. Die relative

Aktivität der Monooxygenase für das n-Alkan 64 lag mit 52% bei einem Wert von 0.0912 U/mg. Das

bedeutet, dass die Dodekansäure (66) im Vergleich zu dem für die Biotransformation eingesetzten

n-Oktan (64) doppelt so gut umgesetzt wurde. Desweiteren wurde die Aktivität bezüglich des

Substrats n-Heptan (67) untersucht, um einen Trend für kleinere Alkane vorhersagen zu können. Der

lineare C7-Körper 67 wurde mit einer Aktivität von 0.0215 U/mg vom Wildtyp der P450 BM-3


38

umgesetzt. Dies entsprach einer relativen Aktivität von 12% und war deutlich schlechter als für den

linearen C8-Körper 64 (Tabelle 2).

Tabelle 2: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3

Eintraga Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]b

1 Dodekansäure 0.1748 100

2 n-Oktan 0.0912 52

3 n-Heptan 0.0215 12 asiehe AAV 6,

bbezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

Bei Einsatz des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 war eine abnehmende Aktivität mit

abnehmender Kettenlänge zu beobachten, so dass Dodekansäure (66) am besten umgesetzt wurde.

19A12-Mutante der P450 BM-3 [74,75]

Das Referenzsubstrat für die 19A12-Mutante der P450 BM-3 war das n-Alkan 67 und es wurde eine

Aktivität von 0.1439 U/mg bezogen auf diese Referenzsubstanz gemessen. Die relative Aktivität der

Monooxygenase für das Substrat n-Oktan (64) lag bei einem Wert von 0.0632 U/mg, was einer

relativen Aktivität von 44% entspricht und damit unter der spektrophotometrisch bestimmten

Aktivität für das Referenzsubstrat n-Heptan (67) lag. Es wurde ferner die Aktivität bezogen auf die

Säure 66 untersucht, der von der 19A12-Mutante der P450 BM-3 überhaupt nicht umgesetzt wurde

(Tabelle 3).

Tabelle 3: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3


1 n-Heptan 0.1439 100

2 n-Oktan 0.0632 44

3 Dodekansäure 0.0000 <2 asiehe AAV 6,

bbezogen auf n-Heptan. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

Bei Einsatz der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 war eine abnehmende Aktivität mit

zunehmender Kettenlänge zu beobachten, so dass n-Heptan (67) am besten umgesetzt wurde. Diese

Mutante erschien geeignet für die Biotransformation des Wunschsubstrates n-Butan (65).


39

F87V-Mutante der P450 BM-3

Als Referenzsubstrat für die F87V-Mutante der P450 BM-3 wurde der C12-Körper 66 eingesetzt und

es wurde eine Aktivität von 0.1160 U/mg bezogen auf diese Referenzsubstanz bestimmt. Die relative

Aktivität der Monooxygenase auf das Substrat n-Oktan (64) lag mit 22% bei einem Wert von

0.0251 U/mg. Hier zeigte sich, dass das Referenzsubstrat Dodekansäure (66) deutlich besser

umgesetzt wurde, als der lineare C8-Körper 64 (Tabelle 4).

Tabelle 4: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3



2 n-Oktan 0.0251 22 asiehe AAV 6,

bbezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

Bei Einsatz der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 war eine deutlich abnehmende

Aktivität mit abnehmender Kettenlänge zu beobachten, so dass diese Mutante weniger geeignet für

die Biotransformation des Wunschsubstrates n-Butan (65) erschien.

3.4.2.2.2 Stabilitäten der 19A12- und F87V-Mutante der Cytochrom P450-

Monooxygenase aus Bacillus megaterium

Im Hinblick auf die Hydroxylierung des Wunschsubstrats n-Butan (65), dessen Siedepunkt bei -0.5°C

liegt und das somit bei Raumtemperatur gasförmig ist [76], wurden die Stabilitäten der 19A12-

Mutante und der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium bei 8°C

untersucht. Bei dieser Temperatur liegt noch ein geringer Teil des n-Butans (65) als Flüssigkeit vor.

Die Bestimmung der Stabilitäten erfolgte mit Hilfe der UV/Vis-Spektroskopie. Dazu wurden

Enzymlösungen über 24 Stunden in einem geschlossenen Kolben gerührt und die Temperatur für die

Monooxygenasen entweder über 24 Stunden bei Raumtemperatur oder 8 Stunden bei 8°C mit einer

anschließenden Erwärmung in den verbleibenden 16 Stunden auf Raumtemperatur gehalten. Die

Ergebnisse mit der niedrigeren Temperatur wurden anschließend mit denen bei Raumtemperatur

verglichen. Bei der 19A12-Mutante wurde als Referenzsubstanz n-Heptan (67) verwendet und bei der

F87V-Mutante wurde Dodekansäure (66) eingesetzt (Abbildung 45).


40

Abbildung 45: Reaktionsgleichungen der Photometertests mit einer P450-Monooxygenase BM-3

Stabilität der 19A12-Mutante der P450 BM-3 bei Raumtemperatur

Bei Raumtemperatur lag die Aktivität der 19A12-Mutante der P450 BM-3 nach einer Zeit von

8 Stunden nur noch bei 50%. Nach der angestrebten Reaktionszeit von 24 Stunden war keine

messbare Aktivität mehr vorhanden (Abbildung 46).

Abbildung 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur

Stabilität der 19A12-Mutante der P450 BM-3 bei niedrigerer Temperatur

Es verhielt es sich etwas anders, wenn die Lösung der 19A12-Mutante eine konstante Temperatur

von 8°C für 8 Stunden mit einer anschließenden Erwärmung in den verbleibenden 16 Stunden auf

Raumtemperatur aufwies. Die Restaktivität der gekühlten 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase

BM-3 liegt nach 24 Stunden noch bei 73%. Die Ergebnisse sind in Abbildung 47 dargestellt.


41

Abbildung 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden

und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur

Stabilität der F87V-Mutante der P450 BM-3 bei Raumtemperatur

Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur lag die Restaktivität der F87V-Mutante der P450 BM-3 nach

24 Stunden nur noch bei 27%, was einen deutlichen Verlust darstellt (Abbildung 48).

Abbildung 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur

Stabilität der F87V-Mutante der P450 BM-3 bei niedrigerer Temperatur

Auch hier verhielt es sich anders, wenn die Temperatur für 8 Stunden bei 8°C gehalten und in den

verbleibenden 16 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt wird. Die Restaktivität der gekühlten F87V-

Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 lag nach 24 Stunden noch bei guten 73% (Abbildung 49).


42

Abbildung 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden


Diese Ergebnisse waren der Anlass die Reaktionstemperatur während der Hydroxylierung für

8 Stunden bei 8°C zu halten und anschließend innerhalb der verbleibenden 16 Stunden auf

Raumtemperatur zu erwärmen.

3.4.2.3 Analytische Vorarbeiten

Vor der Durchführung einer Eintopf-Zweistufen-Synthese wurde zunächst eine valide Analytik

etabliert. Hierzu wurden eine Methoden der Aufarbeitung untersucht, wobei bei einer Methode der

Schütteltrichter und bei der anderen Methode 2 ml-Eppendorf-Gefäße verwendet wurden. Als

Referenzsubstanzen wurden die bei Einsatz des Edukts n-Oktan (64, Sdp. 126°C)[77] möglichen

Oxidationsprodukte 1-Oktanol (68, Sdp. 196°C)[78], 2-Oktanol (69, Sdp. 174-181°C)[79], 3-Oktanol (70,

Sdp. 174-176°C)[80] und 4-Oktanol (71, Sdp. 174-176°C)[81] und als externer Standard der

Heteroaromat Pyridin (72, Sdp. 115°C)[82] verwendet (Abbildung 50).

Abbildung 50: Strukturformeln der verschiedenen Oktanole und von Pyridin (72)


43

Der externe Standard Pyridin (72) wurde vor der Aufarbeitung zur Reaktionsmischung dazugegeben.

Anhand dieser Versuche kann ein Faktor berechnet werden, der sich aus folgendem Quotienten

ergibt und der Auskunft über die Verlässlichkeit der jeweils untersuchten Aufarbeitungsmethode gibt

(Abbildung 51).

Abbildung 51: Formel für die Berechnung des Faktors

3.4.2.3.1 Aufarbeitung mit Hilfe eines Schütteltrichters

Die erste Aufarbeitungsmethode beinhaltet nach Zusatz von Pyridin (72) die Nutzung des

Schütteltrichters zur Extraktion der wässrigen Phase mit Dichlormethan und das anschließende

Trocknen über Magnesiumsulfat. Am Ende wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei

900 mbar entfernt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.


Schütteltrichters

Eintraga Alkohol Dauerb [h] Ausbeute des Pyridins [%]

Ausbeute des Alkohols [%]

Faktor

1 1-Oktanol 24 97 82 1.18

2 1-Oktanol 0 86 74 1.16

3 2-Oktanol 24 92 82 1.12

4 2-Oktanol 0 94 85 1.11

5 3-Oktanol 24 85 76 1.12

6 3-Oktanol 0 96 95 1.01

7 4-Oktanol 24 95 75 1.27

8 4-Oktanol 0 90 79 1.14 asiehe AAV 8,

bReaktionszeit

Die Werte für den Faktor schwankten bei 24 Stunden bis zu 0.15 und bei 0 Stunden ebenfalls bis zu

0.15. Das sind zu hohe Schwankungen für eine präzise Auswertung. Die Ausbeute des eingesetzten

Pyridins (72) betrug bei 0 Stunden durchschnittlich 92% und bei 24 Stunden durchschnittlich

ebenfalls 92%. Die Werte der zurückerhaltenen Alkohole 68-71 lag bei 24 Stunden zwischen 74% und


44

82% und bei 0 Stunden wurde nur bei 3-Oktanol (70) mit 95% ein Wert über 90% erhalten. Die

Ausbeute der anderen Alkohole 68, 69, 71 schwankte bei 0 Stunden zwischen 79% und 85%. Diese

Methode der Aufarbeitung war aufgrund der relativ geringen Wiederfindungsrate insbesondere bei

den Alkoholen 68-71 für präparative Zwecke nicht geeignet, weshalb eine neue Methode der

Aufarbeitung untersucht wurde.

3.4.2.3.2 Aufarbeitung mit Hilfe von Eppendorf-Gefäßen

Bei der zweiten Methode wurden als Extraktionsgefäße nach Zusatz von Pyridin (72) 2 ml-Eppendorf-

Gefäße genutzt. Nach dreimaliger Extraktion der wässrigen Phase mit Dichlormethan und mit Hilfe

eines Thermomixers und Trennung der beiden Phasen durch eine Zentrifuge, wurde das

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6

zusammengefasst.


Gefäßen

Eintraga Alkohol Dauerb [h] Ausbeute des Pyridins [%]


Faktor

1 1-Oktanol 24 97 82 1.18

2 1-Oktanol 0 97 94 1.03

3 2-Oktanol 24 91 81 1.12

4 2-Oktanol 0 94 91 1.03

5 3-Oktanol 24 97 85 1.14

6 3-Oktanol 0 96 93 1.03

7 4-Oktanol 24 91 81 1.12

8 4-Oktanol 0 94 83 1.13 asiehe AAV 8,

bReaktionszeit

Die Werte für den Faktor schwankten bei 24 Stunden bis zu 0.06 und bei 0 Stunden sind bis auf

Eintrag 8, bei dem der Faktor um 0.08 abwich, drei Faktoren mit 1.03 gleich. Der Heteroaromat 72

wurde bei 0 Stunden zu durchschnittlich 95% zurück erhalten und bei 24 Stunden zu durchschnittlich

94%. Bei 0 Stunden wurde nur 4-Oktanol (71) mit 83% nicht zu über 90% wieder erhalten. Die Werte

der anderen zurückerhaltenen Alkohole 68-70 lagen bei 0 Stunden zwischen 91% und 94%. Der

Ausbeute der Alkohole 68-71 schwankte bei 24 Stunden zwischen 81% und 85%. Diese Methode der


45

Aufarbeitung ist für präparative Zwecke gut geeignet, da der Faktor relativ konstant blieb und die

Alkohole mit sehr guten Werten zurückerhalten wurden. Diese Methode der Aufarbeitung fand

dementsprechend für präparative Ansätze Anwendung. Der durchschnittliche Erhalt der Alkohole

68-71 lag nach 0 Stunden bei 91% und nach 24 Stunden bei 82%.Der durchschnittliche Faktor war

nach 0 Stunden bei 1.05 und nach 24 Stunden bei 1.14.

3.4.2.4 Hydroxylierung von n-Oktan

Die katalytische Aktivität der P450-Monooxygenase BM-3 kann durch den präparativen Ansatz des

ersten Reaktionsschrittes, also der Oxidation von n-Oktan (64) zu den Oktanolen, nachgewiesen

werden (Abbildung 52).

Abbildung 52: Hydroxylierung von n-Oktan (64)

Die Verbindung n-Oktan (64) wurde als Modellsubstrat ausgewählt, da der Siedepunkt nicht zu

niedrig ist und deshalb nicht so viel verdampfen kann, wie bei niedrigen Homologen, die Toxizität

geringer ist, als beispielsweise bei n-Hexan[83] und die Menge an Isomeren analytisch noch gut

handhabbar ist. Die biokatalytische Hydroxylierung des n-Alkans 64 wurde anhand verschiedener

Gesichtspunkte untersucht. Es wurde die Abhängigkeit der Reaktion von der Substratkonzentration,

vom eingesetzten Cofaktor und der daraus resultierenden Cofaktorregenerierung, von der

Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors und von der Reaktionstemperatur analysiert. Die Ergebnisse

sind in den nachfolgenden Kapiteln dargestellt.

3.4.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration

In diesem Abschnitt wurden zwei verschiedene Substratkonzentrationen von n-Oktan (64)

untersucht. Bei einer Substratkonzentration von 100 mM, die durch eine Verringerung des

Reaktionsmediums gewährleistet wurde, erfolgte die Reaktion in einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß und

bei einer Konzentration von 20 mM erfolgte die Reaktion in einem 10 ml-Rundkolben. Das

Eppendorf-Gefäß wurde für 24 Stunden mit einem Thermomixer bei 25°C geschüttelt, der


46

Rundkolben wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7

zusammengefasst.

Tabelle 7: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)

Eintraga c (64) Umsatzb Produktbildungb

[mM] [%] [mol/l] [g/l]

1a 20 11 0.0029 0.38

1bc 20 14 0.0033 0.42

2 100 n.d. n.d. n.d. asiehe AAV 9,

bnach

1H-NMR und Auswaage bestimmt,

cWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung

Bei einer Substratkonzentration von 100 mM n-Oktan (64) wurde kein Umsatz beobachtet, während

bei einer Substratkonzentration von 20 mM Umsätze von 11% bis 14% und eine Produktbildung von

0.38 g/l bis 0.42 g/l erzielt wurden. Die weiteren Reaktionen wurden dementsprechend mit einer

Substratkonzentration von 20 mM n-Oktan (64) durchgeführt. Eine eventuelle Erklärung dafür, dass

bei einer Substratkonzentration von 100 mM, die sich aus der Verringerung des Reaktionsvolumens

ergab, kein Umsatz stattfand, könnte in der zu hohen Enzymkonzentration und der daraus

resultierenden Dickflüssigkeit der Reaktionslösung liegen.

3.4.2.4.2 Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung

In diesem Abschnitt werden zwei verschiedene Systeme untersucht. Bei der Oxidation des n-Oktans

(64) wurde die NADPH-abhängige F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium

(P450 BM-3) verwendet. Bei Einsatz des im Vergleich zu NADPH kostengünstigeren Cofaktors NADP+

am Anfang der Reaktion wurde zur Cofaktorregenerierung D-Glucose und das Enzym

Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus sp. eingesetzt. Durch diese in situ-Cofaktorregenerierung


47

konnte die Menge des Cofaktors NADPH gering gehalten werden, da die Glucosedehydrogenase das

durch die Oxidation entstehende NADP+ wieder zum NADPH umwandelte, das von der P450-

Monooxygenase für die Reaktion benötigt wurde (Abbildung 53).


situ-Cofaktorregenerierung

Bei Einsatz des teureren NADPH am Anfang der Reaktion lag keine Cofaktorregenerierung vor. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die biokatalytische

Hydroxylierung von n-Oktan (64)

Eintraga GDH Cofaktor Umsatzb Produktbildungb

[U/mmol] [mmol] [%] [mol/l] [g/l]

1a 36 0.010

NADP+ 11 0.0029 0.38

1bc 36 0.010

NADP+ 14 0.0033 0.42

2 0 0.010

NADPH n.d. n.d. n.d.

asiehe AAV 9,

bnach



Die Hydroxylierung von n-Oktan (64) wurde in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) bei Raumtemperatur

über 24 Stunden durchgeführt. Beim System mit NADP+ und GDH als zusätzlichem Enzym lief die


48

Hydroxylierungsreaktion mit Umsätzen von 11% bis 14% und Produktbildungen von 0.38 g/l bis

0.42 g/l ab. Bei dem System ohne Cofaktorregenerierung war kein Umsatz zu erkennen, weshalb die

Reaktion die in situ-Cofaktorregenerierung benötigte. Es könnte ein Grund hierfür sein, dass durch

die Cofaktorregenerierung die Verluste des Cofaktors für die Nebenreaktionen der P450-

Monooxygenase („Shuntways“ siehe Kapitel 3.2.2, Abbildung 10) minimiert wurden, da NADPH

wieder durch die Reaktion der D-Glucose zu D-Gluconolacton mit Hilfe der GDH gebildet wurde und

für einen weiteren Zyklus zur Verfügung stand. Die weiteren Reaktionen wurden dementsprechend

mit einer Cofaktorregenerierung durchgeführt.

3.4.2.4.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+

Cofaktoren sind sehr teuer und sollten daher sparsam für die Reaktionen verwendet werden. Die

Stoffmenge des im vorher beschriebenen in situ-Cofaktorregenerierungssystem mit einer GDH und

D-Glucose verwendeten Cofaktors NADP+ wurde im Folgenden von 0.010 mmol auf 0.002 mmol

herabgesetzt. Die Hydroxylierung des n-Alkans 64 wurde in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 mM

Substratkonzentration und Raumtemperatur über 24 Stunden durchgeführt (Tabelle 9).



Eintraga NADP+ Umsatzb Produktbildungb

[mmol] [%] [mol/l] [g/l]

1a 0.010 11 0.0029 0.38

1bc 0.010 14 0.0033 0.42

2a 0.002 14 0.0031 0.41

2bd 0.002 13 0.0030 0.39 asiehe AAV 9,

bnach


cWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,

dWiederholungs-

versuch zu 2a zur Validierung


49

Die Reaktion zeigte durch die Zugabe von 0.002 mmol NADP+ ähnliche Ergebnisse, was aufgrund der

gut funktionierenden Cofaktorregenerierung zu erwarten war. Es wurden 13% bis 14% Umsatz und

eine Produktbildung von 0.39 g/l bis 0.41 g/l mit der niedrigeren Cofaktor-Stoffmenge erzielt,

während bei Zugabe von 0.010 mmol NADP+ Umsätze von 11% bis 14% und eine Produktbildung von

0.38 g/l bis 0.42 g/l erreicht wurden. Die weiteren Reaktionen wurden aufgrund dieser Ergebnisse

mit nur 0.002 mmol NADP+ als Cofaktor durchgeführt.

3.4.3.4.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3

In diesem wurden Abschnitt die verfügbaren P450-Monooxygenase BM-3 miteinander verglichen,

d.h. die F87V-Mutante, die 19A12-Mutante und der Wildtyp wurden auf ihre Fähigkeit zur

Produktbildung hinsichtlich der Hydroxylierung von n-Alkans 64 geprüft. Die Ergebnisse sind in

Tabelle 10 dargestellt.


n-Oktan (64)

Eintraga P450 BM-3 Umsatzb Produktbildungb

[%] [mol/l] [g/l]

1 F87V 11 0.0029 0.38

2 19A12 5 0.0009 0.11

3 Wildtyp 16 0.0031 0.40 asiehe AAV 9,

bnach

1H-NMR und Auswaage bestimmt

Man konnte erkennen, dass die Produktbildung bei der F87V-Mutante und dem Wildtyp in einem

ähnlichen Bereich lagen, die Produktbildung mit der 19A12-Mutante allerdings deutlich niedriger

war.


50

3.4.2.4.5 Einfluss der Reaktionstemperatur

Die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ist, wie in Abschnitt 3.4.2.2.2 gezeigt wurde, bei

niedrigeren Reaktionstemperaturen stabiler als bei Raumtemperatur. Die katalytische Aktivität der

Monooxygenase konnte nun durch eine Reaktion bei 8°C über 8 Stunden und der anschließenden

Erwärmung über 16 Stunden auf Raumtemperatur bzw. 24 Stunden bei Raumtemperatur überprüft

werden. Die Hydroxylierung von n-Oktan (64) wurde mit einer Substratkonzentration von 20 mM und

Raumtemperatur über 24 Stunden durchgeführt. Für die in situ-Cofaktorregenerierung wurden

0.002 mmol NADP+, D-Glucose und das Enzym Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. eingesetzt. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst.


Eintraga Temperatur Umsatzb Produktbildungb

[%] [mol/l] [g/l]

1a RT 14 0.0031 0.41

1bc RT 13 0.0030 0.39

2 8°C-RT 16 0.0036 0.47 asiehe AAV 9,

bnach



Die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 war in der Reaktion bei 8°C über 8 Stunden und

der anschließenden Erwärmung über 16 Stunden auf Raumtemperatur geringfügig aktiver als bei der

Reaktion über 24 Stunden bei Raumtemperatur. Es wurde ein Umsatz von 16% bei der niedrigeren

Temperatur erzielt, während die Reaktionen bei Raumtemperatur 13% bis 14% Umsatz zeigten.

Dieses Ergebnis ist insofern von Bedeutung, da er Siedepunkt des späteren Zielsubstrats n-Butan (65)

bei -0.5°C [76] ist und daher die Verdampfung bei 8°C geringer ist als bei Raumtemperatur.


51

3.4.2.5 Hydroxylierungsreaktion von n-Butan

Die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) zu 2-Butanol (35) wurde zuerst mit Hilfe der für

kurzkettige n-Alkane geeigneten 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium

(P450 BM-3) durchgeführt.[75] Die P450 BM-3 ist NADPH-abhängig. Durch eine in situ-Cofaktor-

regenerierung mit Einsatz einer NADP+-abhängigen Glucosedehydrogenase (GDH) wurde die Menge

des kostenintensiven Cofaktors gering gehalten, da die Glucosedehydrogenase das durch die

Oxidation entstehende NADP+ in situ wieder zum NADPH umwandelt (Abbildung 54).

Abbildung 54: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65) unter in situ-Cofaktorregenerierung

mit einer GDH


Zusätzlich zur 19A12-Mutante wurden auch der Wildtyp (WT) und die F87V-Mutante der P450-

Monooxygenase aus Bacillus megaterium (P450 BM-3) auf ihre Eignung als Katalysator hin

untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst.


von n-Butan (65)


52

Eintraga P450 BM-3 Produktbildungb

[mol/l] [g/l]

1 19A12 0.0013 0.10

2 F87V n.d. n.d.

3 Wildtyp n.d. n.d. asiehe AAV 10,

bProduktbildung nach


Als Produkt wurde beim Einsatz der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ausschließlich

2-Butanol (35) erhalten. Die 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 ist bekannt dafür, dass

sie auch kurzkettige n-Alkane, wie n-Propan, umsetzt.[75] Bei Verwendung der F87V-Mutante und des

Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 wurde kein Umsatz zum Alkohol 35 beobachtet. Bei der

biokatalytischen Hydroxylierung des n-Alkans 65 mit in situ-Cofaktorregenerierung durch Einsatz

einer Glucosedehydrogenase mit Hilfe der für kurzkettigere n-Alkane selektiven Mutante 19A12 der

P450-Monooxygenase BM-3 wurde selektiv 2-Butanol mit bis zu 0.10 g/l und 0.0013 mol/l gebildet.

In der Literatur [27,44] wurden der Wildtyp und die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 für

die Hydroxylierung von etwas längerkettigeren n-Alkanen verwendet und reagierten entsprechend

nicht mit n-Butan (65).


Im vorangegangenen Abschnitt konnte gezeigt werden, dass die NADPH-abhängige 19A12-Mutante

der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium (P450 BM-3) für die biokatalytische

Hydroxylierung von n-Butan (65) geeignet ist. Es wurde das System einer in situ-Cofaktor-

regenerierung mit Einsatz einer Glucosedehydrogenase (GDH) gewählt, um die die Menge des

kostenintensiven Cofaktors NADPH gering zu halten. In diesem Abschnitt wurde die Abhängigkeit der

Reaktion von der Reaktionstemperatur untersucht. Dabei wurde die Temperatur in einem Bereich

von -5°C bis Raumtemperatur für 8 Stunden konstant gehalten und anschließend erfolgte in den

verbleibenden 16 Stunden die langsame Erwärmung auf Raumtemperatur. Die Ergebnisse sind in



53


Eintraga Temperatur Produktbildungb

[mol/l] [g/l]

1 RT 0.0008 0.06

2 8°C-RT 0.0013 0.10

3 0°C-RT 0.0021 0.16

4 -1/-2°C-RT 0.0017 0.13

5 -5°C-RT 0.0006 0.04 asiehe AAV 10,



Die Ergebnisse in Tabelle 13 zeigen, dass das Maximum der Produktbildung der 19A12-Mutante bei

0°C lag. Hier wurde eine Produktbildung von 0.16 g/l erreicht. Die Aktivität des Enzyms war bei dieser

Temperatur gut, die Reaktionsmischung war nicht gefroren wie bei -5°C oder sehr viskos wie bei

-1/-2°C. Die Temperatur von 0°C lag sehr nahe am Siedepunkt des Flüssiggases n-Butan (65). Dieser

liegt bei -0.5°C [76] und deshalb verdampft das n-Alkan 65 nicht so viel wie es bei Raumtemperatur

verdampft, so dass genug Substrat für die Biotransformation zur Verfügung steht. Sogar bei einer

Reaktionstemperatur von -5°C konnte 2-Butanol (35) mit einer Produktbildung von 0.04 g/l

synthetisiert werden, obwohl hier die Reaktionsmischung gefroren war. Gute Werte für die

Produktbildung wurden auch bei einer Temperatur von -1/-2°C und 8°C erhalten. Hier wurde der

Alkohol 35 mit 0.13 g/l für -1/-2°C und mit 0.10 g/l für 8°C gebildet. Die Produktbildung bei Raum-

temperatur lag bei 0.06 g/l im Bereich der Temperatur von -5°C.

3.4.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit

Zur Klärung, ob die Hydroxylierungsreaktion zu 2-Butanol (35) nur während der Aufwärmphase oder

tatsächlich bei 0°C stattfand, wurde der Aspekt der Reaktionszeit untersucht. Es wurde einmal sofort


54

nach den 8 Stunden bei 0°C aufgearbeitet und einmal nach 8 Stunden bei 0°C mit anschließenden

16 Stunden Erwärmung auf Raumtemperatur. Erfreulicherweise konnte bei einer Reaktionszeit von

8 Stunden und einer Reaktionstemperatur von 0°C ohne anschließendes Aufwärmen auf

Raumtemperatur eine Produktbildung von 0.14 g/l bzw. 0.0019 mol/l erzielt werden. Das belegt, dass

die 19A12-Mutante bei dieser Temperatur aktiv war und die Reaktion nicht nur während des

Aufwärmprozesses stattfand. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 zusammengefasst.

Tabelle 14: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)

Eintraga Temperatur Dauerb Produktbildungc

[h] [mol/l] [g/l]

1 0°C-RT 24 0.0021 0.16

2 0°C 8 0.0019 0.14 asiehe AAV 10,

bReaktionszeit,

cProduktbildung nach


3.4.3 Zusammenfassung

Zuerst nach einem geeignetem Analytik-System geforscht. Als interner Standard wurde Pyridin (72)

ausgewählt, das vor der Aufarbeitung, aber nach der Reaktion hinzugegeben wurde. Hierbei erwies

sich die dreimalige Extraktion der wässrigen Phase mit Dichlormethan in 2 ml-Eppendorf-Gefäßen

mit Hilfe eines Thermomixers und anschließende Trennung der Phasen mit Hilfe einer Zentrifuge am

stabilsten. Anschließend erfolgte die Entfernung des Lösungsmittels an einem Rotationsverdampfer

bei definiertem Druck.

3.4.3.1 Hydroxylierung von n-Oktan

Die Hydroxylierung von n-Oktan (64) wurde unter verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Die

Startbedingungen waren der Einsatz der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus


55

megaterium (P450 BM-3), die sich in vorbereitenden spektrophotometrischen Tests als geeignet für

die Biotransformation herausgestellt hat. Desweiteren wurde die Reaktion bei Raumtemperatur über

einen Zeitraum von 24 Stunden in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und mit 38.2 U/mmol

(Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure) P450-Monooxygenase BM-3 durchgeführt. Zuerst wurde

ein geeignetes Reaktionsvolumen und daraus resultierend ein geeignetes Reaktionsgefäß untersucht.

Es stellte sich heraus, dass eine Konzentration von 20 mM n-Oktan (64) und ein 10 ml-Rundkolben

mit Umsätzen von 11% bis 14% und Produktbildung von 0.38 g/l bis 0.42 g/l sehr gut geeignet waren.

Anschließend wurde die Abhängigkeit vom Cofaktor untersucht. Theoretisch denkbare Cofaktoren

wären NADPH und NADP+. Bei Einsatz des reduzierten Cofaktors wurde die Reaktion ohne in situ-

Cofaktorregenerierung durchgeführt und lieferte keinen Umsatz. Diese wurde erst bei Einsatz des

oxidierten Cofaktors NADP+ sowie unter in situ-Cofaktorregenerierung erzielt. Der eingesetzte

Cofaktor NADP+ wurde von einer Glucosedehydrogenase, die D-Glucose in D-Gluconolacton

überführt, zu dem für die Hydroxylierungsreaktion benötigten Cofaktor NADPH reduziert. Dabei

wurden Umsätze von 11% bis 14% und Produktbildung von 0.38 g/l bis 0.42 g/l erreicht. Dies

bestätigte die Wahl des Cofaktors NADP+ mit einer in situ-Cofaktorregenerierung für die

darauffolgenden Versuche. Cofaktoren sind kostenintensiv, weshalb diese in katalytischen Mengen

eingesetzt werden sollten. Zu diesem Zweck wurde die eingesetzte Stoffmenge von NADP+

untersucht. Es stellte sich heraus, dass bei Einsatz von 0.010 mmol NADP+ Umsätze von 11% bis 14%

mit einer Produktbildung von 0.38 g/l bis 0.42 g/l erreicht wurden und bei Einsatz von 0.002 mmol

NADP+ 13% bis 14% Umsatz und 0.39 g/l bis 0.41 g/l Produktbildung. Demzufolge waren 0.002 mmol

des oxidierten Cofaktors für die Reaktion ausreichend. Als nächstes wurde der Einsatz des Wildtyps

und verschiedener Mutanten (F87V, 19A12) der P450-Monooxygenase BM-3 untersucht. Es stellte

sich heraus, dass die Produktbildungen, die mit der F87V-Mutante und dem Wildtyp erreicht wurden,

in einem vergleichbaren Bereich lagen und dass die 19A12-Mutante deutlich schlechter abschnitt.

Die F87V-Mutante, mit der die vorherigen Versuche bereits durchgeführt wurden, wurde eingesetzt.

Abschließend wurde die Abhängigkeit der Biotransformation von der Reaktionstemperatur

untersucht. In spektrophotometrischen Vorarbeiten zeigte sich, dass die F87V-Mutante eine höhere

Aktivität nach 24 Stunden beibehalten hatte, wenn die Reaktion nicht für 24 Stunden bei

Raumtemperatur, sondern für 8 Stunden bei 8°C und einer anschließenden Erwärmung während der

verbleibenden Stunden auf Raumtemperatur, durchgeführt wurde. Demzufolge wurde die

Reaktionstemperatur für 8 Stunden bei 8°C gehalten und in den anschließenden 16 Stunden erfolgte

die langsame Erwärmung auf Raumtemperatur. Mit der niedrigeren Reaktionstemperatur wurde das

bislang beste Ergebnis mit einem Umsatz von 16% und einer Produktbildung von 0.47 g/l erzielt

(Abbildung 55).


56

Abbildung 55: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)

3.4.3.2 Hydroxylierung von n-Butan

Aufgrund der erfreulichen Ergebnisse bei niedrigerer Temperatur konnte nun die Biotransformation

von n-Butan (65), das seinen Siedepunkt bei -0.5°C hat, [76] zu 2-Butanol (35) auf verschiedene

Einflüsse untersucht werden. In vorbereitenden spektrophotometrischen Untersuchungen hat sich

die 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium als am besten geeignet

herausgestellt. Desweiteren konnte durch die einleitenden spektrophotometrischen Messungen

gezeigt werden, dass sowohl die 19A12-Mutante als auch die Glucosedehydrogenase bei niedrigeren

Temperaturen nach 24 Stunden aktiver waren, als nach 24 Stunden bei Raumtemperatur. Dabei

wurden die Aktivität der Monooxygenase bei 8°C für 8 Stunden und anschließender Erwärmung

innerhalb der verbleibenden 16 Stunden und die Aktivität der Glucosedehydrogenase bei -10°C bzw. -

5°C über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die Startbedingungen waren eine Reaktionszeit

von 24 Stunden und die Verwendung eines 100 ml-Rundkolbens mit 10 ml Phosphatpuffer

(pH 7.0, 50 mM) als Reaktionsvolumen. Aufgrund der Vorergebnisse mit n-Oktan (64) als Substrat

wurde auch hier eine in situ-Cofaktorregenerierung durch Einsatz einer Glucosedehydrogenase, von

D-Glucose und durch Einsatz des oxidierten Cofaktors NADP+ eingeführt. Anschließend wurde nach

einer geeigneten Mutante für die Hydroxylierung von n-Alkans 65 geforscht. Dabei wurden der

Wildtyp, die 19A12- und die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 untersucht. Bei Einsatz

der 19A12-Mutante wurde selektiv der Alkohol 35 mit einer Produktbildung bis zu 0.10 g/l und

0.0013 mol/l erhalten. Der Wildtyp und die F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 wurden

bei Hydroxylierung von längerkettigen n-Alkanen eingesetzt und reagierten nicht mit dem n-Alkan

65.[27,44] Der nächste Schritt stellte die Suche nach der geeigneten Reaktionstemperatur dar. Dafür

wurde die Temperatur über 8 Stunden bei -5°C, -1/-2°C, 0°C oder 8°C mit anschließender Erwärmung

auf Raumtemperatur in den verbleibenden 16 Stunden bzw. über 24 Stunden bei Raumtemperatur

eingestellt. Das beste Ergebnis wurde mit einer 19A12-Mutante, 0.002 mmol NADP+, 24 Stunden


57

Reaktionszeit, wobei die Temperatur für 8 Stunden bei 0°C gehalten wurde und sich in den

verbleibenden 16 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt hat, erzielt. Hierbei wurde das Produkt 2-

Butanol (35) mit 0.16 g/l gebildet (Abbildung 56).

Abbildung 56: Biokatalytische Hydroxylierung von gasförmigen n-Butan (65)

3.5 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Synthese von Cycloalkanonen

3.5.1 Ziel der Arbeit

Das Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation [13] zur Herstellung von Cycloalkanen zu

Cycloalkanonen beruht auf dem Zusammenspiel zweier Biokatalysatoren, einer P450-

Monooxygenase und einer Alkoholdehydrogenase. Die NADPH-abhängige P450-Monooxygenase aus

Bacillus megaterium (P450 BM-3) ist für die Oxidation der Cycloalkane zu reaktiveren Alkoholen

verantwortlich, während die Aufgabe der Alkoholdehydrogenase in der Oxidation der gebildeten

Alkohole zu den gewünschten Ketonen besteht. Diese Anordnung gewährleistet eine vorteilhafte

Cosubstrat-freie Cofaktorregenerierung, da das eingesetzte NADPH von der P450-Monooxygenase zu

NADP+ oxidiert wird, das von der Alkoholdehydrogenase wieder zu NADPH reduziert wird

(Abbildung 57). Der Katalysezyklus kann nun wieder von vorne starten. Der Cofaktor kann deshalb in

katalytischen Mengen zugegeben werden und wird nicht in stöchiometrischen Mengen benötigt.

Dies soll in einer Eintopf-Zweistufen-Synthese im Reaktionsmedium Wasser erfolgen. Das Konzept

erfüllt einige Voraussetzungen einer „Dream Reaction“.[1] Das Reaktionsmedium Wasser ist

kostengünstig und ökologisch unbedenklich. Die eingesetzten Enzyme sind biologischer Natur und

zumeist unbedenklich für den Menschen. Der für die Reaktion benötigte Sauerstoff kann durch

Luftsauerstoff zugeführt werden.


58

Abbildung 57: Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation von Cycloalkanen

Als Edukt wurde in dieser Arbeit Cyclooktan (73) als Modellverbindung eingesetzt. Es besitzt einen

Siedepunkt von 150-152°C und ist schlecht wasserlöslich (7.9 mg/l).[84] Der cyclische C8-Körper 73

liegt bei Raumtemperatur als Flüssigkeit vor und wurde als Modellsubstrat ausgewählt, da er einen

höheren Siedepunkt als das mit 55.0 mg/ml besser wasserlösliche Cyclohexan (81°C) [85] besitzt.

3.5.2 Ergebnisse und Diskussion

3.5.2.1 Spektrophotometrische Vorarbeiten

3.5.2.1.1 Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen aus Bacillus

megaterium

Zunächst wurden die Aktivitäten der einzelnen Cytochrom P450-Monooxygenasen bezüglich

Cyclooktan (73) mit Hilfe eines UV/Vis-Spektrometers untersucht, um herauszufinden, welche

Monooxygenase für die Biotransformation zum Cyclooktanol (74) am besten geeignet ist. Hierzu

wurden die 19A12-Mutante und die F87V-Mutante der Cytochrom P450-Monooxygenase getestet

(Abbildung 58).

Abbildung 58: Biokatalytische Reaktion, die mit Hilfe des UV/Vis-Spektrometers beobachtet wird


59

19A12-Mutante der P450 BM-3

Die spektrophotometrisch bestimmte Aktivität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase aus

Bacillus megaterium bezogen auf das Cycloalkan 73 lag bei einem Wert von 0.1749 U/mg, was einer

sehr guten Aktivität entspricht. Diese Mutante ist geeignet, die Biotransformation mit dem cyclischen

C8-Körper durchzuführen.

F87V-Mutante der P450 BM-3

Die spektrophotometrisch bestimmte Aktivität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3

bezogen auf Cyclooktan (73) lag bei nur 0.0074 U/mg und somit deutlich niedriger als die Aktivität

der 19A12-Mutante.

3.5.2.2 Analytische Vorarbeiten

Es wurde die Analytik mit Hilfe eines Standards für die Reaktionsvolumina von 1 ml, 4 ml und 5 ml

gemäß der AAV 11 untersucht. Als Standard wurde Pyridin (72) gewählt, das nach der Reaktionszeit

und vor der Aufarbeitung zugegeben wurde. Dabei wurden mit Hilfe von der 1H-NMR-Spektroskopie

und der Auswaage 95% bis 98% an Cyclooktanon (75) und 90% bis 97% des Heteroaromaten 72 als

Standard wiedergefunden.

Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 1 ml

Zur Etablierung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 1 ml wurde

1 ml Phosphatpuffer und das Cycloalkanon 75 in einer Konzentration von 100 mM in ein 2 ml-Eppen-

dorf-Gefäß gegeben. Nach Zugabe des Standards Pyridin (72) wurde aufgearbeitet und

durchschnittlich 95% Cyclooktanon (75) und durchschnittlich 94% des Heteroaromaten 72 erhalten.


Zur Etablierung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 4 ml wurden

4 ml Phosphatpuffer und 25 mM des Cycloalkanons 75 in einen 25 ml-Rundkolben gegeben. Die

Aufarbeitung erfolgte nach der Zugabe von Pyridin (72). Cyclooktanon (75) wurde mit 98%

zurückgewonnen und der Heteroaromat 72 mit 90%.


Zur Etablierung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem Reaktionsvolumen von 5 ml wurden

5 ml Phosphatpuffer und 20 mM des Cycloalkanons 75 in einen 10 ml-Rundkolben gegeben. Nach


60

Zugabe des Standards Pyridin (72) wurde aufgearbeitet und durchschnittlich 95% Cyclooktanon (75)

und durchschnittlich 97% des Heteroaromaten 72 wiedergefunden.

3.5.2.3 Hydroxylierung von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanol

Abbildung 59: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74)

Die katalytische Aktivität der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium konnte durch den

präparativen Ansatz des ersten Reaktionsschrittes, also der Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu

Cyclooktanol (74) in wässrigem Reaktionsmedium, nachgewiesen werden. Hierbei wurde das

Cycloalkan 73 von der P450-Monooxygenase BM-3 unter Verbrauch von NADPH zum Cycloalkanol 74

hydroxyliert (Abbildung 59).

In den folgenden Kapiteln wurden die Abhängigkeit vom eingesetzten Cofaktor, der

Cofaktorregenerierung, von der eingesetzten Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten

P450-Monooxygense BM-3 untersucht.


Prinzipiell existieren zwei mögliche Systeme: das System ohne Cofaktorregenerierung oder das

System mit in situ-Cofaktorregenerierung durch Einsatz einer Glucosedehydrogenase und D-Glucose.

System ohne Cofaktorregenerierung

Der Einsatz des kostenintensiven Cofaktors NADPH war bei der Hydroxylierung ohne

Cofaktorregenerierung erforderlich. Hierbei wurde der reduzierte Cofaktor im Laufe der Reaktion zu

NADP+ oxidiert und stand dann nicht mehr für die Reaktion zur Verfügung (Abbildung 60). Hierbei

konnte weder bei einer Substratkonzentration von 20 mM noch von 100 mM ein Umsatz beobachtet

werden. Gründe hierfür könnten die geringe Aktivität der P450-Monooxygenase sein und der Verlust

des Cofaktors NADPH durch die Nebenreaktionen dieses Enzyms.


61

Abbildung 60: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) ohne Cofaktorregenerierung

System mit einer in situ-Cofaktorregenerierung

Die Hydroxylierung mit einer in situ-Cofaktorregenerierung erfolgte unter Einsatz des Cofaktors

NADP+, einer Glucosedehydrogenase (GDH) aus Bacillus sp. als zusätzlichem Enzym und D-Glucose als

Cosubstrat. Das anfänglich eingesetzte NADP+ wurde von der Glucosedehydrogenase zu dem für die

Hydroxylierung benötigten Cofaktor NADPH reduziert. Im Laufe der Hydroxylierung wurde NADPH

wieder zu NADP+ oxidiert, wodurch der Katalysezyklus geschlossen wurde (Abbildung 61).

Abbildung 61: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) mit in situ-Cofaktorregenerierung

durch Einsatz einer GDH und D-Glucose

Hier konnte bei einer Enzymmenge von 3.82 U (bezogen auf Dodekansäure (66) und einem

Reaktionsvolumen von 1 ml, was einer Enzymkonzentration von 33.0 g/l entspricht, kein Umsatz

beobachtet werden. Bei gleicher Enzymmenge mit einem Reaktionsvolumen von 5 ml, was einer

geringeren Enzymkonzentration von 6.6 g/l entspricht, konnte ein Umsatz von 6% bis 7% mit einer

Produktbildung von 0.138 g/l bis 0.172 g/l erzielt werden. Es lag hierbei vermutlich an der hohen

Konzentration des Enzyms mit 33.0 g/l in 1 ml Reaktionsvolumen und der daraus resultierenden


62

Dickflüssigkeit der Lösung. Bei einem Reaktionsvolumen von 5 ml war die Lösung weniger viskos und

das Protein konnte sich deshalb mehr bewegen.

3.5.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung in

Abhängigkeit vom Reaktionsvolumen und der Menge der P450-Monooxygenase

In diesem Abschnitt wurde die Hydroxylierung von Cyclooktan (73) mit einer in situ-Cofaktor-

regenerierung unter den Aspekten der Konzentration an eingesetztem Cycloalkan 73 und der

eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase untersucht. Dazu wurden drei Modelle betrachtet.

Hydroxylierung von Cyclooktan mit in situ-Cofaktorregenerierung, 20 mM Substratkonzentration und

38.2 U/mmol P450-Monooxygenase

Die Hydroxylierung des Cycloalkans 73 mit einer Enzymmenge von 38.2 U/mmol (Enzymaktivität

bezogen auf Dodekansäure (66)) und einer Substratkonzentration von 20 mM wurde zuerst

betrachtet. Hierbei wurden bei einer Enzymkonzentration von 6.6 g/l ein Umsatz von durch-

schnittlichen 7% und eine Produktbildung von durchschnittlich 0.155 g/l erzielt (Tabelle 15).



Die Konzentration von Cyclooktan (73) wurde auf 100 mM erhöht. Die Hydroxylierung wurde

desweiteren mit einer Enzymmenge von 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure

(66)) durchgeführt, um einen direkten Vergleich zu erhalten. Allerdings konnte kein Umsatz

beobachtet werden. Es lag hierbei vermutlich an der zu hohen Konzentration des Enzyms (33.0 g/l)

und der daraus resultierenden Dickflüssigkeit der Lösung (Tabelle 15).



Die beiden vorher betrachteten Reaktionsmodelle gründeten auf der P450-Monooxygenase-Menge,

deren Aktivität sich auf Dodekansäure (66) bezog. Bei dem Substrat, das hier untersucht werden

sollte, handelte es sich jedoch um Cyclooktan (73). Deshalb wurde im nächsten Schritt die Menge der

P450-Monooxygenase auf diesen cyclischen C8-Körper 73 bezogen und auf Grund der niedrigeren

Aktivität auf dieses Substrat die Unitmenge auf 0.764 U (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)

herabgesetzt, da sonst sehr große Mengen an Enzym erforderlich gewesen wären. Zur Steigerung der

Produktbildung wurde die Substratkonzentration auf 25 mM erhöht. Erfreulicherweise konnte hier


63

bei einer Enzymkonzentration von 10.8 g/l ein Umsatz von 10% mit einer Produktbildung von

0.328 g/l erzielt werden. Das Ergebnis war somit besser als bei Einsatz einer Enzymmenge von 3.82 U

(Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66) und einer Substratkonzentration von 25 mM, denn

das Produkt Cyclooktanol (74) wurde mit 0.138 g/l bis 0.172 g/l gebildet (Tabelle 15).

Tabelle 15: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der

Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase

asiehe AAV 12,

bnach

1H-NMR und Auswaage,

cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,

eWiederholungsversuch zu 1a zur

Validierung

3.5.2.4 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von

Cyclooktanon

Die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zur Synthese von Cyclooktanon (75) in

wässrigem Medium beruht auf dem Zusammenspiel einer P450-Monooxygenase und einer

Alkoholdehydrogenase (Abbildung 62).

Eintraga c (73) P450 BM-3 74b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb

[mM] [U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 20 38.20 6.6 0.86 7 7 27 0.0017 0.172

1be 20 38.20 6.6 0.69 6 6 10 0.0013 0.138

2 100 38.20 33.0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

3 25 7.64 10.8 1.31 10 10 27 0.0026 0.328


64

Abbildung 62: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) durch Kombination einer P450-

Monooxygenase aus Bacillus megaterium und einer ADH aus Lactobacillus kefir

Der erste Schritt ist die Hydroxylierung des unreaktiveren Cycloalkans 73 zu dem reaktiveren

Cyclooktanol (74) mit Hilfe der NADPH-abhängigen P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium

(BM-3). Im Laufe der Reaktion wird NADPH zu NADP+ oxidiert. Der oxidierte Cofaktor NADP+ steht

somit für die anschließende Oxidation des Alkohols 74 zum Keton 75 durch die

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir zur Verfügung und wird im Laufe der Reaktion wieder

zu NADPH reduziert. Diese Anordnung gewährleistet eine vorteilhafte Cosubstrat-freie

Cofaktorregenerierung, da das eingesetzte NADPH von der P450-Monooxygenase zu NADP+ oxidiert

wird, das wiederum von der Alkoholdehydrogenase nachfolgend zu NADPH reduziert wird. Somit

steht ausreichend reduzierter Cofaktor für einen weiteren Katalysezyklus zur Verfügung.

3.5.2.4.1 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation

In diesem Teilkapitel wurde der Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation

untersucht. Die Reaktion wurde mit einer Enzymmenge von 3.82 U/mmol (Enzymaktivität bezogen

auf Dodekansäure (66) und mit einer Substratkonzentration von 20 mM und 100 mM durchgeführt,

um einen direkten Vergleich zu bekommen. Hierbei zeigte sich, dass bei einer Substratkonzentration

von 20 mM mit einer Produktbildung von 0.026 g/l ein deutlich niedrigerer Wert erhalten wurde, als

bei einer Substratkonzentration von 100 mM, bei eine Produktbildung von 0.130 g/l erzielt wurde

(Tabelle 16).


65

Tabelle 16: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von

Cyclooktan (73)

asiehe AAV 13,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH

3.5.2.4.2 Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-

Monooxygenase auf die Doppeloxidation

Im Hinblick auf das durchaus positive Ergebnis der Produktbildung von 0.328 g/l (Tabelle 15, Eintrag

3), das bei der Hydroxylierung mit 7.64 U/mmol P450-Monooxygenase (Enzymaktivität bezogen auf

Cyclooktan (73)) und einer Substratkonzentration von 25 mM erzielt wurde, wurden diese

Reaktionsbedingungen auf die Doppeloxidation angewendet. Sie wurden mit dem Ergebnis, das bei

einer Substratkonzentration von 20 mM und Einsatz von 38.2 U/mmol P450-Monooxygenase

(Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)), erhalten wurde, verglichen. Das Produkt wurde mit

0.09 g/l bis 0.14 g/l für die Konzentration von 25 mM Cyclooktan 73 und einer Enzymkonzentration

von 10.8 g/l gebildet und erzielte damit eine geringfügig höhere Produktbildung als bei einer

Substratkonzentration von 20 mM und einer Enzymkonzentration von 6.6 g/l, bei der eine Produkt-

bildung von 0.094 g/l erreicht wurden (Tabelle 17).

Eintraga

c (73) 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb

[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1 20 0.13 1 1 2 0.0002 0.026

2 100 0.13 1 1 1 0.0010 0.130


66

Tabelle 17: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-

Monooxygenase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)

asiehe AAV 13,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,

eWiederholungsversuche zu 2a zur

Validierung

3.5.2.4.3 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase auf die

Doppeloxidation

Es stellte sich die Frage, ob durch die Erhöhung der Menge an eingesetzter P450-Monooxygenase

BM-3 eine höhere Produktbildung erzielt werden könnte. Deshalb wurde die Enzymmenge auf

15.28 U/mmol verdoppelt bzw. auf 22.92 U/mmol verdreifacht und mit der einfachen Enzymmenge

von 7.64 U/mmol verglichen. Die Aktivität des Enzyms war hier auf Cyclooktan (73) bezogen. Bei allen

Reaktionen, die mit einer Substratkonzentration von 25 mM und über 24 Stunden durchgeführt

wurden, wurde ein Umsatz von 3% erzielt. Mit zweifacher Enzymmenge (Enzymkonzentration von

21.5 g/l) wurde das Produkt Cyclooktanon (75) mit 0.103 g/l gebildet, die mit der Produktbildung von

0.090 g/l bis 0.140 g/l bei einfacher Enzymmenge (Enzymkonzentration von 10.8 g/l) vergleichbar ist.

Lediglich bei Verdreifachung der Enzymmenge (Enzymkonzentration von 32.3 g/l) wurde mit einer

Eintraga

c (73) P450 BM-3 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb


1 20 38.20 6.6 0.47 4 3 8 0.0007 0.094

2a 25 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140

2be 25 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090

2ce 25 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100


67

Produktbildung von 0.93 g/l ein etwas niedrigerer Wert erhalten (Tabelle 18). Das Problem lag auch

hier vermutlich an der hohen Enzymkonzentration und der daraus resultierenden Erhöhung der

Viskosität.


Doppeloxidation von Cyclooktan (73)

asiehe AAV 13,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,


Validierung

3.5.2.5 Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv

Die sehr geringen Umsätze und die geringen Produktbildungen bis maximal 0.140 g/l waren Anlass

dafür, dass über die Einführung eines Additivs nachgedacht wurde. Wie in Kapitel 3.2.2 in Abbildung

10 gezeigt, wird im ersten Schritt, die Hydroxylierung mit einer P450-Monooxygenase, ein Teil des

Cofaktors NADPH kontinuierlich für die „Shuntway“-Reaktionen verbraucht, bis der Zyklus aufgrund

der komplett verbrauchten Menge NADPH zum Erliegen kommt. Je mehr der Cofaktor NADPH für die

Eintraga

P450 BM-3 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb

[U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140

1be 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090

1ce 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100

2 15.28 21.5 0.41 3 3 13 0.0008 0.103

3 22.92 32.3 0.37 3 3 10 0.0007 0.093


68

Nebenreaktionen verbraucht wird, desto niedriger ist die coupling efficiency. Es konnte in anderen

Arbeiten gezeigt werden, dass die Einführung eines zusätzlichen Cofaktorregenerierungssystems die

coupling efficiency erhöhen und somit auch die Produktbildungsrate der Doppeloxidation erhöhen

konnte.[86] Unter Einsatz einer enzymgekoppelten in situ-Cofaktorregenerierung mit einer Glucose-

dehydrogenase und D-Glucose konnte das während der Nebenreaktionen entstehende NADP+ wieder

zum NADPH umgewandelt werden. NADPH konnte daraufhin dem Zyklus wieder zugeführt werden

und der Katalysezyklus startete von Neuem. Die Produktbildungsrate konnte dadurch bis zu der

dreifachen Menge gesteigert werden.[86] Anstatt einer enzymgekoppelten in situ-Cofaktor-

regenerierung wurde bei der Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) das Substrat

Isopropanol (30) als Additiv ausgewählt, das von der Alkoholdehydrogenase unter Reduktion von

NADP+ zu NADPH zu Aceton oxidiert werden konnte. Das durch diese substratgekoppelte in situ-

Cofaktorregenerierung entstehende NADPH stand dann wieder für den ersten Schritt der

Doppeloxidation, der Hydroxylierung des Cycloalkans 73 zu Cyclooktanol (74), zur Verfügung. Die

Verluste durch die Nebenreaktion der P450-Monooxygenase wurden dadurch minimiert.

Anschließend erfolgte die Oxidation des entstehenden Cycloalkanols 74 zum Cycloalkanon 75 unter

Bildung von NADPH und der Katalysezyklus konnte von Neuem beginnen (Abbildung 63).

Abbildung 63: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv

Durch den Einsatz des billigeren Cofaktors NADP+ konnten Kosten gespart werden und die Verluste

des Cofaktors durch Nebenreaktionen der P450-Monooxygenase BM-3 minimiert werden. Im

folgenden Abschnitt wurde das System mit Isopropanol 30 als Additiv mit der vorher diskutierten

Doppeloxidation ohne Additiv verglichen. Desweiteren wurde der Einfluss der Reaktionstemperatur,


69

der Reaktionszeit, der Substratkonzentration und der Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase

auf die Doppeloxidation mit Isopropanol 30 als Additiv untersucht.

3.5.2.5.1 Einfluss des Additivs Isopropanol auf die Doppeloxidation

Zuerst wurde das System mit Isopropanol (30) als Additiv mit der vorher diskutierten Doppel-

oxidation ohne Additiv bei einer Substratkonzentration von 25 mM, einer Reaktionszeit von

24 Stunden und unter Einsatz von 7.64 U/mmol P450-Monooxygenase (Enzymaktivität bezogen auf

Cyclooktan (73)) bzw. 200 U/mmol Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (Enzymaktivität

bezogen auf Acetophenon) verglichen. Es wurden erfreulicherweise ein deutlich höherer Umsatz und

eine damit erhöhte Produktbildung bei Einsatz des Alkohols 30 als Additiv erhalten. Der Umsatz

belief sich auf 10% bis 11% bei einer Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l. Damit wurde ein

dreifach höheres Ergebnis erzielt, als bei der Doppeloxidation ohne das Additiv mit einem Umsatz

von 3% bis 4% und einer Produktbildung von 0.090 g/l bis 0.140 g/l. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19

dargestellt.


des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz


70

asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,


Validierung

3.5.2.5.2 Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Doppeloxidation von Cyclooktan

mit Isopropanol als Additiv

Aufgrund der vielversprechenden Ergebnisse wurde bei der Doppeloxidation mit Isopropanol (30) als

Additiv weitergearbeitet. Im nächsten Schritt wurde der Einfluss der Reaktionstemperatur auf die

Doppeloxidation untersucht. Dazu wurde die Reaktion über 24 Stunden bei Raumtemperatur mit der

Reaktion verglichen, bei der in den ersten 8 Stunden konstant eine Temperatur von 8°C gehalten

wurde und bei der die Erwärmung auf Raumtemperatur in den verbleibenden 16 Stunden

durchgeführt wurde. Mit einem Umsatz von 11% und einer Produktbildung von 0.328 g/l lag das

Ergebnis bei der niedrigeren Temperatur im Bereich der Ergebnisse bei Raumtemperatur, bei denen

Umsätze von 10% bis 11% und eine Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l erzielt wurde. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 20 zusammengefasst.

Eintraga

IPA 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb

[µl] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 0 0.56 4 4 11 0.0011 0.140

1b 0 0.36 3 3 5 0.0007 0.090

1c 0 0.40 3 3 7 0.0008 0.100

2a 10 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

2be 10 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

2ce 10 1.36 11 12 26 0.0027 0.340


71

Tabelle 20: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von

Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,


Validierung

3.5.2.5.3 Einfluss der Reaktionszeit auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit

Isopropanol als Additiv

Als nächstes wurde der Einfluss der Reaktionszeit auf die Doppeloxidation untersucht, indem die

Reaktionszeit verlängert wurde. Hierbei wurde in 48 Stunden mit einem Umsatz von 11% und einer

Produktbildung von 0.345 g/l ein sehr ähnliches Ergebnis wie bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden

erreicht. Hier wurden Umsätze von 10% bis 11% und Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l

erreicht. Eine deutlich höhere Bildung an Produkt konnte also nicht durch eine Verlängerung der

Reaktionszeit erzielt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 dargestellt.

Eintraga T

75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb

[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a RT 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1be RT 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1ce RT 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 8°C 1.31 11 12 27 0.0026 0.328


72


von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

asiehe AAV 14,

bReaktionszeit,

cnach


dUmsatz nach IS,

eUmsatz nach ISH,

fWiederholungsversuche

zu 1a zur Validierung

3.5.2.5.4 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einer

Substratkonzentration von 25 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit


Im nächsten Schritt wurde der Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase auf die

Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv bei einer Substratkonzentration

von 25 mM und einer Reaktionszeit von 24 Stunden untersucht. Als P450-Monooxygenase wurden

die F87V-Mutante und die 19A12-Mutante miteinander verglichen. Mit der 19A12-Mutante wurde

mit einem Umsatz von 20% bis 22% und einer Produktbildung von 0.633 g/l bis 0.685 g/l ein deutlich

besseres Ergebnis erzielt als bei Verwendung der F87V-Mutante. Hier wurden Umsätze von 10% bis

Eintraga

Dauerb 75c Umsatzc Umsatzd Umsatze Produktbildungc

[h] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 24 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1bf 24 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1cf 24 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 48 1.38 11 11 40 0.0027 0.345


73

11% und eine Produktbildung von 0.323 g/l bis 0.353 g/l erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22

zusammengefasst.


25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol

(30) als Additiv

asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,


Validierung, fWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung

Eintraga Mutante


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1be F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1ce F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

2bf 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

2cf 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633


74

3.5.2.5.5 Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation von

Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv

In diesem Teilkapitel wurde der Einfluss der Substratkonzentration auf die Doppeloxidation

untersucht. Die Doppeloxidation wurde sowohl mit der 19A12-Mutante als auch mit der F87V-

Mutante bei einer Enzymmenge von 7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)) und

einer Substratkonzentration von 25 mM bis 100 mM durchgeführt, um einen direkten Vergleich zu

erhalten. Bei Einsatz beider Mutanten zeigte sich durch die Erhöhung der Substratkonzentration eine

deutliche Verbesserung (Abbildung 64).

Abbildung 64: Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase und der Substratkonzentration auf die

biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als

Additiv

Einsatz der 19A12-Mutante

Die Produktbildung von 0.633 g/l bis 0.685 g/l, die mit der 19A12-Mutante bei einer Substrat-

konzentration von 25 mM erzielt wurde, konnte durch die Erhöhung der des Cycloalkans 73 auf

100 mM auf eine Produktbildung von 0.800 g/l gesteigert werden, was einer Verbesserung um 22%

entspricht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 dargestellt.


75

Tabelle 23: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,


Validierung

Einsatz der F87V-Mutante

Es konnte ein ähnlicher Trend bei Einsatz der F87V-Mutante verzeichnet werden wie bei Einsatz der

19A12-Mutante. Die Produktbildung nahm hier bei einer Substratkonzentration von 25 mM von

0.339 g/l bis 0.353 g/l auf 0.490 g/l bei einer Konzentration von 100 mM zu, was einer Steigerung von

45% entspricht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 zusammengefasst.


Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,


Validierung

Eintraga


[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 25 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

1bd 25 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

1cd 25 2.53 20 20 40 0.0050 0.633

2 100 0.80 6 6 14 0.0063 0.800

Eintraga


[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 4 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1be 4 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1ce 4 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 1 0.49 4 4 10 0.0039 0.490


76


Substratkonzentration von 100 mM auf die Doppeloxidation von Cyclooktan mit


Anschließend wurden die 19A12- und F87V-Mutante der P450-Monooxygenase bei einer

Substratkonzentration von 100 mM getestet. Die höchste Produktbildung wurde mit der 19A12-

Mutante erreicht. Sie betrug hier 0.80 g/l, während mit der F87V-Mutante 0.49 g/l des Cycloalkanons

75 gebildet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 dargestellt.



asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH

Eintraga Mutante


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1 19A12 0.80 6 6 14 0.0063 0.80

2 F87V 0.49 4 4 10 0.0039 0.49


77

3.5.2.5.7 Einfluss der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium auf die

Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv

Bei den Mutanten der P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium handelte es sich um

Rohextrakte, in denen noch andere aktive Substanzen enthalten ein könnten. Es wurde daher eine

Reaktion mit dem Leervektor der P450-Monooxygenase bei einer Substratkonzentration von 25 mM

den Reaktionen der 19A12- und der F87V-Mutante verglichen. Ein Leervektor ist der aus dem

Wirtsorganismus E. coli stammende Rohextrakt ohne Expression der P450-Monooxygenase BM-3.[87]

Im Gegensatz zu den Reaktionen mit den Mutanten, konnte kein Umsatz mit dem Leervektor

beobachtet werden, was beweist, dass die Hydroxylierung wirklich von den Mutanten der P450-

Monooxygenase katalysiert wurde und nicht von anderen Substanzen im Rohextrakt. Die Ergebnisse

sind in Tabelle 26 dargestellt.


Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

Eintraga Enzym


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1be F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1ce F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340


78

asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,



3.5.2.5.8 Einfluss der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir auf die

Doppeloxidation von Cyclooktan mit Isopropanol als Additiv

Im letzten Schritt wurde der Einfluss der katalytischen Aktivität der Alkoholdehydrogenase aus

Lactobacillus kefir auf die Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit Isopropanol (30) als Additiv

untersucht. Dazu wurde diese Reaktion mit der 19A12- oder der F87V-Mutante der P450 BM-3 mit

sowie ohne Zusatz der Alkoholdehydrogenase durchgeführt. Erwartungsgemäß konnte ohne die

Alkoholdehydrogenase weder bei Einsatz der 19A12-Mutante noch bei Einsatz der F87V-Mutante ein

Umsatz beobachtet werden, da der am Anfang der Reaktion zugesetzte Cofaktor NADP+ von der

P450-Monooxygenase BM-3 nicht umgesetzt werden konnte (Tabelle 27).


Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

Eintraga Enzym


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

2bf 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

2cf 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633

3 Leer-

vektor n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.


79

asiehe AAV 14,

bnach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,



3.5.3 Zusammenfassung

Sowohl die Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) als auch die Doppeloxidation des

Cycloalkans 73 zur Synthese von Cyclooktanon (75) wurden unter verschiedenen Gesichtspunkten

mit dem Ziel der Etablierung von geeigneten biokatalytischen Eintopf-Verfahren im wässrigen

Medium mit molekularem Sauerstoff als Reagenz untersucht.

3.5.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan

Bei der Hydroxylierung von Cyclooktan (73) waren die Startbedingungen der Einsatz von

38.2 U/mmol (bezogen auf Dodekansäure) F87V-Mutante der P450-Monooxygenase aus Bacillus

megaterium (P450 BM-3) bei einer Substratkonzentration von 20 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0,

50 mM) und einer Reaktionszeit von 24 Stunden. Die Reaktion wurde zuerst mit dem Cofaktor

NADPH ohne Cofaktorregenerierung durchgeführt, was zu keinem Umsatz führte. Erst durch die

Einführung einer in situ-Cofaktorregenerierung konnte eine Produktbildung von 0.155 g/l erreicht

werden. Dazu wurde als Cofaktor NADP+, als Cosubstrat D-Glucose und als Zweitenzym die

Glucosedehydrogenase eingesetzt, die unter Bildung des für den Hydroxylierungsschritt benötigten

Cofaktors NADPH die D-Glucose in D-Gluconolacton umwandelt. Die Produktbildung konnte mit Hilfe

Eintraga Mutante

LK-ADH 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb

[U/mmol] [mg] [%] [%] [%] [mmol/ml] [mg/ml]

1a F87V 200 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1be F87V 200 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1ce F87V 200 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 F87V 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

3a 19A12 200 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

3bf 19A12 200 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

3cf 19A12 200 2.53 20 20 40 0.0050 0.633

4 19A12 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.


80

der in situ-Cofaktorregenerierung im abschließenden Schritt auf 0.328 g/l durch Änderung der

Substratkonzentration auf 25 mM und der Enzymmenge auf 7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen

auf das Cycloalkan 73) verbessert werden (Abbildung 65).

Abbildung 65: Biokatalytische Hydroxylierung von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanol (74) mit einer

Produktbildung von 0.328 g/l

3.5.3.2 Doppeloxidation von Cyclooktan

Die Startbedingungen bei der Doppeloxidation waren der Einsatz von 0.1 Äquivalenten NADPH als

Cofaktor und 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) F87V-Mutante der P450-

Monooxygenase aus Bacillus megaterium bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden und einer

Substratkonzentration von 100 mM. Auf diese Reaktion wurde der Einfluss der Konzentration des

Edukts Cyclooktan (73) und der eingesetzten Enzymmenge untersucht. Durch eine Veränderung der

Substratkonzentration von 20 mM auf 25 mM mit einer einhergehenden Änderung der eingesetzten

Enzymmenge von 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf die Säure 66) auf 7.64 U/mmol

(Enzymaktivität bezogen auf das Cycloalkan 73) konnte eine Steigerung der Produktbildung von

0.094 g/l auf 0.110 g/l verzeichnet werden. Anschließend wurde der Einfluss der Enzymmenge auf die

Reaktion untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Doppeloxidation bei einer Substratkonzentration

von 25 mM und Enzymmengen von 7.64 U/mmol, 15.28 U/mmol und 22.92 U/mmol (Enzymaktivität

bezogen auf das Cycloalkan 73) durchgeführt. Die Produktbildung von 0.09 g/l bis 0.14 g/l bei

7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf das Cycloalkan 73) P450-Monooxygenase nahm bei

Erhöhung der Enzymmenge ab (Abbildung 66). Die Produktbildung lag bei einer Enzymmenge von

15.28 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)) bei 0.103 g/l und von 22.92 U/mmol

(Enzymaktivität bezogen auf das Cycloalkan 73) bei 0.093 g/l.


81

Abbildung 66: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) mit einer

Produktbildung im Bereich von 0.09 bis 0.14 g/l

Die Doppeloxidation wurde anschließend mit und ohne Isopropanol 30 als Additiv untersucht. Dazu

wurde die Doppeloxidation einerseits ausgehend von Cyclooktan (73) und NADPH als Cofaktor und

andererseits ausgehend vom Cycloalkan 73, Isopropanol (30) und dem Cofaktor NADP+ untersucht.

Durch die Einführung des Alkohols 30 als Additiv und NADP+ als Cofaktor konnte die Produktbildung

von 0.090 g/l bis 0.14 g/l auf 0.323 g/l bis 0.353 g/l gesteigert werden. Fortan wurde die Doppel-

oxidation mit Isopropanol (30) als Additiv unter den Gesichtspunkten Reaktionstemperatur,

Reaktionszeit, Substratkonzentration und eingesetzter Mutante der P450-Monooxygenase unter-

sucht. Es wurde zuerst der Einfluss bei Verringerung der Reaktionstemperatur auf 8°C für 8 Stunden

mit anschließender Erwärmung auf Raumtemperatur während der verbleibenden 16 Stunden auf die

Doppeloxidation mit dem Alkohol 30 als Additiv untersucht. Die Produktbildung lag mit 0.328 g/l in

einem vergleichbaren Bereich wie bei der Durchführung der Doppeloxidation mit Isopropanol (30) als

Additiv bei Raumtemperatur über 24 Stunden. Hier wurde eine Produktbildung von 0.323 g/l bis

0.353 g/l erzielt. Im nächsten Schritt wurde die Reaktionszeit von 24 Stunden auf 48 Stunden erhöht.

Auch hier wurde mit einer Produktbildung von 0.345 g/l ein Ergebnis im gleichen Bereich erzielt. Die

19A12-Mutante stellte sich als geeignete Mutante in der biokatalytischen Doppeloxidation des

Cycloalkans 73 zum Cycloalkanon 75 heraus. Hierbei wurde eine Produktbildung von 0.651 g/l bei

einer Substratkonzentration von 25 mM erreicht. Zur Verbesserung der Produktbildung wurde die

Substratkonzentration von 25 mM auf 100 mM erhöht. Dadurch konnte die Produktbildung deutlich

auf 0.80 g/l verbessert werden, was auch das bisher beste Ergebnis darstellte (Abbildung 67).


82

Abbildung 67: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon (75) unter

Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung im Bereich von 0.80 g/l

4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton

83

4. Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-

Monooxygenase als Katalysator zur Herstellung von epsilon-Caprolacton

4.1 Einleitung

Baeyer-Villiger-Monooxygenasen, die zur Klasse der Oxidoreduktasen gehören, sind Flavoenzyme

und dafür bekannt, dass sie entsprechend einer Baeyer-Villiger-Oxidation lineare, cyclische und

aromatische Ketone zu den korrespondierenden Estern oder Lactonen oxidieren können.[88-90] Die

kommerziell erwerbliche NADPH-abhängige Baeyer-Villiger-Monooxygenase aus Acinetobacter

calcoaceticus (EC 1.14.13., BVMO ECS-MO1) [88] kann Cyclohexanon (41) unter Verbrauch von NADPH

zu ε-Caprolacton (53) umwandeln. Als vorhergehender Schritt kann die NADPH-abhängige

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (EC 1.1.1.2,[91] LK-ADH) unter Bildung von NADPH

Cyclohexanol (16) zu Cyclohexanon (41) oxidieren, so dass es möglich ist, in einem Eintopf-

Zweistufen-Verfahren im wässrigen Medium mit molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel das

ε-Caprolacton (53) aus dem cyclischen Alkohol 16 herzustellen. Hierbei kann auf den Zusatz eines

Cosubstrats verzichtet werden (Abbildung 68). Das Produkt ε-Caprolacton (53) kann zur Herstellung

von Polycaprolacton (PCL, 54) verwendet werden.[92,93]

Abbildung 68: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) in einem Eintopf-Zweistufen-

Verfahren im wässrigen Medium zu ε-Caprolacton (53)


84


4.2.1 Verwendung von εεεε-Caprolacton in der Industrie

4.2.1.1 Polycaprolacton (PCL)

Das Lacton 53 wird vor allem zur Herstellung von Polycaprolacton (PCL, 54) verwendet, ein farbloses

Polymer mit einer Schmelztemperatur im Bereich von 58 bis 65°C (Abbildung 69).[92]

Abbildung 69: Das Polymer Polycaprolacton (PCL, 54)

Polycaprolacton (54) kann mit anderen Polymeren Polymermischungen bilden. Daraus ergeben sich

neue Werkstoffe, die die verschiedenen Eigenschaften der einzelnen Polymere vereinen.

Polycaprolacton (54) kann aber auch als polymerer Weichmacher eingesetzt werden und ist

biologisch gut abbaubar, weshalb das Polymer auch in der Medizin Anwendung findet.[92]

4.2.1.2 Herstellung von Polycaprolacton durch anionische Polymerisation von

εεεε-Caprolacton

Es gibt mehrere Basen oder Lewis-Basen, die in der Lage sind, die anionische ringöffnende

Polymerisation zu initiieren. Dazu gehören Alkoholate, Alkoxide, Phosphine, Amine und

Metallalkyle.[92] Die Initiierung der anionischen ringöffnenden Polymerisation durch ein Alkoholat 76,

das nucleophil am Carbonyl-Kohlenstoffatom angreift und somit eine Ringöffnung unter Entstehung

eines Alkoxids 77 herbeiführt, wird in Abbildung 70 dargestellt. Das Alkoxidkettenende ermöglicht

das Kettenwachstum, bis das Wachstum durch Zugabe von Inhibitoren gestoppt wird.[92,93] Es

entstehen Polycaprolactone, die je nach ihrer Kettenlänge unterschiedliche Schmelztemperaturen

haben.[92]


85

Abbildung 70: Anionische Polymerisation von ε-Caprolacton (53) zur Synthese von

Polycaprolactonen [92]

4.2.2 Herstellung von εεεε-Caprolacton

4.2.2.1 Baeyer-Villiger-Oxidation von Cyclohexanon unter Verwendung von

Persäuren

Bei der Baeyer-Villiger-Oxidation handelt es sich um eine Oxidationsreaktion von Ketonen zu Ester

bzw. Lactonen unter Einsatz von Persäuren. Als Persäuren 78 werden in der organischen Chemie

typischerweise Peressigsäure oder meta-Chlorperbenzoesäure (mCPBA) eingesetzt. Die Persäure

kann als Nucleophil das durch Protonierung entstehende Carbokation angreifen und das sogenannte

Criegee-Intermediat 79 bilden. Nach Abspaltung einer Carbonsäure und abschließender

Deprotonierung erhält man das Lacton 53 (Abbildung 71).[94]

Abbildung 71: Synthese von ε-Caprolacton (53) durch die Baeyer-Villiger-Oxidation von

Cyclohexanon (41) unter Verwendung von Persäuren 78 [94]


86

4.2.2.2 Industrielle Herstellung durch den UCC-Prozess

Das ε-Caprolacton (53) spielt eine wichtige Rolle für die Herstellung von Polymeren und wird zu

mehreren 10.000 Tonnen jährlich produziert. Allein die Firma Interox in England betreibt seit 1975

eine 10.000 jato Anlage.[21] Beim industriellen UCC-Prozess (Union Carbide Corporation) wird das

Keton Cyclohexanon (41) bei 50°C unter Normaldruck mit Peressigsäure (78a) zu ε-Caprolacton (53)

oxidiert (Abbildung 72). Hierbei wird eine Selektivität von 85% bis 90% erreicht.[21]

Abbildung 72: Industrielle Herstellung von ε-Caprolacton (53) durch den UCC-Prozess [21]

Die als Oxidationsmittel eingesetzte Peressigsäure (78a) ist allerdings brandfördernd, ätzend,

gesundheitsschädlich und umweltgefährlich.[95] Aus toxikologischer und ökologischer Sicht ist diese

Chemikalie daher eher problematisch zu betrachten.

4.2.3 Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase

Baeyer-Villiger-Monooxygenasen benötigen den Cofaktor NADPH oder NADH und sind gewöhnlich

abhängig von Flavin (FAD oder FMN). Der in der Abbildung 73 dargestellte Mechanismus beschreibt

die Baeyer-Villiger-Oxidation unter Einsatz des Cofaktors NADPH und des Coenzyms Flavin-Adenin-

Dinukleotid (FAD, 80). Während der enzymatischen Baeyer-Villiger-Oxidation wird ein Sauerstoff-

Atom des Sauerstoff-Moleküls in das Ausgangsketon, hier Cyclohexanon (41), unter Bildung des

korrespondierenden Esters oder Lactons, hier ε-Caprolacton (53), eingeführt. Das zweite Sauerstoff-

atom wird in Wasser umgewandelt. Das FAD wird unter Oxidation von NADPH zu NADP+ zu FADH2

(81) reduziert. Die Oxidation verläuft dann über das Intermediat Peroxoflavin (82), das einen

nucleophilen Angriff auf das Carbonyl-Kohlenstoffatom des Ausgangsketons startet

(Abbildung 73).[1,96]


87

Abbildung 73: Mechanismus der Baeyer-Villiger-Monooxygenase [1,96,97]

4.2.4 Präparative Anwendungen der BVMO

4.2.4.1 Enantioselektive Sulfoxidation von prochiralen Thioethern

Die Arbeitsgruppe von REETZ et al. veröffentlichte 2004 ihre Ergebnisse zur enantioselektiven

Sulfoxidation von prochiralen Thioethern. Die (R)-selektive Mutante 1-D10-F6 einer Cyclohexanon-

Monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (EC 1.14.13.22) oxidierte unter Einsatz

von molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel das Substrat Methyl-p-methylbenzylthioether (83)

zum korrespondierenden (R)-Sulfoxid (R)-84 mit einer Ausbeute von 75% und einem ee-Wert von

98.9%.[98] Einen ähnlichen Erfolg erzielte die Gruppe bei der gleichen Reaktion unter Einsatz mit der

von ihnen entwickelten (S)-selektiven Mutante 1-H8-A1 einer Cyclohexanon-Monooxygenase aus

Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (EC 1.14.13.22) und Luftsauerstoff. Hierbei konnte das entsprechende


88

(S)-Sulfoxid (S)-84 mit einer Ausbeute von 52% und einem ee-Wert von 99.7% erhalten werden

(Abbildung 74).[98]

Abbildung 74: Enantioselektive Sulfoxidation eines prochiralen Thioethers 83 mit Hilfe einer

CHMO [98]

Darüber hinaus untersuchte die Gruppe das Potential von Mutanten für eine effiziente, kinetische

Spaltung der rac-Sulfoxide rac-84. Hierzu wurde ein racemisches Gemisch des Sulfoxids 84 mit

Luftsauerstoff und entweder der (R)-selektiven Mutante 1-D10-F6 oder der (S)-selektiven Mutante

1-H8-A1 versetzt. Bei der Oxidation des racemischen Sulfoxids rac-84 mit der 1-D10-F6-Mutante

unter der Synthese des Sulfons 85 wurde ein Umsatz von 43% erzielt. Der ee-Wert des verbleibenden

(R)-Sulfoxids (R)-84 lag bei 98.7%. Durch Einsatz der 1-H8-A1-Mutante konnte das racemische

Gemisch des Sulfoxids 84 mit einem Umsatz von 62% zum Sulfon 85 oxidiert werden. Das

verbleibende (S)-Sulfoxid (S)-84 wurde mit einem ee-Wert von 98.9% erhalten (Abbildung 75).[98]

Abbildung 75: Kinetische Spaltung des racemischen Sulfoxids rac-84 mit Hilfe einer CHMO [98]


89

4.2.4.2 Katalytische kinetische Racematspaltung von 4-Hydroxy-2-ketonen

Im Jahre 2006 zeigte KIRSCHNER et al., dass acylierte (S)-1,2-Diole (S)-87a-c und (S)-88a-c aus

racemischen 4-Hydroxy-2-ketonen rac-86a-c durch eine BVMO aus P. fluorescens DSM 50106

erhalten werden konnte, wobei ein maximaler Umsatz von 48% erzielt wurde

(Abbildung 76).[89] Durch Acylwanderung von der primären zur sekundären Hydroxygruppe

entstanden die Verbindungen (S)-87a-c und (S)-88a-c als Mischung in einem Verhältnis von 4:1.[89]

Abbildung 76: Kinetische Racematspaltung von racemischen 4-Hydroxyketonen rac-86 [89]

4.2.4.3 Synthese von ββββ-Aminosäuren und ββββ-Aminoalkoholen durch Nutzen der

Regioselektivität der BVMO

REHDORF et al. fand 2010 einen Zugangsweg zu den wertvollen Bausteinen der β-Aminosäuren und β-

Aminoalkoholen, indem die Gruppe die Regioselektivität der BVMO ausnutzte. Hierzu wurde ein

racemisches, N-geschütztes β-Aminoketon rac-89 durch kinetische Racematspaltung mit einer BVMO

zu einem abnormalen N-geschützten β-Aminosäureester 90, bei dem der Sauerstoff am weniger

gehinderten Kohlenstoffatom eingefügt wurde, und zu einem normalen N-geschützten Baeyer-

Villiger-Ester 91 mit dem Sauerstoff am höher substituierten Kohlenstoffatom umgesetzt (Abbildung

77).[90] Es wurden insgesamt vier BMVOs gefunden, die in der Lage waren, das racemische β-

Aminoketon rac-89 als Substrat zu akzeptieren, wobei die Cyclododecanon-Monooxygenase aus

Rhodococcus ruber im Gegensatz zu den anderen untersuchten BVMOs das (+)-Enantiomer (+)-90

bildete.[90]


90

Abbildung 77: BVMO-katalysierte kinetische Racematspaltung des N-geschützten β-Aminoketons

rac-89 [90]

Das Enzym Lipase B aus Candida antarctica (CAL-B) war in der Lage den abnormalen N-geschützten

(+)-β-Aminosäureester (+)-90 zu der N-geschützten β-(+)-Aminosäure (+)-92 zu hydrolysieren und

den normalen N-geschützten Ester 91 zu dem N-geschützten β-Aminoalkohol 93 (Abbildung 78).[90]

Abbildung 78: Synthese einer N-geschützten β-(+)-Aminosäure (+)-92 und eines N-geschützten β-Aminoalkohols 93 [90]


91

4.2.4.4 Verwendung in der Synthese von Esomeprazol

Darüber hinaus wurde die Fähigkeit der BVMO zur enantioselektiven Sulfoxidation genutzt, um den

Arzneistoff Esomeprazol (95) aus Omeprazol (94) mit Hilfe einer BVMO zu synthetisieren

(Abbildung 79).[99] Esomeprazol (95) ist ein Protonenpumpenhemmer, der zur Behandlung von

Ösophagitis (Speiseröhrenentzündung)[100] und gastro-ösophagealem Reflux eingesetzt wird.[101]

Abbildung 79: Synthese des Protonenpumpenhemmers Esomeprazol (95) durch enantioselektive

Sulfoxidation aus Omeprazol (94) mit einer BVMO [99]

4.3 Ziel der Arbeit

Das Ziel der Arbeit war die direkte biokatalytische Oxidation von Cyclohexanol (16) zu ε-Caprolacton

(53) unter Einsatz von molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel im Reaktionsmedium Wasser in

Form einer Eintopf-Zweistufen-Synthese. Hierbei wurde das Konzept der biokatalytischen

Doppeloxidation, das auf dem Zusammenspiel einer Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-

Villiger-Monooxygenase beruht, angewendet. Die Baeyer-Villiger-Monooxygenase ist NADPH-

abhängig. Dementsprechend musste die Alkoholdehydrogenase auch NADPH-abhängig sein, um

dadurch eine vorteilhafte Cosubstrat-freie Cofaktorregenerierung zu ermöglichen. Im ersten Schritt

wurde Cyclohexanol (16) von einer Alkoholdehydrogenase durch Reduktion des Cofaktors NADP+ zu

NADPH zum Cyclohexanon (41) oxidiert. Das entstehende NADPH wurde im Laufe der die Baeyer-

Villiger-Oxidation des Ketons 41 zu ε-Caprolacton (53) wieder zu NADP+ oxidiert. Der für einen

erneuten Katalysezyklus benötigte Cofaktor NADP+ stand somit wieder zur Verfügung und konnte

dementsprechend in katalytischen Mengen eingesetzt werden (Abbildung 80). Das Konzept erfüllt

einige Voraussetzungen einer „Dream Reaction“.[6] Das Reaktionsmedium Wasser ist kostengünstig

und ökologisch unbedenklich und der für die Reaktion benötigte molekulare Sauerstoff kann durch

Luftsauerstoff zugeführt werden.


92

Abbildung 80: Biokatalytische Doppeloxidation des Alkohols 16 unter Synthese von ε-Caprolacton

(53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium

Die Bearbeitung dieses Forschungsprojekts erfolgte im Rahmen des von der „Deutschen

Bundesstiftung Umwelt“ geförderten Verbundprojekts „Nachhaltige, biokatalytische Oxidations-

prozesse“ (AZ-13234-32).

4.4 Ergebnisse und Diskussion

4.4.1 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Aktivitätsbestimmung der

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir für die Oxidation von Cyclohexanol zu

Cyclohexanon

Die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) wurde aufgrund ihrer NADPH-

Abhängigkeit auf ihre Eignung bezogen auf die Oxidation von Cyclohexanol (16) zu Cyclohexanon (41)

getestet. Sie zeichnete sich durch eine hohe Substratbreite aus und reduzierte während der Reaktion

NADP+ zum für die Baeyer-Villiger-Oxidation benötigten NADPH. Als Referenzsubstrat für die

spektrophotometrischen Untersuchungen wurde 1-Phenylethanol (96) eingesetzt (Abbildung 81).

Abbildung 81: Die bei der spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der LK-ADH eingesetzten

sekundären Alkohole 1-Phenylethanol (96) und Cyclohexanol (16)


93

Die Ergebnisse der spektrophotometrischen Aktivitätsbestimmung der LK-ADH sind in Tabelle 28

dargestellt.

Tabelle 28: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH

Eintraga Substrat U/ml [μmol/min*ml] relative Aktivitätb [%]

1 1-Phenylethanol 79.4 100

2 Cyclohexanol 55.2 70

asiehe AAV 15,

bbezogen auf 1-Phenylethanol. Vg = 1 ml, f = 101, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

4.4.2 Synthese von εεεε-Caprolacton ausgehend von Cyclohexanol unter Kombination

einer Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase

In diesem Teilabschnitt wurde die Synthese von ε-Caprolacton (53) ausgehend von Cyclohexanol (16)

unter Kombination einer Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase unter den

Gesichtspunkten der Abhängigkeit von der der Cofaktor- und Substratmenge untersucht und ein

„Proof of Concept“ erstellt.

4.4.2.1 Einfluss der Cofaktormenge

Cofaktoren sind sehr kostenintensiv, weshalb aus ökonomischen Gründen nur eine geringe Menge

davon für die Reaktionen verwendet werden sollten. Die Stoffmenge an verwendeten NADP+ wurde

im Folgenden von 0.1 auf 0.02 Äquivalente herabgesetzt. Die biokatalytische Doppeloxidation von

Cyclohexanol (16) zur Synthese von ε-Caprolacton (53) wurde in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und

Raumtemperatur über 24 Stunden durchgeführt. Als Enzyme wurden 40 U LK-ADH und 3.82 U BVMO

eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 29 dargestellt.


94


Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors

Eintraga

ADH BVMO NADP+ Umsatzb Produktbildungb

[U] [U] [Äq.] [%] [mol/l] [g/l]

1 40 3.82 0.02 97 0.0192 2.20

2 40 3.82 0.10 99 0.0197 2.25

asiehe AAV 16,

bnach

1H-NMR und Auswaage bestimmt.

Die Reaktion erzielte durch die Zugabe von 0.02 Äquivalenten NADP+ ähnliche Ergebnisse wie bei

höherer Cofaktorzugabe. Es wurden 97% Umsatz mit der niedrigeren Cofaktor-Stoffmenge erzielt,

während bei Zugabe von 0.1 Äquivalenten NADP+ ein Umsatz von 99% erreicht wurde. Die weiteren

Reaktionen werden mit nur 0.02 Äquivalenten NADP+ als Cofaktor durchgeführt. Die Reaktion mit

0.02 Äquivalenten NADP+ lieferte den „Proof of Concept“.

4.4.2.2 Einfluss der Substratkonzentration

Basierend auf den erfreulichen und vielversprechenden Ergebnissen erfolgte eine Prozess-

optimierung. Die Menge des Substrats Cyclohexanol (16) wurde sukzessive in 20 mM-Schritten von

20 mM auf 100 mM erhöht, in der Hoffnung, eine höhere Produktbildung zu erzielen. Alle anderen

Bedingungen wurden nicht verändert, sodass die Reaktionen in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) mit

einer Reaktionsdauer von 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt wurden. Es wurden ferner

als Enzyme 40 U LK-ADH und 3.82 U BVMO eingesetzt. Die Ergebnisse in Tabelle 30 dargestellt.


95


Stoffmenge des eingesetzten Substrats

Eintraga

ADH BVMO c (Cyclohexanol) Umsatzb Produktbildungb

[U] [U] [mM] [%] [mg/ml]

1a 40 3.82 20 97 2.20

1bb 40 3.82 20 99 2.25

2 40 3.82 40 97 4.41

3 40 3.82 60 94 6.45

4 40 3.82 80 36 3.21

5 40 3.82 100 24 2.72

asiehe AAV 16,

bnach



Erfreulicherweise konnte bis zu einer Substratmenge von 60 mM eine Steigerung der Produktbildung

von 2.20 g/l auf 6.45 g/l erzielt werden. Der Umsatz nahm ganz leicht von 97% für 20 mM und 40 mM

auf 94% für 60 mM ab. Bei höheren Mengen an Cyclohexanol (16) konnte ein rapider Abfall sowohl

des Umsatzes als auch in der Produktbildung beobachtet werden. So wurden bei 80 mM

Cyclohexanol-Konzentration nur noch 36% Umsatz bei einer Produktbildung von 3.21 g/l erhalten,

bei 100 mM konnte nur noch 24% Umsatz und 2.72 g/l Produktbildung erzielt werden. Die Ergebnisse

sind graphisch in Abbildung 82 zu sehen.


96

Abbildung 82: Abhängigkeit der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) von der


Dieses Ergebnis veranlasste weiterführende spektrophotometrische Untersuchungen, um eine

Erklärung für den Abfall im Umsatz zu finden, da dieses Ergebnis auf eine Inhibierung und bzw. oder

ein Stabilitätsverlust der weniger stabilen BVMO hinwies. Aus diesem Grund wurde der Einfluss des

Substrats Cyclohexanol (16), des Zwischenprodukts Cyclohexanon (41) und des Zielprodukts

ε-Caprolacton (53) auf die BVMO in Bezug auf Inhibierung und Stabilität untersucht.

4.4.3 Spektrophotometrische Untersuchungen zur Inhibierung und Stabilität der

Baeyer-Villiger-Monooxygenase

Die spektrophotometrischen Untersuchungen wurden durchgeführt, um den Abfall des Umsatzes ab

einer Substrat-Konzentration von 60 mM infolge von Inhibierung oder Stabilität der BVMO erklären

zu können.

4.4.3.1 Inhibierung

Zuerst wurde die Inhibierung der Baeyer-Villiger-Monooxygenase (BVMO) durch Cyclohexanon (41)

mit Substratkonzentrationen von 0 bis 100 mM untersucht. Das Keton 41 stellt das Zwischenprodukt

in der Doppeloxidation dar und wird im Laufe der Reaktion schnell zum Lacton 53 umgesetzt,

weshalb der Einfluss von Keton 41 vernachlässigbar ist. Die höchste hierbei erreichte Aktivität der

BVMO wurde bei einer Konzentration von 12 mM Cyclohexanon (41) erzielt. Bei höheren

Konzentrationen fiel die Aktivität infolge einer Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41) ab. So


97

wurde bei einer Konzentration von 100 mM des Ketons 41 eine relative Aktivität von 57% erreicht.

Die Ergebnisse sind graphisch in Abbildung 83 dargestellt.

Abbildung 83: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41)

Anschließend wurde die Inhibierung der BVMO durch das ε-Caprolacton (53) mit Substrat-

konzentrationen von 0 bis 0.4 M untersucht (Abbildung 84). Das Lacton 53 ist das Zielprodukt der

Doppeloxidation und wird durch die Reaktion der BVMO mit Cyclohexanon erhalten.

Abbildung 84: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53)

Hier war deutlich eine sofortige Abnahme der relativen Aktivität zu verzeichnen, was auf eine

Inhibierung der BVMO durch das Produkt ε-Caprolacton (53) hindeutete. Bei einer Konzentration von

0.1 M an Lacton 53 wurde eine relative Aktivität der BVMO von 67% gemessen und diese Aktivität


98

nahm sukzessive bis auf 14% bei einer Konzentration von 0.4 M ε-Caprolacton (53) ab. Ein

wesentlicher Grund für die niedrigeren Umsätze bei Einsatz von höheren Konzentrationen von

Cyclohexanol (16) liegt offensichtlich in der Inhibierung der BVMO durch das ε-Caprolacton (53).

4.4.3.2 Stabilitätstests

Konsequenterweise wurde die BVMO auch auf ihre Stabilität in der Reaktionszeit von 24 Stunden

und Raumtemperatur untersucht. Als Benchmark-Versuch wurde eine Lösung der BVMO in

Phosphatpuffer (pH 7.0) über 24 Stunden gerührt und in definierten Abständen die jeweilige Aktivität

per Spektrophotometer überprüft. Hierbei nahm die Aktivität selbst in Abwesenheit der Additive

innerhalb von 24 Stunden auf 60% ab. In der Doppeloxidation liegt aber nicht nur die BVMO vor,

sondern auch das Edukt Cyclohexanol (16), das in sehr kleinen Mengen vorkommende

Zwischenprodukt Cyclohexanon (41) und das Zielprodukt ε-Caprolacton (53). Im Anschluss an diesen

Benchmark-Versuch wurde der Einfluss dieser drei Komponenten getrennt voneinander auf die

BVMO untersucht. Zur Überprüfung des Einflusses des Alkohols 16 auf das Enzym wurde jeweils eine

Enzymlösung mit entweder 25 mM, 50 mM oder 100 mM Cyclohexanol (16) versetzt und diese

Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierbei lag die relative Aktivität nach

24 Stunden für 25 mM und 50 mM Cyclohexanol (16) in einem ähnlichen Bereich wie beim

Benchmark-Versuch ohne Zusatz. Einen negativen Einfluss hatte eine Cyclohexanol-Konzentration

von 100 mM auf die relative Aktivität, die nach 24 Stunden nur noch 39% betrug (Abbildung 85). Für

die Prozessoptimierung stellten diese Ergebnisse keine große Herausforderung dar, da der

erforderliche Alkohol 16 in der optimalen Konzentration im Laufe des Prozesses immer wieder

zugegeben werden kann.

Abbildung 85: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanol (16)


99

Der Einfluss des Zwischenprodukts Cyclohexanon (41) auf die Aktivität der BVMO wurde untersucht,

indem man die Enzymlösung mit entweder 25 mM, 50 mM oder 100 mM Cyclohexanon (41)

versetzte und diese Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur rührte. Es zeigte sich, dass das

Keton 41 einen größeren negativen Einfluss auf die Aktivität der BVMO hat. Bei einer Konzentration

von 50 mM Cyclohexanon (41) sank die relative Aktivität auf 36% ab, bei einer Konzentration von

100 mM wurde sogar nur noch 21% erhalten (Abbildung 86). Das Keton 41 tritt in der Doppel-

oxidation allerdings nur als Zwischenprodukt auf, dessen Konzentration während der Reaktion sehr

gering ist und deshalb für die Prozessoptimierung vernachlässigbar.

Abbildung 86: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von Cyclohexanon (41)

Zuletzt wurde der Einfluss des Zielprodukts ε-Caprolacton (53) auf die Aktivität der BVMO getestet.

Hierbei wurde jeweils eine Enzymlösung mit entweder 0.1 M, 0.25 M, 0.5 M oder 1.0 M

ε-Caprolacton (53) versetzt und diese Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es konnte

kein Einfluss auf die Enzymaktivität bei einer Konzentration von 0.1 M ε-Caprolacton (53) festgestellt

werden, jedoch bei einer Konzentration von 0.25 M konnte eine deutliche Abnahme der Aktivität auf

8% nach 24 Stunden (Abbildung 87). Bei Verwendung der höheren Konzentrationen 0.5 M und 1.0 M

konnte keine Aktivität der BVMO beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stabilität der

BVMO durch Zugabe des Lactons 53 stark abnimmt.


100

Abbildung 87: Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen von ε-Caprolacton (53)

In Anbetracht dessen, dass das Lacton 53 sowohl inhibierend als auch negativ auf die Stabilität der

der BVMO wirkt, ist es für die Prozessoptimierung wichtig, Baeyer-Villiger-Monooxygenasen zu

identifizieren, die weniger oder gar von ε-Caprolacton (53) inhibiert oder deaktiviert werden.

Desweiteren muss nach geeigneten Methoden zur Entfernung des Zielprodukts während der

Reaktion geforscht werden, damit die Konzentration des Lactons 53 gering gehalten wird.

4.4 Zusammenfassung

Während dieser Doktorarbeit wurde die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zur

Synthese von ε-Caprolacton 53 in wässrigem Medium untersucht und ein „Proof of Concept“ erstellt.

Hierzu wurde der Alkohol 16 im ersten Schritt mit Hilfe einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus

kefir unter Reduktion des Cofaktors NADP+ zu Cyclohexanon (41) oxidiert, das sofort unter Oxidation

des zuvor entstandenen Cofaktors NADPH mit Hilfe der Baeyer-Villiger-Monooxygenase zum

Lacton 53 oxidiert wurde. Es wurde der Einfluss der eingesetzten Konzentration des Alkohols 16 auf

die Reaktion untersucht, wobei der Bereich von 20 mM bis 100 mM Substratkonzentration

untersucht wurde. Hierbei wurde bei einer Konzentration von 40 mM Cyclohexanol (16) mit einem

Umsatz von 97% das beste Ergebnis erzielt (Abbildung 88).[102,103]


101

Abbildung 88: „Proof of Concept“ für die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu

ε-Caprolacton (53)

Der Umsatz nahm bei den höheren Konzentrationen von 80 mM und 100 mM sukzessive auf 24% ab.

Deshalb wurden spektrophotometrisch die Inhibierung der Baeyer-Villiger-Monooxygenase und ihre

Stabilität intensiv untersucht. Es konnte hierbei eine deutliche Inhibierung und ein deutlicher

Stabilitätsverlust durch höhere Mengen des Zielprodukts ε-Caprolacton (53) auf die Baeyer-Villiger-

Monooxygenase beobachtet werden. Durch höhere Mengen des Alkohols 16 und des Ketons 41

konnte der gleiche Effekt beobachtet werden, jedoch im geringeren Ausmaß. Für die

Prozessoptimierung stellen die Mengen an Cyclohexanol (16) und Cyclohexanon (41) kaum ein

Problem dar, da der Alkohol 16 als Edukt zudosiert werden kann und die Cyclohexanon-

Konzentrationen während der Reaktion als vernachlässigbar betrachtet werden kann, da dieses

sofort zu ε-Caprolacton (53) umgesetzt werden kann. Ein Problem stellt die entstehende Menge an

Lacton 53 dar und für die Prozessoptimierung ist es wichtig, Baeyer-Villiger-Monooxygenasen zu

identifizieren, die weniger oder gar nicht vom Zielprodukt inhibiert oder deaktiviert werden. Ein

Augenmerk sollte auch auf einer geeignete Entfernung des Zielprodukts während der Reaktion sein

(in situ-product removal), um die Konzentration des Lactons 53 gering zu halten.

5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit enzymatischen Reduktionsreaktionen

102

5. Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen in Kombination mit

enzymatischen Reduktionsreaktionen

5.1 Einleitung

Die erste Bearbeitung dieses Themas erfolgte durch BORCHERT [11] und BURDA [13] aus dem Arbeitskreis

von Prof. Dr. GRÖGER. Aus den erzielten Ergebnissen ergaben sich die Fragen nach deren

Reproduzierbarkeit und nach weiteren Einflüssen (Einfluss der Proteinmenge, pH-Verläufe) auf die

Reaktion, deren Beantwortung Gegenstand dieser Arbeit war. Hierbei standen vor allem die beiden

Einzelreaktionen im Vordergrund. Die Biaryleinheit findet man z.B. in dem selektiven Kathepsin-K-

Inhibitor Odanacatib (97, Abbildung 89) wieder, der gegen Osteoporose eingesetzt wird. Das

Kathepsin K ist ein Enzym, das den Knochenabbau, insbesondere am Abbau der Proteinanteile in den

Knochen verantwortlich ist.[26]

Abbildung 89: Der Kathepsin-K-Inhibitor Odanacatib (97) [104]


5.2.1 Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen

In den 1970ern wurden die ersten Reaktionen zur Knüpfung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen

publiziert.[105-111] Diese Kohlenstoff-Kohlenstoff-Kupplungen bereicherten in großem Ausmaß die

organische Synthesechemie. Die Katalyse erfolgte über ein Übergangsmetall und Palladium-

katalysierte Kreuzkupplungen nahmen schnell an Bedeutung zu.[112] Im folgenden Kapitel werden

kurz die Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen Suzuki-, Negishi-, Stille- und Heck-Kupplung

und deren allgemeinen Mechanismus vorgestellt.


103

5.2.1.1 Bekannte Palladium-katalysierte Kupplungsreaktionen

Unter Metall-katalysierten Kupplungsreaktionen versteht man eine metallorganisch katalysierte

Kohlenstoff-Kohlenstoff-Knüpfung zwischen zwei verschiedenen Molekülen. Bei der Palladium-

katalysierten Kupplung ist das Metall des Katalysators Palladium. Es gibt verschiedene Palladium-

katalysierte Kupplungsreaktionen, die sich in der eingesetzten Organometallverbindung und in den

Edukten unterscheiden.[112] Die in dieser Arbeit betrachtete Suzuki-Kupplung wurde im Jahre 1979

unter SUZUKI entdeckt,[105,106] dessen Arbeit auf diesem Gebiet 2010 mit dem Nobelpreis für Chemie

gewürdigt wurde.[113] Die Suzuki-Kupplung ist eine Palladium-katalysierte Reaktion zur Alkenylierung

bzw. Arylierung von Bor-gebundenden Organylresten.[114] Hierbei werden Organoborverbindungen

mit organischen Elektrophilen, wie Aryl- oder Alkenylhalogeniden und -triflaten, in Anwesenheit

einer Base miteinander verknüpft.[115] Die Suzuki-Kreuzkupplung wird zur Synthese von

Biarylsystemen, wie in dieser Arbeit beschrieben, eingesetzt. Neben dieser Anwendung ist der

stereoselektive Aufbau von konjugierten Dienen und Polyenen von großer Bedeutung und spielt eine

Rolle bei der Synthese der Naturstoffe Dragmacidin F,[116] Michellamin B[117] und Diazonamid A.[118]

Die Suzuki-Kupplung zählt zu einer der am meisten angewendeten und zuverlässigsten Palladium-

katalysierten Kreuzkupplungsreaktionen, was auch daran liegen kann, dass die für die Suzuki-

Kreuzkupplung benötigten Organoborverbindungen leicht zu synthetisieren sind und darüber hinaus

eine hohe Beständigkeit gegenüber Luft und Wasser aufweisen. Es ergeben sich hieraus relativ milde

Reaktionsbedingungen und die entstehenden Nebenprodukte sind ungiftig.[119] Die nächste Reaktion

ist die ebenfalls 2010 mit dem Nobelpreis für Chemie gekrönte Negishi-Kupplung,[113] die 1977 unter

NEGISHI erstmals publiziert wurde. Hierbei werden Arylhalogenide oder –triflate mit Organozink-

verbindungen verknüpft.[107] Große Ähnlichkeit mit der Suzuki-Kupplung weist die Stille-Kupplung auf.

Hierbei handelt es sich um die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Kupplung einer Organozinnverbindung mit

einem Kohlenstoffelektrophil wie einem Alkylhalogenid.[108] Eine weitere bekannte Palladium-

katalysierte Kupplungsreaktion ist die von SONOGASHIRA entwickelte Sonogashira-Kupplung. Bei dieser

Reaktion werden Arylhalogenide mit endständigen Alkinen umgesetzt. Neben dem Palladium-

Katalysator wird ein Kupferhalogenid als weiterer Katalysator eingesetzt.[109,120]

5.2.1.2 Mechanismus der Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen

Die Palladium-katalysierten Kupplungsreaktionen haben einen allgemein gültigen Katalysezyklus der

aus den drei Schritten oxidative Addition, Transmetallierung und reduktive Eliminierung besteht. Bei

der oxidativen Addition handelt es sich um eine Umsetzung des Halogenids 99 mit einem

Palladium(0)-Komplex 98 unter Bildung der Palladium(II)-Spezies 100. Dabei wird der Palladium(0)-


104

Komplex 98 in die Kohlenstoff-Halogen-Bindung des Edukts insertiert.[94] Durch die Verwendung von

elektronenreichen Liganden im Palladium-Komplex wird die oxidative Addition begünstigt, da die

Insertion in die RX-Bindung erleichtert wird. Als Substrate eignen sich am besten Moleküle, die eine

schwache R-X-Bindungsenergie aufweisen.[120-124] Der nächste Schritt ist die Transmetallierung.

Voraussetzung hierbei ist die größere Affinität der Metalls M zu dem Liganden X, was auch die

Triebkraft der Reaktion darstellt.[125] Bei der Transmetallierung wird der Rest der

Organometallverbindung 101 auf das Palladium unter Bildung einer Palladium(II)-Spezies 102, die

beide zu verknüpfenden Reste enthält, übertragen. Desweiteren wird die stabile Metallhalogenid-

Verbindung 103 abgespalten.[94] Der letzte Schritt beinhaltet die reduktive Eliminierung zum Produkt

104 unter Regeneration des Katalysators zum Pd(0)-Komplex 98 (Abbildung 90).[94] Zwischen der

Transmetallierung und der reduktiven Eliminierung findet oft noch eine cis-trans-Isomerisierung

statt.[126]

Abbildung 90: Allgemein gültiger Katalysezyklus der Palladium-katalysierten

Kupplungsreaktionen [94,127]

Eine Ausnahme im Reaktionsmechanismus bildet die Heck-Reaktion, die mit dem Nobelpreis für

Chemie 2010 belohnt wurde.[113] Es handelt sich hierbei um die direkte Arylierung bzw. Vinylierung

von Olefinen. Bei dieser Reaktion sind ein Halogenid (meist ein Arylhalogenid) und ein Alken die

Edukte. Bei der Heck-Reaktion fällt der Schritt der Transmetallierung weg, stattdessen erfolgen eine

Olefin-Insertion und eine ß-Eliminierung des Arylpalladium-Komplexes unter Freisetzung des

substituierten Olefins.[110,111]


105

5.2.1.3 Suzuki-Kreuzkupplung

Die Suzuki-Kreuzkupplung ist eine Palladium-katalysierte Kreuzkupplung von Organoboran-

verbindungen 103a mit Aryl- oder Alkenylhalogeniden 99 unter Bildung einen C-C-verknüpften

Moleküls 104 (Abbildung 91).[94]

Abbildung 91: Allgemeine Reaktionsgleichung der Suzuki-Kreuzkupplung [94]

Im Folgenden ist der Katalysezyklus speziell für die Suzuki-Kreuzkupplung dargestellt (Abbildung 92).

Abbildung 92: Katalysezyklus der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung [94]

In dieser Arbeit wurde zuerst der Palladiumkatalysator aus dem Präkatalysator PdCl2 und dem

wasserlöslichen[128,129] Liganden TPPTS (105) gebildet (Abbildung 93).

Abbildung 93: Der wasserlösliche Ligand TPPTS (105) [129]


106

Bei der oxidativen Addition erfolgt die Umsetzung des Halogenids 99 mit dem Palladium(0)-Komplex

98 unter Bildung der Palladium(II)-Spezies 100. Bei der Suzuki-Kreuzkupplung findet bei der Trans-

metallierung ein Austausch der Liganden zwischen Palladium und Bor statt. Die in dieser Arbeit

verwendete Organoboranverbindung war Phenylboronsäure 101b und als Halogenid-Komponente

wurden entweder 4‘-Iodacetophenon (106) oder der korrespondierende Alkohol rac-4'-Iodphenyl-

ethan-1-ol (rac-107) eingesetzt. Das Natriumhydrogencarbonat wurde als Base in einem wässrigen

Medium eingesetzt. Die Herausforderung bestand darin, dass das als Edukt eingesetzte Keton 106

genau wie der in situ gebildete Alkohol 107 als Substrate für die Suzuki-Kupplung zur Verfügung

standen. Als Produkte der Suzuki-Kupplung wurden deshalb 4‘-Phenylacetophenon (108) bzw. rac-4´-

Biphenylethan-1-ol (rac-109) erhalten (Abbildung 94).

Abbildung 94: Mögliche Produkte aus der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bzw. rac-4'-

Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)

5.2.2 Enzymatische Reduktion von Ketonen zur Synthese stereoselektiver Alkohole

Für die Reduktion von prochiralen Ketonen zur Synthese chiraler sekundärer Alkohole werden

Alkoholdehydrogenasen eingesetzt (Abbildung 95). Die Reduktionsreaktion, bei der ein

Wasserstoffatom und zwei Elektronen von NADPH auf das Keton übertragen werden, ist

hochenantioselektiv.[1]

Abbildung 95: Stereoselektive Reduktion von prochiralen Ketonen zu sekundären chiralen Alkoholen


107

Bei Verwendung der (R)-selektiven Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir wird der

korrespondierende (R)-Alkohol gebildet.[65] Die Herausforderung bestand darin, dass sowohl das in

situ gebildete Keton 108 als auch das als Edukt eingesetzte Keton 106 während der Tandem-Reaktion

als Substrate für die biokatalytische Reduktion zur Verfügung standen. Das 4‘-Iodacetophenon (106)

konnte mit Hilfe der LK-ADH zum korrespondierenden (R)-Alkohol (R)-107 reduziert werden

(Abbildung 96).

Abbildung 96: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) durch die Verwendung der

(R)-selektiven LK-ADH

Das aus der Suzuki-Kupplung entstehende 4‘-Phenylacetophenon (108) wurde von der LK-ADH zum

korrespondierenden (R)-Alkohol (R)-109 umgesetzt (Abbildung 97).

Abbildung 97: Enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (107) durch die Verwendung der

(R)-selektiven LK-ADH

5.3 Ziel der Arbeit

Die Herausforderung bestand hierbei, dass die in der Tandem-Reaktion kombinierten

Einzelreaktionen verschiedene pH-Optima haben. Der pH-Bereich für enzymkatalysierte Reaktionen

liegt für gewöhnlich bei pH 5 bis 8, wobei das Optimum oftmals bei pH 7 liegt.[4] Im Gegensatz dazu

ist die Suzuki-Kreuzkupplung eine basenkatalysierte Reaktion mit einem pH-Optimum im alkalischen

Bereich.[105,106] Durch die Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der

enzymatischen Reduktion in Form einer Tandem-Reaktion können chirale Alkohole wie z.B. (R)-4´-

Biphenylethan-1-ol ((R)-109) aus einem Keton wie z.B. 4‘-Iodacetophenon (106) hergestellt werden.

Das Edukt 4‘-Iodacetophenon (106) konnte sowohl biokatalytisch mit einer (R)-selektiven ADH zum

(R)-4'-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107) reduziert, als auch metallkatalytisch durch die Suzuki-Kupplung


108

zu 4‘-Phenylacetophenon (108) umgesetzt werden. Mit Hilfe einer (R)-selektiven ADH konnte das

Keton 108 dann biokatalytisch zu (R)-4´-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) reduziert werden, während der

chirale Alkohol (R)-107 durch die Suzuki-Kupplung zum chiralen Endprodukt (R)-4´-Biphenylethan-1-

ol ((R)-109) umgesetzt werden konnte (Abbildung 98).


Reduktion

Chirale Alkohole sind wichtige Bausteine für die Pharmaindustrie und daher von großer

Bedeutung.[124]Auch bei Naturstoffsynthesen findet die Suzuki-Kreuzkupplung Anwendung, z.B. bei

dem hocheffizienten Aufbau des Gerüsts von Palytoxin, das KISHI et al. 1989 vorgestellt haben.[125,130]

Dieses Gift kann aus der Weichkoralle der Gattung Palythoa gewonnen werden.[130] In dieser Arbeit

wurde der Einfluss der Proteinmenge auf beide Reaktionen und die pH-Verläufe untersucht, um ein

besseres Verständnis für den Ablauf der Reaktion zu bekommen.

5.4 Ergebnisse und Diskussion

5.4.1 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von 4´-Iodacetophenon zur Synthese von 4´-

Phenylacetophenon

Sowohl das als Edukt eingesetzte Keton 106 wie auch der während der Tandem-Reaktion in situ

gebildete Alkohol 107 standen als Reaktionspartner für die Phenylboronsäure 101b zur Verfügung.

Als Produkte der Suzuki-Kupplung wurden für das Edukt 4‘-Iodacetophenon (106) dementsprechend

4‘-Phenylacetophenon (108) (Abbildung 99) bzw. für das in situ gebildete Edukt rac-4'-Iodphenyl-

ethan-1-ol (rac-107) wurde das korrespondierende rac-4´-Biphenylethan-1-ol (rac-109) erhalten. Auf


109

Grund dessen wurde die Suzuki-Kupplung für beide Edukte unter verschiedenen Gesichtspunkten

untersucht. Der Katalysator für die Suzuki-Kreuzkupplung wurde aus PdCl2 und dem wasserlöslichen

Liganden TPPTS 105 generiert.


5.4.1.1 Benchmark

Der Benchmark-Versuch [11] (Abbildung 100) war eine Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon

(106) mit Phenylboronsäure (101b) unter Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (108). Die Reaktion

wurde in einem geschlossenen 10 ml Rundkolben über 24 Stunden bei Raumtemperatur und

400 rpm Rührgeschwindigkeit durchgeführt. Das Reaktionsmedium bestand aus wässriger Natrium-

hydrogencarbonat-Lösung und Isopropanol in einem Mischungsverhältnis von 1:1. Es wurden 4 mol%

PdCl2 und 5 mol% TPPTS (105) als Katalysator eingesetzt. Hierbei wurde vollständiger Umsatz

erreicht.

Abbildung 100: Benchmark der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit

Phenylboronsäure (101b)


110

5.4.1.2 Einfluss der Proteinkonzentration

Das Ziel war die Tandemreaktion, d.h. die Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und

biokatalytischer Reduktion. Durch die Verwendung einer Alkoholdehydrogenase wurde eine Menge

an Protein in die Reaktion eingebracht. Es war daher notwendig, zu klären, ob die zugesetzte

Proteinmenge einen Einfluss auf die Suzuki-Kupplung des Ketons 106 mit Phenylboronsäure 101b

hat. Die Proteinkonzentration wurde durch die Zugabe von HSA auf 0 bis 10 g/l eingestellt. Bei

steigender Proteinkonzentration nahm der vollständige Umsatz ohne Protein bis auf 50% bei einer

Zugabe von 10 g/l Proteinkonzentration ab. Bei Zugabe der Konzentration von 1.0 g/l Protein wurde

noch vollständiger Umsatz erzielt. Das Ziel war es, in der Tandemreaktion die Proteinmenge gering zu

halten, um den größtmöglichen Umsatz zu erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 31 dargestellt.


(106)

Eintraga HSA [g/l] Umsatz [%]

1 0 >95

2 1 >95

3 5 82

4 10 50 asiehe AAV 19.

Anhand der untenstehenden Grafik (Abbildung 101) konnte verdeutlicht werden, wie sehr die

Proteinzugabe die Suzuki-Reaktion inhibiert. Der optimale Proteinkonzentration für die Tandem-

Reaktion lag in dem Bereich zwischen 1.0 g/l und 2.5 g/l und die Menge an Alkoholdehydrogenase

wurde dementsprechend in der Tandem-Reaktion angepasst.


111

Abbildung 101: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von

4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenylboronsäure (101b)

5.4.1.3 Einfluss der Reaktionszeit

4‘-Iodacetophenon (106) war ein sehr gutes Substrat für die Suzuki-Kupplung, da bereits nach

24 Stunden vollständiger Umsatz erzielt wurde. Es wurde daraufhin getestet, wie schnell diese

Reaktion beendet ist und deshalb wurde die Reaktion bei einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden

abgebrochen und aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 dargestellt.

Tabelle 32: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)

Eintraga Reaktionszeit [h] Umsatz [%]

1 5.5 89

2 24.0 >95 asiehe AAV 19.

Hierbei wurde nach einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden ein sehr guter Umsatz von 89% erzielt, was

beweist, dass die Reaktion schnell abläuft und die Vermutung, dass 4‘-Iodacetophenon (106) ein sehr

gutes Substrat ist, wurde bestätigt.


112

5.4.1.4 pH-Verlauf der Reaktion

Im Zuge der Untersuchung auf den Einfluss der Reaktionszeit wurden parallel die pH-Verläufe der

Reaktionen, deren Ergebnisse in Eintrag 1 und 2 der Tabelle 32 zu finden sind, mit Hilfe eines pH-

Meters detektiert (Abbildung 102).

Abbildung 102: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)

Hierbei wurde zuerst ein deutlicher Abfall des pH-Werts von 8.54 auf 8.18 bei einer Reaktionszeit von

24 Stunden bzw. von 8.56 auf 8.24 bei 5.5 Stunden Reaktionszeit verzeichnet. Anschließend stieg der

pH-Wert kontinuierlich auf 8.77 nach 5.5 Stunden und auf 9.94 nach 24 Stunden an. Der Anstieg des

pH-Werts nach Ende der Reaktion ist durch die Reaktion von NaHCO3 zu NaOH und CO2 zu

begründen. Die Ergebnisse die pH-Verläufe der Reaktionen von Tabelle 32, Eintrag 1 und 2 sind in

Tabelle 33 dargestellt. Hierbei wurde bei einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden ein Umsatz von 89%

zum 4‘-Phenylacetophenon (108) erhalten und bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden konnte ein

vollständiger Umsatz erzielt werden.

Tabelle 33: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) bei verschiedenen

Reaktionszeiten


113

Eintraga Zeit pH-Wert bei 24 h

Reaktionszeit pH-Wert bei 5.5 h

Reaktionszeit

1 IPA + NaHCO3 + 106 9.48 9.39

2 + 101b 9.30 9.25

3 mit Katalysator 0 h 8.54 8.56

4 2.0 h 8.18 8.24

5 4.0 h 8.31 8.48

6 5.5 h 8.79 8.74

7 7.0 h 8.80

8 24.0 h 9.94 asiehe AAV 19.

5.4.2 Suzuki-Kreuzkupplungsreaktion von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol zur Synthese

von rac-4´-Biphenylethan-1-ol

Wie in dem Kapitel 5.2.1.3 bereits angedeutet, stand in der Tandem-Reaktion neben dem

4‘-Iodacetophenon (106) als Edukt auch noch das bereits reduzierte rac-4`-Iodphenylethan-1-ol

(rac-107) als Kupplungspartner zur Verfügung. Bei der Verwendung des racemischen Alkohols

rac-107 als Edukt wurde in der entsprechenden Suzuki-Reaktion rac-4‘-Biphenylethan-1-ol (rac-109)

synthetisiert (Abbildung 103).

Abbildung 103: Suzuki-Kreuzkupplung von rac- 4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit

Phenylboronsäure (101b)

5.4.2.1 Natriumborhydrid-Reduktion zur Synthese von rac-4´-Iodphenylethan-1-ol

Am Anfang wurde der racemische Alkohol rac-107 durch eine Reduktion des kommerziell

erwerblichen 4‘-Iodacetophenons (106) mit Natriumborhydrid (110) in Methanol hergestellt. Hierbei

wurde vollständiger Umsatz innerhalb von 24 Stunden bei Raumtemperatur erzielt (Abbildung 104).


114

Abbildung 104: Synthese des racemischen Alkohols rac-107 durch Reduktion des Ketons 106 mit

Natriumborhydrid (110)

5.4.2.2 Einfluss der Reaktionszeit

Das rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) war gegenüber dem Keton 106 das nicht favorisierte Edukt

für die Suzuki-Kupplung. Dementsprechend wurden nach 48 Stunden Reaktionszeit bei

Raumtemperatur maximal 80% und nach 24 Stunden maximal 75% Umsatz zu dem racemischen

Alkohol 4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) erreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 34 dargestellt.


(rac-107)

asiehe AAV 21, b

Wiederholungsversuch zu 1a zur Validierung, cWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung

Eintraga Reaktionszeit [h] Umsatz [%]

1a 24 75

1bb 24 69

2a 48 80

2bc 48 71

2cb 48 78


115

5.4.2.3 Einfluss der Proteinmenge

Der Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kupplung von rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit

Phenylboronsäure (101b) zu dem racemischen Alkohol rac-109 war sehr deutlich. Durch die

steigende Proteinmenge in Form von HSA nahm der Umsatz von 80% ohne Protein bis auf nur noch

11% bei einer Konzentration von 10 g/l Protein ab. Der Rückgang des Umsatzes war mit maximal 75%

bei 1.0 g/l HSA-Konzentration sehr gering, aber bei einer Konzentration von 5 g/l mit einem Umsatz

von 51% zeichnete sich bereits der negative Einfluss auf die Reaktion ab. Auch hier gilt es, die

Proteinmenge in der Tandemreaktion gering zu halten, um den größtmöglichen Umsatz zu erzielen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 35 dargestellt.


Iodphenylethanol (rac-107)

asiehe AAV 21, b

Wiederholungsversuche zu 1a zur Validierung, cWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung,

dWiederholungsversuch zu 3a zur Validierung

Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung 105 graphisch dargestellt.

Eintraga HSA [g/l] Umsatz [%]

1a 0 80

1bb 0 71

1cb 0 78

2a 1 75

2bc 1 71

3a 5 51

3bd 5 51

4 10 11


116

Abbildung 105: Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung von rac-4‘-Iodphenylethanol

(rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)

5.4.3 Enzymatische Reduktion von 4´-Iodacetophenon unter Verwendung einer

Alkoholdehydrogenase

Die enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) zu (R)-4‘-Iodphenylethanol ((R)-107)

erfolgte durch Verwendung der (R)-selektiven Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir. Durch

den Einsatz von Isopropanol (IPA, 30) im Reaktionsmedium konnte hier auf eine substratgekoppelte

Cofaktorregenerierung zurückgegriffen werden. Der anfänglich eingesetzte Cofaktor NADP+ wurde

durch die Oxidation des Alkohols 30 zu Aceton (31) durch die LK-ADH in das für die Reduktion des

Ketons 106 benötigte NADPH umgewandelt. Bei der Reduktion zum Alkohol (R)-107 wurde der

reduzierte Cofaktor NADPH wieder in seine oxidierte Form NADP+ umgewandelt und somit konnte

ein weiterer Katalysezyklus von Neuem beginnen (Abbildung 106). In diesem Kapitel wurde die

Abhängigkeit von der eingesetzten Proteinkonzentration, die auf 1.0 g/l bzw. 2.5 g/l festgesetzt

wurde, auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) und der pH-Verlauf während

dieser Reaktion untersucht. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralcel® OJ-H,

Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Ein Ausschnitt eines HPLC-

Chromatogramms von racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-107) mit der Chiralcel® OJ-H-Säule ist

in Abbildung 107 dargestellt.


117

Abbildung 106: Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Hilfe der LK-ADH

Abbildung 107: Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ol

(rac-107) mit der Chiralcel® OJ-H-Säule


118

5.4.3.1 Einfluss der Proteinkonzentration

Es wurde der Einfluss der Proteinkonzentration, die auf 1.0 g/l und 2.5 g/l festgesetzt wurde, auf die

biokatalytische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) untersucht. Hierbei wurden vollständige

Umsätze für Proteinkonzentrationen von 1.0 g/l und 2.5 g/l (aus der LK-ADH) in 48 Stunden bei

Raumtemperatur erzielt (Tabelle 36).

Tabelle 36: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-

Iodacetophenon (106)

Eintraga Proteinkonzentration [g/l] ee [%] Umsatz [%]

1a 1.0 >99 >95

1bb 1.0 >99 >95

2a 2.5 >99 >95

2bc 2.5 >99 95

asiehe AAV 22,

bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,


5.4.3.2 pH-Verlauf der Reaktion

Im Zuge der Untersuchung auf den Einfluss der Proteinkonzentration wurden parallel die pH-Verläufe

der Versuche 1a und 2a aus Tabelle 36 der Reaktionen mit Hilfe eines pH-Meters detektiert. Die

graphische Auftragung ist in Abbildung 108 und die Daten sind in Tabelle 37 dargestellt.


119

Abbildung 108: pH-Verlauf der enzymatischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106)

Der pH-Wert wurde durch die Zugabe des Enzyms erwartungsgemäß niedriger. Der Abfall des pH-

Werts von 9.49 auf 8.74 war aufgrund der größeren Verdünnung der Reaktionslösung für eine

Proteinkonzentration von 2.5 g/l Protein größer als der Abfall des pH-Werts von 9.41 auf 9.06 für

eine Konzentration von 1.0 g/l. Durch Zugabe von NADP+ sank der pH-Wert nochmal. Anschließend

stieg der pH-Wert kontinuierlich auf im Mittel 10.16 an. Die pH-Verläufe der Versuche 1a und 2a aus

Tabelle 36 sind in Tabelle 37 dargestellt. Bei beiden Messungen wurde das Produkt 4‘-Iod-

phenylethan-1-ol (rac-107) mit einem Umsatz von über 95% und einem ee-Wert von über 99%

erhalten.

Tabelle 37: pH-Verläufe der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei

unterschiedlichen Mengen von LK-ADH


120

Eintraga Zeit pH-Wert bei 1.0 g/l

Proteinkonzentration pH-Wert bei 2.5 g/l

Proteinkonzentration

1 IPA + NaHCO3 + 106 9.41 9.49

2 mit Enzym 9.06 8.74

3 mit NADP+ 8.66 8.40

4 2.0 h 9.11 8.80

5 4.0 h 9.44 9.19

6 4.75 h 9.52 9.35

7 21.0 h 10.05 9.77

8 24.0 h 10.07 9.81

9 26.0 h 10.09 9.86

10 45.0 h 10.18 10.13

11 48.0 h 10.17 10.14

asiehe AAV 22

5.4.4 Enzymatische Reduktion von 4´-Phenylacetophenon unter Verwendung einer


Bei der biokatalytische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (108) wurde die Abhängigkeit von der

eingesetzten Proteinkonzentration, die auf 1.0 g/l bzw. 2.5 g/l festgesetzt wurde, untersucht. Hierbei

wurde ein Umsatz von durchschnittlich 53% bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l und von

durchschnittlich 66% bei einer Konzentration von 2.5 g/l in 48 Stunden erzielt. Es war klar erkennbar,

dass das Keton 108 das schlechtere Edukt in der biokatalytischen Reduktion war, als das bereits

getestete Keton 106, mit dem bei gleicher Reaktionszeit Umsätze über 95% für 1.0 g/l und 2.5 g/l

Proteinkonzentration erzielt wurden. Die Erhöhung der Proteinkonzentration von 1.0 g/l auf 2.5 g/l

hatte einen positiven Einfluss auf die Reaktion, so dass im Durchschnitt 13% mehr Umsatz bei

höherer Proteinmenge erreicht wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 38 dargestellt.


121

Tabelle 38: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von

4‘-Phenylacetophenon (108)

Eintraga Proteinkonzentration [g/l] ee [%] Umsatz [%]

1a 1.0 >99 50

1bb 1.0 >99 56

2a 2.5 >99 64

2bc 2.5 >99 67

asiehe AAV 22,



Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v),

0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Ein Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen

4‘-Biphenylethan-1-ol (rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule ist in der folgenden Abbildung 109

dargestellt.


122


(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule

5.4.5 Tandemreaktionen der Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen

Reduktion

Durch die Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen

Reduktion in Form einer Tandem-Reaktion können chirale Alkohole hergestellt werden

(Abbildung 110). Chirale Alkohole sind wichtige Bausteine für die Pharmaindustrie und daher von

großer Bedeutung.[26] Das Edukt 4'-Iodacetophenon (106) wurde sowohl bei der Suzuki-Kupplung als

bei der Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) am schnellsten

umgesetzt. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v),

0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Ein Ausschnitt eines HPLC-Chromatogramms von racemischen

4‘-Biphenylethan-1-ol (rac-109) mit der Chiralpak® IB-Säule ist in Abbildung 111 dargestellt.


123


Reduktion


(rac-109) mit der Chiralpak® AD-H-Säule


124

5.4.5.1 Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration

In der Tandem-Reaktion mit dem Rohextrakt der LK-ADH wurde der gewünschte Biphenylalkohol

(R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) sowohl bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l als auch für

eine Konzentration von 2.5 g/l mit einem Umsatz von 24% erhalten. Der Gesamtumsatz lag bei

beiden Reaktionen über 95%. Bei Einsatz der geringeren Proteinmenge fiel auf, dass das bei der

Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) entstehende 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem

Umsatz von 64% gebildet wurde und das bei der biokatalytischen Reduktion des Ketons 106

entstehende (R)-4'-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107) nur zu 12% erhalten wurde. Die Suzuki-Kupplung

war bei geringeren Proteinkonzentrationen die klar schnellere Reaktion. Bei Einsatz einer Protein-

konzentration von 2.5 g/l wurde das bei der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) Keton 108

mit 6% Umsatz erhalten, während bei der biokatalytischen Reduktion des Ketons 106 ein Umsatz von

52% zu verzeichnen war. Die biokatalytische Reduktion war bei höheren Proteinkonzentrationen die

klar schnellere Reaktion, allerdings bildeten sich bei der höheren Proteinkonzentration auch verstärkt

Nebenprodukte (18%). Die Strukturen der Nebenprodukte sind nicht bekannt und der Einfluss dieser

Verbindungen muss noch besser untersucht werden, was aber nicht Gegenstand dieser Promotion

war. Alle Ergebnisse sind in Tabelle 39 dargestellt.

Tabelle 39: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion


125

Eintraga Protein-

konzentration [g/l]

Umsatz zu 108

[%]

Umsatz zu (R)-107

[%]

Umsatz zu (R)-109

[%] ee [%]

Gesamtumsatz [%]

1 1.0 42 23 35 >99 >95

2 2.5 6 52 24 >99 >95

asiehe AAV 23.

5.4.5.2 pH-Verlauf der Reaktionen

Im Zuge der Untersuchung auf den Einfluss der Proteinmenge wurden parallel die pH-Verläufe der

Versuche 1 und 2 aus Tabelle 39 mit Hilfe eines pH-Meters detektiert. Die graphische Auftragung ist

in Abbildung 112 dargestellt.

Abbildung 112: pH-Verläufe der Tandem-Reaktion bei unterschiedlichen Mengen an LK-ADH

Der pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Konzentration von 1.0 g/l mit einer Erniedrigung des

pH-Werts von 8.68 auf 8.46 mit anschließendem kontinuierlichen Anstieg auf 9.38 nach 48 Stunden

glich dem Verlauf für die Suzuki-Kupplung. Bei einer Konzentration von 2.5 g/l verhielt sich der pH-

Verlauf erst durch einen Anstieg von pH 8.23 auf 8.84 wie bei der biokatalytischen Reduktion, aber

anschließend war auch hier eine Erniedrigung des pH-Werts von 8.84 auf 8.64 zu verzeichnen, was

charakteristisch für die Suzuki-Kupplung war. Durch die höhere Menge von Enzym wurde die


126

biokatalytische Reduktion favorisiert. Das Ergebnis für den pH-Verlauf der Tandem-Reaktionen bei

einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l (vgl. Eintrag 1, Tabelle 39) ist in Tabelle 40 dargestellt. Es

wurde hierbei ein Umsatz von 42% zu 4‘-Phenylacetophenon (108), ein Umsatz von 23% mit einem

ee-Wert von über 99% zum Alkohol (R)-107) und ein Umsatz von 35% zu (R)-4'-Biphenylethan-1-

ol ((R)-109) bei einem Gesamtumsatz von über 95% erhalten.

Tabelle 40: pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l

Eintraga Zeitablauf pH-Wert

1 nach Zugabe von IPA + NaHCO3 + 106 9.34

2 nach Zugabe des Katalysators 9.00

3 nach Zugabe des Enzyms 8.80

4 nach Zugabe von NADP+ 8.68

5 2.0 h 8.46

6 3.5 h 8.69

7 5.0 h 8.74

8 24.0 h 8.39

9 25.75 h 8.83

10 28.0 h 9.04

11 30.0 h 9.15

12 48.0 h 9.38 asiehe AAV 23

Das Ergebnis für den pH-Verlauf der Tandem-Reaktion bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l (vgl.

Eintrag 2, Tabelle 39) ist in Tabelle 41 dargestellt. Es wurde hierbei ein Umsatz von 6% zu

4‘-Phenylacetophenon (108), ein Umsatz von 52% mit einem ee-Wert von über 99% zum Alkohol

(R)-107 und ein Umsatz von 24% zu (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) bei einem Gesamtumsatz von

über 95% erhalten.


127







5 2.0 h 8.84

6 4.0 h 8.64

7 6.0 h 8.61

8 22.0 h 8.57

9 24.0 h 8.82

10 28.0 h 8.98

11 46.0 h 9.15

12 48.0 h 9.16 asiehe AAV 23.

5.4.5.3 Einfluss des einsetzten Cofaktors

Die Abhängigkeit von der Menge des eingesetzten Cofaktors auf die Tandem-Reaktion wurde

untersucht. Bei einer Proteinkonzentration 1.0 g/l fand keine biokatalytische Reduktion in

Abwesenheit des Cofaktors statt: es wurde mit über 95% Umsatz nur das Kupplungsprodukt 4‘-

Phenylacetophenon (108) erhalten. Bei Zusatz von 0.06 Äquivalenten NADP+ fand stattdessen die

biokatalytische Reduktion mit einem Umsatz von 23% zu (R)-4'-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107) und

von 35% zu (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) bei einem Gesamtumsatz von über 95% statt. Die

vorhandene Menge Cofaktor bei einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l reichte nicht aus, um die

enzymatische Reduktion zu katalysieren, so dass der Cofaktor auf jeden Fall eingesetzt werden

musste. Anders verhielt es sich bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l. Hier fand die

enzymatische Reduktion in Abwesenheit eines zugesetzten Cofaktors mit einem Umsatz von 12% zu

dem Alkohol (R)-107 und von 24% zu dem Biphenylalkohol (R)-109 bei einem Gesamtumsatz von 77%

statt. Die Menge an Cofaktor bei einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l reichte aus, um eine

enzymatische Reduktion zu katalysieren, doch mussten Einbußen im Gesamtumsatz in Kauf

genommen werden. In Anwesenheit von 0.06 Äquivalenten NADP+ bei einer Proteinkonzentration


128

von 2.5 g/l lag der Gesamtumsatz bei über 95% mit 52% Umsatz zum Alkohol (R)-107 und mit 24%

zum Biphenylalkohol (R)-109 (Tabelle 42).

Tabelle 42: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion

Eintraga NADP+

[Äq.]

Protein-konzentration

[g/l]

Umsatz zu 108

[%]

Umsatz zu (R)-107

[%]

Umsatz zu (R)-109 [%]

Gesamtumsatz [%]

1 0 1.0 >95 n.d. n.d. >95

2 0.06 1.0 42 23 35 >95

3 0 2.5 64 12 24 77

4 0.06 2.5 6 52 24 >95

asiehe AAV 23


129

5.6 Zusammenfassung

5.6.1. Suzuki-Kupplung

5.6.1.1 Benchmark-Versuch

Es wurde ein vollständiger Umsatz der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit Phenyl-

boronsäure (101b) zu 4‘-Phenylacetophenon (108) in einer Reaktionszeit von 24 Stunden zu erzielt

(Abbildung 113). Diese Ergebnisse deckten sich mit den von BORCHERT erzielten Ergebnissen.[11,131] Die

Reaktion lief sehr schnell ab und nach einer Reaktionszeit von 5.5 Stunden wurden bereits 89%

Umsatz erhalten.


unter Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem Umsatz von über 95%

Bei der Suzuki-Kupplung des racemischen Alkohols rac-107 mit Boronsäure 101b zu dem racemischen

Biphenylalkohol rac-109 wurde ein Maximalumsatz von 80% bei einer Reaktionszeit von 48 Stunden

erzielt. Dies bestätigte die Ergebnisse von BORCHERT [131] und bewies, dass das Keton 106 ein besseres

Edukt für die Suzuki-Kupplung als rac-4‘-Iodphenylethan-1-ol (rac-109) war.

5.6.1.2 Einfluss der Proteinmenge auf die Suzuki-Kupplung

Desweiteren wurde auf diese Reaktion ein negativer Einfluss durch die Erhöhung der zugesetzten

Proteinkonzentration in Form von HSA beobachtet. Bei Einsatz des Ketons 106 als Substrat nahm der

vollständig erzielte Umsatz ohne Protein bei steigender Proteinmenge bis auf 50% bei einer

Proteinkonzentration von 10.0 g/l ab. Hierbei wurde bei einer Konzentration von 1.0 g/l Protein noch

vollständiger Umsatz erzielt. Auch bei Verwendung des racemischen Alkohols rac-107 als Edukt

wurde auf diese Reaktion ein negativer Einfluss durch die Erhöhung der Proteinkonzentration in

Form von HSA beobachtet. Bei steigender Konzentration des Proteins nahm der Umsatz ohne Protein

von 80% bis auf 11% bei einer Produktkonzentration von 10.0 g/l ab (Abbildung 114).


130

Abbildung 114: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-

Iodacetophenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)

5.6.2 Enzymatische Reduktion

Bei der enzymatischen Reduktion des Ketons 106 mit einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus

kefir und Substrat-gekoppelter in situ-Cofaktorregenerierung durch Verwendung von Isopropanol

(30) im Reaktionsmedium wurde ein Umsatz von 97% zum enantiomerenreinen Alkohol (R)-107 in

einer Reaktionszeit von 48 Stunden bei Raumtemperatur erhalten. Hierbei wurde eine Protein-

konzentration von 1.0 g/l in Form der LK-ADH und 0.06 Äquivalente des Cofaktors NADP+ eingesetzt.

Bei der enzymatischen Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (108) mit einer Alkoholdehydrogenase

aus Lactobacillus kefir wurde mit 67% der beste Umsatz zum enantiomerenreinen Biphenylalkohol

(R)-109 erzielt. Die Reaktionszeit betrug 48 Stunden und die Reduktion wurde bei Raumtemperatur

durchgeführt. Es wurde hierbei eine Proteinkonzentration von 2.5 g/l in Form der LK-ADH und

0.06 Äquivalente des Cofaktors NADP+ eingesetzt.

5.6.3. Tandem-Reaktion

Das beste Ergebnis in Bezug auf den Erhalt des (R)-Biarylalkohols (R)-109 wurde mit dem Keton 106

als Substrat und einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l in Form der LK-ADH über einen Reaktions-

zeitraum von 48 Stunden mit einer Substratkonzentration von 40 mM erreicht. Die biokatalytische

Reduktion fand mit einem Umsatz von 23% zu dem (R)-Alkohol (R)-107 und von 35% zu dem

(R)-Biphenylalkohol (R)-109 bei einem Gesamtumsatz von über 95% statt. Bei beiden Reduktionen

wurde ein ee-Wert von über 99% erreicht. Die Suzuki-Kreuzkupplung lieferte mit einem Umsatz von


131

42% das Keton 108 und mit 35% das gewünschte (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) bei einem

Gesamtumsatz von über 95% (Abbildung 115).

Abbildung 115: Tandem-Reaktion mit 4‘-Iodacetophenon (106) als Substrat zur Herstellung des

gewünschten (R)-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109)

6. Zusammenfassung

132

6. Zusammenfassung

In dieser Doktorarbeit ist es gelungen, eine Reihe von „Proof of Concepts“ für Eintopfsynthesen unter

Einsatz von Biokatalysatoren in wässrigem Medium zu erbringen. Die untersuchten Syntheseprozesse

umfassten neuartige biokatalytische Verfahren zur Hydroxylierung von kurzkettigen n-Alkanen

insbesondere vom Flüssiggas n-Butan (65), zur Doppeloxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen

sowie von Cyclohexanol (16) zu ε-Caprolacton (53) und zur Kombination einer metallkatalysierten

Reaktion am Beispiel der Suzuki-Kreuzkupplung mit einer biokatalytischen Reduktion. Die Ergebnisse

dieser Arbeit sind in diesem Kapitel zusammengefasst.

6.1 Biokatalytische Hydroxylierung von n-Alkanen zur Synthese von Alkoholen durch

Einsatz einer P450-Monooxygenase

Hierbei stand die Etablierung eines Verfahrens im wässrigen Medium zur biokatalytischen

Hydroxylierung von n-Alkanen wie n-Oktan (64) und n-Butan (65) mit einer P450-Monooxygenase im

Vordergrund (Abbildung 116). Von besonderer Bedeutung war die biokatalytische Hydroxylierung

des Flüssiggases n-Butan (65) zu 2-Butanol (35), einer Bulkchemikalie.

Abbildung 116: Biokatalytische Hydroxylierung der n-Alkane 64 und 65 zu den korrespondierenden

Alkoholen

Bei der Hydroxylierung von n-Alkanen wird unter Verbrauch von NADPH und Einsatz einer

P450-Monooxygenase aus Bacillus megaterium der korrespondierende Alkohol gebildet. Eine in situ-

Cofaktorregenerierung durch Einsatz von D-Glucose und Glucosedehydrogenase (GDH) reduziert das

bei der Hydroxylierung entstehende NADP+ wieder zum benötigten NADPH. Einleitende Versuche zur

Hydroxylierung von n-Alkanen wurden mit dem Substrat 64 durchgeführt, für das durch den Einsatz

6. Zusammenfassung

133

F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3, einer Substratkonzentration von 20 mM und oben

beschriebener in situ-Cofaktorregenerierung in Phosphatpuffer pH 7.0 eine Produktbildung von

0.47 g/l erreicht wurde (Abbildung 117).

Abbildung 117: Biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)

Die biokatalytische Hydroxylierung des bei Raumtemperatur gasförmigen n-Butans (65) zu

2-Butanol (35) mit einer P450-Monooxygenase und dem in situ-Cofaktorregenerierungssystem mit

einer GDH wurde im Hinblick auf den Einfluss der Reaktionstemperatur und der eingesetzten

Mutante der P450-Monooxygenase untersucht. Aufbauend auf diesem Ergebnis für das Substrat 64

wurde für das Substrat 65 mit dem gleichen System der Cofaktorregenerierung unter Einsatz der

19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 und einer Reaktionstemperatur von 0°C für die

ersten 8 Stunden sowie anschließendem langsamen Erwärmen auf Raumtemperatur eine Umsetzung

zu dem Alkohol 35 mit einer Produktbildung von 0.16 g/l erreicht (Abbildung 118).

Abbildung 118: Biokatalytische Hydroxylierung des Flüssiggases n-Butan (65) zu 2-Butanol (35)

6. Zusammenfassung

134

6.2 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan zur Synthese von Cyclooktanon

durch die Kombination einer P450-Monooxygenase mit einer


Das Ziel war die biokatalytische Direktoxidation von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen mit

Luftsauerstoff im wässrigen Medium in Form einer Eintopf-Zweistufen-Synthese. Im ersten Schritt

wurde das Modellsubstrat Cyclooktan (73) unter Oxidation des Cofaktors NADPH zu NADP+ durch

eine P450-Monooxygenase zum Cyclooktanol (74) hydroxyliert. In der zweiten Stufe der Reaktion

wurde der cyclische Alkohol 74 mit Hilfe einer Alkoholdehydrogenase zum Cyclooktanon (75) unter

Reduktion des zuvor bei der Hydroxylierung gebildeten NADP+ zu NADPH oxidiert. Als

umweltfreundliches Oxidationsmittel fungierte molekularer Sauerstoff in Form von Luft. Zudem

ermöglichte dieses Konzept den Verzicht auf den Zusatz eines Cosubstrats (Abbildung 119).

Abbildung 119: Biokatalytische Doppeloxidation des Cycloalkans 73 zum Cycloalkanon 75

Gerade im Hinblick auf die festgestellte Flüchtigkeit der Cycloalkane war die Entwicklung einer

aussagekräftigen Bestimmungsmethode zur Erfassung des Umsatzes von hoher Priorität. In dieser

Arbeit konnte eine valide Analytik zur Lösung dieser Herausforderung erfolgreich etabliert werden.

Die biokatalytische Doppeloxidation des Modellsubstrats Cyclooktan (73) zur Synthese von

Cyclooktanon (75) wurde auf die Abhängigkeit von einem zusätzlichen Additiv, von der

Reaktionstemperatur, von der Reaktionszeit, von der Substratkonzentration und von der

eingesetzten P450-Monooxygenase untersucht. Die Einführung von Isopropanol (30) als Additiv und

die damit verbundene Umstellung auf NADP+ als Cofaktor führte zu einer deutlichen Steigerung der

Produktbildung von 0.090 bis 0.140 g/l auf 0.323 bis 0.353 g/l. Durch das Herabsetzen der Reaktions-

temperatur auf 8°C für 8 Stunden und anschließende Erwärmung auf Raumtemperatur während der

verbleibenden Stunden konnte kein Vorteil beobachtet werden, ebenso wenig wie bei der Erhöhung

der Reaktionszeit von 24 Stunden auf 48 Stunden. Als geeignete Mutante erwies sich die 19A12-

Mutante der P450-Monooxygenase BM-3, mit der eine Steigerung der Produktbildung auf 0.633 bis

0.685 g/l erzielt wurde. Eine nochmalige deutliche Erhöhung der Produktbildung wurde durch

Erhöhung der Substratkonzentration von 25 mM auf 100 mM durch eine Verringerung des

6. Zusammenfassung

135

Reaktionsvolumens erreicht. Mit dem Einsatz des Alkohols 30 als Additiv, Raumtemperatur als

Reaktionstemperatur, 24 Stunden als Reaktionszeit, Einsatz der 19A12-Mutante der P450-

Monooxygenase BM-3 und eine Substratkonzentration von 100 mM in pH 7.0 Phosphatpuffer wurde

mit einer Produktbildung von 0.80 g/l das beste Ergebnis erzielt (Abbildung 120).

Abbildung 120: Optimierte biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) zu Cyclooktanon

(75) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv mit einer Produktbildung von 0.80 g/l

6.3 Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol zur Synthese von

εεεε-Caprolacton durch Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einer Baeyer-

Villiger-Monooxygenase

Das Ziel der Arbeit war die direkte biokatalytische Oxidation von Cyclohexanol (16) zu ε-Caprolacton

(53) mit Luftsauerstoff im Reaktionsmedium Wasser in Form einer Eintopf-Zweistufen-Synthese. Das

Konzept dieser biokatalytischen Doppeloxidation beruht auf der Kombination einer

Alkoholdehydrogenase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase. Im ersten Schritt wurde das

Cycloalkanol 16 von einer Alkoholdehydrogenase durch Reduktion des Cofaktors NADP+ zu NADPH

zum Cyclohexanon (41) oxidiert. Der zweite Schritt war eine Baeyer-Villiger-Oxidation, bei der das

Cycloalkanon 41 zu ε-Caprolacton (53) unter Oxidation des vorher entstandenen NADPH zu NADP+

oxidiert wird. Außer molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel wurde durch dieses Konzept kein

Zusatz eines Cosubstrats erforderlich (Abbildung 121).

6. Zusammenfassung

136

Abbildung 121: Biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) unter Synthese von

ε-Caprolacton (53) in einer Eintopf-Zweistufen-Reaktion in wässrigem Medium

Im Rahmen dieser Doktorarbeit gelang es, eine biokatalytische Doppeloxidation des Alkohols 16 zur

Synthese des Lactons 53 in einer Eintopfreaktion in wässrigem Medium durchzuführen. Es wurde

hierbei die Abhängigkeit der Reaktion von der eingesetzten Konzentration an Cyclohexanol (16)

untersucht, wobei der Bereich von 20 mM bis 100 mM Substratkonzentration im Fokus lag. Hierbei

wurde bei einer Konzentration von 40 mM Cyclohexanol (16) mit einem Umsatz von 97% das beste

Ergebnis erzielt (Abbildung 122).

Abbildung 122: „Proof of Concept“ der biokatalytischen Doppeloxidation von Cyclohexanol (16) zu

ε-Caprolacton (53) (optimiertes Verfahren)

Es konnte im Rahmen der Prozessentwicklung ein Zusammenhang zwischen der eingesetzten

Konzentration an Cyclohexanol (16) und dem Umsatz festgestellt werden. Bis zu einer Konzentration

von 60 mM des Alkohols 16 wurde mit 94% ein sehr guter Umsatz verzeichnet, der dann sukzessive

bei einer Konzentration von 100 mM auf 24% abnahm. Diese Abhängigkeit wurde in Abbildung 123

graphisch dargestellt.

6. Zusammenfassung

137

Abbildung 123: Einfluss der Konzentration des eingesetzten Cyclohexanols (16) auf den Umsatz

Die Gründe für den Rückgang des Umsatzes bei erhöhter Konzentration des Alkohols 16 lagen

insbesondere in der deutlichen Inhibierung und dem deutlichen Stabilitätsverlust der Baeyer-Villiger-

Monooxygenase durch höhere Mengen des Zielprodukts ε-Caprolacton (53). Für die zukünftigen

Arbeiten zur Prozessoptimierung ist die Identifizierung von Baeyer-Villiger-Monooxygenasen, die

weniger oder gar nicht vom Zielprodukt inhibiert oder deaktiviert werden, von großer Bedeutung.

Desweiteren muss nach geeigneten Methoden zur Entfernung des Zielprodukts aus dem

Reaktionsgemisch während der Reaktion (in situ-product removal) geforscht werden, damit die

effektive Konzentration gering gehalten wird.

6.4 Kombination einer metallkatalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit einer

enzymatischen Reduktion zur Synthese eines Biarylalkohols aus 4‘-Iodacetophenon

Bei der Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung mit einer biokatalytischen

Reduktion durch Einsatz einer Alkoholdehydrogenase war das Ziel, den Ablauf dieser Tandem-

reaktion zu verstehen, bei der 4‘-Iodacetophenon (106) als Edukt verwendet wurde (Abbildung 124).

Hierbei wurden beide Reaktionen separat voneinander untersucht, wobei der Fokus vor allem auf

der Abhängigkeit der Suzuki-Reaktion von der eingebrachten Proteinmenge im Laufe der

Tandemreaktion lag.

6. Zusammenfassung

138

Abbildung 124: Konzept der Tandem-Reaktionen durch Kombination der Suzuki-Kreuzkupplung mit

einer biokatalytischen Reduktion

Durch die Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der enzymatischen

Reduktion kann z.B. der Biarylalkohol (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) hergestellt werden. Das

Edukt 4‘-Iodacetophenon (106) konnte sowohl die Suzuki-Kreuzkupplung als auch die biokatalytische

Reduktion eingehen. Mit Hilfe der Suzuki-Kreuzkupplung wurde aus dem Keton 106 das dem-

entsprechende 4‘-Phenylacetophenon (108) erhalten oder das Keton 106 wurde biokatalytisch mit

Hilfe der Alkoholdehydrogenase zum korrespondierenden rac-4'-Iodphenyl-ethan-1-ol (rac-107)

reduziert. Das gewünschte Produkt, der Biarylalkohol (R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109), konnte

durch die Suzuki-Kupplung aus dem enantiomerenreinen Alkohol (R)-107 oder durch die

biokatalytische Reduktion des Ketons 108 erhalten werden. Im Hinblick auf die Tandemreaktion

wurde der Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung für die beiden potentielle

Substrate 4‘-Iodacetophenon (106) und rac-4'-Iodphenyl-ethan-1-ol (rac-107) untersucht. Hierbei

konnte mit Hilfe des humanen Serumalbumins (HSA) als Modellprotein der Einfluss der

Proteinmenge auf die Suzuki-Kreuzkupplung wie z.B. die Inhibierung der Reaktion beobachtet

werden. Es ergaben sich für beide Verbindungen sehr ähnliche Kurven. Die Umsätze nahmen

sukzessive bei höheren Proteinkonzentrationen ab, was zeigte, dass das Protein der LK-ADH bei

ansonsten konstant gehaltenen Reaktionsbedingungen die Suzuki-Kreuzkupplung inhibieren kann

(Abbildung 125).

6. Zusammenfassung

139

Abbildung 125: Einfluss der Proteinkonzentration auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-

Iodacetophenon (106) bzw. von rac-4‘-Iodphenylethanol (rac-107) mit Phenylboronsäure (101b)

Das beste Ergebnis bei der Kombination der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung und der

enzymatischen Reduktion in Form einer Tandemreaktion im Bezug auf den Erhalt des Biarylalkohols

(R)-4'-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) wurde mit einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l, die aus dem

Rohextrakt der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir stammte, über eine Reaktionszeit von

48 Stunden und einer Substratkonzentration von 40 mM erreicht. Das wässrige Medium bestand aus

einer 1:1 (v/v) - Mischung aus Isopropanol und wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung. Der

Biarylalkohol (R)-109 wurde mit 99% ee und einem Umsatz von 35% erhalten. Desweiteren wurde

der Alkohol (R)-4'-Iodphenylethan-1-ol (R)-107 mit einem Umsatz von 23% und 99% ee und das Keton

4‘-Phenylacetophenon (108) mit einem Umsatz von 42% synthetisiert. Der Gesamtumsatz der

Tandem-Reaktion belief sich auf über 95% (Abbildung 126).

Abbildung 126: Ergebnisse der Tandemreaktion

6. Zusammenfassung

140

Die Ergebnisse stellen eine Reihe von „Proof of Concepts“ dar, die Perspektiven für weitere

Forschungsarbeiten auf diesem Gebiet eröffnen. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf der

Enzymklasse der Oxidoreduktasen mit einem Schwerpunkt auf Monooxygenasen und deren

Reaktionen. Die mit Hilfe der vorgestellten biokatalytischen Methoden synthetisierten Produkte

stellten vor allem Bulkchemikalien wie z.B. ε-Caprolacton (53) dar. In dieser Arbeit wurden einige

Mehrstufen-Eintopf-Synthesen in einem wässrigen Medium wie die biokatalytische Oxidation von

linearen Alkanen zu Alkoholen, die biokatalytische Doppeloxidation von Cycloalkanen zu den

korrespondierenden Cycloalkanonen oder die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclohexanol (16)

zu ε-Caprolacton (53) realisiert. Es wurden neuartige Synthesen mit Oxidoreduktasen erfolgreich

entwickelt und eine Kombination von metallkatalytischer Reaktion mit einer biokatalytischen

Reaktion ausführlich auf deren Ablauf untersucht. Eine offene Herausforderung für die Forschung

stellt die Verbesserung von biokatalytischen Konzepten dar, mit dem Ziel, effiziente und technisch

geeignete Verfahren zu entwickeln, die sich als konkurrenzfähig zu den lange etablierten Prozessen

der chemischen Industrie erweisen.

7. Summary

141

7. Summary

In this work a number of „proof of concepts“ for one-pot syntheses by using biocatalysts in aqueous

media were successfully performed. The examined processes contain new biocatalytic proceedings

for the hydroxylation of short-chain n-alkanes, especially of the liquid gas n-butane 65, the double

oxidation of cycloalkanes to synthesize cycloalkanones and also of cyclohexanol 16 to synthesize

ε-caprolactone 53. Furthermore the combination of the metal-catalyzed Suzuki cross-coupling

reaction followed by a biocatalytic reduction was examined. The summarized results are shown in

this chapter.

7.1 Biocatalytic hydroxylation of n-alkanes by using a P450-monooxygenase

The establishment of a process in aqueous media in order to hydroxylate n-alkanes like n-octane (64)

and n-butane (65) by applying a P450-monooxygenase was of capital importance as well as the

hydroxylation of the liquid gas n-butane (65) for the purpose to synthesize the bulk chemical

2-butanol 35 (figure 1).

Figure 1: Biocatalytic hydroxylation of the n-alkanes 64 und 65 in order to obtain the corresponding

alcohols

The alcohol was synthesized during the hydroxylation of n-alkanes by using a P450-monooxygenase

from Bacillus megaterium and consumption of the cofactor NADPH. The application of additional

D-glucose and glucose dehydrogenase (GDH) enabled an in situ-cofactor regeneration in order to

reduce the cofactor NADP+ which was formed during the hydroxylation. The reduced cofactor NADPH

was then used in order to synthesize the alcohol during the biocatalytic oxidation reaction. The

substrate n-octane (64) was used for the first experiments. The hydroxylation of n-alkane 64 in

7. Summary

142

aqueous media was obtained by using the F87V-mutant of P450-monooxygenase BM-3, a substrate

concentration of 20 mM and the in situ-cofactor regeneration described above with a product

formation of 0.47 g/L (figure 2).

Figure 2: Biocatalytic hydroxylation of n-octane (64)

The biocatalytic hydroxylation of the gaseous n-butane (65) by applying a P450-monooxygenase and

the in situ-cofactor regeneration system was examined for the dependency of the reaction

temperature and of the applied mutant of the P450-monooxygenase. Based on the obtained result

for n-octane (64) the same cofactor regeneration system was used for the biocatalytic hydroxylation

of the n-alkane 65. The best result was achieved by using the 19A12-mutant of P450-monooxygenase

BM-3 and a reaction temperature of 0°C for the first 8 hours, followed by a slow warm-up to room

temperatur during the remaining 16 hours. The desired 2-butanol (35) was synthesized with a

product formation of 0.16 g/L (figure 3).

Figure 3: Biocatalytic hydroxylation of the liquid gas n-butane (65) to obtain 2-butanol (35)

7. Summary

143

7.2 Biocatalytic double oxidation of cyclooctane to synthesize cyclooctanone by

using a combination of a P450-monooxygenase and an alcohol dehydrogenase

The aim was the direct biocatalytic double oxidation of cycloalkanes in order to synthesize cyclo-

alkanones by using only atmospheric oxygen as reagent in an aqueous media in the fashion of a one-

pot-two-step-reaction. The first step contained the hydroxylation of cyclooctane (73) by using a

P450-monooxygenase and by consumption of the initial cofactor NADPH in order to obtain

cyclooctanol (74). An alcohol dehydrogenase (ADH) oxidized the alcohol 74 to cyclooctanone (75)

during the second step. During the hydroxylation reaction NADP+ was achieved which could be used

as cofactor during the oxidation reaction and was meanwhile reduced to NADPH. The catalytic cycle

restarted and there was no need for co-substrates (figure 4).

Figure 4: Biocatalytic double oxidation of cyclooctane (73) in order to synthesize cyclooctanone (75)

With regard to the noticed volatility of the cycloalkanes the development of a convincing method for

the determination of conversion and product formation was of particular importance. During this

work a valid analytic system was established and in consequence this challenge was met successfully.

The biocatalytic double oxidation of cyclooctane (73) was studied for the dependency of an additive,

the reaction temperature, the reaction time, the substrate concentration and the applied mutant of

the P450-monooxygenase. The introduction of the additive isopropyl alcohol (30) led to the

application of NADP+ as cofactor at the beginning of the reaction and to an increase of the product

formation from 0.090 - 0.140 g/L to 0.323 - 0.353 g/L. The reduction of the reaction temperature,

which was first room temperature, to a reaction temperature of 0°C for the first 8 hours, followed by

a slow warm-up to room temperatur during the remaining 16 hours did not enhance the product

formation. Also the increase of the reaction time from 24 hours to 48 hours did not lead to more

synthesized product. The product formation increased to 0.633 - 0.685 g/L by using the 19A12-

mutant of P450-monooxygenase BM-3 which was the most suitable of the examined variants. A

further improvement of the product formation was obtained by using a substrate concentration of

100 mM instead of 25 mM. The best result was achieved by using the alcohol 30 as additive, room

temperature, 24 hours reaction time, the 19A12-variant of P450-monooxygenase BM-3, the alcohol

7. Summary

144

dehydro-genase from Lactobacillus kefir and a substrate concentration of 100 mM. The biocatalytic

double oxidation of cyclooctane (73) in order to synthesize cyclooctanone (75) in aqueous media was

performed with a product formation of 0.80 g/L (figure 5).

Figure 5: Optimized biocatalytic double oxidation of cyclooctane (73) in order to synthesize

cyclooctanone (75) by using the additive isopropyl alcohol (30) (“proof of concept”)

7.3 Biocatalytic double oxidation of cyclohexanol in order to synthesize

εεεε-caprolactone by using a combination of an alcohol dehydrogenase and a Baeyer-

Villiger-monooxygenase

The development of a direct biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to synthesize

the bulk chemical ε-caprolactone (53) in a one-pot-two-step fashion was of capital importance. This

was achieved by combining an alcohol dehydrogenase und a Baeyer-Villiger-monooxygenase with

only atmospheric oxygen as reagent in aqueous media (figure 6).

Figure 6: Biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to synthesize ε-caprolactone (53)

in a one-pot-two-step fashion

7. Summary

145

The first step was the oxidation of cyclohexanol (16) to cyclohexanone (41) by using an alcohol

dehydrogenase. The initial cofactor NADP+ was reduced during this reaction to NADPH. The second

step contained the Baeyer-Villiger-oxidation of cycloalkanone 41 in order to synthesize lactone 53 by

using a Baeyer-Villiger-monooxygenase. The cofactor NADPH was meanwhile oxidized to NADP+ and

the catalytic cycle could restart. Except for molecular oxygen as oxidant no additional co-substrate

was required. In this work the biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to

synthesize ε-caprolactone (53) with only atmospheric oxygen as reagent in a one-pot-two-step

fashion in aqueous media was successfully performed. The dependency of the substrate

concentration, which ranged from 20 mM to 100 mM, on the double oxidation was analyzed. The

best result was obtained by using a substrate concentration of 40 mM cyclohexanol (16). The

conversion was 97% (figure 7).

Figure 7: Optimized biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to synthesize

ε-caprolactone (53) (“proof of concept”)

The increase of the substrate concentration showed very good conversions of 94% at a concentration

of 60 mM cyclohexanol (16), but further increase of the substrate concentration led to a significant

drop of conversion which was only 24% at a concentration of 100 mM cyclohexanol (16) (figure 8).

7. Summary

146

Figure 8: Dependency of the concentration of cyclohexanol (16) on the conversion

In order to find an explanation for this dependency the impact of cyclohexanol (16), cyclohexanone

(41) and ε-caprolactone (53) on the reaction was studied with respect on inhibition and stability of

the Baeyer-Villiger-monooxygenase. A significant inhibition and loss of stability of the Baeyer-Villiger-

monooxygenase was observed by increasing the concentration of the lactone 53. The future work

should address on solving the problem of inhibition and deactivation of the Baeyer-Villiger-

monooxygenase by the product ε-caprolactone (53). Baeyer-Villiger-monooxygenases have to be

identified which will not be inhibited and deactivated by the lactone 53. Furthermore processes for

the in situ-product removal during the reaction should be of capital importance.

7.4 Combination of the metal-catalyzed Suzuki cross-coupling and an enzymatic

reduction in order to synthesize a biarylalcohol

The goal of the combination of the palladium-catalyzed Suzuki cross-coupling reaction and the

biocatalytic reduction by using an alcohol dehydrogenase was to understand the course of the

tandem reaction with 4‘-iodoacetophenone (106) as initial substrate. Both, the Suzuki cross-coupling

reaction and the biocatalytic reduction were examined separately. The dependency of the amount of

protein on the reactions especially on the Suzuki cross-coupling was studied in detail. The desired

product of this tandem reaction was the biarylalcohol (R)-109 (figure 9).

7. Summary

147

Figure 9: Concept of the tandem reaction by combining Suzuki cross-coupling reaction and

biocatalytic reduction

During the tandem-reaction the compound 4‘-iodoacetophenone (106) was able serve as initial

substrate for both the Suzuki cross-coupling reaction and the biocatalytic reduction. The initial

substrate 106 was converted to 4‘-phenylacetophenone (108) during the Suzuki cross-coupling

reaction respectively to (R)-4‘-iodophenylethan-1-ol (R)-107 during the biocatalytic reduction by

using an alcohol dehydrogenase. The ketone 108 could be biocatalytically reduced to the desired

biarylalcohol (R)-109. The alcohol (R)-107 could serve as substrate for the Suzuki cross-coupling

reaction in order to synthesize the (R)-4'-biphenylethan-1-ol ((R)-109). Furthermore the impact of the

concentration of protein on the Suzuki cross-coupling reaction was studied for the both possible

substrates 106 and rac-107 using human serum albumin (HSA) as model protein with respect of

inhibition. Very similar results were obtained for both substrates: the increase of the concentration

of HSA led to lower conversions. This approved the Suzuki cross-coupling was inhibited by higher

concentrations of protein (figure 10).

7. Summary

148

Figure 10: Dependency of the concentration of protein on the conversion of the Suzuki cross-

coupling with ketone 106 respectively with racemic alcohol rac-107 as initial substrate

The best result with regard to the synthesized product (R)-4'-biphenylethan-1-ol ((R)-109) was

obtained by using a concentration of 1.0 g/L protein, which originated from the alcohol dehydro-

genase from Lactobacillus kefir, 48 hours reaction time and a substrate concentration of 40 mM

4‘-iodoacetophenone (106). The reaction media was a mixture of isopropyl alcohol (30) and an

aqueous solution of sodium carbonate in a ratio of 1:1. The overall conversion of the tandem

reaction was more than 95%. The desired product of the tandem reaction, (R)-4'-biphenylethan-1-ol

((R)-109), was obtained with 99% ee and a conversion of 35%. Furthermore (R)-4‘-iodophenylethan-

1-ol ((R)-107) was synthesized with 99% ee and a conversion of 23% and 4‘-phenylacetophenone 108

was obtained with a conversion of 42% (figure 11).

Figure 11: Results of tandem reaction

7. Summary

149

7.5. Outlook

These results constitute a number of „proof of concepts“ and offer several perspectives for further

investigations on this research topic. The enzyme class of oxidoreductases with focus on

monooxygenases and their reactions was of particular importance for this work. Furthermore the

combination of a biocatalytic reaction and a metal-catalyzed reaction was studied more detailed.

Some new synthesis routes to obtain bulk chemicals like 2-butanol (35) and ε-caprolactone (53) were

developed successfully by using oxidoreductases in enzymatic reactions in aqueous media and in a

one-pot fashion with only atmospheric oxygen as reagent. This work contains the biocatalytic

oxidation of n-alkanes to alcohols, the biocatalytic double oxidation of cycloalkanes to the

corresponding cycloalkanones and the biocatalytic double oxidation of cyclohexanol (16) in order to

synthesize lactone 53. It is very important to improve the enzymatic concepts in order to develop

technically applicable and efficient processes which would be able to be in competition with the

long-established chemical industry processes.

8. Experimenteller Teil

150


8.1 Verwendete Chemikalien und Geräte

Chemikalien:

• Die für diese Doktorarbeit verwendeten käuflichen Chemikalien wurden von Acros Organics®,

Sigma-Aldrich®, ABCR®, Fisher Scientific® oder Fluka® bezogen und ohne weitere Reinigung

eingesetzt.

• Das gasförmige n-Butan wurde als Hochschulspende von der Evonik Degussa GmbH zur

Verfügung gestellt.

• Alle verwendeten Lösungsmittel wurden vor Gebrauch am Rotationsverdampfer destilliert.

Enzyme:

Die verwendeten Enzyme wurden im Rahmen folgender Zusammenarbeiten erhalten:

• Die P450 BM-3 Monooxygenasen wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. U. Schwaneberg

(RWTH Aachen) entwickelt und dankenswerterweise für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

• Die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (LK-ADH)und Rhodococcus sp. (Rsp-ADH) [132,133]

wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. W. Hummel (Universität Düsseldorf, Institut für

molekulare Enzymtechnologie, Forschungszentrum Jülich) entwickelt und dankenswerterweise

für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Diese ADHs sind bei evocatal GmbH ebenfalls käuflich

erwerbbar.

• Die Baeyer-Villiger-Monooxygenase ESC-BVMO 01 aus Acinetobacter calcoaceticus wurde von

der Firma Enzymicals AG aus Greifswald, Deutschland entwickelt und dankenswerterweise für

diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

• Die Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (GDH) wurde von Amano Enzyme Inc. aus Nagoya,

Japan erhalten.

• Die Cofaktoren NAD(P)H und NAD(P)+ wurden von Oriental Yeast Co. Ltd. bezogen.

Dünnschichtchromatographie:

Es wurden DC-Platten mit Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumträgerfolie von Merck® verwendet.

Zum Nachweis der Substanzzonen diente die Fluoreszenzlöschung bei einer Wellenlänge von 254 nm.


151

HPLC:

Die Spektren wurden mit einem LC-Net II / ADC Gerät und Pumpen (PU-1587 Intelligent Prep. Pump

und PU 987 Intelligent Prep. Pump) der Firma JASCO oder mit einem Gerät CBM-10A und Pumpe (LC-

10AT Liquid Chromatograph) der Firma Shimadzu aufgenommen. Die Trennungen erfolgten an den

Säulen Daicel Chiralcel® OJ-H bzw. Daicel Chiralpak® AD-H und IB.

NMR-Spektroskopie:

Die Spektren wurden auf einem Bruker Avance 300 oder 400 NMR-Spektrometer aufgenommen. Alle

Spektren wurden bei Raumtemperatur gemessen. Die chemischen Verschiebungen der 1H-NMR-

Spektren sind in ppm angegeben. Spinmultiplizitäten werden als s (Singulett), d (Dublett), dd

(dupliziertes Dublett), t (Triplett), q (Quartett) und m (Multiplett) angegeben. Die erhaltenen Daten

wurden mit der Software MestRec (3.6.9.0) bearbeitet.

Thermomixer:

Für die Durchführung der Versuche wurde ein Eppendorf Thermomixer Comfort des Typs 5355

verwendet.

Säulenchromatographie:

Die säulenchromatographische Reinigung wurde mit SiO2 als stationärer Phase durchgeführt. Es

wurde dafür Merck® Silikagel 60 (0.04-0.063 nm) der Firma ICN Biomedicals GmbH verwendet.

UV/Vis-Spektroskopie:

Diese Messungen wurden an einem SPEKOL® 1300 UV/Vis-Spektrophotometer der Firma analytikjena

durchgeführt und mit dem Programm WinASPECT 2.2.6.0 unter Zuhilfenahme des Moduls „Kinetik

Programms“ bearbeitet.

Zentrifuge:

Zur Trennung der organischen Phase von der wässrigen Phase wurde eine Hochgeschwindigkeits-

Mikroliter-Zentrifuge des Modells CT15RE von VWR verwendet.


152

8.2 Synthesen und spektroskopische Daten

8.2.1 Hydroxylierung von n-Alkanen zur Darstellung von Alkoholen

8.2.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 für die Herstellung des LB-Mediums (AAV 1)

Es wurden 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl in einer Glasflasche in 1000 ml destilliertem

Wasser gelöst. Anschließend wurde die Flasche bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert.

8.2.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 für die Herstellung des TB-Mediums (AAV 2)

Das TB-Medium bestand aus zwei verschiedenen Lösungen, die zum Schluss zusammengegeben

wurden. Lösung A bestand aus 12 g - 102 g Trypton, 24 g - 204 g Hefeextrakt und 4 g - 34 g Glycerin,

die in 800 ml - 7400 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Die Lösung wurde bei 121°C für

20 Minuten autoklaviert. Lösung B bestand aus in 200 ml - 1100 ml destilliertem Wasser gelösten

KH2PO4 (2.31 g -19.64 g) und K2HPO4 (12.54 g - 106.59 g). Die Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten

autoklaviert. Beim Fermenter - Versuch wurden zusätzlich 8 ml, steril filtrierte (0.2 μm Filter), SEL

(Spurenelemente-Lösung) und 8 ml, steril filtriertes (0.2 μm Filter), Kanamycin (100 µl/ml bzw.

100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zugegeben. Die beiden Lösungen wurden unter sterilen

Bedingungen miteinander vermischt.

8.2.1.2.1 Herstellung des TB-Mediums

Die Herstellung des TB-Mediums erfolgte gemäß AAV 2. Das TB-Medium bestand aus zwei

verschiedenen Lösungen, die zum Schluss zusammengegeben wurden. Lösung A bestand aus 12 g

Trypton, 24 g Hefeextrakt und 4 g Glycerin, die in 800 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Die

Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. Lösung B bestand aus in 200 ml destilliertem

Wasser gelösten KH2PO4 (2.31 g) und K2HPO4 (12.54 g). Die Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten

autoklaviert. Die beiden Lösungen wurden unter sterilen Bedingungen miteinander vermischt.

8.2.1.2.2 Herstellung des TB-Mediums für einen Fermenter-Versuch

Die Herstellung des TB-Mediums erfolgte gemäß AAV 2. Das TB-Medium bestand aus zwei

verschiedenen Lösungen, die zum Schluss zusammengegeben wurden. Lösung A besteht aus 102 g

Trypton, 204 g Hefeextrakt und 34 g Glycerin, die in 7400 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Die

Lösung wurde im Fermenter bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. Lösung B bestand aus in 1100 ml

destilliertem Wasser gelösten KH2PO4 (19.64 g) und K2HPO4 (106.59 g). Die Lösung wurde bei 121°C


153

für 20 Minuten autoklaviert. Lösung B wurde mit 8 ml, steril filtrierter (0.2 μm Filter), SEL (Spuren-

elemente-Lösung) und 8 ml, steril filtrierten (0.2 μm Filter), Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml,

1000fach konzentriert) versetzt und mit Hilfe einer Impfflasche in den Autoklaven zur Lösung A

gegeben.

8.2.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 für die Herstellung des M9-Minimal-Mediums

(AAV 3)

Es wurden 64.0 g Na2HPO4 x 7 H2O, 15.0 g KH2PO4, 2.5 g NaCl und 5.0 g NH4Cl in 970 ml destilliertem

Wasser gelöst. Die Lösung wurde bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert. Unter sterilen Bedingungen

wurden 25 ml einer steril filtrierten (0.2 μm Filter) 20%igen Glucose-Lösung, 5 ml einer separat

autoklavierten 1 M MgSO4-Lösung und 0.2 ml einer separat autoklavierten 1 M CaCl2-Lösung

dazugegeben. Das M9-Minimal-Medium wird bei der Ganzzellkatalyse eingesetzt.

8.2.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 für die Herstellung der Mutanten für die

P450-Monooxygenase BM-3 (AAV 4)

Die Anzucht der Enzyme erfolgte unter sterilen Bedingungen. Das eingesetzte Antibiotikum, SEL

(Spurenelemente-Lösung), ALA (Aminolävulinsäure), Thiamin und IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalacto-

pyranosid) waren steril filtriert (0.2 μm Filter). Die eingesetzten Antibiotika waren Kanamycin für die

19A12-Mutante und den Wildtyp und Ampicillin für die F87V-Mutante. Zu 4 ml LB-Medium wurden

4 μl Antibiotikum (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) und ein Tropfen eines Glycerol-

Stocks des Wildtyps bzw. der jeweiligen Mutante der P450-Monooxygenase gegeben. Die Kultur

wuchs über Nacht (ca. 16 h) bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers. Anschließend

wurden zu 600 ml TB-Medium, 600 μl Antibiotikum (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzen-

triert), 600 μl SEL (1000fach konzentriert) und 6 ml der Übernachtkultur (1% des Volumens des TB-

Mediums) gegeben. Die Vorkultur ließ man bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers

wachsen, bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 4 bis 6 Stunden). Anschließend wurden

600 μl ALA (0.5 M, 1000fach konzentriert), 600 µl Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert) und 600 µl

IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert), durch das die Enzymexpression induziert wurde, dazu gegeben.

Die Enzyme wurden ca. 20 h bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers exprimiert. Die

anschließende Aufarbeitung erfolgte nicht unter sterilen Bedingungen, aber bei 4°C. Es wurden

zweimal je 300 ml der Hauptkultur in eine 500 ml-Tube überführt und für 20 Minuten bei 4000 rpm

und 4°C zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 60 ml PBS-Puffer (pH 7.4) je 500 ml-Tube gelöst und


154

für 20 Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die entstehenden Pellets wurden zu 18 ml je

500 ml - Tube aufgenommen und mit Hilfe des Vortexers wurde eine homogene Lösung hergestellt.

Anschließend erfolgte in drei Zyklen der Zellaufschluss mit Hilfe eines Homogenisators. Die Zellreste

wurden von den Enzymen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 4°C und 13000 rpm voneinander

getrennt. Es wurden je 10 ml des Überstandes der zentrifugierten Probe in Falcon Tubes (50 ml)

überführt. Diese Falcon Tubes wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren und ca. 5 Tage lyophilisiert.

8.2.1.4.1 Herstellung des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3

Die Anzucht der Enzyme erfolgte gemäß AAV 4 unter sterilen Bedingungen. Das eingesetzte

Antibiotikum Kanamycin, SEL, ALA, Thiamin und IPTG waren steril filtriert (0.2 μm Filter). Zu 4 ml LB-

Medium wurden 4 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) und ein Tropfen

eines Glycerol-Stocks des Wildtyps der P450-Monooxygenase gegeben. Die Kultur wuchs über Nacht

(ca. 16 h) bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers. Anschließend wurden zu 600 ml

TB-Medium, 600 μl Kanamycin (100 µL/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert), 600 μl SEL

(1000fach konzentriert) und 6 ml der Übernachtkultur (1% des Volumens des TB-Mediums) gegeben.

Die Vorkultur ließ man bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers wachsen, bis eine

OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 4 bis 6 Stunden). Anschließend wurden 600 μl ALA (0.5 M,

1000fach konzentriert), 600 µl Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert) und 600 µl IPTG (0.1 M,

1000fach konzentriert), durch das die Enzymexpression induziert wurde, dazu gegeben. Die Enzyme

wurden ca. 20 h bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers exprimiert. Die


zweimal je 300 ml der Hauptkultur in eine 500 ml - Tube überführt und für 20 Minuten bei 4000 rpm

und 4°C zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 60 ml PBS-Puffer (pH 7.4) je 500 ml - Tube gelöst und


500 ml-Tube aufgenommen und mit Hilfe des Vortexers eine homogene Lösung hergestellt.





Ausbeute: 693 mg


155

8.2.1.4.2 Herstellung der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3

Die Anzucht der Enzyme erfolgte gemäß AAV 4 unter sterilen Bedingungen. Das eingesetzte

Antibiotikum Kanamycin, SEL, ALA, Thiamin und IPTG waren steril filtriert (0.2 μm Filter). Zu 4 ml LB-

Medium wurden 4 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) und ein Tropfen

eines Glycerol-Stocks der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase gegeben. Die Kultur wuchs über

Nacht (ca. 16 h) bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers. Anschließend wurden zu

600 ml TB-Medium, 600 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert), 600 μl SEL

(1000fach konzentriert) und 6 ml der Übernachtkultur (1% des Volumens des TB-Mediums) gegeben.

Die Vorkultur ließ man bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers wachsen, bis eine

OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 4 bis 6 Stunden). Anschließend wurden 600 μl ALA (0.5 M,

1000fach konzentriert), 600 µL Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert) und 600 µl IPTG (0.1 M,

1000fach konzentriert), durch das die Enzymexpression induziert wurde, dazu gegeben. Die Enzyme

wurden ca. 20 h bei 30°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers exprimiert. Die


zweimal je 300 ml der Hauptkultur in eine 500 ml-Tube überführt und für 20 Minuten bei 4000 rpm

und 4 °C zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 60 ml PBS-Puffer (pH 7.4) je 500 ml-Tube gelöst und


500 ml-Tube aufgenommen und mit Hilfe des Vortexers eine homogene Lösung hergestellt.





Ausbeute: 584 mg

8.2.1.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 für die Fermentation der 19A12-Mutante der

P450-Monooxygenase BM-3 (AAV 5)

Die Fermentation der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 wurde in Anlehnung an eine

literaturbekannte Arbeitsvorschrift [47] durchgeführt. Die Anzucht der Enzyme erfolgte unter sterilen

Bedingungen. Das eingesetzte Antibiotikum, SEL, ALA, Thiamin und IPTG wurden steril filtriert

(0.2 μm Filter). Zu 4 ml LB-Medium wurden 4 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach

konzentriert) und ein Tropfen eines Glycerol-Stocks der jeweiligen Mutante der P450-

Monooxygenase gegeben. Anschließend wurden zu 160 ml LB-Medium 1.6 ml einer Übernachtkultur


156

der 19A12-Mutante und 160 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert)

gegeben. Die Vorkultur ließ man bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers

bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht

Vorkultur und 160 μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zu 8.5

Medium in den Fermenter gegeben. Die Kulturen l

Sauerstoffeintrag von 3 l/min wachsen, bis eine OD

wurden 8.16 ml ALA (0.5 M, 1000fach konzentriert), 8.16 ml Thiamin (100

und 8.16 ml IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert) zur Lösung gegeben. Die Enzyme w

23 Stunden exprimiert, bis eine OD

4000 rpm und 4°C für 10 Minuten

dazugegeben. Anschließend wurden

wurde verworfen und die zurückbleibenden Pellets w

in AAV 3 beschrieben, aufgearbeitet.

8.2.1.6 Allgemeine Arbeitsvorschrift

bestimmung der P450-Monooxygenase BM

Die Enzymaktivität wurde in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift

photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch

Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen Alkans als Substrat bestimmt.

wurde die Steigung aus dem einleitenden linearen Bereich der Kurve für den NADPH

herangezogen. Der molare Extinktionskoeffizient ε

zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680

Lösung des Alkans (100 mM) und 100

P450-Monooxygenase BM-3 aus

50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion w

200 μl einer NADPH-Lösung (0.8

Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten w

photometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für die Substrate Dodekansäure

bzw. n-Heptan (67) erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität

von 100%) bestimmt.

Abbildung 127: Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung

μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert)

man bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers

von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde (ca. 2 bis 3 Stunden). Anschließend

μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zu 8.5

Medium in den Fermenter gegeben. Die Kulturen ließ man bei 37°C, 300 rpm und einem

Sauerstoffeintrag von 3 l/min wachsen, bis eine OD600 von 0.8 bis 1.0 erreicht wurde

den 8.16 ml ALA (0.5 M, 1000fach konzentriert), 8.16 ml Thiamin (100 g/l, 1000fach konzentriert)

und 8.16 ml IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert) zur Lösung gegeben. Die Enzyme w

ine OD600 von 15.72 erreicht wurde. Die Enzymlösung w

Minuten zentrifugiert. Es wurden pro 500 ml-Tube 45

urden bei 4000 rpm und 4°C für 30 Minuten exprimiert. Der Überstand

worfen und die zurückbleibenden Pellets wurden bei -20°C eingefroren und bei Bedarf, wie

3 beschrieben, aufgearbeitet.

8.2.1.6 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 zur spektrophotometrischen Aktivitäts

Monooxygenase BM-3 (AAV 6)

in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift


in Gegenwart des jeweiligen Alkans als Substrat bestimmt.

wurde die Steigung aus dem einleitenden linearen Bereich der Kurve für den NADPH

Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM

zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer DMSO

Lösung des Alkans (100 mM) und 100 μl Enzymlösung des Rohextraktes des jeweiligen Mutanten der

3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH

mM)) zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten

Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der

Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektro

photometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für die Substrate Dodekansäure

erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität

Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung

μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert)

man bei 37°C und 250 rpm mit Hilfe des Inkubationsschüttlers wachsen,

(ca. 2 bis 3 Stunden). Anschließend wurden 160 ml der

μl Kanamycin (100 µl/ml bzw. 100 mg/ml, 1000fach konzentriert) zu 8.5 l TB-

man bei 37°C, 300 rpm und einem

wurde. Anschließend

g/l, 1000fach konzentriert)

und 8.16 ml IPTG (0.1 M, 1000fach konzentriert) zur Lösung gegeben. Die Enzyme wurden ca.

. Die Enzymlösung wurde bei

Tube 45 ml PBS-Puffer

exprimiert. Der Überstand

20°C eingefroren und bei Bedarf, wie

6 zur spektrophotometrischen Aktivitäts-

in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift [10] spektro-


in Gegenwart des jeweiligen Alkans als Substrat bestimmt. Zur Berechnung

wurde die Steigung aus dem einleitenden linearen Bereich der Kurve für den NADPH-Verbrauch

hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden

μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer DMSO-

des Rohextraktes des jeweiligen Mutanten der

Phosphatpuffer (pH 7.0,

Minuten durch Zugabe von

mM)) gestartet und der

rden durch den Vergleich der spektro-

photometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für die Substrate Dodekansäure (66)

erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität

Gleichung zur spektroskopischen Aktivitätsbestimmung


157

8.2.1.6.1 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung des Wildtyps der P450-

Monooxygenase BM-3

Die Enzymaktivität wurde gemäß AAV 6 spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm

durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen

Alkans als Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es

wurden zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 680 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 20 μl einer

DMSO-Lösung von Dodekansäure (66, 100 mM), n-Oktan (64, 100 mM) oder n-Heptan (67, 100 mM)

und 100 μl Enzymlösung des Rohextraktes des Wildtyps der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus

megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion

wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in

Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen

Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten

(U/mg) mit der für das Substrat Dodekansäure erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment

mit der relativen Aktivität von 100%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 43 dargestellt.

Tabelle 43: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten des Wildtyps der P450 BM-3

Eintrag Substrat U/mg [μmol/min*mg] relative Aktivität [%]a


2 n-Oktan 0.0912 52

3 n-Heptan 0.0215 12 abezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

8.2.1.6.2 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der 19A12-Mutante der

P450-Monooxygenase BM-3





DMSO-Lösung von (66, 100 mM), n-Oktan (64, 100 mM) oder n-Heptan (67, 100 mM) und 100 μl

Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus

megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion



158

Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen

Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten

(U/mg) mit der für das Substrat n-Heptan erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit

der relativen Aktivität von 100%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 44 dargestellt.

Tabelle 44: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der 19A12-Mutante der P450 BM-3


1 n-Heptan 0.1439 100

2 n-Oktan 0.0632 44

3 Dodekansäure 0.0000 <2 abezogen auf n-Heptan. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

8.2.1.6.3 Spektrophotometrische Aktivitätsbestimmung der F87V-Mutante der

P450-Monooxygenase BM-3





DMSO-Lösung von (66, 100 mM) oder n-Oktan (64, 100 mM) und 100 μl Enzymlösung des Roh-

extraktes der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf

10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach

5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0,

50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten wurden durch

den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das

Substrat Dodekansäure erhaltenen Enzymaktivitäten (als Referenzexperiment mit der relativen

Aktivität von 100%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 45 dargestellt.

Tabelle 45: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der F87V-Mutante der P450 BM-3



2 n-Oktan 0.0251 22 bbezogen auf Dodekansäure. Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.


159

8.2.1.7 Allgemeine Arbeitsvorschrift 7 zur spektrophotometrischen Bestimmung der

Stabilität von P450-Monooxygenasen BM-3 (AAV 7)

Die Enzymaktivität wurde in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift [10] spektro-

photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH an

durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart von n-Heptan oder Dodekansäure als Substrat bestimmt.

Der molare Extinktionskoeffizient ε340 beträgt hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden zunächst in eine 1 ml

fassende Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von n-Heptan

(100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase

BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 8 Stunden

bei 8°C und anschließend für 16 Stunden bei RT gerührt wird bzw. 24 Stunden bei RT gerührt wurde,

zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer

NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH

gemessen. Diese Messung wurde in verschiedenen Abständen durchgeführt. Die relativen Aktivitäten

wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der

für die Substrate n-Heptan erhaltenen Enzymaktivitäten bestimmt.

8.2.1.7.1 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei

Raumtemperatur über 24 Stunden

Der Photometertest wurde gemäß AAV 7 durchgeführt. Es wurden zunächst in eine 1 ml fassende

Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von n-Heptan (67,

100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase


bei RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch

Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und

der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung wurde in verschiedenen Abständen

durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch

erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat n-Heptan (67) erhaltenen Enzym-

aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 46 dargestellt.


160

Tabelle 46: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über

24 Stunden

Eintrag Zeit [h] relative Aktivität [%]

1 0 100

2 1 99

3 2 87

4 8 50

5 24 0

Vg = 1 ml, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

8.2.1.7.2 Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über

8 Stunden und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur


Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von n-Heptan (67,

100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase


bei 8°C und anschließend für 16 Stunden bei RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion


Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung

wurde in verschiedenen Abständen durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den

Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat

n-Heptan (67) erhaltenen Enzymaktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 47 dargestellt.

Tabelle 47: Stabilität der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden



1 0 100

2 2 97

3 4 76

4 8 74

5 24 73



161

8.2.1.7.3 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei

Raumtemperatur über 24 Stunden


Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von Dodekansäure (66,

100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-

3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 24 Stunden bei

RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch

Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und

der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung wurde in verschiedenen Abständen

durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch

erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat Dodekansäure (66) erhaltenen Enzym-

aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 48 dargestellt.

Tabelle 48: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei Raumtemperatur über

24 Stunden


1 0 100

2 2 100

3 4 93

4 8 60

5 24 27


8.2.1.7.4 Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über

8 Stunden und anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur


Küvette 770 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μl einer DMSO-Lösung von Dodekansäure (66,

100 mM) und 20 μl Enzymlösung des Rohextraktes der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-

3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die für 8 Stunden bei

8°C und anschließend für 16 Stunden bei RT gerührt wurde, zusammengegeben. Die Reaktion wurde

anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphat-

puffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Diese Messung wurde in


162

verschiedenen Abständen durchgeführt. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der

spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (U/mg) mit der für das Substrat Dodekansäure

(66) erhaltenen Enzymaktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 49 dargestellt.

Tabelle 49: Stabilität der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 bei 8°C über 8 Stunden und

anschließenden 16 Stunden bei Raumtemperatur


1 0 100

2 2 92

3 4 93

4 8 80

5 24 73


8.2.1.8 Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 zur Überprüfung des Verlusts der Substrate

durch verschiedene Aufarbeitungsmethoden (AAV 8)

In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und je

einer der Alkohole 1-Oktanol (68), 2-Oktanol (69), 3-Oktanol (70) oder 4-Oktanol (71) miteinander

vermischt und für 0 bis 24 Stunden unter einmaligen Öffnen des Reaktionsgefäßes bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Pyridin (72, 0.3 mmol) als Standard zugegeben. Die

Lösung wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Gemisch dreimal mit je

5 ml Dichlormethan unter Zuhilfenahme eines Schütteltrichters extrahiert bzw. auf mehrere 2 ml

Eppendorf-Gefäße verteilt und dreimal mit je 1 ml Dichlormethan je Eppendorf-Gefäß bei 25°C mit

Hilfe des Thermomixers extrahiert. Anschließend wurden bei der Schütteltrichter-Aufarbeitung die

vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und bei der Eppendorf-Aufarbeitung erfolgte

30 Minuten lang die Phasentrennung durch eine Zentrifuge bei 13000 Umdrehungen pro Minute.

Nach Entfernen der wässrigen Phase wurde das Lösungsmittel der vereinigten organischen Phasen

am Rotationsverdampfer entfernt und die Massen des externen Standards und des jeweiligen

Substrats wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.


163

8.2.1.8.1 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die

Aufarbeitung mit Hilfe eines Schütteltrichters

Die Überprüfung wurde gemäß AAV 8 durchgeführt In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben

wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und je ein Substrat (68, 69, 70, 71, 0.1 mmol, 13.0 µl)

miteinander vermischt und für 0 bis 24 Stunden unter einmaligen Öffnen des Reaktionsgefäßes bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard

zugegeben. Die Lösung wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das

Gemisch dreimal mit je 5 ml Dichlormethan unter Zuhilfenahme eines Schütteltrichters extrahiert.

Anschließend wurden die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel

der vereinigten organischen Phasen wurde am Rotationsverdampfer entfernt und die Massen des

externen Standards und des jeweiligen Substrats wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-

Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 50 dargestellt.


Schütteltrichters

Eintraga Alkohol Dauera [h] Ausbeute des Pyridins [%]


Faktor

1 1-Oktanol 24 97 82 1.18

2 1-Oktanol 0 86 74 1.16

3 2-Oktanol 24 92 82 1.12

4 2-Oktanol 0 94 85 1.11

5 3-Oktanol 24 85 76 1.12

6 3-Oktanol 0 96 95 1.01

7 4-Oktanol 24 95 75 1.27

8 4-Oktanol 0 90 79 1.14 aReaktionszeit


164

8.2.1.8.2 Arbeitsvorschrift zur Überprüfung des Verlusts der Substrate durch die

Aufarbeitung mit Eppendorf-Gefäßen

Die Überprüfung wurde gemäß AAV 8 durchgeführt. In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben

wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und je ein Substrat (68, 69, 70, 71, 0.1 mmol, 13.0 µl)

miteinander vermischt und für 0 bis 24 Stunden unter einmaligem Öffnen des Reaktionsgefäßes bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden Pyridin (72, 0.3 mmol 24.2 µl) als Standard

zugegeben. Die Lösung wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das

Gemisch auf mehrere 2 ml Eppendorf-Gefäße verteilt und dreimal mit je 1 ml Dichlormethan je

Eppendorf-Gefäß bei 25°C mit Hilfe des Thermomixers extrahiert. Anschließend erfolgte 30 Minuten

lang die Phasentrennung durch eine Zentrifuge bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen

der wässrigen Phase wurde das Lösungsmittel der vereinigten organischen Phasen am

Rotationsverdampfer entfernt und die Massen des externen Standards und des jeweiligen Substrats

wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in



Gefäßen

Eintrag Alkohol Dauera [h] Ausbeute des Pyridins [%]


Faktor

1 1-Oktanol 24 97 82 1.18

2 1-Oktanol 0 97 94 1.03

3 2-Oktanol 24 91 81 1.12

4 2-Oktanol 0 94 91 1.03

5 3-Oktanol 24 97 85 1.14

6 3-Oktanol 0 96 93 1.03

7 4-Oktanol 24 91 81 1.12

8 4-Oktanol 0 94 83 1.13 aReaktionszeit


165

8.2.1.9 Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 zur biokatalytischen Hydroxylierung von

n-Oktan (AAV 9)

In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH

7.0, 50 mM) bzw. in einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß wurden 1 ml

Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter Rohextrakt

des Wildtyps, der F87V-Mutante oder der 19A12-Mutante der

P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität

bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt.

Anschließend werden n-Oktan (64, 0.1 mmol), D-Glucose

(0.5 mmol) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.

(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH

7.0) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten

bei -5°C, 0°C, 8°C oder Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion

wurde anschließend durch Zugabe von NADP+ bzw. NADPH

gestartet und das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei 8°C

oder Raumtemperatur und anschließend 16 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt bzw. bei 25°C 24 Stunden im Thermomixer geschüttelt. Danach wurden

Pyridin (72, 0.3 mmol) als externer Standard in reiner Form hinzugegeben und für 5 Minuten bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße

verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das

Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei

550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-

Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene

Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die

Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach

Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in

einen 25 ml-Rundkolben bzw. in einen 10 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von den entstehenden Oktanolen 69 - 71

und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.


166


Die Untersuchung zum Einfluss der Substratkonzentration wurde gemäß AAV 9 durchgeführt. In

einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) bzw. in einem 2 ml-

Eppendorf-Gefäß werden 1 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter Rohextrakt der

F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf

Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64, 0.1 mmol, 11.4 µl),

D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1

verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für

20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt bzw. bei 25°C im Thermomixer geschüttelt. Die Reaktion

wurde anschließend durch Zugabe von NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und das

Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt bzw. bei 25°C im Thermomixer

geschüttelt. Danach wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form

hinzugegeben und für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml

auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je

1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im

Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde die

überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-

Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal

wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei

13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit

Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben bzw. in einen 10 ml-Rundkolben

überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von

den entstehenden Oktanolen 69 - 71 und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-

NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 52 dargestellt.


167

Tabelle 52: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-

Oktan (64)

Eintrag c (64) Umsatza Produktbildunga

[mM] [%] [mol/l] [g/l]

1a 20 11 0.0029 0.38

1bb 20 14 0.0033 0.42

2 100 n.d. n.d. n.d. anach


bWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung


Bei der Cofaktorregenerierung durch den Einsatz einer Glucosedehydrogenase und D-Glucose wurde

als Cofaktor NADP+ benötigt (Abbildung 128).


situ-Cofaktorregenerierung


168

Bei dem System ohne Cofaktorregenerierung wurde als Cofaktor das kostenintensivere NADPH

eingesetzt (Abbildung 129).

Abbildung 129: Hydroxylierung von n-Oktan (64) ohne Cofaktorregenerierung

Die Untersuchung zum Einfluss des eingesetzten Cofaktor wurde gemäß AAV 9 durchgeführt. In

einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter

Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität

bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64,

0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.

(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) bzw. nur n-Oktan (64, 0.1 mmol,

11.4 µl), im Falle von NADPH als Cofaktor dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für

20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von NADP+

bzw. NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard

in reiner Form hinzugegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden

die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den

Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch

30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert.

Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf

neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde

noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten

Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe

einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben überführt und das

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen von den entstehenden

Oktanolen 69 - 71 und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie

bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 53 dargestellt.


169

Tabelle 53: Einfluss des eingesetzten Cofaktors und der Cofaktorregenerierung auf die

biokatalytische Hydroxylierung von n-Oktan (64)

Eintrag GDH Cofaktor Umsatza Produktbildunga

[U/mmol] [mmol] [%] [mol/l] [g/l]

1a 36 0.010

NADP+ 11 0.0029 0.38

1bb 36 0.010 NADP+

14 0.0033 0.42

2 0 0.010

NADPH n.d. n.d. n.d.

anach



8.2.1.9.3 Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+

Die Untersuchung zum Einfluss der Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors NADP+ wurde gemäß AAV

9 durchgeführt. In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und

lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol,

Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden

n-Oktan (64, 0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus

Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Das

Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde

anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg bzw. 0.01 mmol, 7.44 mg)

gestartet und das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach

wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form hinzugegeben und für

5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-

Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml

Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im


überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue Eppendorf-




Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am


und Pyridin (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die



170



Eintrag NADP+ Umsatza Produktbildunga

[mmol] [%] [mol/l] [g/l]

1a 0.010 11 0.0029 0.38

1bb 0.010 14 0.0033 0.42

2a 0.002 14 0.0031 0.41

2bc 0.002 13 0.0030 0.39 anach



cWiederholungsversuch zu 2a zur

Validierung


Die Untersuchung zum Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 wurde gemäß AAV 9

durchgeführt. In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und

lyophilisierter Rohextrakt des Wildtyps, der F87V-Mutante oder der 19A12-Mutante der P450-

Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander

vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64, 0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und

Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer

pH 7.0) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.

Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) gestartet und das

Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden Pyridin (72,

0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form hinzugegeben und für 5 Minuten bei






171

Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene




einen 25 ml-Rundkolben bzw. in einen 10 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am





n-Oktan (64)

Eintrag P450 BM-3 Umsatza Produktbildunga

[%] [mol/l] [g/l]

1 F87V 11 0.0029 0.38

2 19A12 5 0.0009 0.11

3 Wildtyp 16 0.0031 0.40 anach



Die Untersuchung zum Einfluss der der Reaktionstemperatur wurde gemäß AAV 9 durchgeführt. In

einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyophilisierter


bezogen auf Dodekansäure (66)) miteinander vermischt. Anschließend wurden n-Oktan (64,

0.1 mmol, 11.4 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.

(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Das Reaktions-


172

gemisch wurde für 20 Minuten bei -5°C, 0°C, 8°C oder Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde

anschließend durch Zugabe von NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch

wurde 8 Stunden bei 8°C oder Raumtemperatur und anschließend 16 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Danach wurden Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als externer Standard in reiner Form

hinzugegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt bzw. geschüttelt. Anschließend

wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den



Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf

neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch

zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei







Eintrag Temperatur Umsatza Produktbildunga

[%] [mol/l] [g/l]

1a RT 14 0.0031 0.41

1bb RT 13 0.0030 0.39

2 8°C-RT 16 0.0036 0.47 anach




173

Charakterisierung der entstehenden Oktanole anhand des Eintrags 2 in Tabelle 56:

2-Oktanol (69): 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 0.83-0.88 (m, 6H, H-C1), 1.21-1.28 (m, 10H,

H-C2), 3.67-3.73 (m, 1H, H-C3)


H-C5), 3.39-3.45 (m, 1H, H-C6)


H-C8), 3.49-3.53 (m, 1H, H-C9)

8.2.1.10 Allgemeine Arbeitsvorschrift 10 zur biokatalytischen Hydroxylierung von

n-Butan (AAV 10)

In einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0,

50 mM) und lyophilisierter Rohextrakt des Wildtyps, der F87V-Mutante oder

der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzymaktivität

bezogen auf Dodekansäure (66) bzw. n-Heptan (67)) miteinander vermischt.

Anschließend wurden NADPH (0.002 mmol) bzw. D-Glucose (0.5 mmol),

Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0)

und NADP+ (0.002 mmol) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-Butan (65) zugegeben, indem man die

Öffnung der Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des Rundkolbens hielt und das Ventil für ca.

1 Sekunde öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest verschlossen und das Reaktionsgemisch

wurde 8 Stunden bei -5°C, -1/-2°C, 0°C, 8°C oder RT gerührt. Anschließend wurde sofort

aufgearbeitet oder das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden in

den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml zu je 1 ml auf

zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml



überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-

Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch





174

Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Masse des entstehenden 2-Butanols (35) wurde aus

der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.


Die Untersuchung zum Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase BM-3 wurde gemäß AAV 10

durchgeführt. In einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)

und lyophilisierter Rohextrakt des Wildtyps, der F87V-Mutante oder der 19A12-Mutante der P450-

Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66) bzw. n-Heptan (67))

miteinander vermischt. Anschließend wurden D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg), Glucosedehydrogenase

aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) und NADP+ (0.002 mmol,

1.48 mg) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-Butan (65) zugegeben, indem man die Öffnung der

Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des Rundkolbens hielt und das Ventil für ca. 1 Sekunde

öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest verschlossen und das Reaktionsgemisch wurde

8 Stunden bei 8°C gerührt. Das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von

24 Stunden in den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml

zu je 1 ml auf zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-

Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten

Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde

die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-






der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 57

dargestellt.


175


von n-Butan (65)

Eintrag P450 BM-3 Produktbildunga

[mol/l] [g/l]

1 19A12 0.0013 0.10

2 F87V n.d. n.d.

3 Wildtyp n.d. n.d. aProduktbildung nach



Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionstemperatur wurde gemäß AAV 10 durchgeführt. In

einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und

lyophilisierter Rohextrakt der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzym-

aktivität bezogen auf n-Heptan (67)) miteinander vermischt. Anschließend wurden D-Glucose

(0.5 mmol, 90.1 mg), Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und

Phosphatpuffer pH 7.0) und NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-

Butan (65) zugegeben, indem man die Öffnung der Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des

Rundkolbens hielt und das Ventil für ca. 1 Sekunde öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest

verschlossen und das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei -5°C, -1/-2°C, 0°C, 8°C oder

Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von

24 Stunden in den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml

zu je 1 ml auf zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-


Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Danach wurde

die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-


176


zweimal wiederholt. Anschließende erfolgt die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei





dargestellt.


Eintrag Temperatur Produktbildunga

[mol/l] [g/l]

1 RT 0.0008 0.06

2 8°C-RT 0.0013 0.10

3 0°C-RT 0.0021 0.16

4 -1/-2°C-RT 0.0017 0.13

5 -5°C-RT 0.0006 0.04 aProduktbildung nach


Charakterisierung des entstehenden 2-Butanols anhand des Eintrags 3 in Tabelle 58:

1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 0.99 (t, 3J = 7.35 Hz, 3H, H-C1), 2.10 (s, 3H, H-C2), 2.47

(q, 2H, H-C3)


177


Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionstemperatur wurde gemäß AAV 10 durchgeführt. In

einem gekühlten 100 ml-Rundkolben wurden 10 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und lyo-

philisierter Rohextrakt der 19A12-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (3.82 U, Enzymaktivität

bezogen auf n-Heptan (67)) miteinander vermischt. Anschließend wurden D-Glucose (0.5 mmol,

90.1 mg), Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (18 U, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer

pH 7.0) und NADP+ (0.002 mmol, 1.48 mg) dazu gegeben. Danach wurde zügig n-Butan (65)

zugegeben, indem man die Öffnung der Monoblockdose kopfüber in die Öffnung des Rundkolbens

hielt und das Ventil für ca. 1 Sekunde öffnete. Der 100 ml-Rundkolben wurde fest verschlossen und

das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei 0°C gerührt. Entweder wurde danach sofort

aufgearbeitet oder das Reaktionsgemisch erwärmte sich bei einer Reaktionszeit von 24 Stunden in

den anschließenden 16 Stunden auf Raumtemperatur. Anschließend wurden die 10 ml zu je 1 ml auf

zehn 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml



überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in fünf neue 2 ml-







dargestellt.

Tabelle 59: Einfluss der Reaktionszeit auf die biokatalytische Hydroxylierung von n-Butan (65)


178

Eintrag Temperatur Dauera Produktbildungb

[h] [mol/l] [g/l]

1 0°C-RT 24 0.0021 0.16

2 0°C 8 0.0019 0.14 aReaktionszeit,



8.2.2 Kombination von Oxidationsreaktionen zur Darstellung von Cycloalkanonen

8.2.2.1 Spektrophotometrische Bestimmung der Aktivitäten verschiedener P450-

Monooxygenasen BM-3





DMSO-Lösung von Cyclooktan (73, 100 mM) und 100 μl Enzymlösung des Rohextraktes der 19A12-

oder der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium (10 mg auf 10 ml

Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach

5 Minuten durch Zugabe von 200 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0,

50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 60

dargestellt.

Tabelle 60: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten verschiedener P450-Monooxygenasen

bezogen auf Cyclooktan (73)

Eintrag P450 BM-3 U/mg

[µmol/min*mg]

1 19A12 0.1749

2 F87V 0.0074


179

8.2.2.2. Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 zur Untersuchung der Analytik mit Hilfe

eines Standards (AAV 11)

In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß, in einem 25 ml- oder in einem 10 ml-Rundkolben wurden 1 ml bis

5 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75, 0.1 mmol) miteinander vermischt

und für 5 Minuten im Thermomixer bei 25°C geschüttelt bzw. für 5 Minuten bei Raumtemperatur

gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol) hinzugegeben. Anschließend wurde das

2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan versetzt bzw. die 4 ml oder die 5 ml wurden

zu je 1 ml auf vier bzw. fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den



Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute

zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen

abgenommen und in vier bzw. fünf neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene




einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei

900 mbar entfernt. Die Massen des Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der

Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.

8.2.2.2.1 Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards bei einem

Reaktionsvolumen von 1 ml

Die Untersuchung der Analytik mit Hilfe eines Standards erfolgte gemäß AAV 11. In einem 2 ml-

Eppendorf-Gefäß wurden 1 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75,

0.1 mmol, 12.6 mg) miteinander vermischt und für 5 Minuten im Thermomixer bei 25°C geschüttelt.

Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) hinzugegeben. Anschließend wurde das

2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde

durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C

extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 30 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro

Minute zentrifugiert. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde

die organische Phase in einen 10 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72)

wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.


180

Durchschnittliche Wiederfindung an Cyclooktanon (75): 95%

Durchschnittliche Wiederfindung an Pyridin (72): 94%




Rundkolben wurden 4 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75, 0.1 mmol,

12.6 mg) miteinander vermischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Vor der

Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) hinzugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu

je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen

mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im

Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur

Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die

überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-




Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am








Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpufferlösung (pH 7.0, 50 mM) und Cyclooktanon (75, 0.1 mmol,

12.6 mg) miteinander vermischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Vor der

Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) hinzugegeben. Anschließend wurden die 5 ml zu

je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen




181











8.2.2.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 zur Hydroxylierung von Cyclooktan mit

Cofaktorregenerierung zum Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der

Monooxygenase (AAV 12)

In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß, in einem 25 ml- oder in einem 10 ml-

Rundkolben wurden zu 1 ml bis 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)

nacheinander 7.64 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73))

bzw. 38.2 U/mmol (Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)) der

F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (als lyophilisierter

Rohextrakt), Cyclooktan (73, 0.1 mmol), D-Glucose (0.5 mmol) und

36 U/mmol Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp. (1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH

7.0) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol)

gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurden Pyridin (72,

0.3 mmol), als Standard zugegeben. Anschließend wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit

1 ml Dichlormethan versetzt bzw. die 4 ml oder die 5 ml wurden zu je 1 ml auf vier bzw. fünf 2 ml-

Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml

Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurden durch 30 Minuten Schütteln im







182


Kanüle wurde die organische Phase in einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden

Cycloalkanols 74 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-

Spektroskopie bestimmt.

8.2.2.3.1 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 1 ml

Reaktionsvolumen und 38.2 U/mmol Monooxygenase

Die Synthese des Cyclooktanols (74) erfolgte gemäß AAV 12. In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß wurden

zu 1 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante

der P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)),

Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus

Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Die

Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet

und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol,

24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml



Phasentrennung 30 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Nach Entfernen der

wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 10 ml-Kolben

überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des

entstehenden Cycloalkanols 74 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der

1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 61 dargestellt.

8.2.2.3.2 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung in 4 ml


Die Synthese des Cyclooktanols (74) erfolgte gemäß AAV 12. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu

4 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der

P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan

(73, 0.1 mmol, 13.6 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp.

(36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Die Reaktion

wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für


183

24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl)

als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml oder die 5 ml zu je 1 ml auf vier bzw. fünf

2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml

Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wird durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer

Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung

10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende

wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße

gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt.

Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen

pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die

organische Phase in einen 10 ml- bzw. 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanols 74 und des

Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Das Ergebnis

ist in Tabelle 61 dargestellt.

8.2.2.3.3 Hydroxylierung von Cyclooktan mit Cofaktorregenerierung mit 5 ml


Die Synthese des Cyclooktanols (74) erfolgte gemäß AAV 12. In einem 10 ml-Rundkolben wurden zu

5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der

P450-Monooxygenase BM-3 (38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)),

Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), D-Glucose (0.5 mmol, 90.1 mg) und Glucosedehydrogenase aus

Bacillus sp. (36.0 U/mmol, 1:1 verdünnt in Glycerin und Phosphatpuffer pH 7.0) dazu gegeben. Die

Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet

und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol,

24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml oder die 5 ml zu je 1 ml auf vier bzw.

fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml









184



Cycloalkanols 74 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-


Tabelle 61: Abhängigkeit der biokatalytischen Hydroxylierung von Cyclooktan (73) von der

Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-Monooxygenase

anach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,

dWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung

Eintraga c (73) P450 BM-3 74a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga


1a 20 38.20 6.6 0.86 7 7 27 0.0017 0.172

1bd 20 38.20 6.6 0.69 6 6 10 0.0013 0.138

2 100 38.20 33.0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

3 25 7.64 10.8 1.31 10 10 27 0.0026 0.328


185

8.2.2.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 13 zur Doppeloxidation von Cyclooktan

(AAV 13)

In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß bzw. in einem 10 ml- oder 25 ml-

Rundkolben wurden zu 1 ml bis 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM,

1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der

F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 bis 22.92 U/mmol,

Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73) bzw. 38.2 U/mmol, Enzym-

aktivität bezogen auf Dodekansäure (66)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol) und

LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch

Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol) als Standard zugegeben. Anschließend

wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan versetzt bzw. die 5 ml werden zu

je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen




überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in neue 2 ml-Eppendorf-






Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-

Spektroskopie bestimmt.

8.2.2.4.1 Einfluss des Substratkonzentration

Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 13. In einem 2 ml-Eppendorf-Gefäß bzw.

10 ml-Rundkolben werden zu 1 ml bzw. 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesium-

chlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3

(38.2 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Dodekansäure (66)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl)

und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend

durch Zugabe des Cofaktors NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard


186

zugegeben. Anschließend wurde das 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml Dichlormethan

versetzt bzw. die 5 ml wurden zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen

Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System

wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C

extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 30 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro

Minute zentrifugiert. Nach Entfernen der wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde

die organische Phase in einen 10 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotations-

verdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins

(72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in


Tabelle 62: Einfluss der Substratkonzentration auf die biokatalytische Doppeloxidation von

Cyclooktan (73)

anach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH

Eintrag

c (73) 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga

[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1 20 0.13 1 1 2 0.0002 0.026

2 100 0.13 1 1 1 0.0010 0.130


187

8.2.2.4.2 Doppeloxidation von Cyclooktan mit 4 ml Reaktionsvolumen und


Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 13. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu

4 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter


bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1

verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors

NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der

Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden

die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den





abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion

mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung

durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der wässrigen

Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt

und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des

entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der

1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 63 dargestellt.

8.2.2.4.3 Doppeloxidation von Cyclooctan mit 5 ml Reaktionsvolumen und



5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter


bezogen auf Dodekansäure (66)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1

verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors

NADPH (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der


die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den



188




abgenommen und in fünf neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion






1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 63 dargestellt.

Tabelle 63: Einfluss der Substratkonzentration und der Menge der eingesetzten P450-

Monooxygenase auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73)

anach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,

dWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung

Eintrag

c (73) P450 BM-3 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga


1 20 38.20 6.6 0.47 4 3 8 0.0007 0.094

2a 25 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140

2bd 25 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090

2cd 25 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100


189

8.2.2.4.4 Einfluss der eingesetzten Menge an P450-Monooxygenase

Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 13. In einem 25 ml-Rundkolben werden zu

4 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) lyophilisierter Rohextrakt der F87V-

Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 bis 22.92 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf

Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit

Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADPH

(0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der















Doppeloxidation von Cyclooktan (73)


190

aUmsatz nach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,


8.2.2.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 14 zur Doppeloxidation von Cyclooktan mit

Isopropanol als Additiv (AAV 14)

In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu 997.5 µl bis 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM

Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64

U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol), IPA (30, 2.5 bis

10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde

anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol) gestartet und für 24 bis 48 Stunden bei

Raumtemperatur bzw. 8 Stunden bei 8°C und anschließender Erwärmung auf Raumtemperatur

innerhalb der verbleibenden 16 Stunden gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol)

als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße



550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei

13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in

den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben

beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte

die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach


einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar

entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der

Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt (Tabelle 65).

Eintrag

P450 BM-3 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga

[U/mmol] [g/l] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 7.64 10.8 0.56 4 4 11 0.0011 0.140

1be 7.64 10.8 0.36 3 3 5 0.0007 0.090

1ce 7.64 10.8 0.40 3 3 7 0.0008 0.100

2 15.28 21.5 0.41 3 3 13 0.0008 0.103

3 22.92 32.3 0.37 3 3 10 0.0007 0.093


191


des Additivs Isopropanol (30) und mit dessen Einsatz

aUmsatz nach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,


Charakterisierung des entstehenden Cyclooktanons anhand des Eintrags 2a in Tabelle 65:

1H-NMR (400 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 1.38 (m, 2 H, H-C1), 1.57 (m, 4 H, H-C2), 1.89 (m, 4 H,

H-C3), 2.43 (m, 4 H, H-C3)

Eintrag

IPA 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga

[µl] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 0 0.56 4 4 11 0.0011 0.140

1b 0 0.36 3 3 5 0.0007 0.090

1c 0 0.40 3 3 7 0.0008 0.100

2a 10 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

2bd 10 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

2cd 10 1.36 11 12 26 0.0027 0.340


192

Abbildung 130: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclooktan (73) mit der 19A12-

Mutante und Isopropanol (30) als Additiv



3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter


bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH

(200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe

des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei

Raumtemperatur bzw. 8 Stunden bei 8°C und anschließender Erwärmung auf Raumtemperatur

innerhalb der verbleibenden 16 Stunden gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol,

24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-

Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan

versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des


193

Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei

13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in

den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier neue 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben

beschriebene Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte

die Phasentrennung durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach


einen 25 ml-Kolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar

entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der

Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 66

dargestellt.

Tabelle 66: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die biokatalytische Doppeloxidation von

Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

aUmsatz nach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,


Eintrag T

75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga

[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a RT 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1bd RT 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1cd RT 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 8°C 1.31 11 12 27 0.0026 0.328


194





bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH

(200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe

des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bzw. 48 Stunden bei


zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die

wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-

System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und

25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro

Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen









von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv


195

aReaktionszeit,

bUmsatz nach


cUmsatz nach IS,

dUmsatz nach ISH,

eWiederholungsversuche zu 1a

zur Validierung

8.2.2.5.3 Einfluss der eingesetzten P450-Monooxygenase bei einem




Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol,

Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und


Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei


zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die

wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-

System wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und

25°C extrahiert. Anschließend wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro

Minute zentrifugiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen






entstehenden Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-

NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 68 dargestellt.

Eintrag

Dauera 75b Umsatzb Umsatzc Umsatzd Produktbildungb

[h] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 24 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1be 24 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1ce 24 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 48 1.38 11 11 40 0.0027 0.345


196


25 mM auf die biokatalytische Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von

Isopropanol (30) als Additiv

aUmsatz nach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,

dWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung,

eWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung


Die Synthese des Cyclooktanons (75) erfolgte gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden

997.5 bis 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander

lyophilisierter Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3

(7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA

(30, 10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde

Eintrag Mutante


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1bd F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1cd F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

2be 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

2ce 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633


197

anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden

bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als

Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße bzw.

der 1 ml auf ein neues 2 ml-Eppendorf-Gefäß verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-


Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C extrahiert. Anschließend

wurde zur Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach

wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen und in vier bzw.

ein neues 2 ml-Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan

wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten


einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Kolben überführt und das


Cycloalkanons 75 und des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-

Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind für die 19A12-Mutante in Tabelle 69 und für die F87V-

Mutante in Tabelle 70 dargestellt.

Einsatz der 19A12-Mutante

Tabelle 69: Einfluss der 19A12-Mutante und der Substratkonzentration auf die biokatalytische

Doppeloxidation von Cyclooktan (73) von unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

aUmsatz nach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,


Eintrag


[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 25 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

1bd 25 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

1cd 25 2.53 20 20 40 0.0050 0.633

2 100 0.80 6 6 14 0.0063 0.800


198

Einsatz der F87V-Mutante


Doppeloxidation von Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

anach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,



Substratkonzentration von 100 mM


997.5 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander 7 lyophilisierter

Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol,

Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan (73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 2.5 μl) und


Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei


zugegeben. Anschließend wurde die wässrige Phase in ein 2 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und mit 1

ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System wurde durch 30 Minuten Schütteln im


Phasentrennung 10 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Danach wird die

überstehende wässrige Phase in dem Eppendorf-Gefäß abgenommen und in ein neues 2 ml-





Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und

Eintrag


[mM] [mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a 4 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1bd 4 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1cd 4 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 1 0.49 4 4 10 0.0039 0.490


199

des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die




aUmsatz nach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH

8.2.2.5.6 Einfluss von der Präsens der P450-Monooxygenase

Die Untersuchung über die Notwendigkeit der P450-Monooxygenase erfolgte gemäß AAV 14. In

einem 25 ml-Rundkolben werden zu 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM, 1 mM Magnesium-

chlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-Mutante bzw. des

Leervektors der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan

(73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit

Glycerin) gegeben. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.01 mmol,

7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der Aufarbeitung wurde

Pyridin (72, 0.3 mmol, 24.2 µl) als Standard zugegeben. Anschließend wurden die 4 ml zu je 1 ml auf

Eintrag Mutante


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1 19A12 0.80 6 6 14 0.0063 0.80

2 F87V 0.49 4 4 10 0.0039 0.49


200

vier 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml









Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Massen des entstehenden Cycloalkanons 75 und

des Pyridins (72) wurden aus der Auswaage mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die



Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

Eintrag Enzym


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

1a F87V 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1bd F87V 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1cd F87V 1.36 11 12 26 0.0027 0.340


201

aUmsatz nach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,



8.2.2.5.7 Einfluss von der Präsens der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir

Die Untersuchung über die Notwendigkeit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir erfolgte

gemäß AAV 14. In einem 25 ml-Rundkolben wurden zu 3990 µl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM,

1 mM Magnesiumchlorid) nacheinander lyophilisierter Rohextrakt der 19A12- bzw. der F87V-

Mutante der P450-Monooxygenase BM-3 (7.64 U/mmol, Enzymaktivität bezogen auf Cyclooktan

(73)), Cyclooktan (73, 0.1 mmol, 13.6 µl), IPA (30, 10 μl) und LK-ADH (200 U/mmol, 1:1 verdünnt mit

Glycerin) bzw. keine LK-ADH gegeben. Die Reaktion wurde anschließend Zugabe des Cofaktors NADP+

(0.01 mmol, 7.44 mg) gestartet und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Vor der







abgenommen und in vier neue 2 ml- Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion







Eintrag Enzym


[mg] [%] [%] [%] [mol/l] [g/l]

2a 19A12 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

2be 19A12 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

2ce 19A12 2.53 20 20 40 0.0050 0.633

3 Leer-

vektor n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.


202


Cyclooktan (73) unter Einsatz von Isopropanol (30) als Additiv

anach


bUmsatz nach IS,

cUmsatz nach ISH,



Eintrag Mutante

LK-ADH 75a Umsatza Umsatzb Umsatzc Produktbildunga

[U/mmol] [mg] [%] [%] [%] [mmol/ml] [mg/ml]

1a F87V 200 1.41 11 11 26 0.0028 0.353

1bd F87V 200 1.29 10 11 34 0.0026 0.323

1cd F87V 200 1.36 11 12 26 0.0027 0.340

2 F87V 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

3a 19A12 200 2.54 20 20 37 0.0050 0.635

3be 19A12 200 2.74 22 25 35 0.0054 0.685

3ce 19A12 200 2.53 20 20 40 0.0050 0.633

4 19A12 0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.


203

8.2.3 Enzymatische Oxidationsreaktionen mit einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase

als Katalysator zur Herstellung von εεεε-Caprolacton

8.2.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 15 für die spektrophotometrische Bestimmung

der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (AAV 15)

Zur Bestimmung der Enzymaktivität wurden Stammlösungen des Cyclohexanols (16, 10 mM) und des

als Referenzsubstanz verwendeten 1-Phenylethanols und eine 12.5 mM NADP+-Lösung in

Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) hergestellt. Es wurden 960 μl der entsprechenden Substratlösung

und 20 μl NADP+-Lösung in eine Küvette pipettiert und durch Schütteln gut vermischt. Anschließend

wurden 20 μl der entsprechend verdünnten LK-ADH-Lösung (Rohextrakt) zugegeben und die Lösung

wurde noch ein weiteres Mal gut durchmischt. Die Messung wurde anschließend so schnell wie

möglich gestartet. Es wurde die Zunahme von NADPH beobachtet (Tabelle 74).

Tabelle 74: Spektrophotometrisch bestimmte Aktivitäten der LK-ADH

Eintrag Substrat U/ml [μmol/min*ml] relative Aktivitäta [%]

1 1-Phenylethanol 79.4 100

2 Cyclohexanol 55.2 70

abezogen auf 1-Phenylethanol. Vg = 1 ml, f = 101, ε = 6,3 ml/(μmol·cm), Vp = 0,02 ml, d = 1 cm.

8.2.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 16 für die biokatalytische Doppeloxidation von

Cyclohexanol zur Synthese von εεεε-Caprolacton (AAV 16)

In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)

und Rohextrakt der BVMO ECS-MO1 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf

Cyclohexanon (41)) vermischt und gut geschüttelt. Anschließend wurden

Cyclohexanol (16, 0.1 mmol bis 0.5 mmol), 1 mg MgCl2 und LK-ADH (40 U,

Enzymaktivität bezogen auf Acetophenon, 1:1 verdünnt mit Glycerin) dazu

gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten im Thermomixer

bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe von NADP+


204

(0.002 mmol bis 0.01 mmol) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden bei









einen 25 ml-Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar

entfernt. Die Masse des entstehenden Anteils an ε-Caprolacton (53) wurde ausgehend von der

Auswaage des Rohprodukts mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.

8.2.3.2.1. Einfluss der Cofaktormenge

Die Untersuchung zum Einfluss des eingesetzten Cofaktors wurde gemäß AAV 16 durchgeführt. In

einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und Rohextrakt der BVMO

ECS-MO1 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf Cyclohexanon (41)) vermischt und gut geschüttelt.

Anschließend wurden Cyclohexanol (16, 0.1 mmol, 10.5 μl), 1 mg MgCl2 und LK-ADH (40 U,

Enzymaktivität bezogen auf Acetophenon, 1:1 verdünnt mit Glycerin) dazu gegeben. Das

Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten im Thermomixer bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion

wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.002 mmol bis 0.01 mmol, 1.48 mg bis

7.44 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt und die wässrigen

Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das Zweiphasen-System

wurde durch 30 Minuten Schütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei 550 rpm und 25°C

extrahiert. Danach wurde die überstehende wässrige Phase in den Eppendorf-Gefäßen abgenommen

und in fünf neue Eppendorf-Gefäße gegeben. Die oben beschriebene Extraktion mit Dichlormethan

wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung durch 30 Minuten


einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-Rundkolben überführt und das

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die Masse des entstehenden Anteils

an ε-Caprolacton (53) wurde ausgehend von der Auswaage des Rohprodukts mit Hilfe der 1H-NMR-



205


Stoffmenge des eingesetzten Cofaktors

Eintrag

ADH BVMO NADP+ Umsatza Produktbildunga

[U] [U] [Äq.] [%] [mol/l] [g/l]

1 40 3.82 0.02 97 0.0192 2.20

2 40 3.82 0.10 99 0.0197 2.25

anach

1H-NMR und Auswaage bestimmt.

Charakterisierung des entstehenden ε-Caprolactons (53) anhand des Eintrags 1 in Tabelle 75:

1H-NMR (300 MHz, CD3OD, RT): δ [ppm] = 1.68-1.80 (m, 6H, H-C1), 2.62 (m, 2H, H-C2), 4.24 (m, 2H,

H-C3)


206

Abbildung 131: 1H-NMR-Spektrum von der Doppeloxidation von Cyclohexanol (16)

8.2.3.2.2 Abhängigkeit von der eingesetzten Substratkonzentration

Die Untersuchung zum Einfluss der eingesetzten Substratkonzentration wurde gemäß AAV 16

durchgeführt. In einem 10 ml-Rundkolben wurden 5 ml Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) und

Rohextrakt der BVMO ECS-MO1 (3.82 U, Enzymaktivität bezogen auf Cyclohexanon (41)) vermischt

und gut geschüttelt. Anschließend wurden Cyclohexanol (16, 0.1 mmol bis 0.5 mmol, 10.5 μl bis

52.5 µl), 1 mg MgCl2 und LK-ADH (40 U, Enzymaktivität bezogen auf Acetophenon, 1:1 verdünnt mit

Glycerin) dazu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten im Thermomixer bei

Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde anschließend durch Zugabe des Cofaktors NADP+

(0.002 mmol, 1.48 mg) gestartet und das Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden bei Raum-

temperatur gerührt. Anschließend wurden die 5 ml zu je 1 ml auf fünf 2 ml-Eppendorf-Gefäße verteilt

und die wässrigen Phasen in den Eppendorf-Gefäßen mit je 1 ml Dichlormethan versetzt. Das

Zweiphasen-System wurde durch 30 MinutenSchütteln im Thermomixer Comfort des Typs 5355 bei




207

Extraktion mit Dichlormethan wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte die Phasen-

trennung durch 30 min. Zentrifugieren bei 13000 Umdrehungen pro Minute. Nach Entfernen der

wässrigen Phase mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurde die organische Phase in einen 25 ml-

Rundkolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900 mbar entfernt. Die

Masse des entstehenden Anteils an ε-Caprolacton (53) wurde ausgehend von der Auswaage des

Rohprodukts mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt (Tabelle 76).



Eintrag

ADH BVMO c (Cyclohexanol) Umsatza Produktbildunga

[U] [U] [mM] [%] [mg/ml]

1a 40 3.82 20 mM 97 2.20

1bb 40 3.82 20 mM 99 2.25

2 40 3.82 40 mM 97 4.41

3 40 3.82 60 mM 94 6.45

4 40 3.82 80 mM 36 3.21

5 40 3.82 100 mM 24 2.72

anach




208

8.2.3.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 17 zur Inhibierung der BVMO ECS-MO1 durch

Cyclohexanon und das Produkt εεεε-Caprolacton (AAV 17)

Die Enzymaktivität wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung

des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des Cyclohexanons (41) als

Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden

zunächst in eine 1 ml fassende Küvette Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), in Phosphatpuffer gelöstes

Cyclohexanon (41, 300 mM) und eine Enzym-Lösung der BVMO ECS-MO1 (in Phosphatpuffer (pH 7.0,

50 mM)) zusammengegeben. Es wurde so viel Volumen der Cyclohexanon-Stammlösung (300 mM)

zugegeben, bis eine Konzentration von 10 mM bis 100 mM im Photometertest erreicht wurde. Bei

der Untersuchung der Inhibierung von ε-Caprolacton (53) wurde die Cyclohexanon-Konzentration auf

25 mM gehalten und so viel Volumen einer ε-Caprolacton-Stammlösung zugegeben, bis eine

ε-Caprolacton-Konzentration von 0.025 M bis 0.400 M erreicht wurde. Die Reaktion wurde

anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 50 μl einer NADPH-Lösung (0.8 mM in

Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die Ergebnisse

sind für die Inhibierung durch Cyclohexanon (41) in Tabelle 77 und für die Inhibierung durch

ε-Caprolacton (53) in Tabelle 78 dargestellt.

Tabelle 77: Inhibierung der BVMO durch Cyclohexanon (41)

Eintrag c (Cyclohexanon) [mM] relative Aktivität [%]

1 0 0

2 10 100

3 20 72

4 35 63

5 50 57

6 100 57



209

Tabelle 78: Inhibierung der BVMO durch ε-Caprolacton (53)

Eintrag c (εεεε-Caprolacton) [M] relative Aktivität [%]

1 0 100

2 0.025 91

3 0.050 79

4 0.100 67

5 0.200 38

6 0.400 14


8.2.3.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 18 zur Stabilität der BVMO ECS-MO1 (AAV 18)

Die Enzymaktivität der BVMO wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch

Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart von Cyclohexanon (41)

als Substrat bestimmt. Der molare Extinktionskoeffizient ε340 betrug hierbei 6.3 mM-1cm-1. Es wurden

zunächst in eine 1 ml fassende Küvette 725 μl Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 125 μl einer Lösung

von Cyclohexanon (41) in Puffer (200 mM) und 100 μl einer Lösung der BVMO ECS-MO1 (3.82 U in

Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) bzw. einer mit Cyclohexanol (16) bzw. mit Cyclohexanon (41,

25 mM bis 100 mM) bzw. mit ε-Caprolacton (53, 0.1 M bis 1.0 M) versetzten Lösung der BVMO ECS-

MO1 (3.82 U in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)), die 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird,

zusammengegeben. Die Reaktion wurde anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 50 μl einer

NADPH-Lösung (0.8 mM in Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM)) gestartet und der Verbrauch an NADPH

gemessen. Diese Messung wurde in mehreren definierten Zeitabständen innerhalb von 24 Stunden

durchgeführt. Die Ergebnisse sind für die Stabilität der BVMO ohne Zusatz in Tabelle 79, mit Zusatz

von verschiedenen Konzentrationen durch Cyclohexanol (16) in den Tabellen 80-82 mit Zusatz von

verschiedenen Konzentrationen durch Cyclohexanon (41) in den Tabellen 83-85 und mit Zusatz von

verschiedenen Konzentrationen ε-Caprolacton (53) in den Tabellen 86 und 87 dargestellt.


210

Stabilität der BVMO ohne Zusatz

Tabelle 79: Stabilität der BVMO ohne Zusatz


1 0.5 100

2 1.0 100

3 2.0 99

4 4.0 96

5 7.0 79

6 24.0 60


Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen an Cyclohexanol (16)

Tabelle 80: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanol (16)


1 0 100

2 0.5 96

3 1.5 94

4 3.5 93

5 6.5 87

6 24.0 58




1 0 100

2 1.0 102

3 3.0 101

4 7.0 87

5 24.0 72



211



1 0 100

2 1.0 96

3 2.5 93

4 4.0 89

5 7.0 76

6 24.0 39


Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen an Cyclohexanon (41)

Tabelle 83: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 25 mM Cyclohexanon (41)


1 0 100

2 1.0 102

3 2.0 89

4 7.0 83

5 24.0 48




1 0 100

2 1.0 92

3 2.0 82

4 4.0 77

5 7.0 66

6 24.0 36



212



1 0 100

2 1.0 94

3 2.0 86

4 4.0 82

5 7.0 58

6 24.0 21


Stabilität der BVMO bei verschiedenen Konzentrationen an ε-Caprolacton (53)

Tabelle 86: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.1 M ε-Caprolacton (53)


1 0 100

2 1.0 99

3 3.0 97

4 5.0 88

5 7.0 82

6 24.0 67


Tabelle 87: Stabilität der BVMO bei einer Konzentration von 0.25 M ε-Caprolacton (53)


1 0 100

2 1.0 84

3 2.0 74

4 4.0 57

5 8.0 32

6 24.0 8



213

8.2.4 Palladium-katalysierte Kreuzkupplung in Kombination mit einer

enzymatischen Reduktionsreaktion

8.2.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 zur Suzuki-Kreuzkupplung von

4‘-Iodacetophenon zur Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (AAV 19)

Es wurde eine Suspension aus 4 mol% Palladium(II)chlorid und

5 mol% TPPTS (105), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in

0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wurde

diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus

Natriumhydrogen-carbonat (1.0 mmol), 4'-Iodacetophenon (106,

0.4 mmol) und Phenylboronsäure (101b, 0 bis 0.4 mmol) und in 5 ml

entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser gegeben.

Anschließend wurden nur in Kapitel 8.2.4.1.1 bis zu 100 mg HSA (human serum albumin) zugegeben.

Nach 5.5 bis 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm mit zuweilen punktueller

Protokollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M

Salzsäure angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.

8.2.4.1.1 Einfluss der Proteinkonzentration

Die Untersuchung zum Einfluss der Proteinkonzentration wurde gemäß AAV 19 durchgeführt. Es

wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol,

11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.

Nach 30 Minuten wurde diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus Natriumhydrogen-

carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und Phenylboronsäure

(101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser

gegeben. Anschließend wurden kein bzw. 10 mg bis 100 mg HSA zugegeben. Nach 24 Stunden

Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Salzsäure

angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen

wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die

Ergebnisse sind Tabelle 88 dargestellt.


214


(106)

Eintrag HSA [g/l] Umsatz [%]

1 0 >95

2 1 >95

3 5 82

4 10 50

Abbildung 132: 1H-NMR-Spektrum der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (106) mit

Phenylboronsäure (101b) (Benchmark-Versuch)


215

Charakterisierung des entstehenden 4'-Phenylacetophenons (108) anhand des Eintrags 1 in

Tabelle 88:

1H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 2.63 (s, 3H, H-C1), 7.39 (t, 3J = 7.20 Hz, 1H, H-C10), 7.46 (t,

3J = 7.40 Hz, 2H, H-C9, H-C9'), 7.61 (d, 3J = 6.80 Hz, 2H, H-C8, H-C8'), 7.67 (d, 3J = 8.80 Hz, 2H, H-C5, H-

C5'), 8.02 (d, 3J = 8.40 Hz, 2H, H-C4, H-C4')


Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionszeit wurde gemäß AAV 19 durchgeführt. Es wurde eine

Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg),

beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach

30 Minuten wurde diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension aus Natriumhydrogen-



gegeben. Nach 5.5 bis 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde das Reaktions-

gemisch mit 2.5 M Salzsäure angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und

das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektros-

kopie bestimmt. Die Ergebnisse sind Tabelle 89 dargestellt.

Tabelle 89: Einfluss der Reaktionszeit auf die Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)


216

Eintrag Reaktionszeit [h] Umsatz [%]

1 5.5 89

2 24.0 >95

8.2.4.1.3 pH-Verlauf der Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon

Die Beobachtung des pH-Verlauf der Suzuki-Kupplung wurde gemäß AAV 19 durchgeführt. Es wurde

eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105, 0.020 mmol,

11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.




gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm mit punktueller Proto-

kollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit, wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M

Salzsäure angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen werden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer entfernt. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die


Umsatz: >95%

Tabelle 90: pH-Verlauf der Suzuki-Kreuzkupplung von 4‘-Iodacetophenon (106)

Eintrag Zeit pH-Wert bei 24 h

Reaktionszeit pH-Wert bei 5.5 h

Reaktionszeit

1 IPA + NaHCO3 + 106 9.48 9.39

2 + 101b 9.30 9.25

3 mit Katalysator 0 h 8.54 8.56

4 2.0 h 8.18 8.24

5 4.0 h 8.31 8.48

6 5.5 h 8.79 8.74

7 7.0 h 8.80

8 24.0 h 9.94


217

8.2.4.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 20 für die Synthese des rac-Iodphenylethan-1-

ols durch Reduktion mit Natriumborhydrid (AAV 20)

Zur Synthese des racemischen Alkohols wurde 4’-Iodacetophenon (106,

3.0 mmol, 738.2 mg) in 20 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von

Natriumborhydrid (4.2 mmol, 158.9 mg) wurde 24 Stunden bei Raum-

temperatur gerührt. Die Lösung wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 7

eingestellt. Die Zugabe von 20 ml dest. Wasser führte zur Bildung von

weißem Niederschlag. Es wurde dreimal mit je 20 ml Dichlormethan

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das

Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt des rac-4‘-

Iodphenylethan-1-ols (rac-107) im Ölpumpenvakuum getrocknet.

Ausbeute: 93%

Abbildung 133: 1H-NMR-Spektrum der Natriumborhydrid-Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106)


218

Charakterisierung des entstehenden racemischen 4‘-Iodphenylethan-1-ols (rac-107):

1H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.45 (d, 3J = 6.40 Hz, 3H, H-C1), 1.76 (br s, 1H, OH), 4.84 (q,

3J = 6.27 Hz, 1H, H-C2), 7.11 (d, 3J = 8.00 Hz, 2H, C4, H-C4'), 7.66 (d, 3J = 8.40 Hz, 2H, C5, H-C5')

Die spektroskopischen Daten (1H-NMR-Spektroskopie) stimmen mit denen aus der Literatur

überein.[11,13]

8.2.4.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 für die Suzuki-Kupplung von

rac-4‘-Iodphenylethanol zur Synthese von rac-4'-Biphenylethan-1-ol (AAV 21)

Es wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol) und

TPPTS (105, 0.020 mmol), beides bezogen auf rac-Iodphenylethan-1-

ol (rac-107), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach

30 Minuten wird diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension

aus Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol), rac-4'-Iodphenyl-ethan-1-

ol (rac-107, 0.4 mmol) und Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol) und

in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser

gegeben. Anschließend wurden nur in Kapitel 8.2.4.3.2 bis zu 100 mg HSA zugegeben. Nach 24 bis

48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5



Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt rac-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) wurde im

Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.53 (d, 3J = 6.40 Hz, 3H, H-C1), 4.95 (q, 3J = 6.40 Hz, 1H, H-

C2), 7.33 (t, 3J = 7.40 Hz, 1H, H-C10), 7.43 (m, 4H, H-C4, H-C4', H-C9, H-C9'), 7.57 (m, 4H, H-C5, H-C5',

H-C8, H-C8')


219

Die spektroskopischen Daten (1H-NMR-Spektroskopie) stimmen mit denen aus der Literatur

überein.[11,13]


Die Untersuchung zum Einfluss der Reaktionszeit wurde gemäß AAV 21 durchgeführt. Es wurde eine


beides bezogen auf rac-Iodphenylethan-1-ol (rac-107), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.


carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107, 0.4 mmol, 99.2 mg) und Phenyl-

boronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem

dest. Wasser gegeben. Nach 24 bis 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das

Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5 angesäuert und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet. Der Feststoff wurde

abfiltriert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt rac-4'-

Biphenylethan-1-ol (rac-109) wurde im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-

NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind Tabelle 91 dargestellt.


(rac-107)

aWiederholungsversuch zu 1a zur Validierung,

bWiederholungsversuche zu 2a zur Validierung

Eintrag Reaktionszeit [h] Umsatz [%]

1a 24 75

1ba 24 69

2a 48 80

2bb 48 71

2cb 48 78


220

8.2.4.3.2 Einfluss der Proteinmenge

Die Untersuchung zum Einfluss der Proteinmenge wurde gemäß AAV 21 durchgeführt. Es wurde eine


beides bezogen auf rac-Iodphenylethan-1-ol (rac-107), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.


carbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), rac-4'-Iodphenylethan-1-ol (rac-107, 0.4 mmol, 99.2 mg) und Phenyl-

boronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem

dest. Wasser gegeben. Anschließend wurden kein bzw. 10 bis 100 mg HSA zugegeben. Nach

48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5



Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt rac-4'-Biphenylethan-1-ol (rac-109) wurde im

Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die



Iodphenylethanol (rac-107)

aWiederholungsversuche zu 1a zur Validierung,


cWiederholungsversuch zu 3a

zur Validierung

Eintrag HSA [g/l] Umsatz [%]

1a 0 80

1ba 0 71

1ca 0 78

2a 1 75

2bb 1 71

3a 5 51

3bc 5 51

4 10 11

8.2.4.4 Allgemeine Arbeitsvorschrif

Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat

gelöst. Anschließend wurden Keton

wurde so viel Rohextrakt der LK

2.5 g/l erreicht wurde. Die Reaktion w

48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH

während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10

organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am

Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt

wurde mittels chiraler HPLC bestimmt.

8.2.4.4.1 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von

4‘-Iodacetophenon

Die Synthese von

22. Zunächst w

5 ml dest. Wasser und 5

Iodacetophenon (

zugegeben. Danach w

konzentration

Enzymkonzentration) bzw. 581 µl (entsprechen

der LK-ADH dazu pipettiert. Die Reaktion w

18.6 mg) gestartet. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller

Protokollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10


Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum

getrocknet. Der ee-Wert wurde

0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Die Ergebnisse sind Tabelle 9

HPLC (Chiralcel® OJ-H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):

tR(S) = 17.3 Minuten

tR(R) = 18.5 Minuten

ee-Wert: >99%


Allgemeine Arbeitsvorschrift 22 für die biokatalytische Reduktion (AAV

Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol) in 5 ml dest. Wasser und 5

rden Keton (0.4 mmol) und 1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Danach

so viel Rohextrakt der LK-ADH dazu pipettiert, dass eine Proteinkonzentration von 1.0 g/l bis

. Die Reaktion wurde durch Zugabe von NADP+ (0.025 mmol

Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH

ährend der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten


Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet

wurde mittels chiraler HPLC bestimmt.


Die Synthese von (R)-Iodphenylethan-1-ol ((R)-107)

. Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol

ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol gelöst. Anschließend w

Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und 1 mM

zugegeben. Danach wurden 233 µl (entsprechen

konzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK

581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l

ADH dazu pipettiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Cofaktors

Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller

Werts während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10


ngsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum

mittels chiraler HPLC (Chiralcel® OJ-H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v),

Die Ergebnisse sind Tabelle 93 dargestellt.

H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):


221

für die biokatalytische Reduktion (AAV 22)

ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol

Magnesiumchlorid zugegeben. Danach

konzentration von 1.0 g/l bis

mmol) gestartet. Nach

Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts

ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten


im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der ee-Wert


) erfolgte gemäß AAV

Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg) in

ml Isopropanol gelöst. Anschließend wurden 4'-

1 mM Magnesiumchlorid

µl (entsprechen einer Protein-

) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml

einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt

des Cofaktors NADP+ (0.025 mmol,

Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller

Werts während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan


ngsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum

H, Hexan:Isopropanol 95:5 (v/v),


222

Tabelle 93: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-

Iodacetophenon (106)

Eintrag Proteinkonzentration [g/l] ee [%] Umsatz [%]

1a 1.0 >99 97

1ba 1.0 >99 97

2a 2.5 >99 97

2bb 2.5 >99 95



8.2.4.4.2 pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon

Die Beobachtung des pH-Verlaufs der biokatalytischen Reduktion von 4'-Iodacetophenon (106)

wurde gemäß AAV 22 durchgeführt. Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg)

in 5 ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol gelöst. Anschließend wurden 4'-Iodacetophenon (106,

0.4 mmol, 98.4 mg) und 1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Danach wurden 233 µl (entsprechen

einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.

581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH dazu pipettiert.

Die Reaktion wurde durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.025 mmol, 18.6 mg) gestartet. Nach

48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts

während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten



223

Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Die pH-

Verläufe der Versuche 1a und 2a aus Tabelle 93 sind in Tabelle 94 dargestellt.

Tabelle 94: pH-Verlauf der biokatalytischen Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (106) bei

unterschiedlichen Mengen von LK-ADH

Eintrag Zeit pH-Wert bei 1.0 g/l

Proteinkonzentration pH-Wert bei 2.5 g/l

Proteinkonzentration

1 IPA + NaHCO3 + 106 9.41 9.49

2 mit Enzym 9.06 8.74

3 mit NADP+ 8.66 8.40

4 2.0 h 9.11 8.80

5 4.0 h 9.44 9.19

6 4.75 h 9.52 9.35

7 21.0 h 10.05 9.77

8 24.0 h 10.07 9.81

9 26.0 h 10.09 9.86

10 45.0 h 10.18 10.13

11 48.0 h 10.17 10.14

8.2.4.4.3 Einfluss der Enzymmenge auf die biokatalytische Reduktion von 4‘-

Phenylacetophenon

Die Synthese von (R)-4‘-Biphenylethan-1-ol ((R)-109) erfolgte gemäß

AAV 22. Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol,

84.0 mg) in 5 ml dest. Wasser und 5 ml Isopropanol gelöst.

Anschließend wurden 4'-Phenylacetophenon (108, 0.4 mmol,

78.5 mg) und 1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Danach wurden

233 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l)

Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw. 581 µl


224

(entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH dazu pipettiert. Die

Reaktion wurde durch Zugabe des Cofaktors NADP+ (0.025 mmol, 18.6 mg) gestartet. Nach

48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts

während der Reaktionszeit wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten


Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der ee-Wert

wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)

bestimmt. Nach säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel mit Cyclohexan und Ethylacetat

als Lösungsmittel im Verhältnis 4:1 (v/v) wurde das Produkt als weißer Feststoff erhalten. Die


Umsatz: 67%

Isolierte Ausbeute (sauberes Produkt): 51% (40 mg, 0.202 mmol)

HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):



ee-Wert: >99%

Tabelle 95: Einfluss der Proteinkonzentration auf die biokatalytische Reduktion von

4‘-Phenylacetophenon (108)

Eintrag Protein

1a

1ba

2a

2bb


8.2.4.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift

(R)-4'-Biphenylethan-1-ol (AAV

Es

TPPTS (

(

w

bzw

NADP

bestehend aus Natriumhydrogencarbonat

acetophenon (106, 0.4 mmol) und Phenylboronsäure (

in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5

Rühren bei Raumtemperatur, 400

Reaktionszeit wurde mit 2.5 M Essigsäure auf pH

10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen w

getrocknet. Das Lösungsmittel w

Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz w

Wert wird mittels chiraler HPLC (Chiralpak®

bestimmt.

8.2.4.5.1 Einfluss der Proteinkonzentration auf die Tandem

Die Untersuchung zum Einfluss der Proteinmenge auf die Tandem

durchgeführt. Zuerst wurde eine Suspension aus

TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg)

8. Experimenteller Tei

Proteinkonzentration [g/l] ee [%]

1.0 >99

1.0 >99

2.5 >99

2.5 >99

Wiederholungsversuch zu 1a zur Validierung, bWiederholungsversuch zu 2a zur Validierung

8.2.4.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 23 für die Tandem-Reaktion zur Synthese von

ol (AAV 23)

Es wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol

TPPTS (105, 0.020 mmol), beides bezogen auf 4‘

(106), in 0.5 ml entgasten dest. Wasser angesetzt.

wurde diese, ebenso wie für eine Proteinkonzentration von

bzw. 2.5 g/l) benötigte Menge an Rohextrakt der LK

NADP+ (0.025 mmol) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension

bestehend aus Natriumhydrogencarbonat

mmol) und Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol) und 1 mM

ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden

Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und punktueller Protokollierung des pH

M Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Anschließend w

ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat

getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im

. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie

Wert wird mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/

Einfluss der Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion

chung zum Einfluss der Proteinmenge auf die Tandem-Reaktion wurde

eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8

mmol, 11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106)


225

Umsatz [%]

50

56

64

67

Reaktion zur Synthese von

Palladium(II)chlorid (0.016 mmol) und

, beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon

ml entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten

für eine Proteinkonzentration von 1.0 g/l

) benötigte Menge an Rohextrakt der LK-ADH und bis

zu einer parallel dazu angesetzten Suspension

(1.0 mmol), 4'-Iod-

mM Magnesiumchlorid

ml entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden

rpm und punktueller Protokollierung des pH-Werts während der

. Anschließend wurde dreimal mit je

rden über Magnesiumsulfat

am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im

Spektroskopie bestimmt. Der ee-

IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)

Reaktion

Reaktion wurde gemäß AAV 23

(0.016 mmol, 2.8 mg) und

), in 0.5 ml entgasten


226

dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese, ebenso wie 233 µl (entsprechen einer

Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.

581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH und NADP+

(0.025 mmol, 18.6 mg) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension bestehend aus

Natriumhydrogencarbonat (1.0 mmol, 84.0 mg), 4'-Iodacetophenon (106, 0.4 mmol, 98.4 mg) und

Phenylboronsäure (101b, 0.4 mmol, 48.8 mg) und in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml

entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde

mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Anschließend wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan


Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum

getrocknet. Der Umsatz wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie und der ee-Wert mittels chiraler HPLC

(Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt (Tabelle 96).

HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):



ee-Wert für (R)-107: >99%


Tabelle 96: Einfluss der eingesetzten Proteinkonzentration auf die Tandem-Reaktion


227

Eintraga Protein-

konzentration [g/l]

Umsatz zu 108

[%]

Umsatz zu (R)-107

[%]

Umsatz zu (R)-109

[%] ee [%]

Gesamtumsatz [%]

1 1.0 42 23 35 >99 >95

2 2.5 6 52 24 >99 >95

8.2.4.5.2 pH-Verlauf der Tandem-Reaktion

Die Beobachtung des pH-Verlaufs der Tandem-Reaktion von 4'-Iodacetophenon (106) wurde gemäß

AAV 23 durchgeführt. Zuerst wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg)

und TPPTS (105, 0.020 mmol, 11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml

entgasten dest. Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese, ebenso wie 233 µl (entsprechen

einer Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.

581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH und NADP+

(0.025 mmol, 18.6 mg) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension bestehend aus



entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, 400 rpm und

punktueller Protokollierung des pH-Werts während der Reaktionszeit wurde mit 2.5 M Essigsäure auf

pH 5 angesäuert. Anschließend wurde dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten


Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz

wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt und der ee-Wert mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB,

Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm). Die pH-Verläufe des Versuchs 1 aus Tabelle 96

ist in Tabelle 97 und des Versuchs 2 aus Tabelle 96 ist in Tabelle 98 dargestellt.




228


Eintrag Zeitablauf pH-Wert





5 2.0 h 8.46

6 3.5 h 8.69

7 5.0 h 8.74

8 24.0 h 8.39

9 25.75 h 8.83

10 28.0 h 9.04

11 30.0 h 9.15

12 48.0 h 9.38







5 2.0 h 8.84

6 4.0 h 8.64

7 6.0 h 8.61

8 22.0 h 8.57

9 24.0 h 8.82

10 28.0 h 8.98

11 46.0 h 9.15

12 48.0 h 9.16


229

8.2.4.5.3 Einfluss des Cofaktors

Die Untersuchung zum Einfluss des Cofaktors auf die Tandem-Reaktion erfolgte gemäß AAV 23.

Zuerst wurde eine Suspension aus Palladium(II)chlorid (0.016 mmol, 2.8 mg) und TPPTS (105,

0.020 mmol, 11.4 mg), beides bezogen auf 4‘-Iodacetophenon (106), in 0.5 ml entgasten dest.

Wasser angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese, ebenso wie 233 µl (entsprechen einer

Proteinkonzentration von 1.0 g/l) Rohextrakt der LK-ADH (43 mg/ml Enzymkonzentration) bzw.

581 µl (entsprechen einer Proteinkonzentration von 2.5 g/l) Rohextrakt der LK-ADH und. NADP+ (0 bis

0.025 mmol bzw. 0 bis 18.6 mg) zu einer parallel dazu angesetzten Suspension bestehend aus



entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 48 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 rpm wurde

mit 2.5 M Essigsäure auf etwa pH 5 angesäuert. Anschließend wurde dreimal mit je 10 ml

Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat

getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im

Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMR bestimmt. Der Umsatz wurde durch

1H-NMR-Spektroskopie bestimmt und der ee-Wert mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB,

Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm). Die Ergebnisse sind Tabelle 99 dargestellt.

Tabelle 99: Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Tandem-Reaktion


230

Eintrag NADP+

[Äq.]

Protein-konzentration

[g/l]

Umsatz zu 108

[%]

Umsatz zu (R)-107

[%]

Umsatz zu (R)-109 [%]

Gesamtumsatz [%]

1 0 1.0 >95 n.d. n.d. >95

2 0.06 1.0 42 23 35 >95

3 0 2.5 64 12 24 77

4 0.06 2.5 6 52 24 >95

HPLC (Chiralpak® IB, Hexan:Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/Minuten, 238 nm):





9. Literaturverzeichnis

231


[1] K. Buchholz, V. Kasche, U. T. Bornscheuer, Biocatalysts and Enzyme Technology, Wiley-VCH,

Weinheim, 2005.

[2] Umweltbundesamt: Weiße Biotechnologie – Ökonomische und ökologische Chancen,

Dubbert/Heine, Berlin 2006.

http://www.umweltbundesamt.de/uba-info-medien/dateien/3260.htm, Stand 17.07.2013.

[3] T. Becker, D. Breithaupt, H. W. Doelle, A. Fiechter, M. Griensven, C. Kasper, S. Lütz, R.

Pörtner, H.-G. Schlegel, D. Sell, S. Shimizu, F. Stahl, K. Suck, R. Ulber, J. Wegener, K. Würges,

H. Yamada, H. Zorn, Ullmann´s Biotechnology and Biochemical Engineering, Band 1, Wiley-

VCH, Weinheim, 2007.

[4] a) K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 6. Auflage, Springer, Berlin Heidelberg,

2011; b) K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 5. Auflage, Springer, Berlin, 2004.

[5] A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, 2. komplett überarbeitete

und erweiterte Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2006.

[6] R. A. Sheldon, I. Arends, U. Hanefeld, Green Chemistry and Catalysis, Wiley-VCH, Weinheim,

2007.

[7] ExPASy Bioinformatics Resource Portal: http://enzyme.expasy.org/EC/2.6.1.2, Stand 5.9.13.

[8] ExPASy Bioinformatics Resource Portal: http://enzyme.expasy.org/EC/6.3.3.3, Stand 5.9.13.

[9] K. Baer, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2008.

[10] E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Angew. Chem. 2008, 120, 9693-9696; Angew. Chem. Int. Ed.

2008, 47, 9551-9554.

[11] S. Borchert, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen,

2008.

[12] K. Baer, M. Kraußer, E. Burda, W. Hummel, A. Berkessel, H. Gröger, Angew. Chem. Int. Ed.

2009, 48, 9355–9358; Angew. Chem. 2009, 121, 9519-9522.

[13] E. Burda, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Erlangen, 2010

[14] M. Kraußer, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2011.

[15] K. Baer, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2011.

[16] G. Rulli, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, 2009.

[17] M. Kraußer, T. Winkler, N. Richter, S. Dommer, A. Fingerhut, W. Hummel, H. Gröger,

ChemCatChem 2011, 3, 293-296.

[18] K. Tenbrink, M. Seßler, J. Schatz, H. Gröger, Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 2363-2367.

[19] P. Anastas, J. C. Warner, Green Chemistry: Theory and Practice, Oxford University Press,

Oxford, 1998.


232

[20] P. Anastas, L. G. Heine, T. C. Williamson, Green Chemical Syntheses and Processes, American

Chemical Society, Washington DC, 2000.

[21] H.-J. Arpe, Industrielle Organische Chemie, 6. Auflage Wiley-VCH, Weinheim, 2007.

[22] B. Fabry, Chemie in unserer Zeit 1991, 4, 214-222.

[23] I. T. Horváth, P. T. Anastas, Chem. Rev. 2007, 107, 2169-2173.

[24] P. A. Wender, M. P. Croatt, B. Witulski, Tetrahedron 2006, 62, 7505-7511.

[25] T. Schiffer, G. Oenbrink, Ullmann´s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7th Edition, 2005,

Electronic Release, Wiley-VCH.

[26] Deutsche Apothekerzeitung: Odanacatib zur Therapie der Osteoporose,

http://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/pharmazie/news/2010/12/21/odanacatib-zur-

therapie-der-osteoporose.html, Stand 15.12.10, aufgerufen am 9.7.13.

[27] S. C. Maurer, K. Kühnel, L. A. Kaysser, S. Eiben, R. D. Schmid, V. B. Urlacher, Adv. Synth. Catal.

2005, 347, 1090-1098.

[28] A. W. Munro, J. G. Lindsay, Mol. Microbiol. 1996, 20, 1115-1125.

[29] E. T. Farinas, U. Schwaneberg, A. Glieder, F. H. Arnold, Adv. Synth. Catal. 2001, 343, 601-606.

[30] P. C. Cirino, F. H. Arnold, Adv. Synth. Catal., 2002, 344, 932-937.

[31] L. O. Narhi, A. J. Fulco, J. Biol. Chem. 1987, 262, 6683-6690.

[32] D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U. Schwaneberg, R. D. Schmid, J. Biotechnol. 2001, 88, 167-

171.

[33] S. C. Maurer, H. Schulze, R. D. Schmid, V. Urlacher, Adv. Synth. Catal. 2003, 345, 802-810.

[34] A. Glieder, E. T. Farinas, F. H. Arnold, Nat. Biotechnol. 2002, 20, 1135-1139.

[35] A. Celik, D. Sperandio, R. E. Speight, N. J. Turner, Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 2688-2690.

[36] W. Kaim, B. Schwederski, Bioanorganische Chemie, 3. Auflage, Teubner Verlag, Stuttgart,

2004.

[37] S. J. Lippard, J. M. Berg, Bioanorganische Chemie, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1995.

[38] I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A. M. Stock, S. A. Maves, D. E. Benson, R. M. Sweet, D.

Ringe, G. A. Petsko, S. G. Sligar, Science 2000, 287, 1615-1622.

[39] P. C. Cirino, F. H. Arnold, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 3299-3301.

[40] Dissertation von S. Tatzel, Modellierung von Cytochrom P450-Monooxygenasen, Stuttgart,

2008.

[41] S. S. Boddupalli, R. W. Estabrook, J. A. Petersen, J. Biol. Chem. 1990, 265, 4233-4239.

[42] U. Schwaneberg, C. Schmidt-Dannert, J. Schmitt, R. D. Schmid, Anal. Biochem. 1999, 269, 359-

366.


233

[43] U. Schwaneberg, C. Otey, P. C. Cirino, E. Farinas, F. H. Arnold, J. Biomol. Screening 2001, 6,

111-117.

[44] W. Adam, Z. Lukacs, C. R. Saha-Möller, B. Weckerle, P. Schreier, Eur. J. Org. Chem. 2000,

2923-2926.

[45] K. Hofstetter, J. Lutz, I. Lang, B. Witholt, A. Schmid, Angew. Chem. 2004, 116, 2215-2218;

Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 2163-2166.

[46] E. T. Farinas, M. Alcalde, F. Arnold, Tetrahedron 2004, 60, 535-528.

[47] U. Schwaneberg, A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, R. D. Schmid, J. Chromatogr. A 1999, 848,

149-159.

[48] J. Kuper, T. S. Wong, D. Roccatano, M. Willmanns, U. Schwaneberg, J. Am. Chem. Soc. 2007,

129, 5786-5787.

[49] W. Adam, Z. Lukacs, D. Harmsen, C. R. Saha-Möller, P. Schreier, J. Org. Chem. 2000, 65, 878-

882.

[50] W. Adam, Z. Lukacs, C. Kahle, C. R. Saha-Möller, P. Schreier, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001, 11,

377-385.

[51] M. W. Peters, P. Meinhold, A. Glieder, F. H. Arnold, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13442-

13450.

[52] Y. Watanabe, S. Laschat, M. Budde, O. Affolter, Y. Shimada, V. B. Urlacher, Tetrahedron 2007,

63, 9413-9422.

[53] E. Weber, A. Seifert, M. Antonovici, C. Geinitz, J. Pleiss, V. B. Urlacher, Chem. Commun. 2011,

47, 944-946.

[54] F. E. Zilly, J. P. Acevedo, W. Augustyniak, A. Deege, U. W. Häusig, M. T. Reetz, Angew. Chem.

2011, 123, 2772-2776; Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 2720-2724.

[55] S. Kardinahl, D. Rabelt, M. Reschke, Chem. Ing. Techn. 2006, 78, 209-217.

[56] A. Streitwieser, C. H. Heathcock, E. M. Kosower, Organische Chemie, 2. Auflage, VCH,

Weinheim, 1994.

[57] R. W. Estabrook, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 338, 290-298.

[58] A. Rentmeister, F. H. Arnold, R. Fasan, Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 26-28.

[59] H.-J. Böhm, D. Banner, S. Bendels, M. Kansy, B. Kuhn, K. Müller, U. Obst-Sander, M. Stahl,

ChemBioChem 2004, 5, 637-643.

[60] A. Dennig, N. Lülsdorf, H. Liu, U. Schwaneberg, Angew. Chem. 2013, 125, 8617-8620. Angew.

Chem. Int. Ed. 2013, 52, 8459-8462.

[61] A. Dennig, J. Marienhagen, A. J. Ruff, L. Guddat, U. Schwaneberg, ChemCatChem 2012, 4,

771-773.


234

[62] O. Shoji, T. Kunimatsu, N. Kawakami, Y. Watanabe, Angew. Chem. 2013, 125, 6738-6742.

[63] C. Filling, K. D. Berndt, J. Benach, S. Knapp, T. Prozorovski, E. Nordling, J. Biol. Chem. 2002,

277, 25677-25684.

[64] N. H. Schlieben, K. Niefind, J. Müller, B. Riebel, W. Hummel, D. Schomburg, J. Mol. Biol. 2005,

349, 801-813.

[65] H. Gröger, F. Chamouleau, N. Orologas, C. Rollmann, K. Drauz, W. Hummel, A. Weckbecker,

A. May, Angew. Chem. 2006, 118, 5806-5809; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5677-5681.

[66] H. Jörnvall, B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzales-Duarte, J. Jeffery, D. Ghosh,

Biochemistry 1995, 17, 487-492.

[67] W. Blankenfeldt, I. D. Kerr, M. F. Giraud, H. J. McMiken, G. Leonard, C. Whitfield, P. Messner,

M. Graninger, J. H. Naismith, Structure 2002, 10, 773-786.

[68] C. Filling, K. D. Berndt, J. Benach, S. Knapp, T. Prozorovski, E. Nordling et al., J. Biol. Chem.

2002, 277, 25677-25684.

[69] A. Weckbecker, Dissertation, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, Jülich, 2005.

[70] M. T. Musser, Ullmann´s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Elektronische Fassung, Wiley-

VCH, Weinheim, 2012.

[71] T. Schiffer, G. Oenbrink, Ullmann´s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. Auflage,

Elektronische Fassung, Wiley-VCH, 2000.

[72] J. Teles, B. Rößler, R. Pinkos, T. Genger, T. Preiss (BASF SE), Eur. Patent EP 1663932, 2008.

[73] J. Teles, B. Rössler, R. Pinkos, G. Tebben, C. Müller (BASF SE), Eur. Patent EP 2041060, 2009.

[74] R. Fasan, M. M. Chen, N. C. Crook, F. H. Arnold, Angew. Chem. 2007, 119, 8566-8570; Angew.

Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8414-8418.

[75] R. Fasan, Y. T. Meharenna, C. D. Snow, T. L. Poulos, F. H. Arnold, J. Mol. Biol. 2008, 383, 1069-

1080.

[76] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von n-Butan

[77] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von n-Oktan

[78] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von 1-Oktanol

[79] Acros Organics: Sicherheitsdatenblatt von DL-2-Oktanol

[80] Acros Organics: Sicherheitsdatenblatt von DL-3-Oktanol

[81] Acros Organics: Sicherheitsdatenblatt von 4-Oktanol

[82] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von Pyridin

[83] Sigma-Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von n-Hexan

[84] Merck Millipore: Sicherheitsdatenblatt Cyclooktan

[85] Merck Millipore: Sicherheitsdatenblatt Cyclohexan


235

[86] C. A. Müller, B. Akkapurathu, T. Winkler, S. Staudt, W. Hummel, H. Gröger, U. Schwaneberg,

Adv. Synth. Catal. 2013, 355, 1787-1798.

[87] E. Burda, T. Reß, T. Winkler, C. Giese, X. Kostrov, T. Huber, W. Hummel, H. Gröger, Angew.

Chem. 2013, 125, 9493-9496; Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 9323-9326.

[88] Enzymicals AG, Biocatalyst catalog 2013.

[89] A. Kirschner, U. T. Bornscheuer, Angew. Chem. 2006, 118, 7161-7163; Angew. Chem. Int. Ed.

2006, 45, 7004-7006.

[90] J. Rehdorf, M. D. Mihovilovic, U. T. Bornscheuer, Angew. Chem. 2010, 122, 4609-4611;

Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 4506-4508.

[91] T. Schubert, Dissertation, Forschungszentrum Jülich, Jülich, 2002.

[92] J. Zhou, Dissertation, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, 2010.

[93] M. Labet, W. Thielemans, Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 3484-3504.

[94] T. Laue, A. Plagens, Namen- und Schlagwortreaktionen der Organischen Chemie, 5. Auflage,

Vieweg+Teubner, Wiesbaden, 2006.

[95] Sigma Aldrich: Sicherheitsdatenblatt von Peressigsäure

[96] D. E. Torres Pazmiño, H. M. Dudek, M. W. Fraaije, Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14, 138-144.

[97] The European Bioinformatics Institute – Protein Data Bank in Europe, aufgerufen am 10.3.14:

http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/PDBeXplore/ligand/?ligand=FAD#

[98] M. T. Reetz, F. Daligault, B. Brunner, H. Hinrichs, A. Deege, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43,

4078-4081.

[99] G. de Gonzalo, M. D. Mihovilovic, M. W. Fraaije, ChemBioChem 2010, 11, 2208-2231.

[100] http://www.apotheken-umschau.de/Sodbrennen/Sodbrennen--Ursachen-

Speiseroehrenentzuendung-Oesophagitis-55050_4.html, Stand 23.1.14

[101] Infomed Online: E. Gysling, A. de Luca – Esomeprazol in pharma-kritik Nr.11/2001.

http://www.infomed.ch/pk_template.php?pkid=272

[102] Inzwischen wurde auch von der Arbeitsgruppe BORNSCHEUER über ein weiteres

Herstellungsverfahren von ε-Caprolacton auf dem Weg der Doppeloxidation ausgehend von

Cyclohexanol berichtet: H. Wulf, H. Mallin, U.T. Bornscheuer, Enzyme Microb. Technol. 2013,

53, 283-287.

[103] Die im Rahmen dieser Dissertation vorgestellten Arbeiten zur Herstellung von ε-Caprolacton

(Kapitel 4.4) erfolgten unabhängig von denen in der Literaturstelle [102] beschriebenen

Arbeiten.

[104] ChemieTek® Expertise & Experience, aufgerufen am 24.3.2014:

http://www.chemietek.com/products.aspx?pid=109


236

[105] N. Miyaura, A. Suzuki, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1979, 19, 866-867.

[106] N. Miyaura, K. Yamada und A. Suzuki, Tetrahedron Lett. 1979, 20, 3437-3440.

[107] A. O. King, N. Okukado, E.-i. Negishi, Chem. Comm. 1977, 19, 683-684.

[108] D. Milstein, J. K. Stille, J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 3636-3638.

[109] K. Sonogashira, Y. Tohda, N. Hagihara, Tetrahedron Lett. 1975, 16, 4467-4470.

[110] R. F. Heck, J. P. Nolley, Jr., J. Org. Chem. 1972, 37, 2320-2322.

[111] H. A. Dieck, F. R. Heck, J. Organomet. Chem. 1975, 93, 259-263.

[112] K. C. Nikolaou, P. G. Bulger, D. Sarlah, Angew. Chem. 2005, 117, 4516-4563; Angew. Chem.

Int. Ed. 2005, 44, 4442-4489.

[113] Nobelprize.org – The Official Website of the Nobel Prize:

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/lists/year/index.html?year=2010&images=yes,

aufgerufen am 22.8.13.

[114] R. Brückner, Reaktionsmechanismen, 3. Auflage, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2007.

[115] A. Suzuki, Acc. Chem. Res. 1982, 15, 178-184.

[116] N. K. Garg, D. D. Caspi, B. M. Stoltz, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 9552-9553.

[117] P. D. Hobbs, V. Upender, J. Liu, D. J. Pollart, D. W. Thomas, M. I. Dawson, Chem. Commun.

1996, 923-924.

[118] R. R. Knowles, J. Carpenter, S. B. Blakey, A. Kayano, I. K. Mangion, C. J. Sinz, D. W. C.

MacMillan, Chem. Sci. 2011, 2, 308-311.

[119] N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 1995, 95, 2457-2483.

[120] K. Sonogashira, J. Organomet. Chem. 2002, 653, 46-49.

[121] F. M. Bickelhaupt, T. Ziegler, P. von Ragué Schleyer, Organometallics 1995, 14, 2288-2296.

[122] A. Diefenbach, F. M. Bickelhaupt, J. Chem. Phys. 2001, 115, 4030-4040.

[123] K. Albert, P. Gisdakis, N. Rösch, Organometallics 1998, 17, 1608-1616.

[124] M. Jakt, L. Johannissen, H. S. Rzepa, D. A. Widdowson, R. Wilhelm, J. Chem. Soc., Perkin

Trans. 2, 2002, 576-581.

[125] O. Reiser, Chem. unserer Zeit 2001, 2, 94-100.

[126] L. J. Goossen, D. Koley, H. L. Hermann, W. Thiel, Organometallics 2005, 24, 2398-2410.

[127] S. R. Chemler, D. Trauner, S. J. Danishefsky, Angew. Chem. 2001, 113, 4676-4701; Angew.

Chem. Int. Ed. 2001, 40, 4544-4568.

[128] C. Dupuis, K. Adiey, L. Charruault, V. Michelet, M. Savignac, J.-P. Genêt, Tetrahedron Lett.

2001, 42, 6523-6526.

[129] C. Delhomme, D. Weuster-Botz, F. E. Kühn, Green Chem. 2009, 11, 13-26.


237

[130] R. W. Armstrong, J.-M. Beau, S. H. Cheon, W. J. Christ, H. Fujioka, W.-H. Ham, L. D. Hawkins,

H. Jin, S. H. Kang, Y. Kishi, M. J. Martinelli, W. W. McWhorter Jr., M. Mizuno, M. Nakata, A. E.

Stutz, F. X. Talamas, M. Taniguchi, J. A. Tino, K. Ueda, J.-i. Uenishi, J. B. White, M. Yonaga,

J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 7525-7530.

[131] S. Borchert, geplante Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

[132] W. Hummel, M.-R. Kula (FZ Jülich GmbH), EP 456107; 1991.

[133] A. Weckbecker, W. Hummel, Biocat. Biotrans. 2006, 24, 380-389.

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