BC-Praktikum II WS 2011/12

Ralf Dürr AG Dietrich

Protein

Genexpressionsnachweis 1:

Proteinnachweise

Genom - Proteom

aufgrund veränderter Bedingungen (Umweltfaktoren, Temperatur, Genexpression, Wirkstoffgabe etc.), z.B.:

Raupe und Schmetterling: gleiches Genom, aber unterschiedliches Proteom! Veränderungen des

Proteoms oftmals sehr schnell, z.B. Phosphorylierungen und Dephosphorylierung von

Proteinen (wichtig für Signaltransduktion).

Genom   größtenteils bekannt

  eher statisch

Proteom   relativ unbekannt   hoch dynamisch

Proteomik

Erforschung des Proteoms, das heißt der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen unter definierten Bedingungen und zu

einem definierten Zeitpunkt vorliegenden Proteine.

Einzelprotein-Analyse

Proteomik

Proteomik – Proteinanalyse im großen Maßstab

Protein-Expressionsprofile, Proteinmodifikationen und Protein-Netzwerke in Relation zu Zellfunktion und biologischen Prozessen,

z.B. Entwicklung, Gesundheit und Krankheit

Microarrays

modernes molekularbiologisches Untersuchungssystem

erlaubt die parallele Analyse von mehreren tausend Einzelnachweisen in einer geringen Menge

biologischen Probenmaterials

→ "Genchips" oder "Biochips" (viele Informationen auf kleinstem Raum)

DNA-Microarrays Protein-Microarrays

A) DNA-Microarrays

Genomanalyse, Diagnostik, differenzielle Genexpression

Bestimmung der mRNA-Menge bestimmter Gene

1.) Sonden (Oligos / cDNAs) an definierten Positionen eines Rasters, z. B. Glasträger

2.) RNA-Extraktion, cDNA- oder cRNA-Synthese mit Fluoreszenzfarbstoffen

3.) Hybridisierung mit Microarrays: markierte cDNA/cRNA Stücke binden an ihren

komplementären Gegenpart auf dem Array

4a.) Auslesen der Fluoreszenzsignale jeder Position des DNA-Microarrays mittels Lasers

4b.) Bioinformatischer Signalausgleich, Normalisierung, Auswertung

Chip mit Oligos

bzw. cDNAs

Hybridisierung, Exzitation, Auswertung

Auswertung der DNA-Microarrays

B) Protein-Microarrays

Spots: Vielzahl von Testfeldern

auf engstem Raum

C.) Detektion: Spots mit und ohne Protein-Protein-Interaktion (auch quantitative

Detektionsverfahren möglich)

B.) Auftrag der zu testenden Probe (Proteinmix / Antikörper)

Einzelprotein-Nachweise

verschiedenen Eigenschaften der Proteine

→verschiedene Möglichkeiten der Proteindetektion

Methoden der Proteindetektion

Objektive Methoden

  Molekulargewicht   Aminosäuresequenz

Subjektive Methoden

  colorimetrisch   absorptionsspektroskopisch

→abhängig von funktionellen Gruppen →relative Quantifizierung anhand

Proteinstandards

Strukturelle Analyse

  NMR-Analyse (Magnet-Resonanz-Tomographie)   Röntgenkristall-Analyse   Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion

Funktionelle Analyse

  immunologisch   enzymatisch   radioaktiv

Prinzip

  Proteine absorbieren und fluoreszieren im UV-Bereich (1 – 400 nm)   Proteinabsorption wird bei definierter Wellenlänge gemessen   Proteine werden nicht denaturiert

Assay reaktive Gruppe Detektionslimit (µg/ml)

Photometrisch A280 Tryptophan, Tyrosin 20 - 3000

A205 Peptidbindung 1 - 100

Fluorimetrisch

Anregung 280 aromatische AS 5 – 50 Emission 320 - 350

1. Absorptionsspektroskopie

2. Colorimetrische Methoden

Prinzip

Quantifizierung von Protein-Farbstoff-Komplexen durch Messung der Absorption bei spezifischer Wellenlänge anhand einer Standardkurve.

  abhängig von funktionellen Gruppen der Aminosäuren, welche mit einem Farbstoff reagieren keine absolute Quantifizierung

  verschiedene Assays und Versuchsbedingungen können > 20 % Abweichung hervorrufen

  Proteine denaturiert infolge von Färbung bei extremen pH-Werten

Assay Prinzip Sensitivität

Bradford Coomassie brilliant blue G250 bindet 0.2 – 20 µg/ml an aromatische und basische AS-Reste

Biuret Komplexierung der Peptidbindungen mit 1 – 20 mg/ml Cu2+ unter Bildung eines Farbumschlags

Bicinchoninic acid (BCA) Reduktion von Cu2+ durch Peptide unter 0.2 – 50 µg/ml Bildung eines Farbumschlags

Lowry Komplexierung der Peptidbindungen mit 2 – 100 µg/ml Cu2+ unter Bildung eines Farbumschlags

2. Colorimetrische Methoden

Bradford assay:

  Coomassie brilliant blue G250 + aromatische od. basische Seitenketten der Proteine (insbesondere Arginin) in saurem Milieu; sehr sensitiv, einfache Durchführung, auch zur Färbung von Proteingelen geeignet

  Quantifizierung: Absorption bei 595 nm   Beeinträchtigung: Sensitivität gegenüber Detergenzien (z. B. sodium

dodecylsulfate (SDS)) oder reduzierende Substanzen (z. B. Dithiothreitol (DTT)).

2. Colorimetrische Methoden

2. Colorimetrische Methoden

Biuret assay:

Bicinchoninic acid assay (BCA):

violett

A 562

Kupferreduktion

(Molybdän- / Wolfram-Heteropolysäure)

Lowry assay:

A 540; geringe

Sensitivität (Fehlings Reagenz)

Proteindetektion und Charakterisierung

3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese

3.1 1-D-Gelelektrophorese / SDS-PAGE

→ Molekülgröße und Reinheit eines Proteins

Proteine wandern durch Poren eines Polyacrylamid-Gels innnerhalb eines elektrischen Feldes

3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese

3.2 2-D-Gelelektrophorese

1-D: erste Trennung nach pI 2-D: Trennung nach Größe (SDS-PAGE) pI-Elektrophorese wird einem SDS-Gel aufgelegt

Proteine wandern senkrecht zur 1. Dimension in das SDS-Gel

Ende der Auftrennung

Gel mit pH-Gradient

Gel mit Protein beladen

pI-Elektrophorese

nach der pI-Elektrophorese

3. Proteintrennung durch Gelelektrophorese

3.2 2-D-Gelelektrophorese

Tausende von Proteinen können als einzelne Spots getrennt werden, geeignet zum Vergleich von Protein-Expressionsprofilen verschiedener Zellpopulationen, z. B. unterschiedliche Entwicklungsstadien, Tumor vs. Normalgewebe.

Prinzip

  Direkte Färbung des Gels (Coomassie, Silber, Fluoreszenzfarbstoffe)   Indirekt nach Gel-Blotting auf eine Membran   Detektion durch Autoradiografie radioaktiv markierter Proteine [35S].

4. Proteindetektion nach Trennung durch Gelelektrophorese

4.1 Direkte Färbung des Gels

Coomassie: bindet unspezifisch an Proteine, die durch Methanol/Essigsäure in einem Polyacrylamid-Gel fixiert sind. Detektionslimit: 0,3 – 1 µg/Proteinbande.

Silbernitrat: bindet an chemische Gruppen (Sulfhydryl, Carboxyl etc.). Nach Fixierung wird ein Polyacrylamid-Gel mit Silbernitrat gefärbt. Detektionslimit: 2 – 5 ng/Proteinbande.

Fluoreszenzfarbstoffe: z. B. SYPRO-Orange od. SYPRO-Red werden durch UV angeregt. Gefärbte Gele können in einem Transilluminator fotografiert oder mit einem Laserscanner gescannt werden. Detektionslimit: 1 – 2 ng/Proteinbande.

4. Proteindetektion nach Trennung durch Gelelektrophorese

4.2 Detektion durch Gel-Blotting (Western Blot)

Proteinübertragung auf Membran durch elektrisches Feld (blotting)

→ Detektion direkt colorimetrisch oder durch spezifische, signalmarkierte

Antikörperbindung (India ink: →50 ng; Gold: → 3 ng; SYPRO Ruby: →2 ng;

Western Blot: →0.1 - 1 ng Antigen)

5. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)

  Basiert auf spezifischen Antigen- Antikörper-Komplexen, einer der Partner ist immobilisiert

  Detektion durch einen markierten Antikörper (Enzym, Farbstoff etc.)

  ELISA erfordert Optimierung hinsichtlich unspezifischer Bindungen (z. B. Bindung an Plastikoberfläche, unspezifische Bindung der Reaktionspartner Reduktion durch Blockierung der unspezifischen Bindestellen nach Immobilisierung der Bindepartner)

5. Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)

Bsp: Enzymdetektion anhand ihrer katalytischen Aktivität

Für Nachweis der Expression eines unbekannten Proteins wird das codierende Gen an ein bekanntes Reportergen (z. B. β-Galactosidase oder Luciferase) gekoppelt, welches quantifiziert werden kann.

Assay zur Detektion von HIV-1 infizierten Zellen basierend auf β-gal Reportergen.

6. Funktionelle assays

6. Funktionelle assays

Detektion der Inhibierung einer HIV-1 Infektion durch reduzierte Expression eines Reportergens

 Aminogruppe der terminalen AS-Reste reagieren mit Phenylisothiocyanat (PITC) zu einer Anilinthiazolin-AS

 Flüssige oder gasförmige Trifluoressigsäure spaltet die AS-Derivate

7. Proteinsequenzierung durch Edman-Abbau

 Konversion der Anilinthiazolin-AS in Phenylthiohydantoin-AS, identifiziert durch reverse Phasechromatografie.

8. Massenspektrometrie

Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin

8. Massenspektrometrie

Quelle: IZKF Ulm, Dr. Markus Wunderlin

8. Massenspektrometrie

Quelle: http://www.chemie.uni-kl.de/forschung/oc/kubik/index

a) Röntgenbeugungsanalyse (X-ray)

9. Strukturelle Analysen

a) Röntgenbeugungsanalyse

1.) Züchten eines Proteinkristalls 2.) Synchotron (Teilchenbeschleuniger) - Röntgenbeugung

3.) Streuungsbild 4.) Computeranalyse und Proteinstruktur

in atomarer Auflösung

b) Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion

1.) Probenvorbereitung und Elektronenmikroskopie 2.) EM-Aufnahme

3.) „Picken“ einzelner Moleküle, Einteilung in Klassen, Winkelbestimmung, Rückprojektion, Computerberechnungen in

iterativen Verfahrung um Unschärfe zu minimieren 4.) 3D rekonstruiertes

Protein

Fitting a) Röntgenkristallstruktur +

b) 3D-Rekonstruktion +