Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen
Funktion des
Fettsäuresynthase-Komplexes in
Saccharomyces cerevisiae
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Thomas Delong
aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt
von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 17. Mai 2006
Vorsitzender der Promotionskomission: Prof. Dr. D.-P. Häder
Erstberichterstatter: Prof. Dr. E. Schweizer
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. B. Rautenstrauss
Für meine geliebte Frau Carol Anne
und unseren Sohn Joshua Joseph
Danksagungen
Herrn Prof. Dr. E. Schweizer danke ich für die Überlassung des interessanten Themas und für
die umfassende und stets freundliche Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit.
Ich danke Prof. Dr. G. Keller vom Lehrstuhl für Mathematik und Stochastik für seinen
wertvollen Rat bei der Behandlung der in dieser Arbeit enthaltenen stochastischen Fragen.
Allen Mitarbeitern des Lehrstuhls danke ich für die gute Zusammenarbeit und stete
Hilfsbereitschaft.
INHALT I
Inhaltsverzeichnis Seite
VERZEICHNIS DER TABELLEN V
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN VI
VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN IX
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 2
1 EINLEITUNG 3
2 ERGEBNISSE 16
2.1 Herstellung hexamerer FAS-Mischkomplexe mit unterschiedlichen
Anteilen an Phosphopantethein-haltigen Untereinheiten
16
2.1.1 Hintergrund 16
2.1.2 Herstellung eines Phosphopantethein-freien FAS-Komplexes 17
2.1.3 Vorversuche zur Spaltung und anschließenden Reassoziation des
hexameren FAS-Komplexes
20
2.1.3.1 Ermittlung der maximal möglichen Menge (NH4)2SO4 bei der
Ausfällung von DMMA-dissoziierter FAS
21
2.1.3.2 Ermittlung der Mindestmenge DMMA, welche für die Dissoziation
des FAS-Komplexes benötigt wird
22
2.1.3.3 Ermittlung der geringsten für eine vollständige Reaktivierung
notwendigen Enzymmenge
24
2.1.3.4 Ermittlung der zur maximalen Reaktivierung von DMMA-
behandelter FAS notwendigen Zeit
26
2.1.4 Herstellung von hybriden Mischkomplexen aus Phosphopantethein-
freien und Phosphopantethein-haltigen FAS-Komplexen und
Vermessung der Aktivitäten dieser Mischkomplexe
28
2.1.5 Modellrechnung zur Aktivität von partiell phosphopantetheinylierten
FAS-Mischkomplexen bei Vorliegen einer Halbseiten-Aktivität
34
2.2 Untersuchungen ausgewählter Aspekte der Synthese überlanger
Fettsäuren in Hefe
41
2.2.1 Hintergrund 41
INHALT II
2.2.2 Identifizierung der mit einer Membranfraktion der Mutante ∆ybr159w
gebildeten Elongaseprodukte
48
2.2.3 FAS-freie Membranfraktionen 50
2.3 Drosselung der FAS-Aktivität in vivo und ihre physiologischen Folgen 57
2.3.1 Hintergrund 57
2.3.2 Drosseln der FAS-Aktivität durch kontrollierten Zusatz von Cerulenin
zu intakten Zellen
57
2.3.3 Isolierung von Hefe-Mutanten mit reduzierter FAS-Aktivität 60
2.3.3.1 Charakterisierung von FAS-Mutanten mit verringertem Wachstum
auf fettsäurefreiem Medium
60
2.3.3.2 Bestimmung der FAS-Aktivität in FAS-Mutanten mit verringertem
Wachstum auf Fettsäure-freiem Medium
63
2.3.3.2.1 Optimierung des radiometrischen FAS-Tests 63
2.3.3.2.1.1 Optimierung der zum Radio-FAS-Test eingesetzten
Proteinmenge
63
2.3.3.2.1.2 Festlegung der für den Radio-FAS-Test optimalen
Reaktionszeit
64
2.3.3.2.2 Messung der spezifischen Aktivität von gereinigter
Fettsäuresynthase aus den in Abb. 36 aufgeführten Mutanten
65
2.3.3.3 Untersuchungen an der Mutante fas1-268 67
2.3.3.3.1 Untersuchung der Stabilität des FAS-Proteins der Mutante fas1-
268 während der Aufreinigung des FAS-Komplexes
67
2.3.3.3.2 Gaschromatische Untersuchung des Fettsäuremusters in den
Lipiden der Mutante fas1-268
69
2.3.3.3.3 Untersuchung der in vitro FAS-Produkte im Rohextrakt der
Mutante fas1-268 und des Wildtyps BY4742
72
2.3.3.3.4 Messung der Fettacyl-CoA Spiegel im Zellextrakt von
Hefezellen
74
3 DISKUSSION 78
4 MATERIAL UND METHODEN 86
4.1 Material 86
INHALT III
4.1.1 Arbeitsgeräte 86
4.1.2 Sonstiges Arbeitsmaterial 87
4.1.3 Chemikalien 87
4.1.3.1 Allgemeine Chemikalien und Lösungsmittel 87
4.1.3.2 Spezielle Chemikalien und Lösungsmittel 87
4.1.4 Kultur-Medien 88
4.1.4.1 Nährmedien für Hefe 88
4.1.4.2 Nährmedien für E.coli 89
4.2 Organismen 89
4.2.1 E. coli 89
4.2.2 S. cerevisiae 89
4.3 Biochemische Methoden 90
4.3.1 Kultivierung von Mikroorganismen 90
4.3.1.1 Anzucht von E. coli-Zellen 90
4.3.1.2 Anzucht von Hefezellen 90
4.3.1.3 Zelldichte-Bestimmung von Flüssigkulturen 90
4.3.2 Transformation von S. cerevisiae und E. coli-Zellen 90
4.3.2.1 CaCl2-Methode zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 90
4.3.2.2 Transformation von CaCl2-behandelten E. coli-Zellen mit Plasmid-
DNA
91
4.3.2.3 Hefetransformation nach der modifizierten Lithiumacetat-Methode 91
4.3.3 Arbeiten mit DNA 92
4.3.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem „QIAprepSpin Plasmid Kit“
(Quiagen)
92
4.3.3.2 Restriktionsendonuclease-Spaltung von DNA 92
4.3.3.3 Analytische Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten 93
4.3.4 FAS Enzymreinigung aus Hefe 93
4.3.4.1 Zellaufschluß 93
4.3.4.2 Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Sedimentation in der
Ultrazentrifuge
93
4.3.4.3 Saccharose-Dichtegradient-Zentrifugation 94
4.3.5 FAS Aktivitätsmessungen [LYN3] 95
INHALT IV
4.3.5.1 FAS-Gesamtreaktion 95
4.3.5.2 β-Ketoacyl-Reduktase-Reaktion 95
4.3.5.3 Auswertung 96
4.3.5.4 Radioaktiver FAS-Test 96
4.3.6 Dissoziation und Reassoziation von Hefe-FAS nach der DMMA-
Methode [WER2, MIT]
97
4.3.7 Elongase Aktivitätstest 98
4.3.8 Gaschromatographische Analyse von Fettsäuremethylestern 98
4.3.9 „Reversed-Phase“-HPLC Analyse von Fettsäure-Gemischen 99
4.3.10 Isolierung von FAS-freien Hefemembranen 100
4.3.11 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen [BOL] 101
4.3.12 Proteintransfer auf PVDF-Membranen und Immundetektion 102
4.3.12.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen 102
4.3.12.2 Nachweis von ProteinA-markierter Proteine mit Peroxidase-
Antiperoxidase (PAP)-Antikörpern
102
4.3.12.3 „Enhanced Chemoluminescense“ (ECL)-Methode 102
4.3.13 Zellaufschluss von S.cerevisiae 103
4.3.14 In vivo Mutagenese mit Ethylmethansulfat [ADA] 103
4.3.15 Isolierung und Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern der Hefe 104
4.3.15.1 Isolierung nach Mancha et al. [MAN] 104
4.3.15.2 Isolierung nach Maningo et al. [MAG] 105
4.3.15.3 Isolierung nach Rosendal et al. [ROS] 106
4.3.15.4 Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern durch RP-HPLC 107
4.3.16 Proteinbestimmung nach Bradford [BRA] 107
4.4 Chemische Methoden 108
4.4.1 Synthese von Stearoylchlorid 108
4.4.2 Synthese von 3-Oxoeicosansäuremethylester 109
5 LITERATURVERZEICHNIS 110
LEBENSLAUF 114
INHALT V Verzeichnis der Tabellen
Seite
Tab. 1: Reinigung von Pantethein-haltiger und Pantethein-freier FAS aus Wildtyp bzw. SC1260 / YCp2MM-Transformierten Zellen.
19
Tab. 2: Ausfällung von BSA durch steigende (NH4)2SO4-Konzentrationen. 22Tab. 3: Optimierte Versuchsparameter für die Herstellung hybrider FAS-
Mischkomplexe . 27
Tab. 4: Zur Dissoziation / Reassoziation eingesetzte Mischungen aus Phosphopantethein (PA)-haltiger Wildtyp-FAS und Phosphopantethein-freier Mutanten-FAS.
28
Tab. 5: Abhängigkeit der FAS-Gesamtaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.
30
Tab. 6: Abhängigkeit der FAS β-Keto-ReduktaseTeilaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.
31
Tab. 7: Tab. 7: Relativer Anteil bestimmter Mischkomplex-Typen im Reassoziations-Gemisch aus phosphopantetheinylierter ( ) und nicht- phosphopantetheinylierter ( ) FAS.
35
Tab. 8: Berechnung der Nachbarschafts-unabhängigen (A) und Nachbarschafts-abhängigen (B) Halbseitenaktivität für die verschiedenen Anordnungsmöglichkeiten pantetheinylierter (●) und nicht- pantetheinylierter (○) α-Untereinheiten im hexameren FAS-Komplex.
38
Tab. 9 Berechnung der Aktivität von partiell pantetheinylierten Mischkomplexen unter der Annahme, dass eine Vollseiten-Aktivität (VS), eine gemäß Tab. 8 undifferenzierte, d.h. Nachbarschafts-unabhängige Halbseiten-Aktivität (HS) oder eine gemäß Tab. 8 differenzierte Halbseiten-Aktivität (vHS) besteht.
39
Tab. 10: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren mit Acetyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag) FAS Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe
53
Tab. 11: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit von Cerulenin) mit Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag) Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe
54
Tab. 12: Tab. 12: Spezifische FAS-Aktivitäten des gereinigten FAS Komplexes (optischer Test) und des Rohextraktes (radiometrischer Test) von Wildtyp Hefe und von verschiedenen Mutanten
66
INHALT VI Verzeichnis der Abbildungen
Seite
Abb. 1: Reaktionsmechanismus und Teilaktivitäten der Fettsäuresynthase 5
Abb. 2: Anordnung der Teilenzym-Domänen in den zwei bekannten Varianten
von Typ I Fettsäuresynthasen
6
Abb. 3: Übertragung des Phosphopantethein-Restes von Coenzym A auf apo FAS 8
Abb. 4: Modell des FAS-Komplexes der Hefe 9
Abb. 5: Hypothetische Halbseiten- (B) bzw. Vollseiten- (A) Aktivität eines (αβ)2-
Dimeren des FAS-Komplexes in Hefe
10
Abb. 6: Intragene Komplementation zweier unterschiedlich defekten FAS-
Mutanten nach dem Halbseiten-Modell in Abb. 5B
11
Abb. 7: Beispiele für die verschiedenen Arten von Fettacyl-CoA bedürftigen
Reaktionen der Hefe.
13
Abb. 8: Schematische Darstellung der geplanten FAS Dissoziations-
/Reassoziations-Experimente
16
Abb. 9: Überprüfung des Phänotyps von YCp2MM-transformierten SC1260
Zellen
18
Abb. 10: Abschließende Rohrzucker-Gradienten Zentrifugation der gereinigten
YCp2MM-FAS
19
Abb. 11: Protein-Acylierung mit DMMA 20
Abb. 12: FAS Inaktivierungskinetik mit unterschiedlichen Mengen DMMA 23
Abb. 13: Reaktivierung der FAS-Gesamtaktivität (A) und der β-Keto-
ReduktaseTeilaktivität (B) nach DMMA-Behandlung
25
Abb. 14: FAS Reaktivierungskinetik nach DMMA-Behandlung 27
Abb. 15: Relative spezifische FAS-Gesamtaktivitäten bei FAS-Komplexen
unterschiedlichen Phosphopantethein-Gehaltes
30
Abb. 16: Relative spezifische β-Ketoreduktaseaktivitäten bei FAS-Komplexen
unterschiedlichen Phosphopantethein-Gehaltes
31
Abb. 17: Abhängigkeit der restituierten FAS-Aktivität vom Anteil
pantetheinylierter FAS-Untereinheiten im Gemisch
33
Abb. 18: Theoretische Gesamtaktivität von FAS-Mischkomplexen bei Annahme
von Vollseiten-Aktivität (●), genereller Halbseiten-Aktivität ohne
Nachbarschafts-Effekte (●) und spezieller Halbseiten-Aktivität mit
obligatorischer Nachbarschaftsbeziehung (●).
36
INHALT VII Abb. 19: Verschiedene Möglichkeiten der relativen Anordnungen einer
unterschiedlichen Zahl phosphopantetheinylierter ( ) und nicht-
phosphopantetheinylierter ( ) α-Untereinheiten zueinander im Hexamer
in einem einfachen zweidimensionalen Modell
37
Abb. 20: Irreversible Hemmung der FAS-Kondensationsreaktion durch Cerulenin 42
Abb. 21: Reaktionsprodukte des Enzymsystems Elongase bei Verwendung von
Membranpräparationen aus Wildtyp- (A) und ∆ybr159w-Mutanten-Zellen
(B) nach p-Bromphenacylierung und Auftrennung mittels Radio-HPLC
43
Abb. 22: Derivatisierung von Fettsäuren zu p-Bromphenacylestern 44
Abb. 23: Elongation von Stearoyl-CoA in der Mutante ∆ybr169w und mögliche
Reaktionsprodukte
45
Abb. 24: Bildung von Diketiden durch aufeinander folgende Kondensation von
Stearoyl-CoA mit 2 Molekülen Malonyl-CoA
46
Abb. 25: Syntheseweg des 3-Oxoeicosansäuremethylesters gemäß Milton et al.
[MIL]
47
Abb. 26: FAB-Massenspektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters 47
Abb. 27: 1H-NMR Spektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters 48
Abb. 28: Vergleichende RP-HPLC Analyse der von der Mutante ∆ybr159w
synthetisierten Zwischenprodukte mit dem synthetischen 3-
Oxoeicosansäuremethylester
49
Abb. 29: Nachweis von Membran-gebundener Fettsäuresynthase in einer
gereinigten Zellmembran-Fraktion aus Hefe
52
Abb. 30: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren mit Acetyl-CoA als
Startsubstrat durch die löslichen (Ü, gelb) und die partikulären (N, braun)
FAS Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von
Wildtyp Hefe
53
Abb. 31: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit
von Cerulenin) mit Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die lösliche (Ü,
gelb) und die partikuläre (N, braun) Fraktionen der in Abb. 29
dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe
55
Abb. 32: Wachstumskinetik von Wildtyp Hefe in Gegenwart unterschiedlicher
Ceruleninkonzentrationen
58
Abb. 33: Anteil lebender Zellen in mit und ohne Cerulenin gewachsenen
Hefekulturen
59
INHALT VIII Abb. 34: Wachstum verschiedener fas-Mutanten und des Wildtyps auf Fettsäure-
haltigem (YPD+FS) und Fettsäure-freiem (YPD) Vollmedium
61
Abb. 35: Wachstumskinetiken von Wildtyp-Hefe und verschiedenen fas-Mutanten
in Fettsäure-haltigem (A, YPD+FS) und Fettsäure-freiem (B, YPD)
Medium
62
Abb. 36: Proteinabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige
Fettsäuren
64
Abb. 37: Zeitabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige
Fettsäuren
65
Abb. 38: Gesamtaktivität (A) und spezifische Aktivität (B) von FAS-Präparationen
aus Wildtyp Hefe ( ) und aus der Mutante fas1-268 ( ) während der
Aufreinigung
68
Abb. 39: GC-Analyse der aus Wildtyp-Hefe (A) und aus der Mutante fas1-268 (B)
gewonnenen Fettsäure-Methylester
70
Abb. 40: Zusammensetzung der in den Lipiden von Wildtyp ( ) und fas1-268 ( )
Zellen enthaltenen Fettsäuren
71
Abb. 41: Radio-HPLC Analyse der in vitro Fettsäuresynthese-Produkte von
Rohextrakten aus Wildtyp (A) und fas1-268 (B) Zellen
73
Abb. 42: Auftrennung von Palmitoyl-CoA, Margaroyl-CoA und Stearoyl-CoA
durch RP-HPLC
75
INHALT VIII
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen a / α Paarungstyp ACP Acyl Carrier Protein AC Acetyl-Transferase APS Ammoniumpersulfat AT Acyl-Transferase BSA Rinderserumalbumin 14C Kohlenstoffisotop 14 CoA, CoASH Coenzym A Ci Curie cpm Impulse pro Minute Da Dalton DH Dehydratase DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DMMA Dimethylmaleinsäureanhydrid DTT Dithiothreitol E Extinktion ECL Enhanced Chemoluminescence EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked immuno-sorbant assay EMS Ethylmethansulfonat ER Enoyl-Reduktase EUROSCARF European Saccharomyces cerevisiae archive for functional analysis FAS Fettsäuresynthase KR Ketoacyl-Reduktase KS Ketoacyl-Synthase MPT Malonyl/Palmitoyl Transferase NADPH Nicotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat, reduziert OD Optische Dichte PAA Polyacrylamid PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PPT Phosphopantethein-Transferase RP-HPLC Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography SDS Dodecylsulfat-Natriumsalz TBE Tris/Borat/EDTA TCA Trichloressigsäure TE Thioesterase TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyldiamin thr Threonin Tris Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan U Die Einheit „U“ eines jeden Enzyms ist diejenige Enzymmenge, welche die
Umwandlung von 1 µMol Substrat pro Minute unter definierten Bedingungen katalysiert.
ura Uracil UpM Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolettes Licht VLCFA Überlange Fettsäuren WT Wildtyp YPD Komplettmedium (Fettsäure-frei) YPDFS Komplettmedium (Fettsäure-haltig)
1
Zusammenfassung Thema dieser Arbeit waren verschiedene enzymchemische und physiologische Aspekte der Fettsäurebiosynthese in Saccharomyces cerevisiae. Dabei wurden zum einen die funktionellen Wechselbeziehungen zwischen den sechs Phosphopantethein-Resten innerhalb des hexameren (α6β6) Fettsäuresynthase-Komplexes der Hefe geklärt. Zum anderen sollten seit kurzem vorliegende genetische Befunde zur Identität des Fettsäureelongase-Gens YBR159w durch biochemische Studien untermauert und die eventuelle Beteiligung der Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren untersucht werden. Ein weiteres Ziel war es, Hefe-Mutanten mit einer verminderten Fettsäuresynthase Aktivität herzustellen, um mit ihnen die Folgen eines Absinkens des zellulären Acyl-CoA Spiegels zu überprüfen. Im Einzelnen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: 1. Es wurden zwei unterschiedliche Varianten des Fettsäuresynthase-Komplexes isoliert, in denen einmal die 6
Phosphopantethein-Reste des hexameren Enzyms vollzählig enthalten waren, während sie im anderen Fall vollständig fehlten. Durch reversible Dissoziation und Reassoziation von definierten Gemischen beider Komplexe wurden FAS-Mischkomplexe mit unterschiedlichen Anteilen an Phosphopantethein-haltigen und Phosphopantethein-freien α-Untereinheiten hergestellt. Beim Vergleich von spezifischer FAS-Aktivität und molarem Phosphopantethein-Gehalt stellte sich heraus, dass die FAS-Gesamtaktivität eines hybriden Mischkomplexes direkt proportional zu seinem Pantetheinylierungsgrad war. Dieser Befund spricht für die funktionelle Eigenständigkeit jedes einzelnen der 6 Phosphopantethein-Reste im Komplex und macht früher diskutierte kooperative Wechselbeziehungen zwischen den Resten unwahrscheinlich. Eine Halbseitenaktivität von Hefe-FAS konnte somit zugunsten einer Vollseitenaktivität ausgeschlossen werden.
2. Die Funktion des vor kurzem identifizierten Gens YBR159w im Rahmen der Synthese überlanger Fettsäuren sollte durch Charakterisierung des vor dem Reaktionsblock angehäuften Zwischenproduktes näher untersucht werden. Das vermutete Fettsäureelongase-Zwischenprodukt 3-Oxoeicosansäure wurde in Form seines Methylesters chemisch hergestellt und als Referenz zur Identifizierung der in vitro von der Mutante ∆ybr159w synthetisierten Intermediate eingesetzt. Das Chromatographie-Verhalten der derivatisierten Referenzsubstanz war nahezu, aber nicht vollständig identisch mit dem des in der Mutante akkumulierten Zwischenprodukts. Mögliche Ursachen hierfür im Zusammenhang mit der Instabilität der 3-Ketosäure und verschiedene denkbare Folgereaktionen im rohen Zellextrakt werden diskutiert.
3. Es wurde der Frage nachgegangen, ob in Hefezellen die Fettsäuresynthase eventuell noch eine Nebenfunktion als Fettsäure-Elongase hat. In diesem Zusammenhang wurde versucht, S.cerevisiae Zellmembranen frei von anhaftender Fettsäuresynthase herzustellen. Dabei zeigte sich, dass selbst nach intensivem Waschen mit Detergens-haltigem Puffer noch eine beträchtliche Menge FAS-Protein fest mit der Membran verhaftet war und sich von ihr nicht ablösen ließ. Die Membranfraktion besaß dennoch keine nachweisbare de novo FAS-Aktivität. Die Elongase-Aktivität der Membranen sank bei dem Waschprozess auf einen, letztlich konstanten, Wert von 5-10 Prozent der ursprünglichen Aktivität ab. Ob diese Inaktivierung durch Enzymdenaturierung oder durch die Entfernung eines löslichen Cofaktors bedingt war, wurde nicht geklärt.
4. Es wurden fas-Mutanten mit deutlich eingeschränkter, aber nicht vollständig verlorener Fähigkeit zur eigenständigen de novo Fettsäuresynthese untersucht. Es war geplant, anhand des in solchen Mutanten abgesenkten Palmitoyl-CoA Spiegels zellphysiologisch besonders kritische Palmitoylierungsreaktionen zu identifizieren. Bei einigen der untersuchten Mutanten wurde eine gute Korrelation zwischen dem bei Fettsäuremangel reduzierten Wachstum und der im Zellextrakt und auch im gereinigten FAS-Komplex noch vorhandenen FAS-Aktivität festgestellt. Bei einer einzelnen Mutante, fas1-268, war eine solche Korrelation nicht gegeben, da sie trotz niedriger Aktivität der gereinigten FAS und sehr schlechtem Wachstum in fettsäurefreiem Medium noch eine hohe FAS-Aktivität im Rohextrakt aufwies. Die Möglichkeit des spezifischen Defekts einer bisher nicht bekannten Palmitoylierungsaktivität des FAS-Komplexes wird diskutiert.
5. Die ungewöhnlich hohe FAS-Aktivität im Rohextrakt der Mutante fas1-268 wurde im Hinblick auf die Inaktivität des gereinigten Komplexes näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass das fas1-268 FAS-Protein offensichtlich metastabil ist, indem es zunächst in noch aktiver Form synthetisiert wird und danach in der Zelle seine Aktivität rasch verliert. Die Mutante fas1-268 synthetisiert einen ungewöhnlich hohen Anteil überlanger 26:0 Fettsäure. Diese Eigenschaft lässt sich einesteils mit dem bekannten Enzymdefekt der Mutante (Palmitoyl-Transferase negativ) im Sinne einer verzögerten Ablösung und somit begünstigten Weiterverlängerung der FAS-Produkte interpretieren. Zum anderen dürfte die Elongase bei der Konkurrenz um das gemeinsame Substrat Malonyl-CoA von der Inaktivierung der Fettsäuresynthase in der Mutante profitieren.
2
Summary Various enzyme chemical and physiological aspects of fatty acid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae were investigated. One purpose was to investigate the correlation between the six different phoshopantetheine residues in the hexameric (α6β6)fatty acid synthase complex in yeast. Another purpose was to biochemically investigate the putative function of the recently identified fatty acid elongase gene YBR159w and to study the possible involvement of fatty acid synthase in the formation of very long chain fatty acids. Another goal was to create yeast mutants with reduced fatty acid synthase activity levels and to investigate the effect of decreased acyl-CoA levels on critical cellular palmitoylation reactions. In detail, the following results were obtained: 1. Two types of fatty acid synthase complexes were isolated, on which the first type included all of the six
phoshopantetheine residues of the hexameric enzyme while the second contained none. By reversible dissociation and reassociation of defined mixtures of both complex types, hybrid FAS complexes with different proportions of phoshopantetheine-containing and phoshopantetheine-free α-subunits were produced. Comparison of specific FAS activities and molar phoshopantetheine concentrations showed that the activity of hybrid FAS-complexes was directly proportional to their degree of pantetheinylation. This finding strongy supports the functional autonomy of each of the six phoshopantetheine residues and therefore, makes any cooperative interaction between them unlikely. It is concluded that yeast FAS exhibits full-site, rather than half-of-the-sites reactivity.
2. The function of the recently identified gene YBR159w in fatty acid elongation was investigated by characterisation of the intermediates accumulated in ∆ybr159w mutants. The putative fatty acid elongation intermediate 3-oxoeicosanoic acid was chemically synthesised and used as a reference to identify the in vitro products of the ketoreductase mutant ∆ybr159w. The elution characteristics of the reference substance in RP-HPLC chromatography was almost, but not completely identical with that of intermediates accumulated in the mutant. Possible reasons for these differences are discussed in connection with the instability of 3-Ketoacids in the crude cell extract.
3. It was investigated whether yeast fatty acid synthase possibly exhibits an additional function as a fatty acid elongating system. An attempt was made to isolate S. cerevisiae cell membranes free from adherent fatty acid synthase. It was found that even after repeated washings with a detergent-containing buffer, a noticeable amount of FAS protein was still tightly connected to the membrane fraction. Nevertheless, the membrane fraction had no detectable de novo FAS activity. During the washing process, the elongase activity of the membranes decreased to a low but finally constant level of 5-10 percent of its original activity. Whether this deactivation was caused by enzyme denaturation or by the removal of a soluble cofactor has not been studied further.
4. FAS mutants with a distinctly reduced, but not completely absent ability for independent de novo fatty acid synthesis were investigated. The decreased palmitoyl-CoA levels in these mutants were expected to be useful in identifying the most critical cellular palmitoylation reactions. In most of the investigated mutants, the reduced growth rates in fatty acid deficient medium were perfectly correlated to the FAS activity in the cell extracts as well as to that of the purified FAS enzymes. However, in a single mutant, fas1-268, this correlation was absent. The low FAS activity of the purified enzyme and the poor growth in fatty acid free medium contrasted to an almost wildtype-like FAS-activity in the cell extract. Based on these characteristics a specific defect of a so far unidentified palmitoylation activity of yeast FAS is discussed.
5. The high FAS activity in crude cell extract of the mutant fas1-268 being in contrast to the inactivity of the isolated mutant FAS was investigated in more detail. It was shown that the fas1-268 FAS protein is apparently metastabile. While being active in statu nascendi, it continuously looses activity during enzyme purification. Mutant fas1-268 produced an unusually high proportion of the 26:0 very long chain fatty acid. On the one hand, this characteristic may be explained by the known palmitoyl transferase defect of the mutant. On the other hand, fatty acid elongases might also benefit from the inactivation of the FAS complex which usually competes for the common substrate malonyl-CoA.
EINLEITUNG 3
1 Einleitung
Die de novo Biosynthese langkettiger Fettsäuren aus Acetyl-Coenzym A ist eine elementare
biochemische Leistung fast aller Organismen und Zellen. Das Enzymsystem, welches diese
Leistung erbringt, ist die so genannte Fettsäuresynthase (FAS). Das FAS-Enzymsystem
katalysiert den Reaktionsablauf der Fettsäure-Biosynthese in mehreren aufeinander
folgenden, biochemisch gut untersuchten Schritten. Die Einzelheiten dieser Reaktionsfolge
wurden von Lynen [LYN1, LYN2], Vagelos [VAG1, VAG2] und Wakil [TOO] entschlüsselt
und sind in dem in Abb. 1 gezeigten Reaktionsschema zusammengefasst. Die biologischen
Aufgaben von Fettsäuren für die Struktur und Funktion lebender Zellen sind äußerst
vielfältig. Mengenmäßig am bedeutsamsten ist ihr Vorkommen in den Phospholipiden der
meisten biologischen Membranen und in den Triacylglyceriden der Speicherfette. Daneben
üben sie aber auch als Seitenketten von Coenzymen (z.B. Liponsäure), als Bestandteil von
Sekundärmetaboliten (z.B. Norsorolinsäure [WOL]), als kovalente Anheftungen spezieller
eukaryotischer Proteine (z.B. Palmitoylierung von Ras [DIE]) und als eukaryotische „second
messenger“ Moleküle (z.B. Diacylglycerin als Aktivator der Proteinkinase C [OLI]), wichtige
biologische Funktionen aus. Sie spielen demnach nicht nur Schlüsselrollen bei der zellulären
Energiespeicherung und bei der Stabilität und Dynamik biologischer Membranen, sondern
wirken auch als Regulatoren des zellulären Metabolismus und der Zellphysiologie.
Obwohl ausgeprägte Unterschiede in der molekularen Struktur der FAS-Enzyme
unterschiedlicher Organismen existieren, ist doch der Reaktionsmechanismus der Synthese
von Fettsäuren aus Acetyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A in sämtlichen biologischen
Systemen grundsätzlich derselbe. Bei diesem Prozess werden mehrere aufeinander folgende
Zyklen einer stets gleich bleibenden Reaktionssequenz in Kombination mit einer speziellen
Anfangs- und Endreaktion durchlaufen. Die einzelnen Reaktionsschritte der
Fettsäurebiosynthese werden von den folgenden Teilenzymen des FAS-Multienzymsystems
katalysiert: Acetyl-Transferase (AC); Malonyl-Transferase (MT); Ketoacyl-Synthase (KS);
Ketoacyl-Reduktase (KR); Dehydratase (DH); Enoyl-Reduktase (ER) und Thioesterase (TE)
bzw. Palmitoyl-Transferase (PT). In Abhängigkeit von dem jeweiligen FAS-System können
die drei Acyl-Transferasen außer als Acetyl-, Malonyl- und Palmitoyl-Transferasen auch als
Malonyl/Palmitoyl-Transferasen (MPT bei Pilzen) oder als Acetyl/Malonyl-Transacylase
Mischenzyme (AT bei Tieren) auftreten [SCH]. Die Reaktionsweise der einzelnen
EINLEITUNG 4
Teilenzyme im Gesamtprozess der Fettsäuresynthese ist in Abb. 1 dargestellt. Im Einzelnen
spielt sich der Reaktionsablauf wie folgt ab:
Die de novo Biosynthese von Fettsäuren beginnt damit, dass eine Acetylrest von Coenzym A
auf eine spezielle OH-Bindungsstelle des Acetyl-Transferase-Teilenzyms (1) übertragen wird.
Von dort wird der Acylrest an eine funktionelle Cystein-Thiolgruppe im aktiven Zentrum des
Ketoacylsynthase-Teilenzyms (3) abgegeben. Gleichzeitig wird vom zweiten Startsubstrat
Malonyl-Coenzym A der Malonylrest durch das Teilenzym Malonyl-Transferase (2) auf die
terminale SH-Gruppe (SHC) des Phosphopantetheinarms der Acyl-Carrier-Protein-
Komponente im FAS-System übertragen. Die Ketoacyl-Synthase (3) katalysiert nun, unter
Freisetzung von CO2, die Übertragung des Acetylrestes auf den decarboxylierten Malonylrest.
Somit entsteht ein als Phosphopantethein-Thioester enzymgebundenes 3-Oxocarbonsäure-
Intermediat. Anschließend wird der 3-Oxoacyl-Thioester durch das Teilenzym Ketoacyl-
Reduktase (4) unter Verbrauch von NADPH zum 3-Hydroxyacyl-Thioester reduziert. Dieses
Intermediat wird dann, durch das Dehydratase-Teilenzym (5), unter Freisetzung von Wasser
in ein enzymgebundenes 2,3-Transenoat umgewandelt. Das Enoyl-Reduktase-Teilenzym (6)
sorgt schließlich unter Verwendung von NADPH für die abschließende Reduktion des Enoats
zu einer um zwei Kohlenstoffatome verlängerten, vollständig gesättigten Fettsäure. Dieses
immer noch enzymgebundene Reaktionsprodukt wird nun, solange es noch nicht die
Endlänge von 16-18 Kohlenstoffatomen erreicht hat, auf die Cystein-Thiolgruppe der
Ketoacyl-Synthase zurück übertragen und so in einen weiteren Verlängerungszyklus
eingespeist. Am Ende von insgesamt sieben derartigen Elongationszyklen wird die
entstandene langkettige Fettsäure entweder durch eine Palmitoyl-Transferase (8;
Mikroorgansimen) mit Coenzym A thiolytisch oder durch eine Thioesterase (7; Tiere) mit
Wasser hydrolytisch abgespalten.
Bisher sind zwei hinsichtlich ihrer molekularen Struktur unterschiedliche Typen von FAS-
Systemen bekannt. Beim einen Typ (Typ II), der überwiegend in Bakterien und in den
Organellen von Eukaryonten auftritt, werden die verschiedenen enzymatischen Teilaktivitäten
diskreten Einzelenzymen zugeschrieben, von denen jedes durch ein eigenes spezielles Gen
kodiert wird. Im Gegensatz dazu sind beim zweiten FAS-Typ (Typ I) die katalytischen
Zentren der verschiedenen Teilenzym-Aktivitäten entweder auf einer einzigen,
zusammenhängenden (Typ Ib) oder auf zwei, ebenfalls multifunktionellen Polypeptidketten
(Typ Ia) lokalisiert. Dieses Organisationsprinzip ist schematisch in Abb. 2 dargestellt.
EINLEITUNG 5
Abb. 1: Reaktionsmechanismus und Teilaktivitäten der Fettsäuresynthase.
Die enzymatischen Teilaktivitäten sind nummeriert (1-8, s. auch im Text) und mit blauen Kästchen hinterlegt.
Die Startsubstrate Acetyl-CoA (rot) und Malonyl-CoA (blau) und die entsprechenden Atomsymbole werden
einschließlich bis zur Ketoacyl-Synthase-Reaktion farblich hervorgehoben. Der Phosphopantethein-Rest wird
durch die Kurzschreibweise Pan-S dargestellt. Die funktionelle Cystein-Thiolgruppe des Ketoacyl-Synthase-
Teilenzyms wird durch die Kurzschreibweise Cys-S dargestellt.
EINLEITUNG 6
AC ER DH KR PPTPPTKSMPT ACP Typ Ia S. cerevisiae (α6β6)
Typ Ib Corynebakterien (α6)
β α
α
KS AT DH ER KR ACP TE Typ Ib Säugetiere (α2)
α
AC ER DH MPT ACP KR KS
Abb. 2: Anordnung der Teilenzym-Domänen in den zwei bekannten Varianten von Typ I
Fettsäuresynthasen.
Die Pfeile kennzeichnen zusammenhängende Leserahmen auf DNA-Ebene (Aminosäuresequenz in
Pfeilrichtung) bzw. Polypeptidsequenzen. Die farbliche Unterteilung der Proteinketten in einzelne funktionelle
Domänen ist nicht skaliert, entspricht aber in der relativen Reihenfolge der Domänen den experimentellen
Befunden [SCH]. PPT ist das Kürzel für die Phosphopantethein-Transferase. Die übrigen Abkürzungen sind in
Abb. 1 beschrieben.
Fettsäuresynthasen des Typs I treten - mit Ausnahme der höheren Pflanzen -
charakteristischerweise im Cytoplasma aller Eukaryonten [LYN2, RAN, SCH1] auf.
Zusätzlich werden sie bei Prokaryonten auch noch in der Familie der Coryne- und
Mycobakterien gefunden [BLO]. Wie bereits erwähnt und ebenfalls in Abb. 2 verdeutlicht ist,
können Typ I FAS-Enzyme unter Berücksichtigung der Anordnung ihrer katalytischen
Domänen und der stöchiometrische Zusammensetzung ihrer Untereinheiten auch noch in die
zwei Subtypen Ia und Ib unterteilt werden. Hinsichtlich ihrer Quartärstruktur kennzeichnet die
mikrobiellen Typ I Fettsäuresynthasen eine hexamere Zusammensetzung α6β6 bei Pilzen bzw.
α6 bei Coryne- und Mycobakterien. Die Domänenreihenfolge innerhalb der α- bzw. αβ-
Protomere folgt hierbei dem in Abb. 2 gezeigten Schema der Typ Ia-Synthasen. Im Gegensatz
dazu sind tierische Typ I Fettsäuresynthasen Dimere und zeigen die in Abb. 2 für Typ Ib-
Synthasen skizzierte Domänen-Reihenfolge. Als eine Besonderheit mit bisher noch
unbekannter funktioneller Bedeutung wurden vereinzelt auch auf DNA-Ebene Fusionen von
2-3 kompletten FAS-Genen des Typs Ib beobachtet [COL, SIR2, ZHU].
Die Fettsäuresynthase ist in der Regel ein cytosolisches Haushaltsenzym. In der vielfältig
substrukturierten Eukaryonten-Zelle findet sich neben der cytosolischen FAS jedoch auch
EINLEITUNG 7
noch eine zweite, mitochondrielle Fettsäuresynthase mit spezieller Bedeutung für den
Energiestoffwechsel dieser Organelle [BRO, SHI]. Gelegentlich beobachteten, zusätzlichen
FAS-Varianten in bestimmten Organismen kommt dort gewöhnlich eine spezielle Bedeutung
im Sekundärstoffwechsel dieser Zellen zu [FER1, FER2, FIT].
Die Fettsäuresynthase (FAS) in S. cerevisiae besteht aus zwei verschiedenen Protein-
Untereinheiten, α und β. Beide Untereinheiten sind mit 226 (α) bzw. 207 (β) kDa von
vergleichbarer Größe. Der intakte FAS-Komplex ist ein (αβ)6 Hexameres bzw. α6β6
Heterododecameres. Die α-Untereinheit enthält die aktiven Zentren der Ac(et)yltransferase
(AC), Enoyl-Reduktase (ER), Dehydratase (DH) und Malonyl-/Palmitoyl-Transacylase
(MPT). Die β-Untereinheit enthält neben der Acyl-Carrier-Protein-Domäne (ACP) die aktiven
Zentren der Ketoacyl-Reduktase (KR), der Ketoacyl-Synthase (KS) und der
Phosphopantethein-Transferase (PPT) (vgl. Abb. 2).
Im Gegensatz zu allen anderen bekannten FAS-Systemen verfügt der FAS-Komplex in Hefe
und anderen Pilzen über eine eigene, interne Phosphopantethein-Transferase [FIC], welche
mit den drei übrigen aktiven Zentren der α-Untereinheit dieses Typ Ia FAS-Proteins fusioniert
ist (vgl. Abb. 2). Die Aufgabe der Phosphopantethein-Transferase (PPT) besteht darin, die im
ACP-Bereich der α-Kette verankerte prosthetische Gruppe Phosphopantethein
posttranslationell von Coenzym A auf die Hydroxylgruppe eines spezifischen Serinrestes
(Ser180) der apo ACP-Domäne zu übertragen (vgl. Abb. 3). Die terminale SH-Gruppe von
enzymgebundenem Phosphopantethein stellt eine der beiden bekannten reaktiven
Thiolgruppen des FAS-Komplexes dar. Sie wird, im Gegensatz zu der im aktiven Zentrum
der Ketoacyl-Synthase gelegenen „peripheren“ SH-Gruppe (SHP) als „zentrale“ Thiolgruppe
bezeichnet (SHC). Wie aus dem geschilderten Reaktionsablauf hervorgeht, spielt die
prosthetische Gruppe 4’-Phosphopantethein bei der Elongation der Fettsäuren durch das FAS-
System eine Schlüsselrolle. Aufgrund der Länge und Flexibilität dieses Armes nimmt man an,
dass die daran gebundenen Intermediate an den einzelnen Teilenzymen vorbeigeführt und
dabei deren katalytischen Zentren präsentiert werden. In allen Fettsäuresynthasen ist der
Kofaktor Phosphopantethein kovalent an die OH-Gruppe eines speziellen Serinrestes im sog.
Acyl-Carrier-Protein (ACP) gebunden. Während das Acyl-Carrier-Protein in E. coli (Typ II
FAS) das mengenmäßig bedeutsamste Einzelprotein der Zelle darstellt [ROC], steht den
verschiedenen Teilenzymen in Typ I FAS-Systemen nur eine einzige komplexinterne ACP-
Domäne zur Verfügung.
EINLEITUNG 8
+ O
HHH
H
Adenin
OH O
SHNN
OP
OP
OH
O
H
O
H
O
O OH
OHO
P OHO
OHapo-FAS ( )
3',5'-ADP PPT
PPTACP
SHC
holo-FAS ( )SH
PPTACP
OH
O
Abb. 3: Übertragung des Phosphopantethein-Restes von Coenzym A auf apo FAS.
Der Phosphopantethein-Rest (rot markiert) wird durch das Enzym Phosphopantethein-Transferase (PPT) von
Coenzym A auf einen spezifischen Serinrest des Acyl-Carrier-Protein (ACP) Bereichs im FAS-Komplex
übertragen.
Lynen et al. [LYN2] entwickelten das in Abb. 4 gezeigte Schema zum enzymgebundenen
Ablauf des Fettsäuresynthese-Prozesses an den beiden Thiolgruppen („periphere“ Cystein-
und „zentrale“ Pantethein SH-Gruppe) des Enzymproteins [AYL, ENG, KRE, LYN2, SCR,
SCH2, ZIE]. Im Einzelnen wird dabei der Acetatrest in drei aufeinander folgenden Schritten
von Coenzym A auf die „periphere“ Thiolgruppe (Cys-SHP) übertragen. An dieser
Übertragung sind eine spezielle Hydroxylgruppe (Ser-OHAc) der Ac(et)yltransferase (AC), die
„zentrale“ Thiolgruppe (SHC) als vorübergehende Acylierungsstellen und die „periphere“ SH-
Gruppe (Cys-SHP) als endgültige Acetyl-Bindestelle beteiligt (vgl. Abb. 4). Wie in Abb. 4 mit
dem gepunkteten Pfeil angedeutet ist, kann die Acetylgruppe grundsätzlich, wenn auch
deutlich weniger effizient, auch über die Malonyl-Transferase zur „zentralen“ und dann zur
„peripheren“ SH-Gruppe übertragen werden. In einem davon unabhängigen, zweistufigen
Transacylierungs-Prozess wird der Malonylrest von Coenzym A über eine spezielle
Hydroxylgruppe (Ser-OHMal) der Malonyl/Palmitoyl-Transacylase (MPT) auf die zentrale
Thiolgruppe (SHC) übertragen. Anschließend kondensieren, wie in Abb.1 dargestellt,
EINLEITUNG 9
enzymgebundenes Malonat und enzymgebundenes Acetat durch die katalytische Wirkung der
Ketoacyl-Synthase (KS) miteinander unter CO2-Abspaltung zu enzymgebundener β-
Ketosäure (vgl. Abb. 1).
KSKR
PPT
DHER
MPT
AC
ACP
SHC
HSC
HOMal
HOAcAcetyl-CoA
Malonyl-CoA
SHP
Abb. 4: Modell des FAS-Komplexes der Hefe.
Acetyl- und Malonyl-Bindungsstellen und Transacylierungsreaktionen des FAS-Komplexes in Hefe. Die
Untereinheiten α (grün) und β (rot) wurden durch unterschiedliche Farben und deren katalytische Zentren als
diskrete Proteindomänen gekennzeichnet. Der Phosphopantethein-Rest ist durch eine Zickzacklinie dargestellt.
Abkürzungen: Acetyl-Transferase (AC), Ketoacyl-Synthase (KS), Ketoacyl-Reduktase (KR),
Phosphopantethein-Transferase (PPT), Dehydratase (DH), Enoyl-Reduktase (ER), Malonyl/Palmitoyl-
Transferase (MPT), Acyl-Carrier-Protein (ACP).
Nach der Kondensationsreaktion befindet sich deren Produkt an der „zentralen“ Thiolgruppe
(SHC). Diese ist damit blockiert und kann mit einem neuen Malonylrest erst dann wieder
beladen werden, wenn das Intermediat von ihr abgespalten wurde. Dies erfolgt dadurch, dass
die „zentrale“ Thiolgruppe (SHC) sozusagen als „schwingender Arm“ fungiert und das an sie
gebundenen Intermediat an den verschiedenen katalytischen Zentren des FAS-Komplexes
vorbeischleust, bis es letztlich als gesättigter Acylrest wieder auf die „periphere“
Cysteingruppe (Cys-SHP) übertragen wird und damit die „zentrale“ SH-Gruppe (SHC) wieder
freigesetzt wird (vgl. Abb. 1). Damit wird sie wieder aufnahmefähig für einen neuen
Malonylrest, welcher für einen weiteren Elongationszyklus notwendig ist.
Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Reaktivität des FAS-Komplexes von
Hefe einer negativen Kooperativität unterliegt [SCU]. Dies bedeutet, dass sich weder Acetat
noch Malonat, selbst unter Sättigungsbedingungen, stöchiometrisch an alle vorhandenen
EINLEITUNG 10
Acetat- bzw. Malonat-Bindestellen des FAS-Komplexes binden. Stattdessen binden nur 2-3
statt 12 theoretisch mögliche Mole Malonat und 6-7 statt 24 mögliche Mole Acetat an 1 Mol
des hexameren FAS-Komplexes. Diese negative Kooperativität stellt wohl sicher, dass der
größte Teil der Bindungsstellen des Enzym-Oligomers für die Intermediate zur Verfügung
steht und nicht schon zu Beginn der Reaktion durch die Startsubstrate blockiert wird. Sie ist
daher günstig für den Reaktionsmechanismus und könnte einer der Gründe für die stets
oligomere Struktur des FAS-Komplexes sein. Weiterhin haben frühere Untersuchungen von
Lynen et al. [LYN3] gezeigt, dass sich an die 6 „peripheren“ SH-Gruppen des FAS-Hexamers
nur 3 Moleküle des SHP-Hemmstoffes Iodacetamid binden. Es erschien daher denkbar, dass
Hefe-FAS eine Halbseiten-Aktivität aufweist, bei der jeweils nur 3 von 6 (αβ)-Einheiten
gleichzeitig aktiv sind. Eine derartige Aktivität wäre dann gegeben, wenn für jeden
Reaktionszyklus nicht nur eine, sondern zwei (αβ)-Einheiten nötig wären. Im Gegensatz dazu
steht eine Vollseiten-Aktivität, bei der jede (αβ)-Einheit für sich alleine aktiv ist (vgl. Abb.
5).
A
B
Abb. 5: Hypothetische Halbseiten- (B) bzw. Vollseiten- (A) Aktivität eines (αβ)2-Dimeren des FAS-
Komplexes in Hefe.
Die individuellen α-Untereinheiten (rot) und die β-Untereinheiten (grün) arbeiten bei einer Vollseiten-Aktivität
vollständig unabhängig voneinander. Im Gegensatz dazu kooperieren bei einer Halbseiten-Aktivität zwei (αβ)–
Protomere (grau hinterlegt) miteinander in derselben Reaktionsfolge.
EINLEITUNG 11
Frühere genetische Versuche hatten gezeigt, dass eine defekte Domäne der β-Untereinheit
(gleiches gilt für α) durch die entsprechende intakte Domäne einer anderen β-Untereinheit
ersetzt werden kann, d.h. jede β-Untereinheit funktioniert nicht für sich alleine und
unabhängig von den anderen β-Untereinheiten, sondern alle β-Untereinheiten im Komplex
können miteinander kommunizieren [KUN, SCH3, WER2]. Dieser Zusammenhang soll durch
folgendes Beispiel erläutert werden: Die Diploide, die nach Kreuzung einer Enoylreduktase-
defekten FAS-Mutante mit einer Dehydratase-defekten FAS-Mutante entsteht, besitzt wieder
FAS-Aktivität, obwohl sie zwei für sich allein inaktive Arten von β-Untereinheiten besitzt
(Abb. 6).
A
B
Abb. 6: Intragene Komplementation zweier unterschiedlich defekten FAS-Mutanten nach dem
Halbseiten-Modell in Abb. 5B.
Werden die FAS-Untereinheiten einer Dehydratase-defekten Mutante (gelb hinterlegt) mit denen einer
Enoylreduktase-defekten Mutante (grau hinterlegt) in der diploiden Zelle zu einem Hybridkomplex gemischt, so
erlaubt nur das Halbseiten-Modell (B), nicht aber das Vollseiten-Modell (A) eine Wiederherstellung der FAS-
Aktivität.
Diese so genannte intragene Komplementation von defekten β-Untereinheiten (gleiches gilt
für die α-Untereinheiten) lässt sich unschwer dadurch erklären, dass die beiden Defekte durch
die in Abb. 6B für kooperierende (αβ)-Dimere gezeigte β1/β2 Wechselwirkung umgangen
EINLEITUNG 12
werden. Allerdings bleibt dabei die Fragestellung offen, ob die offensichtliche
Wechselwirkung zwischen zwei gleichartigen Untereinheiten im FAS-Komplex die Folge
einer obligatorischen Halbseiten-Aktivität ist (vgl. Abb. 6B) oder ob sie neben der Vollseiten-
Aktivität nur eine weitere Möglichkeit des Komplex-internen Produkt Austauschs darstellt.
Die Problematik der Vollseiten- und Halbseiten-Aktivität im FAS-Komplex der Hefe war
eine der Fragen, die es in dieser Arbeit zu untersuchen galt. Um Aufschluss über die
Beteiligung des Phosphopantethein-Restes an einer möglichen Halbseiten-Aktivität zu
erhalten, sollten dabei FAS-Komplexe der Hefe gewonnen werden, die nicht vollständig
phosphopantetheinyliert waren. Anschließend sollten die FAS-Aktivitäten dieser nur teilweise
phosphopantetheinylierten FAS-Komplexe gemessen und mit der Anzahl der jeweils
vorhandenen Phosphopantethein-Reste korreliert werden.
Die Beendigung der FAS-Reaktionsfolge durch eine hydrolytische oder thiolytische
Terminationsreaktion (vgl. Abb. 1) ist hinsichtlich der Kettenlängen-Spezifität eine
individuelle Eigenschaft jedes einzelnen FAS-Systems. Durch diese Terminations-Reaktion
werden sowohl die Kettenlänge des FAS-Produktes als auch der Empfänger der jeweils
synthetisierten Fettsäuren bestimmt. In E. coli werden die langkettigen Fettsäuren
beispielsweise spezifisch durch eine Glycerinphosphat-Transacylase unter Umgehung einer
Acyl-CoA Zwischenstufe direkt vom Acyl-Carrier-Protein auf 3-Phosphoglycerat übertragen
[ROC]. Ferner können in bakteriellen FAS-Systemen kürzerkettige Intermediate für andere
Prozesse, wie z. B. die Liponsäure-Biosynthese, abgezweigt werden. Von einigen FAS-
Systemen weiß man, dass sie ihre Fettsäure-Endprodukte nicht auf Coenzym A oder Wasser,
sondern direkt an spezielle Zielproteine oder Metabolite abgeben [UEN]. In jedem Fall wird
der Abbruch des Elongationszyklus wahrscheinlich durch eine Verschiebung der relativen
Aktivitäten zweier FAS-intern miteinander um dasselbe Zwischenprodukt konkurrierender
Teilenzyme, der Ketoacyl-Synthase und der Fettacyl-Transferase bzw. –Hydrolase, bewirkt
[BLO, WON]. Die Endprodukte der Fettsäuresynthase dienen in mancherlei Weise auch als
Substrate für weiterführende zelluläre Prozesse. Die verschiedenen in Abb. 7 aufgeführten
Fettacylierungsreaktionen werden durch spezifische Transacylasen unter Verwendung von
Acyl-CoA als Substrat durchgeführt. Dabei dürften die einzelnen Transacylasen ihre
Michaelis Konstanten einerseits an die physiologischen Acyl-CoA Konzentrationen der Zelle
und anderseits an den Bedarf der Zelle für das jeweilige Acylierungsprodukt angepasst haben.
Mutationsbedingte Veränderungen von KM-Werten dieser Enzyme oder ein Absinken des
EINLEITUNG 13
intrazellulären Acyl-CoA Spiegels sollten zu eventuell differentiell ausgeprägten Defekten bei
den in Abb. 7 aufgeführten Zell-Leistungen führen.
Lysophosphatidat Phosphatidat
Triacylglyceride Phosphoglyceride
C
CH2OH
H
CH2OPO3
HO C
H2C
H
CH2OPO3
HO
O C R1
O
C
H2C
H
CH2OPO3
O
O C R1
O
C
O
R2
Acyl-CoA Acyl-CoA
A
C
Farnesyl
Palmitoyl-CoA
SH
Ras
C
Farnesyl
S
Palmitoyl
Ras
B
Serin Dehydrosphinganin Dihydrosphingosin Sphingosin
C
CH2OH
NH3+
COO-
HPalmitoyl-CoA C
CH2OH
NH3+
C
H
O
CH2
CH2
(CH2)12
CH3
C
CH2OH
NH3+
C
H
OH
CH2
CH2
(CH2)12
CH3
C
CH2OH
NH3+
C
H
OH
CH
CH
(CH2)12
CH3
C
Abb. 7: Beispiele für die verschiedenen Arten von Fettacyl-CoA bedürftigen Reaktionen der Hefe.
In der Abb. sind verschiedene Fettacyl-CoA bedürftige Reaktionen der Hefe dargestellt. Dazu gehören u. a. die
Fett-Acylierung von Glycerin (A), die Fett-Acylierung von Proteinen (B) und die Bildung von Sphingosin (C).
Daher war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, den Einfluss einer verminderten FAS-Aktivität
in Hefe auf andere zelluläre Funktionen zu untersuchen. Dazu sollte die FAS-Aktivität in
EINLEITUNG 14
Hefe soweit herabgesetzt werden, dass durch den dadurch abgesenkten Acyl-CoA Spiegel der
Zelle bestimmte Fettsäure-bedürftige Reaktionen nicht mehr ausreichend versorgt werden
konnten.
Obwohl die meisten Fettsäuresynthasen Acetyl-CoA als Startsubstrat verwenden und
Palmitin- bzw. Stearinsäure die Endprodukte bilden, existieren dennoch auch FAS-Systeme
mit andersartigen Start- und Endprodukten. So produzieren einige bakterielle Systeme
terminal verzweigte Fettsäuren aus verzweigten, kurzkettigen Fettsäure-Startern [KAN1,
KAN2]. Andere FAS-Systeme verwenden langkettige Fettsäure-CoAs anstelle von Acetyl-
CoA als Startsubstrat. Derartige Systeme werden gewöhnlich als Elongasen bezeichnet und
bilden Fettsäuren bzw. Fettsäurederivate bis zu einer Kettenlänge von 60 Kohlenstoffatomen.
Das Produktspektrum der FAS kann auch durch die Gegenwart oder unter dem Einfluss
bestimmter Proteine oder Metabolite verschoben werden. So entstehen z. B. mit Hefe-FAS in
Gegenwart des Acyl-CoA Bindeproteins (ACBP) hauptsächlich 14 – 18 C-Atome lange
Fettsäuren, während in Abwesenheit von ACBP vor allem 18 – 20 C-Atome lange Produkte
gebildet werden [LYN2].
In Eukaryonten-Zellen wird neben den vom cytosolischen FAS-Komplex gebildeten
langkettigen (C14 – C18) Fettsäuren zusätzlich noch eine geringe Menge (0,5 – 3%)
überlange Fettsäuren (VLCFA) mit einer Länge bis zu 26 C-Atomen synthetisiert. Überlange
Fettsäuren sind üblicherweise über eine Amidbindung an das Sphingosinrückgrat der
Sphingolipide gebunden [DIC]. Trotz ihres geringen Anteils an der Gesamtmenge zellulärer
Lipide sind überlange Fettsäuren aus noch nicht ganz geklärten Gründen für das Überleben
der Zellen notwendig [KOH, SCE]. Überlange Fettsäuren werden durch das bereits erwähnte
Elongase-System gebildet, welches langkettiges Acyl-CoA (z.B. Stearoyl-CoA) anstelle von
Acetyl-CoA als Starter verwendet. Ansonsten benötigt dieses membrangebundene FAS-
ähnliche Enzym-System ebenso wie herkömmliche FAS Malonyl-CoA und NADPH für den
Elongationsprozess [DIT, ROS]. Trotz großer Ähnlichkeit im Reaktionsmechanismus von
FAS und Elongase erscheint es vorerst auf Grund des bisher fehlenden Nachweises weiter
Pantethein-haltiger Zellproteine als eher zweifelhaft, dass das Elongationssystem ebenfalls
mit enzymgebundenem Phosphopantethein als prosthetischer Gruppe arbeitet. Auch ist die
Elongase – im Gegensatz zu allen übrigen bekannten FAS-Systemen – nicht empfindlich
gegenüber dem Hemmstoff Cerulenin [ROS]. Weitergehende Kenntnisse zur molekularen
Struktur der Elongase(n) in Hefe liegen bisher nicht vor. Es hat jedoch den Anschein, als ob
EINLEITUNG 15
dieses membrangebundene Enzymsystem – anders als FAS – sich aus verschiedenen,
voneinander unhabhängigen Einzelenzymen zusammensetzt. Zwei der beteiligten Teil-
Enzyme, eine β-Ketoacyl-Reduktase und eine Enoyl-Reduktase, werden offenbar durch die
Gene YBR159w und TSC13 kodiert [BEA, HAN, KIM, ROS]. Die Rolle des Gens
YBR159w bei der Bildung überlanger Fettsäuren durch die Elongase-Systeme der Hefe war
eine weitere Fragestellung, die in dieser Arbeit behandelt wurde. Die Funktion von YBR159w
sollte dabei durch die chemische Synthese von Referenz-Substanzen zur Charakterisierung
der Elongations-Intermediate geklärt werden.
ERGEBNISSE 16
2 Ergebnisse
2.1 Herstellung hexamerer FAS-Mischkomplexe mit unterschiedlichen
Anteilen an Phosphopantethein-haltigen Untereinheiten
2.1.1 Hintergrund
In einem ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollte die funktionelle Wechselbeziehung
zwischen den sechs verschiedenen Phosphopantethein-Resten innerhalb des hexameren (α6β6)
FAS-Komplexes der Hefe untersucht werden. Experimentell sollte dabei so vorgegangen
werden, dass die Abhängigkeit der FAS-Gesamtaktivität von der Zahl der Phosphopantethein-
Reste im Komplex bestimmt wurde. Denkbar war dabei neben einer linearen Beziehung
zwischen beiden Größen (keine Kooperativität) unter Umständen auch eine nicht-lineare
Beziehung (z.B. positive Kooperativität).
+
DMMA Dissoziation
Reassoziation
A B C D E F G
Abb. 8: Schematische Darstellung der geplanten FAS Dissoziations-/Reassoziations-Experimente.
Phosphopantethein-haltige ( ) und Phosphopantethein-freie ( ) Untereinheiten der beiden Ausgangsenzyme
wurden durch DMMA-Behandlung voneinander getrennt und anschließend durchmischt. Bei der Reaggregation
intakter FAS aus dem Gemisch entstanden FAS-Komplexe (A-G) mit unterschiedlichen Anteilen an
Phosphopantethein-haltigen α-Untereinheiten (0-6).
ERGEBNISSE 17
Um diese Frage zu klären, sollte ein vollkommen Phosphopantethein-freier FAS-Komplex
mit einer vollständig phosphopantetheinylierten FAS in unterschiedlichen stöchiometrischen
Verhältnissen vermischt und anschließend die beiden Arten von FAS-Komplex mittels
Dimethylmaleinsäureanhydrid (DMMA) in ihre einzelnen Untereinheiten dissoziiert werden.
Bei der anschließenden Reassoziation von Phosphopantethein-freien und Phosphopantethein-
haltigen Untereinheiten aus diesem Gemisch zu intakten hexameren Aggregaten sollten
Mischkomplexe mit unterschiedlichen Anteilen an Phosphopantethein-haltigen
Untereinheiten gebildet werden (vgl. Abb. 8).
2.1.2 Herstellung eines Phosphopantethein-freien FAS-Komplexes
Phosphopantethein-haltige FAS kann aus Wildtyp Hefezellen gewonnen werden. Zur
Herstellung von Phosphopantethein-freier FAS wurde in einer Hefemutante (SC1260), in der
das Gen für die Phosphopantethein-tragende FAS α-Untereinheit zuvor deletiert worden war
(∆fas2::LEU2) eine Plasmid-kodierte, mutierte α-Untereinheit exprimiert, welche die
Fähigkeit zur Phosphopantethein-Bindung verloren hatte. Dies war dadurch erreicht worden,
dass die im Wildtyp-Protein Phosphopantethein-bindende Aminosäure Ser180 in Untereinheit
α durch Glycin ersetzt worden war. Das entsprechende Plasmid YCp2MM war von Maria
Mittag in unserem Labor konstruiert worden [MIT]. Durch das Fehlen der Aminosäure
Ser180 kann der Phosphopantethein-Rest nicht mehr von Coenzym A auf die ACP-Domäne
des FAS-Komplexes übertragen werden (vgl. Abb. 3).
Die mit YCp2MM transformierten SC1260 Zellen wurden in fünf getrennten Ansätzen in
jeweils 20 l Uracil-freiem Selektivmedium (SCD-Ura+FS) angezüchtet. Nach jeder Anzucht
wurden die abgeernteten Hefezellen auf ihren Phänotyp hin überprüft und dabei sichergestellt,
dass die Zellen während der Anzucht (a) nicht revertiert (kein Wachstum auf Fettsäure-freiem
YPD-Medium!) und (b) nicht ihr Plasmid verloren hatten (Wachstum auf Uracil-freiem
Selektiv-Medium!). Es zeigt sich, dass nach jeder der fünf Kultivationen die geernteten Zellen
in der Tat noch den zu erwartenden Phänotyp aufwiesen. Das Ergebnis einer dieser
Überprüfungen ist stellvertretend für alle anderen in Abb. 9 gezeigt.
ERGEBNISSE 18
SCD-Ura+FS
YPD
YPD+FS
Abb. 9: Überprüfung des Phänotyps von YCp2MM-transformierten SC1260 Zellen.
Ein Tropfen der zu untersuchenden Zellsuspension wurde mit steriler Pipette auf YPD Agar aufgesetzt. Nach
dem Eintrocknen der Flüssigkeit wurde sofort auf die beiden anderen angegebenen Medien überstempelt und alle
drei Platten fünf Tage bei 30°C inkubiert.
Sofort nach der Ernte wurden die abzentrifugierten Hefezellen durch Schütteln mit Glasperlen
aufgeschlossen und zwei aufeinander folgende (NH4)2SO4-Fraktionierungen (18,5 g
(NH4)2SO4 / 100 ml und 10,0 g (NH4)2SO4 / 100 ml) zur Anreicherung des FAS-Komplexes
durchgeführt (vgl. Material und Methoden). Das Sediment der zweiten Fraktionierung wurde
bei -20°C eingefroren. Die gesammelten, eingefrorenen Sedimente wurden zum Schluss
vereinigt, aufgetaut und mit ihnen die übliche FAS-Anreicherung wie in Material und
Methoden beschrieben durchgeführt. Die abschließende Rohrzucker-Gradienten
Zentrifugation der angereicherten FAS ergab das in Abb. 10 gezeigte Sedimentationsprofil.
Das aus den YCp2MM-Transformanten gereinigte Enzym war wie erwartet völlig inaktiv in
der FAS-Gesamtaktivität. Demgegenüber zeigte das Teilenzym β-Ketoacyl-Reduktase eine
spezifische Aktivität von 2901mU/mg, was 103% der entsprechenden Wildtyp-Aktivität
entsprach. Das so gewonnene hoch-reine und Phosphopantethein-freie FAS-Enzym (41,3 mg)
wurde in 30% (NH4)2SO4 ausgefällt und bei -20°C aufbewahrt.
ERGEBNISSE 19
Abb. 10: Abschließende Rohrzucker-Gradienten Zentrifugation der gereinigten YCp2MM-FAS.
Der Rohrzuckergradient wurde nach der Zentrifugation in 1,5ml Fraktionen ausgetropft. Die Fraktionen wurden
bei 280 nm auf ihren Proteingehalt untersucht. Die gelb unterlegten Fraktionen enthielten das FAS-Protein und
wurden gesammelt.
In einem weiteren Versuch wurden 54,3 mg Phosphopantethein-haltige Wildtyp-FAS aus
600 g Reinzuchthefe (Firma Kitzmann) gereinigt. Diese FAS besaß eine spezifische
Gesamtaktivität von 1982 mU/mg. Das Teilenzym β-Ketoacyl-Reduktase besaß hier eine
spezifische Aktivität von 2803 mU/mg (Tab. 1).
Tab. 1: Reinigung von Pantethein-haltiger und Pantethein-freier FAS aus Wildtyp bzw. SC1260 /
YCp2MM-Transformierten Zellen.
spezifische Aktivitäten
FAS KR
Herkunft
Ausgangsmenge
Hefezellen
[g]
Ausbeute
reines Enzym
[mg] [mU/mg]
Wildtyp
600 g
54,3 mg
1982 mU/mg
2803 mU/mg
SC1250 /
Ycp2MM
490 g
41,3 mg
0 mU/mg
2901 mU/mg
ERGEBNISSE 20
2.1.3 Vorversuche zur Spaltung und anschließenden Reassoziation des hexameren
FAS-Komplexes
Frühere Versuche von Knut Werkmeister [WER1] und Maria Mittag [MIT] an diesem Institut
hatten gezeigt, dass Hefe-FAS durch kontrollierte Acylierung mit Dimethylmaleinsäure-
Anhydrid (DMMA) reversibel in ihre Untereinheiten dissoziiert und aus diesen anschließend
wieder eine intakte und voll aktive FAS reassoziiert werden kann. Das Anhydrid acyliert
unter Ringöffnung mit einer seiner beiden Carboxylgruppen bestimmte freie Amino-,
Hydroxyl- bzw. Thiolgruppen des FAS-Komplexes. Die dabei freigesetzte zweite
Carboxylgruppe des geöffneten Anhydrids sorgt durch ihre negative Ladung für eine interne
Abstoßung der acylierten Protein-Untereinheiten, wodurch sich die Quarternärstruktur ebenso
wie Teilbereiche der Tertiärstruktur des FAS-Komplexes auflösen (vgl. Abb. 11).
OO O
CH3CH3
+ + H+
Enzym NH
O CH3
CH3
O
O-
NH2Enzym
Abb. 11: Protein-Acylierung mit DMMA.
Das Anhydrid acyliert bestimmte freie Amino-, Hydroxyl- und/oder Thiol-Gruppen des FAS-Komplexes. Die
bei der Ringöffnung gebildete freie Carboxylgruppe sorgt, aufgrund ihrer pH-bedingt negativen Ladung (gelb
hinterlegt), durch intra- und intermolekulare Abstoßungskräfte für eine Auflösung von Tertiär und Quarternär-
Struktur des Proteins.
Nach Literaturangaben kann DMMA-behandelte FAS durch Absenkung des pH-Wertes auf
pH 5,9, bei gleichzeitiger Stabilisierung durch Serumalbumin- und Ammoniumsulfat-Zusatz,
wieder deacyliert und renaturiert werden [WER2, MIT]. Die Nacharbeitung dieser Vorschrift
stieß im vorliegenden Fall zunächst auf unvorhergesehene Schwierigkeiten. Es wurden daher
alle Parameter des Reassoziierungsversuchs systematisch überprüft und gegebenenfalls
variiert und dabei nochmals optimiert. Folgende Überlegungen lagen diesen Optimierungs-
Experimenten zugrunde:
1. Ein Überschuss (NH4)2SO4 könnte zur Folge haben, dass bei der Ausfällung von FAS
auch noch das im Ansatz enthaltene BSA mit ausfällt. Dies würde dazu führen, dass
ERGEBNISSE 21
die Bestimmung der FAS-Konzentration und folglich auch die Ermittlung der
spezifischen FAS-Aktivität nicht mehr genau möglich ist.
2. Eine Überdosierung von DMMA könnte zu einer übermäßigen Acylierung und damit
irreversiblen Deaktivierung des Enzyms führen. Als Folge davon würde sich die
Aktivität des FAS-Komplexes nicht oder nicht mehr vollständig regenerieren können.
3. Eine zu geringe Enzymkonzentration könnte zur Folge haben, dass die Reassoziations-
Dauer im Vergleich zur gleichzeitig ablaufenden spontanen Enzym-Inaktivierung zu
lang wird und damit die Aktivität des Komplexes nur teilweise wiederhergestellt
werden kann.
4. Eine zu kurze Reaktivierungsdauer führt umgekehrt ebenfalls zu einer nur
unvollständigen Reaktivierung des FAS-Komplexes. Daher musste auch die
Zeitspanne, welche zur maximalen Reaktivierung des FAS-Komplexes führt, ermittelt
werden.
Im folgenden Abschnitt wurde versucht, für alle genannten Parameter die optimalen
Bedingungen zu ermitteln.
2.1.3.1 Ermittlung der maximal möglichen Menge (NH4)2SO4 bei der Ausfällung
von DMMA-dissoziierter FAS
Um sicherzustellen, dass bei der (NH4)2SO4-Fällung von reassoziierter FAS kein BSA mit
ausgefällt wird, wurde, unter sonst gleichen Versuchsbedingungen, eine Fällungsreihe mit
BSA in Abwesenheit von FAS durchgeführt. Dabei wurden der BSA-Lösung steigende
Mengen (NH4)2SO4 zugesetzt und jedes Mal die im Fällungsüberstand noch vorhandene
Menge BSA ermittelt. Alle Versuchansätze enthielten, abgesehen von FAS, die üblichen im
Reassoziationsexperiment enthaltenden Zusätze: 500 µl Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 (300
mM), 300 µl BSA (10 mg/ml), 6 µl DMMA (100 mg/ml THF) und (NH4)2SO4-gesättigte
1 M Essigsäure (zugesetzt bis zum Erreichen von pH 5,9). Verschiedenen derartigen Ansätzen
wurden steigende Mengen von (NH4)2SO4-gesättigtem Kaliumphosphatpuffer pH 5,9 (300
mM) zugesetzt. Nach 5 min Stehen bei 4°C wurden die Proben zentrifugiert und die
Proteinkonzentrationen im Überstand ermittelt. Es zeigt sich, dass BSA unter diesen
Bedingungen erst ab einer (NH4)2SO4-Konzentration von 0,74 g/ml anfing auszufallen (vgl.
Tab. 2). Dies war erst bei Zusatz von >600 µl gesättigter (NH4)2SO4-Lösung zu der BSA-
ERGEBNISSE 22
haltigen Probe der Fall, also bei wesentlich höheren als den im Reassoziations-Experiment
eingesetzten Konzentrationen.
Unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen der in vitro Reassoziation von DMMA-
behandelter Fettsäuresynthase (Tab. 2, Experiment 3) wurden somit die für eine BSA-
Ausfällung nötigen (NH4)2SO4-Konzentrationen nicht erreicht. Man kann daher sehr wohl
davon ausgehen, dass alles beim Reaktivierungsschritt ausgefällte Protein ausschließlich aus
FAS-Protein besteht. Die damit berechneten spezifischen Aktivitätswerte dürften somit
korrekt sein.
Tab. 2: Ausfällung von BSA durch steigende (NH4)2SO4-Konzentrationen.
In einer Lösung von 500 µl Kaliumphosphatpuffer (300 mM, pH 7,5) waren 3 mg BSA und 6 µl DMMA (100
mg/ml THF) enthalten. Die Probe wurde anschließend mit 1 M (NH4)2SO4-gesättigter Essigsäure auf pH 5,9
titriert. Anschließend wurden die angegebenen Mengen Kaliumphosphatpuffer (300 mM pH 5,9, gesättigt mit
(NH4)2SO4) dazugegeben. Nach Stehen für 5 min wurden die Proben abzentrifugiert (30 min, 4°C, 14000 Upm)
und der Proteingehalt des Überstandes durch den Bradford-Test bestimmt (vgl. Material und Methoden).
Experiment Nr.
1
2
3
4
5
6
Zusatz gesätt. (NH4)2SO4-Lösung
[µl]
0 200 400 600 800 1000
Gesamtvolumen [µl] 1356 1556 1756 1956 2156 2356
Proteinmenge im Überstand nach Zentrifugation
[µg]
2983 3092 3031 2990 2555 1951
2.1.3.2 Ermittlung der Mindestmenge DMMA, welche für die Dissoziation des
FAS-Komplexes benötigt wird
Um die für die FAS-Dissoziation optimale Menge DMMA (möglichst vollständige
Dissoziation, möglichst keine irreversible Denaturierung) zu ermitteln, wurden in zwei
getrennten Ansätzen einmal 5,0 mg FAS-Enzym mit 3 µl DMMA-Lösung (100 mg/ml) und
einmal 4,0 mg FAS-Enzym mit 6 µl DMMA-Lösung (100 mg/ml) behandelt. Die Abnahme
der FAS-Gesamtaktivität in beiden Reaktionsansätzen wurde durch Enzymtests nach
unterschiedlichen Inkubationszeiten zeitlich verfolgt.
ERGEBNISSE 23
Aus Abb. 12 ist ersichtlich, dass unter den hier gewählten Bedingungen 3 µl DMMA-Lösung
(100 mg/ml THF) nicht ausreichten, um 5,0 mg FAS-Protein (gelöst in 0,5 ml
Kaliumphosphatpuffer) vollständig zu inaktivieren. Nach anfänglich raschem Absinken der
Aktivität verblieb nach ca. 10 min Inkubation eine Restaktivität von ca. 56 Prozent des
Ausgangswertes, die ab diesem Zeitpunkt nicht weiter abnahm. Da die Reaktion in wässrigem
Medium stattfand, kann davon ausgegangen werden, dass der Großteil des zugesetzten
Anhydrids so rasch hydrolysiert wurde, dass er für die Acylierung des Proteins nicht mehr zur
Verfügung stand. Demgegenüber war mit 6 µl zugesetztem DMMA eine vollständige
Inaktivierung des FAS-Enzyms möglich. Hier reichte die DMMA-Konzentration offenbar
aus, um trotz konkurrierender Hydrolyse das FAS-Protein letztlich vollständig zu
inaktivieren. Es wurden daher in allen weiteren Dissoziations-Versuchen jeweils 4,0 mg FAS-
Protein für 8 min mit 6 µl frisch angesetzter DMMA-Lösung inkubiert.
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20
Inkubationszeit mit DMMA [min]
FAS-
Ges
amta
ktiv
ität [
%] X
Abb. 12: FAS Inaktivierungskinetik mit unterschiedlichen Mengen DMMA.
In einem Volumen von jeweils 500 µl Kaliumphosphatpuffer (300 mM, pH 7,5) wurden zu 5,0 mg Wildtyp-
FAS 3 µl ( ) und zu 4,0 mg Wildtyp-FAS 6 µl ( ) DMMA-Lösung (100 mg/ml THF) zugegeben und nach
gründlicher Durchmischung auf Eis inkubiert. Zu den angegebenen Inkubationszeiten wurde mit 10 µl Proben
der beiden Ansätze die FAS-Gesamtaktivität im Standard Testansatz (vgl. Material und Methoden) gemessen.
ERGEBNISSE 24
2.1.3.3 Ermittlung der geringsten für eine vollständige Reaktivierung notwendigen
Enzymmenge
Als nächstes wurde die für eine vollständige Reassoziation notwendige Mindestmenge an
FAS-Protein ermittelt. Ziel dieser Versuchsreihe war es zu erreichen, dass die Aktivität des
eingesetzten FAS-Enzyms nach Dissoziation und anschließender Reassoziation vollkommen
wiederhergestellt wird. Hierzu wurden vier Proben mit unterschiedlichen Mengen an
Wildtyp-FAS (1,4 – 5,0 mg / 0,5 ml Kaliumphosphatpuffer) jeweils für 8 min mit 6 µl
DMMA-Lösung denaturiert. Anschließend wurde das dissoziierte FAS-Protein entsprechend
der Standard-Versuchsvorschrift wieder reassoziiert. Die Gesamtaktivität der renaturierten
FAS und die Aktivität des Teilenzyms β-Ketoreduktase wurden bei allen Proben zunächst vor
der Dissoziation, dann unmittelbar nach der Dissoziation und schließlich 60 min bzw. 120
min nach Reaktivierungsbeginn vermessen. Die Ergebnisse dieser Messreihen sind in Abb. 13
dargestellt.
Man sieht, dass zur Rückgewinnung der ursprünglich eingesetzten Enzymaktivität eine
Proteinkonzentration von mindestens 4,0 mg pro 0,5 ml Ansatzvolumen nötig war. Niedrigere
Konzentrationen wie 1,4 oder 3,0 mg FAS führten selbst nach 120 min Reaktivierungsdauer
zu keiner vollständigen Wiederherstellung weder der Gesamtaktivität noch der β-
Ketoreduktase Aktivität. Je niedriger die Proteinkonzentration war, desto früher kam offenbar
auch der Reaktivierungsprozess zum Stillstand. Denkbar war auch, dass bei niedrigeren
Proteinkonzentrationen das ungünstigere Enzym/DMMA-Verhältnis einen höheren Anteil
irreversibel denaturiertem Protein erzeugte. Während der Reaktivierungsprozess mit 1,4 mg
FAS pro 0,5 ml Ansatzvolumen bereits nach 60 min beendet war, bedurfte es in den anderen
Fällen dafür mehr als 60 min.
ERGEBNISSE 25
0
20
40
60
80
100
120
140
0 60 120
Reaktivierungszeit [min]
rest
ituie
rte
FAS-
Ges
amta
ktiv
ität
[% A
usga
ngsa
ktiv
ität]
Ausgangsaktivität
A
0
20
40
60
80
100
120
140
0 60 120
Reaktivierungszeit [min]
rest
ituie
rte
β-K
etor
eduk
tase
-Akt
ivitä
t [%
Aus
gang
sakt
ivitä
t]
Ausgangsaktivität
B
Abb. 13: Reaktivierung der FAS-Gesamtaktivität (A) und der β-KetoreduktaseTeilaktivität (B) nach
DMMA-Behandlung.
Für diesen Versuch wurden 1,4 mg ( ), 3,0 mg ( ), 4,0 mg ( ) und 5,0 mg ( ) Wildtyp-FAS, jeweils gelöst
in 0,5ml Kaliumphosphatpuffer (300mM, pH 5,9) eingesetzt. Alle Proben wurden für 8 min mit 6 µl DMMA
(100 mg/ml THF) inkubiert. Die restituierte FAS-Aktivität (A) und die restituierte Aktivität der β-Ketoreduktase
(B) wurden einmal vor DMMA-Zugabe (100%), unmittelbar nach der Dissoziation (0 min) sowie 60 min und
120 min danach vermessen. Die Aktivitäten wurden auf die Ausgangsaktivität vor DMMA-Zugabe bezogen.
ERGEBNISSE 26
Interessanterweise führte der Versuchsansatz mit 5,0 mg FAS pro 0,5ml Ansatzvolumen zu
einer Rückgewinnung von mehr als der ursprünglich eingesetzten Enzymaktivität. Nach 120
min Reaktivierungsdauer wurden ca. 130% Prozent sowohl der ursprünglichen FAS- als auch
der ursprünglichen β-Ketoreduktase Aktivität gemessen. Die Reaktivierungskinetik deutet
darauf hin, dass evtl. sogar noch höhere Werte erreichbar gewesen wären. Eine grundsätzlich
ähnliche, wenn auch nicht ganz so ausgeprägte Tendenz zu höheren Reaktivierungswerten
zeigt das Experiment mit 4,0 mg FAS. Entsprechende Beobachtungen waren in früheren
Experimenten gelegentlich auch schon von anderen Mitarbeitern des Instituts gemacht
worden. Eine befriedigende Erklärung dieses Phänomens steht zurzeit noch aus.
Aufgrund der in Abb. 13 gezeigten Ergebnisse einerseits und im Interesse eines möglichst
sparsamen Umgangs mit dem verfügbaren Probenmaterial anderseits wurden in allen
künftigen Dissoziations-Versuchen jeweils 4,0 mg FAS-Protein pro Ansatz eingesetzt.
2.1.3.4 Ermittlung der zur maximalen Reaktivierung von DMMA-behandelter
FAS notwendigen Zeit
Als letztes wurde nach den vorausgegangenen Experimenten untersucht, welche
Reaktivierungszeit notwendig ist, um eine maximale Reaktivierung von 4,0 mg DMMA-
behandeltem FAS-Protein zu erhalten. Dazu wurden zunächst 4,0 mg FAS für 8 min mit 6 µl
DMMA-Lösung (100 mg/ml THF) dissoziiert und das Protein anschließend dem
standardisierten Reaktivierungsverfahren unterworfen. Dabei wurde die FAS-Gesamtaktivität
im Reaktionsansatz nach unterschiedlichen Reaktivierungszeiten vermessen.
Aus Abb. 14 wird deutlich, dass der Reaktivierungsprozess nach 240 min abgeschlossen war
und dabei ca. 120% der ursprünglich vorhandenen Enzymaktivität zurück gewonnen wurden.
Für den Hauptversuch wurde somit eine Reaktivierungszeit von 240 min festgelegt. Als
Ergebnis der geschilderten Versuche wurden somit die in Tab. 3 zusammengefassten
Bedingungen als optimal ermittelt.
ERGEBNISSE 27
0
25
50
75
100
125
0 100 200 300 400 500
Reaktivierungszeit [min]
rest
ituie
rte
FAS-
Akt
ivitä
t [%
]
Abb. 14: FAS Reaktivierungskinetik nach DMMA-Behandlung.
4,0 mg FAS gelöst in 0,5ml Kaliumphosphatpuffer (300 mM, pH 7,5) wurden für 8 min mit 6 µl DMMA (100
mg/ml THF) dissoziiert. Anschließend wurden 8 µl Mercaptoethanol und 300 µl BSA (10 mg/ml)
dazugegeben. Die Lösung wurde langsam mit ca. 550 µl Essigsäure (1 M, ges. mit (NH4)2SO4) auf pH 5,9 titriert
und mit 500 µl Kaliumphosphatpuffer (pH 5,9, gesättigt mit (NH4)2SO4) versetzt. Der Niederschlag wurde für 30
min bei 4°C abzentrifugiert (14000Upm) und in 480 µl Reaktivierungspuffer (100 mM Kaliumphosphatpuffer
pH 7,5, 10 mM DTT, 20 µM FMN, 0,5mM EDTA) resuspendiert. Aus dieser Lösung wurde zu den
angegebenen Zeiten jeweils 10 µl entnommen und damit die FAS-Gesamtaktivität bestimmt. Die gemessenen
Werte wurden auf die Ausgangsaktivität bezogen.
Tab. 3: Optimierte Versuchsparameter für die Herstellung hybrider FAS-Mischkomplexe.
Parameter
optimaler Wert*
Menge DMMA 6 µl (100 mg/ml THF)
Inkubationszeit 8 min
(NH4)2SO4-Puffer 500 µl (gesättigt)
Reaktivierungsdauer 240 min
* Die Angaben gelten für 4,0 mg Hefe-FAS, gelöst in 500 µl 300 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5.
ERGEBNISSE 28
2.1.4 Herstellung von hybriden Mischkomplexen aus Phosphopantethein-freien und
Phosphopantethein-haltigen FAS-Komplexen und Vermessung der Aktivitäten
dieser Mischkomplexe
Unter Verwendung der in Tab. 3 zusammengefassten, optimierten Versuchsparameter wurden
in der nächsten Versuchsreihe zwei unterschiedliche FAS-Proteine in verschiedenen
Mischungsverhältnissen im „Eintopfverfahren“ gemeinsam dissoziiert und anschließend zu
hybriden Mischkomplexen reassoziiert. Durch dieses Experiment sollten mögliche
Wechselwirkungen zwischen den sechs identischen Untereinheiten innerhalb eines FAS-
Komplexes ermittelt werden. Die erwähnten hybriden Mischkomplexe wurden aus
Phosphopantethein-haltiger Wildtyp-FAS und einer Phosphopantethein-freien Mutanten-FAS
(s.o.) hergestellt. Um in den reassoziierten Mischkomplexen unterschiedliche relative Anteile
von phosphopantetheinylierten und nicht-phosphopantetheinylierten Untereinheiten zu
erhalten, wurden die beiden FAS-Arten vor ihrer Dissoziation in unterschiedlichen
stöchiometrischen Mengen miteinander gemischt. Mit diesen Gemischen wurde dann der
Dissoziations- / Reassoziations-Prozess im „Eintopfverfahren“ durchgeführt.
Tab. 4: Zur Dissoziation / Reassoziation eingesetzte Mischungen aus Phosphopantethein (PA)-haltiger
Wildtyp-FAS und Phosphopantethein-freier Mutanten-FAS.
Jeder Veruchsansatz enthält 4,0 mg Gesamtprotein und wurde gemäß den in Tab.3 aufgeführten Bedingungen
behandelt.
Anteil im Gemisch
Experiment
Wildtyp-FAS Pantethein-
freie FAS
PA-Gehalt der
reassoziierten
FAS
[mg] [mg] [%]
1 4,0 0,0 100
2 3,3 0,7 83
3 2,7 1,3 67
4 2,0 2,0 50
5 1,3 2,7 33
6 0,7 3,3 17
7 0,0 4,0 0
ERGEBNISSE 29
Die sieben in Tab. 4 aufgeführten FAS-Gemische wurden nach den in Tab. 3 angegebenen
Bedingungen dissoziiert und zu Mischkomplexen reassoziiert. Nach 240 min Renaturierung
wurden die restituierten Aktivitäten der FAS-Gesamtreaktion und der β-Ketoreduktase
Teilreaktion bestimmt. Die dabei ermittelten Werte sind in Tab. 5 und 6 sowie in Abb. 15 und
16 dargestellt.
ERGEBNISSE 30
Tab. 5: Abhängigkeit der FAS-Gesamtaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.
Zur Durchführung der Versuche vgl. Tab. 3 und 4.
spezifische FAS Gesamtaktivität
Anteil Pantetheinhaltiger
α-Untereinheiten im FAS-
Komplex [%]
Vor
Dissoziation
Nach
Dissoziation
nach 240 min
Reassoziation
[%] [mU/mg] [mU/mg] [mU/mg]
0 0 0 0
17 396 0 496
33 690 0 659
50 1101 0 1071
67 1453 22 1686
83 1705 36 2075
100 1982 36 2371
0
20
40
60
80
100
120
100 83 67 50 33 17 0
Anteil Phosphopantethein-haltiger α-Untereinheiten [%]
rela
tive
spez
ifisc
he
FAS-
Ges
amta
ktiv
ität [
%]
Abb. 15: Relative spezifische FAS-Gesamtaktivitäten von FAS-Komplexen unterschiedlichen
Phosphopantethein-Gehaltes.
Die gemessenen FAS Gesamtaktivitäten aus Tab. 5 wurden auf die Aktivität der gereinigten Wildtyp-FAS
(Phosphopantetheinylierungsgrad 100%) vor deren Dissoziation bezogen.
( ) vor der Zugabe von DMMA ( ) nach 8 min Dissoziation ( ) nach 240 min Reassoziation
ERGEBNISSE 31
Tab. 6: Abhängigkeit der FAS β-Ketoreduktase Teilaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des
Enzymkomplexes.
Zur Durchführung der Versuche vgl. Tab.3 und 4.
spezifische β-Ketoreduktase-Aktivität
Anteil Pantethein-haltiger
α-Untereinheiten im FAS-
Komplex
Vor
Dissoziation
Nach
Dissoziation
nach 240 min
Reassoziation
[%] [mU/mg] [mU/mg] [mU/mg]
0 2901 828 3029
17 2847 747 3225
33 2992 624 3046
50 2775 636 3105
67 2735 447 3106
83 2724 425 3132
100 2803 334 2933
0
20
40
60
80
100
120
100 83 67 50 33 17 0
Anteil Phosphopantethein-haltiger α−Untereinheiten [%]
rela
tive
spez
ifisc
he
β-K
etor
eduk
tase
-Akt
ivitä
t [%
]
Abb. 16: Relative spezifische β-Ketoreduktase-Aktivitäten von FAS-Komplexen unterschiedlichen
Phosphopantethein-Gehaltes.
Die gemessenen β-Ketoreduktase-Aktivitäten aus Tab. 6 wurden auf die Aktivität der gereinigten Wildtyp-FAS
(Phosphopantetheinylierungsgrad 100%) vor deren Dissoziation bezogen.
( ) vor der Zugabe von DMMA ( ) nach 8 min Dissoziation ( ) nach 240 min Reassoziation
ERGEBNISSE 32
Aus Abb. 16 wird deutlich, dass die spezifische β-Ketoreduktase-Aktivität des FAS-Enzyms
offensichtlich vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzyms unabhängig ist. Dies war bereits
aus der nahezu identischen Aktivität der beiden reinen Ausgangsenzyme, d.h. der
Phosphopantethein-freien und der vollständig phosphopantetheinylierten FAS ersichtlich (vgl.
Tab. 1). Insofern ist es auch nicht erstaunlich, dass sämtliche Mischkomplexe mit ihren
unterschiedlichen Anteilen Phosphopantethein-haltiger Untereinheiten ebenfalls praktisch
dieselbe, Wildtyp-artige β-Ketoreduktase-Aktivität aufweisen. Die prosthetische Gruppe wird
unter den hier gewählten Testbedingungen für die Reaktion offenbar nicht genutzt. Das
verwendete Modellsubstrat Acetessigsäureethylester wird wohl, ebenso wie dies bereits früher
schon für den Coenzym A Thioester der Acetessigsäure gezeigt worden war, im katalytischen
Zentrum der Reduktase als solcher eingelagert und dann direkt reduziert. Durch Zugabe von
DMMA und die dadurch bewirkte Dissoziation des Komplexes in unabhängige
Untereinheiten wurde die β-Ketoreduktase-Aktivität zwar drastisch auf 12 bis 30% ihrer
Ausgangsaktivität abgesenkt, aber bemerkenswerterweise geht diese FAS-Teilaktivität bei der
DMMA-Behandlung nicht vollständig verloren. Die begrenzte Aktivitätsabnahme spricht
dafür, dass entweder das aktive Zentrum der β-Ketoreduktase durch die Quarternärstruktur
des Komplexes stabilisiert wird, oder dass umgekehrt bei der DMMA-Behandlung neben der
Quarternärstruktur auch Teile der Tertiärstruktur aufgelöst werden. In Anbetracht der
nennenswerten dabei verbleibenden Restaktivität dürfte im letzteren Fall das β-
Ketoreduktase-Zentrum durch die DMMA-Behandlung zwar deformiert, aber nicht
vollständig zerstört worden sein. Die an die Dissoziation anschließende Wiederherstellung der
Komplexstruktur führte auch bei dem Teilenzym β-Ketoreduktase, ebenso wie dies bereits bei
der Gesamt-FAS Aktivität beobachtet worden war, zu einer über den Ausgangswert
hinausgehenden (ca. 110%) Rückgewinnung der ursprünglichen Enzymaktivität.
Aus Abb. 15 wird deutlich, dass die FAS-Gesamtaktivität der verschiedenen
Reaktionsansätze, d.h. der Gemische aus voll aktiver und zu 100% phosphopantetheinylierter
FAS mit einer völlig inaktiven, Phosphopantethein-freien Präparation, vor der DMMA-
Behandlung direkt proportional zum Anteil Phosphopantethein-haltiger Synthase im Gemisch
ist. Dieser Befund ist trivial und entspricht der Erwartung. Andererseits ist die Bewertung der
mit den restituierten Enzymen erhaltenen Ergebnisse etwas komplexer. Auf den ersten Blick
sieht es auch hier danach aus, als ob die Gesamtaktivitäten der restituierten Ansätze direkt
proportional zu ihrem relativen Gehalt an Phosphopantethein-haltiger FAS wären (vgl. Abb.
15 und 17).
ERGEBNISSE 33
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Anteil Phosphopantethein-haltiger α -Untereinheiten [%]
rela
tive
spez
ifisc
he
FAS-
Ges
amta
ktiv
ität [
%]
Abb. 17: Abhängigkeit der restituierten FAS-Aktivität vom Anteil pantetheinylierter FAS-Untereinheiten
im Gemisch.
Die FAS-Aktivitäten aus Tab. 5 wurden auf die Aktivität der reassoziierten Wildtyp-FAS
(Phosphopantetheinylierungsgrad 100%) bezogen. Als Vergleich zu der experimentell ermittelten
Ausgleichsgeraden ( ) aus den Werten ( ) in Abb. 15 ist auch der theoretische Aktivitätsverlauf aufgetragen
( ), der bei einer unabhängigen Funktionsweise der phosphopantetheinylierten FAS-Untereinheiten im
Gemisch zu erwarten wäre (Vollseiten-Aktivität).
Die in Abb. 17 experimentell ermittelte Abhängigkeit der FAS-Aktivität vom
Phosphopantetheingehalt des FAS-Gemisches erwies sich als praktisch deckungsgleich mit
der für eine Vollseiten-Aktivität zu erwartende Abhängigkeit. Demnach scheint es für die
Aktivität einer einzelnen pantetheinylierten Untereinheit des hexameren Komplexes irrelevant
zu sein, ob und wie viele der restlichen Untereinheiten ebenfalls pantetheinyliert sind.
Demzufolge würde jede phosphopantetheinylierte (αβ)-Einheit im hexameren (αβ)6-Komplex
denselben Beitrag zur FAS-Gesamtaktivität leisten, gleichgültig in welchem Umfeld von
pantetheinylierten oder nicht pantetheinylierten anderen Untereinheiten sie sich befindet.
Dieses Ergebnis widerspräche der Annahme einer Halbseiten-Aktivität, bei der nur doppelt
phosphopantetheinylierte, nicht jedoch einfach phosphopantetheinylierte (αβ)2-Dimere aktiv
wären. Um diese Interpretation der Ergebnisse aus Abb. 15 und 17 weiter abzusichern, wurde
alternativ zu den experimentellen Daten auch noch theoretisch berechnet, wie der
Kurvenverlauf in Abb. 17 aussehen müsste, falls tatsächlich eine Halbseiten-Aktivität
ERGEBNISSE 34
vorläge. Bei einer derartigen Enzymcharakteristik wären nicht nur die Phosphopantethein-
freien, sondern auch alle nur einfach phosphopantetheinylierten (αβ)2-Paare inaktiv. Die
Berechnungen zu den Folgen einer derartigen Situation sind im nächsten Abschnitt
beschrieben.
Bei der Bewertung der in Tab. 5 und Abb. 15 gezeigten Ergebnissen soll auch noch darauf
hingewiesen werden, dass bei der Dissoziation des FAS-Komplexes mit DMMA die
Gesamtaktivität, anders als die des Teilenzyms β-Keto-Reduktase, praktisch vollständig
verschwindet. Dieses kann zum einen ausschließlich mit der Dissoziation der Untereinheiten
α und β, zum anderen aber auch mit zusätzlichen, weitergehenden Strukturänderungen des
FAS-Proteins, gegenüber denen bestimmte Teilenzyme unter Umständen besonders
empfindlich sind, zusammenhängen.
2.1.5 Modellrechnung zur Aktivität von partiell phosphopantetheinylierten FAS-
Mischkomplexen bei Vorliegen einer Halbseiten-Aktivität
Wildtyp-FAS ist ein Hexameres aus sechs jeweils einfach phosphopantetheinylierten (αβ)-
Protomeren. Umgekehrt ist die in dem Dissoziations-/Reassoziations-Experiment verwendete
Mutanten-FAS aus sechs nicht-phosphopantetheinylierten (αβ)-Protomeren aufgebaut.
Werden Phosphopantethein-haltige und Phosphopantethein-freie Monomere aus dem
Dissoziationsgemisch beider FAS-Komplexe nach den Gesetzen der Stochastik und ohne
spezielle Präferenzen wieder zu Hexameren zusammengefügt, so bilden sich in jedem Fall,
unabhängig vom relativen Anteil beider Monomer-Typen im Gemisch, alle sieben in Tab. 7
gezeigten Monomeren-Kombinationen (A-G). Lediglich der relative Anteil jeder einzelnen
der sieben Monomeren Kombinationen sollte in Abhängigkeit vom zahlenmäßigen Verhältnis
von pantetheinylierten und nicht-pantetheinylierten Untereinheiten im Gemisch variieren. Für
jeden der in dieser Arbeit hergestellten Mischkomplexe lässt sich der Anteil jeder einzelnen
der sieben in Tab. 7 gezeigten Kombinationen nach der Formel
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅
⋅⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
+⋅⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛
+=− !!
!611
1WSk
kk
ZWS
GA
berechnen, wobei k das Verhältnis zwischen eingesetzten Phosphopantethein-haltigen zu
Phosphopantethein-freien FAS-Komplexen ist und S bzw. W die Anzahl der
ERGEBNISSE 35
Phosphopantethein-haltigen bzw. Phosphopantethein-freien Untereinheiten im Mischkomplex
darstellen. Führt man diese Berechnung für alle fünf in dieser Arbeit untersuchten Gemische
aus phosphopantetheinylierter und nicht-phosphopantetheinylierter FAS durch, so erhält man
die in Tab. 7 dargestellten Werte.
Tab. 7: Relativer Anteil bestimmter Mischkomplex-Typen im Reassoziations-Gemisch aus
phosphopantetheinylierter ( ) und nicht- phosphopantetheinylierter ( ) FAS.
Relativer Anteil bestimmter Mischkomplex-Typen
im Reassoziations-Gemisch [%]
A
B
C
D
E
F
G
:
Misch-
verhältnis
(1 + 5) 0,002 0,06 0,80 5,4 20,1 40,2 33,5
(2 + 4) 0,14 1,64 8,2 21,9 32,9 26,3 8,8
(3 + 3) 1,6 9,4 23,4 31,3 23,4 9,4 1,6
(4 + 2) 8,8 26,3 32,9 21,9 8,2 1,64 0,14
(5 + 1) 33,5 40,2 20,1 5,4 0,80 0,06 0,002
Die Verteilung der phosphopantetheinylierten und damit potentiell enzymatisch aktiven (αβ)-
Monomeren auf die sieben verschiedenen in Tab. 7 aufgeführten Mischkomplexe A-G ist für
die Berechnung der FAS-Gesamtaktivität der Gemische so lange nicht relevant, als die
Monomeren Vollseiten-Aktivität aufweisen und zur Funktion keinen zweiten, ebenfalls
phosphopantetheinylierten Partner brauchen. Für diesen einfachsten Fall gilt die in Abb. 17
und 18 (blaue Kurve) gezeigte Beziehung unabhängig von der Aufteilung der Monomeren auf
die sieben unterschiedlichen Mischkomplex-Typen. Gilt jedoch das Gesetz der Halbseiten-
Aktivität, dann wären die Komplexe F und G in Tab. 7 völlig inaktiv und die Komplexe D
und E besäßen beide 1/3 und die Komplex B und C beide 2/3 der vollen Wildtyp-Aktivität.
Berücksichtigt man diese Überlegung bei der Berechnung der zu erwartenden FAS-Aktivität
für die fünf verschiedenen Reassoziations-Mischungen gemäß Tab. 7, so ergibt sich die durch
die rote Kurve in Abb. 18 gezeigte Abhängigkeit.
ERGEBNISSE 36
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Anteil Phosphopantethein-haltiger α -Untereinheiten im FAS-Mischkomplex
bere
chne
te F
AS-
Ges
amta
ktiv
ität [
%]
Abb. 18: Theoretische Gesamtaktivität von FAS-Mischkomplexen bei Annahme von Vollseiten-Aktivität
(●), genereller Halbseiten-Aktivität ohne Nachbarschafts-Effekte (●) und spezieller Halbseiten-Aktivität
mit obligatorischer Nachbarschaftsbeziehung (●).
Das erwähnte Halbseiten-Aktivitätsmodell kann noch weiter verfeinert werden, indem man
postuliert, dass nur unmittelbar benachbarte Phosphopantethein-haltige Monomere, aber keine
nicht-benachbarten Monomere im Hexameren miteinander wechselwirken können und dabei
Aktivität erzeugen. Wenn man der Einfachheit halber beim - sicher nicht realistischen –
zweidimensionalen Modell der Abb. 19 bleibt, so ergeben sich bereits hier eine Vielzahl
unterschiedlicher relativer Anordnungen der phosphopantetheinylierten Monomeren
zueinander im hexameren Komplex.
ERGEBNISSE 37
Abb. 19: Verschiedene Möglichkeiten der relativen Anordnungen einer unterschiedlichen Zahl
phosphopantetheinylierter ( ) und nicht-phosphopantetheinylierter ( ) α-Untereinheiten zueinander im
Hexamer in einem einfachen zweidimensionalen Modell.
ERGEBNISSE 38
Tab. 8: Berechnung der Nachbarschafts-unabhängigen (A) und Nachbarschafts-abhängigen (B)
Halbseitenaktivität für die verschiedenen Anordnungsmöglichkeiten pantetheinylierter (●) und nicht-
pantetheinylierter (○) α-Untereinheiten im hexameren FAS-Komplex.
In B werden die Positionen der Untereinheiten im Hexameren als festgelegt, in A als nicht festgelegt angesehen.
In A und B wurden jeweils nur gepaarte Pantethein-haltige Untereinheiten zur Aktivitätsberechnung
herangezogen.
A
B
Anteil
pantetheinylierter
α-Untereinheiten
im Hexameren
Undifferenzierte
Anordnungs
HS-
Aktivität
Differenzierte
Anordnungs-
Möglichkeiten
Anteil
vHS-
Aktivität
6/6
100%
100%
100%
5/6
66,7%
100%
66,7%
40%
66,7%
40%
33,3%
4/6
66,7%
20%
66,7%
30%
33,3%
60%
33,3%
3/6
33,3%
10%
0%
40%
33,3%
40%
0%
2/6
33,3%
20%
0%
1/6
0%
100%
0%
0/6
0%
100%
0%
ERGEBNISSE 39
Tab. 9: Berechnung der Aktivität von partiell pantetheinylierten Mischkomplexen unter der Annahme,
dass eine Vollseiten-Aktivität (VS), eine gemäß Tab. 8 undifferenzierte, d.h. Nachbarschafts-unabhängige
Halbseiten-Aktivität (HS) oder eine gemäß Tab. 8 differenzierte Halbseiten-Aktivität (vHS) besteht.
Werte berechnet aus Tab. 7, 8 und Abb. 19.
Mögliche partiell pantetheinylierte FAS-Varianten
rel.
Gesamt-Aktivität
5 + 1
[%]
[%]
Anteil im Gemisch 33,5 40,2 20,1 5,4 0,8 0,06 0,002
VS-Aktivität 33,5 33,5 13,4 2,7 0,27 0,01 - 83,3
HS-Aktivität 33,5 26,8 13,4 1,8 0,27 - - 75,7
vHS-Aktivität 33,5 26,8 10,7 1,6 0,11 - - 72,7
4 + 2
Anteil im Gemisch 8,8 26,3 32,9 21,9 8,2 1,6 0,14
VS-Aktivität 8,8 21,9 21,9 11,0 2,7 0,27 - 66,7
HS-Aktivität 8,8 17,6 21,9 7,3 2,7 - - 58,4
vHS-Aktivität 8,8 17,6 17,6 6,6 1,1 - - 51,6
3 + 3
Anteil im Gemisch 1,6 9,4 23,4 31,3 23,4 9,4 1,6
VS-Aktivität 1,6 7,8 15,6 15,6 7,8 1,6 - 50,0
HS-Aktivität 1,6 6,3 15,6 10,4 7,8 - - 41,7
vHS-Aktivität 1,6 6,3 12,5 9,4 3,1 - - 32,9
2 + 4
Anteil im Gemisch 0,14 1,6 8,2 21,9 32,9 26,3 8,8
VS-Aktivität 0,14 1,4 5,5 11,0 11,0 4,4 - 33,3
HS-Aktivität 0,14 1,1 5,5 7,3 11,0 - - 25,0
vHS-Aktivität 0,14 1,1 4,4 6,6 4,4 - - 16,6
1 + 5
Anteil im Gemisch 0,002 0,06 0,8 5,4 20,1 40,2 33,5
VS-Aktivität 0,002 0,05 0,54 2,7 6,7 6,7 - 16,7
HS-Aktivität 0,002 0,04 0,54 1,8 6,7 - - 9,1
vHS-Aktivität 0,002 0,04 0,43 1,6 2,7 - - 4,8
ERGEBNISSE 40
Bei der Überlegung, welche Ergebnisse zu erwarten wären, falls der restituierte FAS-
Komplex eine Halbseiten-Aktivität aufwiese, kann man von zwei grundsätzlich verschiedenen
Modellen ausgehen: im einen Fall bildet eine einzelne phosphopantetheinylierte α-
Untereinheit mit einer beliebigen zweiten, ebenfalls phosphopantetheinylierten α-Untereinheit
im Komplex ein aktives Dimer. Im zweiten Fall tut sie dies nur, falls die zweite Untereinheit
sich im Komplexgefüge in der richtigen geometrischen Position zu ihr befindet. In diesem
Fall würden sich also nur benachbarte, d.h. „vicinale“ Untereinheiten gegenseitig ergänzen. In
Abb. 19 wurden die verschiedenen Möglichkeiten der relativen Anordnungen einer
unterschiedlichen Zahl phosphopantetheinylierter α-Untereinheit zueinander in einem
einfachen zweidimensionalen hexameren Modell systematisch durchgespielt. Die sich daraus
ergebenden Häufigkeiten bestimmter Hexamerer mit fest gefügten Positionen wurden aus
Abb. 19 abgeleitet und sind in Tab. 8 aufgelistet. Unter Verwendung dieser und der in Tab. 7
enthaltenen Werte wurden in Tab. 9 die theoretisch erwarteten FAS-Aktivitäten berechnet, die
einmal bei Zugrundeliegen einer einfachen Halbseiten-Aktivität ohne bestimmte sterische
Voraussetzungen (HS) und zum anderen bei Vorliegen einer „vicinalen“ Halbseiten-Aktivität
(vHS), bei der nur die in Abb. 19 benachbarten α2-Paare aktiv sind, erhalten werden. Auch
der Fall, dass keine Halbseiten-Aktivität, sondern eine Vollseiten-Aktivität (VS) vorliegt,
wurde in Tab. 9 berechnet. Die errechneten Werte sind in Abb. 18 ebenfalls aufgetragen. Wie
man beim Vergleich von Abb. 17 mit Abb. 18 sieht, entsprechen die experimentell ermittelten
Werte in Abb. 17 am ehesten dem VS-Diagramm in Abb. 18. Dieser Befund sowie die klar
vom VS-Kurvenverlauf sich abhebenden HS- und vHS-Diagramme sprechen eindeutig gegen
das Vorliegen einer obligatorischen Halbseiten-Aktivität im FAS-Komplex der Hefe.
ERGEBNISSE 41
2.2 Untersuchungen ausgewählter Aspekte der Synthese überlanger
Fettsäuren in Hefe
2.2.1 Hintergrund
Fettsäuren mit mehr als 18 C-Atomen Kettenlänge werden als „überlange“ Fettsäuren („very
long chain fatty acids“; VLCFA) bezeichnet. Sie gehören nicht zu den üblichen Bestandteilen
aller biologischen Membranen. Lediglich in der Plasmamembran von Eukaryontenzellen sind
sie, in meist sehr geringer Menge (1-3 Prozent), enthalten. Obwohl sie für die Lebensfähigkeit
dieser Zelle unentbehrlich sind, weiß man über ihre biologische Funktion erst wenig. Eine
Rolle bei wichtigen Signal-Weiterleitungsvorgängen erscheint wahrscheinlich.
Die Biosynthese überlanger Fettsäuren erfolgt in Hefe durch Verlängerung der langkettigen
Fettsäuren Palmitin- und Stearinsäure. Unter Verwendung von Malonyl-CoA als
Elongationsbaustein wird dabei nach einem Fettsäuresynthase-analogen Mechanismus in der
Hauptsache Cerotinsäure (26:0) gebildet [DIT]. Das beteiligte Enzymsystem, die Fettsäure-
Elongase, kann zwar anhand seiner Enzymaktivität nachgewiesen werden, wurde jedoch
molekular bisher weder isoliert noch charakterisiert. Immerhin konnten jedoch einzelne
Komponenten des Multienzymsystems Elongase vor kurzen auf indirektem Wege, d.h. mit
Hilfe spezifischer Deletionsmutationen, nachgewiesen werden. In unserem Labor war dies vor
allem das Teilenzym β-Ketoacyl-Reduktase, für dessen Synthese das Hefegen YBR159w
verantwortlich ist [ROS]. In dem hier vorliegenden Teil meiner Arbeit sollten die
vorhandenen genetischen Befunde zur Identität des Gens YBR159w durch biochemische
Studien untermauert werden.
Da Fettsäuresynthase und Elongase zwei analog arbeitende Enzymsysteme sind, ist es
schwierig, durch einen optischen in vitro Test zwischen beiden zu differenzieren. In beiden
Fällen wird Malonyl-CoA unter NADPH-Verbrauch in Fettsäuren eingebaut. Experimentell
wird diese Reaktion entweder im optischen Test anhand des NADPH-Verbrauchs gemessen,
oder aber es wird der Einbau von [2]-14C-markierter Malonsäure in radioaktiv markierte
Fettsäuren bestimmt. In erster Näherung kann die spezifische Elongase-Aktivität durch
radiogaschromatographische oder Radio-HPLC-Analyse der gebildeten Fettsäuren festgestellt
werden. Im Bereich von 16 – 20 C-Atome langen Fettsäuren überschneiden sich jedoch die
Aktivitäten beider Enzymsysteme, so dass hier auch mit diesem Test eine Diskriminierung
ERGEBNISSE 42
schwierig ist. Es war daher außerordentlich hilfreich festzustellen, dass FAS und Elongase
sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Hemmstoff Cerulenin deutlich unterscheiden.
Während das Elongase Enzymsystem durch Cerulenin nicht erkennbar gehemmt wird, ist
dieses Reagens für praktisch alle Fettsäuresynthasen ein effizient und irreversibel wirkender
Inhibitor. Man geht davon aus, dass Cerulenin die β-Ketoacylsynthase-Reaktion der FAS
irreversibel dadurch blockiert, dass es sich unter Öffnung des Epoxidrings kovalent an den
Cysteinrest des katalytisch aktiven Zentrums („periphere“ SH-Gruppe) anlagert (vgl. Abb. 20)
NHOH
O
OHKSKR
PPT
DHER
MPT
AC
ACP
SS
O
CH2COO-
O
CH2COO-
+ CeruleninKS
KR
PPT
DHER
MPT
AC
ACP
SS
R
O
PPT
A B
Abb. 20: Irreversible Hemmung der FAS-Kondensationsreaktion durch Cerulenin.
Die „periphere“ SH-Gruppe (grün) im aktiven Zentrum der Ketoacyl-Synthase bindet normalerweise den zu
verlängernden Acylrest (A), reagiert jedoch in Gegenwart von Cerulenin mit dem sterisch ähnlichen Hemmstoff
(B).
Eine so modifizierte FAS ist nicht mehr in der Lage, den Acyl-Starter an die „periphere“ SH-
Gruppe anzulagern und somit die Schlüsselreaktion der Fettsäurebiosynthese durchzuführen.
Der Zusatz von Cerulenin zu einem in vitro Fettsäuresynthese-Ansatz bewirkt somit, dass nur
Elongase-Produkte, und keine FAS-Produkte mehr gebildet werden. Das Produktspektrum
eines derartigen Ansatzes mit Wildtyp-Elongase ist in Abb. 21A gezeigt. Bei Verwendung
von Stearoyl-CoA als Starter bilden sich dabei die überlangen Fettsäuren 20:0, 22:0, 24:0,
26:0. Bei der Radio-HPLC Analyse (Abb. 21A) werden diese Säuren in Form ihrer p-
Bromphenacyl-Derivate nachgewiesen und den entsprechenden Referenzverbindungen (Abb.
21C) zugewiesen. Während Hefezellen in vivo offensichtlich noch über ein zweites Elongase-
System verfügen, das beim Ausfall des Gens YBR159w das Überleben der Zelle sichert, fällt
bei dem geschilderten in vitro Test bei Verwendung eines ∆ybr159-Mutantenextraktes als
Enzymquelle die Verlängerungsreaktion komplett aus (Abb. 21B).
ERGEBNISSE 43
0
400
800
0 10 20 30 40 50 60
Zeit [min]
Mal
onyl
-CoA
Ein
bau
X[c
pm]
A
0
200
400
0 10 20 30 40 50 60
Zeit [min]
Mal
onyl
-CoA
Ein
bau
X
[cpm
]
X
Y
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
Zeit [min]
Abs
orpt
ion
[A25
4]
18:0 20:022:0
24:0 26:0
C
Abb. 21: Reaktionsprodukte des Enzymsystems Elongase bei Verwendung von Membranpräparationen
aus Wildtyp- (A) und ∆ybr159w-Mutanten-Zellen (B) nach p-Bromphenacylierung und Auftrennung
mittels Radio-HPLC.
Um eine Interferenz mit der zellulären FAS-Aktivität auszuschalten, wurden die Reaktionen in Gegenwart des
FAS-Inhibitors Cerulenin durchgeführt. Als Startsubstrat diente Stearoyl-CoA. Einzelheiten des Tests sind in
Material und Methoden aufgeführt. In C sind die p-bromphenacylierten Standard-Fettsäureester abgebildet.
ERGEBNISSE 44
Sowohl die Ähnlichkeit der YBR159w-kodierten Proteinsequenz mit bekannten Keto-
Reduktase-Sequenzen als auch verschiedene Kontrollexperimente von Heidi Rössler und
Christoph Rieck in unserem Arbeitskreis hatten nahe gelegt, dass das Gen YBR159w für eine
Ketoreduktase-Aktivität kodiert [RÖS]. Demnach sollte mit Stearoyl-CoA als Starter der
Elongationsprozess nach der ersten Kondensation mit Malonyl-CoA und der Bildung von β-
Ketoeicosansäure blockiert werden. Tatsächlich werden in Abb. 21B anstelle der vier mit dem
Wildtyp-Enzym beobachteten überlangen Fettsäuren zwei kürzerkettige Reaktionsprodukte
von zunächst unbekannter chemischer Struktur nachgewiesen. In dieser Arbeit sollte durch
Synthese möglicher Reaktions-Zwischenprodukte als Referenzen die Identität dieser Produkte
ermittelt werden.
2.2.2 Identifizierung der mit einer Membranfraktion der Mutante ∆ybr159w
gebildeten Elongaseprodukte
Beim Enzymtest mit einer Elongase-haltigen Membranfraktion werden langkettige Acyl-CoA
Starter in Gegenwart von NADPH, [2]-14C-Malonyl-CoA zu überlangen Fettsäuren
verlängert. Die radioaktiv markierten Produkte werden nach der Synthese durch saure
Totalhydrolyse freigesetzt, mit Petrolether extrahiert und anschließend zu p-
Bromphenacylestern derivatisiert (vgl. Abb. 22). Diese können durch „Reversed Phase“
HPLC aufgetrennt und im Radio-Flußzellendetektor detektiert werden. Die vor der Hydrolyse
zugesetzten, nicht radioaktiven Standard-Fettsäuren können durch einen UV-
Flußzellendetektor erfasst werden.
Br C
O
CH2 Br R'3N R'3NH+Br+ + +Br C
O
CH2OOCRRCOOH
Abb. 22: Derivatisierung von Fettsäuren zu p-Bromphenacylestern.
Nachdem im Reaktionsansatz mit dem Startsubstrat Stearoyl-CoA und einer
Membranfraktion der ∆ybr159w-Mutante zwei nicht identifizierbare Verbindungen
entstanden waren, die im Wildtyp-Ansatz nicht auftraten und aufgrund ihres Laufverhaltens
keine verlängerten Fettsäuren sein konnten (Abb. 21B), musste es sich hierbei um
Zwischenprodukte der Stearinsäure-Elongation handeln. Bei Vorliegen eines Ketoacyl-
ERGEBNISSE 45
Reduktase-Defektes in der Mutante kamen in Anbetracht des bekannten Syntheseweges von
Fettsäuren vor allem die in Abb. 23 gezeigten Substanzen 1 und 2 in Frage.
COOHH23C11
HOOC COOH+
H23C11
COOH
O
H23C11
O
CO2
Kondensation
Ketoreduktion YBR159w
H23C11
COOH
OH
Dehydratation
3
1 2
H23C11
COOH4
CO2
Abb. 23: Elongation von Stearoyl-CoA in der Mutante ∆ybr169w und mögliche Reaktionsprodukte.
Die Säuren sind der Übersichtlichkeit halber als freie Säuren und nicht als CoA-Derivate dargestellt.
Nach der Kondensation von Stearoyl-CoA mit Malonyl-CoA sollte in der Mutante ∆ybr159w
die anschließende Reduktion der gebildeten 3-Ketoeicosansäure (Verbindung 1) blockiert
sein. Durch evtl. unspezifische im Ansatz enthaltene Reduktase(n) könnte trotzdem in
geringem Umfang die Weiterreaktion zu der Verbindungen 3 stattfinden, was anschließend
wiederum die Bildung von 4 ermöglichen könnte. Die Reduktion von Verbindung 4 zur
gesättigten 20:0 Fettsäure findet gemäß Abb. 21B nicht statt. Eine unspezifische Reduktion
der gebildeten Ketosäure erschien möglich, da dem Ansatz die übliche Menge NADPH als
Reduktionsmittel zugesetzt worden war. Auf jeden Fall könnte unter den Bedingungen der
ERGEBNISSE 46
Aufarbeitung des Reaktionsansatzes aber auch eine Decarboxylierung der 3-Ketosäure zum
entsprechenden Keton (Verbindung 2) stattfinden. Zur Überprüfung der in Abb. 23
skizzierten Reaktionen wurde daher in einem ersten Versuch dem Elongase-Testansatz der
Mutante ∆ybr159w kein NADPH zugesetzt. Als Folge davon verschwand die Verbindung X
in Abb. 21 aus dem Produktgemisch (vgl. Abb 28A). Demnach hatte es sich hier
möglicherweise um eine der beiden Verbindungen 3 oder 4 in Abb. 23 gehandelt. Die
verbliebene Verbindung sollte daher entweder die derivatisierte β-Ketosäure (Verbindung 1 in
Abb. 23) oder das daraus abgeleitete Keton (Verbindung 2 in Abb. 23) sein.
Theoretisch wäre es auch denkbar, dass die primär gebildete 3-Ketosäure eine weitere
Kondensationsreaktion mit Malonyl-CoA zu einer 3,5-Diketosäure (Verbindung 5 in Abb. 24)
eingegangen war und sich auch daraus wieder durch Decarboxylierung das entsprechende
Diketon gebildet hatte (Verbindung 6 in Abb. 24)
C17H35
O O
C17H35
O O O
C17H35
O O
Malonyl-CoA
CO2
5
6
Abb. 24: Bildung von Diketiden durch aufeinander folgende Kondensation von Stearoyl-CoA mit 2
Molekülen Malonyl-CoA.
Zur Farbgebung vgl. Abb. 22.
Um diesen verschiedenen denkbaren Reaktions-Möglichkeiten nachzugehen, wurde der 3-
Oxoeicosansäuremethylester synthetisch hergestellt und bei der Analyse der ∆ybr159w
Elongationsprodukte als Referenzsubstanz eingesetzt.
3-Oxoeicosansäuremethylester [MIL] wurde, wie im Detail in Material und Methoden
beschrieben, mit Hilfe der Acetessigesterreaktion gemäß Abb. 25 hergestellt. Dazu wurde
zunächst aus Stearinsäure das Stearoylchlorid hergestellt und dieses mit Acetessigester und
ERGEBNISSE 47
Natrium in Benzol umgesetzt. Anschließend wurde das Acetessigester-Addukt mit
Natriummethanolat zerlegt und nach Ansäuern der entstandene 3-Oxoeicosansäuremethylester
mit Petrolether extrahiert, gewaschen und mehrfach in Petrolether umkristallisiert.
C
O
OHH31C15SO2, HCl
SOCl2C
O
ClH31C15
CH
O CH3
O
OH CH3
H2
(Na/Benzol) OCH3
HC
O CH3
O
Na+
C
O
H31C15 CH
O CH3
O
OCH3
NaCl
H3CO-
Na+
C
O
H31C15 CH
O
OCH3
-Na
+
Na+H
+
H3CC
O
OCH3
C
O
H31C15
O
OCH3
-
1/2
Abb. 25: Syntheseweg des 3-Oxoeicosansäuremethylesters gemäß Milton et al. [MIL].
Abb. 26: FAB-Massenspektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters.
Das Signal bei 341m/z entspricht dem erwarteten [M+1]-Signal des 3-Oxoeicosansäure-methylesters.
ERGEBNISSE 48
Abb. 27: 1H-NMR Spektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters.
Interpretation der Signale: 0.88 (t, -CH3), 1.23 (m, -(CH2)16-), 1.56 (m, -CH2-CH2-CO-), 2.15 (t, -CH2-CO-, E-
Enolform), 2.32 (t, -CH2-CO-, Z-Enolform), 2.50 (t, -CH2-CO-, Ketoform), 3.42 (s, -CO-CH2-CO-, Ketoform),
3.70 (s, -COH=CH-COO-, Z-Enolform), 3.71 (s, -OCH3), 4.96 (s, -COH=CH-COO-, E-Enolform).
Das Produkt entstand mit einer Gesamtausbeute von 83%. Die Identität des 3-
Oxoeicosansäuremethylester wurde anschließend durch Massenspektrometrie (Abb. 26) und
FAB-1H-NMR (Abb. 27) verifiziert.
Der 3-Oxoeicosansäuremethylester wurde vor der Totalhydrolyse des Reaktionsansatzes der
Elongationsreaktion dem Ansatz zugesetzt um zu gewährleisten, dass die Referenzsubstanz
denselben Bedingungen ausgesetzt ist wie die Produkte der Elongationsreaktion. Somit
durchlaufen beide, Reaktionsprodukte und zugesetzter Standard, dieselben Reaktionsfolgen
von Esterhydrolyse und p-Bromphenacylierung. Abb. 28 zeigt zum einen, dass der
synthetische 3-Oxoeicosansäuremethylester-Standard nach Durchlaufen des Elongase
Reaktions- und Aufarbeitungsprozesses im HPLC-Chromatogramm aus einem Hauptsignal
(Signal S1) und einer Schulter (Signal S2) besteht und zum anderen, dass beide Substanzen
ein geringfügig zu längeren Laufzeiten hin verschobenes Laufverhalten im Vergleich zu dem
von der Mutante synthetisierten Produkt (Signal Y) aufweisen.
ERGEBNISSE 49
0
200
400
0 10 20 30 40 50 60
Zeit [min]
Mal
onyl
-CoA
Ein
bau
X
[cpm
]Y
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 10 20 30 40 50 60
Zeit [min]
Abs
orpt
ion
[A25
4]
S1
S2
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
Zeit [min]
Abs
orpt
ion
[A25
4]
18:0 20:022:0
24:0 26:0
C
Abb. 28: Vergleichende RP-HPLC Analyse der von der Mutante ∆ybr159w synthetisierten
Zwischenprodukte mit dem synthetischen 3-Oxoeicosansäuremethylester.
In A ist das von der Mutante mit Stearoyl-CoA und Malonyl-CoA, aber ohne Reduktionsmittel (NADPH)
gebildete Elongationsprodukt gezeigt. In B ist das Laufverhalten von entsprechend derivatisiertem (p-
bromphenacyliertem) 3-Oxoeicosansäuremethylester gezeigt. In C sind die p-bromphenacylierten Standard-
Fettsäureester abgebildet.
ERGEBNISSE 50
Die Tatsache, dass das von der Mutante ∆ybr159w gebildete Intermediat (Abb. 28A) in
beträchtlichem Umfang durch NADPH reduziert wurde (vgl. Abb. 28A und Abb. 21B) spricht
dafür, dass es sich um eine Ketoverbindung handelte. Da das Intermediat jedoch ein
unterschiedliches Chromatographie-Verhalten wie der synthetische Standard aufweist, kann
es sich bei dem Intermediat nicht um die 3-Oxoeicosansäure handeln. Es erscheint daher
wahrscheinlich, dass die zunächst entstandene, instabile β-Ketosäure aufgrund einer
fehlenden Ketoreduktase-Aktivität frei in der Lösung vorliegt und daher spontan zu einem
Methylketon decarboxyliert. In Gegenwart von NADPH kann anschließend das Methylketon
durch unspezifische Ketoreduktase-Aktivitäten zwar reduziert werden, eine weitere
Umsetzung durch Fettsäueelongasen wäre jedoch nicht möglich, da der entstehende Alkohol
über keine Carboxylgruppe mehr verfügt. Aus demselben Grund ist die p-
Bromphenacylierung des Ketons und damit der Nachweis der nicht-radioaktiven
Refereanzsubstanz im UV-Detektor nicht möglich. Die in Abb. 23 skizzierte Reaktionsweise
gilt daher als wahrscheinlich, konnte von mir aber nicht definitiv bewiesen werden.
2.2.3 FAS-freie Membranfraktionen
Versuche von Heidi Rössler und Christoph Rieck in unserem Labor hatten gezeigt, dass ein
Zellextrakt der Mutante ∆ybr159w zwar in vitro keine überlangen Fettsäuren mehr
synthetisiert, dass die Mutante jedoch in vivo diese Fähigkeit zur VLCFA-Synthese nicht
vollständig, sondern nur zu einem Teil eingebüßt hat. Dieser Befund sprach dafür, dass es in
Hefe noch ein zweites Enzymsystem gibt, welches zur Fettsäure-Elongation in der Lage ist.
Ein weiterer Befund war, dass die normalerweise durch externe Fettsäuren kompensierbare
Wachstums-Hemmung durch Cerulenin bei der Mutante ∆ybr159w zu einer durch externe
Fettsäuren nicht kompensierbaren Letalität führte. Einziger bisher bekannter Angriffspunkt
von Cerulenin in Hefezellen ist die Fettsäuresynthase. Eine mögliche Erklärung für die
geschilderten Befunde bestand somit darin, dass die Fettsäuresynthase in Hefe neben ihrer
eigentlichen Funktion der de novo Biosynthese von Palmitinsäure und Stearinsäure eventuell
auch noch in gewissem Umfang zur Verlängerung von Stearinsäure (18:0) zu Cerotinsäure
(26:0) in der Lage ist. Man könnte sich vorstellen, dass diese Nebenreaktion von einer
kleinen, Membran-gebundenen Subpopulation der in der Zelle vorhandenen FAS-Moleküle
durchgeführt wird. Der einfachste Versuch, die o.g. Hypothese zu bestätigen wäre der
Nachweis, dass erst mit einer ∆ybr159w/∆fas-Doppelmutation die Zelle die Fähigkeit zur
Fettsäure-Elongation völlig verliert. Dieser Versuch lässt sich jedoch in der Praxis nicht
ERGEBNISSE 51
durchführen, da die genannte Doppelmutation offenbar letal ist. Alle Versuche, eine solche
Doppelmutation entweder durch gezielte in vitro Mutagenese oder durch klassische
Kreuzungsexperimente herzustellen, waren bisher erfolglos geblieben (Christoph Rieck,
unveröffentlichte Daten). Auch wenn diese Tatsache bereits ein gutes Indiz für die Richtigkeit
der obigen Annahme war, so sollte doch versucht werden, weitere und mehr direkte
experimentelle Beweise für die Beteiligung von FAS an der VLCFA-Synthese zu finden. In
der vorliegenden Arbeit wurde dies zunächst damit versucht, die Existenz einer fest in der
Membran verankerten FAS-Fraktion nachzuweisen. Die Bestimmung des Produktmusters und
der enzymatischen Aktivität dieser membrangebundenen FAS-Fraktion sollte dann
anschließend untersucht werden.
Fettsäuresynthase ist normalerweise ein lösliches, im Cytoplasma enthaltenes Enzym. Zur
Darstellung einer möglicherweise Membran-gebundenen FAS-Fraktion wurde die
Membranfraktion aus dem Zellextrakt von Wildtyp-Hefe durch differentielle Zentrifugation
isoliert. Das Sediment wurde mit Aufschlusspuffer insgesamt sechsmal gewaschen. In einem
Parallel-Versuch wurden die Membranen in entsprechender Weise mit einem
Aufschlusspuffer gewaschen, der einen 1%igen Zusatz des Detergents Triton X-100 enthielt.
Nach jedem Waschschritt wurde mittels Western-Blot-Analyse die jeweils abgelöste und die
mit der Membranfraktion verbunden gebliebenen FAS visualisiert. Aus Abb. 29 wird
deutlich, dass bei der Zentrifugation des Rohextraktes, wie erwartet, der größte Teil des FAS-
Komplexes im Überstand blieb. Auch nach dem ersten Waschen des Niederschlags konnte
noch eine beträchtliche Menge (ca. 50%) des zunächst Membran-gebundenen FAS-
Komplexes solubilisiert werden. Bereits nach dem zweiten Waschgang war jedoch nur noch
sehr wenig lösliche FAS im Überstand. Danach blieb der Anteil Membran-gebundener FAS
offensichtlich konstant und kein weiteres Enzym wurde mehr von der Membran abgelöst.
Auch der Zusatz des Detergents Triton X-100 hatte keinen Einfluss auf die Löslichkeit dieser
Membran-gebundenen FAS-Fraktion. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Hefe-FAS nicht
nur im Cytoplasma gelöst, sondern auch in einer fest an die Zellmembran gebundenen Form
vorkommt. Daraus ergibt sich die Frage, ob diese Membran-gebundene FAS-Fraktion evtl.
eine spezielle, von der de novo Biosynthese abweichende Funktion hat.
ERGEBNISSE 52
FAS-
Stan
dard
RE
Ü N
1
Ü1 N1
2
Ü2 N2
3
Ü3 N3
4
Ü4 N4
5
Ü5 N5
6
Ü6 N6
A
B
Abb. 29: Nachweis von Membran-gebundener Fettsäuresynthase in einer gereinigten Zellmembran-
Fraktion aus Hefe.
Insgesamt wurden 5 g Wildtyphefe (BY4742) in 5 ml Aufschlusspuffer (50 mM Tris·HCl pH 7,4, 300 mM
Saccharose, 0,1 mM EDTA) suspendiert und durch Schütteln mit 5 g Glasperlen aufgeschlossen. Grobe
Zelltrümmer wurden durch kurze Zentrifugation (5 min bei 5000 g) getrennt. Anschließend wurde der Überstand
(Rohextrakt, RE) zur Auftrennung in partikuläre (N) und lösliche (Ü) Fraktion 30 min bei 20.000 g zentrifugiert.
Der dabei erhaltene Niederschlag wurde mit 5 ml Waschpuffer (50 mM Tris·HCl pH 7,4, 0,1 mM EDTA) einmal
ohne (A) und einmal mit (B) Zusatz von Triton X-100 gewaschen und wieder sedimentiert. Dieser Waschschritt
wurde, mit zwischengeschalteter Zentrifugation (30 min bei 20000 g), mehrfach wiederholt. Die Zahlen in der
Abbildung geben die verschiedenen aufeinander folgenden Waschschritte an. Nach jeder Zentrifugation wurde
mit spezifischem FAS-Antiserum eine Western-Blot-Analyse sowohl des Überstands (Ü) als auch des
Niederschlags (N) durchgeführt. Dazu wurde, mit Ausnahme des Rohextraktes (RE), jeweils ein gleiches
Volumen (5 µl) der verschiedenen Proben eingesetzt. Vom Rohextrakt wurde 1 µl eingesetzt.
Zur Klärung dieser Frage wurde zunächst die Aktivität der Membran-gebundenen FAS durch
den Einbau von radioaktiv markiertem [2]-14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren untersucht. Abb.
30 zeigt, dass die FAS-Aktivität im Überstand des ersten Waschsschrittes sehr hoch ist. Die
Gesamt-FAS Aktivität des Niederschlags (Membranfraktion) ist dagegen relativ niedrig. Da
bei jedem Waschschritt der Niederschlag wieder in dem gleichen Volumen (5 ml) frischen
Puffers suspendiert wurde, sollte die Summe der Messwerte Nn und Ün dem Wert Nn-1
entsprechen. Wie Tab. 10 zeigt, ist dies auch im Rahmen der Messgenauigkeit in guter
Näherung der Fall.
ERGEBNISSE 53
Tab. 10: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren mit Acetyl-CoA als Startsubstrat durch
die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag) FAS Fraktionen der in Abb. 29
dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.
Einzelheiten der Testdurchführung vgl. Material und Methoden. Die aufgelisteten Messwerte wurden durch
Subtraktion eines Blindwertes (Ansatz ohne NADPH) korrigiert.
FAS-Aktivität
Waschschritt Überstand [cpm] Niederschlag [cpm]
Überstand +
Niederschlag [cpm]
Rohextrakt 14620 (±7,1%)
1 13354 (±7,2%) . 1329 (±7,6%) . 14683
2 1372 (±7,3%) . 201 (±8,9%) . 1572
3 248 (±6,6%) . 38 (±13 %) . 286
4 38 (±16% ) . 30 (±11 %) . 68
5 13 (±26% ) . 28 (±15 %) . 41
6 29 (±29% ) . 43 (±13 %) . 72
0
100
200
300
400
500
1 2 3 4 5 6
Waschschritt
Einb
au v
on M
alon
yl-C
oA in
Fet
tsäu
ren
[cpm
/µl]
Abb. 30: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren mit Acetyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen
(Ü, gelb) und die partikulären (N, braun) FAS Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten
Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.
Es wurden jeweils identische Volumina (30 µl) für einen radiometrischen FAS-Test eingesetzt (vgl. Material
und Methoden). Die Nummerierung der Waschschritte in Abb. 29 und Abb. 30 ist dieselbe.
ERGEBNISSE 54
Aus dem Vergleich von Abb. 29 und Tab. 10 lässt sich schließen, dass die Membran-
gebundene FAS mit Acetyl-CoA als Starter keinen messbaren Einbau von Malonyl-CoA in
langkettige Fettsäuren durchführt und somit ihre eigentlichen FAS-Funktion – die Synthese
von Palmitinsäure und Stearinsäure aus Acetyl-CoA und Malonyl-CoA – nicht mehr
durchführt. Dies könnte bedeuten, dass die membrangebundene FAS-Subpopulation
tatsächlich eine von der löslichen FAS abweichende Funktion besitzt. Daher wurde als
nächstes die Elongase-Aktivität von membrangebundener FAS anhand des Einbaus von
radioaktivem [2]-14C-Malonyl-CoA in Stearoyl-CoA in Abwesenheit von Cerulenin
untersucht. Auch diese Versuche wurden systematisch mit den Membranfraktionen (N)
verschiedener, aufeinander folgender Waschschritte durchgeführt. Tab. 11 zeigt, dass nach
der Zentrifugation des Rohextraktes die Elongase-Aktivität im Niederschlag um den Faktor
13 höher war als im Überstand. Die Aktivität des Niederschlags ging jedoch durch weiteres
Waschen verloren und war bereits nach dem dritten Reinigungsschritt kaum noch
nachweisbar (s. Abb. 31).
Tab. 11: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit von Cerulenin) mit
Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag)
Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.
Einzelheiten der Testdurchführung vgl. Material und Methoden. Die aufgelisteten Messwerte wurden durch
Subtraktion eines Blindwertes (Ansatz ohne NADPH) korrigiert.
C18-CoA Elongase-Aktivität
Waschschritt Überstand [cpm] Niederschlag [cpm]
Überstand +
Niederschlag [cpm]
Rohextrakt 1147 (±6,5%)
1 101 (±13 %) . 1359 (±7,2%) . 1460
2 33 (±18 %) . 261 (±23 %) . 294
3 39 (±19 %) . 72 (±29 %) . 111
4 32 (±20 % ) . 22 (±30 %) . 53
5 36 (±25 % ) . 60 (±29 %) . 96
6 42 (±22 % ) . 33 (±29 %) . 75
ERGEBNISSE 55
0
10
20
30
40
50
1 2 3 4 5 6
Waschschritt
Einb
au v
on M
alon
yl-C
oA
in V
LCFA
[cpm
/µl]
X
Abb. 31: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit von Cerulenin) mit
Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die lösliche (Ü, gelb) und die partikuläre (N, braun) Fraktionen der
in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.
Es wurden jeweils identische Volumina (30 µl) für den radiometrischen Elongase-Test (in Abwesenheit von
Cerulenin) mit Stearoyl-CoA als Startsubstrat eingesetzt (vgl. Material und Methoden). Die Nummerierung der
Waschschritte in Abb. 29 und Abb. 31 ist dieselbe.
Diese Abnahme ist erstaunlich, weil die Membran-gebundene Elongase durch die
Waschschritte eigentlich nicht entfernt werden sollte und man daher eine persistierende,
vergleichbar hohe und konstant bleibende Elongase-Aktivität in allen Membranfraktionen
erwartet hätte. Da dies jedoch nicht der Fall war, könnte das Ergebnis der in Abb. 31
gezeigten Versuchsreihe dafür sprechen, dass ein für die Elongase-Reaktion notwendiger
Cofaktor bei der Waschprozedur mehr und mehr von den Membranen abgelöst wurde. Trotz
der Verwendung von Stearoyl-CoA als Startsubstrat bleibt es jedoch auf Grund der
Abwesenheit von Cerulenin im Testansatz von Abb. 31 möglich, dass aufgrund der
Decaboxylierung von Malonyl-CoA zu Acetyl-CoA auch eine Acetyl-CoA abhängige FAS-
Aktivität an der Malonyl-CoA Inkorporation der verschiedenen Ansätze dieses Versuchs
beteiligt war. In diesem Fall wäre die abnehmende Malonyl-CoA Inkorporationsrate die Folge
eines zunächst hohen und dann zunehmend von den Membranen abgewaschenen Anteils an
FAS-Protein. Die schließlich verbleibende Restaktivität – und nicht die zunächst hohe
Aktivität von Fraktion 1 – würde dann die tatsächliche mit der Membran assoziierte
ERGEBNISSE 56
Elongase-Aktivität darstellen. Auf Grund der geringen Enzymaktivität war es leider nicht
möglich, eine Produktanalyse der Elongasereaktion der gewaschenen Membranen
durchzuführen und damit die erwähnten Fragen zu klären. Die Beteiligung der
Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren erscheint somit auf Grund der
geschilderten Befunde weiterhin denkbar, kann aber mit ihnen nicht eindeutig bewiesen
werden.
ERGEBNISSE 57
2.3 Drosselung der FAS-Aktivität in vivo und die physiologischen
Folgen dieser Inaktivierung
2.3.1 Hintergrund
Die Hauptaufgabe der Fettsäuresynthase in allen Organismen liegt zunächst darin, den Bedarf
der Zelle an Fettsäuren für die Membranbiosynthese zu decken. Außer zur Synthese von
Phospholipiden wird zelluläres Fettacyl-CoA aber auch zur Synthese von Triacylglycerid-
Speicherfetten, zur Acylierung bestimmter Membranproteine und, in Eukaryonten, auch zur
Synthese von Sphingolipiden benötigt (vgl. Abb. 7). Die meisten dieser Reaktionen sind für
das Überleben der Zelle unentbehrlich. Der FAS-Komplex der Hefe ist in der Lage, gesättigte
Fettsäuren bis zu einer Länge von 20 Kohlenstoffatomen zu bilden. Ein Ausfall der Fettsäure-
Biosynthese, sei es durch FAS-Hemmung oder Mutation, führt dazu, dass alle Fettsäure-
bedürftigen Reaktionen der Zelle nicht mehr ausgeführt werden können. Durch Aufnahme
externer langkettiger Fettsäuren kann allerdings in den meisten Fällen das Fehlen ihrer
zellulären Biosynthese ausgeglichen werden. Ziel der im Folgenden geschilderten Versuche
war es, Hefezellen mit reduzierter FAS-Aktivität herzustellen bzw. Hefe-Mutanten mit einem
erniedrigten Fettacyl-CoA Spiegel zu isolieren. Mit diesen Mutanten sollten dann die aus dem
Absinken des Acyl-CoA Spiegels resultierenden Auswirkungen auf die verschiedenen
Fettacylierungsreaktionen und auf die Zellphysiologie als ganzes untersucht werden.
2.3.2 Drosseln der FAS-Aktivität durch kontrollierten Zusatz von Cerulenin zu
intakten Zellen
In dieser Versuchsreihe sollte untersucht werden, inwieweit die FAS-Aktivität in vivo durch
Zugabe von Cerulenin kontrolliert gedrosselt werden kann. Dazu wurde die
Wachstumskinetik von Wildtyp Hefe (BY4742) in Gegenwart verschiedener
Ceruleninkonzentrationen verfolgt.
ERGEBNISSE 58
0
1
2
3
4
-4 1 6 11 16
Zeit [h]
Zelld
icht
e [A
600]
X 0µM2µM4µM6µM8µM10µMCerulenin
Abb. 32: Wachstumskinetik von Wildtyp Hefe in Gegenwart unterschiedlicher Ceruleninkonzentrationen.
Die Zellen wurden zunächst bis zu einer Zelldichte (A600) von 1,0 in YPD-Medium wachsen gelassen.
Anschließend wurde die Kultur in 6 gleiche Ansätze aufgeteilt und jeder Ansatz mit frischem YPD-Medium
10fach verdünnt (Zeitpunkt -4 h). Nach 4 h Anwachsen bei 30°C wurden zu den Ansätzen die in der Abb.
angegebenen unterschiedlichen Mengen Cerulenin zugegeben und weiter bei 30°C inkubiert.
Aus Abb. 32 wird deutlich, dass das Zellwachstum unter den hier angewandten Bedingungen
durch 2 mM Cerulenin nicht erkennbar, durch 4 mM Cerulenin schwach, durch 6 mM
Cerulenin deutlich und durch ≥ 8 mM Cerulenin vollständig gehemmt wurde.
Um den physiologischen Status der Cerulenin-gehemmten Zellen festzustellen, d.h. um zu
klären, ob Cerulenin den Stoffwechsel nur reversibel verlangsamt oder ob es die Zellen
irreversibel abtötet, wurde der Anteil lebender Zellen in drei Kulturen mit unterschiedlichem
Cerulenin-Gehalt bestimmt.
ERGEBNISSE 59
0
1
2
3
-4 -2 0 2 4 6
Zeit [h]
Zelld
icht
e [A
600]
x
0µM4µM10µM
Cerulenin
98%
98%
8%
0,4%
Abb. 33: Anteil lebender Zellen in mit und ohne Cerulenin gewachsenen Hefekulturen.
Die Zellen wurden zunächst bis zu einer Zelldichte (A600) von 1,0 in YPD-Medium wachsen gelassen.
Anschließend wurde die Kultur in 3 gleiche Ansätze aufgeteilt und jeder Ansatz mit frischem YPD-Medium
10fach verdünnt. Nach 4 h Anwachsen bei 30°C wurden zu den Ansätzen die in der Abb. angegebenen
unterschiedlichen Mengen Cerulenin zugegeben und weiter bei 30°C inkubiert. Zu den angegebenen
Zeitpunkten wurden den Kulturen Proben entnommen und in diesen mit einer Thoma-Zählkammer die
Gesamtzellenzahl und außerdem, nach geeigneter Verdünnung, der auf YPD-Agar auswachsende Anteil
lebender Zellen bestimmt.
Wie Abb. 33 zeigt, wurde eine Hefekultur zum Zeitpunkt Null in drei gleiche Teile geteilt,
zwei davon mit Cerulenin zu unterschiedlichen Endkonzentrationen versetzt und dann bei
30°C weiter wachsen gelassen. Das Zellwachstum wurde in regelmäßigen Zeitintervallen
verfolgt und nach 7 h mit allen 3 Kulturen eine Lebendzellzahl-Bestimmung durchgeführt.
Dabei ergab sich, dass die Cerulenin-freie Kultur nach 7 h Wachstum noch 98% lebende
Zellen, die Kultur mit 4 mM Cerulenin noch 8% und die mit 12 mM Cerulenin nur noch 0,4%
lebende Zellen enthielt. Die Bildung Cerulenin-resistenter Zellen wurde durch Überprüfung
des Phänotyps der auf YPD ausgestrichenen Zellen mittels Überstempeln auf Cerulenin-
haltige YPD Agarplatten ausgeschlossen (nicht gezeigt).
Der Wachstums-reduzierende Effekt subletaler Dosen von Cerulenin auf Hefekulturen scheint
somit auf der Abtötung eines Teils der Kultur und weniger auf einer Beeinflussung der
Teilungsrate der einzelnen Zelle zu beruhen. Dieser „Alles oder Nichts“-Effekt des
ERGEBNISSE 60
Hemmstoffs auf die Zelle erscheint plausibel, wenn man bedenkt, dass Cerulenin im
Vergleich zur zellulären FAS-Konzentration in hohem molaren Überschuss vorliegt und
letztlich irreversibel an die Fettsäuresynthase bindet. Bei genügend langer Einwirkungszeit
reagieren selbst bei niedriger Cerulenin-Konzentration letztlich alle FAS-Moleküle der Zelle
mit dem Hemmstoff und die Zelle stirbt ab. Eine zeitliche Balance zwischen FAS-Hemmung,
FAS-Resynthese und Zellteilung könnte theoretisch zwar zu einer Hefekultur mit partiell
inaktivierter FAS-Population führen, geeignete Bedingungen sind jedoch in der Praxis kaum
beherrschbar und führen auch alsbald zum Auftreten und Überhandnehmen Cerulenin-
resistenter Mutanten. Es wurde daher ein anderer Weg eingeschlagen, um die zelluläre
Fettsäurebiosynthese kontrolliert zu drosseln.
2.3.3 Isolierung von Hefe-Mutanten mit reduzierter FAS-Aktivität
Auf der Suche nach Zellen mit reduzierter FAS-Aktivität sollten als nächstes FAS-Mutanten
isoliert werden, die in Abwesenheit von Fettsäuren langsamer wachsen als Wildtyp Hefe. Um
sicherzugehen, dass das langsame Wachstum nicht auf FAS-unabhängigen Mutationen
beruht, sollten diese Mutanten nur in Abwesenheit von Fettsäuren langsam wachsen, in
Gegenwart extern zugesetzter Fettsäuren jedoch wieder normal wachsen. Die genannten
Mutanten wären somit „leaky“ und enthielten eine Fettsäuresynthase, die nicht vollständig
inaktiv wäre, sondern eine für langsames Wachstum noch ausreichende Fettsäurebiosynthese-
Rate aufwiese. Das langsamere Wachstum wäre damit eine durch verringerte FAS-Aktivität
und die dadurch abgesenkte Verfügbarkeit an langkettigem Acyl-CoA in der Zelle bedingt.
Um derartige Mutanten zu finden, wurde neben einer von mir selbst durchgeführten EMS-
Mutagenese auch auf die bereits existierende, umfangreiche Sammlung von fas-Mutanten am
hiesigen Lehrstuhl zurückgegriffen.
2.3.3.1 Charakterisierung von FAS-Mutanten mit verringertem Wachstum auf
Fettsäure-freiem Medium
Bei der vergleichenden, semi-quantitativen Analyse des Wachstumsverhaltens von ca. 2000
verschiedenen S. cerevisiae Mutanten auf einerseits Fettsäure-freiem und andererseits
Fettsäure-haltigem YPD-Vollmedium wurden 6 Stämme identifiziert, die den ins Auge
gefassten Phänotyp aufwiesen. Das Wachstum der Mutanten auf den beiden Medien ist in
Abb. 34 dokumentiert.
ERGEBNISSE 61
YPD+FS
YPD
WT fas1-268 fas2-385 fas2-438 fas2-469 fas-644 fas-1095
Abb. 34: Wachstum verschiedener fas-Mutanten und des Wildtyps auf Fettsäure-haltigem (YPD+FS) und
Fettsäure-freiem (YPD) Vollmedium.
Die einzelnen Stämme wurden zunächst auf YPD+FS Vollmedium 3 Tage bei 30°C anwachsen gelassen. Von
den gut gewachsenen Kulturen wurde dann eine Zahnstocherspitze voll Zellen entnommen und in sterilem
Wasser suspendiert. Aus dieser Suspension wurden je 5 µl Tropfen mit einer sterilen Pipette auf YPD und auf
YPD+FS Agar aufgetropft. Nach 3 Tagen Inkubation bei 30°C wurde das Zellwachstum dokumentiert.
Um das geänderte Wachstumsverhalten der Mutanten quantitativ besser erfassen zu können,
wurden anschließend mit den ausgewählten Stämmen Wachstumskinetiken in Fettsäure-freien
und Fettsäure-haltigen Flüssigmedien aufgenommen. Aus Abb. 35A wird deutlich, dass alle
Stämme in Fettsäure-haltigem YPD+FS-Medium gut wuchsen. Lediglich die maximal
erreichte Zelldichte unterschied sich von Stamm zu Stamm, was wahrscheinlich auf FAS-
unabhängige Eigenarten der einzelnen Stämme zurückzuführen war. Im Gegensatz dazu
wuchsen in Abwesenheit von Fettsäuren 4 der 6 untersuchten Mutanten so langsam, dass eine
Zunahme der Zelldichte im Beobachtungszeitraum (35h) nicht festgestellt wurde (vgl. Abb.
35B). Lediglich 2 Mutanten, fas2-469 und fas-1095 zeigten erkennbares Wachstum, das
jedoch deutlich langsamer war als das des Wildtyps. Bemerkenswerterweise war das
Wachstum der beiden Mutanten nicht nur durch eine im Vergleich zum Wildtyp geringere
Teilungsrate in der logarithmischen Phase, sondern auch durch eine niedrigere Zelldichte in
der stationären Phase gekennzeichnet. Ein Vergleich der Ergebnisse aus Abb. 34 und 35 ergab
die grundsätzliche Übereinstimmung des Wachstumsverhaltens der untersuchten Mutanten
auf Festmedium und in Flüssigmedium.
ERGEBNISSE 62
0
1
2
3
4
5
6
7
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0
Zeit [h]
Zelld
icht
e [A
600]
X
A
0
1
2
3
4
5
6
7
0 5 10 15 20 25 30 35
Zeit [h]
Zelld
icht
e [A
600]
X
469 644 268 1095 WT 385 438
B
Abb. 35: Wachstumskinetiken von Wildtyp-Hefe und verschiedenen fas-Mutanten in Fettsäure-haltigem
(A, YPD+FS) und Fettsäure-freiem (B, YPD) Medium.
Von den einzelnen Stämmen wurden zunächst Vorkulturen in YPD+FS Vollmedium für 12 h bei 30°C
angezüchtet. Proben der Vorulturen wurden dann mit sterilem Wasser auf eine Zelldichte von A600 = 0,1
verdünnt. Jeweils 10 ml der verdünnten Vorkulturen wurden abzentrifugiert und die sedimentierten Zellen erneut
mit 10 ml sterilem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden anschließend in 3,0 ml sterilem Wasser
resuspendiert und davon jeweils 1 ml in 200 ml Fettsäure-freies (A) bzw. Fettsäure-haltiges (B) Vollmedium
überführt und die beimpften Kulturen anschließend bei 30°C auf einem Schüttler wachsen gelassen.
ERGEBNISSE 63
2.3.3.2 Bestimmung der FAS-Aktivität in fas-Mutanten mit verringertem
Wachstum auf Fettsäure-freiem Medium
Als nächstes sollte festgestellt werden, ob die reduzierten Wachstumsraten der in Abb. 35
untersuchten Mutanten mit entsprechend reduzierten zellulären FAS-Aktivitäten
einhergingen. Zur Untersuchung dieser Frage wurden zum einen die FAS-Enzyme einiger
Mutanten isoliert und die enzymatische Aktivität des gereinigten Enzymkomplexes im
optischen Test ermittelt. Zum anderen wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem die FAS-
Aktivität des Rohextraktes unmittelbar nach dem Zellaufschluss radiometrisch bestimmt
werden konnte. Dieses Verfahren hatte den Vorteil, dass nur eine geringe Menge Hefezellen
für den Test notwendig war und damit das zeitaufwendige und evtl. Denaturierungsvorgänge
begünstigende Reinigungsverfahren des FAS-Komplexes überflüssig wurde.
2.3.3.2.1 Optimierung des radiometrischen FAS-Tests
Um die FAS-Aktivität im Zellrohextrakt mit möglichst hoher Genauigkeit und
Empfindlichkeit bestimmen zu können, wurden in Vorversuchen die Bedingungen festgelegt,
unter denen der Einbau von [2]-14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren zum einen möglichst hoch
und zum anderen immer noch proportional zur eingesetzten Enzymmenge und zur
Inkubationszeit war.
2.3.3.2.1.1 Optimierung der zum Radio-FAS-Test eingesetzten Proteinmenge
Hefezellen wurden durch Schütteln mit Glasperlen aufgeschlossen (s. Material und
Methoden). Die Protein-Konzentration im Zellextrakt wurde mit dem Bradford-Test
bestimmt. Anschließend wurden unterschiedliche Mengen des Zellextraktes zum
radiometrischen FAS-Test eingesetzt und unter ansonsten festgelegten Bedingungen der
Einbau von [2]-14C-Malonyl-CoA durchgeführt. Die Proben wurden nach dem Reaktionsstop
alkalisch hydrolysiert, dann angesäuert und die radioaktiv markierten Fettsäuren insgesamt
dreimal mit Petrolether ausgeschüttelt. Die Petrolether-Fraktionen wurden dreimal mit 1 M
Essigsäure gewaschen, im Stickstoffstrom eingeengt und im Scintillationszähler vermessen.
ERGEBNISSE 64
0
5000
10000
15000
0 100 200 300 400 500
Zellextrakt [µg Protein]
Einb
au v
on M
alon
yl-C
oA
in la
ngke
ttige
Fet
tsäu
ren
[cpm
]
Abb. 36: Proteinabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren.
Unterschiedliche Mengen des Rohextraktes (0, 50, 100, 250, 500 µg) von Wildtyp-Hefe (BY4742) wurden für
30 min bei 30°C in Gegenwart von 100 µl Cystein·HCl (0,1M), 100 µl KOH (0,1 M), 10 µl Glucose-6-Phosphat
(0,1 M), 20 µl NADP+ (10 mM), 10 µl Acetyl-Coenzym A (10 mM), 12,5 µl Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase (0,8 mg/ml), 6 µl Malonyl-CoA (6 mM), 1,4 µl 14C-Malonyl-CoA (30000 cpm) und
Aufschlusspuffer (ad. 1000 µl, 50 mM Tris pH 7.3, 50 mM KCl, 1mM EDTA) inkubiert. Die Reaktion wurde
durch Zugabe von 2 ml methanolischer KOH (3 M) abgebrochen. Die Fettsäureester wurden für 5 h bei 95°C
hydrolysiert. Anschließend wurden die Proben mit Salzsäure (5 M) angesäuert. Die Fettsäuren wurden dreimal
mit Petrolether extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Essigsäure (1 M) gewaschen, im Luftstrom
eingeengt und im Scintillationszähler vermessen.
In Abb. 36 ist der Einbau von [2]-14C-Malonsäure in langkettige Fettsäuren in Abhängigkeit
von der eingesetzten Proteinmenge unter ansonsten gleich bleibenden Bedingungen
abgebildet. Man sieht, dass unter den gewählten Bedingungen der Malonsäure-Einbau bis zu
einer Proteinmenge von 100 µg direkt proportional zur eingesetzten Proteinmenge war. Daher
wurde für die weiteren Versuche eine Proteinmenge von 100 µg pro Ansatz festgelegt.
2.3.3.2.1.2 Festlegung der für den Radio-FAS-Test optimalen Reaktionszeit
Die optimale Reaktionszeit sollte im Interesse eines hohen Radioaktivitäts-Einbaus möglichst
lang, aber gleichzeitig noch so kurz sein, dass der Substratverbrauch während der Reaktion
die Substratsättigung des Enzyms nicht verringerte. Daher sollte im Untersuchungszeitraum
ERGEBNISSE 65
auch der Einbau von [2]-14C-Malonsäure proportional zur Inkubationszeit sein. Entsprechend
dem vorhergehenden Versuch zur Ermittlung der optimalen Enzymmenge wurden hier die
Inkubationszeiten unter Konstanthaltung der übrigen Parameter variiert.
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 10 20 30 40 50 60
Inkubationszeit [min]
Einb
au v
on M
alon
yl-C
oA
in la
ngke
ttige
Fet
tsäu
ren
[cpm
]
Abb. 37: Zeitabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren.
100 µg Rohextrakt der Wildtyp-Hefe (BY4742) wurden unter den in Abb. 36 beschriebenen Bedingungen für die
angegebenen Zeiten bei 30°C inkubiert.
Abb. 37 zeigt, dass die Einbaurate bis zu einer Inkubationszeit von 30 min eine befriedigende
Linearität aufweist. Daher wurde für die weiteren Versuche eine Inkubationszeit von 30 min
festgelegt.
2.3.3.2.2 Messung der spezifischen Aktivität von gereinigter Fettsäuresynthase aus
den in Abb. 35 aufgeführten Mutanten
In einer ersten Versuchsreihe wurden der FAS-Komplex aus Wildtypzellen und aus den
Mutanten fas1-268, fas2-469 und fas-1095 entsprechend dem in Material und Methoden
beschriebenen Reinigungsprotokoll isoliert. Danach wurde die spezifische FAS-Aktivität der
gereinigten Enzyme mit Hilfe des üblichen optischen FAS-Tests bestimmt (Tab. 12). In einer
zweiten Versuchsreihe wurde die FAS-Aktivität nach dem Zellaufschluss direkt im
Rohextrakt mit dem radiometrischen Test bestimmt. Die dabei festgestellten und auf den
ERGEBNISSE 66
Proteingehalt des Rohextraktes bezogenen Aktivitätswerte sind ebenfalls in Tab. 12
aufgeführt.
Tab. 12: Spezifische FAS-Aktivitäten des gereinigten FAS Komplexes (optischer Test) und des
Rohextraktes (radiometrischer Test) von Wildtyp Hefe und von verschiedenen Mutanten.
Einzelheiten der verwendeten Tests sind in Material und Methoden beschrieben. (n. gem. = nicht gemessen)
Enzym
FAS-Aktivitäten
Gereinigte FAS
[mU/mg]
Rohextrakt
[cpm/(min·mg)]
Wildtyp 1932 (100 %) 2173 (100 %)
fas1-268 29 (1,5 %) 1344 (61,8 %)
fas2-469 n. gem. 892 (41,0 %)
fas2-438 66 (3,4 %) 12 (0,6 %)
fas2-385 n. gem. 20 (0,9 %)
fas-644 n. gem. 108 (5,0%)
fas-1095 224 (11,6 %) 65 (3,0%)
Die spezifischen Aktivitäten der gereinigten Mutantenenzyme waren im Vergleich zum
Wildtypenzym alle sehr niedrig, was mit dem Wachstumsverhalten der Zellen in Fettsäure-
freiem Medium gut korrelierte. In Übereinstimmung mit ihrem deutlich messbaren,
schwachen Wachstum ohne Fettsäuren enthält die Mutante fas-469 ein FAS-Enzym, das noch
eine mittlere Restaktivität aufwies. Der relativ hohe Wert beim radiometrischen Test dieser
Mutante (ca. 42% des Wildtyps) stimmte somit mit dem vergleichsweise guten Restwachstum
der Mutanten in YPD-Medium überein. Anderseits zeigte die Mutante fas1-1095 in Abb. 35
ebenfalls ein schwaches, Fettsäure-unabhängiges Wachstum, enthielt aber ein FAS-Enzym
mit nur ca. 10% Restaktivität. Vergleicht man die Aktivitätswerte, die einmal mit dem
gereinigten Komplex und im anderen Fall mit dem Rohextrakt frisch aufgeschlossener Zellen
erhalten wurden miteinander, so beobachtet man bei der Mutante fas1-268 eine überraschende
Diskrepanz, was den prozentualen Abfall der FAS-Aktivität im Rohextrakt einerseits und
andererseits beim gereinigten Enzym betraf, beides Mal im Vergleich zu den entsprechenden
Werten des Wildtyps. Während bei den anderen untersuchten Mutanten die Aktivität von
Zellextrakt und gereinigtem Enzym auf prozentual vergleichbare Restwerte abgesunken
waren, war bei der Mutante fas1-268 die Aktivität der reinen FAS zwar auch auf den bei der
Mutante durchaus üblichen Wert von 1,5 Prozent der Aktivität von Wildtyp-FAS abgesunken,
ERGEBNISSE 67
im Zellextrakt befanden sich jedoch noch über 60% der FAS-Aktivität von Wildtypzellen
(Tab. 12). Dieser hohe Wert stand im deutlichen Gegensatz zu der Tatsache, dass die Mutante
fas1-268 sich in ihrem Wachstumsverhalten (praktisch kein Wachstum auf Fettsäure-freiem
Medium) von den Mutanten ohne nennenswerte FAS-Aktivität nicht erkennbar unterschied
(vgl. Abb. 35).
Die einfachste Erklärung für die unterschiedlichen FAS-Aktivitäten der Mutante fas1-268 im
Rohextrakt und beim gereinigten Enzym bestand in der Annahme eines durch die Mutation
besonders labilisierten FAS-Proteins, das im Rohextrakt noch partiell aktiv war, diese
Aktivität jedoch während der Enzymreinigung durch zunehmende Denaturierung rasch verlor.
Diese Deutung sollte durch die im Folgenden beschriebenen Versuche untermauert werden.
2.3.3.3 Untersuchung an der Mutante fas1-268
2.3.3.3.1 Untersuchung der FAS-Aktivität der Mutante fas1-268 während der
Aufreinigung des FAS-Komplexes
Um die spezielle Labilität des FAS-Proteins der Mutante fas1-268 im Verlauf der
Enzymanreicherung zu überprüfen, wurde die Fettsäuresynthase aus Wildtyphefe (BY4742)
und aus der Mutante fas1-268 isoliert und die Akivitätsausbeuten für beide Enzyme auf jeder
Reinigungsstufe miteinander verglichen.
Die FAS-Aktivitäten beider Hefestämme wurden nach jedem Reinigungsschritt ermittelt. Für
beide Enzympräparationen wurde von der gleichen Zellmenge (380g) ausgegangen und alle
Reinigungsschritte wurden unter gleichartigen Bedingungen durchgeführt. Protein und
Enzymaktivitätstests wurden mit identischen Probenmengen durchgeführt. Die gemessenen
spezifischen und Gesamtaktivitäten beider Enzyme auf verschiedenen Stufen des
Reinigungsprozesses sind in Abb. 38 aufgeführt.
ERGEBNISSE 68
0
20
40
60
80
100
1. AmmoniumsulfatFraktionierung
2. AmmoniumsulfatFraktionierung
Saccharose-Gradient
(Spitzenfraktion)
Ges
amta
ktiv
ität [
U]
A
0
50
100
150
200
1. AmmoniumsulfatFraktionierung
2. AmmoniumsulfatFraktionierung
Saccharose-Gradient
(Spitzenfraktion)
spez
ifisc
he A
ktiv
ität [
mU
//mg]
X
2000
29,5 %15,4 %
4,2 %
100 %
100 %
100 %
B
Abb. 38: Gesamtaktivität (A) und spezifische Aktivität (B) von FAS-Präparationen aus Wildtyp Hefe ( )
und aus der Mutante fas1-268 ( ) während der Aufreinigung.
Je 380g Wildtyp und fas1-268 Hefezellen wurden in 400ml Aufschlusspuffer suspendiert, durch Schütteln mit
Glasperlen aufgeschlossen und anschließend die FAS-Proteine nach dem in Material und Methoden
beschriebenen Verfahren angereichert. Aufgeführt sind jeweils die Fraktionen, welche bei der Anreicherung von
Wildtyp-FAS den FAS-Komplex enthalten. In A sind die gemessenen Gesamtaktivitäten abgebildet, während in
B die gemessenen spezifischen Aktivitäten angegeben sind. In B wurde zusätzlich die Mutanten-Aktivität jeder
Fraktion mit der entsprechenden Wildtyp-Aktivität verglichen.
ERGEBNISSE 69
Man sieht, dass die spezifische Aktivität des Mutantenenzyms während der Aufreinigung im
Gegensatz zum Wildtypenzym (6fach vs. 44fach) kaum zunimmt (Abb. 38B).
Dementsprechend sinkt die FAS-Gesamtaktivität während der Reinigung beim Mutanten-
Enzym wesentlich rascher ab als beim Wildtyp-Enzym (Abb. 38A). Daraus geht hervor, dass
der mutierte FAS Komplex während der Aufreinigung in der Tat wesentlich rascher
inaktiviert wird als das Wildtyp-Enzym. Demnach handelt es sich bei dem Stamm fas1-268
um eine FAS-Mutante, bei der das Enzym weniger durch die Mutation als solche inaktiviert
wird, sondern vielmehr seine Inaktivierung vor allem dadurch erfährt, dass das Enzymprotein
sich verhältnismäßig rasch von der zunächst noch aktiven in eine inaktive Konformation
umlagert. Normalerweise falten sich mutierte Proteine gleich von Anfang an in der inaktiven
Struktur, oder aber die Umwandlung in aktive Folgestrukturen geht so rasch vonstatten, dass
sie sich der üblichen experimentellen Beobachtung entzieht.
2.3.3.3.2 Gaschromatische Untersuchung des Fettsäuremusters in den Lipiden der
Mutante fas1-268
Um Aufschluss über die Folgen einer gedrosselten Fettsäurebiosynthese-Rate auf die Lipid-
Zusammensetzung der Hefezelle zu gewinnen, wurde eine gaschromatographische Analyse
der in den fas1-268 Lipiden enthaltenen Fettsäuren durchgeführt. Dazu wurde die Mutante in
500 ml Fettsäure-freiem YPD Medium angezüchtet. Die in diesem Medium nur sehr schlecht
wachsende Kultur (vgl. Abb. 35) wurde für 24h bei 30°C wachsen gelassen. Die Zelldichte
nahm dabei von 0,8 auf 1,1 OD600 zu. Der als Kontrolle ebenfalls angezüchtete Wildtyp
wurde bei einer optischen Dichte von 1,3 OD600 geerntet. Die Zellen wurden dann durch
Zentrifugation geerntet und mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen. Für die Extraktion
der Fettsäuren wurden die Zellen lyophilisiert und mit methanolischer HCl (2M) für 5h bei
95°C hydrolysiert.
ERGEBNISSE 70
Det
ekto
rsig
nal
5 10 15 20
Retentionszeit (min)
A
Det
ekto
rsig
nal
5 10 15 20
Retentionszeit (min)
B
Abb. 39: GC-Analyse der aus Wildtyp-Hefe (A) und aus der Mutante fas1-268 (B) gewonnenen Fettsäure-
Methylester.
ERGEBNISSE 71
Die anschließende gaschromatographische Analyse der Fettsäure-Methylester ist in Abb. 39B
gezeigt. Als Vergleich diente eine Probe, die nach demselben Verfahren aus Wildtypzellen
(BY4742) gewonnen worden war (vgl. Abb. 39A).
0
10
20
30
40
50
60
12:0 14:0 16:0 + 16:1
18:0 + 18:1
26:0 26:OH
Ant
eil a
n G
esam
tfetts
äure
n [%
]
Abb. 40: Zusammensetzung der in den Lipiden von Wildtyp ( ) und fas1-268 ( ) Zellen enthaltenen
Fettsäuren.
Angaben in Prozent bezüglich der Summe aller abgebildeten Fettsäuren. Einzelheiten der Herstellung der
Fettsäuremethylester aus den Hefe-Lipiden sind in Material und Methoden beschrieben.
Beim Vergleich der Fettsäuremuster der beiden Stämme (Abb. 40) fällt auf, dass die Mutante
fas1-268 praktisch gleich viel 16:0- und Hydroxy-26:0-Fettsäuren bildet wie der Wildtyp. Im
Gegensatz dazu enthält sie wesentlich weniger 18:0-Fettsäuren als der Wildtyp. Solche
Schwankungen ebenso wie die beobachteten Variationen im Gehalt an 12:0 und 14:0-
Fettsäuren beobachtet man nicht selten bei unterschiedlichen Hefekulturen, ohne dass es
dadurch zu physiologischen Unterschieden kommt. Bemerkenswerter ist dagegen der
ungewöhnlich hohe Gehalt an der normalerweise seltenen überlangen Fettsäure 26:0. Mit
einem Anteil von etwa 15% an den Gesamtfettsäuren bildet die Mutante etwa siebenmal so
viel 26:0 Fettsäure wie der Wildtyp. Diese Steigerung des Gehalts an überlangen Fettsäuren
könnte entweder mit deren reduzierter Weiterverwertung oder aber mit einer gesteigerten
VLCFA-Synthese in der Mutante zusammenhängen. So könnte auf Grund der reduzierten
FAS-Aktivität in der Mutante die Elongase eventuell auf einen größeren Malonyl-CoA Pool
ERGEBNISSE 72
zurückgreifen und folglich auch mehr überlange Fettsäuren bilden. Ein solcher
Zusammenhang würde bedeuten, dass die VLCFA-Synthese normalerweise durch das
Malonyl-CoA Angebot limitiert wird und die Fettsäuresynthase bei der Konkurrenz um
dasselbe Substrat in Wildtypzellen der effizientere Verwerter ist.
2.3.3.3.3 Untersuchung der in vitro FAS-Produkte im Rohextrakt der Mutante fas1-
268 und des Wildtyps BY4742
Der Rohextrakt der Mutante fas1-268 hatte im radiometrischen FAS-Test eine hohe
Einbaurate von [2]-14C-Malonyl-CoA in Petrolether-extrahierbare Fettsäuren aufgewiesen
(vgl. Tab. 12). Um festzustellen, ob es sich bei diesem Einbau um eine hohe Restaktivität der
fas1-268 Fettsäuresynthase handelte, die zur geringen Aktivität des gereinigten Enzyms im
Widerspruch stand, wurden die im Rohextrakt gebildeten Produkte mittels Radio-HPLC
Analyse untersucht. Die Befunde, dass die Mutante fas1-268 auf die Zufuhr exogener
Fettsäuren angewiesen war (vgl. Abb. 35A) und dass das gereinigte Enzym praktisch inaktiv
war, sprachen eigentlich gegen die Annahme einer effizienten Eigensynthese langkettiger
Fettsäuren im Zellextrakt der Mutante. Denkbar war auch, dass der starke Malonyl-CoA
Einbau auf eine erhöhte Elongase-Aktivität hindeutete, oder dass nicht die notwendigen
langkettigen, sondern vor allem physiologisch nutzlose mittel- oder kurzkettige Fettsäuren
synthetisiert wurden. Für die Analyse wurden Rohextrakte der Mutante fas1-268 und des
Wildtyps (BY4742) mit [2]-14C-Malonyl-CoA unter den Versuchsbedingungen des
radiometrischen FAS-Tests inkubiert. Die dabei gebildeten radioaktiv markierten Fettsäuren
wurden nach saurer Hydrolyse (2M methanolische HCl, 5h) der zellulären Lipide mit
Petrolether extrahiert und zu p-Bromphenacylestern derivatisiert. Anschließend wurden diese
Ester durch RP-HPLC aufgetrennt und mit Hilfe von Referenzverbindungen charakterisiert.
Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigt Abb. 41. Man sieht, dass mit dem Wildtyp-Extrakt –
wie für die FAS-Reaktion erwartet - vor allem die Produkte Palmitinsäure und Stearinsäure
gebildet werden (Abb. 41A). Auch mit dem Mutantenextrakt sind diese beiden Fettsäuren die
prominentesten Produkte. Als zusätzliche Produkte (ca. 40%) treten hier aber auch noch
niedrigere Homologe wie Myristinsäure, Laurinsäure und Caprinsäure in Erscheinung (Abb.
41B). Eine derartige Verschiebung des Produktspektrums zu kürzeren Kettenlängen ist bei der
Fettsäuresynthase bekannt in Fällen, bei denen entweder ein Überangebot an Acetyl-CoA
vorliegt (das dürfte hier unwahrscheinlich sein) oder das Aktivitätsverhältnis der FAS-
ERGEBNISSE 73
Teilenzyme Palmitoyl-Transferase zu Ketoacyl-Synthase zugunsten des ersteren Teilenzyms
verschoben ist.
0
200
400
600
800
1000
20 30 40 50 60 70 80
Zeit [min]
Mal
onyl
-CoA
Ein
bau X
[cpm
]
A
0
200
400
600
800
1000
20 30 40 50 60 70 80
Zeit [min]
Mal
onyl
-CoA
Ein
bau X
[cpm
]
B
0
0,2
0,4
0,6
20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0
Zeit [min]
Abs
orpt
ion
[A25
4] X
X
10:0
12:014:0
16:0
18:0
C
Abb. 41: Radio-HPLC Analyse der in vitro Fettsäuresynthese-Produkte von Rohextrakten aus Wildtyp
(A) und fas1-268 (B) Zellen.
Die Auftrennung eines definierten Fettsäure p-Bromphenacylester Gemischs ist in (C) gezeigt. Einzelheiten zur
Probenvorbereitung und Durchführung der Analyse siehe Material und Methoden.
ERGEBNISSE 74
Grundsätzlich wäre allerdings auch eine mutationsbedingte Aktivitäts-Erhöhung oder eine
Spezifitäts-Veränderung des Teilenzyms Palmitoyl-Transferase denkbar. Die Spezifitäts-
Veränderung könnte z.B. in der Umwandlung der Transesterase- in eine Hydrolase-Aktivität
oder in einer Verschiebung der Substratspezifität zu kürzeren Kettenlängen bestehen. Alle
genannten Effekte würden die Effizienz der Synthese von Palmitin- und Stearinsäure
beeinträchtigen und könnten somit den Defekt-Phänotyp der Mutante - zumindest im Prinzip -
erklären.
Die zuletzt genannten Überlegungen zu einer veränderten Rolle des Teilenzyms Palmitoyl-
Transferase werden durch frühere biochemische und genetische Befunde von A. Knobling
[KNO] gestützt. Danach ist in der Mutante fas1-268 die Schlußreaktion der Fettsäuresynthase,
die durch das Teilenzym Malonyl/Palmitoyl-Transferase katalysiert wird, defekt (nur noch
2% Wildtyp-Aktivität). Als Folge der Malonyltransferase-Inaktivierung könnte die
Ketoacylsynthase und damit die Kettenverlängerung gebremst werden.
Die in Abb. 41 gezeigten Befunde stehen im Einklang mit den Ergebnissen der
gaschromatographischen Analyse der in den fas1-268 Lipiden enthaltenen Fettsäuren. Auch
hier enthielten die Mutanten-Lipide einen höheren Anteil an Laurin- und Myristinsäure als die
entsprechenden Lipide des Wildtyps (vgl. Abb. 42).
2.3.3.3.4 Messung der Fettacyl-CoA Spiegels im Zellextrakt von Hefezellen
Der Ausfall der Palmitoyl-Transferase in der Mutante fas1-268 sollte zu einem Abfall des
zellulären Palmitoyl-CoA Spiegels führen. Palmitoyl-CoA ist das Substrat verschiedener
essentieller Fettacylierungsreaktionen in Hefe. Um den möglichen Effekt der fas1-268
Mutation auf diese Reaktionen abschätzen zu können, sollte in den im folgenden Abschnitt
beschriebenen Versuchen versucht werden, den Palmitoyl-CoA Spiegel in Wildtyp- und
Mutantenzellen zu bestimmen.
Die Auftrennung unterschiedlicher Fettacyl-CoA Thioester kann durch „Reversed Phase“-
HPLC an einer unpolaren Säule erfolgen [ROD]. Die von der Säule eluierten Fettacyl-CoA
Ester können aufgrund der in ihrem CoA-Teil enthaltenen Puringruppe im UV-
Flußzellendetektor bei 260 nm nachgewiesen werden. Da Hefe keine ungeradzahligen
Fettsäuren bildet, kann Margaroyl-CoA (17:0-CoA) als interner Standard für die spätere
ERGEBNISSE 75
Quantifizierung der Ester bei der Auftrennung eingesetzt werden. Dieser Standard wird vor
der Extraktion dem jeweiligen Reaktionsansatz beigefügt. Dadurch wird sichergestellt, dass er
während der Extraktion den gleichen experimentellen Bedingungen ausgesetzt ist wie die in
vivo gebildeten Thioester. Dadurch wird es möglich, evtl. Verluste während der Aufarbeitung
bei der Berechnung zu berücksichtigen. Die RP-HPLC-Trennung eines definierten Gemischs
aus Palmitoyl-CoA, Margaroyl-CoA und Stearoyl-CoA ist in Abb. 42 dargestellt. Man sieht,
dass das angewandte Verfahren sowohl für die Auftrennung als auch für die Quantifizierung
langkettiger Fettacyl-CoA Ester geeignet ist.
0
0,2
0,4
0,6
20 30 40 50 60
Zeit[min]
A25
4
C16-CoA
C17-CoA
C18-CoA
Abb. 42: Auftrennung von Palmitoyl-CoA, Margaroyl-CoA und Stearoyl-CoA durch RP-HPLC.
Insgesamt wurden jeweils 10nmol Palmitoyl-, Maragaroyl- und Stearoyl-CoA aufgetragen und entsprechend den
Laufbedingungen (Material und Methoden) an einer Prontosil C18-SH 5 µm Säule (250 mm x 4,6 mm inkl.
Vorsäule, Fa. Bischoff) durch RP-HPLC aufgetrennt.
In der Literatur sind verschiedene Verfahren für die Extraktion von Fettacyl-CoA Estern aus
biologischem Material beschrieben [MAN, MAG, ROD]. In dieser Arbeit wurden davon die
folgenden Verfahren auf ihre Anwendbarkeit für ein Hefe-Zellextrakt näher untersucht.
1. Eine von Mancha et al. [MAN] beschriebene Methode zur quantitativen Analyse der
Fettacyl-CoA Zusammensetzung eines komplexen Lipid-Gemischs basiert darauf,
dass zunächst die freien Fettsäuren und unpolaren Lipide mittels Petrolether-
ERGEBNISSE 76
Extraktion aus einer isopropanolhaltigen, wässrigen Lösung abgetrennt werden.
Danach wird fettacyliertes Acyl-Carrier-Protein in Gegenwart von Ammoniumsulfat
mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch ausgeschüttelt und schließlich die Fettacyl-
CoAs von anderen polareren Lipiden durch selektive Adsorption an neutralem
Kieselgel abgetrennt.
2. Eine weitere Methode zur quantitativen Analyse des Fettacyl-CoA Spiegels in
Kaninchen-Zellen (Nierenrinde) wurde von Maningo et al. [MAG] entwickelt. Hierbei
werden zunächst die Fettacyl-CoA Ester durch ein Choroform/Methanol-Gemisch
mehrmals extrahiert. Anschließend werden Chloroform und Kaliumphosphatpuffer
zugegeben und vermischt. Die obere, organische Phase, welche die Fettacyl-CoA
Ester enthält, wird anschließend mit Chloroform gewaschen. Die Methanol-haltige
Phase wird abschließend unter einem Stickstoffstrom eingeengt.
3. Eine dritte Methode zur quantitativen Analyse des Fettacyl-CoA-Spiegels in
Rattenleber wurde von Rosendal et al. [ROD] beschrieben. Hierbei werden zunächst
die Lipide durch eine Dreiphasenextraktion in einem Chloroform/Methanol/Wasser
Gemisch entfernt. Die langkettigen Fettacyl-CoA-Ester, welche sich hier im
Gegensatz zu dem von Maningo et al. [MAG] beschriebenen Verfahren in der
proteinhaltigen Interphase befinden, werden nach der Abtrennung von Ober- und
Unterphase durch ein Methanol / Ammoniumacetatpuffer-Gemisch extrahiert. Das
Extrakt wird mit der vorherigen, oberen Phase, welche die kurzkettigen Fettacyl-CoA-
Ester enthält, vereinigt und in einem Stickstoffstrom eingeengt.
In allen drei Fällen wurden bei der Nacharbeitung der obigen Verfahren vor dem
Zellaufschluss 10nmol Margaroyl-CoA als interner Standard den Hefezellen beigefügt.
Außerdem wurde die Zellaufschluss-Methode dem jeweiligen Aufschluss-Milieu
entsprechend variiert. Während der Glasperlenaufschluss von Hefezellen in wässrigem
Medium (Ansatz 1) nur eine relativ kurze Aufschlusszeit (5-10 min) benötigt, erforderte der
vollständige Aufschluss von Hefe in organischen Lösungsmitteln (Ansatz 2 und 3) eine
deutlich längere Zeit (30-60 min). Die Analyse der Extrakte nach allen geschilderten
Extraktionsverfahren, führte zu keinem Nachweis messbarer Mengen Acyl-CoA bei der RP-
HPLC Analyse. Selbst ein Signal für das als Standard zugesetzte Margaroyl-CoA konnte
nicht entdeckt werden. Auch eine veränderte Zellaufschlussmethode (Mikrodismembrator-
ERGEBNISSE 77
Aufschluss tiefgefrorener Zellen) oder ein momentanes Abtöten von aus der Kultur
entnommenen Hefezellen durch Trifluoressigsäure bzw. Perchlorsäure (Verhinderung
enzymatischer Abbaureaktionen während der Aufarbeitung) führte zu keinen besseren
Ergebnissen. Die Versuche wurden daher an dieser Stelle abgebrochen und die Fragestellung
nicht weiter verfolgt.
DISKUSSION 78
3 Diskussion
In einem ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde von mir untersucht, in wieweit die sechs
katalytischen Zentren des hexameren Fettsäuresynthase Komplexes der Hefe jeweils einzeln
und unabhängig nebeneinander aktiv sind. Die Frage war nicht trivial und eine Reihe früherer
Befunde aus unserem und anderen Laboratorien deuteten auf ein komplexes Problem hin. So
hatten Schuster et al. [SCU] beobachtet, dass einerseits zwar alle sechs Reaktionszentren des
(αβ)6 Hexameren am Reaktionsgeschehen des arbeitenden Komplexes gleichberechtigt
teilnehmen, anderseits aber nur 2-3 der 6 chemisch gleichartigen Substratbindestellen im nicht
arbeitenden Komplex mit den Substraten Acetat oder Malonat acylierbar waren. Auch der
Inhibitor Iodacetamid vermochte nach Befunden von Oesterhelt et al. [OES] nur 3 der 6
Ketosynthase-Zentren im Komplex zu alkylieren. Diese Daten sprachen dafür, dass während
des Reaktionsgeschehens die einzelnen Monomeren im (αβ)6 Hexameren konformationelle
Strukturänderungen erfahren, auf Grund derer sie für bestimmte Substrate oder
Reaktionszwischenprodukte entweder spezifisch zugänglich oder ihnen gegenüber speziell
abgeschirmt waren. Nachdem eine ähnliche sub-stöchiometrische Acylierung auch bei der
dimeren tierischen FAS beobachtet worden war (S. Smith, persönliche Mitteilung), erschien
es denkbar, dass hier eine generelle Reaktionsweise multimerer FAS-Komplexe deutlich
wurde. Auf der Grundlage der geschilderten Befunde wurde zunächst eine eventuelle
Halbseiten-Aktivität der FAS diskutiert, wonach das reaktive FAS-Enzym ein α2 oder (αβ)2
Dimeres ist, in dem sich zu jedem Zeitpunkt immer nur eines der beiden Monomeren in einer
aktiven und das andere in einer inaktiven Konformation befindet. Diese Hypothese konnte
durch die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse erstmals eindeutig widerlegt werden.
Zumindest für die Acyl-Carrier-Protein Domäne und die an ihr befestigte prosthetische
Gruppe, das Phosphopantethein, konnte von mir gezeigt werden, dass jede der 6
Phosphopantethein-Gruppen im Komplex zu jedem Zeitpunkt einen gleich großen Beitrag zur
Gesamtaktivität des Komplexes liefert. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem bereits
erwähnten Befund, dass im Fettsäuren synthetisierenden FAS Komplex alle 6
Reaktionszentren aktiv sind [SCU]. Auch für tierische FAS konnte vor kurzem gezeigt
werden, dass jede der beiden α-Untereinheiten in diesem dimeren für sich allein funktioniert
und in ihrem Reaktionsmechanismus nicht auf die Kooperation mit der zweiten α-
Untereinheit angewiesen sind. Die Dimeren-Bildung dürfte stattdessen eher eine passive
Struktur-stabilisierende Funktion haben [ZHA].
DISKUSSION 79
Angesichts der autarken Funktionsweise jeder einzelnen FAS Untereinheit gilt es, deren
erstaunliche Fähigkeit zu erklären, selbst zwei weit auseinander liegende, an
entgegengesetzten Enden der multifunktionellen Kette befindliche Domänen miteinander in
Wechselwirkung zu bringen. Eine Antwort hierauf wird letztlich erst die dreidimensionale
Strukturanalyse des FAS-Komplexes und damit die Kenntnis der topologischen Anordnung
der acht verschiedenen Reaktionszentren in einer der 6 Elementarzellen des Komplexes
liefern. Bis vor kurzem schien dieses Ziel in Ermangelung röntgenographischer Strukturdaten
noch in weiter Ferne. S. Jenni et al. [JEN] gelang jedoch kürzlich mit Hilfe der „Vapour
Diffusion“ Technik die Herstellung von monoklinen FAS-Kristallen aus dem Pilz
Thermomyces lanuginosus. Im Gegensatz zur Bäckerhefe besitzt dieser mit Hefe verwandte
Organismus auf Grund seiner Thermostabilität ein FAS-Protein, das trotz grundsätzlich
gleichartiger Struktur wie Hefe-FAS offensichtlich stabiler ist und sich deshalb besser
kristallisieren lies. Die Kristalle eigneten sich zu einer Röntgenkristallstruktur-Analyse und
führten zur Berechnung der Grobstruktur des α6β6 FAS-Komplexes mit einer maximalen
Auflösung von 5Å. Obwohl diese Auflösung nicht ausreichte, um das FAS-Rückgrat über
seine ganze Länge verfolgen zu können, gelang es Jenni et al. dennoch, unter Verwendung der
bekannten dreidimensionalen Strukturen der homologen bakteriellen FAS Einzelenzyme die
meisten katalytischen Zentren innerhalb der dreidimensionalen FAS-Struktur zu lokalisieren.
Lediglich die Position des Acyl-Carrier-Proteins konnte nicht eindeutig festgelegt werden,
was sich wahrscheinlich auf die inhärente Beweglichkeit dieser Domäne zurückführen lässt.
Die jetzt vorliegenden röntgenographischen Daten erlauben ein wesentlich detaillierteres Bild
zur Architektur des hexameren FAS-Komplexes (vgl. Abb. 45A) als dies bisher auf Grund
von elektronenmikroskopischen Bildern möglich gewesen war. Nach diesen Berechnungen ist
der 2,6 MDa große α6β6 FAS-Komplex in zwei Reaktionskammern unterteilt, welche durch
eine zentrale „Radspeichen-Struktur“ voneinander getrennt sind. Jede dieser
halbkugelförmigen Reaktionskammern enthält drei der sechs kompletten Sätze an
katalytischen Domänen, die für den Reaktionszyklus der Fettsäurebiosynthese notwendig
sind. Die Autoren schreiben, dass in jeder der beiden Reaktionskammern drei unscharf
erkennbare interne Strukturen vorliegen, welche die ACP-Domänen darstellen könnten. Diese
Strukturen sind jeweils an einem zentralen Punkt zwischen einem Satz katalytischer Domänen
lokalisiert. Die Entfernungen von diesem Punkt aus zu den angrenzenden aktiven Zentren
liegen zwischen 50 und 70 Å (vgl. Abb. 45 B). Der Phosphopantethein-Rest ist daher mit
einer Länge von nur 18 Å zu kurz, um allein als „schwingender Arm“ die Acyl-Intermediate
zu den einzelnen aktiven Zentren zu transportieren. Statt dessen scheint es wahrscheinlich,
DISKUSSION 80
dass die gesamte ACP-Domäne als „mobiler Träger“ zwischen den einzelnen katalytischen
Domänen hin und her wandert, während der Phosphopantethein-Rest als Lieferant der Acyl-
Intermediate diese in die hydrophoben Taschen der aktiven Zentren hineinreicht (vgl. Abb.
45C).
Abb. 45: Röntgenkristallstruktur eines α6β6 FAS Komplexes und schematischer Reaktionsweg des Acyl-
Carrier-Proteins zu den individuellen katalytischen Domänen [JEN].
(A) Betrachtung des hexameren FAS-Komplexes von außen. Die aktiven Zentren des FAS-Komplexes sind ins
Innere der Reaktionskammern gerichtet. Die verschiedenen Domänen sind durch unterschiedliche Farben
markiert. (B) Hier ist ein Satz der aktiven Zentren abgebildet, der für einen vollständigen Reaktionszyklus
notwendig ist. Um den Einblick in die Reaktionskammer zu gewährleisten, wurde ein Teil der vorderen
Kammer-Wand entfernt. Die Abstände zwischen dem mutmaßlichen Acyl-Carrier-Protein (grüne Punkte) und
den individuellen katalytischen Domänen sind durch rote Verbindungslinien dargestellt. (C) Der vom
Reaktionsmechanismus vorgezeichnete Weg des Acyl-Carrier-Proteins bei der Beförderung von Acyl-
Intermediaten zu den verschiedenen aktiven Zentren ist durch graue Verbindungslinien dargestellt.
A
B C
DISKUSSION 81
Der Austausch von Substraten und Produkten zwischen den einzelnen Reaktionskammern und
der umgebenden Lösung findet wahrscheinlich durch passive Diffusion durch mehrere
Kammer-Öffnungen mit einem Durchmesser von bis zu 25 Å statt. Diese Öffnungen
ermöglichen die Diffusion von kleineren Molekülen, bilden jedoch eine Barriere für
Makromoleküle.
Größere konformationelle Veränderungen der Struktur, welche die Anordnung der
katalytischen Domänen untereinander beeinflussen, werden von den Autoren ausgeschlossen,
da der FAS-Komplex seine nicht-kristallographische Symmetrie bis zu einer Auflösung von 5
Å behält, und da die katalytischen Domänen in Bereichen mit hoher struktureller Dichte
vorliegen. Aufgrund der Strukturanalyse von Jenni et al. [JEN] sind keine Aussagen über die
strukturelle Grundlage der in anderem Zusammenhang feststellten, negativen Kooperativität
des Hefe FAS-Komplexes möglich. Auch die von Oesterhelt et al. [OES] beobachtete
partielle Besetzung von nur 3 der 6 „peripheren“ SH-Gruppen durch den Hemmstoff
Iodacetamid kann durch die Strukturanalyse nicht erklärt werden. Interessanterweise reicht
diese 50 prozentige Alkylierung aus für eine vollständige Inaktivierung der Über-Alles FAS-
Aktivität. Dies könnte eventuell bedeuten, dass zwei im Komplex dimerisierte
Ketoacylsynthase-Zentren geringfügige konformationelle Veränderungen erfahren und
dadurch stets nur eine der beiden peripheren SH-Gruppen zur Verfügung steht.
Die Autoren interpretieren die Kristallstruktur des FAS-Komplexes weiterhin in dem Sinne,
dass jede der drei ACP-Domänen innerhalb einer Reaktionskammer mehrere identische
katalytische Domänen dieser Kammer erreichen kann. Dies würde eine Erklärung für die von
Werkmeister et al. [WER2] beobachtete in vitro Komplementation zwischen unterschiedlich
mutierten FAS-Komplexen liefern. Die zweite diskutierbare Möglichkeit, dass nicht jede ACP
Domäne jedes aktive Zentrum in einer Reaktionskammer erreichen kann, sondern dass die
Intermediate unter den verschiedenen, jeweils fixierten ACP-Domänen weiter gereicht
werden, erscheint nach der in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnissen eher
unwahrscheinlich. In diesem Fall wäre eine einzige aktive, d.h. pantetheinylierte ACP-
Domäne im Zusammenwirken mit zwei nicht-pantetheinylierten ACP-Domänen in derselben
Reaktionskammer zur Erzeugung von FAS-Aktivität nicht ausreichend. Dies ist jedoch der
Fall.
DISKUSSION 82
In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur funktionellen
Identität des Hefegens YBR159w durchgeführt. Die Funktion dieses am
Fettsäureelongationsprozess in Hefe beteiligten Gens hatte bisher nur indirekt auf Grund der
Sequenzähnlichkeit seines Produktes mit verschiedenen bekannten Ketoreduktasen
wahrscheinlich gemacht werden können. In unserem Labor hatte Heidi Rössler [RÖS] mittels
radiometrischer RP-HPLC Analyse gezeigt, dass die Elongase-haltige Membranfraktion einer
∆ybr159w-Mutante in Anwesenheit von [2]-14C-Malonyl-CoA und NADPH aus Stearoyl-
CoA keine überlangen, gesättigten Fettsäuren mehr bilden. Stattdessen wurden zwei zunächst
nicht identifizierbare Intermediate der Fettsäure-Elongation synthetisiert. In Abwesenheit des
Reduktionsmittels NADPH entstand nur noch eines der beiden Intermediate. Daraus ging
hervor, dass es sich hierbei wohl um die durch eine Ketoacyl-Synthase aus Stearoyl-CoA und
Malonyl-CoA gebildete 3-Oxoeicosansäure handeln dürfte. Die durch Reduktion mit NADPH
und einer unspezifischen Reduktase daraus gebildete Hydroxyverbindung kann in vitro nicht
zur Bildung von verlängerten, gesättigten Fettsäuren verwendet werden. Andernfalls hätte die
Mutation ∆ybr159w keinen Phänotyp. Der Grund für den kompletten Ausfall der Elongation
trotz teilweise erhaltener Ketoreduktion dürfte entweder darin liegen, dass es sich bei der
gebildeten Hydroxyverbindung nicht um das Elongase-Zwischenprodukt 3-
Hydroxyeicosansäure handelte, sondern eventuell um ein reduziertes Keton, oder aber dass
die Reduktion nach Ablösung der Intermediate aus dem Elongase-System statt findet, so dass
eine Fortsetzung des Prozesses nicht erfolgt. Für die zuerst genannte Möglichkeit könnte
sprechen, dass die von mir als Referenzsubstanz synthetisierte 3-Oxoeicosansäure sich beim
Vergleich mit der enzymchemisch synthetisierten Zwischenverbindung leider nicht als mit
dieser identisch erwies. Nichtsdestotrotz besitzen beide Substanzen ein sehr ähnliches
Elutionsverhalten bei der RP-HPLC Analyse. Während der Standard, auf Grund seiner
Detektierbarkeit bei 254 nm, mit Sicherheit über eine p-bromphenacylierte Carboxylgruppe
verfügt, kann dies für das durch die Membranfraktion gebildete Intermediat nicht festgestellt
werden. Es besteht daher die Möglichkeit, dass die zunächst gebildete 3-Oxoeicosansäure bei
fehlender Ketoreduktion – sei es auf Grund eines Fehlens von NADPH oder des Defekts der
Ketoreduktase Ybr159p – nicht zur 3-Hydroxyeicosansäure weiterreagiert, sondern auf andere
Weise chemisch modifiziert wurde. So wäre zum Beispiel die Decarboxylierung der 3-
Ketoeicosansäure zum entsprechenden Methylketon denkbar. Die Reduktion dieses
Methylketons durch eine unspezifische Ketoreduktase würde zu einem sekundären Alkohol
führen. Die Identität der im Test gebildeten Verbindung mit einer dieser Substanzen scheint
möglich, wurde von mir aber nicht untersucht. Entsprechende, aus der Referenzsubstanz
DISKUSSION 83
gebildete Folgeprodukte bleiben unentdeckt, da sie weder radioaktiv noch p-bromphenacyliert
sind.
Eine partielle Kompensation des durch den YBR159w-Ausfall bedingten Elongase-Verlustes
war bereits früher mit der mutmaßlichen Elongase-Funktion einer membranständigen FAS-
Fraktion in Zusammenhang gebracht worden (C. Rieck, Dissertation). Die synthetische
Letalität von Elongase / FAS- Doppelmutanten und die durch den FAS-Inhibitor Cerulenin
induzierte Letalität von Elongasemutationen hatten für diese Annahme gesprochen. Um diese
hypothetische Beteiligung der Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren näher
zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit versucht, eine FAS-freie Membranfraktion durch
Waschen der Membranen herzustellen und sie auf ihren eventuellen Gehalt an FAS-Protein zu
untersuchen.. Dabei stellte sich in der Tat heraus, dass ein geringer aber konstanter Anteil des
FAS-Komplexes selbst nach zahlreichen Waschschritten fest an der Membran lokalisiert
bleibt und nicht davon abgewaschen werden kann. Diese membranständige Fettsäuresynthase
war jedoch in vitro inaktiv und weder in der Lage, aus Acetyl-CoA langkettige Fettsäuren
noch aus Stearoyl-CoA überlange Fettsäuren zu bilden. Die Frage einer Beteiligung der
membranständigen Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren blieb somit offen,
da das Enzym durch die Waschschritte und möglicherweise infolge Denaturierung durch das
zugesetzte Detergenz seine Aktivität verloren hatte.
Mit dem Ziel, zellphysiologisch kritische Palmitoylierungsreaktionen wie etwa die Protein-
Palmitoylierung auf diese Weise nachweisen und untersuchen zu können, wurde von mir in
einem dritten Teil der Arbeit versucht, die zelluläre FAS-Aktivität in vivo zu drosseln. Dabei
wurde zunächst untersucht, ob eine subletale FAS-Hemmung eventuell durch kontrollierten
Einsatz des spezifischen Hemmstoffs Cerulenin zu erreichen ist. In diesen Versuchen konnte
von mir zwar gezeigt werden, dass das Wachstum der Hefen durch variable Cerulenin
Konzentrationen unterschiedlich stark gehemmt wird. Die Cerulenin-abhängige
Wachstumsminderung war jedoch schlecht reproduzierbar, da sich der Hemmstoff einerseits
irreversibel an die Fettsäuresynthase bindet und andererseits seine Hemmwirkung in
wässrigem Medium rasch verliert. Der Hemmstoff war somit auf Grund seiner zeitlich
abnehmenden Verfügbarkeit nicht in der Lage, den zellulären FAS-Spiegel Dosis-abhängig in
reproduzierbarer Weise zu erniedrigen. Daher wurde in einer zweiten Versuchsreihe ein
anderer Ansatz gewählt, um Zellen mit einem erniedrigten FAS-Spiegel zu erhalten. Dabei
wurden fas-Mutanten untersucht, die in Fettsäure-freiem Medium ein reduziertes, aber noch
DISKUSSION 84
erkennbares Wachstum aufwiesen, die anderseits aber in Gegenwart von Fettsäuren ein
uneingeschränktes, Wildtyp-artiges Wachstum zeigten. Die meisten der ca. 2000 von mir
überprüften fas-Mutanten zeigten in Fettsäure-freiem Medium keinerlei Wachstum. Lediglich
sechs Mutanten wurden identifiziert, die den geforderte „leaky“ Phänotyp besaßen. Durch
einen speziell entwickelten radiometrischen FAS-Test konnte die FAS-Aktivität sehr
empfindlich auch in den Rohextrakten der Mutanten gemessen werden. Daneben wurde mit
dem üblichen optischen Test auch die spezifische Aktivität der gereinigten FAS-Komplexe
der Mutanten untersucht. Mit nur einer Ausnahme ergab sich in allen Fällen eine gute
Übereinstimmung zwischen dem in vivo reduzierten Wachstum und der durch Mutation
verminderten FAS-Aktivität. Der Defekt war dabei in guter Übereinstimmung sowohl im
Zellextrakt als auch beim gereinigten FAS-Komplex messbar. Im Gegensatz zu diesen
Mutanten stand das Verhalten der Mutante fas1-268. Sie besaß, trotz eines kaum
nachweisbaren Wachstums in Fettsäure-freiem Medium, eine sehr hohe FAS-Aktivität im
Zellextrakt. Erst der gereinigte fas1-268 FAS-Komplex besaß dem Wachstumsverhalten
entsprechend keine Aktivität. Weiter konnte von mir gezeigt werden, dass die zunächst
beträchtliche FAS-Aktivität im Rohextrakt der Mutante fas1-268a auf Grund einer
ungewöhnlich hohen Labilität des mutierten FAS-Proteins während der Aufreinigung verloren
ging. Bemerkenswert bleibt bei dieser durchaus nicht ungewöhnlichen Mutanten-
Charakteristik allerdings, dass die hohe FAS-Aktivität im Rohextrakt in deutlichem
Widerspruch zu dem geringen Wachstum der Zellen in Fettsäure-freiem Medium steht. Es
kann spekuliert werden, ob eventuell eine bisher nicht bekannte Funktion von FAS,
unabhängig von der offensichtlich kaum betroffenen Fettsäurebiosynthese-Aktivität, selektiv
geschädigt ist. Denkbar wäre in diesem Zusammenhang eine Transferase-Aktivität, welche
die direkte Übertragung von Palmitoyl-Resten von Palmitoyl-FAS z.B. auf ein bestimmtes
Zielprotein durchführt. Derartige direkte Transacylierungen unter Umgehung einer Palmitoyl-
CoA Zwischenverbindung sind von anderen FAS-Systemen bekannt [WAT1, WAT2]. In
Einklang mit der Annahme eines derartigen Transacylase-Defektes steht der Befund von
Knobling et al. [KNO], dass die Mutante fas1-268 zu einer Mutantengruppe gehört, in der
speziell die Palmitoyl-Transacylase Teilaktivität durch Mutation geschädigt ist. Das in vivo
gebildete Fettsäuremuster der Mutante fas1-268 zeigte eine verstärkte Bildung sowohl der
kürzerkettigen Fettsäuren Laurin- und Myristinsäure als auch der überlangen Fettsäure
Cerotinsäure. Die verstärkte Bildung von Laurin- und Myristinsäure durch den FAS-Komplex
dürfte auf der ineffizienten Kettenverlängerung durch die Mutanten-FAS beruhen, wodurch es
zu einer vorzeitigen Abspaltung der „unfertigen“ kürzerkettigen Säuren kommt. Die Bildung
DISKUSSION 85
der überlangen Fettsäure Cerotinsäure wird nicht durch FAS, sondern durch die Elongase
durchgeführt. Die Elongase konkurriert mit dem FAS-Komplex um den verfügbaren Malonyl-
CoA Pool und kann in der Mutante auf Grund deren reduzierter FAS-Aktivität wohl vermehrt
auf diesen Pool zurückgreifen. Die darüber hinaus mit dem Aktivitäts-reduzierten FAS-
Mutanten geplanten Versuche, wie etwa die Messung der zellulären Palmitoyl-CoA Spiegel
und eine eventuelle Beeinträchtigung der spezifischen Protein-Palmitoylierung konnten von
mir nicht mehr durchgeführt werden, da die Bestimmung des zellulären Fettacyl-CoA
Spiegels sich in meinen Händen unerwartet hartnäckig einer experimentellen Beherrschung
entzog.
MATERIAL UND METHODEN 86
4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Arbeitsgeräte
Autoklav A5; Fa. Webeco
Brutschränke VI 5050 EK und KKB 500, Fa. Heraeus Christ
Eismaschine Fa. Scotsman
Elektroblot Semi-Dry-Blotter, Fa. Labortechnik
Gaschromatograph HP-5890 mit HP-5 (crosslinked 5% Ph Me silicone,
0.2mm x 25 m); Fa. Hewlett-Packard (Agilent)
Gefriertrockner Alpha 1–2; Fa. Christ
Geltrockner SE 540, Fa. Hoefer
HPLC Anlage mit
Radiodetektor
Controller 2152, Pumpe 2150, Niederdruck Gradientenmischer
Ultragrad 11300, UV-Detektor Uvicord SD 2158; Fa.
Pharmacia-LKB
HPLC Säule Prontosil 120-5-C18-SH 5.0 µm (250x4.0mm inkl. Vorsäule);
Fa.Bischoff
Flussscintillationszähler Radiomatic 500TR mit Solarscint 400µl; Fa. Packard
Scintillationszähler Tri-Carb 1500; Fa. Packard
Elektrophoresekammer Proteingel: 45-1010-I; Fa. Peqlab
Präzisionspipetten Pipetman P20, P200, P1000, Fa. Gilson
Geltrockner SE 540; Fa.Hoefer
Magnetrührer Fa. Heidolph
Netzgerät EPS 500/400; Fa. Pharmacia-LKB
pH-Meter 511; Fa. Knick
Rolltrommel TC5; Fa. New Brunswick
Schüttler G25, G10; Fa. New Brunswick
Spektralphotometer Typ Ultraspec II und III, Fa LKB, Typ Ultraspec Plus, Fa.
Pharmacia, Typ 1101 M mit Kompensationsschreiber Typ 4412,
Fa. Eppendorf
Thermoblock Fa. Liebisch
MATERIAL UND METHODEN 87
Vortex Fa. Heidolph
Waagen Typ 801 und 1518; Fa. Sartorius
Wasserbad Fa. Julabo
Tischzentrifuge Biofuge Pico; Fa. Heraeus
Zentrifuge Superspeed RC-5B; Fa. Sorvall
Ultrazentrifuge L7-55; Fa. Beckmann
Zentrifugenrotoren SW28, Ti45, Ti60, Ti45; Fa. Sorvall
4.1.2 Sonstiges Arbeitsmaterial
Chromatographiepapier 3 MM Papier; Fa. Whatman
Glasperlen Durchmesser 0.2 mm; Fa. Sigmund Lindner
Membranen Nitrocellulosemembran (NCV4/NCV2); Fa. Schleich & Schüll
Papierfilter Typ Nr.1; Fa. Whatman
GB004; Fa. Schleicher&Schüll
Pasteurpipetten Fa. Fortuna
Petrischalen Fa. Greiner
Röntgenfilme X-ray film/medical; Fa. Konica Minolta
Rundfilter Typ HA (Porendurchmesser 0.45 µm); Fa. Millipore
4.1.3 Chemikalien
4.1.3.1 Allgemeine Chemikalien und Lösungsmittel
Käufliche Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt ist, von Sigma-Aldrich bzw.
Merck bezogen und ohne weitere Vorbehandlung eingesetzt.
4.1.3.2 Spezielle Chemikalien und Lösungsmittel
Fa. Applichem Leupeptin, Pepstatin
Fa. Fluka PMSF, Coomassie Brilliant Blue, Gylcin, DMSO
Fa. Gibco-BRL Bactopepton, Trypton, Hefeextrakt, Yeast Nitrogen Base
Fa. Grünenthal Ampicillin
Fa. Qiagen QIAprep Spin Plasmid Kit, Qiagen Plasmid Kit
MATERIAL UND METHODEN 88
Fa. Roth Rotiszint eco Plus, Acetonitril HPLC grade, Methanol HPLC-
Grade, Petrolether
Fa. Serva Ammoniumpersulfat, Tween 20, DTT
Fa. NEN [2-14C]-Malonyl-Coenzym A (56mCi/mmol)
Fa. Pierce p-Bromphenacylbromid
Fa. Otto Nordwald Agar-Agar
4.1.4 Kultur-Medien
Die Substanzen wurden in jeweils 1 l deionisiertem H2O gelöst und 40 min bei 120°C und 1
bar Überdruck autoklaviert.
4.1.4.1 Nährmedien für Hefe
YPD 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glucose
YPDFS wie YPD, zusätzlich 10 g Tween 40, 0.3 g Butterhydrolysat
YPDFS+Cerulenin wie YPDFS, zusätzlich nach vollst. Erkalten 25 µM
Cerulenin (Stammlsg. 2.5mM in Ethanol, bei -20. lagern)
SCD 1.7 g Yeast Nitrogen Base, 5 g (NH4)2SO4, 20 Glucose,
50 ml (20x) AS-Mix
Zur Selektion von Transformanten diente das Medium ohne die jeweilige Aminosäure bzw.
Base im 20x AS-Mix.
AS-Mix (20x) AS-Mix (20x) 0,1 g Adenin, 0,2 g Arginin, 0,2 g Histidin, 0,2 g
Uracil, 0,2 g Tryptophan, 0,2 g Methionin, 0,3 g Isoleucin,
0,3 g Leucin, 0,3 g Threonin, 0,3 g Tyrosin, 0,3 g Serin,
0,3 g Valin, 0,5 g Phenylalanin
Die Aminosäuren und Basen wurden unter Erwärmen und Rühren in 500 ml MilliQ-Wasser
gelöst.
MATERIAL UND METHODEN 89
4.1.4.2 Nährmedien für E. coli
SOC-Medium 20g Trypton, 5g Hefeextrakt, 0,6g NaCl, 0,2g KCl, 10ml 1M
MgSO4, 10ml 1M MgCl2, 10ml 2M Glucose
LB-Medium 10g Trypton, 5g Hefeextrakt, 10g NaCl, pH 7,5
4.2 Organismen
4.2.1 E. coli
DH5α supE44 hsdR17 (rk-mk+) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 ∆lacU169
(Ø80lacZM15)
4.2.2 S. cerevisiae
Stamm Genotyp Herkunft
BY4742 Mat α his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 Euroscarf Frankfurt
SC1260 Mat a ura3 leu2 his3 pra1 prb1 prc1 cps1
ABYS ∆fas2::LEU2 rho-
LS Biochemie
∆ybr159w MAT α his3 leu2 lys2 ura3
ybr159w::HIS5
LS Biochemie
fas1-268 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie
fas2-385 X 2180-1A; Mat α LS Biochemie
fas2-438 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie
fas2-469 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie
fas-644 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie
fas-1095 X 2180-1A; Mat α LS Biochemie
MATERIAL UND METHODEN 90
4.3 Biochemische Methoden
4.3.1 Kultivierung von Mikroorganismen
4.3.1.1 Anzucht von E. coli-Zellen
E.coli-Zellen wurden auf Festmedium im Brutschrank bei 37°C angezogen. Flüssigkulturen
wuchsen bei 37°C in Reagenzgläsern (2–10 ml) auf einer Rolltrommel bzw. in
Erlenmeyerkolben (50–500 ml) auf einer Schüttelplattform.
4.3.1.2 Anzucht von Hefezellen
Das Wachstum von Hefezellen auf Festmedien erfolgte, soweit nicht anders angegeben, bei
30°C im Brutschrank. Flüssigkulturen wurden in Reagenzgläsern (2–8 ml) auf einer
Rolltrommel oder in Erlenmeyer- (30–3 000 ml) bzw. Fernbachkolben (400–1 000 ml)
unter Schütteln angezogen.
4.3.1.3 Zelldichte-Bestimmung von Flüssigkulturen
Die Zelldichte-Bestimmung von Hefe und E. coli-Kulturen erfolgte durch Messung der
Absorption im Spektralphotometer bei 600nm. Dabei entspricht ein Wert von A600 = 1,0 bei
E. coli einer Zelldichte von ca. 3·108 Zellen/ml und bei Hefe einer Zelldichte von ca. 2·107
Zellen/ml
4.3.2 Transformation von S. cerevisiae und E. coli-Zellen
4.3.2.1 CaCl2-Methode zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Lösungen ·
·
·
100mM MgCl2
100mM CaCl2
100mM CaCl2-Lösung, 15% (v/v) Glycerin
100ml LB-Medium wurde mit 1ml einer Übernachtkultur des E. coli-Stammes DH5α
beimpft. Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von A600 = 0,5 angezogen und durch
MATERIAL UND METHODEN 91
Zentrifugation (JA-14, 8000Upm, 4°C, 10 min) geerntet. Anschließend wurden die Zellen in
eiskalter MgCl2-Lösung resuspendiert, zentrifugiert (50ml Sarstadt-Röhrchen, 3000Upm,
4°C, 10 min), in CaCl2-Lösung resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Abschließend
wurden die Zellen erneut zentrifugiert (50ml Sarstadt-Röhrchen, 3000Upm, 4°C, 10 min) und
in eisgekühlter CaCl2-Lösung die zusätzlich 15% (v/v) Glycerin enthielt aufgenommen und je
100 µl in vorgekühlte, sterile Eppendorfgefäße aliquotiert. Die Zellen wurden bei -80°C
gelagert.
4.3.2.2 Transformation von CaCl2-behandelten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA
Es wurden 100 µl der CaCl2-kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden die
Zellen mit etwa 1 µg DNA gemischt, 30 min zur Absorption des Plasmids auf Eis gehalten
und dann für 2 min einem „Hitzeschock“ bei 42°C ausgesetzt. Die Zellen wurden auf Eis
gekühlt und in 1 ml LB-Medium aufgenommen. Zur Regeneration (Expression der
Antibiotika-Resistenz) wurden die Zellen für 1h bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in
einer Eppendorf-Zentrifuge sedimentiert und in 200 µl LB-Medium resuspendiert. Die
Suspension wurde auf LB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikazusatz ausplattiert und
bei 37°C über Nacht inkubiert.
4.3.2.3 Hefetransformation nach der modifizierten Lithiumacetat-Methode
Lösungen ·
·
·
LP-Mix: 40% Polyethylenglycol 4000, 0,1M Lithiumacetat, 10mM
Tris/HCl pH 7,5, 1mM EDTA
Carrier-DNA: auf 95°C erhitzt und geschert
TrE (10/1): 10mM Tris, 1mM EDTA pH 8,0
Der zu transformierende Hefestamm wurde über Nacht in einem geeigneten Medium bis zur
mittellogarithmischen Wachstumsphase kultiviert. 1,4ml der Kultur wurde in ein steriles
Eppendorfgefäß überführt und durch Zentrifugation sedimentiert. Das Sediment wurde durch
einen Rüttler kurz aufgelockert und anschließend wurden 10 µl Carrier-DNA-Lösung und ca.
2 µg der zu transformierenden DNA zugegeben. Nun wurden 500 µl LP-Mix und 55 µl
DMSO mit dem Ansatz vermischt und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 15
min Inkubation bei 42°C wurden 500 µl steriles TrE (10/1) zugegeben und die Zellen
abzentrifugiert (3000Upm, 2 min). Das Zellsediment wurde erneut in 1ml TrE (10/1)
MATERIAL UND METHODEN 92
gewaschen und zentrifugiert (5000Upm, 2 min). Schließlich wurden die Zellen in 100 µl TrE
resuspendiert und auf einem geeigneten Selektivmedium ausplattiert.
4.3.3 Arbeiten mit DNA
4.3.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem „QIAprepSpin Plasmid Kit“ (Quiagen)
Lösungen Alle benötigten Lösungen sind im QIAprepSpin Plasmid Kit enthalten.
Die das entsprechende Plasmid enthaltenden E. coli-Zellen wurden über Nacht in 5ml
Antibiotikum-haltigem LB-Medium angezogen, in der Tischzentrifuge (13000Upm, 30s)
sedimentiert und in 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Nach der Überführung in ein
Eppendorfgefäß wurden zuerst 250 µl Puffer P2 zugefügt und vorsichtig gemischt, dann
350 µl Puffer N3 zugegeben, wieder kurz gemischt und 10 min in der Tischzentrifuge
(13000Upm) abzentrifugiert. Der klare Überstand wurde auf eine QIAprep-Säule mit
Sammelgefäß gegeben und in der Tischzentrifuge (13000Upm, 30s) zentrifugiert.
Anschließend wurde die Säule zuerst mit 500 µl Puffer PB und dann mit 750 µl Puffer PE
gewaschen. Zur Entfernung der Waschpufferreste wurde die Säule nochmals zentrifugiert
(13000Upm, 60s) und dann in ein frisches Eppendorfgefäß gestellt. Die Plasmid-DNA wurde
eluiert, in dem man 50 µl H2O in die Mitte der Säule gab, diese 5 min stehen lies und dann in
der Tischzentrifugie zentrifugiert (13000Upm, 60s).
4.3.3.2 Restriktionsendonuclease-Spaltung von DNA
Lösungen ·
·
Puffer A, B, H, M, L: (Boehringer, Gibco)
Stop-Mix: 7 M Harnstoff, 40% Glycerin, 50 mM EDTA, 10 mM
Tris/HCL pH 8,0, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylencyanol
Restriktionenzyme ermöglichen die Herstellung definierter DNA-Fragmente, die für den
Einbau in rekombinante Plasmide und deren Charakterisierung herangezogen werden können.
Plasmid-DNA wurde mit 1-2 U Restriktionsenzym pro 100 µg DNA in dem oben
aufgeführten Universalpuffer bei 37°C in einem Reaktionsvolumen von 15-80 µl für 2h
inkubiert. Zur Inaktivierung der Restriktionsenzyme wurden die Ansätze mit 100 µl Stop-
Mix versetzt.
MATERIAL UND METHODEN 93
4.3.3.3 Analytische Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten
Lösungen ·
·
·
Agarose: Electrophoresis Grade (Gibco)
TBE-Puffer (1x): 89mM Tris, 89mM Borsäure, 2,5mM EDTA, pH 8,3
Ethidiumbromidlösung: 1% (w/v)
DNA-Restriktionsfragmente wurden durch eine Flachbett-Elektrophorese in 1% Agarosegel
aufgetrennt. Die Agarose wurde mit einem entsprechenden Volumen 1xTBE-Puffer versetzt,
erhitzt bis eine klare Lösung vorlag und sofort in die Gussform gefüllt. Die Elektrophorese
wurde bei 110V in 1xTBE durchgeführt. Anschließend wurde das Gel für 15 min in einer
Ethidiumbromidlösung gefärbt, wodurch die DNA-Banden bei 312nm sichtbar wurden. Durch
das Auftragen von Längenstandards konnte eine Größenbestimmung der DNA-Fragmente
erfolgen.
4.3.4 FAS Enzymreinigung aus Hefe
4.3.4.1 Zellaufschluß
Alle Arbeitsschritte wurden entweder im Kühlraum bei 4°C oder unter Eiskühlung
durchgeführt. Die gefrorenen Hefezellen wurden mit dem gleichen Volumen
Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 200 mM) aufgetaut und zu einer dickflüssigen homogenen
Suspension verrührt. Nach Zugabe von 2 mg/ml festen PMSF als Proteasehemmer kamen zur
Zellsuspension jeweils 1/3 Volumen Glasperlen, und das Gemisch wurde im
Glasperlenschüttler aufgeschlossen (8 x 30 sec mit Zwischenkühlung im Eisbad), das
Homogenat von den Glasperlen abdekantiert und Zellreste abzentrifugiert (8000 UpM, 15
min).
4.3.4.2 Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Sedimentation in der Ultrazentrifuge
Unter Rühren erfolgte die erste Ammoniumsulfat-Fällung (17,5 g / 100 ml) für 30 min. Die
ausgefallenen Proteine wurden abzentrifugiert (12000 UpM, 30 min) und der Protein-
Niederschlag verworfen. Der von der Fällung abdekantierte FAS-haltige Überstand wurde
einer zweiten Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen (10,5 g / 100 ml) und wiederum
abzentrifugiert (12000 UpM, 60 min). Das Sediment dieser Fällung wurde in
MATERIAL UND METHODEN 94
Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 200 mM) aufgenommen und mit Hilfe des Potter-
Homogenisators gelöst. Die trübe Lösung, bestehend aus dem FAS-Komplex und anderen
hochmolekularen Komponenten, wurden sedimentiert (38000 UpM, 8h).
Der Niederschlag wurde in Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 200 mM) aufgenommen, durch
Plümpern homogenisiert und die erste (17,5 g / 100 ml) und zweite (10,5 g / 100 ml)
Ammoniumsulfatfällung wie oben beschrieben wiederholt. Wiederum erfolgte die
Homogenisierung und Sedimentierung (38000 UpM, 8 h) des Niederschlags der zweiten
Fällung. Der entstanden Niederschlag wurde in 6-12 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 50
mM) aufgenommen und wenn nötig klarzentrifugiert (15000 Upm, 1h).
4.3.4.3 Saccharose-Dichtegradient-Zentrifugation
Zur weiteren Aufreinugung der Enzympräparation wurden jeweils 1/6 Volumen (max 1,5 ml)
der enthaltenen Enzymlösung auf die Oberfläche eines Rohrzuckergradienten (30 ml
Röhrchen) pipettiert (Gradient linear aufgebaut aus 10%iger und 30%iger Saccharose-
Lösung).
Die Auftrennung des Proteingemischs im Gradienten erfolgte durch Ultrazentrifugation
(25000 UpM, 15 h, SW27 Ausschwingroter). Nach Beendigung des Laufs konnte das FAS-
assoziierte Flavin mittels seitlicher Bestrahlung der Röhrchen mit UV-Licht zur Fluoreszenz
angeregt und sichtbar gemacht werden. Anschließend wurde eine 10 cm lange Injektionsnadel
1-2 mm über den Röhrchenboden eingeführt und die Lösung unter Verwendung einer
peristalltischen Pumpe in 1,5 ml Tropfen-Fraktionen ausgetropft.
Durch UV-Messung bei 280 nm wurden die proteinhaltingen Fraktionen bestimmt. Die FAS-
haltigen unter ihnen wurden vereinigt, mit Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 50mM) auf das
doppelte Volumen aufgefüllt und in de Ultrazentrifuge sedimentiert (38000 rpm, 8-10 h). Die
abzentrifugierte, gereinigte Fettsäuresynthase wurde in geringen Volumen
Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 50 mM) gelöst (ca. 1 ml), mit dem gleichen Volumen
Glycerin versetzt und bei -20°C gelagert. Eine andere und für die Stabilität der
Enzymaktivität bessere Aufbewahrungsmöglichkeit besteht darin, die vereinigten
proteinhaltigen Fraktionen einer Ammoniumsulfat-Totalfällung zu unterziehen (30 g / 100
ml). Die Proteinfällung wurde abzentifugiert (12000 rpm, 30 min) und mit einem Tropfen
Glycerin versetzt. Auch in dieser Form erfolgte die Lagerung der Fettsäuresynthase bei -20°C.
MATERIAL UND METHODEN 95
4.3.5 FAS Aktivitätsmessungen [LYN3]
4.3.5.1 FAS-Gesamtreaktion
Lösungen ·
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0,1M Kaliumphosphatpuffer pH 7,3
Acetyl-CoA (20 mg/ml)
Acetessigsäureethylester (purum)
100mM Cystein·HCl 100mM KOH; BSA (20 mg/ml); NADPH (30
mg/ml); Malonyl-CoA (20 mg/ml);
In eine 1ml Quarzküvette wurden (700 – X) µl Kaliumphosphatpuffer, 100 µl Cystein·HCl
und 100 µl KOH gegeben. Nach mehrmaligem Invertieren der Küvette wurden 50 µl BSA,
20 µl Acetyl-CoA, ca. 10 µl NADPH und X(10-50) µl der FAS-Enzymlösung beigegeben.
Anschließend wurde der Ansatz erneut mehrmals invertiert und die nicht-enzymatische
Extinktionsabnahme wurde für 2 min bei 366nm vermessen (Null-Linie). Anschließend wurde
die Küvette aus der Halterung des Photometers genommen und die FAS-Reaktion wurde
durch die Zugabe von 20 µl Malonyl-CoA initiiert. Die Küvette wurde noch mehrmals
invertiert und in die Photometerhalterung zurückgestellt. Der NADPH Verbrauch wurde für
2-15 min bei 366nm verfolgt.
4.3.5.2 β-Ketoacylreduktase Reaktion
In eine 1ml Quarzküvette wurden (720 – X) µl Kaliumphosphatpuffer, 100 µl Cystein·HCl
und 100 µl KOH gegeben. Nach mehrmaligem Invertieren der Küvette wurden 50 µl BSA,
ca. 10 µl NADPH und X(10-50) µl der FAS-Enzymlösung beigegeben. Anschließend wurde
der Ansatz erneut mehrmals invertiert und die nicht-enzymatische Extinktionsabnahme wurde
für 2 min bei 366nm vermessen (Null-Linie). Anschließend wurde die Küvette aus der
Halterung des Photometers genommen und die FAS-Reaktion wurde durch die Zugabe von
20 µl Acetessigester initiiert. Die Küvette wurde noch mehrmals invertiert und in die
Photometerhalterung zurückgestellt. Der NADPH Verbrauch wurde für 2-15 min bei 366nm
verfolgt.
MATERIAL UND METHODEN 96
4.3.5.3 Auswertung
Die spezifische FAS-Aktivität wurde wie folgt berechnet:
[]366]/[Pr
][Prmin]/[
][2
1000]/[.
366
366
nmbeiNADPHvonntskoeffizieExtinktionmolarermlmgntrationoteinkonzeC
mlnobenvolumeVEMinuteprosänderungExtinktionE
mlnTestvolumeVCV
EVmgmUAktivitätspez
P
P
T
PP
T
====∆=
⋅⋅⋅∆⋅⋅
=
ε
ε
Anmerkung: Bei der Berechnung der spezifischen FAS-Aktivität nach Lynen tritt im Nenner
der Faktor 2 auf, da pro Synthesezyklus 2 Äquivalente NADPH verbraucht werden.
4.3.5.4 Radioaktiver FAS-Test
Lösungen ·
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Aufschlusspuffer: 50 mM Tris pH 7.3, 50 mM KCl, 1 mM EDTA
[2]-14C- Malonyl-Coenzym A: 30000 cpm
Stearin- und Palmitinsäure: gesättigt in Petrolether
methanolische KOH: 6 M; Essigsäure: 3 M
Cystein·HCl: 100 mM; KOH: 100 mM; Glucose-6-Phosphat: 100 mM;
NADPH: 100 mM; Acetyl-Coenzym A: 10 mM; Malonyl-Coenzym A:
6mM; BSA: 10 mg/ml; Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase: 0,8 mg/ml
Die bis zur OD600 = 1.0 angewachsene Hefe wurde geerntet und mit Aufschlusspuffer wie in
mit Glasperlen aufgeschlossen. Der Gesamtproteingehalt des Zellrohextraktes wurde mit dem
Bradford-Test bestimmt. 100 µg Zellextrakt in 676 µl Aufschlusspuffer wurden in einem 1.5
ml Eppendorf-Gefäß mit 100 µl Cystein-HCl, 100 µl KOH, 10 µl Glucose-6-Phosphat, 20 µl
NADPH, 20 µl Acetyl-CoA und 12.5 µl Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase vermischt. 10 µl
nicht-radioaktives Malonyl-CoA wurden mit 30000 cpm [2]-14C-Malonyl-CoA vermengt.
Durch Zugabe des Malonyl-CoA Gemischs wurde die FAS-Reaktion gestartet und die
Enzymlösung bei 30°C für 30 min inkubiert. Anschließend wurde die Lösung in ein
Glasröhrchen mit Teflondeckel überführt und die Enzymreaktion mit 2 ml 6M HCl in
Methanol gestoppt. Gebildete Fettsäuren wurden in Gegenwart von 20µl Stearin- und
MATERIAL UND METHODEN 97
Palmitinsäure (ges. in Petroether) durch Hydrolyse bei 95°C für 5 h von kovalent gebundenen
Phosphoglyceriden und Proteinen freigesetzt und durch 3-maliges Auschütteln mit Petrolether
extrahiert. Die Extrakte wurden in einem neuen Glasröhrchen mit Teflondeckel gesammelt
und, um nicht eingebautes radioaktives Malonyl-CoA zu entfernen, einmal mit 3 N Essigsäure
gewaschen. Die organische Phase (oben) wurde möglichst vollständig abgesaugt und in ein
Szintillations-Zählgefäß gefüllt. Die Petroletherfraktion wird 3-malig mit 2 ml 3 M Essigsäure
gewaschen und anschließend unter stetem Stickstoff-Einstrom eingedampft. Der Rückstand
wird in 5 ml Szintillationscocktail (Rotiszint Eco Plus, Fa. Roth) aufgenommen. Die
Radioaktivität wurde im Szintillationszähler vermessen. Alternativ zu dem beschriebenen
Verfahren werden für die Auftrennung der Fettsäuren durch die RP-HPLC insgesamt 100000
cpm [2]-14C- Malonyl-Coenzym A eingesetzt.
4.3.6 Dissoziation und Reassoziation von Hefe-FAS nach der DMMA-Methode
[WER, MIT]
Lösungen ·
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Spaltpuffer: 300mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5
DMMA: Dimethylmaleinsäureanhydrid in THF (100 mg/ml)
BSA: 10 mg/ml
Titrationslösung: 100mM Essigsäure gesättigt mit (NH4)2SO4
(NH4)2SO4-Puffer: 300mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,9 ges. mit
(NH4)2SO4
Reaktivierungspuffer: 100mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, 10mM DTT,
20 µM FMN, 0,5mM EDTA
In einem 2 ml Eppendorfgefäß wurden 4 mg FAS in 500 µl Spaltpuffer gelöst. Die FAS- und
die Ketoreduktase-Aktivität werden mit jeweils 10 µl des Ansatzes vermessen. Unter
Eiskühlung wird die FAS nun durch Zugabe von 6 µl DMMA-Lösung für 8 min dissoziiert.
Nun werden 8 µl Mercaptoethanol zugegeben und kurz durchmischt. Anschließend wird die
FAS-Aktivität und die Ketoreduktase-Aktivität mit jeweils 10 µl des Ansatzes erneut
vermessen. Nun werden 300 µl BSA zugegeben. Der Ansatz wird langsam (ca. 5 min), unter
ständigem Rühren und pH-Kontrolle mit einer Mini-Elektrode mit jeweils 50 µl Portionen
mit der Titrationslösung auf pH 5,9 titriert. Nun werden 500 µl (NH4)2SO4-Puffer zugegeben
und die entstandene Trübung für 30 min bei 4°C an einer Tischzentrifuge abzentrifugiert
(4°C, 14000 UpM). Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag wird in 460 µl
MATERIAL UND METHODEN 98
Reaktivierungspuffer gelöst und für 5 min gerührt. Die FAS- und die Ketoreduktase-Aktivität
werden mit jeweils 10 µl des Ansatzes nach 240 min vermessen.
4.3.7 Elongase Aktivitätstest
Lösungen ·
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Aufschlusspuffer: 50mM Tris-Cl (pH 7.4), 50mM KCl, 10% Glycerin, 2
ml 0.5M EDTA
[2]-14C-Malonyl-CoA: 100000 cpm
methanolische HCl: 6M
Acyl-CoA: 1mM; Malonyl-CoA: 5mM; BSA: 5 mg/ml; Cerulenin: 1mM;
NADPH: 4 mg/ml; DTT: 3 mg/ml
Die bis zur OD600 von 1.0 angewachsene Hefe wurde geerntet und mit dem Aufschlusspuffer
mit Glasperlen aufgeschlossen. Die Membranfraktion wurde durch Ultrazentrifugation
(100000g, 1h, 4°C) sedimentiert und in möglichst wenig Aufschlusspuffer mit einem Potter-
Elvejhem Homogenisator resuspendiert. Der Gesamtproteingehalt der so gewonnenen
Membranfraktion wurde mit dem Bradford-Test bestimmt. 500 µg Gesamtprotein wurden in
einem 1.5 ml Eppendorf-Gefäß mit 20 µl Acyl-CoA, 20 µl NADPH, 10 µl DTT 10 µl BSA
und 10 µl Cerulenin vermischt. Die Elongasereaktion wurde mit einem Gemisch aus 2 µl
nicht-radioaktivem Malonyl-CoA und radioaktivem Malonyl-CoA (insgesamt 100000 cpm)
gestartet. Die Enzymreaktion fand bei 30°C für 1 h statt. Anschließend wurde die Lösung in
ein Glasröhrchen mit Teflondeckel überführt und die Enzymreaktion mit 2 ml 6 M HCl in
Methanol gestoppt. Gebildete Fettsäuren wurden durch Hydrolyse bei 95°C für 5 h
freigesetzt. Vor dem Extrahieren der Fettsäuren durch 3-maliges Ausschütteln mit Petrolether
wurden diese mit 10 µl einer gesättigten Fettsäurestandardlösung, bestehend aus Fettsäuren
der Kettenlängen C14–C26 versetzt. Die Extrakte wurden in neuen Glasröhrchen mit
Teflondeckel gesammelt und der Petrolether mit Stickstoff verblasen. Die Proben wurden
dann mit p-Bromphenacylbromid derivatisiert und mittels Radio-HPLC untersucht.
4.3.8 Gaschromatographische Analyse von Fettsäuremethylestern
Lösungen ·
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Chloroform/Methanol: (2:1)
methanolische HCl: 83% (v/v) Methanol, 17% (v/v) HCl konz.
NaCl: gesättigt
MATERIAL UND METHODEN 99
50 ml Hefekultur wurde bis zur spätlogarithmischen Phase (OD600 = 2–3) angezogen.
Geernte Zellen wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und in der
Gefriertrocknungsanlage Alpha 1–2 (Fa. Christ) vollständig lyophilisiert. Die pulverisierten
Zellextrakte wurden in Glasröhrchen mit Teflondeckel überführt. Zur Hydrolyse und
Methylierung der Fettsäuren wurden 2 ml 6M methanolische HCl zugegeben und die Extrakte
durch starkes Schütteln (Vortex) gelöst. Die Glasröhrchen wurden mit Teflondeckeln fest
zugeschraubt und die Lösungen bei 95°C über Nacht inkubiert. Die gebildeteten Fettsäure-
Methylester wurden 3 Mal mit Petrolether augeschüttelt und die Extrakte in neuen
Glasröhrchen gesammelt. Der Petrolether wurde durch im Stickstoff-Strom eingedampft und
der Rückstand in 20 µl Petrolether aufgenommen. Jeweils 1 µl der Proben wurden für die
gaschromatographische Analyse verwendet. Als stationäre Phase diente eine HP-5
Kapillarsäule (unpolar, 0.2mmx 25 m). Die Substrattrennung erfolgte in 25 min unter
folgenden Bedingungen:
Injektionstemperatur: 280°C
Ofentemperatur: 100°C auf 280°C bei 10 °C/min
Ausglühen: 280°C für 6 min
Trägergas: Helium
Die Fettsäure-Methylester wurden mit einem Flammenionisationsdetektor, der durch ein
Wasserstoff-Sauerstoff-Gemisch gezündet wurde, bei 300°C nachgewiesen.
4.3.9 „Reversed-Phase“-HPLC Analyse von Fettsäure-Gemischen
Lösungen ·
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Puffer A: Methanol:Acetonitril:Isopropanol = 10:3:1
Puffer B: (Puffer A : Wasser) = 1:1
Dimethylformamid (DMF)
p-Bromophenacylbromid;
N,N-Diisopropylethylamin
Bevor die aus dem Reaktionsansatz extrahierten Fettsäuren mittels Radio-HPLC aufgetrennt
und im Radio- bzw. UV-Detektor analysiert werden konnten, wurden sie zu p-
Bromophenacylester derivatisiert. Aufgrund des dabei eingeführten aromatischen Rings
konnten sie anschließend als p-Bromophenacylester optisch bei 254 nm detektiert werden.
Dazu wurden in Glasröhrchen mit Teflondeckel die getrockneten Fettsäuren mit 80 µl
MATERIAL UND METHODEN 100
Dimethylformamid, 10 µl p-Bromophenacylbromid und 10 µl N,N-Diisopropylethylamin
versetzt und für 1 h bei 65°C im Heizblock erhitzt. Diese Lösung wurde direkt in die HPLC
injiziert. Die Fettsäuren wurden üuber eine Prontosil 120-5-C18-SH 5.0 µm (250 x 4.0mm
inkl. Vorsäule) RP-HPLC Säule der Fa. Bischoff (Leonberg) nach folgenden Bedingungen
aufgetrennt:
Gradient: 0–15 min 92% A, 8% B ! 100% A, 0% B
15–50 min 100% A, 0% B
50–55 min 100% A, 0% B ! 92% A, 8% B
55–64 min 92% A, 8% B
Flussrate: 0,6 ml/min
Die Radioaktivität wurde durch eine Solarscint (400µl) Feststoff-Flusszelle mit dem
Radiodetektor Radiomatic 500TR (Fa. Packard) gemessen und zusammen mit den
Massenpeaks durch das Analyseprogramm „Flow-Analyzer“ der Firma Packard ausgewertet.
4.3.10 Isolierung von FAS-freien Hefemembranen
Lösungen ·
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Aufschlusspuffer: 50mM Tris·HCl pH 7,4, 300mM Saccharose, 0,1mM
EDTA
Waschpuffer: 50mM Tris·HCl pH 7,4, 0,1mM EDTA
Waschpuffer mit Triton X-100: Waschpuffer, 1% Triton X-100
In YPD Vollmedium gewachsene Hefezellen wurden in der späten logarithmischen Phase
durch Zentrifugation geerntet und dreimal in destilliertem Wasser gewaschen. Pro 1g Hefe
wurden dann 1 ml Aufschlußpuffer, 1g Glasperlen, 1 µl Leupeptin, 1 µl Pepstatin und 5 µl
Phenylmethansulfonylfluorid zugegeben. Anschließend wurden die Zellen insgesamt 5 Mal
im Braun Zellhomogenisator für jeweils 15 sec aufgeschlossen und zwischendurch jeweils 1
min im Eisbad gekühlt. Das Zellhomogenisat wurde für 10 min zentrifugiert (Rotor: Heraeus
8179, 3200Upm) und dabei von groben Zelltrümmern und nicht aufgeschlossenen Zellen
befreit. Der Überstand (Rohextrakt) wurde mit Aufschlußpuffer auf 5 ml aufgefüllt und für 30
min bei 20000xg zentrifugiert. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde in 5ml Waschpuffer
homogenisiert und für 30 min auf Eis gestellt. Anschließend wurde die Suspension erneut für
30 min bei 20000xg zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde insgesamt 6 Mal wiederholt.
MATERIAL UND METHODEN 101
4.3.11 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen [BOL]
Lösungen ·
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·
Tris/Glycin Laufpuffer: 250mM Tris·HCl, 1,92M Glycin, 1% SDS, pH 8,3
Acrylamidlösung: 30% Acrylamid, 0,8% Methylenbisacrylamid in H2O
Lower-Tris (4x): 1,5M Tris·HCl, 0,4% SDS, pH 8,8
Upper-Tris (4x): 0,5M Tris·HCl, 0,4% SDS, pH 6,8
TEMED
Ammoniumpersulfat: 10%ige Lösung
Probenpuffer (5x): 60mM Tris·HCl pH 6,8, 25% Glycerin, 2% SDS,
20mM DTT, 0,1% Bromphenolblau
Die gelelektrophoretische Untersuchung von Zellrohextrakten und gereinigten
Enzympräparationen erfolgte in vertikalen Polyacrylamid-Flachgelen (10 x 10 cm) von 1mm
Dicke.
Trenngel 5% Sammelgel 3%
H2O 2,8ml 1,54ml
Lower-Tris (4x) 1,25ml
Upper-Tris (4x) 625 µl
30% PAA 0,83ml 250 µl
10% APS 150 µl 125 µl
TEMED 10 µl 10 µl
Der Ansatz für das Trenngel wurde zusammenpipettiert, zügig in die Gelkassette gegossen
und mit Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation wurde der Alkohol abgegossen
und der Sammelgel-Ansatz über das Trenngel gefüllt. Zu den Proteinproben wurde 1/5
Probenpuffer gegeben. Die Proben wurden für 5 min auf 97°C erhitzt. Die Elektrophorese
erfolgt bei 160V für ca. 200 min in 1x Tris/Glycin-Laufpuffer.
MATERIAL UND METHODEN 102
4.3.12.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen und Immundetektion
4.3.12.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen
Lösungen · Transferpuffer: 28mM Tris, 39mM Glycin, 0,04% SDS
Der Transfer elektrophoretisch aufgetrennter Proteine auf eine Nitrozellulose-Membrann
erfolgte im sogenannten „Semi-dry“-Verfahren unter Verwendung des „Nova-Blot“-Gerätes
der Firma Pharmacia/LKB. Fünf Lagen Whatman-3M-Papier in Gelgröße wurden in
Transferpuffer getränkt und auf die gewässerte Graphitanode geschichtet. Darauf wurde die
Membran und auf diese wiederum das Proteingel luftblasenfrei aufgelegt. Fünf weitere Lagen
in Transferpuffer getränktes Whatman-3M-Papier und die gewässerte Graphitkathode wurde
aufgelegt. Der Transfer erfolgte für 90 min bei einer Stromstärke von 0,8mA/cm2 Gelfläche.
4.3.12.2
Nachweis von ProteinA-markierter Proteine mit Peroxidase-
Antiperoxidase (PAP)-Antikörpern
Lösungen ·
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·
TBS (10x): 0,1 M Tris·HCl, 1,5 M NaCl, pH 8,0
0.05% Tween20 in TBS
3% Magermilch in TBS
Die mit TBS-Milchlösung blockierte PVDF Membran wurde zweimal in MilliQ unter
Schwenken gewaschen und in 10 ml einer frischen TBS-Milchläsung mit PAP-Antikörpern in
der Verdünnung 1:5000 für 1 h bei Raumtemperatur unter leichter Bewegung inkubiert.
Anschließend wurde die Membran erneut zweimal mit MilliQ gewaschen und für 3–5 min in
10 ml TBS-0.05% Tween 20 geschüttelt. Danach wurde rasch 4–5 Mal in MilliQ gespült und
die Färbereaktion nach der ECL-Methode (s.u.) durchgeführt.
4.3.12.3 „Enhanced Chemoluminescense“ (ECL)-Methode
Lösungen ·
·
ECL1: 10 ml 100mM Tris-Cl (pH 8.5), 44 µl Kumarsäure,100 µl 250mM
Luminol
ECL2 (10 ml 100mM Tris-Cl, 6 µl H2O2)
MATERIAL UND METHODEN 103
Die in MilliQ gewaschene PVDF-Membran wurde in einer unmittelbar zuvor hergestellten
Mischung der Lösungen ECL1 und ECL2 für 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und
anschließend in einer Röntgenfilmkassette zwischen transparenten Küchenfolien
eingeschlagen. So schnell wie möglich wurden dann in der Dunkelkammer Röntgenfilme
durch Auflegen auf die Membran unterschiedlich lange exponiert (5 sec bis 5 min) und in
einer Entwicklermaschine entwickelt. Anschließend wurden die fixierten Filme nochmals
mit Wasser gewaschen und getrocknet.
4.3.13 Zellaufschluss von S.cerevisiae
Lösungen ·
·
Aufschlusspuffer: abhängig von der nachfolgenden Aufarbeitung des
Zellextraktes (wird entsprechend angegeben)
Proteaseinhibitoren: PMSF 7 mg/ml in Isopropanol, Leupeptin
0.5 mg/ml, Pepstatin A 0.68 mg/ml in Methanol
Fertig angewachsene Zellkulturen wurden durch Zentrifugation (3500 UpM, 5 min, 4°C)
geerntet, mit 50 ml MilliQ-Wasser gewaschen und nach der erneuten Zentrifugation für
mindestens 1 h bei −80°C eingefroren. Kurz vor dem Aufschluss wurde eine für den Versuch
ausreichende Menge an Zellen aufgetaut und mit der gleichen Menge Aufschlusspuffer
versetzt. Die Proteaseinhibitoren wurden in den Konzentrationen PMSF 5 µl, Leupeptin 1 µl,
Pepstatin A 1 µl pro ml Zellsuspension zugegeben. Der Aufschluss erfolgte mit dem gleichen
Volumen Glasperlen in einem speziellen Schüttelgerät mit Zwischenkühlung im Eis-Wasser
Bad für jeweils 6x 30 sec. Der Überstand wurde in einem JA14-Becher abdekantiert und die
verbliebenen Glasperlen mit mind. 1 Volumen Aufschlusspuffer nachgewaschen. Die
vereinigten Zellextrakte wurden durch Zentrifugation (4 000 UpM, 10 min, 4.) von groben
Zelltrümmern befreit und das geklärte Zell-Lysat in ein neues Gefäß gefüllt.
4.3.14 In vivo Mutagenese mit Ethylmethansulfat [ADA]
Lösungen ·
·
·
Mutagenesepuffer: 0,1M Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,0
EMS: Ethylmethansulfat;
Natriumthiosulfat: 5%
MATERIAL UND METHODEN 104
Für die in vivo Mutagenese wurden Hefe-Zellen in YPD-Medium bei 30°C zur frühen
stationäre Phase (1,3 x 108 Zellen/ml) hochgezogen. Die Zellen wurden geerntet, zweimal in
sterilem Wasser gewaschen und in 1ml sterilem Mutagenesepuffer resuspendiert. Die exakte
Zelldichte wurde mittels einer Thoma Zählkammer bestimmt. Die Suspension wurde halbiert.
Zu der einen Hälfte wurden 15 µl EMS zugegeben, die andere diente als nicht-mutagenisierte
Kontrolle, um später die Überlebensrate zu bestimmen. Beide Gefäße wurden 3h bei 30°C
inkubiert. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert, in sterilem Wasser aufgenommen,
in ein frisches Gefäß überführt und dann zweimal mit Natriumthiosulfat gewaschen. Die
mutagenisierten Zellen wurden in 500 µl Wasser aufgenommen und in geeigneter
Verdünnung auf YPDFS-Platten ausplattiert, so dass pro Platte 100-200 überlebende
anwuchsen. Der Verdünnungsfaktor wurde durch Vorversuche bestimmt. Von den nicht-
mutagenisierten Kontrollzellen wurde eine vergleichbare Menge ausgebracht. Die Platten
wurden fünf Tage bei 30°C inkubiert und danach die Zahl der angewachsenen Kolonien
bestimmt bzw. die mutierte Kultur auf Selektiv-Nährböden weiter bearbeitet.
4.3.15 Isolierung und Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern der Hefe
4.3.15.1 Isolierung nach Mancha et al. [MAN]
Lösungen ·
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Aufschlußpuffer: Isopropanol / 50mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,2 (1:1,
v/v), BSA (1 mg/ml), MgCl2 (5mM), Essigsäure 12,5 µl/ml; Petrolether:
gesättigt mit 50% wässrigem Isopropanol
(NH4)2SO4: gesättigte, wässrige Lösung
Extraktionslösung: Chloroform / Methanol (1:2, v/v)
Waschpuffer: Methanol / 20mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 (1:1, v/v)
Margaroyl-CoA: 1mM
Der zu untersuchende Hefestamm YPD Vollmedium bis zur mittellogarithmischen
Wachstumsphase kultiviert, geerntet und in destilliertem Wasser gewaschen. In einem
verschließbaren Glasröhrchen wurden pro Gramm Hefe 1 ml Aufschlußpuffer gegeben.
Anschließend wurden 1 g Glasperlen und 10 µl Margaroyl-CoA dazugegeben. Die Zellen
wurden insgesamt 10-20 Mal für 30 sec durch starkes Schütteln (Vortex) aufgeschlossen.
Zwischendurch wurden die Proben für 1 min auf Eis gekühlt. Nach dem vollständigen
Aufschluß der Zellen wurden pro Milliliter ursprünglich zugesetztem Aufschlußpuffer 1
MATERIAL UND METHODEN 105
weiterer ml Aufschlußpuffer dazugegeben. Die Proben wurden dreimal mit Petrolether
ausgeschüttelt. Anschließend wurden noch pro Milliliter ursprünglich beigesetztem
Aufschlußpuffer 50 µl (NH4)2SO4-Lösung und 8 ml Extraktionslösung (Chloroform /
Methanol (1:2, v/v)) langsam (3-5 min) unter Schütteln dazugegeben. Die Lösung wurde für
20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend für 10 min klarzentrifugiert.
Der Überstand wurde über eine Glassäule (0,6 x 30cm), welche 0.75g neutrales
Aluminiumoxid enthielt gegossen. Anschließend wurde das Gel zunächst mit 15 ml
Extraktionslösung (Chloroform / Methanol (1:2, v/v)) und dann mit 10 ml Diethylether
gespült, im Stickstoffstrom getrocknet und in ein Glasröhrchen überführt. Das getrocknete
Gel wurde in 5 ml Waschpuffer (Methanol / 20mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 (1:1, v/v))
aufgenommen und für 30 min bei 4°C durchmischt. Abschließend wurde das Aluminiumoxid
durch Zentrifugation sedimentiert. Der Überstand wurde abdekantiert, über eine mit
Glaswolle gefüllte Pasteurpipette filtriert und im Vakuum eingeengt.
4.3.15.2 Isolierung nach Maningo et al. [MAG]
Lösungen ·
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Aufschlußpuffer: Chloroform / Methanol (1:2, v/v)
Kaliumphosphatpuffer: 10 mM, pH 5,3
Margaroyl-CoA: 1 mM
Die Hefe wurde bis zur mittellogarithmischen Wachstumsphase gezüchtet, durch
Zentrifugation geerntet und in destilliertem Wasser gewaschen. In ein
Glasperlenaufschlußgefäß wurden 4g Hefe, 4ml Aufschlußpuffer, 4g Glasperlen und 10 µl
Margaroyl-CoA gegeben. Das Gemisch wurde in 20-30 Intervallen für jeweils 15 sec
aufgeschlossen und zwischenzeitlich jeweils für 1 min auf Eis gekühlt. Die Suspension wurde
in ein Glasröhrchen überführt. Die im Aufschlußgefäß zurückgebliebenden Zellen wurden mit
2ml Aufschlußpuffer zweimal gespült und auch in das Glasröhrchen überführt. Die
Suspension wurde für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein weiteres Glasröhrchen
überführt, mit 2,1 ml Kaliumphosphatpuffer und 2,1 ml Chloroform vermischt, für 1 min am
Schüttler durchmischt und für 10 min zentrifugiert. Die chloroformhaltige Phase (unten)
wurde entfernt. Anschließend wurde die methanolische Phase erneut mit 2,1 ml Chloroform
gewaschen. Abschließend wurde das Methanol im Stickstoffstrom entfernt.
MATERIAL UND METHODEN 106
4.3.15.3 Isolierung nach Rosendal et al. [ROS]
Lösungen ·
·
·
·
·
·
Perchlorsäure: 6,6 M bzw. 10 mM
BSA: 3 mg/ml - frei von Fettsäuren
Chloroform
Methanol
Extraktionspuffer: 2 ml Isopropanol, 2 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer
pH 7,2, 50 µl Eisessig, 80 µl BSA (50 mg/ml)
Margaroyl-CoA: 1 mM
Das Wachstum der Hefezellen wurde durch Zugabe von 10% eisgekühlter 6,6 M
Perchlorsäure (6,6M) zu 100 ml einer Zellsuspension (OD600 = 1,0) gestoppt. Die Zellen
wurden bei 4°C abzentrifugiert, in 5 ml 10 mM Perchlorsäure resuspendiert und in
Glasröhrchen überführt. Die Zellen wurden erneut abzentrifugiert. Zu den Zellen wurden
10 µl 1 mM Margaroyl-CoA, 100 µl BSA, Wasser (ad 800 µl) und 1g Säure-gewaschenen
Glasperlen gegeben. Anschließend wurden 3ml Chloroform/Methanol (2:1) dazugegeben und
die Zellen insgesamt 60mal in 30 Sekunden Intervallen (zwischen den Intervallen 1 min auf
Eis kühlen) durch starkes Schütteln (Vortex) aufgeschlossen. Nach dem Zellaufschluß wurden
1ml Chloroform und 1ml Wasser zugemischt und für 10 min bei 4500 Upm (4°C)
zentrifugiert (Heraeus Multifuge 3 S-R). Die obere Phase wurde nun vorsichtig mit einer
Glaspipette entfernt. Gleichzeitig wurde das Glasröhrchen gedreht, so dass die Interphase an
der Glaswand hängen blieb. Danach wurde auch die untere Phase vorsichtig mit einer
Glaspipette entfernt. Die Interphase wurde im Stickstoffstrom getrocknet und die Glasperlen
wurden entfernt. Zu der getrockneten Interphase wurden 200 µl Extraktionspuffer und 0,1g
Glasperlen gegeben. Die Probe wurde 10 mal in 30 Sekunden Intervallen (zwischen den
Intervallen 1 min auf Eis kühlen) stark geschüttelt (Vortex) und für 20 min auf Eis stehen
gelassen. Anschließend wurde die Probe für 10 min bei 4500 Upm (4°C) zentrifugiert
(Heraeus Multifuge 3 S-R). Der Überstand wurde in ein Glasröhrchen überführt, im Vakuum
(Speedvac) getrocknet, in 100 ml Extraktionspuffer resuspendiert und direkt auf die HPLC-
Säule aufgetragen (vgl. 4.3.15.4).
MATERIAL UND METHODEN 107
4.3.15.4 Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern durch RP-HPLC
Lösungen ·
·
Puffer A: 20% (v/v) Acetonitril, 80% Kaliumphosphatpuffer (25mM, pH
5,3)
Puffer B: 70% (v/v) Acetonitril, 25% Kaliumphosphatpuffer (25mM, pH
5,3)
Die oben hergestellte Lösung wurde direkt auf die Säule aufgetragen. Zur Auftrennung der
Acyl-CoA-Ester wurde eine Prontosil C18-SH 5 µm (250mm x 4,6mm inkl. Vorsäule, Fa.
Bischoff) RP-HPLC-Säule unter den folgenden Bedingungen verwendet:
Flußrate: 0,5ml/min
0-5 min: 80% Puffer A; 5-15 min: 80% Puffer A - 50% Puffer A; 15-20: min 50% Puffer A;
20-50 min: 50% Puffer A - 0% Puffer A; 50-55 min: 0% Puffer A; 55-60 min: 0% Puffer A -
85% Puffer A; 60-65 min: 85%Puffer A
4.3.16 Proteinbestimmung nach Bradford [BRA]
Lösungen ·
·
Bradford Stammlösung: 100ml Ethanol (95%), 200ml ortho-
Phosphorsäure (88%), 350 mg Coomassie Brilliant Blue G-250
Bradford Arbeitslösung: 15ml Ethanol, 30ml ortho-Phosphorsäure (88%),
30ml Stammlösung, ad 500ml aq. dest.
BSA: 1,0 mg/ml
Zunächst wurde mit einer BSA-Lösung bekannter Konzentration eine BSA-Eichkurve mit 5
Meßpunkten (2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 µg/ml entsprechend 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 der BSA-
Lösung ad 100 µl H2O) hergestellt. Die Proteinprobe wurde –gegebenenfalls verdünnt- in
unterschiedlichen Mengen (2 - 100 µl ad 100 µl H2O) eingesetzt, so dass jeweils 2,5 –
12,5 µg Protein in den Proben enthalten waren. Zu allen Ansätzen wurde zügig 1ml Bradford
Arbeitslösung gegeben, kurz durchgemischt und nach 5 min (spätestens nach 30 min) die
Extinktion bei 595nm vermessen. Aus den Messwerten wurde das arithmetische Mittel
gebildet.
MATERIAL UND METHODEN 108
4.4 Chemische Methoden
4.4.1 Synthese von Stearoylchlorid
Ein Zweihals-Reaktionskolben wurde mit einem Rückflußkühler und
einem Tropftrichter ausgestattet. In den Kolben wurden 142g
Stearinsäure gegeben. Über einen Zeitraum von 40 min wurden
langsam 44ml Thionylchlorid zugegeben. Der Kolben wurde im
Wasserbad für 30 min unter dem Rückflußkühler erhitzt.
4.4.2 Synthese von 3-Oxoeicosansäuremethylester
Diese Verbindung wurde durch die
Acetessigesterreaktion hergestellt. Eine Lösung aus 13,6
g Acetessigsäureethylester, 2,0 g gepulvertem Natrium
und 100 ml wasserfreiem Benzol wurde für 2h unter dem
Rückflußkühler erhitzt. Diese Lösung wurde im Eisbad
abgekühlt und 0,08 Mole Stearoylchlorid wurden unter Rühren innerhalb von 15 min
dazugegeben. Die Lösung wurde für 15 min unter dem Rückflußkühler erhitzt, abgekühlt und
dann 50 g zertrümmertes Eis dazugegeben. Die Lösung wurde in Gegenwart des Farbstoffes
Kongo Rot mit 5%iger Schwefelsäure bis zum Umschlagspunkt angesäuert. Anschließend
wurden 70ml Ethanol dazugegeben und die zwei Phasen voneinander getrennt. Die
benzolhaltige Phase wurde insgesamt dreimal mit 10% Ethanol gewaschen und dann über
Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum
entfernt.
Eine Natriummethanolat Lösung wurde hergestellt, indem 2,1 g Natrium in 63 ml abs.
Methanol unter Rühren gelöst wurden. Diese Lösung wurde zu dem eingeengten Rückstand
gegeben und für 8 h bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Lösung wurden dann 30 g
zertrümmertes Eis gegeben und dann in Gegenwart des Farbstoffes Kongo Rot mit 10%iger
Schwefelsäure bis zum Umschlagspunkt angesäuert. Der 3-Oxoeicosansäuremethylester
wurde mit Petrolether extrahiert. Die vereinten Petroletherfraktionen wurden mit Wasser
gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Rotationsverdampfer
unter Vakuum entfernt. Das Produkt wurde insgesamt dreimal in Petrolether umkristallisiert.
H33C16
O
Cl
H33C16
O O
O
MATERIAL UND METHODEN 109
Ausbeute: 83%
Schmelzpunkt: 52-54°C 1H-NMR Spektrum (CDCl3): 0.88 (t, -CH3), 1.23 (m, -(CH2)16-), 1.56 (m, -CH2-CH2-CO-),
2.15 (t, -CH2-CO-, E-Enolform), 2.32 (t, -CH2-CO-, Z-Enolform), 2.50 (t, -CH2-CO-,
Ketoform), 3.42 (s, -CO-CH2-CO-, Ketoform), 3.70 (s, -COH=CH-COO-, Z-Enolform), 3.71
(s, -OCH3), 4.96 (s, -COH=CH-COO-, E-Enolform).
Massenspektrum: m/z 341 (M+1)
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Lebenslauf Personalien
Vor- und Zuname: Thomas Delong
Geburtstag: 04.11.1974
Geburtsort: Erlangen
Familienstand: verheiratet, 1 Kind
Schulbildung
09/1981 - 07/1985 Grundschule Büchenbach, Erlangen
09/1985 - 12/1991 Christian-Ernst-Gymnasium, Erlangen
01/1992 - 06/1992 San-Ramon-Valley-Highschool in Danville, Kalifornien USA
09/1992 - 06/1993 Mercer-Island-Highschool auf Mercer Island, Washington USA
Abschluss: „Highschool Diploma“
09/1993 - 06/1995 Seattle University in Seattle, Washington USA
Abschluss: „Associate of Arts“
09/1993 - 06/1995 Anerkennung des „Associates of Arts“ als deutsche
Hochschulzugangsberechtigung durch die Bezirksregierung
Düsseldorf.
Studium
10/1995 - 05/2000 Eberhard-Karls-Universität Tübingen
Diplomstudiengang Chemie
05/2000 - 07/2002 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen
Diplomstudiengang Chemie
Abschluss: Dipl.-Chem. Univ.
08 / 2002 - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen
Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie: Untersuchungen zur
Reaktionsweise und physiologischen Funktion des
Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae