Date post: | 05-Apr-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | burkhard-moos |
View: | 109 times |
Download: | 1 times |
ZellfraktionierungOrganellenpräparation aus Saccharomyces
cerevisiae
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien Ernten Aufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch Isolierung + Reinigung der Fraktionen
◦ Mitochondrien◦ Mikrosomen
Proteinbestimmung nach Lowry Markerenzymmessungen
◦ NADPH-Cytochrom c-Reduktase (Mikrosomen)◦ Succinatdehydrogenase (Mitochondrien)
Quantitative Bestimmung der Cytochromen
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Durchführung
Puffer A (Dithiothreitol)◦ Di-Sulfidbrücken werden dadurch aufgebrochen (Vorbereitung für Zymolyasezugabe)
Puffer B ( Sorbit) & Puffer C ( Mannit)◦ Damit der osmotische Druck stabil bleibt
Zymolyase◦ Enzym zum Abbau von Zellmembran
Phenylmethylsulfonylfluorid◦ Inhibiert proteolytische Abbaureaktionen
Triton X-100◦ Detergenz löst Membranlipide
Phenanzinmethosulfat◦ Mediator zur Wasserstoffübertragung, verstärkt die ReaktionBernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara
Treusch
Reagentien
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Messung durcho Aktivitätsenzym, welches nur in spezifischen Organell einer Zelle eine
Reaktion hervorruft
o Immunologische Charakterisierung
o Identifizierung von Zellfraktionen durch charakteristische Proteine mittels Elektrophorese
o Elektronenmikroskopie, Bestimmte Strukturen und Dichte sind spezifisch für das jeweilige Organell.
Aktivitätsmessung
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Unterschiede der NährmedienLactat Glucose
Aerob Citratzyklus + Oxidative
Phosphorylierung Mitochondrien Bis zu 12 ATP / Lactat Niedrigere Zellausbeute zu
erwarten
Anaerob, aber auch unter aeroben Bedingungen
Glycolyse + Fermentation zur Energiegewinnung bevorzugt
Cytosol 2 ATP / Glucose Pasteur-Effekt Crabtree-Effekt Höhere Zellausbeute zu
erwarten
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Lactat -> Pyruvat liefert keine Energie, deshalb erfolgt keine Fermentation sondern eine aerobe Verstoffwechselung durch den Citratzyklus
Citratcyclus & Fermentation im Vergleich
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
• Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit Cytochrom b2
Citratcyclus & Fermentation im Vergleich 2
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Unterschiede im Zellaufbau
Lactat Glucose
Atmungskette findet in den Mitochondrien statt- dadurch vermehrte Mitochondrien-Bildung
Höherer Anteil an ß-1,6-Glucan (verursacht langsameren Verdau) in der Zellwand◦ 50 min. bei 30°C mit Zymolyase
Fermentation findet im Endoplasmatischen Reticulum statt- dadurch vermehrte Mikrosomen-Bildung
Niedrigerer Anteil an ß-1,6-Glucan◦ 30 min. bei 30°C mit halber
Zymolyase-Menge
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Ablesen der Proteinmenge in der Messküvette aus gegebener Kalibrationskurve (c[µg/2,6mL] gegen Absorption)
Proteinbestimmung nach Lowry
Probe [µl] f E546 Blindwert E546
korr. Proteinmenge (Kalibration)
Protein [mg/mL]
Homogenat 15 10 0,212 0,088 0,124 25 16,67
Mitochondrien 15 2 0,221 0,088 0,133 26 3,47
Mikrosomen 15 5 0,231 0,088 0,143 29 9,67
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Benötigte Werte:
◦ Aktivität ([ΔE/min], entspricht
der Steigung), in dem Bereich,
in dem die Steigung maximal
ist!- umrechnen in Minuten
◦ Volumen der
Organellenfraktionen
◦ Proteinkonzentration in der
jeweiligen Fraktion
Markerenzymbestimmung
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.60
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
f(x) = 0.0174479876160991 x + 0.0550960533195735R² = 0.999601279646301
f(x) = 0.0234495337650324 x + 0.0792991322849214R² = 0.999659799676429
Aktivitätsbestimmung NCCR Homogenat
[min]
Ab
s
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Spezifische Aktivität [(ΔE/min)/mg]
Gesamtaktivität der Fraktion [ΔE/min]
Markerenzyme- Aktivitätsberechnungen
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Ausbeute
Anreicherungsfaktor
Kreuzkontamination
Markerenzyme- Reinheitsbestimmung
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Mittels Lambert-beer‘schem Gesetz Wellenlängenpaar λBasis/λMax zur Bestimmung von ΔE
Quantitative Cytochrombestimmung
λBasis/λMax [nm] ε [l/(mmol*cm)]
Cytochrom aa3 602/627 24,0
Cytochrom b 562/576 25,5
Cytochrom c/c1 550/533 19,2
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Bestimmung erfolgt über Differenzspektrum der α-Banden
ΔE…Extinktionsunterschied zw. λmax und λBasis
Cytochrom- Berechnung
ε Proteinkonzentration[mg/ml] Eλmax,α Ebasis ΔE c (Messlsg.)
[mmol/l]c (Mit.-Susp.)
[nmol/mg]
Cytochrom aa3 24 3,6590,012794
-0,00115 0,0139 5,810E-04 0,1588
Cytochrom b 25,5 3,6940,076551
0,047876 0,0287 1,125E-03 0,3044
Cytochrom c+c1 19,2 3,6590,088646
0,018298 0,0703 3,664E-03 1,0015
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Verdünnungen beachten
Einheiten
Taschenrechner
Schummelzettel
Nicht vergessen!
Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch
Danke für die Aufmerksamkeit
Fragen?