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Proteine in wässriger Lösung Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“
Proteine in wässriger Lösung
Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“
Proteine in wässriger Lösung
Hydrathülle
hydrophileOberfläche
hydrophoberKern
++
+ +
--
-
H-Brücken, ionische Wechselwirkungen
H-Brücken, hydrohobe Wechselwirkungen
(fest gebunden)
entfaltete Peptidkette:
hydrophobe Bereiche exponiert
gefaltete Peptidkette:
hydrophobe Bereiche im Inneren
hydrophobe Region
Dispersion von Lipiden in Wasser
jedes Lipid-Molekül zwingt die Wassermoleküle,einen höheren Ordnungszustand einzunehmen
Clustering
Nur die Lipidmoleküle an der Seiteerzwingen eine höhere Ordnung
Proteine in wässriger Lösung
Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“
Denaturieren
Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten
Denaturieren von Proteinen
entfalten
hydrophobe und hydrophile Bereiche exponiert
Aggregationüber hydrophobe Bereiche
Stabilisierung von Monomerendurch Lösungsmittel/ Zusatz von Additiven,
die mit hydrophoben Oberflächenenergetisch günstige
Wechelwirkungen eingehen können
random coil
entfaltete Peptidkette:hydrophobe Bereiche exponiert
gefaltete Peptidkette:
hydrophobe Bereiche im Innerenhydrophobe
Region
Aggregation überhydrophobe Bereiche
Bereich mit einergeordneten Wasserstruktur
Denaturieren von Proteinen
Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten
Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche:
• Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) • Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) • Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten
Membranproteine geeignet
• Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( → Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat
S
O
O
O O CH2CH
2 CH2 CH
2CH
2CH
2 CH2
CH2
CH2CH
2CH
2CH
3
CH2
CH2
OCH2
CH2
OOH CH2
CH2 O C
CH3
CH3
CH2 C CH
3
CH3
CH3
n
wichtige Detergenzien
SDS (Natrium-dodecylsulfat)
Triton X-100
Na
Denaturieren von Proteinen
Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten
Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche:
• Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) • Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) • Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten
Membranproteine geeignet
• Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( → Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat
Harnstoff,Mercapto-ethanol
Proteine in wässriger Lösung
Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“
Denaturieren
Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten
Methoden: Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten
Membranproteine geeignet Aussalzen:
Konkurrenz von Proteinen und Salzen um Wasser, nicht alle Salze sind gleich gut geeignet (Hofmeister Serie)
Einsalzen durch niedrigere Salzkonzentrationen
Hofmeister-Serie
Klassifizierung von Ionen in der Reihenfolge ihrer Fähigkeit,Proteine auszusalzen (bzw. in Lösung zu halten)
SO > H PO > CH COO > Cl > Br > I > ClO > SCN4 2 4-
3- - - -
4- -2-
NH > K > Na > Li > Mg > Ca > Guanidinium4+ + + + 2+ 2+
Löslichkeit
Destabilisierung der Tertiärstruktur
Aussalzen
Wirkung von Additiven auf die Hydrathülle von Proteinen
Eindringen in die HydrathülleWechselwirkung mit Proteinen
Aussschluss aus Hydrathülleungestörte Wechselwirkung zwischenProtein und Hydrathülle
nach Creighton
Wasser
Additiv
