NextSeq 550Dx-Gerät Packungsbeilage (1000000030326) ·...

NextSeq™ 550Dx-Gerät

FÜR IN-VITRO-DIAGNOSTIK

Katalog-Nr. 20005715

Bestimmungsgemäße VerwendungDas NextSeq 550Dx-Gerät ist für die Sequenzierung von DNA-Bibliotheken bei Verwendung von In-vitro-Diagnose-Assays vorgesehen. Das NextSeq 550Dx-Gerät darf nur mit In-vitro-Diagnose-Reagenzien undAnalysesoftware verwendet werden, die spezifisch registriert, zertifiziert oder zugelassen sind.

VerfahrensprinzipienDasIllumina NextSeq 550Dx-Gerät ist für die Sequenzierung von DNA-Bibliotheken mit In-vitro-Diagnostik-Assays vorgesehen. Für die Zugabe nutzt das NextSeq 550Dx aus DNA vorbereiteteBibliotheken, bei denen amplifizierten Targets Probenindizes und Erfassungssequenzen hinzugefügtwerden. Die Probenbibliotheken werden auf einer Fließzelle erfasst und auf dem Gerät unter Verwendungvon SBS-Chemie (Sequencing by Synthesis, Sequenzierung durch Synthese) sequenziert. Die SBS-Chemie verwendet eine Methode mit reversiblen Terminatoren, um einzelne mit Fluoreszenzfarbstoffmarkierte Nukleotidbasen zu erkennen, die in wachsende DNA-Stränge eingebaut sind. DieEchtzeitanalyse-Software (RTA) führt die Bildanalyse sowie das Base-Calling durch und weist jeder Basefür jeden Sequenzierungszyklus einen Qualitäts-Score zu. Nach Abschluss der Primäranalyse kann dieSekundäranalyse auf dem Gerät ausgeführt werden, um Base-Calls zu verarbeiten. Das NextSeq 550Dx-Gerät verwendet je nach Workflow verschiedene Module für die Sekundäranalyse. Bei den Modulen fürKeimbahn- und somatische Varianten umfasst die Verarbeitung das Demultiplexing, die Generierung vonFASTQ-Dateien, das Alignment, das Varianten-Calling und die Generierung von VCF- sowie gVCF-Dateien (Varianten-Call-Format bzw. genomisches Varianten-Call-Format). Die VCF- und gVCF-Dateienenthalten Informationen zu Varianten, die an spezifischen Positionen in einem Referenzgenom gefundenwurden.

Dual-Boot-KonfigurationDas NextSeq 550Dx-GerätNextSeq 550Dx-Gerät verfügt über eine Dual-Boot-Konfiguration, die esermöglicht, das Gerät entweder im Dx-Modus (Diagnose) oder im RUO-Modus (nur fürForschungszwecke) zu betreiben. Sequenzierungsassays für die In-vitro-Diagnostik, einschließlich derModule für Keimbahn- und somatische Varianten, werden im Diagnosemodus durchgeführt. ImDiagnosemodus können nur IVD-Sequenzierungsreagenzien eingesetzt werden. Die Leistungsmerkmaleund Verfahrenseinschränkungen für das NextSeq 550Dx-Gerät wurden mittels der Module für Keimbahn-und somatische Varianten im Diagnosemodus bestimmt.

Einschränkungen des Verfahrens1 Für In-vitro-Diagnostik.2 Die Module für Keimbahn- und somatische Varianten können in Verbindung mit dem NextSeq 550Dx High

Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) oder dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen)Folgendes leisten:

u Sequenzierungsausgabe ≥ 90 Gigabasen (Gb)

u Read-Länge (bei Paired-End-Läufen) 2 x 150 Basenpaare (bp)

u Anteil der Basen mit Q30 oder höher beträgt ≥ 75 % bei einer Read-Länge von 2 x 150 bp75 % der Basen oder mehr haben Qualitäts-Scores auf der Phred-Skala von ≥ 30, was auf eine Base-Call-Genauigkeit von über 99,9 % hindeutet.

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3 Reads mit Indels (Insertionen, Deletionen und Kombinationen daraus), deren Inhalt eine Länge von mehr als25 Basenpaaren (bp) aufweist, werden von der Assay-Software nicht aligniert. Indels mit einer Länge von> 25 bp können von der Assay-Software nicht identifiziert werden.

4 Möglicherweise werden Amplikon-Reads mit extremen Varianteninhalten von der Assay-Software nicht aligniert,was dann dazu führen kann, dass die Region als Wildtyp gemeldet wird. Zu extremen Inhalten gehören:

u Reads mit mehr als drei Indels

u Reads mit einer Länge von mindestens 30 bp und einem SNV-Inhalt (Single Nucleotide Variant,Einzelnukleotidvariante) von mehr als 4 % der Gesamtlänge des Amplikon-Targets (ohne Sondenregionen)

u Reads mit einer Länge von < 30 bp und einem SNV-Gehalt von > 10 % der Gesamtlänge des Amplikons(einschließlich Sondenregionen)

5 Große Varianten, wie Mehrfachnukleotidvarianten (MNV) und große Indels, werden in der Ausgabe-VCF-Dateimöglicherweise als separate kleinere Varianten aufgeführt.

6 Deletions-Varianten werden ggf. herausgefiltert oder verpasst, wenn sie zwei Amplikons auf der Platte umfassenund die Länge der Deletion der Überlappung der beiden Amplikons entspricht oder diese übertrifft.

7 Das System kann keine Indels erkennen, wenn diese unmittelbar an einen Primer angrenzend auftreten und eskein überlappendes Amplikon gibt. Der Assay kann in Regionen mit überlappenden Amplikons Deletionen nichterkennen, wenn die überlappende Region kleiner als die zu erkennende Deletion ist. Wenn es sich bei derüberlappenden Region zwischen zwei angrenzenden Amplikons beispielsweise um zwei Basen handelt, kann derAssay keine Deletionen erkennen, die beide Basen umfassen. Die Deletion einer einzelnen dieser Basen kannerkannt werden.

8 Wie bei jedem auf Hybridisierung basierenden Workflow zur Bibliotheksvorbereitung können zugrundeliegendePolymorphismen, Mutationen, Insertionen oder Deletionen in Oligonukleotid-bindenden Regionen dieuntersuchten Allele und die Anzahl der während der Sequenzierung erfolgten Calls beeinträchtigen. Beispiele:

u Eine Variante in der Phase mit einer Variante in der Primer-Region wird möglicherweise nicht amplifiziert, waszu einem falsch negativen Ergebnis führt.

u Varianten in der Primer-Region könnten die Amplifikation des Referenz-Allels verhindern, was zu einemfehlerhaften homozygoten Varianten-Call führt.

u Indel-Varianten in der Primer-Region können an dem an den Primer angrenzenden Read-Ende zu einemfalsch positiven Call führen.

9 Indels können aufgrund von Strangverzerrungen herausgefiltert werden, wenn sie in der Nähe eines Read-Endesauftreten und während des Alignments einem Soft-Clipping unterzogen werden.

10 Kleine MNVs wurden nicht validiert und werden nur im Modul für somatische Varianten gemeldet.11 Deletionen werden in der VCF-Datei unter der Koordinate der vorhergehenden Base gemäß VCF-Format

gemeldet. Daher muss bei angrenzenden Varianten vor dem Melden berücksichtigt werden, dass ein einzelnerBase-Call eine homozygote Referenz ist.

12 Keimbahn-spezifische Einschränkungen:

u Unter Verwendung des Local Run Manager-Moduls für Keimbahn-Varianten für NextSeq 550Dx ist dasNextSeq 550Dx-Gerät darauf ausgelegt, qualitative Ergebnisse für das Keimbahn-Varianten-Calling (z. B.homozygote, heterozygote oder Wildtyp-Ergebnisse) zu liefern.

u Bei Verwendung in Kombination mit dem Keimbahn-Varianten-Modul beträgt die für ein genaues Varianten-Calling benötigte Mindestabdeckung pro Amplikon das 150-Fache. Es werden 150 DNA-Fragmentebenötigt, was 300 überlappenden Paired-End-Reads entspricht. Die Anzahl der Proben und die Gesamtzahlder Zielbasen beeinflussen die Abdeckung. GC-Inhalt und andere genomische Inhalte können dieAbdeckung beeinträchtigen.

u Kopienzahlvarianten haben einen Einfluss darauf, ob eine Variante als homozygot oder heterozygotidentifiziert wird.

u Varianten in bestimmten repetitiven Kontexten werden in den VCF-Dateien herausgefiltert. Der RMxN-Wiederholungsfilter wird verwendet, um Varianten zu filtern, wenn die gesamte oder ein Teil derVariantensequenz im Referenzgenom angrenzend an die Variantenposition wiederholt vorkommt. Beim

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NextSeq550Dx-Gerät

Keimbahn-Varianten-Calling sind mindestens neun Wiederholungen in der Referenz notwendig, damitVarianten gefiltert werden. Dabei werden nur Wiederholungen mit Längen von bis zu 5 bp (R5 x 9)berücksichtigt.

u Ein Indel und eine SNV an einem einzelnen Locus kann dazu führen, dass nur eine Variante gemeldetwird.

13 Spezifische Einschränkungen für somatische Varianten.

u Unter Verwendung des Moduls für somatische Varianten ist das NextSeq 550Dx-System daraufausgelegt, qualitative Ergebnisse für das Calling von somatischen Varianten (z. B. das Vorhandenseineiner somatischen Variante mit einer Variantenhäufigkeit von 0,026 oder mehr mit einerNachweisgrenze von 0,05) zu liefern.

u Bei Verwendung in Kombination mit dem Modul für somatische Varianten beträgt die für ein genauesVarianten-Calling benötigte Mindestabdeckung pro Amplikon das 450-Fache pro Oligonukleotid-Pool. Pro Oligonukleotid-Pool werden 450 DNA-Fragmente benötigt, was 900 überlappenden Paired-End-Reads entspricht. Die Anzahl der Proben und die Gesamtzahl der Zielbasen beeinflussen dieAbdeckung. GC-Inhalt und andere genomische Inhalte können die Abdeckung beeinträchtigen.

u Beim Calling somatischer Varianten werden Varianten nur dann gefiltert, wenn mindestens sechsWiederholungen in der Referenz vorhanden sind. Dabei werden nur Wiederholungen mit Längen vonbis zu 3 bp (R3 x 6) berücksichtigt.

u Das Modul für somatische Varianten kann nicht zwischen Keimbahn- und somatischen Variantenunterscheiden. Das Modul ist darauf ausgelegt, Varianten über einen Bereich vonVariantenhäufigkeiten hinweg zu erkennen. Jedoch kann die Variantenhäufigkeit nicht dazu verwendetwerden, um somatische Varianten von Keimbahn-Varianten zu unterscheiden.

u Normales Gewebe in der Probe beeinträchtigt die Erkennung von Varianten. Die gemeldeteNachweisgrenze basiert auf einer Variantenhäufigkeit bezogen auf die Gesamt-DNA, die aus demTumor und aus normalem Gewebe extrahiert wurde.

Produktkomponenten1 NextSeq 550Dx-Gerät (Katalog-Nr. 20005715)2 Die Software für das NextSeq 550Dx-Gerät umfasst folgende Komponenten:

Software-Anwendung

Funktion Beschreibung

NextSeq 550DxOperatingSoftware (NOS)

Steuert denBetrieb desGeräts.

Die NOS-Softwareanwendung steuert den Betrieb des Geräts während derSequenzierung und generiert Bilder, die anschließend von derEchtzeitanalyse-Software (RTA) verwendet werden.

Echtzeitanalyse-Software (RTA)

Führt diePrimäranalysedurch.

Die RTA-Softwareanwendung konvertiert die von der NOS für jede Platte proZyklus des Sequenzierungslaufs erzeugten Bilder in Base-Call-Dateien.Diese werden anschließend von den Local Run Manager-Analysemodulenverarbeitet. Die RTA-Softwareanwendung hat keine Benutzeroberfläche.

Local RunManager

Benutzeroberflächefür dieModulauswahl

Die Local Run Manager-Software ist eine im Gerät integrierte Lösung für dieBenutzerverwaltung, die Auswahl des entsprechenden Analysemoduls unddie Statusüberwachung.

Modul fürsomatischeVarianten

Führt dieSekundäranalysedurch.

Dieses Local Run Manager-Analysemodul verarbeitet Base-Calls über dieSekundäranalyse. Die Verarbeitung umfasst das Demultiplexing, dieGenerierung von FASTQ-Dateien, das Alignment, das Varianten-Calling unddie Berichterstellung. Der Varianten-Caller (Pisces) generiert VCF-Dateienmit Informationen zu Varianten, die an spezifischen Positionen in einemReferenzgenom gefunden wurden. In den Dateien wird auch die festgestellteVariantenhäufigkeit protokolliert.

Modul fürKeimbahn-Varianten

Führt dieSekundäranalysedurch.

Dieses Local Run Manager-Analysemodul verarbeitet Base-Calls über dieSekundäranalyse. Die Verarbeitung umfasst das Demultiplexing, dieGenerierung von FASTQ-Dateien, das Alignment, das Varianten-Calling unddie Berichterstellung. Der Varianten-Caller (Pisces) generiert VCF-Dateienmit Informationen zu Varianten, die an spezifischen Positionen in einemReferenzgenom gefunden wurden, und identifiziert jede Variante alsheterozygot oder homozygot.


NextSeq550Dx-Gerät

Betriebsbedingungen

Umgebungsfaktor Spezifikation

Temperatur Die Labortemperatur muss 19 °C bis 25 °C (22 °C ± 3 °C) betragen. Diese Temperatur istdie Betriebstemperatur des Geräts. Während eines Laufs darf die Umgebungstemperaturnicht um mehr als ± 2 °C schwanken.

Luftfeuchtigkeit Es muss eine relative, nicht kondensierende Luftfeuchtigkeit zwischen 20 % und 80 %aufrechterhalten werden.

Geräte und Materialien

Erforderliche, separat erhältliche Geräte undMaterialienNextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen), Katalog-Nr. 20019554

NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen), Katalog-Nr. 20028871

Erforderliche, jedoch nicht bereitgestellte Geräte undMaterialien

Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien für Sequenzierungsläufe

Verbrauchsmaterial Anbieter Zweck

Alkoholtupfer, 70 % IsopropyloderEthanol, 70 %

VWR, Katalog-Nr. 95041-714(oder vergleichbar)Allgemeiner Laborlieferant

Reinigung der Fließzelle und allgemeineVerwendung

Labortücher, fusselfrei VWR, Katalog-Nr. 21905-026 (oder vergleichbar)

Reinigung der Fließzelle und allgemeineVerwendung

Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien für die Gerätewartung

Verbrauchsmaterial Anbieter Zweck

NaOCl, 5 %(Natriumhypochlorit)

Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. 239305(oder vergleichbares Produkt inLaborqualität)

Waschen des Geräts mithilfe desmanuellen Nachwaschlaufs; verdünnt auf0,12 %

Tween 20 Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P7949 Waschen des Geräts mit manuellenWaschoptionen; verdünnt auf 0,05 %

Wasser, Laborqualität Allgemeiner Laborlieferant Waschen des Geräts (manuellerWaschlauf)

Luftfilter Illumina, Katalog-Nr. 20022240 Reinigen der Luft, die das Gerät zurKühlung aufnimmt

Richtlinien für Wasser in LaborqualitätBei Geräteverfahren sollte immer deionisiertes Wasser bzw. Wasser in Laborqualität verwendet werden.Verwenden Sie niemals Leitungswasser. Verwenden Sie nur die folgenden oder äquivalente Wasserarten:

u Deionisiertes Wasser

u Illumina PW1

u 18-Megohm-(MΩ)-Wasser

u Milli-Q-Wasser

u Super-Q-Wasser

u Wasser in Molekularbiologie-Qualität


NextSeq550Dx-Gerät

Warn- und Vorsichtshinweise

VORSICHT

Gemäß geltender Gesetze ist der Verkauf oder die Nutzung dieses Geräts nur über einen Arztbzw. im Auftrag eines Arztes oder einer anderen Fachperson mit entsprechender Lizenz zulässig.

1 Einige Komponenten der von Illumina bereitgestellten Reagenzien für das NextSeq 550Dx-Gerät enthalten potenziell gefährliche Chemikalien. Es kann daher durch Inhalation oderorale Aufnahme, Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personenkommen. Tragen Sie eine entsprechende für das Expositionsrisiko geeigneteSchutzausrüstung, einschließlich Schutzbrille, Handschuhen und Laborkittel. VerbrauchteReagenzien sind als chemische Abfälle zu behandeln. Entsorgen Sie sie daher gemäß dengeltenden regionalen, nationalen und lokalen Gesetzen und Vorschriften. Zusätzliche umwelt-,gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie in den Sicherheitsdatenblättern (SDS,Safety Data Sheet) unter support.illumina.com/sds.html.

2 Handhaben Sie alle Blutproben so, als wären sie mit HIV (Humanes Immundefizienzvirus), HBV (HumanesHepatitis-B-Virus) oder anderen über das Blut übertragenen Erregern infiziert (allgemein gültigeVorsichtsmaßnahmen).

3 Wenn die beschriebenen Verfahren nicht eingehalten werden, kann dies zu fehlerhaften Ergebnissen odereiner wesentlichen Minderung der Probenqualität führen.

4 Wenden Sie die routinemäßigen Vorsichtsmaßnahmen für das Labor an. Pipettieren Sie nicht mit demMund. Essen, trinken oder rauchen Sie nicht in ausgewiesenen Arbeitsbereichen. Tragen Sie beimUmgang mit Proben und Kit-Reagenzien Einweg-Handschuhe und einen Laborkittel. Waschen Sie sichnach dem Umgang mit Proben und Kit-Reagenzien gründlich die Hände.

5 Ordnungsgemäße Laborpraktiken und eine gute Laborhygiene sind unerlässlich, um eine Kontaminationvon Reagenzien, Instrumenten und Proben genomischer DNA durch PCR-Produkte zu verhindern. EineKontamination durch PCR-Produkte kann zu falschen und unzuverlässigen Ergebnissen führen.

6 Stellen Sie zur Verhinderung einer Kontamination sicher, dass die Voramplifikations- undNachamplifikationsbereiche über eigene Geräte und Verbrauchsmaterialien (z. B. Pipetten,Pipettenspitzen, Hitzeblöcke, Vortexer und Zentrifugen) verfügen.

7 Die Index-zu-Proben-Paarung muss genaudem ausgedrucktenPlatten-Layoutentsprechen. Local RunManager fülltdieIndex-PrimerautomatischmitdenzugehörigenProbennamenaus, wenndiese indas Modul eingegebenwerden. DemBenutzerwird empfohlen, die mitProbenverbundenen Index-Primerzuüberprüfen, bevorerdenSequenzierungslauf startet.Abweichungenzwischendem Probenblattund dem Plattenlayout führenzueinem VerlustderpositivenProbenidentifikationund fehlerhaftenErgebnisberichten.

8 Es wird dringend empfohlen, eine (vom Benutzer bereitzustellende) Virenschutz-Software zu installieren,um den Computer vor Viren zu schützen. Installationsanweisungen finden Sie im Benutzerhandbuch.

9 Betreiben Sie das NextSeq 550Dx-Gerät nicht, wenn ein Gehäuseteil entfernt wurde. Wenn Sie das Gerätbetreiben, während eines oder mehrere Gehäuseteile entfernt sind, sind Sie möglicherweise Netz- undGleichstromspannungen ausgesetzt.

10 Berühren Sie nicht den Fließzellentisch in der Fließzellenkammer. Das Heizelement in der Kammer arbeitetbei 22 °C bis 95 °C, sodass es zu Verbrennungen kommen kann.

11 Das Gerät wiegt ca. 84 kg und kann schwere Verletzungen verursachen, wenn es fallen gelassen oderfalsch behandelt wird.

GebrauchsanweisungDie folgende Gebrauchsanweisung gilt für die Ausführung des Moduls für Keimbahn-Varianten und desModuls für somatische Varianten im Diagnosemodus auf dem NextSeq 550Dx-Gerät bei Verwendung desNextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) oder des NextSeq 550Dx High Output ReagentKit v2.5 (300 Zyklen).

Eingeben von LaufinformationenDetaillierte Anweisungen finden Sie im Referenzhandbuch zum NextSeq 550Dx-Gerät (Dokument-Nr. 1000000009513) und im Handbuch des entsprechenden Local Run Manager-Moduls.


NextSeq550Dx-Gerät

http://support.illumina.com/sds.html

Festlegen von Parametern1 Melden Sie sich bei Local Run Manager an.2 Wählen Sie Create Run (Lauf erstellen) und dann Somatic Variant (Somatische Varianten) oder

Germline Variant (Keimbahn-Varianten).3 Geben Sie einen Namen ein, mit dem der Lauf von der Sequenzierung bis zur Analyse identifiziert werden

kann.Verwenden Sie alphanumerische Zeichen, Leerzeichen, Unterstriche oder Bindestriche.

4 [Optional] Geben Sie eine Laufbeschreibung ein, die hilft, den Lauf zu identifizieren.Verwenden Sie alphanumerische Zeichen, Leerzeichen, Unterstriche oder Bindestriche.

5 Wählen Sie die Anzahl der Proben und das Index-Set aus der Dropdown-Liste aus.Beachten Sie Folgendes, wenn Sie eine Auswahl treffen.

u In der Dropdown-Liste wird die Anzahl der Proben zusammen mit einem Index-Set aufgeführt. „24-Set 1“gibt z. B. Folgendes an: 24 zu testende Proben mit Indizes aus Index-Set 1.

u Die Index-Set-Nummern beziehen sich auf verschiedene Sets von i5- und i7-Indexpaaren. Sowohl Set 1als auch Set 2 bieten Index-Diversität. Es werden zwei Index-Sets angeboten, um zu verhindern, dass eineinzelnes Set aufgebraucht wird.

u Wählen Sie die Anzahl der Proben, die der Anzahl der zu testenden Proben am nächsten ist. Wenn diegenaue Anzahl der Proben, die Sie testen, nicht aufgeführt ist, wählen Sie die nächstkleinere Zahl. WennSie beispielsweise 18 Proben testen möchten, wählen Sie 16 Proben aus.

u Empfohlene Proben-Wells und Index-Kombinationen, die die Anforderungen an die Index-Diversitäterfüllen, werden grün hervorgehoben.

Importieren von Manifestdateien für den Lauf1 Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Manifestdateien an einem zugänglichen Netzwerkspeicherort

oder auf einem USB-Laufwerk verfügbar sind.2 Wählen Sie Import Manifests (Manifeste importieren).3 Navigieren Sie zur Manifestdatei und wählen Sie die Manifeste aus, die Sie hinzufügen möchten.

HINWEIS

Um Manifestdateien für alle Läufe verfügbar zu machen, die das Analysemodul für Keimbahn-bzw. somatische Varianten verwenden, fügen Sie die Dateien über die Funktion „ModuleSettings“ (Moduleinstellungen) hinzu. Für diese Funktion werden Administratorrechte benötigt.Weitere Informationen finden Sie im Referenzhandbuch zum NextSeq 550Dx-Gerät (Dokument-Nr. 1000000009513).

Angeben der Proben für den LaufWählen Sie eine der folgenden Optionen, um die Proben für den Lauf festzulegen, und führen Sie dieentsprechenden Schritte durch.

u Enter samples manually (Manuelles Eingeben der Proben): Verwenden Sie die leere Tabelle auf demBildschirm „Create Run“ (Lauf erstellen).

u Import samples (Importieren von Proben): Navigieren Sie zu einer externen Datei mit kommagetrenntenWerten (*.csv). Im Bildschirm „Create Run“ (Lauf erstellen) steht eine Vorlage zum Herunterladen zurVerfügung.

ManuellesEingebenderProben1 Geben Sie einen eindeutigen Probennamen (Analysemodul für somatische Varianten) oder eine

eindeutige Proben-ID (Analysemodul für Keimbahn-Varianten) ein.Verwenden Sie alphanumerische Zeichen, Bindestriche oder Unterstriche.

2 [Optional] Bei positiven oder negativen Kontrollproben klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählenSie den Kontrolltyp aus.Die Kontrollprobe in einem Proben-Well wird automatisch für den entsprechenden Well in dem anderenPool übernommen.

3 [Optional] Geben Sie im Feld „Sample Description“ (Probenbeschreibung) eine Probenbeschreibung ein.Verwenden Sie alphanumerische Zeichen, Bindestriche oder Unterstriche.


NextSeq550Dx-Gerät

4 Wählen Sie einen Index-1-Adapter aus der Dropdown-Liste „Index 1 (i7)“ aus.Wenn Sie vorgeschlagene Proben-Wells verwenden, füllt die Software automatisch die i7- und i5-Indexadapter aus, die den Anforderungen an die Index-Diversität entsprechen. Wenn die genaue Anzahlder Proben, die Sie testen, nicht aufgeführt ist, achten Sie darauf, Indexadapter für zusätzliche Wellsauszuwählen.

5 Wählen Sie einen Index-2-Adapter aus der Dropdown-Liste „Index 2 (i5)“ aus.6 Wählen Sie eine Manifestdatei aus der Dropdown-Liste „Manifest“ aus.

Proben im Pool A erfordern ein anderes Manifest als Proben im Pool B.7 Wählen Sie eine der folgenden Optionen zum Anzeigen, Drucken oder Speichern des Plattenlayouts,

sodass es bei der Vorbereitung von Bibliotheken als Referenz zur Verfügung steht:

— Wählen Sie das Symbol Print (Drucken), um das Plattenlayout anzuzeigen. Wählen Sie Print(Drucken), um es auszudrucken.

— Wählen Sie Export (Exportieren), um Probeninformationen in eine externe Datei zu exportieren.8 Wählen Sie Save Run (Lauf speichern).

ImportierenvonProben1 Wählen Sie Import Samples (Proben importieren) und navigieren Sie zum Speicherort der Datei mit den

Probeninformationen. Sie können zwei Dateitypen importieren.— Wählen Sie auf dem Bildschirm „Create Run“ (Lauf erstellen) die Option Template (Vorlage), um ein

neues Plattenlayout zu erstellen. Die Vorlagendatei enthält die korrekten Spaltenüberschriften für denImport. Tragen Sie in jeder Spalte Informationen zu den Proben im Lauf ein. Löschen Sie dieProbeninformationen in nicht genutzten Zellen und speichern Sie anschließend die Datei.

— Verwenden Sie eine Datei mit Probeninformationen, die mittels der Export-Funktion aus demAnalysemodul für somatische Varianten bzw. für Keimbahn-Varianten exportiert wurde.

2 Wählen Sie das Symbol Print (Drucken), um das Plattenlayout anzuzeigen.3 Wählen Sie Print (Drucken), um das Plattenlayout auszudrucken, damit es bei der Vorbereitung von

Bibliotheken als Referenz zur Verfügung steht.4 Wählen Sie Save Run (Lauf speichern).

Vorbereiten der ReagenzienkartuscheBefolgen Sie die Anweisungen zur Reagenzienkartusche sorgfältig, um eine erfolgreiche Sequenzierungzu gewährleisten.1 Nehmen Sie die Reagenzienkartusche aus dem -25 °C bis -15 °C kalten Lagerort heraus.2 Wählen Sie eine der folgenden Methoden zum Auftauen der Reagenzien. Tauchen Sie die Kartusche nicht

in Wasser. Trocknen Sie die Kartusche nach dem Auftauen ab, bevor Sie mit dem nächsten Schrittfortfahren.

Temperatur Auftauzeit Stabilitätsgrenze

Wasserbad bei 15 °C bis30 °C

60 Minuten Nicht länger als 6 Stunden

2 °C bis 8 °C 7 Stunden Nicht länger als 5 Tage

HINWEIS

Wenn mehrere Kartuschen im selben Wasserbad aufgetaut werden, verlängert sich die Auftauzeit.

3 Invertieren Sie die Kartusche fünfmal, um die Reagenzien zu mischen.4 Untersuchen Sie den Boden der Kartusche, um sicherzustellen, dass die Reagenzien aufgetaut und frei

von Ausfällungen sind. Vergewissern Sie sich, dass die Positionen 29, 30, 31 und 32 aufgetaut sind. Siesind größer als die anderen und haben die längste Auftaudauer.

5 Klopfen Sie leicht auf den Tisch, um die Anzahl der Luftblasen zu verringern.Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie direkt mit dem Laden der Probe und dem Konfigurieren desLaufs fortfahren.

Vorbereiten der Fließzelle1 Nehmen Sie einen neuen Fließzellenkarton aus dem Lagerort mit einer Temperatur von 2 °C bis 8 °C.


NextSeq550Dx-Gerät

2 Entfernen Sie die Folienverpackung des Kartons und legen Sie ihn für 30 Minuten bei Raumtemperaturbeiseite.

Vorbereiten von Bibliotheken für die SequenzierungDenaturieren und verdünnen Sie Ihre Bibliotheken auf ein Ladevolumen von 1,3 ml. In der Praxis kanndie Ladekonzentration je nach Bibliotheksvorbereitungs- und Quantifizierungsmethode variieren. DieVerdünnung von Probenbibliotheken hängt von der Komplexität der Oligonukleotid-Pools ab. EineAnleitung zur Vorbereitung von Probenbibliotheken für die Sequenzierung, einschließlich derVerdünnung und des Poolings von Bibliotheken, finden Sie in der Gebrauchsanweisung im Abschnitt fürdie entsprechende Bibliotheksvorbereitungskit. Es ist erforderlich, die Clusterdichte auf dem NextSeq550Dx zu optimieren.

Laden der Bibliotheken in die Reagenzienkartusche1 Reinigen Sie die Verschlussfolie, die den mit Load Library Here (Bibliothek hier laden) beschrifteten

Behälter 10 abdeckt, mit einem fusselfreien Tuch.2 Durchstechen Sie die Folie mit einer sauberen 1-ml-Pipettenspitze.3 Geben Sie 1,3 ml der vorbereiteten Bibliotheken in Behälter Nr. 10 mit dem Namen Load Library Here

(Bibliothek hier laden). Achten Sie beim Zuführen der Bibliotheken darauf, die Verschlussfolie nicht zuberühren.

Abbildung 1 Laden der Bibliotheken

Konfigurieren eines Sequenzierungslaufs1 Melden Sie sich mit Ihrem Kennwort für Local Run Manager beim NextSeq 550Dx-Gerät an.2 Wählen Sie im Startbildschirm der NOS-Software die Option Sequence (Sequenzieren).3 Wählen Sie einen Lauf aus der Liste aus und wählen Sie anschließend Next (Weiter).

Die folgenden Laufkonfigurationsbildschirme werden nacheinander geöffnet: „Load Flow Cell“ (Fließzelleladen), „Load Buffer Cartridge“ (Pufferkartusche laden), „Load Reagent Cartridge“ (Reagenzienkartuscheladen) und „Pre-Run Check“ (Selbsttest).

4 Wenn der Bildschirm „Load Flow Cell“ (Fließzelle laden) angezeigt wird, reinigen und laden Sie dieFließzelle.

u Nehmen Sie die Fließzelle aus der Folienverpackung.

u Öffnen Sie die klare, aufklappbare Plastikverpackung und nehmen Sie die Fließzelle heraus.

u Reinigen Sie die Glasoberfläche der Fließzelle mit einem fusselfreien Alkoholtupfer. Trocknen Sie dasGlas mit einem fusselfreien Labortuch.

u Vergewissern Sie sich, dass die Glasoberfläche der Fließzelle sauber ist. Wiederholen Siegegebenenfalls den Reinigungsschritt.

u Entfernen Sie die gebrauchte Fließzelle aus dem vorherigen Lauf.

u Richten Sie die gebrauchte Fließzelle über den Ausrichtungsstiften aus und legen Sie sie auf denFließzellentisch.

5 Wählen Sie Load (Laden).Die Tür wird automatisch geschlossen, die Fließzellen-ID wird angezeigt und die Sensoren sind markiert.


NextSeq550Dx-Gerät

6 Befolgen Sie die Anweisungen der Software, um den Behälter mit den verbrauchten Reagenzien zu leeren,laden Sie die NextSeq 550Dx-Pufferkartusche und laden Sie die NextSeq 550Dx-Reagenzienkartusche.Wenn die NextSeq 550Dx-Pufferkartusche und -Reagenzienkartusche geladen sind, liest die Software dieRFID ein. Die IDs der Pufferkartusche und Reagenzienkartusche werden auf dem Bildschirm angezeigtund die Sensoren werden überprüft.

7 Wählen Sie nach Abschluss des automatisierten Selbsttests Start. (Nicht erforderlich, falls fürautomatischen Start konfiguriert.)

8 Wenn der Lauf beginnt, wird der Sequenzierungsbildschirm geöffnet. Dieser Bildschirm bietet eine visuelleDarstellung des aktuellen Laufs, einschließlich Intensitäten und Qualitäts-Scores (Q-Scores).

ErgebnisseDie Echtzeitanalyse (RTA) ist eine integrierte Software, die die Bildanalyse sowie das Base-Callingdurchführt und jeder Base für jeden Sequenzierungszyklus einen Qualitäts-Score zuweist. Wenn diePrimäranalyse abgeschlossen ist, beginnt das ausgewählte Local Run Manager-Modul auf dem NextSeq550Dx-Gerät automatisch mit der Sekundäranalyse. Die hier beschriebenen Sekundäranalyseverfahrenbeziehen sich auf die Module für Keimbahn- und somatische Varianten.

DemultiplexingBeim Demultiplexing wird jede Index-Read-Sequenz mit den für den Lauf angegebenen Indexsequenzenverglichen. In diesem Schritt werden keine Qualitätswerte berücksichtigt.

Index-Reads werden wie folgt identifiziert:

u Die Proben sind gemäß der Reihenfolge, in der sie für den Lauf aufgelistet sind, und mit 1 beginnenddurchnummeriert.

u Die Probennummer 0 ist für Cluster reserviert, die keiner Probe zugeordnet wurden.

u Cluster werden einer Probe zugewiesen, wenn die Indexsequenz genau übereinstimmt bzw. je Index-Readmaximal eine Nichtübereinstimmung festgestellt wird.

Generieren von FASTQ-DateienNach dem Demultiplexing generiert die Software temporäre Analysedateien im FASTQ-Format, demTextformat für die Darstellung von Sequenzen. FASTQ-Dateien enthalten die Reads jeder Probe und dieentsprechenden Qualitäts-Scores. Cluster, die den Filter nicht passiert haben, werden nichtaufgenommen.

Jede FASTQ-Datei enthält nur die Reads einer Probe. Der Name der Probe ist Bestandteil des FASTQ-Dateinamens. In den Modulen für Keimbahn- und somatische Varianten können acht FASTQ-Dateien proProbe und Oligo-Pool generiert werden, vier aus Read 1 und vier aus Read 2. Diese Ausgabe ergibt fürKeimbahn- respektive somatische Varianten insgesamt 8 und 16 FASTQ-Dateien pro Probe. FASTQ-Dateien sind die primären Eingabedateien für das Alignment.

AlignmentBeim Alignment werden Cluster von jeder Probe mithilfe eines beschränkten („banded“) Smith-Waterman-Algorithmus an den in der Manifestdatei angegebenen Amplikon-Sequenzen aligniert.

Der „banded“ Smith-Waterman-Algorithmus führt semiglobale Sequenz-Alignments durch, um ähnlicheRegionen zwischen zwei Sequenzen zu ermitteln. Statt die gesamte Sequenz zu betrachten, vergleichtder Smith-Waterman-Algorithmus Segmente aller möglichen Längen.

Jeder Paired-End-Read wird in Bezug auf sein Alignment mit den entsprechenden Sondensequenzendieses Reads untersucht.

u Read 1 wird anhand des umgekehrten Komplements der stromabwärts gelegenen lokusspezifischenOligos (Downstream Locus-Specific Oligos, DLSO) beurteilt.

u Read 2 wird anhand der stromaufwärts gelegenen lokusspezifischen Oligos (Upstream Locus-SpecificOligos, ULSO) bewertet.

u Wenn der Beginn eines Reads maximal eine Nichtübereinstimmung gegenüber der Sondensequenzaufweist, wird die volle Länge des Reads mit dem Amplikon-Ziel dieser Sequenz aligniert.


NextSeq550Dx-Gerät

u Wenn der Beginn eines Reads mit einer Sondensequenz dahin gehend übereinstimmt, dass er maximaldrei Unterschiede (Nichtübereinstimmungen oder Verschiebungen aufgrund vorangehender Indels)aufweist, wird die volle Länge des Reads mit dem Amplikon-Ziel dieser Sequenz aligniert.

u Indels innerhalb der DLSO und ULSO werden aufgrund der Assay-Chemie nicht beobachtet.Die Alignments werden nach den Nichtübereinstimmungsraten über die Region von Interesse oder dasgesamte Amplikon hinweg – je nach Länge des Amplikons – aus den Alignment-Ergebnissenherausgefiltert. Die herausgefilterten Alignments werden als „nicht aligniert“ in Alignment-Dateienprotokolliert und beim Varianten-Calling nicht berücksichtigt.

Varianten-CallingDer Varianten-Caller (Pisces) ist für das Calling von SNV- und Indel-Varianten aus für das Gerätvorbereiteten Bibliotheken konzipiert.

Berichte und zusätzliche AusgabedateienDie Variantenanalysemodule erstellen Berichte mit Kennzahlen, z. B. Sequenzierungstiefe und Anzahl derVarianten, in PDF- und tabulatorgetrennten Textdateien (*.txt). Die Module generieren außerdemAusgabedateien, wie VCF- und gVCF-Dateien (genomisches Varianten-Call-Format) für Varianten-Calling-Anwendungen.

Verfahren zur QualitätskontrolleDie NextSeq 550Dx-Software wertet jeden Lauf, jede Probe und jeden Base-Call anhand vonQualitätskontrollkennzahlen aus. Es wird empfohlen, auch positive und negative Kontrollproben in dieBibliotheksvorbereitung einzubeziehen und zu evaluieren. Bewerten Sie die Kontrollproben wie folgt:

• Negative Kontrollprobe (No Template Control) oder andere Negativkontrolle: Muss daserwartete Ergebnis erzeugen. Wenn die negative Kontrollprobe ein anderes als das erwartete Ergebnisgeneriert, ist möglicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgung oder eine fehlerhafte Aufzeichnung vonIndex-Primern aufgetreten oder es hat eine Kontamination stattgefunden.

• Positive Kontrollprobe: Muss das erwartete Ergebnis erzeugen. Wenn die positive Kontrollprobe einanderes als das erwartete Ergebnis generiert, ist möglicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgungoder eine fehlerhafte Aufzeichnung von Index-Primern aufgetreten.

LeistungsmerkmaleDie Leistungsmerkmale für das NextSeq 550Dx-Gerät wurden mittels der Module für Keimbahn- undsomatische Varianten mit dem TruSeq Custom Amplicon Kit Dx und dem NextSeq 550Dx High OutputReagent Kit v2 (300 Zyklen) bestimmt und mit dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5(300 Zyklen) bestätigt. Die Studien umfassten Probenindizierung, Probenverschleppung, DNA-Zugabe,analytische Sensitivität (Leerwertgrenze/Nachweisgrenze), Genauigkeit und Präzision sowieMethodenvergleich und Reproduzierbarkeit.

Die analytischen Studien mit dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) wurden fürdie Überprüfung von zuvor mit dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) bestimmtenLeistungsangaben konzipiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reagenzien-Kits (v2 und v2.5) beiVerwendung des TruSeq Custom Amplicon Kit Dx eine vergleichbare Leistung zeigen. DieLeistungsmerkmale bezüglich voranalytischer Faktoren, z. B. Extraktionsmethoden oder störendeSubstanzen, finden Sie in der Packungsbeilage zum TruSeq Custom Amplicon Kit Dx.

Definitionen von Berechnungen, die bei Leistungsmerkmalen verwendet wurden1 Die positive prozentuale Übereinstimmung (Positive Percent Agreement, PPA) wird als der Anteil der von

einer Referenzmethode als Varianten klassifizierten Loci berechnet, die vom Assay korrekt gemeldetwerden.u (Anzahl der Varianten-Loci, die vom Assay korrekt gemeldet werden) / (Gesamtzahl der Varianten-

Loci)Vom Assay gemeldete Varianten-Loci, die konkordant mit der Referenzmethode sind, sind echtpositive Werte (true positives, TP). Als Referenz-Calls oder unterschiedliche Varianten-Calls vom


NextSeq550Dx-Gerät

Assay gemeldete Varianten-Loci sind falsch negative Werte (false negatives, FN).2 Die negative prozentuale Übereinstimmung (Negative Percent Agreement, NPA) wird als der Anteil der von

einer Referenzmethode als Wildtyp klassifizierten Loci berechnet, die vom Assay korrekt gemeldetwerden.u (Anzahl der Wildtyp-Loci, die vom Assay korrekt gemeldet werden) / (Gesamtzahl der Wildtyp-Loci)

Vom Assay gemeldete Wildtyp-Loci, die konkordant mit der Referenzmethode sind, sind echtnegative Werte (true negatives, TN). Wildtyp-Loci, die vom Assay als Varianten gemeldet werden,sind falsch positive Werte (false positives, FP).

3 Die prozentuale Gesamtübereinstimmung (overall percent agreement, OPA) wird als der Anteil der Lociberechnet, die vom Assay in Bezug auf eine Referenzmethode korrekt gemeldet werden.u ((Anzahl der vom Assay korrekt gemeldeten Varianten-Loci) + (Anzahl der vom Assay korrekt

gemeldeten Wildtyp-Loci)) / ((Gesamtzahl der Varianten-Loci) + (Gesamtzahl der Wildtyp-Loci))4 Die Berechnungen von PPA, NPA und OPA umfassen keine „No Calls“ (Varianten- oder Referenz-Loci, die

einen oder mehrere Qualitätsfilter nicht erfüllen).5 Die Call-Rate der Autosomen wird als Gesamtzahl der Loci, die die Filter passieren, geteilt durch die

Gesamtzahl der sequenzierten Positionen der Chromosomen 1–22 berechnet. Die Chromosomen X und Ywerden nicht einbezogen. Dieser Messwert berücksichtigt nicht die Übereinstimmung der Calls mit derReferenzmethode.

NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) – Leistung

ProbenindizierungProben-Index-Primer, die während einer Bibliotheksvorbereitung hinzugefügt werden, weisen jederProben-DNA eine eindeutige Sequenz zu. Durch diese eindeutigen Sequenzen können mehrere Probenin einem einzigen Sequenzierungslauf zusammengefasst werden. Die Probenindizierung wird sowohlbeim Workflow für Keimbahn-Varianten als auch beim Workflow für somatische Varianten verwendet.Diese Studie verfolgte das Ziel, die minimale (8) und maximale (96) Anzahl von Proben zu bestimmen, diebei einem einzigen Sequenzierungslauf auf dem NextSeq 550Dx-Gerät verarbeitet werden können. Achteindeutige Platinum-Genome-Proben wurden mit 12 unterschiedlichen Kombinationen von Index-Primernje Probe getestet. Die Probenergebnisse aus vier Sequenzierungsläufen mit dem Modul für Keimbahn-Varianten wurden mit Platinum Genomes Version 2016-1.0 verglichen.

Im ersten Satz von Läufen wurden 96 eindeutig indizierte Probenbibliotheken mit einem repräsentativenAssay getestet, der für die Abfrage verschiedener Gene, die 12.588 Basen pro Strang über alle 23menschlichen Chromosomen hinweg abdecken, ausgelegt ist. Es sollte die Fähigkeit des Assaysüberprüft werden, für eine bestimmte Probe einen gleichbleibenden Genotypisierungsaufruf überverschiedene Index-Primer-Kombinationen hinweg vornehmen zu können. Anschließend wurden zweiSequenzierungsläufe mit acht eindeutig indizierten Probenbibliotheken durchgeführt, um die Mindestzahlder unterstützten Indizes zu ermitteln.

Bei den Läufen mit den 96 indizierten Probenbibliotheken lag die positive prozentuale Übereinstimmung(PPA) bei den SNVs zwischen 98,7 % und 100 %, bei den Insertionen und Deletionen betrug sie 100 %.Alle 96 Indexkombinationen wiesen eine negative prozentuale Übereinstimmung (NPA) von 100 % auf. DieLäufe mit den acht indizierten Probenbibliotheken wiesen für alle Indexkombinationen PPA-Werte von100 % (SNVs, Insertionen und Deletionen) und NPA-Werte von 100 % auf.

ProbenverschleppungDas NextSeq 550Dx-Gerät ermöglicht es, mehrere Proben und Kontrollproben in einem einzigenSequenzierungslauf zu sequenzieren. In einer Studie wurde das Ausmaß der Probenverschleppung ineinem Sequenzierungslauf (innerhalb des Laufs) und zwischen Sequenzierungsläufen (von Lauf zu Lauf)untersucht. Zwei Platinum-Genome-Proben, eine männliche und eine weibliche Probe, wurden mit einemrepräsentativen Assay untersucht. Dieser ist darauf ausgelegt, verschiedene Gene abzufragen, die 12.588Basen (150 Amplikons) über 23 unterschiedliche Chromosomen hinweg abdecken, einschließlich beiderGeschlechtschromosomen. Auf dem NextSeq 550Dx-Gerät erfolgte die Sequenzierung von Bibliothekenmit dem Modul für Keimbahn-Varianten. Die Verschleppung männlicher Proben in weibliche Probenwurde durch das Vorhandensein von Y-Chromosom-Amplikon-Reads in weiblichen Proben festgestellt.


NextSeq550Dx-Gerät

Die Verschleppung innerhalb eines Laufs kann während der Clusterbildung, beim Index-Zyklus-Base-Calling und beim Proben-Demultiplexing auftreten. Zur Untersuchung der Probenverschleppunginnerhalb eines Sequenzierungslaufs wurde ein Bibliothekenpool mit je 46 Replikaten der männlichen undweiblichen Proben plus vier Negativkontrollen einmal auf dem NextSeq 550Dx-Gerät sequenziert. DieProbenverschleppung innerhalb des Laufs wurde beurteilt, indem die Y-Chromosom-Amplikon-Abdeckung jedes weiblichen Replikats mit der durchschnittlichen Y-Chromosom-Amplikon-Abdeckungaller männlichen Replikate im Pool verglichen wurde. Die mittlere Verschleppung innerhalb des Laufs lagbei 0,084 %.

Zur Untersuchung der Probenverschleppung von Lauf zu Lauf wurden zwei Bibliothekenpools vorbereitetund nacheinander auf einem NextSeq 550Dx-Gerät sequenziert. Der erste Pool enthielt 46 Replikate derweiblichen Probe plus zwei Negativkontrollen. Der zweite Pool enthielt 46 Replikate der männlichen Probeplus zwei Negativkontrollen. Beide Pools verwendeten den gleichen Satz an Indexadaptern. Der Pool ausweiblichen Proben wurde zuerst sequenziert, dann folgte ein Sequenzierungslauf mit dem Pool ausmännlichen Proben. Anschließend wurde ein erneuter Sequenzierungslauf mit dem Pool aus weiblichenProben durchgeführt. Die Probenverschleppung von Lauf zu Lauf wurde beurteilt, indem die Y-Chromosom-Amplikon-Abdeckung der entsprechenden Replikate des Wiederholungslaufs des Pools ausweiblichen Proben und des Laufs mit dem Pool aus männlichen Proben miteinander verglichen wurde.Die mittlere Verschleppung von Lauf zu Lauf betrug 0,0076 %.

DNA-Zugabe

Blut (Keimbahn-Varianten-Modul)Für das NextSeq 550Dx-Gerät wurde der DNA-Zugabebereich bei Blutproben für die Vorbereitung vonBibliotheken mit dem TruSeq Custom Amplicon Kit Dx und dem Workflow des Moduls für Keimbahn-Varianten bestimmt. Hierzu wurde eine Studie zur seriellen Verdünnung mit 13 Platinum-Genome-Probenund einem repräsentativen Assay durchgeführt, der auf die Abfrage verschiedener Gene, die12.588 Basen über 23 unterschiedliche Chromosomen hinweg abdecken, ausgelegt ist. Die Bibliothekwurde auf zwei NextSeq 550Dx-Geräten mit einer Charge des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2(300 Zyklen) sequenziert.

Fünf Proben wurden je zweimal bei fünf DNA-Zugabestufen von 250 ng bis 12 ng (250 ng, 100 ng, 50 ng,25 ng und 12 ng) getestet. Acht Proben wurden auf allen fünf DNA-Zugabestufen als Einzelreplikategetestet. Zur Bestimmung der Genauigkeit wurden Proben-Genotypen mit Platinum Genomes Version2016-1.0 verglichen. Die Ergebnisse wurden für jede Zugabestufe ermittelt. Die PPA für jeden Variantentyp(SNVs, Insertionen und Deletionen) ist in Tabelle 1 dargestellt; die NPA ist in Tabelle 2 aufgeführt. AlleZugabestufen hatten eine ähnliche Genauigkeit. Die empfohlene DNA-Zugabe für das TruSeq CustomAmplicon Kit Dx beträgt 50 ng. 25 ng und 100 ng stellen eine Unter- und Obergrenze für die Erfüllung derLeistungsmerkmale dar.

DNA-Zugabe (ng) Variantentyp Erwartete Varianten TP FN Varianten-No-Calls PPA (%)

12 SNV 2412 2381 31 0 98,7

25 2404 8 0 99,7

50 2403 9 0 99,6

100 2412 0 0 100

250 2412 0 0 100

12 Insertion 808 784 3 21 99,6

25 781 5 22 99,4

50 786 2 20 99,8

100 786 0 22 100

250 786 0 22 100

Tabelle 1 PPA-Ergebnisse für jede DNA-Zugabe nach Variantentyp


NextSeq550Dx-Gerät

12 Deletion 758 732 12 14 98,4

25 737 7 14 99,1

50 742 2 14 99,7

100 744 0 14 100

250 744 0 14 100

DNA-Zugabe (ng) TN FP Referenz-No-Calls

NPA (%)

12 430940 4 26 > 99,9

25 430936 0 34 100

50 430936 2 32 > 99,9

100 430942 0 28 100

250 430942 0 28 100

Tabelle 2 NPA für jede DNA-Zugabe

FFPE (Somatisch)Es wurde der DNA-Zugabebereich bei formalinfixierten in Paraffin eingebetteten Proben (FFPE) für dieBibliotheksvorbereitung mit dem TruSeq Custom Amplicon Kit Dx und dem Workflow des Moduls fürsomatische Varianten für das NextSeq 550Dx-Gerät bestimmt. Hierzu wurde eine Studie zur seriellenVerdünnung mit drei Platinum-Genome-Proben und einem repräsentativen Assay durchgeführt, der aufdie Abfrage verschiedener Gene, die 12.588 Basen über 23 unterschiedliche Chromosomen hinwegabdecken, ausgelegt ist. Die Platinum-Genome-Zelllinien GM12878 und GM12877 wurden formalinfixiertund in Paraffin eingebettet. Anschließend wurde die DNA extrahiert. GM12878 wurde mit GM12877 soverdünnt, dass die Varianten-Allelhäufigkeiten (Variant Allele Frequencies, VAFs) bei 81 Varianten(55 SNVs, 10 Insertionen und 16 Deletionen) annähernd 0,025, 0,05 oder 0,10 betrugen. Darüber hinauswies jede Probe 91 Varianten mit höheren Variantenhäufigkeiten bis zu 1,0 VAF auf. Die Proben wurden jezweimal bei fünf DNA-Zugabestufen und gemäß den Messwerten des TruSeq Custom Amplicon Dx -FFPE QC-Kits mit einem dCq-Mittelwert (Delta der quantitativen Zyklen) von 2,1, 3,6, 4,6, 6,0 und 7,8verarbeitet. Jede Bibliothek wurde auf zwei NextSeq 550Dx-Geräten mit zwei Chargen des NextSeq 550DxHigh Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) sequenziert. Zur Bestimmung der Genauigkeit wurden Proben-Varianten-Calls mit Platinum Genomes, Version 2016-1.0 verglichen. Die PPA für jeden Variantentyp(SNVs, Insertionen und Deletionen) ist in Tabelle 3 dargestellt. Die NPA ist in Tabelle 4 aufgeführt. Dieempfohlene DNA-Zugabe für Varianten mit einer VAF von 0,05 oder höher beträgt dCq ≤ 4, wobei 4,6 eineUntergrenze für die Erfüllung der Leistungsmerkmale darstellt.

dCq-Mittelwert

Variantentyp ErwarteteVarianten

ErwarteteNo Calls

Zielverdünnung VAF

0,025 0,05 0,10

Varianten-No-Calls

PPA(%)

Varianten-No-Calls

PPA(%)

Varianten-No-Calls

PPA(%)

2,1 SNV 808 Nichtzutreffend.

196 100 0 100 0 100

3,6 250 99,3 4 100 0 100

4,6 251 94,6 51 99,2 5 100

6,0 257 65,3 213 91,4 100 100

7,8 254 69,3 185 90,7 100 100

2,1 Insertion 264 8 66 96,5 8 100 8 100

3,6 62 97,0 8 100 8 100

4,6 48 96,3 21 100 8 100

6,0 40 80,4 47 98,2 24 95,8

7,8 57 87,0 56 96,2 31 100

Tabelle 3 PPA-Ergebnisse für jede DNA-Zugabe nach Variantentyp


NextSeq550Dx-Gerät

2,1 Deletion 304 16 58 100 16 100 16 100

3,6 80 100 16 100 16 100

4,6 65 95,4 28 100 16 100

6,0 78 74,8 105 94,0 36 100

7,8 76 75,0 79 95,1 57 98,8

dCq-Mittelwert

ErwarteterWildtyp

Zielverdünnung VAF

0,025 0,05 0,10

Referenz-No-Calls

NPA(%)

Referenz-No-Calls

NPA(%)

Referenz-No-Calls

NPA(%)

2,1 93688 344 100 260 100 324 100

3,6 400 100 332 100 380 100

4,6 1308 100 1336 100 784 100

6,0 3900 > 99,9 3296 > 99,9 2996 100

7,8 3020 > 99,9 2880 > 99,9 2448 > 99,9

Tabelle 4 NPA für jede DNA-Zugabe

Analytische Sensitivität (Leerwertgrenze (Limit of Blank, LoB) und Nachweisgrenze (Limitof Detection, LoD))In dieser Studie wurde die Leerwertgrenze (LoB) und Nachweisgrenze (LoD) des Moduls für somatischeVarianten auf dem NextSeq 550Dx-Gerät untersucht. Hierzu wurde ein repräsentativer Assay verwendet,der darauf ausgelegt ist, verschiedene Gene abzufragen, die 12.588 Basen über 23 unterschiedlicheChromosomen hinweg abdecken. Die Platinum-Genome-Zelllinien GM12878 und GM12877 wurdenformalinfixiert und in Paraffin eingebettet. Anschließend wurde die DNA extrahiert. GM12878 wurde mitGM12877 so verdünnt, dass die Variantenhäufigkeiten von 74 Varianten (53 SNVs, 7 Insertionen und 14Deletionen) 0,05 ± 0,02 betrugen. GM12877 und die verdünnte GM12878-Probe (GM12878-D) wurden übersechs aufeinanderfolgende Starttage hinweg mit einem einzigen Gerät getestet. Dabei wurden zweiChargen des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) im Wechsel verwendet undinsgesamt sechs Sequenzierungsläufe durchgeführt. Dieser Test ergab 60 Replikate pro Variante inGM12878-D und 72 Replikate pro entsprechender Wildtyp-Koordinate in GM12877 für jede Reagenzien-Charge. Die LoB- und LoD-Werte wurden nach dem im CLSI-Standard EP17-A2 dargelegten klassischenAnsatz unter Verwendung der nichtparametrischen Option berechnet. LoB und LoD wurden für SNVs,Insertionen und Deletionen separat berechnet, indem die Variantenhäufigkeiten für einen gegebenenVariantentyp gepoolt wurden. Der Typ-I-Fehler wurde mit 0,01 und der Typ-II-Fehler mit 0,05 definiert.

Für die LoB wurden die gepoolten Variantenhäufigkeiten aufsteigend sortiert und es wurde die 99.Rangposition für jede Reagenziencharge und für jeden Variantentyp berechnet (Tabelle 5). Das Modul fürsomatische Varianten verwendet einen Cutoff (die effektive Leerwertgrenze) von 0,026 VAF zur Festlegungder qualitativen Erkennung von Varianten. Die berechneten LoB-Werte weisen nach, dass dieser Cutoffzu einem Typ-I-Fehler von nicht mehr als 0,01 führt.

Variantentyp Beobachtungen insgesamt LoB Reagenziencharge 1 (%) LoB Reagenziencharge 2 (%)

SNV 3816 0,77 0,77

Insertion 504 0,56 0,56

Deletion 1008 1,20 1,20

Tabelle 5 Leerwertgrenze

Zur Berechnung des LoD-Werts wurde für jede Reagenziencharge und für jeden Variantentyp, der unterden Cutoff von 0,026 fällt, der Prozentsatz der individuellen Mutationshäufigkeit berechnet Tabelle 6. Dadie Prozentsätze geringer waren als der Typ-II-Fehler von 5 % (0,05), wurde der Median der kombiniertenVariantenhäufigkeiten als LoD berechnet (Tabelle 6). Als LoD für jeden Variantentyp wurde der größereder beiden für die zwei Reagenzienchargen berechneten Werte genommen – 4,97 % für SNVs, 5,12 % fürInsertionen und 5,26 % für Deletionen.


NextSeq550Dx-Gerät

Reagenziencharge Variantentyp Beobachtungeninsgesamt

Anzahl der VAF-Messungen< 2,6 %

Anteil der VAF-Messungen (%) < 2,6 %

Nachweisgrenze(%)

1 SNV 3180 53 1,7 4,94

Insertion 420 6 1,4 5,08

Deletion 840 7 0,8 5,22

2 SNV 3180 51 1,6 4,97

Insertion 420 5 1,2 5,12

Deletion 840 7 0,80 5,26

Tabelle 6 Nachweisgrenze

Genauigkeit

KeimbahnDie folgende Studie wurde durchgeführt, um die Genauigkeit des Varianten-Callings zu untersuchen, diemit dem Modul für Keimbahn-Varianten auf dem NextSeq 550Dx-Gerät bei Verwendung des NextSeq550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) erzielt werden kann. Mit einem repräsentativen Assay, derfür die Abfrage verschiedener Gene, die 12.588 Basen (150 Amplikons) über 23 verschiedeneChromosomen hinweg abdecken, ausgelegt ist, wurden 13 eindeutige Platinum-Genome-Probengetestet. Drei Bediener führten auf drei Sequenzierungsgeräten und mit drei Reagenzienchargen an fünfStarttagen insgesamt neun Läufe durch. Die Genauigkeit für SNVs, Insertionen und Deletionen wurdeuntersucht, indem die Ergebnisse mit einer gut charakterisierten zusammengesetzten Referenzmethode,Platinum Genomes, Version 2016-1.0, verglichen wurde. Soweit nicht anders angegeben, erfolgte dieDefinition der genomischen Regionen anhand dieser Referenzmethode.

Kriterien Beobachtungen insgesamt1 Ergebnis nach Beobachtung2 Ergebnis nach Lauf3

PPA für SNV 819 98,7 > 99,9

PPA für Insertionen 819 95,0 98,9

PPA für Deletionen 819 100 100

NPA 819 100 100

OPA 819 > 99,9 > 99,9

Tabelle 7 Zusammenfassung der Übereinstimmung des Moduls für Keimbahn-Varianten

1Berechnet als die Anzahl der Proben pro Lauf (91) multipliziert mit der Anzahl an Läufen (9) = 819.2Niedrigster beobachteter Wert bei Probenreplikation über alle neun Läufe hinweg.3Niedrigster Wert, wenn die Daten aus jedem Lauf aggregiert analysiert werden.

Tabelle 8 enthält die Studiendaten mit positiver und negativer prozentualer Übereinstimmung je Probe,wobei die Variantenergebnisse mit Platinum Genomes Version 2016-1.0 für PPA-Berechnungenverglichen werden. Die drei Variantentypen (SNVs, Insertionen und Deletionen) werden kombiniert. Da dieReferenzmethode nur Ergebnisse für die Einzelnukleotidvarianten und Insertionen/Deletionen liefert,werden Ergebnisse von Basen ohne Varianten für NPA-Berechnungen mit der Referenzsequenz desHumangenoms hg19 verglichen.

ProbeMittlere Call-

RateErwarteteVarianten1

TP FNVarianten-No-

CallsTN FP PPA NPA OPA

NA12877 > 99,9 4788 4788 0 0 756762 0 100 100 100

NA12878 > 99,9 8505 8379 1 125 751464 0 > 99,9 100 > 99,9

NA12879 > 99,9 6048 5985 5 58 757701 0 99,9 100 > 99,9

NA12880 > 99,9 6993 6930 0 63 757638 0 100 100 100

NA12881 > 99,9 7875 7811 3 61 751653 0 > 99,9 100 > 99,9

Tabelle 8 Übereinstimmung des Moduls für Keimbahn-Varianten pro Probe


NextSeq550Dx-Gerät

ProbeMittlere Call-

RateErwarteteVarianten1

TP FNVarianten-No-

CallsTN FP PPA NPA OPA

NA12882 > 99,9 6300 6174 3 123 754803 0 > 99,9 100 > 99,9

NA12883 > 99,9 7119 7056 0 63 751905 0 100 100 100

NA12884 > 99,9 7182 7119 6 57 754146 0 99,9 100 > 99,9

NA12885 > 99,9 7686 7560 2 124 754173 0 > 99,9 100 > 99,9

NA12886 > 99,9 7245 7182 7 56 752469 0 99,9 100 > 99,9

NA12887 > 99,9 7119 7119 0 0 750645 0 100 100 100

NA12888 > 99,9 6804 6804 0 0 756065 0 100 100 100

NA12893 > 99,9 7434 7371 1 62 750015 0 > 99,9 100 > 99,9

1Gesamtzahl der Varianten in allen Probenreplikaten über neun Läufe hinweg.

Tabelle 9 enthält die Studiendaten je Probe, wobei die Variantenergebnisse mit der gut charakterisiertenzusammengesetzten Referenzmethode verglichen werden. Die Erkennung wird für jeden Variantentyp –SNVs, Insertionen und Deletionen – separat evaluiert. Referenzpositionen sind ausgeschlossen.

SNVs Insertionen Deletionen

Probe Erwartet TP FN Erwartet TP FN Erwartet TP FN

NA12877 2331 2331 0 1323 1323 0 1134 1134 0

NA12878 5733 5733 0 1260 1197 1 1512 1449 0

NA12879 3591 3591 0 1323 1260 5 1134 1134 0

NA12880 4221 4221 0 1512 1512 0 1260 1197 0

NA12881 4914 4913 1 1512 1449 2 1449 1449 0

NA12882 3717 3717 0 1386 1323 3 1197 1134 0

NA12883 4284 4284 0 1449 1449 0 1386 1323 0

NA12884 4284 4284 0 1575 1512 6 1323 1323 0

NA12885 4725 4725 0 1575 1512 2 1386 1323 0

NA12886 4347 4347 0 1449 1386 7 1449 1449 0

NA12887 4284 4284 0 1323 1323 0 1512 1512 0

NA12888 4158 4158 0 1449 1449 0 1197 1197 0

NA12893 4599 4599 0 1386 1323 1 1449 1449 0

Tabelle 9 Übereinstimmung des Moduls für Keimbahn-Varianten nach Variantentyp

Die Proben wurden weiter auf das Calling kleiner Insertionen und Deletionen (Indels) hin analysiert. EineGesamtübersicht finden Sie in Tabelle 10. Es gab insgesamt 71 Indels mit 1–24 bp großen Insertionen und1–25 bp großen Deletionen.

Variantentyp Erwartete Varianten TP FN Varianten-No-Calls PPA

Insertion 18522 18018 27 477 99,9

Deletion 17388 17073 0 315 100

Tabelle 10 Zusammenfassung der Indel-Erkennung des Moduls für Keimbahn-Varianten


NextSeq550Dx-Gerät

Der repräsentative Assay umfasste 150 Amplikons, die verschiedene genomische Inhalte abdecken sollten. Der GC-Inhalt der Amplikons lag im Bereichvon 0,19–0,87. Die Amplikons wiesen auch eine Reihe von Einzelnukleotid- (z. B. PolyA, PolyT), Dinukleotid- und Trinukleotid-Wiederholungen auf. DieDaten wurden pro Amplikon zusammengestellt (Tabelle 11), um die Auswirkungen der genomischen Inhalte auf den Prozentsatz an korrekten Calls zuermitteln. Der Prozentsatz an korrekten Calls beinhaltet Varianten- und Referenz-Calls und liegt unter 100 %, wenn falsche Calls oder „No Calls“ erfolgtsind.

Amplikon ChromosomAmplikon-Beginn

Amplikon-Ende

Größe desanalysiertenFragments

Basen inzuverlässigenRegionen

Amplikon-GenominhaltGC-Inhalt

KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

1 1 36450499 36450591 93 93 Indel 0,22 76167 0 0 100

2 1 109465122 109465200 79 79 Poly A (5), Poly C (5),Indel

0,38 64701 0 0 100

3 1 218353867 218353957 91 91 Indel 0,4 74529 0 0 100

4 1 223906657 223906748 92 92 Indel 0,49 75348 0 0 100

5 1 228526602 228526682 81 81 Poly G (5) 0,69 66339 0 0 100

6 1 236372039 236372108 70 70 Poly T (10), Indel 0,39 57330 0 0 100

7 1 247812041 247812128 88 88 Poly A (5), CT(3), TAA(3), Indel

0,27 72072 0 0 100

8 2 55862774 55862863 90 90 Indel 0,28 73710 0 0 100

9 2 87003930 87004009 80 80 Indel 0,38 65520 0 0 100

10 2 177016721 177016805 85 81 n. z. 0,65 66339 0 0 100

11 2 186625727 186625801 75 75 Poly A (8) 0,35 61425 0 0 100

12 2 190323504 190323591 88 88 Poly T (5) 0,42 72072 0 0 100

13 2 200796740 200796826 87 87 Poly T (5), Indel 0,31 71253 0 0 100

14 2 212245049 212245139 91 91 Poly T (5), Poly A (6),Indel

0,3 74529 0 0 100

15 2 228147052 228147144 93 93 Indel 0,43 76167 0 0 100

16 2 235016350 235016422 73 73 Poly T (5), Indel 0,42 59787 0 0 100

17 3 4466229 4466321 93 93 AT(3), Indel 0,27 74823 0 1344 98,2

18 3 46620561 46620643 83 83 n. z. 0,43 67977 0 0 100

19 3 49851331 49851400 70 70 CT(3), Indel 0,49 57330 0 0 100

Tabelle 11 Genauigkeitsdaten auf Amplikon-Level des Moduls für Keimbahn-Varianten

17 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

20 3 189713161 189713248 88 88 Poly A (5), Poly T (5),Poly A (9), TG(3)

0,41 72072 0 0 100

21 3 190106030 190106104 75 74 Indel 0,57 60543 0 63 99,9

22 4 2233667 2233744 78 78 Poly A (6) 0,26 63882 0 0 100

23 4 7780541 7780637 97 97 Poly G (6), Poly T (5),Poly A (5)

0,42 79443 0 0 100

24 4 15688604 15688681 78 78 n. z. 0,29 63882 0 0 100

25 4 56236521 56236586 66 62 Poly A (5), Indel 0,36 50778 0 0 100

26 4 102839244 102839314 71 69 Poly A (5) 0,46 56511 0 0 100

27 4 164446743 164446804 62 62 Poly A (7), Indel 0,27 50778 0 0 100

28 5 1882081 1882158 78 75 n. z. 0,78 61425 0 0 100

29 5 14769061 14769144 84 84 GT(3), CCA(3) 0,62 68796 0 0 100

30 5 41069808 41069871 64 64 n. z. 0,39 52416 0 0 100

31 5 74077114 74077196 83 83 Poly A (6), Indel 0,3 67977 0 0 100

32 5 147475343 147475409 67 67 Poly T (5) 0,37 54873 0 0 100

33 5 149323731 149323821 91 91 CT(4), AG(3) 0,55 74529 0 0 100

34 5 155662213 155662287 75 75 Indel 0,43 61425 0 0 100

35 6 6318713 6318814 102 102 Poly G (6) 0,68 83538 0 0 100

36 6 24949983 24950074 92 92 Indel 0,63 75348 0 0 100

37 6 31084900 31084999 100 94 GCT(5), Indel 0,61 76608 0 378 99,5

38 6 32147987 32148084 98 98 PolyT (5), TCT(3), CTT(3)

0,55 80262 0 0 100

39 6 32986864 32986958 95 95 Indel 0,53 77805 0 0 100

40 6 33408498 33408583 86 86 Poly C (6) 0,7 70434 0 0 100

41 6 41647401 41647495 95 94 Poly G (5), Indel 0,61 76986 0 0 100

42 6 112435865 112435955 91 91 Poly A (5) 0,44 74529 0 0 100

43 7 22202076 22202148 73 73 n. z. 0,44 59787 0 0 100

44 7 66276100 66276187 88 88 Indel 0,35 72072 0 0 100

18 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

45 7 77365735 77365821 87 87 Poly A (7), AG(4) 0,26 71253 0 0 100

46 7 110939946 110940030 85 85 Indel 0,38 69615 0 0 100

47 7 128533468 128533557 90 90 Poly G (5), Indel 0,62 73710 0 0 100

48 7 149503875 149503965 91 91 Poly G (6), Poly C (6),Indel

0,71 74529 0 0 100

49 7 154404519 154404599 81 66 n. z. 0,31 54054 0 0 100

50 7 156476507 156476599 93 93 Indel 0,35 76167 0 0 100

51 8 1817312 1817394 83 83 n. z. 0,42 67977 0 0 100

52 8 24811020 24811109 90 89 Poly G (7), CTC(4),Indel

0,61 72171 0 720 99,0

53 8 76518625 76518691 67 67 Indel 0,3 54873 0 0 100

54 9 103054909 103055006 98 98 Poly G (6) 0,67 80262 0 0 100

55 9 105586150 105586214 65 65 Indel 0,32 53235 0 0 100

56 9 107620823 107620918 96 96 n. z. 0,49 78624 0 0 100

57 9 123769149 123769231 83 83 AT(3) 0,37 67977 0 0 100

58 9 138995345 138995441 97 97 Poly C (6), Indel 0,68 79443 0 0 100

59 10 5987120 5987198 79 78 Poly G (5), Indel 0,47 63882 0 0 100

60 10 11784629 11784726 98 91 GC(3) 0,87 74529 0 0 100

61 10 27317777 27317855 79 79 Poly T (5) 0,3 64701 0 0 100

62 10 33018351 33018440 90 90 Poly A (5), Poly T (5) 0,2 73710 0 0 100

63 10 45084159 45084253 95 95 Indel 0,35 77805 0 0 100

64 10 55892599 55892687 89 88 AC(11), Indel 0,42 71747 0 325 99,5

65 10 101611250 101611329 80 80 n. z. 0,49 65520 0 0 100

66 10 118351373 118351453 81 81 n. z. 0,51 66339 0 0 100

67 11 8159816 8159912 97 96 n. z. 0,45 78624 0 0 100

68 11 30177648 30177717 70 70 Indel 0,46 57330 0 0 100

69 11 47470345 47470444 100 100 n. z. 0,65 81900 0 0 100

19 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

70 11 59837679 59837740 62 62 Indel 0,37 50778 0 0 100

71 11 64418856 64418957 102 102 n. z. 0,59 83538 0 0 100

72 11 93529612 93529684 73 73 Poly A (5) 0,4 59787 0 0 100

73 11 101347052 101347136 85 85 n. z. 0,42 69615 0 0 100

74 11 102477336 102477426 91 91 Poly G (6) 0,55 74529 0 0 100

75 11 118406285 118406369 85 85 Indel 0,53 69615 0 0 100

76 11 120357801 120357885 85 85 PolyA (5), CA(3), Indel 0,34 69615 0 0 100

77 11 125769313 125769397 85 85 GA(3) 0,52 69615 0 0 100

78 12 2834770 2834853 84 84 Poly C (5), Indel 0,52 68796 0 0 100

79 12 26811004 26811096 93 93 Poly A (7), AC(4) 0,33 76167 0 0 100

80 12 30881766 30881846 81 81 n. z. 0,49 66339 0 0 100

81 12 88474105 88474175 71 71 Poly A (6) 0,35 58149 0 0 100

82 12 120966872 120966966 95 95 Poly G (5) 0,68 77805 0 0 100

83 13 24167504 24167576 73 73 n. z. 0,52 59787 0 0 100

84 13 25816961 25817049 89 88 Poly A (5), Poly T (7),Poly A (7), Indel

0,22 72072 0 0 100

85 13 44880112 44880200 89 89 Indel 0,49 72891 0 0 100

86 13 77665218 77665294 77 77 Indel 0,39 63063 0 0 100

87 14 31619327 31619393 67 67 GA(3),TA(3) 0,39 54873 0 0 100

88 14 39517884 39517966 83 83 n. z. 0,25 67977 0 0 100

89 14 46958962 46959034 73 72 Poly T (5), Indel 0,19 58642 0 326 99,4

90 14 58050030 58050110 81 81 Indel 0,38 66339 0 0 100

91 14 82390559 82390649 91 91 Indel 0,35 74529 0 0 100

92 14 92549544 92549609 66 66 Poly A (5) 0,41 54054 0 0 100

93 14 102808496 102808589 94 94 Indel 0,62 76986 0 0 100

94 15 43170751 43170848 98 96 Poly C (5) 0,45 78624 0 0 100

95 15 63446149 63446216 68 68 Indel 0,25 55692 0 0 100

20 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

96 15 77879807 77879901 95 93 Poly G (5), Indel 0,68 76167 0 0 100

97 15 81625334 81625428 95 95 Poly T (6) 0,43 77805 0 0 100

98 15 85438263 85438334 72 71 Indel 0,65 58149 0 0 100

99 15 89817413 89817503 91 91 n. z. 0,36 74529 0 0 100

100 15 89864274 89864343 70 70 Indel 0,56 57330 0 0 100

101 16 1894910 1894972 63 63 n. z. 0,27 51597 0 0 100

102 16 28997904 28997998 95 95 Poly C (5) 0,67 77805 0 0 100

103 16 53682908 53682994 87 87 TA(3) 0,41 71253 0 0 100

104 16 57954406 57954509 104 104 Poly C (5) 0,67 85176 0 0 100

105 16 85706375 85706465 91 91 Poly T (5), Indel 0,37 74529 0 0 100

106 17 3563920 3564008 89 89 GC(3) 0,64 72891 0 0 100

107 17 3594191 3594277 87 87 Poly C (5), Indel 0,67 71247 0 6 100

108 17 3970090 3970180 91 91 Indel 0,46 74529 0 0 100

109 17 16084945 16085037 93 93 Indel 0,26 76167 0 0 100

110 17 33998759 33998849 91 89 Poly T (5) 0,54 72891 0 0 100

111 17 39589691 39589774 84 82 PolyA (13), Indel (x2) 0,29 66343 27 788 98,8

112 17 41244394 41244484 91 91 Poly A (5) 0,34 74529 0 0 100

113 17 45438866 45438957 92 92 Poly A (7), AT(3), AT(4), AT(4), Indel

0,26 75348 0 0 100

114 17 61502432 61502510 79 79 Indel 0,41 64413 0 288 99,6

115 17 64023582 64023667 86 86 Poly T (7) 0,22 70434 0 0 100

116 17 72308237 72308320 84 84 GAG(3) 0,62 68796 0 0 100

117 18 2616456 2616522 67 67 GA(3) 0,31 54873 0 0 100

118 18 6980478 6980568 91 91 n. z. 0,37 74529 0 0 100

119 18 9888026 9888094 69 69 Poly A (6), TG(3) 0,43 56511 0 0 100

120 18 38836999 38837073 75 75 Poly A (5), Indel 0,37 61425 0 0 100

121 18 47405382 47405462 81 81 CTC(3), Indel 0,47 66339 0 0 100

21 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

122 18 54815665 54815749 85 85 CT(3), Indel 0,45 69615 0 0 100

123 18 59773996 59774060 65 65 n. z. 0,48 53235 0 0 100

124 19 625143 625241 99 99 n. z. 0,59 81081 0 0 100

125 19 18121418 18121491 74 74 n. z. 0,68 60605 1 0 100

126 19 18186574 18186643 70 70 n. z. 0,64 57330 0 0 100

127 20 746056 746149 94 94 n. z. 0,61 76986 0 0 100

128 20 10633195 10633276 82 82 AC(3) 0,59 67158 0 0 100

129 20 17705633 17705708 76 76 CT(3) 0,58 62244 0 0 100

130 20 21766821 21766890 70 70 GT(3),TG(4), Indel 0,46 57330 0 0 100

131 20 25278421 25278521 101 101 Indel 0,63 82719 0 0 100

132 20 50897302 50897368 67 67 Indel 0,36 54873 0 0 100

133 20 62331904 62331994 91 88 Poly G (6) 0,73 72072 0 0 100

134 20 62690860 62690946 87 87 Indel 0,57 71253 0 0 100

135 21 30300823 30300888 66 66 Indel 0,35 54054 0 0 100

136 21 33694176 33694273 98 98 Poly T (6), CA(3) 0,54 80262 0 0 100

137 21 36710706 36710792 87 87 GT(3), Indel 0,39 71253 0 0 100

138 21 46644924 46644992 69 69 Poly A (6), AG(3), Indel 0,32 56439 0 72 99,9

139 21 46705575 46705664 90 90 Poly T (5), Poly A (6) 0,5 73710 0 0 100

140 22 25750774 25750873 100 100 Indel 0,63 81900 0 0 100

141 22 32439233 32439329 97 97 n. z. 0,68 79443 0 0 100

142 22 37409844 37409940 97 97 Indel 0,46 79443 0 0 100

143 22 37637596 37637694 99 99 n. z. 0,6 81081 0 0 100

144 22 47081347 47081438 92 92 Indel 0,66 75348 0 0 100

145 X 15870424 15870492 69 69 Poly T (5) 0,26 56511 0 0 100

146 X 135288543 135288611 69 69 Poly C (5) 0,62 56511 0 0 100

147 X 135290777 135290847 71 71 n. z. 0,52 58149 0 0 100

148 Y 2655397 2655461 65 0 n. z. 0,55 0 0 0 n. z.

22 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


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NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

149 Y 2655519 2655609 91 0 n. z. 0,48 0 0 0 n. z.

150 Y 2655609 2655679 71 0 Poly A (5) 0,37 0 0 0 n. z.

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Die Sequenzierungsergebnisse der Probe NA12878 wurden mit einem äußerst zuverlässigen Genotyp fürNA12878 verglichen, der vom National Institute of Standards and Technology (NIST) (v.2.19) festgelegt wurde.Von den 150 Amplikons befanden sich 92 Amplikons vollständig innerhalb der äußerst zuverlässigengenomischen Regionen, 41 Amplikons wiesen eine Teilüberlappung und 17 Amplikons keine Überlappung inder NIST-Sequenz auf. Daraus ergaben sich 10.000 Koordinaten pro Replikat für den Vergleich. Base-Calls ohneVarianten wurden mit der Referenzsequenz des Humangenoms hg19 verglichen. Die Genauigkeitsergebnissesind in Tabelle 12 dargestellt.

Probe Anzahl Amplikons Mittlere Call-Rate TP FN TN FP PPA NPA OPA

NA12878 133 > 99,9 6552 1 610470 0 > 99,9 100 > 99,9

Tabelle 12 Übereinstimmung der Ergebnisse des Keimbahn-Varianten-Moduls mit der NIST-Datenbank für ProbeNA12878

Die Daten aus den neun Läufen der Studie mit dem Modul für Keimbahn-Varianten belegen, dass dasNextSeq 550Dx-Gerät Folgendes konsistent sequenzieren kann:

u GC-Inhalt ≥ 19 % (alle Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit 19 % GC-Inhalt erfolgten korrekt, miteiner No-Call-Rate von 0,6 %)

u GC-Inhalt ≤ 87 % (alle Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit 87 % GC-Inhalt erfolgten korrekt,ohne „No Calls“)

u PolyA-Längen ≤ 9 (alle Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit einer PolyA-Wiederholung von neunNukleotiden erfolgten korrekt, ohne „No Calls“)

u PolyT-Längen ≤ 10 (alle Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit einer PolyT-Wiederholung von10 Nukleotiden erfolgten korrekt, ohne „No Calls“)

u PolyG-Längen ≤ 7 (alle Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit einer PolyG-Wiederholung vonsieben Nukleotiden erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 1,0 %)

u PolyC-Längen ≤ 6 (alle Base-Calls in 2.457 sequenzierten Amplikons mit einer PolyC-Wiederholung vonsechs Nukleotiden erfolgten korrekt, ohne „No Calls“)

u Längen von Dinukleotid-Wiederholungen ≤ 11-fach (alle Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit einer11-fachen Dinukleotid-Wiederholung erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 0,5 %)

u Längen von Trinukleotid-Wiederholungen ≤ 5-fach (alle Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit einer5-fachen Trinukleotid-Wiederholung erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 0,5 %)

u Insertionslängen ≤ 24 (66.343 von 66.370 Base-Calls in 819 sequenzierten Amplikons mit einer Insertion aus24 Nukleotiden erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 1,2 %; in der Region mit der Insertion aus 24Nukleotiden traten keine falschen Calls auf)

u Deletionslängen ≤ 25 (alle Base-Calls in 2.457 sequenzierten Amplikons mit einer Deletion von 25Nukleotiden erfolgten korrekt, ohne „No Calls“)

SomatischDie hier beschriebene Studie wurde genutzt, um die Genauigkeit des Varianten-Callings zu untersuchen, die mitdem Modul für somatische Varianten auf dem NextSeq 550Dx-Gerät bei Verwendung des NextSeq 550Dx HighOutput Reagent Kit v2 (300 Zyklen) erzielt werden kann.

Diese Studie verwendete einen repräsentativen Assay, der dafür ausgelegt ist, verschiedene Gene abzufragen,die 12.588 Basen (150 Amplikons) über 23 unterschiedliche Chromosomen hinweg abdecken. Aus FFPE-behandelten Blöcken wurde Platinum-Genome-DNA extrahiert, um sechs eindeutige Proben zu erzeugen, die inder Studie evaluiert werden sollten.

DNA der Probe GM12877 wurde mit DNA der Probe GM12878 zu GM12877-D5 und GM12877-D7 verdünnt, umeine Reihe von eindeutig heterozygoten Varianten mit Variantenhäufigkeiten von ca. 5 % bzw. 7 % zu erzeugen.Auf ähnliche Weise wurde DNA der Probe GM12878 mit DNA der Probe GM12877 verdünnt, um GM12878-D5und GM12878-D7 zu erzeugen. Jede der Proben wurde dreifach getestet, mit Ausnahme der verdünntenProben, die mit sechsfacher Wiederholung getestet wurden. Drei Bediener führten auf dreiSequenzierungsgeräten und mit drei Reagenzienchargen an fünf Starttagen insgesamt neun Läufe durch. Die

Februar 2019 Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEUEnglish Source: 1000000030326 v02 | 24

Genauigkeit für SNV, Insertionen und Deletionen wurde untersucht, indem die Ergebnisse mit einer gutcharakterisierten zusammengesetzten Referenzmethode, Platinum Genomes Version 2016-1.0, verglichenwurden. Soweit nicht anders angegeben, erfolgte die Definition der genomischen Regionen anhand dieserReferenzmethode.

Kriterien Beobachtungeninsgesamt1

Ergebnis nach Beobachtung2 Ergebnis nach Lauf3

PPA für SNV 378 98,9 99,9

PPA für Insertionen 378 96,9 99,9

PPA für Deletionen 378 97,1 99,9

NPA 378 > 99,9 > 99,9

OPA 378 > 99,9 > 99,9

Tabelle 13 Zusammenfassung der Übereinstimmung des Moduls für somatische Varianten

1Berechnet als die Anzahl der Proben pro Lauf (42) multipliziert mit der Anzahl an Läufen (9) = 378.2Niedrigster beobachteter Wert bei Probenreplikation über alle neun Läufe hinweg.3Niedrigster Wert, wenn die Daten aus jedem Lauf aggregiert analysiert werden.

Tabelle 14 enthält die Studiendaten mit positiver und negativer prozentualer Übereinstimmung je Probe, wobeidie Variantenergebnisse mit der gut charakterisierten zusammengesetzten Referenzmethode für PPA-Berechnungen verglichen werden. Die drei Variantentypen (SNVs, Insertionen und Deletionen) werdenkombiniert. Da die Referenzmethode nur Ergebnisse für die Einzelnukleotidvarianten und Insertionen/Deletionenliefert, werden Ergebnisse von Basen ohne Varianten für NPA-Berechnungen mit der Referenzsequenz desHumangenoms hg19 verglichen.

Probe Mittlere Call-Rate Erwartet TP FN Varianten-No-Calls TN FP PPA NPA OPA

GM12877 98,7 2052 2025 0 27 318682 15 100 > 99,9 > 99,9

GM12878 98,8 3645 3564 0 81 317645 0 100 100 100

GM12879 99,8 2592 2538 0 54 323614 2 100 > 99,9 > 99,9

GM12884 99,8 3078 3024 0 54 322038 5 100 > 99,9 > 99,9

GM12885 99,8 3294 3213 0 81 322121 0 100 100 100

GM12888 99,8 2916 2889 0 27 323048 2 100 > 99,9 > 99,9

GM12877-D5 99,8 9288 8930 0 358 630621 0 100 100 100

GM12877-D7 99,7 9288 9032 0 256 629719 0 100 100 100

GM12878-D5 99,5 9288 8699 42 547 628582 0 99,5 100 > 99,9

GM12878-D7 99,7 9288 9108 0 180 629803 0 100 100 100

Tabelle 14 Übereinstimmung des Moduls für somatische Varianten pro Probe

Tabelle 15 enthält die Studiendaten je Probe, wobei die Variantenergebnisse mit der gut charakterisiertenzusammengesetzten Referenzmethode verglichen werden. Die Erkennung wird für jeden Variantentyp – SNVs,Insertionen und Deletionen – separat evaluiert. Referenzpositionen sind ausgeschlossen.



GM12877 999 999 0 567 567 0 486 459 0

GM12878 2457 2457 0 540 513 0 648 594 0

GM12879 1539 1539 0 567 540 0 486 459 0

Tabelle 15 Übereinstimmung des Moduls für somatische Varianten nach Variantentyp

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GM12884 1836 1836 0 675 648 0 567 540 0

GM12885 2025 2025 0 675 648 0 594 540 0

GM12888 1782 1782 0 621 621 0 513 486 0

GM12877-D5 5454 5392 0 1782 1647 0 2052 1891 0

GM12877-D7 5454 5406 0 1782 1728 0 2052 1898 0

GM12878-D5 5454 5192 28 1782 1651 9 2052 1856 5

GM12878-D7 5454 5445 0 1782 1719 0 2052 1944 0

Die 10 Proben wurden weiter auf das Calling kleiner Insertionen und Deletionen (Indels) hin analysiert (Tabelle16). Es gab insgesamt 71 Indels mit 1–24 bp großen Insertionen und 1–25 bp großen Deletionen.

Variantentyp Erwartete Varianten TP FN Varianten-No-Calls PPA

Insertion 10773 10282 9 482 99,2

Deletion 11502 10667 5 830 > 99,9

Tabelle 16 Zusammenfassung der Indel-Erkennung des Moduls für somatische Varianten

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English Source: 1000000030326 v02 | 26

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Die 150 Amplikons waren so konzipiert, dass sie zahlreiche genomische Inhalte abdeckten. Der GC-Inhalt der Amplikons lag im Bereich von 0,19–0,87 %. Die Amplikons wiesen auch eine Reihe von Einzelnukleotid- (z. B. PolyA, PolyT), Dinukleotid- und Trinukleotid-Replikaten auf. Die Datenwurden pro Amplikon zusammengestellt (Tabelle 17), um die Auswirkungen der genomischen Inhalte auf den Prozentsatz an korrekten Calls zuermitteln. Der Prozentsatz an korrekten Calls beinhaltet Varianten- und Referenz-Calls und liegt unter 100 %, wenn falsche Calls oder „No Calls“ erfolgtsind.


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

1 1 36450499 36450591 93 93 Indel 0,22 35066 0 88 99,7

2 1 109465122 109465200 79 79 Poly A (5), Poly C (5),Indel

0,38 29827 0 35 99,9

3 1 218353867 218353957 91 91 Indel 0,4 34202 0 283 99,2

4 1 223906657 223906748 92 92 Indel 0,49 34613 0 163 99,5

5 1 228526602 228526682 81 81 Poly G (5) 0,69 30571 0 47 99,8

6 1 236372039 236372108 70 70 Poly T (10), Indel 0,39 26452 0 8 100,0

7 1 247812041 247812128 88 88 Poly A (5), CT(3), TAA(3), Indel

0,27 33148 0 116 99,7

8 2 55862774 55862863 90 90 Indel 0,28 33928 0 92 99,7

9 2 87003930 87004009 80 80 Indel 0,38 30218 0 22 99,9

10 2 177016721 177016805 85 81 n. z. 0,65 30616 0 2 > 99,9

11 2 186625727 186625801 75 75 Poly A (8) 0,35 28017 0 499 98,3

12 2 190323504 190323591 88 88 Poly T (5) 0,42 33207 0 57 99,8

13 2 200796740 200796826 87 87 Poly T (5), Indel 0,31 32524 9 718 97,8

14 2 212245049 212245139 91 91 Poly T (5), Poly A (6),Indel

0,3 33972 0 456 98,7

15 2 228147052 228147144 93 93 n. z. 0,43 35051 0 103 99,7

16 2 235016350 235016422 73 73 Poly T (5), Indel 0,42 27459 0 136 99,5

17 3 4466229 4466321 93 93 AT(3), Indel 0,27 34534 0 620 98,2

18 3 46620561 46620643 83 83 n. z. 0,43 31339 0 44 99,9

19 3 49851331 49851400 70 70 CT(3), Indel 0,49 26373 0 87 99,7

Tabelle 17 Genauigkeitsdaten auf Amplikon-Level des Moduls für somatische Varianten

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Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

20 3 189713161 189713248 88 88 Poly A (5), Poly T (5),Poly A (9), TG(3)

0,41 32829 0 857 97,5

21 3 190106030 190106104 75 74 Indel 0,57 27925 0 47 99,8

22 4 2233667 2233744 78 78 Poly A (6) 0,26 29327 4 162 99,4

23 4 7780541 7780637 97 97 Poly G (6), Poly T (5),Poly A (5)

0,42 36585 0 117 99,7

24 4 15688604 15688681 78 78 n. z. 0,29 29427 0 57 99,8

25 4 56236521 56236586 66 62 Poly A (5), Indel 0,36 23356 5 75 99,7

26 4 102839244 102839314 71 69 Poly A (5) 0,46 25942 0 140 99,5

27 4 164446743 164446804 62 62 Poly A (7), Indel 0,27 22944 0 560 97,6

28 5 1882081 1882158 78 75 n. z. 0,78 28299 0 53 99,8

29 5 14769061 14769144 84 84 GT(3), CCA(3) 0,62 31658 0 94 99,7

30 5 41069808 41069871 64 64 n. z. 0,39 24120 0 72 99,7

31 5 74077114 74077196 83 83 Poly A (6), Indel 0,3 31297 0 77 99,8

32 5 147475343 147475409 67 67 Poly T (5) 0,37 25277 0 55 99,8

33 5 149323731 149323821 91 91 CT(4), AG(3) 0,55 34308 0 90 99,7

34 5 155662213 155662287 75 75 Indel 0,43 28266 0 163 99,4

35 6 6318713 6318814 102 102 Poly G (6) 0,68 38489 0 67 99,8

36 6 24949983 24950074 92 92 Indel 0,63 34730 0 46 99,9

37 6 31084900 31084999 100 94 GCT(5), Indel 0,61 35057 0 483 98,6

38 6 32147987 32148084 98 98 PolyT (5), TCT(3), CTT(3)

0,55 36647 0 406 98,9

39 6 32986864 32986958 95 95 Indel 0,53 35681 0 238 99,3

40 6 33408498 33408583 86 86 Poly C (6) 0,7 32438 0 70 99,8

41 6 41647401 41647495 95 94 Poly G (5), Indel 0,61 35441 0 91 99,7

42 6 112435865 112435955 91 91 Poly A (5) 0,44 34354 0 44 99,9

43 7 22202076 22202148 73 73 n. z. 0,44 27575 0 28 99,9

44 7 66276100 66276187 88 88 Indel 0,35 33060 0 213 99,4

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Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

45 7 77365735 77365821 87 87 Poly A (7), AG(4) 0,26 32423 0 489 98,5

46 7 110939946 110940030 85 85 Indel 0,38 32074 0 56 99,8

47 7 128533468 128533557 90 90 Poly G (5), Indel 0,62 33791 0 281 99,2

48 7 149503875 149503965 91 91 Poly G (6), Poly C (6),Indel

0,71 34316 0 82 99,8

49 7 154404519 154404599 81 66 n. z. 0,31 24901 0 47 99,8

50 7 156476507 156476599 93 93 Indel 0,35 35067 0 87 99,8

51 8 1817312 1817394 83 83 n. z. 0,42 31365 0 9 > 99,9

52 8 24811020 24811109 90 89 Poly G (7), CTC(4),Indel

0,61 32781 0 890 97,4

53 8 76518625 76518691 67 67 Indel 0,3 25228 0 146 99,4

54 9 103054909 103055006 98 98 Poly G (6) 0,67 36968 0 76 99,8

55 9 105586150 105586214 65 65 Indel 0,32 24472 0 100 99,6

56 9 107620823 107620918 96 96 n. z. 0,49 36203 0 85 99,8

57 9 123769149 123769231 83 83 AT(3) 0,37 31329 0 45 99,9

58 9 138995345 138995441 97 97 Poly C (6), Indel 0,68 36472 0 201 99,5

59 10 5987120 5987198 79 78 Poly G (5), Indel 0,47 29473 0 11 > 99,9

60 10 11784629 11784726 98 91 GC(3) 0,87 34188 0 213 99,4

61 10 27317777 27317855 79 79 Poly T (5) 0,3 29843 0 19 99,9

62 10 33018351 33018440 90 90 Poly A (5), Poly T (5) 0,2 33968 0 68 99,8

63 10 45084159 45084253 95 95 Indel 0,35 35829 0 81 99,8

64 10 55892599 55892687 89 88 AC(11), Indel 0,42 32098 88 2048 93,8

65 10 101611250 101611329 80 80 n. z. 0,49 30217 0 28 99,9

66 10 118351373 118351453 81 81 n. z. 0,51 30531 0 96 99,7

67 11 8159816 8159912 97 96 n. z. 0,45 36105 0 192 99,5

68 11 30177648 30177717 70 70 Indel 0,46 26318 0 153 99,4

69 11 47470345 47470444 100 100 n. z. 0,65 37785 0 24 99,9

29 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

70 11 59837679 59837740 62 62 Indel 0,37 23368 0 68 99,7

71 11 64418856 64418957 102 102 n. z. 0,59 38546 0 10 > 99,9

72 11 93529612 93529684 73 73 Poly A (5) 0,4 27516 0 78 99,7

73 11 101347052 101347136 85 85 n. z. 0,42 32083 0 48 99,9

74 11 102477336 102477426 91 91 Poly G (6) 0,55 34047 0 369 98,9

75 11 118406285 118406369 85 85 Indel 0,53 32065 0 74 99,8

76 11 120357801 120357885 85 85 PolyA (5), CA(3), Indel 0,34 32083 0 47 99,9

77 11 125769313 125769397 85 85 GA(3) 0,52 32103 0 27 99,9

78 12 2834770 2834853 84 84 Poly C (5), Indel 0,52 31645 16 525 98,3

79 12 26811004 26811096 93 93 Poly A (7), AC(4) 0,33 34824 0 330 99,1

80 12 30881766 30881846 81 81 n. z. 0,49 30497 0 121 99,6

81 12 88474105 88474175 71 71 Poly A (6) 0,35 26773 0 65 99,8

82 12 120966872 120966966 95 95 Poly G (5) 0,68 35830 9 72 99,8

83 13 24167504 24167576 73 73 n. z. 0,52 27498 0 114 99,6

84 13 25816961 25817049 89 88 Poly A (5), Poly T (7),Poly A (7), Indel

0,22 32824 0 566 98,3

85 13 44880112 44880200 89 89 Indel 0,49 33574 0 77 99,8

86 13 77665218 77665294 77 77 Indel 0,39 29075 0 31 99,9

87 14 31619327 31619393 67 67 GA(3),TA(3) 0,39 25313 0 13 99,9

88 14 39517884 39517966 83 83 n. z. 0,25 31360 0 22 99,9

89 14 46958962 46959034 73 72 Poly T (5), Indel 0,19 26499 0 717 97,4

90 14 58050030 58050110 81 81 Indel 0,38 30494 0 133 99,6

91 14 82390559 82390649 91 91 Indel 0,35 34313 0 86 99,7

92 14 92549544 92549609 66 66 Poly A (5) 0,41 24555 0 1527 94,1

93 14 102808496 102808589 94 94 Indel 0,62 35472 0 69 99,8

94 15 43170751 43170848 98 96 Poly C (5) 0,45 36264 0 24 99,9

95 15 63446149 63446216 68 68 Indel 0,25 25667 0 37 99,9

30 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

96 15 77879807 77879901 95 93 Poly G (5), Indel 0,68 34745 0 432 98,8

97 15 81625334 81625428 95 95 Poly T (6) 0,43 35870 0 40 99,9

98 15 85438263 85438334 72 71 Indel 0,65 26762 0 76 99,7

99 15 89817413 89817503 91 91 n. z. 0,36 34286 0 112 99,7

100 15 89864274 89864343 70 70 Indel 0,56 26449 0 11 > 99,9

101 16 1894910 1894972 63 63 n. z. 0,27 23809 0 5 > 99,9

102 16 28997904 28997998 95 95 Poly C (5) 0,67 35860 0 50 99,9

103 16 53682908 53682994 87 87 TA(3) 0,41 32835 0 60 99,8

104 16 57954406 57954509 104 104 Poly C (5) 0,67 39177 0 144 99,6

105 16 85706375 85706465 91 91 Poly T (5), Indel 0,37 34075 0 323 99,1

106 17 3563920 3564008 89 89 GC(3) 0,64 33632 0 11 > 99,9

107 17 3594191 3594277 87 87 Poly C (5), Indel 0,67 32752 0 134 99,6

108 17 3970090 3970180 91 91 Indel 0,46 34343 0 82 99,8

109 17 16084945 16085037 93 93 Indel 0,26 35077 0 78 99,8

110 17 33998759 33998849 91 89 Poly T (5) 0,54 33553 0 89 99,7

111 17 39589691 39589774 84 82 PolyA (13), Indel (x2) 0,29 30554 53 2296 92,9

112 17 41244394 41244484 91 91 Poly A (5) 0,34 34360 0 38 99,9

113 17 45438866 45438957 92 92 Poly A (7), AT(3), AT(4),AT(4), Indel

0,26 34367 0 418 98,8

114 17 61502432 61502510 79 79 Indel 0,41 29751 0 119 99,6

115 17 64023582 64023667 86 86 Poly T (7) 0,22 32176 0 340 99,0

116 17 72308237 72308320 84 84 GAG(3) 0,62 31604 7 141 99,5

117 18 2616456 2616522 67 67 GA(3) 0,31 25273 8 45 99,8

118 18 6980478 6980568 91 91 n. z. 0,37 34386 0 12 > 99,9

119 18 9888026 9888094 69 69 Poly A (6), TG(3) 0,43 25692 0 399 98,5

120 18 38836999 38837073 75 75 Poly A (5), Indel 0,37 27923 0 893 96,9

121 18 47405382 47405462 81 81 CTC(3), Indel 0,47 30598 0 20 99,9

31 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

122 18 54815665 54815749 85 85 CT(3), Indel 0,45 31969 0 161 99,5

123 18 59773996 59774060 65 65 n. z. 0,48 24531 0 48 99,8

124 19 625143 625241 99 99 n. z. 0,59 37298 0 124 99,7

125 19 18121418 18121491 74 74 n. z. 0,68 27881 0 109 99,6

126 19 18186574 18186643 70 70 n. z. 0,64 26442 0 26 99,9

127 20 746056 746149 94 94 n. z. 0,61 35501 0 31 99,9

128 20 10633195 10633276 82 82 AC(3) 0,59 30951 0 72 99,8

129 20 17705633 17705708 76 76 CT(3) 0,58 28686 0 42 99,9

130 20 21766821 21766890 70 70 GT(3),TG(4), Indel 0,46 26372 0 88 99,7

131 20 25278421 25278521 101 101 Indel 0,63 38159 0 20 99,9

132 20 50897302 50897368 67 67 Indel 0,36 25188 0 544 97,9

133 20 62331904 62331994 91 88 Poly G (6) 0,73 32969 0 309 99,1

134 20 62690860 62690946 87 87 Indel 0,57 32818 0 77 99,8

135 21 30300823 30300888 66 66 Indel 0,35 24758 9 181 99,2

136 21 33694176 33694273 98 98 Poly T (6), CA(3) 0,54 36902 0 160 99,6

137 21 36710706 36710792 87 87 GT(3), Indel 0,39 32841 0 48 99,9

138 21 46644924 46644992 69 69 Poly A (6), AG(3), Indel 0,32 25939 0 280 98,9

139 21 46705575 46705664 90 90 Poly T (5), Poly A (6) 0,5 33942 0 78 99,8

140 22 25750774 25750873 100 100 Indel 0,63 37733 0 86 99,8

141 22 32439233 32439329 97 97 n. z. 0,68 36617 0 49 99,9

142 22 37409844 37409940 97 97 Indel 0,46 36525 0 162 99,6

143 22 37637596 37637694 99 99 n. z. 0,6 37398 0 24 99,9

144 22 47081347 47081438 92 92 Indel 0,66 34754 0 22 99,9

145 X 15870424 15870492 69 69 Poly T (5) 0,26 26046 0 36 99,9

146 X 135288543 135288611 69 69 Poly C (5) 0,62 26019 0 63 99,8

147 X 135290777 135290847 71 71 n. z. 0,52 26780 0 58 99,8

148 Y 2655397 2655461 65 0 n. z. 0,55 0 0 0 n. z.

32 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät


Amplikon-Ende




KorrekteCalls

FalscheCalls

NoCalls

%korrekteCalls

149 Y 2655519 2655609 91 0 n. z. 0,48 0 0 0 n. z.

150 Y 2655609 2655679 71 0 Poly A (5) 0,37 0 0 0 n. z.

33 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät

Die Sequenzierungsergebnisse der Probe GM12878 wurden mit einem äußerst zuverlässigen Genotyp fürNA12878 verglichen, der vom National Institute of Standards and Technology (NIST) (v.2.19) festgelegt wurde.Von den 150 Amplikons befanden sich 92 Amplikons vollständig innerhalb der äußerst zuverlässigengenomischen Regionen, 41 Amplikons wiesen eine Teilüberlappung und 17 Amplikons keine Überlappung in derNIST-Sequenz auf. Daraus ergaben sich 10.000 Koordinaten pro Replikat für den Vergleich. Base-Calls ohneVarianten wurden mit der Referenzsequenz des Humangenoms hg19 verglichen. Die Genauigkeitsergebnissesind in Tabelle 18 dargestellt.

Probe Anzahl Amplikons Mittlere Call-Rate TP FN TN FP PPA NPA OPA

GM12878 133 98,8 2808 0 258488 0 100 100 100

Tabelle 18 Übereinstimmung der Ergebnisse des Moduls für somatische Varianten mit der NIST-Datenbank für ProbeGMT12878

Die Daten aus den neun Läufen der Studie mit dem Modul für somatische Varianten belegen, dass dasNextSeq 550Dx-Gerät Folgendes konsistent sequenzieren kann:

u GC-Inhalt ≥ 19 % (alle Base-Calls in 378 sequenzierten Amplikons mit 19 % GC-Inhalt erfolgten korrekt, miteiner No-Call-Rate von 2,6 %)

u GC-Inhalt ≤ 87 % (alle Base-Calls in 378 sequenzierten Amplikons mit 87 % GC-Inhalt erfolgten korrekt, miteiner No-Call-Rate von 0,6 %)

u PolyA-Längen ≤ 9 (alle Base-Calls in 378 sequenzierten Amplikons mit einer PolyA-Wiederholung von neunNukleotiden erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 2,5 %)

u PolyT-Längen ≤ 10 (alle Base-Calls in 378 sequenzierten Amplikons mit einer PolyT-Wiederholung von10 Nukleotiden erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von unter 0,1 %)

u PolyG-Längen ≤ 6 (alle Base-Calls in 2.268 sequenzierten Amplikons mit einer PolyG-Wiederholung vonsechs Nukleotiden erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 0,5 %)

u PolyG-Längen ≤ 6 (alle Base-Calls in 756 sequenzierten Amplikons mit einer PolyC-Wiederholung von sechsNukleotiden erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 0,4%)

u Längen von Dinukleotid-Wiederholungen ≤ 4-fach (alle Base-Calls in 1.890 sequenzierten Amplikons miteiner 4-fachen Dinukleotid-Wiederholung erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 0,9 %)

u Längen von Trinukleotid-Wiederholungen ≤ 5-fach (alle Base-Calls in 378 sequenzierten Amplikons mit einer5-fachen Trinukleotid-Wiederholung erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 1,4 %)

u Insertionslängen ≤ 23 (alle Base-Calls in 378 sequenzierten Amplikons mit einer Insertion von 23 Nukleotidenerfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 0,8 %)

u Deletionslängen ≤ 25 (alle Base-Calls in 1.134 sequenzierten Amplikons mit einer Deletion von 25Nukleotiden erfolgten korrekt, mit einer No-Call-Rate von 0,7 %)

PräzisionZur Ermittlung der Präzision des NextSeq 550Dx-Geräts führten drei Bediener auf drei Geräten und mit dreiReagenzienchargen über fünf Starttage hinweg neun Sequenzierungsläufe mit 13 eindeutigen Platinum-Genome-Proben durch. Der repräsentative Assay, die Proben und die Referenzmethode waren die gleichen wiebei der Genauigkeitsstudie für das Modul für Keimbahn-Varianten. Die Präzisionsbeiträge wurden durchAnalyse der Varianzkomponenten bestimmt. Hierbei wurde VAF als Reaktionsvariable verwendet, dieBerechnung der Standardabweichungen erfolgte auf Komponentenebene nach Gerät, Reagenziencharge,Bediener und Starttag (Tabelle 19). Bei der Analyse der Variabilität der einzelnen Geräte, Bediener oderReagenzienchargen wurden insgesamt 699 SNVs, 176 Insertionen und 235 Deletionen untersucht.


Standardabweichung der Komponente Standardabweichung insgesamt

Komponente Variantentyp Max. Median Max. Median

Charge SNV 0,0076 0,0002 0,0833 0,0154

Insertion 0,0104 0,0000 0,0410 0,0157

Deletion 0,0046 0,0005 0,0560 0,0187

Gerät SNV 0,0114 0,0003 0,0840 0,0153

Insertion 0,0138 0,0009 0,0407 0,0161

Deletion 0,0079 0,0008 0,0549 0,0187

Bediener SNV 0,0226 0,0008 0,0841 0,0155

Insertion 0,0344 0,0010 0,0417 0,0164

Deletion 0,0083 0,0013 0,0547 0,0187

Tag SNV 0,0277 0,0012 0,0825 0,0160

Insertion 0,0235 0,0012 0,0409 0,0169

Deletion 0,0271 0,0014 0,0548 0,0188

Tabelle 19 Präzisionsergebnisse für das NextSeq 550Dx-Gerät (Standardabweichung)

Methodenvergleich (Sequenzierungsplattform)Vollblut- und FFPE-Proben wurden auf dem NextSeq 550Dx- und dem MiSeqDx-Gerät mit dem TruSeq CustomAmplicon Kit Dx und dem Workflow für Keimbahn- bzw. somatische Varianten untersucht. DieÜbereinstimmung der Variantenhäufigkeit bei Blut- und FFPE-Proben wurde mit mehreren repräsentativenAssays beurteilt. In Abbildung 2 ist die VAF-Korrelation zwischen den beiden Geräten für einen repräsentativenAssay dargestellt. Tabelle 20 enthält eine Zusammenfassung dieser Korrelation nach Assay-Panel. Basierend aufder starken Korrelation zwischen dem MiSeqDx- und dem NextSeq 550Dx-Gerät wurde festgelegt, dass dieLeistungsmerkmale bezüglich voranalytischer Faktoren (z. B. Extraktionsmethoden oder störende Substanzen)für beide Geräte gelten. Weitere Informationen finden Sie in der Packungsbeilage zum TruSeq CustomAmplicon Kit Dx.

Abbildung 2 VAF-Korrelation zwischen dem MiSeqDx- und dem NextSeq 550Dx-Gerät für FFPE- (links) undBlutproben (rechts) bei Assay 1

35 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät

gDNA-Quelle

Assay(Oligo-Panel)

BiologischeReplikate(Proben)

TechnischeReplikate (proProbe)

Beobachtungen(Anzahl derVarianten)

Steigungswert Regressionskonstante Korrelation(R2)

Blut Assay 1 45 2 8.3691 0,992 0,002 0,9952

Blut Assay 2 45 2 5457 0,995 0,005 0,981

FFPE Assay 1 46 2 8319 0,993 0,000 0,9972

FFPE Assay 3 40 1 280 0,969 0,015 0,978

Tabelle 20 Ergebnisse des Methodenvergleichs mit eindeutigen Blut- und FFPE-Proben

1Zwei Datenpunkte wurden aufgrund der für das Modul für Keimbahn-Varianten angegebenen Limitierungen entfernt.2Bestimmungskoeffizient für die VAF-Chargen gemäß Abbildung 2.

ReproduzierbarkeitDie Reproduzierbarkeit des NextSeq 550Dx-Geräts wurde mit Platinum-Genome-Proben und einemrepräsentativen Assay untersucht, der darauf ausgelegt ist, unter der Nutzung von 150 Amplikons verschiedeneGene abzufragen, die 12.588 Basen über 23 unterschiedliche Chromosomen hinweg abdecken. Der Test für dasKeimbahn-Varianten-Modul bestand aus sieben Replikaten von 13 Proben. Der Test für das Modul fürsomatische Varianten bestand aus sechs Replikaten von sieben Proben auf verschiedenen VAF-Ebenen. DieProben wurden mit dem TruSeq Custom Amplicon Kit Dx vorbereitet.

Die Tests wurden an drei externen Standorten mit einer Charge des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2(300 Zyklen) durchgeführt. An jedem Standort wurde ein NextSeq 550Dx-Gerät verwendet. Zwei Bedienerführten die Tests an jedem Standort durch. Jeder Bediener führte die Tests an drei nicht aufeinanderfolgendenStarttagen für jeden Probentyp bei insgesamt 36 Läufen über die drei Standorte hinweg durch, davon jeweils18 Läufe für den Keimbahn- und für den somatischen Workflow.

KeimbahnKeimbahn-Varianten mit einem VAF-Wert von ≥ 0,2 werden als positiv (Variante) gemeldet. Für erwartete positiveKeimbahn-Varianten wurden die Daten innerhalb jedes Variantentyps (SNV, Insertion, Deletion) auf die No-Call-Rate und die Rate der korrekten positiven Calls hin ausgewertet. Tabelle 21 führt die beobachteten Raten fürjeden Variantentyp auf, zusammen mit der nach der Wilson-Methode berechneten unteren und oberenKonfidenzgrenze (LCL/UCL) für ein Konfidenzniveau von 95 %.

Variantentyp No Call (Kein Call) Korrekter positiver Call

Beobachtet Summe Prozent Beobachtet Summe Prozent 95 % LCL 95 % UCL

SNV 16 110.376 0,014 110.349 110.360 99,99 99,98 99,99

Insertionen 1026 37.044 2,77 36.018 36.018 100 99,99 100,00

Deletionen 648 34.776 1,86 34.128 34.128 100 99,99 100,00

Tabelle 21 Keimbahn-Call-Beobachtungen für erwartete positive Ergebnisse nach Variantentyp

Keimbahn-Varianten mit einem VAF-Wert von < 0,2 werden als negativ (Wildtyp) gemeldet. Für erwartetenegative Keimbahnpositionen wurden die Daten auf „No Calls“ und korrekte Wildtyp-Call-Raten hinausgewertet. Tabelle 22 führt die beobachteten Raten auf, zusammen mit der nach der Wilson-Methodeberechneten unteren und oberen Konfidenzgrenze (LCL/UCL) für ein Konfidenzniveau von 95 %.

Variantentyp No Call (Kein Call) Korrekter negativer Call

Beobachtet Summe Prozent Beobachtet Summe Prozent 95 % LCL 95 % UCL

Wildtyp 4883 19.600.182 0,025 19.595.299 19.595.299 100 100,00 100,00

Tabelle 22 Keimbahn-Call-Beobachtungen für erwartete negative Ergebnisse


English Source: 1000000030326v02 | 36

NextSeq550Dx-Gerät

Bei Keimbahn-Varianten mit einem VAF-Wert ≥ 0,2 und < 0,7 erfolgen positiv heterozygote Calls für die Variante.Bei Varianten mit einem VAF-Wert ≥ 0,7 erfolgen positiv homozygote Calls für die Variante. Es wurdenKeimbahn-Proben mit heterozygoten Varianten verwendet, um zu ermitteln, ob die inhärente Variabilität desAssays den Genotypaufruf beeinflusst. Der Cx-Wert wurde für beide Cutoffs (0,2 für heterozygote und 0,7 fürhomozygote Genotypen) bestimmt, wobei x für den Anteil der wiederholten Tests steht, die den Cutoffüberschreiten. Für den unteren Cutoff von 0,2 VAF war Cx ≥ 99,999 %. Dies weist darauf hin, dass bei 99,999 %oder mehr der heterozygoten Varianten heterozygote Calls erfolgen. Bezogen auf den oberen Cutoff von0,7 VAF war Cx ≤ 0,001 %. Dies weist darauf hin, dass bei 0,001 % oder weniger der heterozygoten Variantenhomozygote Calls erfolgen. Tabelle 23 fasst die Ergebnisse nach Variantentyp zusammen.

Variantentyp Cutoff bei 0,2 VAF Cutoff bei 0,7 VAF

≥ C 99,999 % ≤ C 0,001 %

SNV 94/94 94/94

Insertionen 24/24 24/24

Deletionen 35/35 35/35

Summe 153 153

Tabelle 23 Keimbahn-Cx-Werte für heterozygote Varianten

SomatischSomatische Varianten mit einem VAF-Wert von ≥ 0,026 werden als positiv (Variante) gemeldet. Beobachtungenmit VAF-Werten ≥ 0,01 und < 0,026 wurden für die Zwecke dieser Analyse als mehrdeutig angesehen (wederpositiv noch negativ, als niedrige Variantenhäufigkeit markiert). Zur Beurteilung der Leistung wurden dieErgebnisse auf drei Arten berechnet:

u Bester Fall: Jedes mehrdeutige Ergebnis wurde als korrekter positiver Call gewertet (Übereinstimmung mitden erwarteten Ergebnissen).

u Schlechtester Fall: Jedes mehrdeutige Ergebnis wurde als falscher Call betrachtet (Nichtübereinstimmungmit den erwarteten Ergebnissen).

u Ausschlussfall: Jedes mehrdeutige Ergebnis wurde von der Analyse ausgeschlossen.In den drei Tabellen, Tabelle 24, Tabelle 25 und Tabelle 26, sind die Call-Ergebnisse für den besten,schlechtesten und den Ausschlussfall sowie die nach der Wilson-Methode berechneten unteren und oberenKonfidenzgrenzen (LCL/UCL) für ein Konfidenzniveau von 95 % zusammengefasst.

Variantentyp Korrekter positiver Call

Beobachtet Summe Prozent 95 % LCL 95 % UCL

SNV 54.346 54.346 100 99,99 100,00

Insertionen 18.036 18.036 100 99,98 100,00

Deletionen 18.381 18.381 100 99,98 100,00

Tabelle 24 Beobachtungen beim Calling somatischer Varianten für erwartete positive Ergebnisse nach Variantentyp(bester Fall)



SNV 54.346 54.346 100 99,99 100,00

Insertionen 18.000 18.036 99,8 99,72 99,86

Deletionen 18.381 18.381 100 99,98 100,00

Tabelle 25 Beobachtungen beim Calling somatischer Varianten für erwartete positive Ergebnisse nach Variantentyp(schlechtester Fall)

37 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät



SNV 54.346 54.346 100 99,99 100,00

Insertionen 18.000 18.000 100 99,98 100,00

Deletionen 18.381 18.381 100 99,98 100,00

Tabelle 26 Beobachtungen beim Calling somatischer Varianten für erwartete positive Ergebnisse nach Variantentyp(mehrdeutige Calls entfernt)

Somatische Varianten mit einem VAF-Wert von < 0,01 werden als negative Calls (Wildtyp) gemeldet. Fürerwartete negative somatische Positionen wurden die Daten auf „No Calls“ und korrekte Wildtyp-Call-Raten hinausgewertet. Korrekte Wildtyp-Calls wurden ermittelt, indem die „No Calls“ ausgeschlossen und diebeobachteten Calls, die in den mehrdeutigen Bereich (VAF-Werte ≥ 0,01 und < 0,026) fielen, sowie die falschenCalls, die über dem Cutoff (VAF-Werte ≥ 0,026) lagen, von der Gesamtsumme subtrahiert wurden. Tabelle 27führt die beobachteten Gesamt- und prozentualen Ergebnisse für negative somatische Positionen für die No-Call-Rate und die Call-Rate korrekter Wildtypen auf, zusammen mit der nach der Wilson-Methode berechnetenunteren und oberen Konfidenzgrenze (LCL/UCL) für ein Konfidenzniveau von 95 %.

VariantentypNo Call (Kein

Call)Korrekter

Call

Beobachtet Summe Prozent Mehrdeutig Falsch Richtig Summe Prozent95 %LCL

95 %UCL

Wildtyp 36.326 8.909.676 0,408 2254 121 8.870.975 8.873.350 99,97 99,972 99,974

Tabelle 27 Beobachtungen beim Calling somatischer Varianten für erwartete negative Ergebnisse

Zur Bestimmung des C95 des Assays (innerhalb jedes Variantentyps) wurden somatische Proben mitunterschiedlichen VAF-Werten für dieselbe Variante ausgewertet. Um die Variabilität nahe dem Cutoff desAssays zu bewerten, wurden Proben verwendet, die erwartete VAF-Werte zwischen 0,02 und 0,07 hatten. Fürjede Variante wurde C95 bestimmt. In Tabelle 28 sind die höchsten C95-Werte für jeden Variantentyp aufgeführt.

Variantentyp N C95

SNV 74 0,0613

Insertion 24 0,0573

Deletion 33 0,0575

Tabelle 28 C95 für somatische Varianten – Übersicht

NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) – Leistung

ÜberblickDas NextSeq 550Dx-Gerät wird von zwei Reagenzien-Kits unterstützt: dem NextSeq 550Dx High Output ReagentKit v2 (300 Zyklen) und dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen). Um zu zeigen, dass dasNextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) die mit dem NextSeq 550Dx High Output ReagentKit v2 (300 Zyklen) überprüften und validierten Anforderungen an die Analyseleistung erfüllen kann, wurdenStudien mit dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) durchgeführt. Es wurden zweiBibliotheksvorbereitungen mithilfe des TruSeq Custom Amplicon Kit Dx durchgeführt, eine für den Keimbahn-Workflow und die andere für den somatischen Workflow. Bibliotheken aus jedem Workflow wurden mit dreiChargen aus dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) mithilfe von drei NextSeq 550Dx-Geräten getestet. Darüber hinaus umfassten die Tests für jeden Workflow einen einzelnen Lauf mit demNextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen).


NextSeq550Dx-Gerät

Analytische Sensitivität (Leerwertgrenze (Limit of Blank, LoB) und Nachweisgrenze (Limit ofDetection, LoD))Die Überprüfung mit dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) zeigte, dass das NextSeq550Dx-Gerät Varianten mit einer VAF von 0,05 mit einem Typ-II-Fehler von ≤ 0,05 erkennen konnte und dass dervom Modul für somatische Varianten verwendete Cutoff von 0,026 VAF (die effektive Leerwertgrenze) einen Typ-I-Fehler von ≤ 0,01 unterstützt. Aufgrund dieser Ergebnisse wird erwartet, dass eine Variante mit einer VAF von0,05 in 95 % aller Fälle größer als eine VAF von 0,026 ist und dass eine Wildtyp-Position in 99 % aller Fälle untereinem VAF-Wert von 0,026 liegt. Um sicherzustellen, dass diese Ergebnisse mit dem NextSeq 550Dx HighOutput Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) erreicht werden, wurden mit dem NextSeq 550Dx High Output ReagentKit v2.5 (300 Zyklen) wiederholte Messungen auf dem NextSeq 550Dx-Gerät mit Wildtyp-Proben (LoB-Proben)sowie mit Proben durchgeführt, die Varianten mit einer VAF von 0,05 (LoD-Proben) enthielten. Die Anteile anCalls über und unter dem Cutoff von 0,026 wurden dann mit den mit dem NextSeq 550Dx High Output ReagentKit v2 (300 Zyklen) erzielten Ergebnissen verglichen.

Die Tests umfassten zwei LoD-Proben mit jeweils einem Satz an eindeutigen Varianten, bei denen eine VAF von0,05 anvisiert wurde, sowie entsprechenden LoB-Proben, die in Bezug auf die zu untersuchenden VariantenWildtyp-Proben waren. Zur Bibliotheksvorbereitung wurden LoD- und LoB-Proben mit dem TruSeq CustomAmplicon Kit Dx in jeweils acht und sieben Replikaten verarbeitet. Die Bibliotheken wurden ursprünglich mithilfedes NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) sequenziert, um Varianten/genomischeKoordinaten für die LoB/LoD-Überprüfung mit dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen)zu bestimmen. Bei der LoD-Analyse (N = 51 Varianten) wurden alle Varianten mit einem durchschnittlichen VAF-Wert zwischen 0,045 und 0,055 (LoD-Varianten) basierend auf den Ergebnissen des NextSeq 550Dx High OutputReagent Kit v2 (300 Zyklen) verwendet. Bei der LoB-Analyse wurden die 51 entsprechenden genomischenKoordinaten bewertet.

Zur Überprüfung des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) wurden Bibliotheken in dreiLäufen an drei aufeinanderfolgenden Tagen unter Verwendung desselben Geräts und derselben Charge desReagenzien-Kits sequenziert. Diese Tests ergaben 24 Replikate für jede der 51 LoD-Varianten und 21 Replikatefür jede der entsprechenden Wildtyp-Positionen. Der Anteil an Wildtyp-Calls mit einer VAF von < 0,026 ist inTabelle 29 aufgeführt. Der Anteil an LoD-Varianten-Calls mit einer VAF von > 0,026 ist in Tabelle 30 angegeben.

Variantentyp Überprüfte Positionen Beobachtungen insgesamt Anzahl der VAF-Messungen> 2,6 %

Anteil< 2,6 %

Anteil 95 %Konfidenzintervall

SNV 32 672 0 1 0,994–1

Insertion 11 231 0 1 0,984–1

Deletion 8 168 0 1 0,978–1

Tabelle 29 Anteil an Calls < 0,026 für Wildtyp-Positionen (Überprüfung der LoB-Werte)

Variantentyp ÜberprüftePositionen

Beobachtungeninsgesamt

Anzahl der VAF-Messungen< 2,6 %

Anzahl der VAF-Messungen> 2,6 %

Anteil> 2,6 %

Anteil 95 %Konfidenzintervall

SNV 32 768 1 767 0,999 0,993–1

Insertion 11 264 3 261 0,989 0,967–0,996

Deletion 8 192 2 190 0,99 0,963–0,997

Tabelle 30 Anteil an Calls > 0,026 VAF für LoD-Varianten (Überprüfung der LoD-Werte)

Genauigkeit

KeimbahnDie folgende Studie wurde durchgeführt, um die Genauigkeit des Varianten-Calls zu untersuchen, die mit demModul für Keimbahn-Varianten bei Verwendung des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen)erzielt werden kann. Mit einem repräsentativen Assay wurden 12 eindeutige Platinum-Genome-Proben getestet.

39 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät

Insgesamt wurden auf drei NextSeq 550Dx-Geräten und mit drei Chargen des NextSeq 550Dx High OutputReagent Kit v2.5 (300 Zyklen) 11 Läufe durchgeführt.

Die Genauigkeit für SNVs, Insertionen und Deletionen wurde untersucht, indem die Ergebnisse mit einer gutcharakterisierten zusammengesetzten Referenzmethode, Platinum Genomes, Version 2016-1.0, verglichenwurden. Die Genauigkeitsergebnisse aus einem einzelnen Sequenzierungslauf mit dem NextSeq 550Dx HighOutput Reagent Kit v2 (300 Zyklen) werden als Referenz bereitgestellt. Eine Zusammenfassung der Ergebnissefinden Sie in Tabelle 31.

KriterienBeobachtungeninsgesamt (v2.5)1

Ergebnis nachBeobachtung (v2.5)2

Ergebnis nachBeobachtung (v2)3

Ergebnis nachLauf (v2.5)4

Ergebnis nachLauf (v2)4

PPA fürSNV

1056 98,7 98,7 > 99,9 > 99,9

PPA fürInsertionen

1056 100 100 100 98,9

PPA fürDeletionen

1056 95,2 95,2 > 99,9 100

NPA 1056 100 100 100 100

OPA 1056 > 99,9 > 99,9 > 99,9 > 99,9

Tabelle 31 Zusammenfassung der Übereinstimmung des Moduls für Keimbahn-Varianten

1Berechnet als die Anzahl der Proben pro Lauf multipliziert mit der Anzahl an Läufen (96 Proben pro Lauf x 11 Läufe = 1056 Beobachtungen).2Niedrigster beobachteter Wert bei Probenreplikation über alle Läufe hinweg (basierend auf 11 Läufen für NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5).3Niedrigster beobachteter Wert bei Probenreplikation über 1 Lauf hinweg (96 Beobachtungen insgesamt).4Niedrigster Wert, wenn die Daten aus jedem Lauf aggregiert analysiert werden.

SomatischDie folgende Studie wurde durchgeführt, um die Genauigkeit des Varianten-Callings zu untersuchen, die mitdem Modul für somatische Varianten auf dem NextSeq 550Dx-Gerät bei Verwendung des NextSeq 550Dx High-Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) erzielt werden kann. Mit einem repräsentativen Assay wurden 10 Platinum-Genome-FFPE-Proben (zwei mit Varianten, die auf bis zu 0,05 VAF verdünnt wurden) getestet. Insgesamtwurden auf drei NextSeq 550Dx-Geräten und mit drei Chargen des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5(300 Zyklen) 11 Läufe durchgeführt.

Die Genauigkeit für SNVs, Insertionen und Deletionen wurde untersucht, indem die Ergebnisse mit einer gutcharakterisierten zusammengesetzten Referenzmethode, Platinum Genomes, Version 2016-1.0, verglichenwurden. Die Genauigkeitsergebnisse aus einem einzelnen Sequenzierungslauf mit dem NextSeq 550Dx HighOutput Reagent Kit v2(300 Zyklen) werden als Referenz bereitgestellt. Eine Zusammenfassung der Ergebnissefinden Sie in Tabelle 32.

KriterienBeobachtungeninsgesamt(v2.5)1

Ergebnis nachBeobachtung(v2.5)2

Ergebnis nachBeobachtung(v2)3

Ergebnis nachLauf(v2.5)4

Ergebnis nachLauf(v2)4

PPA für SNV 528 100 100 100 100

PPA fürInsertionen

528 96,9 96,9 > 99,9 > 99,9

PPA fürDeletionen

528 100 100 100 100

NPA 528 > 99,9 > 99,9 > 99,9 > 99,9

OPA 528 > 99,9 > 99,9 > 99,9 > 99,9

Tabelle 32 Zusammenfassung der Übereinstimmung des Moduls für somatische Varianten

1Berechnet als die Anzahl der Proben pro Lauf multipliziert mit der Anzahl an Läufen (48 Proben pro Lauf x 11 Läufe = 528 Beobachtungen).2Niedrigster beobachteter Wert bei Probenreplikation über alle Läufe hinweg (basierend auf 11 Läufen für NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5).


English Source: 1000000030326v02 | 40

NextSeq550Dx-Gerät

3Niedrigster beobachteter Wert bei Probenreplikation über 1 Lauf hinweg (96 Beobachtungen insgesamt).4Niedrigster Wert, wenn die Daten aus jedem Lauf aggregiert analysiert werden.

Präzision

KeimbahnDie Präzision des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) mit dem Modul für Keimbahn-Varianten wurde mithilfe von Platinum-Genome-Proben und einem repräsentativen Assay untersucht. Die Testsumfassten eine einzelne Bibliotheksvorbereitung mithilfe des TruSeq Custom Amplicon Kit Dx und beinhalteten12 Proben, die mit je acht Replikaten verarbeitet wurden. Die Sequenzierung von Bibliotheken erfolgte mithilfevon drei Chargen des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) und drei NextSeq 550Dx-Geräten und es wurden insgesamt neun Sequenzierungsläufe durchgeführt.

Es wurden Proben mit heterozygoten Varianten verwendet, um zu ermitteln, ob die inhärente Variabilität desAssays den Genotypaufruf beeinflusst (N = 153 eindeutig heterozygote Varianten). Der Cx-Wert wurde für beideCutoffs des Moduls für Keimbahn-Varianten (0,2 für heterozygote und 0,7 für homozygote Genotypen)bestimmt, wobei x für den Anteil der wiederholten Tests steht, die den Cutoff überschreiten. Für den unterenCutoff von 0,2 VAF lag die Variante mit dem Cx-Mindestwert für das NextSeq 550Dx Reagent Kit v2.5(300 Zyklen) bei > 99,9 %. Dies weist darauf hin, dass bei mehr als 99,9 % der heterozygoten Variantenheterozygote Calls erfolgen. Für den oberen Cutoff von 0,7 VAF lag die Variante mit dem Cx-Höchstwert für dasNextSeq 550Dx Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) bei < 1,5 %. Dies weist darauf hin, dass bei 1,5% oder weniger derheterozygoten Varianten homozygote Calls erfolgen. Tabelle 33 fasst die Ergebnisse nach Variantentypzusammen. Die Cx-Werte aus einem einzelnen Sequenzierungslauf mithilfe des NextSeq 550Dx High OutputReagent Kit v2 (300 Zyklen) werden als Referenz bereitgestellt.

Variantentyp NCutoff bei 0,2 VAF Cutoff bei 0,7 VAF

Min. Cx (v2)1 Min. Cx (v2)2 Max. Cx (v2.5)1 Max. Cx (v2)2

SNV 94 > 99,9% > 99,9% 1,5 % 1,0 %

Insertionen 24 100 % 100 % 0 % < 0,1%

Deletionen 35 100 % > 99,9% < 0,1% < 0,1%

Tabelle 33 Keimbahn-Cx-Werte für heterozygote Varianten

1Cx-Werte basierend auf Gesamtschätzungen der Standardabweichung aus der Analyse der Varianzkomponenten.2Cx-Werte basierend auf Standardabweichungen der Probe.

SomatischDie Präzision des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) mit dem Modul für somatischeVarianten wurde mithilfe von Platinum-Genome-FFPE-Proben und einem repräsentativen Assay untersucht. DieTests umfassten eine einzelne Bibliotheksvorbereitung mithilfe des TruSeq Custom Amplicon Kit Dx undbeinhalteten zwei Proben mit je 8 Replikaten. Die Sequenzierung von Bibliotheken erfolgte mithilfe des NextSeq550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) und drei NextSeq 550Dx-Geräten und es wurden insgesamtneun Sequenzierungsläufe durchgeführt.

Zur Überprüfung der Variabilität nahe dem VAF-Cutoff des Moduls für somatische Varianten (bei somatischenVarianten mit einem VAF-Wert von ≥ 0,026 erfolgen positive Calls für die Variante) wurden somatische Variantenmit einem erwarteten VAF-Wert von ≤ 0,10 (N = 131 eindeutige Varianten) verwendet. Für jede der somatischenVarianten wurden C95-Werte bestimmt. C95-Werte stellen die VAF dar, bei der die Wahrscheinlichkeit, dass siegrößer als der VAF-Cutoff des Moduls für somatische Varianten ist, bei 95 % liegt. Die höchsten C95-Wertenach Variantentyp sind in Tabelle 34 aufgeführt. Die C95-Ergebnisse aus einem einzelnen Sequenzierungslaufmithilfe des NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) werden als Referenz bereitgestellt.

Variantentyp Anzahl der untersuchten Varianten C95 (v2.5)1 C95 (v2)2

SNV 74 0,064 0,063

Tabelle 34 C95 für somatische Varianten – Übersicht

41 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


Februar 2019

NextSeq550Dx-Gerät

Insertionen 24 0,062 0,061

Deletionen 33 0,060 0,060

1C95-Werte basierend auf Gesamtschätzungen der Standardabweichung aus der Analyse der Varianzkomponenten.2C95-Werte basierend auf Standardabweichungen der Probe.

Methodenvergleich (Reagenzien-Kit)

KeimbahnDie durchschnittlichen VAF-Werte von 215 eindeutigen Varianten wurden über das NextSeq 550Dx High OutputReagent Kit v2 (300 Zyklen) und das NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) hinweg anhandder vom Modul für Keimbahn-Varianten generierten Ergebnisse ausgewertet. Die VAF-Durchschnittswertewurden aus 11 Sequenzierungsläufen (v2.5) und einem Sequenzierungslauf (v2) berechnet. Bei der Berechnungdes Durchschnittswerts der einzelnen Varianten wurden mindestens acht Replikate verwendet. In Abbildung 3ist die VAF-Korrelation zwischen den beiden Reagenzien-Kits dargestellt. Aufgrund der starken linearen VAF-Korrelation und der Ähnlichkeit der Ergebnisse zwischen den Reagenzien-Kits wurde festgelegt, dass dieursprünglich mit dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) in Kombination mit dem Modulfür Keimbahn-Varianten überprüften und validierten Leistungsmerkmale auch für das NextSeq 550Dx HighOutput Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) gelten.

Abbildung 3 VAF-Korrelation (Variant Allele Frequency) des Moduls für Keimbahn-Varianten zwischen dem NextSeq550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) und dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5(300 Zyklen).

SomatischDie durchschnittlichen VAF-Werte für 501 eindeutige Varianten wurden über das NextSeq 550Dx High OutputReagent Kit v2 (300 Zyklen) und das NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5 (300 Zyklen) hinweg anhandder vom Modul für somatische Varianten generierten Ergebnisse ausgewertet. Die VAF-Durchschnittswertewurden aus 11 Sequenzierungsläufen (v2.5) und einem Sequenzierungslauf (v2) berechnet. Bei der Berechnungdes Durchschnittswerts der einzelnen eindeutigen Varianten wurden mindestens drei Replikate verwendet. InAbbildung 4 ist die VAF-Korrelation zwischen den beiden Reagenzien-Kits dargestellt. Aufgrund der VAF-Korrelation und der Ähnlichkeit der Ergebnisse zwischen den Reagenzien-Kits wurde festgelegt, dass die mit


NextSeq550Dx-Gerät

dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) in Kombination mit dem Modul für somatischeVarianten überprüften und validierten Leistungsmerkmale auch für das NextSeq 550Dx High Output ReagentKit v2.5 (300 Zyklen) gelten.

Abbildung 4 VAF-Korrelation (Variant Allele Frequency) des Moduls für somatische Varianten zwischen dem NextSeq550Dx High Output Reagent Kit v2 (300 Zyklen) und dem NextSeq 550Dx High Output Reagent Kit v2.5(300 Zyklen).

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43 | Dokument-Nr. 1000000045251 v02 DEU


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NextSeq550Dx-Gerät

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