Aus der Medizinischen Klinik 1 mit Poliklinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Markus F. Neurath
Der Tyrosinkinaseinhibitor AEE788 im Morrishepatom der Ratte
- Eine tierexperimentelle Arbeit -
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Susanne Söthje aus
Marktredwitz
2
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof Dr. med. Matthias Ocker Korreferent: Prof. Dr. med. Eckhart G. Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 21.März 2012
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Meinem Vater
4
Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung .......................................................................................................................... 1
2. Einleitung ........................................................................................................................................ 3
2.1 Grundlagen ............................................................................................................................... 4 2.1.1 HCC - Wachstumsfaktoren und Signaltransduktion .......................................................... 4
2.1.2 Angiogenese und VEGF ..................................................................................................... 5
2.1.3 EGF – epidermal growth factor ......................................................................................... 8
2.1.4 AEE 788 .............................................................................................................................. 8
2.2 Das Hepatozelluläre Karzinom ................................................................................................. 9
2.2.1 Definition ........................................................................................................................... 9
2.2.2 Epidemiologie .................................................................................................................... 9
2.2.3 Ätiologie .......................................................................................................................... 11
2.2.4 Prävention und Screening ............................................................................................... 13
2.2.5 Diagnostik ........................................................................................................................ 14 2.2.6 Therapie .......................................................................................................................... 16
2.2.6.1 Invasive Methoden ................................................................................................... 18
2.2.6.2 Medikamentöse Therapieoptionen......................................................................... 20
2.3 Fragestellung .......................................................................................................................... 23
3. Material und Methoden ............................................................................................................... 24
3.1 Material .................................................................................................................................. 24
3.2 Zellkultur ................................................................................................................................ 29
3.2.1 Verwendete Zellen .......................................................................................................... 29
3.2.2 Kulturbedingungen und Passage ..................................................................................... 29
3.2.3 Vorbereitung der Zellen zur Inokulation ......................................................................... 30 3.3 Tierexperimentelle Arbeiten .................................................................................................. 30
3.3.1 Tumorinokulation ............................................................................................................ 30
3.3.2 Medikamentengabe ........................................................................................................ 31
3.3.3 Verlaufskontrollen ........................................................................................................... 31
3.3.4 Tötung der Tiere ............................................................................................................. 31
3.4 Western Blot .......................................................................................................................... 31
3.4.1 Proteinextraktion ............................................................................................................ 32
3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration .......................................................................... 32
3.4.3 Gelelektrophorese ........................................................................................................... 33
3.4.4 Transfer auf Nitrocellulosemembran .............................................................................. 33 3.4.5 Antikörperinkubation und Röntgenfilmentwicklung ..................................................... 34
3.4.6 Antikörperentfernung ..................................................................................................... 34
3.4.7 Auswertung ..................................................................................................................... 35
3.5 PCR ......................................................................................................................................... 35
3.5.1 RNA-Isolation aus Tumorgewebe .................................................................................... 35
3.5.2 RNA-Konzentrationsbestimmung .................................................................................... 35
3.5.3 RNA-Transkripition in cDNA ............................................................................................ 36
3.5.4 Light-Cycler PCR .............................................................................................................. 36
3.5.5 Auswertung ..................................................................................................................... 36
3.6 Histologische Verfahren ......................................................................................................... 36 3.6.1 Anfertigung der Präparate .............................................................................................. 36
3.6.2 HE – Färbung ................................................................................................................... 37
3.6.3 TUNEL – Färbung ............................................................................................................. 37
3.6.4 KI-67-Färbung .................................................................................................................. 38
3.6.5 VEGF- und VEGFR-Färbung .............................................................................................. 38
3.6.6 EGF- und EGFR-Färbung .................................................................................................. 38
3.6.7 Auswertung ..................................................................................................................... 38
5
4. Ergebnisse .................................................................................................................................... 40
4.1 Sonographischer Wachstumsverlauf ..................................................................................... 40
4.2 Western Blot .......................................................................................................................... 41
4.3 Immunhistochemie ................................................................................................................ 43 4.3.1 KI-67 Färbung .................................................................................................................. 43
4.3.2 TUNEL-Färbung................................................................................................................ 44
4.3.3 Färbung des EGF- und des VEGF-Rezeptors .................................................................... 45
4.3.4 Färbung der phosphorylierten EGF- und VEGF-Rezeptoren ........................................... 47
4.4 Light-Cycler® PCR ................................................................................................................... 49
5. Diskussion ..................................................................................................................................... 51
6. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................. 56
7. Tabellenverzeichnis ...................................................................................................................... 57
8. Abbildungsverzeichnis .................................................................................................................. 57
9. Literaturverzeichnis ...................................................................................................................... 58 10. Danksagung ................................................................................................................................ 66
11. Lebenslauf .................................................................................................................................. 67
1
1. Zusammenfassung
Als fünfthäufigste Todesursache weltweit steht das hepatozelluläre Karzinom
unverändert im Interesse der medizinischen Forschung.
Ansatz einer medikamentösen systemischen Therapie des HCC stellt die Inhibition
des Gefäßwachstums im Karzinom dar. Bestimmte modulierende Botenstoffe und
Rezeptoren, die dabei eine Rolle spielen, bieten hierfür Angriffsmöglichkeit.
In der vorliegenden tierexperimentellen Arbeit wurde die Wirkung des dualen
Tyrosinkinaseinhibitors AEE788 im Morrishepatom der Ratte untersucht.
Das Potenzial von AEE788 in der HCC-Therapie liegt in der Hemmung der
Phosphorylierung, also Aktivierung der Wachstumsfaktoren epidermal-growth-factor
(EGF) und vascular-epidermal-growth-factor (VEGF) und ihrer Rezeptoren und
anschließende Signalwege, dem mitogen-activated-protein-kinase-Weg (MAPK) und
dem Proteinkinase-B-Weg (AKT).
Jeweils fünf Versuchstiere wurden nach Implantation von Morris-Hepatom-Zellen mit
AEE788 behandelt, weitere fünf Tiere dienten als unbehandelte Kontrollen. Im
Verlauf wurde das Wachstum durch Gewichtskontrollen und sonographische
Ausmessung der Tumorgröße verfolgt. Anschließend wurden die Tumoren für
laborchemische Untersuchungen entnommen: mittels Immunhistochemie, Western-
Blot-Analyse und Polymerasekettenreaktion wurde die Expression von EGF, VEGF
und ihrer Rezeptoren, sowie die MAPK und AKT ausgewertet.
Die Ergebnisse untermauern die Rolle der beiden Wachstumsfaktoren als
Ansatzpunkt in der Therapie des hepatozellulären Karzinoms.
Sowohl auf biochemischer als auch auf makroskopischer Ebene konnte ein positiver
Effekt im Sinne der Arbeitshypothese nachgewiesen werden.
Die immunhistologische Auswertung zeigte eine Proliferationsinhibition bei mit
AEE788 behandelten Tieren, sowie eine verminderte Expression der
Wachstumsfaktoren EGF, VEGF und deren Rezeptoren.
Es konnte gezeigt werden, dass die orale Verabreichung des
Tyrosinkinaseinhibitors AEE788 eine Reduktion des Wachstums des HCC in der
Ratte erzeugt, die Vermittlung dieses Effekts scheint in einer Herabregulierung der
weiterführenden Signaltransduktion von EGF zu beruhen.
Neben anderen Arbeiten zu AEE788 legt die hier Vorliegende den Grundstein für
die Erforschung einer neuen Therapieoption des HCC, verlangt aber nach weiterer
Abklärung in größeren tierexperimentellen Studien, auch um eine eventuelle
alternative Applikationsart in ihrer Wirksamkeit prüfen zu können.
2
Conclusion
Being the fifth most common cause of death worldwide, hepatocellular carcinoma
still remains in the focus of medical research.
Inhibition of angiogenesis in this highly vascularized tumor is a promising approach
to systemic medicamentous treatment, as messengers and receptors with the
potential of medical intervention have been identified.
The present dissertation investigates the effect of the dual tyrosinkinase inhibitor
AEE788 in the morris hepatoma model of the rat.
The potential of AEE788 in the therapy of the hepatocellular carcinoma is assumed
in the regulation of the epidermal-growth-factor (EGF) and vascular-epidermal-
growth-factor (VEGF) as well as their receptors and following signaling pathways,
the mitogen-activated-protein-pathway (MAPK) and proteinkinase-b-way (AKT).
After implanting the tumor cells into the rats` livers, five animals have been treated
orally with AEE788, and five remained untreated as control group, respectively. The
follow-up was done by sonographic assessment of tumor size as well as weight
controls. Subsequently, the tumors were extracted for further investigation: via
immunohistochemistry, western-blotting and quantitative real-time PCR the
expression of EGF, VEGF and their receptors as well as of downstream signaling
molecules MAPK and AKT were analyzed.
The results of this study confirm the importance of these two growth factors as
targets in HCC-therapy.
Biochemical and macroscopic findings support the thesis; AEE788 may have the
potential to inhibit tumor growth. Immunohistochemistry showed an inhibition of
proliferation, as well as a decreased expression of EGF, VEGF and their receptors.
It was possible to show the reduction of tumor growth, which seems to be based on
an inhibition of the down streaming signaling pathways of EGF.
Among other studies concerning AEE788 this dissertation reveals a new therapy
option in HCC, but further research in larger studies is recommended to prove the
present findings and evaluate possible alternative ways of administration.
3
2. Einleitung
Das hepatozelluläre Karzinom bzw. HCC ist die fünfthäufigste Krebserkrankung und
die dritthäufigste tumorassoziierte Todesursache weltweit, europaweit steht es auf
Platz 7 der Krebstodesursachen.
90% aller Lebermalignome sind primäre Leberzellkarzinome, die Inzidenz steigt
weltweit stetig an. Bisher imponiert das HCC mit seiner schlechten Prognose.
Nur in sehr frühen Phasen kann das HCC durch Resektion oder
Lebertransplantation geheilt werden. Mangelnde Früherkennungsmöglichkeiten
gestalten ebenso wie fehlende Therapieoptionen in späteren Stadien die
Behandlung als schwierig. Weltweit fordert es mindestens 500 000 Todesopfer
jährlich. [64]
Das Managment des HCC beansprucht die multidisziplinäre und stadienorientierte
Zusammenarbeit und ist Gegenstand der medizinischen und pharmakologischen
Forschung. Mit der Feststellung, welch wichtige Rolle die Angiogenese in
Entstehung und Wachstum von Tumoren spielt, wurden die Weichen in der
Erforschung medikamentöser systemischer und lokaler Verfahren neu gestellt.
Bereits 1971 wurde von J. Folkman die Hypothese vertreten, dass Tumorwachstum
und –ausbreitung von der Angiogenese abhängig sind. [20]
Da das hepatozelluläre Karzinom als hochvaskularisierter Tumor gilt, ist auch bei
dieser Krebsentität das Gefäßwachstum und dessen Stopp als Therapieziel
interessant.
Einem Mediator kommt hierbei eine Schlüsselfunktion zu: Dem vascular endothelial
growth factor, kurz VEGF. Unreguliert, wie im HCC, führt seine Aktivierung zur
Gefäßneubildung und unterhält so die Ausbreitung des Karzinoms. VEGF, genau
wie andere Wachstumsfaktoren und deren Beeinflussung, stellen eine große
Hoffnung in der Bekämpfung dieses Krebsleidens dar.
4
2.1 Grundlagen
2.1.1 HCC - Wachstumsfaktoren und Signaltransduktion
In der Kanzerogenese unterscheidet man verschiedene Stadien, die Initial-, die
Latenz- und schließlich die Proliferationsphase. Verschiedene Voraussetzungen
sind notwendig, um die Neuentstehung eines Tumors überhaupt möglich zu
machen. Veränderungen im Genom einer Tumorzelle führen zu vermehrter oder
verminderter Expression des Genprodukts oder aber sie führen zu einem
verändertem Genprodukt. Dies kann z. B. zu Mutationen von Protoonkogenen zu
Onkogenen und zum Ausfall von Tumorsuppressorgenen führen und ermöglicht so
eine expansive Größenzunahme. Für das Wachstum benötigt auch ein Tumor
Wege, das Signal zur Proliferation an die Zellen weiterzugeben. Dies geschieht mit
Hilfe sogenannter Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren. Wachstumsfaktoren
sind Proteine, welche durch Bindung an ihre Rezeptoren bestimmte Signalwege in
der Zelle aktivieren, die wiederum z.B. zur Proliferation anregen oder die Apoptose
inhibieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Inhibition der Aktivierung
eben zweier solcher proliferationsstimulierender Rezeptoren im Wachstum des
HCC, weswegen auf diese besonders eingegangen werden soll: Der epidermal-
growth-factor (EGF) und der vascular-endothelial-growth-factor (VEGF). Beide
führen nach Bindung an ihre Rezeptoren zur Aktivierung einer Tyrosinkinase und
anschließend durch Phosphorylierungen anderer intrazellulärer Botenstoffe zur
Aktivierung des Phosphatidylinsotiol-3-AKT-Kinase-Weges und des Ras-MAP-
Kinase-Weges. Schlussendlich münden diese beiden Wege in eine Stimulation der
Proliferation, also in Förderung des Tumorwachstums. [21]
Abb.1 Signaltransduktion nach EGFR- und VEGFR-Aktivierung in der Zelle [21]
5
2.1.2 Angiogenese und VEGF
Unter Angiogenese versteht man die Neubildung von Blutgefäßen aus bereits
Bestehenden, welche vor allem während der Embryonalentwicklung im Zuge der
Vaskulogenese entstanden sind. Verschiedene Reize, welche zu einem
Ungleichgewicht zwischen pro- und antiangiogenetischen Faktoren führen, können
zu einer solchen Blutgefäßneubildung bedingen. So etwa die chronische Hypoxie,
Gewebsazidose, Genmutationen, Immun – oder Entzündungsreaktionen.
Etliche molekulare Einflussgrößen konnten bis jetzt identifiziert werden, die folgende
Tabelle gibt einen Überblick. [39]
Tabelle 1 Pro- und antiangiogentische Faktoren
Proangiogenetische Faktoren Inhibitoren der Angiogen ese
Angiogenin
Angiopoietin-1
Adrenomedullin
Del-1-Fibroblast-growth-factor-1 (acidic FGF, FGF1)
Fibroblast-growth-factor-2 (basic FGF, FGF2)
Follistatin
Granulocyte-colony-stimulating-factor (G-CSF)
Hepatocyte-growth-factor/scatter-factor (HGF/SF)
Interleukin-3 (IL-3)
Interleukin-8 (IL-8)
Intermedin-Keratinocyte-growth-factor (FGF-7)
Leptin
Midkine
Neuregulin
Osteogenic-protein-1
Placental-growth-factor (PlGF)
Platelet-derived-endothelial-cell-growth-factor (PD-ECGF)
Platelet-derived-growth-factor (PDGF)
Pleiotrophin
Progranulin
Proliferin
Transforming-growth-factor-α (TGFα)
Transforming-growth-factor-β (TGFβ)
Tumor-necrosis-factor-α (TNFα)
Vascular-endothelial-growth-factor/vascular-permeabilityfactor (VEGF/VPF)
Angiopoietin-2 (in the absence of VEGF)
Angiostatin
Antithrombin III fragment
Arresten
Canstatin
Chondromodulin I
Connective-tissue-growth-factor (CTGF)
Decorin
Endorepellin
Endostatin
Fibronectin 20-kDa fragment
Interferons-α, β, and γ
Interleukin-4 (IL-4)
Interleukin-10 (IL-10)
Interleukin-12 (IL-12)
Interferon-inducible-protein-10 (IP-10)
Kringle 5
Metastatin
METH-1
METH-2
2-Methoxyestradiol
Osteopontin cleavage product
PEX
Pigment-epithelium-derived-factor (PEDF)
Plasminogen-activator-inhibitor (PAI)
Platelet factor-4
Prolactin 16-KDa fragment
Proliferin-related-protein
Prothrombin kringle 2
Maspin
Restin
Soluble-fms-like-tyrosinekinase-1 (S-Flt-1)
6
SPARC cleavage product
Tetrahydrocortisol-S
Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs)
Thrombospondin-1 and -2
Transforming-growth-factor-β (TGF-β) (activated form)
Troponin-1
Tumstatin
Vascular-endothelial –growth-inhibitor (VEGI)
Vasostatin
Die genetischen Regulatoren der Angiogenese stehen in engem Zusammenhang
mit Tumorwachstumsförderung und –inhibition. So sind beispielweise die aktivierten
Formen der Onkogene HER-2/neu, c-myc oder p73 assoziiert mit der Produktion
von VEGF in den Zellen und der Tumorgenese. Andere Tumorsupressorgene wie
p53, Rb und vHL kontrollieren die Expression des Angiogeneseinhibitors
Thrombospondin und vermindern die Tumorneuvaskularisierung. Eine Mutation im
Retinoblastomgen (Rb) oder von-Hippel-Lindau-Gen (vHL) führen zur VEGF-
Produktion und damit zu Angiogenese und Tumorwachstum. [39]
Im Wachstum von Tumoren gilt es zu unterscheiden zwischen einer avaskulären
Phase, in der man Tumoren bis zu einer Zellzahl von 10.000.000 findet. Solche
Tumoren finden sich autoptisch z.B. bei 40% aller Frauen im Alter zwischen 40 – 50
Jahren und bei 50% aller Männer im Alter zwischen 50 und 60 Jahren, nahezu jeder
im Alter über 70 besitzt solche sporadischen Tumoren z.B. in der Schilddrüse.
Ernährt werden diese Neubildungen über Diffusion, sie bleiben meist klinisch
stumm. [32, 39] Um ihr Wachstum voranzutreiben, benötigen Tumoren schließlich
eine eigene Blutgefäßversorgung, welche über mehrere Stufen im sogenannten
„angiogentic switch“ gebildet wird.
Durch Genmutation in oben aufgeführten Regulatoren kommt es zur Einsprossung
eigener Tumorgefäße, wie die Abbildung 2 zeigt: Nach Erreichen eines „steady-
state“ von Proliferation und Apoptose im Tumor kommt es zur Gefäßdilatation der
umliegenden Gefäße, Neueinsprossung kleiner Abzweigungen und schließlich zur
Ausbildung einer eigenen vaskulären Versorgung. [40]
Abb.2 Angiogenese im Tumor [40]
7
Die lokale Kapillarisierung schreitet mit einer Geschwindigkeit von bis zu 0,8
mm/Tag fort und ermöglicht so das exponentielle Wachstum der Tumormasse und
die überregionale Ausbreitung in Form von Metastasen durch Streuung der
Tumorzellen in die Blutbahn.
Solche Tumorgefäße unterscheiden sich von normalen Blutgefäßen durch eine
geringere Widerstandsfähigkeit, erhöhte Permeabilität und Kurzschlüssen zwischen
verschiedenen Abschnitten. Zum einen führt dies zu vermehrter Nekrose durch
Hypoxie und Azidose, zum anderen werden widerstandsfähige Tumorzellen
selektiert, die frei im Gewebe liegenden Endothelzellen sind leichter erreichbar für
Angiogenesefaktoren wie z.B. VEGF. [10]
Dieses, an dem komplexen Mechanismus der Gefäßneubildung beteiligte Protein,
ist der vascular endothelial growth factor, welcher in mehreren Tumoren gefunden
werden konnte. Derzeit sind verschiedene Subtypen bekannt, darunter VEGF-A, B,
C, D, E sowie der Plazenta Wachstumsfaktor PIGF, wobei vor allem VEGF-A eine
ausschlaggebende Rolle zugesprochen wird. VEGF ist ein großes Protein mit 45
kDa und bindet an Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität, hauptsächlich an VEGFR1
oder Flt-1 und VEGFR2 oder KDR/Flk-1. Mehrere Studien unterstützen die
Hypothese, dass vor allem VEGFR2 bzw. KDR/flk-1 für die physiologische als auch
pathologische Angiogenese im Menschen verantwortlich sind. [73]
Da das HCC sich üblicherweise als ein hochvaskularisierter Tumor zeigt, konnten
die Überexpression des vascular endothelial growth factor, kurz VEGF, und seiner
Rezeptoren flt-1 (VEGFR 1) und flk-1 (KDR, VEGFR 2), nachgewiesen werden.
Diese Überexpression konnte mit dem Tumorstadium korreliert werden. [3, 86]
Das fortschreitende Verständnis physiologischer Vorgänge während der
Angiogenese in Tumoren eröffnet den Weg zu kurativer, ursächlicher Therapie. Das
Konzept der antiangiogenetischen Therapie wurde erstmals 1971 von Judah
Folkman postuliert. Heutzutage findet man bereits über 300 Angiogenese-
Inhibitoren als potenzielle Chemotherapeutika sowohl in Studien als auch in
klinischem Gebrauch. Untenstehende Liste gibt einen Überblick über derzeit
verwendete antiangiogenetische Medikamente und ihr Zieltumoren. [40]
Tabelle 2 Antiangiogeneteische Medikamente in der Krebstherapie Medikament Hersteller Zieltumor
Bevacizumab Gentech/Roche Darm, Lunge, Brust, Gehirn,
Niere
Cetuximab Bristol-Myers
Squibb/Imclone
Kolon, Gehirn
Endostatin Simcere Lunge
Erlotinib Genentech/Roche/OSI Lunge, Pankreas
8
Everolimus Novartis Niere, Pankreas/NET,
Gehirn
Imiquimod Graceway/3M Aktinische Keratose,
Basalzellkarzinom
Interferon alfa Roche/Schering Melanom, Kaposi-Sarkom
Lenalidomide Celgene Myelodysplastisches
Syndrom, Multiples Myelom
Pazopanib GlaxoSmithKline Niere
Sorafenib Bayer/Onyx Niere, Leber
Sunitinib Pfizer Niere, GIST, Pankreas/NET
Temsilorimus Wyeth Niere, Lymphom
Thalidomide Celgene Multiples Myelom
Vandetanib AstraZeneca Schilddrüse
2.1.3 EGF – epidermal growth factor
Der epidermale Wachstumsfaktor (epidermalgrowth factor – EGF) gehört wie c-
erbB-2, C-erbB-3 und c-ErbB-4 in die Familie erbB-Proteine. Es tritt im Zuge der
Mitose als Signalmolekül auf und bindet an den epidermal growth factor receptor,
EGFR-R (auch bezeichnet als ErbB1 oder HER-1) welcher zu den Rezeptor-
Tyrosinkinasen zählt.
Nach Bindung des Liganden und Dimerisierung des Transmembranrezeptors
EGF-R kommt es zur Autophosphorylierung und Signaltransduktion über den MAP-
Kinase-Signalweg, AKT-Signalweg oder das STAT-Protein.
Verschiedene Studien [29, 22] konnten den Zusammenhang zwischen EGF-
Expression und Wachstum der malignen Zellen im HCC zeigen. Die Arbeitsgruppe
Ito et al konnte eine Überexpression des EGF-R im HCC und eine positive
Korrelation zu Krankheitsstadium, Progression und Metastasierung herstellen. [35]
Interessanterweise vermitteln sowohl EGFR als auch VEGFR ihre
Wachstumsregulation über den MAP-Kinase-Weg. [79]
Vorausgehende Studien, die alleinige EGFR bzw. VEGFR-Antagonisten
verwendeten (z.B. Cetuximab [34], Geftinib [33], Bevacizumab [91]) konnten einen
vielversprechenden anti-tumoralen Effekt zeigen.
2.1.4 AEE 788
AEE788 ist ein neuartiger Tyrosinkinaseinhibitor, der sowohl am EGF- als auch am
VEGF –Rezeptor angreift und somit das Tumorwachstum stoppen soll. Des
weiteren inhibiert es den human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), welcher
im HCC jedoch eine untergeordnete Rolle spielt. In vorangehenden Studien konnte
9
der antitumorale Effekt bei oraler Verabreichung im Mausmodell bei anderen
Tumorarten nachgewiesen werden [78], 2008 schließlich auch im HCC humaner
Zelllinien im Nackt-Maus-Modell [56].
2.2 Das Hepatozelluläre Karzinom
2.2.1 Definition
Das hepatozelluläre Karzinom, kurz HCC, ist weltweit die fünfthäufigste
Krebserkrankung mit jährlich steigender Inzidenz. [44]
Es handelt sich hierbei um eine maligne epitheliale Neoplasie der
Leberparenchymzellen.
2.2.2 Epidemiologie
Annähernd 500.000 – 1.000.000 neue Fälle pro Jahr weltweit werden angenommen,
wobei starke regionale Unterschiede in den Inzidenzraten des HCC zu sehen sind.
[5 asmaa] So findet man in den sogenannten Hochinzidenzzonen wie etwa China,
Südostasien oder Afrika 30-120/100.000 Einwohner/Jahr, in Mittelinzidenzzonen wie
etwa Südeuropa 8-25/100.000 und Niedriginzidenzzonen wie den USA und Nord-
sowie Mitteleuropa etwa 1-4 Fälle pro 100.000 Einwohner/Jahr. [67]
Abb.3 Klassifikation in geographische Zonen unterschiedlich hoher Inzidenzraten [61]
Das HCC stellt 65% aller Fälle von Leberkrebs in den USA dar, wobei farbige
Einwohner doppelt so häufig betroffen sind wie Weiße. Asiaten sind doppelt so
häufig betroffen wie afrikanisch stämmige Amerikaner, lateinamerikanische Bürger
wiederum doppelt so häufig wie Kaukasier. [16]
Insgesamt lässt sich in den Industrieländern eine Zunahme der
Leberkrebserkrankungen feststellen, so hat sich die Inzidenzrate zwischen den
Jahren 1976 und 2000 in den Vereinigten Staaten von Amerika verdoppelt. [51]
10
1976 – 1980 lag die Rate der Neuerkrankungen noch bei 1,4 Fällen pro 100.000
Einwohner, 1991 bereits bei 2,4/100.000 Einwohner pro Jahr, zumindest die Hälfte
des Anstiegs wurde durch eine Zunahme der HCV-Infektionen einige Jahrzehnte
zuvor erklärt. [61, 16]
Es bleibt festzuhalten, dass trotz gegenwärtig niedriger Inzidenzraten in der
westlichen Welt die Erkrankungen an primären Leberkrebs steigen und dieser
Anstieg nicht gänzlich erklärt werden kann. Dabei ist das HCC insbesondere in den
westlichen Ländern die Tumorentität mit der größten Steigerung der Inzidenz.
Männer sind ungefähr dreimal so häufig betroffen wie Frauen [16]: Weltweite Registrierung neuer HCC-Fälle pro Jahr [61] Jahr Gesamtzahl Männer Frauen 1990 437408 316300 121100 2000 564300 398364 165972 World health report 2003 714600 504600 210000
Die folgende Abbildung zeigt die altersstandardisierten Inzidenzraten des HCC bei
Männern pro 100000 Einwohner. [5]
Abb.4 Graphische Veranschaulichung der Verteilung der unterschiedlichen Inzidenzzonen
Hinter Lungen-, Magen- und Darmkrebs rangiert der primäre Leberkrebs an Stelle
vier der häufigsten Krebstodesursachen weltweit, auf Platz drei bei Männern und
Platz fünf bei Frauen. [52] Dabei liegt die durchschnittliche Lebenserwartung nach
Diagnosestellung bei ca. acht Monaten. [16]
Die Inzidenz steigt mit zunehmendem Lebensalter und erreicht seinen Höhepunkt
über 65. Allerdings wurde innerhalb der letzten beiden Jahrzehnte ein Trend hin zu
Erkrankung in jüngerem Lebensalter festgestellt. [16]
11
2.2.3 Ätiologie
In etwa 80% der Fälle gründet sich das Leberzellkarzinom auf eine Zirrhose. [25]
Darunter versteht man den Verlust funktionstüchtigen Leberparenchyms, der
histologisch sichtbar wird als Nekrosen, entzündliche Infiltrate, Fibrosierung durch
vermehrte Bildung von Kollagen und extrazellulärer Matrix sowie der Entstehung
sogenannter Regeneratknoten, ein Versuch des bedeutenden Stoffwechselorgans,
seine Funktion wiederherzustellen. Jedoch ist das Stadium der Leberzirrhose im
Gegensatz zur Verfettung oder reinen Fibrose der Leber, irreversibel. [75]
Als Ursache der Leberzirrhose findet man in gängigen Lehrbüchern und Statistiken
den Alkoholabusus mit ca. 50% in den Industrienationen an erster Stelle, gefolgt von
den Virushepatitiden B, C und D mit ca. 45%. Doch wahrscheinlich aufgrund der
besseren Therapiemöglichkeiten der chronischen Hepatitiden und der damit
verbunden längeren Überlebenszeit, in der allerdings auch das
Krebsentstehungsrisiko steigt, findet man vermehrt HBV und HCV Infektionen als
Ursache des HCC in Patienten aus entwickelten Ländern. So zeigt z.B. auch eine
deutsche Studie anhand ihres Patientengutes eine Assoziation mit einer
Virusinfektion in 51,9% der Fälle. [38] Weltweit ist die Hepatitis B Infektion mit 50-
80% aller HCC-Fälle der primäre und wichtigste Risikofaktor. Die Hepatitis C liegt in
10 – 25% einem primären Lebertumor zugrunde, wobei die chronische HCV-
Infektion vor allem in den Industrienationen von Bedeutung ist. [5, 7]
Beide Virushepatitiden können auch ohne Leberzirrhose zu einem HCC führen,
HBV häufiger als HCV. So konnten bestimmte Virusproteine identifiziert werden, wie
z.B. das HBx-Gen, welche ursächlich an der Pathogenese des HCC beteiligt sein
sollen. [41]
Andere wichtige Risikofaktoren für die Entstehung einer Leberzirrhose sind die
Autoimmunhepatitis, die primär biliäre Zirrhose und die primär sklerosierende
Cholangitis, Stoffwechselerkrankungen wie die Hämochromatose, bei der die HCC-
Entwicklung bei ca. 4%/Jahr liegt, der Morbus Wilson, der α1 – Antitrypsinmangel,
die Tyrosinämie Typ 1, die Mukoviszidose, chronische Exposition gegenüber Arsen
oder Nitrosaminen, die kardiale Zirrhose durch chronische Stauung, das Budd-
Chiari-Syndrom und seltener Tropenerkrankungen wie die Bilharziose. Zu erwähnen
ist außerdem der Langzeitmissbrauch androgener Steroide und die Einnahme
östrogenhaltiger Kontrazeptiva. Das größte Risiko der Entwicklung eines HCC aus
einer Zirrhose haben Patienten mit einer Hepatitis B – Infektion, gefolgt von der
Hepatitis C. [18, 26]
12
Das Insulin-Resistenz-Syndrom, welches sich in Fettleibigkeit und Diabetes mellitus
Typ 2 manifestiert, kann über eine Nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) in 5%
der Fälle/Jahr in eine Leberzirrhose münden. [27]
Diabetes Mellitus [13] und Fettleibigkeit [70] konnten in mehreren Studien als
eigenständige Risikofaktoren für die Entwicklung eines primären Leberzellkarzinoms
herausgearbeitet werden. Zu beachten sind hierbei die ständig zunehmenden
Fallzahlen des sogenannten metabolischen Syndroms in der westlichen Welt, auch
bereits bei jungen Patienten, so dass in den kommenden Jahrzehnten eine
zunehmende Anzahl an HCC-Erkrankungen zu erwarten ist.
Die ungleiche geographische Verteilung der internationalen Inzidenzraten des HCC
sind zurückzuführen auf die ungleiche Verteilung der wichtigsten Risikofaktoren, der
Hepatitis B und C Infektion:
Die Seroprävalenz des Hepatitis B – Virus, festgestellt durch Messung des HBsAg
(Hepatitis B – surface- Antigen) liegt in Nordamerika, Nord- und Westeuropa bei
unter 2%, in Asien und unterhalb der Sahara liegendem Afrika bei über 8%.[80]
Bestimmte der bis jetzt bekannten Subtypen des HB-Virus können mit einer
erhöhten Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung eines HCC zugeordnet werden, so
etwa dem Genotyp C. Auch eine simultane HIV-Infektion erhöht das Risiko der
HCC-Entstehung bei HBV positiven Individuen. [5]
Die folgende Grafik veranschaulicht die Unterschiede im Auftreten einer
chronischen HBV- oder HCV-Infektion bei diagnostiziertem HCC: in als entwickelt
geltenden Ländern, hier Japan und die USA, spielt vor allem das HCV neben dem
HCC auf dem Boden einer alkoholischen Leberzirrhose eine Rolle (Daten
entstammen dem Zeitraum von ca. 1970 – 2001): [80]
Abb.5 Simultane HBV bzw. HCV Infektion bei Patienten mit HCC, länderspezifisches Vorkommen [80]
13
In Asien und Afrika kommt ein weiterer, jedoch untergeordneter Risikofaktor hinzu,
das Gift des Pilzes Aspergillus flavus, Aflatoxin B1. [52] Der Schimmelpilz wächst
bevorzugt auf Getreiden und Nüssen im feuchten Klima und sondert sein Mykotoxin
ab, welches so in die Nahrungskette gerät und als stark karzinogen gilt. [30] Das
Toxin soll zu einer spezifischen Mutation im p53-Tumorsupressorgen führen und so
zur Entstehung des HCC beitragen. [5]
Die funktionellen Folgen der Zirrhose sind zunächst die Cholestase, die Entstehung
der portalen Hypertension und derer Konsequenzen, und eine metabolische
Insuffizienz der Leber, welche sich nicht nur in mangelnder „Entgiftungsfunktion“
sondern auch an mangelnder Syntheseleistung des Organs zeigt. Die schwerste
Spätfolge der Leberzirrhose, die Entwicklung eines HCC, trifft etwa 4% der
Patienten pro Jahr.
2.2.4 Prävention und Screening
Zur Prävention der Entstehung des hepatozellulären Karzinoms sollte natürlich die
Vermeidung der bereits aufgeführten Risikofaktoren zählen.
So ließe sich die Infektion mit Hepatitis B vermeiden durch konsequent
durchgeführte Impfung, wie ein Impfprogramm, 1984 in Taiwan eingeführt,
vorbildlich unter Beweis stellt: die Rate HBV-infizierter Kinder sank von 8% auf
0,8%. Auch in Deutschland ist die Impfung aller Kinder sowie als Indikationsimpfung
im Erwachsenenalter, z.B. für medizinisches Personal, durch die STIKO (ständige
Impfkommission des Robert-Koch-Instituts) empfohlen. [68]
Schutz vor dem häufigsten Übertragungsmodus der Hepatitis B kann durch
Verwendung von Kondomen gewährleistet werden, das Bereitstellen von „sauberen“
Injektionsinstrumenten an i.v.-Drogenabhängige und das Screening von
Blutprodukten das Risiko der Hepatitis C-Infektion minimieren. Eine streng
durchgeführte Therapie der Infektionskrankheiten mit Interferon alpha in
Kombination mit anderen antiviralen Mitteln kann das Fortschreiten einer Zirrhose
verhindern.
Alkoholabstinenz bzw. gemäßigter Alkoholgenuss verhinderte eine C2-bedingte
Zirrhose und ihre Folgen, genau wie die Überprüfung von Lebensmittel auf den
Schimmelpilz Aspergillus die Verbreitung seines Toxins verhindert kann.
Verschiedene Studien arbeiten darauf hin, einen Zusammenhang zwischen
diätischen Maßnahmen und der Entstehung des HCC herstellen zu können.
Bezüglich des Konsums von Eiern, Fleisch und anderen tierischen Produkten
konnte allerdings kein Konsens und keine allgemeine Empfehlung gefunden
werden. Dahingegen scheinen Soja-Produkte protektiv zu wirken, sowohl durch die
darin enthaltenen Isoflavone als auch durch einen antagonistischen humoralen
14
Effekt. Der Genuss von Kaffee zeigte in Untersuchungen eine Risikoreduktion von
41% im Gegensatz zu Nicht-Kaffee-Trinkern. [5]
Derzeit wird für Patienten mit Leberzirrhose und erhöhtem Risiko für die Entwicklung
eines HCC die Aufnahme in ein Surveillance-Programm empfohlen. Zu diesem
Kollektiv gehören Patienten mit chronischer Hepatitis B oder C, chronischem
Alkoholabusus, vererbter Hämochromatose und primär biliärer Zirrhose.
Im Rahmen dieser Überwachung sollen sich die Betroffenen alle sechs Monate
einer Lebersonographie, welche mit einer Sensitivität von 65 – 80% und einer
Spezifität von über 90% eine gute Option als Screeningtest darstellt, unterziehen.
Alpha-Fetoprotein (AFP) als alleiniger Test zeigt zu viele falsche Ergebnisse und
wird daher nicht empfohlen. [9]
2.2.5 Diagnostik
Für die Beurteilung des Gesamtbildes ist die anamnestische Abklärung zum Beispiel
der familiären Prädisposition, diätischen, reise- oder suchtbedingten Risikofaktoren
unerlässlich.
Klinische Symptome zeigen sich leider oft erst im Spätstadium, dazu zählen alle
bekannten Zeichen einer Leberinsuffizienz bzw. Zirrhose, wie etwa
Oberbauchdruckschmerz durch Spannung der Leberkapsel, Aszites bei portaler
Hypertension, hepatische Enzephalopathie, Ösophagusvarizenblutungen,
sogenannte Leberhautzeichen wie Spider nävi, Caput medusae, Weißnägel oder
Palmar-/Plantarerythem. [25]
Die Diagnostik des Leberzellkarzinoms schließt sowohl bildgebende Verfahren wie
Ultraschall, Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und
Angiografie als auch laborchemische Untersuchungen ein.
In der CT nutzt man vor allem kontrastmittelverstärkte Verfahren, wobei das HCC im
Gegensatz zu normalem Leberparenchym bevorzugt in der arteriellen und nicht in
der portalvenösen Phase Kontrastmittel anreichert. Grund hierfür ist die stark
ausgeprägte Vaskularisierung des Tumors.
Die MRT gilt der CT in der Bildgebung des HCC als überlegen. In der T1-
gewichteten Aufnahme stellt sich das Leberzellkarzinom hypointens, in der T2-
Wichtung hyperintens im Vergleich zu normal Leberparenchym dar. Allerdings
zeigen mehrere Arbeiten, dass sich das HCC äußerst variabel darstellt. Eine
diffusions-gewichtete Aufnahme kann eventuell helfen, eine Entscheidung über die
Art der Raumforderung zu urteilen.
Denn besonders die Abgrenzung eines HCC-Knotens in einer zirrhotischen Leber
kann sich schwierig darstellen. [8]
15
Mit dem Alpha-Feto-Protein (AFP), einem embryonalen Tumorantigen, welches
normalerweise von der fetalen Leber gebildet wird, gibt es einen laborchemischen
Parameter zur Erfassung eines HCC, da auch dieses zur Bildung dieses Proteins
fähig ist. AFP werden je nach Bindungskapazität an „ lectin lensculinaris agglutin“
drei Unterformen unterschieden AFP-L1, -L2 und –L3. Dabei gilt die dominierende
Glykoform AFP-L3 als assoziiert mit einer schlechteren Prognose. Allerdings wird
seine Wertigkeit kontrovers diskutiert und nur noch in Zusammenhang mit der
Bildgebung als aussagekräftig betrachtet. Normale Werte liegen bei ca. 15 µg/l.
Physiologisch erhöhte Werte finden sich bei Schwangeren, auch bei viralen
Hepatitiden kann AFP im Serum erhöht sein. Ansteigende Werte über 20 µg/l gelten
als auf ein HCC verdächtig.
Die internationalen Grenzwerte für eine AFP – Erhöhung sind nicht einheitlich und
mehrere Studien in denen die AFP-Bestimmung als Screeningmethode für das HCC
verwendet wurde, zeigten eine Sensitivität zwischen 39 und 64%, eine Spezifität
zwischen 76 und 91% und einen positiv prädiktiven Wert von 9 bis 32%. Manche
Autoren fordern sogar eine Abschaffung der AFP-Bestimmung in der Diagnostik des
HCC. [28, 71, 72]
Aus diesen Gründen versuchen derzeit verschiedene Arbeitsgruppen, einen neuen
Tumormarker zu finden, welcher eine größere Sensitivität zur Früherkennung des
HCC besitzt. [89]
In Deutschland steht derzeit noch keine Leitlinie zum Management des HCC zur
Verfügung. Seit 2009 ist bei der AWMF (Arbeitsgemeinschaft der wissenschaftlichen
Fachgesellschaften e.V.) ein Leitlinienvorhaben zur Erstellung einer S3-Leitlinie
angemeldet.
Die Feinnadelbiopsie gilt als Methode der Wahl zur histologischen Sicherung der
Diagnose. Es gibt zwei Möglichkeiten der Biospie, einmal perkutan, blind oder CT-
bzw. Ultraschall-gesteuert, zum anderen die endoskopisch durchgeführte Biopsie.
Dabei ist die Güte des bioptisch gesicherten Materials immer von vielen Faktoren
abhängig, wie etwa der Größe und Lage der Läsion, der Erfahrung des Operateurs
und natürlich der histopathologischen Auswertung. Die Sensitivität bei gesteuerter
perkutaner Biospie liegt bei ungefähr 90%, die Spezifität bei ca. 100%. Die
endoskopische Biopsie zeigt ähnliche Werte. [82]
Die Amercian Association for the Study of Liver Disease empfiehlt in ihren Leitlinien
die Vergabe der Diagnose „hepatozelluläres Karzinom“ bei Knoten mit einer Größe
über 2 cm, falls diese in der Bildgebung die typische arterielle
Kontrastmittelaufnahme zeigen, bei Knoten zwischen 1 und 2 cm wird die Biopsie
empfohlen, falls nicht zwei verschieden bildgebende Verfahren typische HCC
16
Merkmale aufweisen können. Bei Knoten kleiner einen Zentimeter empfiehlt die
European Association for the Study of Liver eine abwartende Haltung mit 3-
monatigen Kontrollen. Das Risiko einer Stichkanalmetastase ist vor allem bei
Knoten über 2cm erhöht und beträgt nach verschiedenen Studien zwischen 0,0003
– 5%.
Alpha-Feto-Protein muss wegen seiner geringen Sensitivität einen Wert von
400 µg/l überschreiten, um die Diagnose des HCC stützen zu können. [82]
2.2.6 Therapie
Um eine Entscheidung bezüglich der für den Patienten bestmöglichen Therapie
treffen zu können, wurden verschieden Klassifikationssysteme entwickelt.
Die TNM-Klassifikation der Union for International Cancer Control (UICC) bezieht
sich auf das Wachstum des HCC und dessen Ausbreitung und lautet wie folgt: [28]
Tabelle 3 TNM-Klassifikation des HCC
T1 Solitär, ohne Gefäßinvasion
T2 Solitär, mit Gefäßinvasion
T3a Multipel >5cm
T3b Invasion größerer Äste der V.portae oder Vv. hepaticae
T4 Invasion von Nachbarorganen, ausgenommen Gallenblase, Perforation des
viszeralen Peritoneums
N N0=ohne regionäre Lymphknoten-, N1=mit regionären Lymphknotenmetastasen
M M0=keine Fernmetastasen, M1=mit Fernmetastasen
Generell unterscheidet man drei Wachstumsmuster des HCC, solitär, multizentrisch
und diffus inflitrierendes Wachstum. [28]
Ein weiteres, 1985 von Okuda et al eingeführtes System, berücksichtigt außer der
Ausbreitung des Tumors in der Leber auch Serumwerte von Albumin, Bilirubin sowie
das Vorhandensein von Aszites. [57]
Die aktuellste und derzeit weltweit gebräuchliche Klassifikation ist die Barcelona
Clinic Liver Cancer (BCLC) Klassifikation, 1999 entwickelt von Llovet, Brù und Briux.
[45]
Diese Klassifikation berücksichtigt neben der Tumorgröße und – ausbreitung auch
den „performance status“ also den allgemeinen Zustand des Patienten, die
Leberfunktion und dazugehörige Serumparameter und gibt neben der
Phaseneinteilung auch die dazugehörige beste Therapieoption wider.
Insgesamt existieren vier Stadien, durchgängig bezeichnet von A bis D.
17
Tabelle 4 Barcelona Clinic Liver Cancer Klassifikation[45]
Stadium PST
(performance status)
Tumoreigenschaft Okuda-Stadium
Leberfunktionsstaus
A= frühes HCC
A1
0
Einzeln
I
Keine portale Hypertension, normales Bilirubin
A2 0 Einzeln I Portale Hypertension, normales Bilirubin
A3 0 Einzeln I Portale Hypertension, anormales Bilirubin
A4 0 3 Tumoren < 3cm I - II Child-Pugh A - B
B = intermediate HCC
0 Groß, multinodular I - II Child – Pugh A - B
C = advanced HCC
0 1 – 2 Gefäßinvasion oder extrahepatische Ausbreitung
I - II Child – Pugh A - B
D = end-stage HCC
3 - 4 mehrere III Child – Pugh C
Stadium A und B: alle Kriterien sollen erfüllt sein Stadium C: zumindest 1 Kriterium: PST 1-2 oder vaskuläre Infiltration/extrahepatische
Ausbreitung Stadium D: zumindest 1 Kriterium: PST 3-4 oder Okuda III/Child-Pugh C
Der hier erwähnt Child-Pugh-Score bezieht sich auf das Stadium der Leberzirrhose,
auf deren Boden das HCC meist entsteht. Zum allgemeinen Verständnis soll er hier
kurz erwähnt werden: [26]
Tabelle 5 Child-Pugh-Score
1 Punkt 2 Punkte 3 Punkte
Albumin i.S. (g/dl) > 3,5 2,8 – 3,5 < 2,8
Bilirubin i.S. (mg/dl) < 2,0 2,0 – 3,0 > 3,0
Quick (%) > 70 40 - 70 < 40
Aszites (Sono) 0 leicht mittelgradig
Grad der
Enzephalopathie*
0 I - II IIi - IV
* Nach der Einteilung von Trey, Burns und Saunders (1966)
Die Addition der Punkte ergibt das jeweilige Stadium, Child A entspricht 5 – 6, Child
B 7 – 9, Child C 10 – 15 Punkten. Die Stadien korrelieren mit der Prognose, die 5-
Jahres-Überlebens-Rate von Patienten im Stadium A beträgt 44%, während diese
bei Patienten im Stadium C bei 21% liegt.
Grundsätzlich gilt es, zwischen konservativen und invasiven sowie kurativen und
palliativen Therapieansätzen zu unterscheiden.
Im Falle des HCC gilt als bisher einziger kurativer Ansatz die Leberteilresektion bzw.
Transplantation. Geeignet für diese Art der Therapie sind allerdings nur Patienten im
18
BCLC-Stadium 0 und A. Patienten in Stadium B sollten einer transarteriellen
Chemoembolisation zugeführt werden, Patienten in Stadium C profitieren von einer
Therapie mit dem Multikinaseinhibitor Sorafenib. [66]
In der Praxis gebräuchliche Therapiealternativen sind derzeit die perkutane
Ethanolinjektion (PEI) und die Radiofrequenzablation (RF), alle Möglichkeiten
werden später näher erläutert.
Folgender Algorithmus wurde zur Orientierung bei Therapiefindung entwickelt:
Abb.6 Therapiealgorithmus nach der BCLC-Klassifikation [14]
2.2.6.1 Invasive Methoden
Die operative Teilresektion ist Therapie der Wahl bei Leberzellkarzinomen ohne
Leberzirrhose und ausreichender Leberfunktion, wonach etwa 20 – 30% der
Patienten auf diese Weise zu behandeln sind. Bestes Ergebnis zeigen nach
operativer Entfernung Patienten mit monodulärem Tumorknoten kleiner als 5cm mit
einer 5-Jahresüberlebensrate von 57% und einer Rezidivrate von 26%. [16]
Thomas E. Starzl vollzog 1963 die erste Lebertransplantation. Seither gilt die
orthotope Lebertransplantation als theoretisch optimale kurative Methode für
Patienten mit resektablen HCC. 1996 etablierte die Arbeitsgruppe um Vicenzo
Mazzaferro die sogenannten Milan-Kriterien, nach welchen Patienten mit HCC ohne
Leberzirrhose für die orthotope Lebertransplantation (OLT) eingeteilt werden. Nach
4 Jahren Beobachtungszeit ihrer transplantierten Patienten gelangte die Gruppe zu
einer Überlebensrate von 75% und einem rezidivfreiem Überleben von 83% sowie
zu folgender Empfehlung: Transplantation in Patienten mit singulärem Herd ≤ 5 cm
oder maximal drei Herden ≤ 3 cm. [50] Die 5 Jahres-Überlebensrate nach erfolgter
19
Transplantation bei Patienten mit zirrhotischer Leber liegt bei ca. 69%. Viele Zentren
konnten in ihren Studien eine Wiederholbarkeit dieser hervorragenden Ergebnisse
in Patienten mit solitären Knoten von einem Durchmesser von maximal 6,5 cm und
mehreren Knoten von max. 4,5 cm Größe beweisen. Einer Ausdehnung der
Selektionskriterien für eine Transplantation liegt derzeit vor allem der Mangel an
geeigneten Spenderorganen zugrunde. Mazzaferro et al schlagen z.B. eine
Modifikation der Milan-Kriterien im Sinne der „up-to-seven“-Regel vor: Der
Durchmesser des größten Tumors in Zentimetern plus die verbleibende Anzahl an
Tumoren darf dabei maximal sieben ergeben, um noch als Indikation zur
Transplantation gewertet zu werden. [66]
Bewährte lokal interventionelle Verfahren sind die perkutane Ethanolinjektion (PEI)
sowie die Radiofrequenzablation (RFA). So erzielt die PEI in solitären Tumoren
≤ 3cm eine Nekrose von 70-80%, in Tumoren ≤ 2cm sogar eine Nekrose von 100%.
[16] Schlussfolgernd wurde festlegt dass die PEI am besten geeignet ist für Herde <
3cm und einer Anzahl < 3, entsprechend BCLC-Stadium A. [50]
Bei der RFA wird die Ablationselektrode ultraschallgesteuert in den Tumor
eingebracht und durch hochfrequenten Wechselstrom und die dadurch entstehende
Hitze eine Verkochung des Gewebes hervorgerufen. Die RFA ist der PEI in
größeren Herden überlegen, außerdem sind weniger Sitzungen zur Zerstörung des
Herdes notwendig. [16]
Weiterhin zählt zu den Möglichkeiten in der Therapie des HCC die Transarterielle
Chemoembolisation (TACE). Da die Lebertumoren hauptsächlich aus der Arteria
hepatica gespeist werden, während normales Leberparenchym eine duale
Blutversorgung, zu 85% über die Portalvene besitzt, führt ein Verschluss
derselbigen, also auch eine transarterielle pharmakologisch unterstützte
Embolisation, zur Nekrose des Tumors.
Sie kann neoadjuvant, also vor geplanter operativer Resektion, zur Verkleinerung
des Tumors, zur Überbrückung der Wartezeit auf eine Transplantation oder in
palliativer Absicht durchgeführt werden.
Yamada et al. konnten durch dieses Verfahren 1990 in Patienten mit nicht
operablem HCC eine 5-Jahres-Überlebens-Rate von 6% herbeiführen. [85]
Neuere Arbeiten von Arbeitsgruppen wie zum Beispiel Llovet et al, Poon et al oder
Ferrari et al zeigten einen Rückgang der Tumorgröße um 16 bis 61%, sowie eine
Vergrößerung der 1 – Jahres – Überlebensrate um 82%. [66]
Derzeit wird aus der Verwendung der Zytostatika Doxorubicin, Mitomycin oder
Cisplatin (TACE) ein Nutzen für die Versorgung palliativer Fälle gezogen. In einer
20
großangelegten Studie mit 8510 Patienten konnte eine signifikante Verlängerung
der Überlebenszeit nach dieser Behandlung gezeigt werden. [46]
2.2.6.2 Medikamentöse Therapieoptionen
Galt das HCC im fortgeschrittenen Stadium, d.h. Leberzellkarzinom mit Metastasen
oder extrahepatischen Begleiterkrankungen, lange Zeit als nicht effektiv
behandelbar, entstand aufgrund des Erfolgs zielorientierter medikamentöser
Therapie in anderen soliden Tumoren, wie etwa der Behandlung HER2/Neu-
positiven Mamma-Karzinomen mit dem Antikörper Trastuzumab [6] erneut Interesse
an der Erforschung einer medikamentösen Behandlung des HCC.
Derzeit untersuchte Medikamente sind vor allem Inhibitoren der Angiogenese, denn
die Blutversorgung und damit die Neubildung von Gefäßen stellen in dem stark
vaskularisierten Tumor den größten Faktor für sein Wachstum dar und ist somit
geeignetes Ziel der medikamentösen systemischen Therapie. Mehrere Studien
konnten zeigen, dass eine hohe Dichte an Gefäßneubildungen in resezierten
Tumoren mit einer verkürzten Rezidiv-freien-Überlebenszeit einhergeht und ein
hoher Serum-Spiegel an zirkulierendem VEGF für eine schlechtere Prognose
spricht. [81, 65]
Zu den derzeit untersuchten Medikamenten gehören unter anderem Sorafenib,
Sunitinib und Bevacizumab. [64]
Bevacizumab (Avastin®) ist ein monoklonaler humaner Antikörper gegen VEGF,
welcher dessen Bindung an seine Rezeptoren verhindert. Zunächst wurde
Bevacizumab in der Therapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms
eingesetzt, in der Behandlung des fortgeschrittenem HCC zeigen Phase II Studien
der Monotherapie mit dem Antikörper ein Ansprechen in 16% der Patienten, das
mediane progressionsfreie Überleben lag bei 6,9 Monaten, die 1-Jahres-
Überlebensquote bei 53%. [74]
So zeigten Zhu et al. in einer Phase II Studie an 33 Patienten im fortgeschrittenem
Stadium, dass die kombinierte zyklische Gabe von Bevacizumab, Gemcitabin sowie
Oxaliplatin, beides Zytostatika, zu einem medianem 6-monatigem
progressionsfreiem Überleben in 48% der Patienten führt. [91]
Das Medikament Nexavar (Sorafenib) inhibiert die Tyrosinkinasen von VEGFR1,
VEGFR2, VEGFR3, FLT3, PDGFRβ, RET und c-KIT. Positive Effekte dieses oralen
Multikinase-Inhibitors wurden in verschieden klinischen Studien gezeigt.
Llovet et al [48] erzielten im „Sorafenib HCC assessment randomized protocol“
(SHARP) in Patienten mit HCC und Child-Pugh-Score A, PST ≤ 2 mit einer zweimal
täglichen Gabe von 400 mg Sorafenib eine signifikante Verlängerung des
21
progressionsfreien Überlebens (5,5 versus 2,8 Monate) und der Überlebenszeit
(10,7 versus 7,9 Monate).
Cheng et al [12]. zeigten ähnliche Ergebnisse (progressionsfreies Überleben 2,8
versus 1,4 Monate sowie Verlängerung der Überlebenszeit 6,5 versus 4,2 Monate).
Allerdings brachen 50% der Patienten aufgrund der toxischen Nebenwirkungen die
Behandlung ab. Dazu zählen dermatologische Effekte wie das Hand-Fuß-Syndrom
und gastrointestinale Beschwerden wie Durchfall und Übelkeit. Durch den Nachweis
der Wirksamkeit von Sorafenib in diesen und weiteren Studien konnte eine neue
Therapieoption des fortgeschrittenen HCC etabliert werden. Allerdings fehlen bisher
Daten zu einer Kombinationstherapie, die einzige Phase II Studie kombiniert
Sorafenib mit Doxorubicin [21].
Sutinib ist ein weiterer Tyrosinkinaseinhibitor, er greift an VEGFR 1-3, PDGFR-α
und PDGFR-β, FLT3, der RET-Kinase und dem „stem cell factor receptor“ (KIT) an.
Präklinische Studien zeigten eine Inhibition der Tyrosinkinasen des VEGF-
Rezeptors und des PDGF-Rezeptors. Zwei Phase-II Studien, in denen die Patienten
jeweils mit 37,5 mg bzw. 50 mg täglich behandelt wurden, zeigten ein medianes
Überleben von 11,2 bzw. 11,6 Monaten, ein progressionsfreies Überleben von 5,2
bzw. 4,1 Monaten. [19, 92]
Cediranib und Vatalanib sind unter anderem ebenfalls gegen die VEGF-Rezeptoren
gerichtet und erzielten in bisherigen Phase I und II Studien wachstumsinhibierende
Effekte. [64]
Gefitinib und Erlotinib sind beide orale EGF-Tyrosinkinaseinhibitoren. Autoren einer
Studie zur Wirkung von Geftinib konnten keinen Vorteil aus der Behandlung mit dem
Tyrosinkinaseinhibitor folgern. [55] Für Erlotinib konnte in Phase II Studien Erfolg in
der Therapie des fortgeschrittenen HCC gezeigt werden. So wurde nach täglicher
Gabe von 150 mg Erlotinib zwar nur geringe Ansprechraten von 6% beobachtet,
allerdings konnten in 50% bzw. 43% der Fälle stabile Verläufe gefunden werden, in
32% bzw. 28% ein progressionsfreies Überleben nach 26 bzw. 24 Wochen. [63, 76]
Eine Studie welche die Kombination von Erlotinib und Bevacizumab beinhaltet, und
somit eine duale Inhibition der VEGF- und EGF-Rezeptoren versucht, erzielte ein
Ansprechen von 25%, das mediane progressionsfreie Überleben lag bei 39
Wochen, die mediane Überlebenszeit bei 68 Wochen. So konnte ein signifikanter
antitumoraler Effekt der Kombination nachgewiesen werden. [76]
Mehrere neue Medikamente, welche ebenfalls Tyrosinkinaseinhibitoren sind,
wurden in den letzten Jahren in der Therapie des HCC getestet.
AZD2171, ein VEGFR, PDGFR und c-kit Inhibitor hat sich in der Behandlung des
Glioblastoms verdient gemacht, allerdings erlitten 84% der Patienten mit
22
fortgeschrittenem HCC, welche in einer Phase II Studie mit AZD2171 behandelt
wurden, Grad 3 Nebenwirkungen [2] Nachdem PTK787, ein weiterer
Multikinaseinhibitor (VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFR-β, Flt-3 und kit) zu
Tumorapoptoseinduktion und einer verminderten Gefäßausbildung im Mausmodell
führte [42], welche durch die Applikation via TACE noch erhöht werden konnte [87],
wurde 2005 eine Phase I Studie an 18 Patienten mit einer oralen Gabe von täglich
750 mg durchgeführt, bei der bei 9 Patienten eine Stabilisation erreicht werden
konnte [37]
Phase I und Phase II Studien des Multikinaseinhibitors TSU-68, welcher die
Aktivierung von VEGFR-2, PDGFR und FGFR hemmt, wurden an Patienten mit
fortgeschrittenem HCC durchgeführt. In Phase II nahmen 35 Patienten täglich 200
mg TSU-68 ein, ein Patient zeigte ein komplettes, zwei ein teilweises Ansprechen
und 15 Patienten ein stabiles Krankheitsbild, die mediane progressionsfreie Zeit lag
bei 2,1 Monaten, die mediane Überlebenszeit bei 13,1 Monaten. Nebenwirkungen
waren Hypalbuminämie, Diarrhö, Anorexie, abdominaler Schmerz, Übelkeit, Ödeme
und eine Transaminasenerhöhung [36].
In einer Phase II Studie wurden 800 mg Brivanib, ein weiterer VEGF und FGR-
Inhibitor, täglich gegeben. Von den 55 Patienten erreichte ein Patient unter Therapie
eine Vollremission, ein sechs-monatiges progressionsfreies Intervall konnte bei
18,2% der Patienten erreicht werden, die mediane Überlebenszeit lag bei 10
Monaten [60].
Weiterer Angriffspunkt zur systemischen Therapie des HCC ist die extracellular
signal-regulated/mitogen-activated protein kinase kinase (MEK). Selumetinib, ein
Inhibitor der MEK-Tyrosinkinase, wurde in einer Phase II Studie an 19 Patienten mit
fortgeschrittenem HCC zweimal täglich in einer Dosierung von 100 mg ausgegeben.
Die Arbeit zeigt jedoch weder ein Ansprechen auf die Therapie in der Bildgebung,
noch wurde eine verlängerte progressionsfreie Überlebenszeit erreicht. Allerdings
konnte im Western-Blot ein Ansprechen nachgewiesen werden. [59]
Ein weiterer MEK-Inhibitor, PD0325901, konnte bis jetzt positive Ergebnisse in vitro
und im Mausmodell zeigen. [24]
Der PI3K-AKT-Signalweg enthält ein Substrat, welches als mammalian target of
rapamycin bezeichnet wird (mTOR), und das wiederum über andere Proteine an der
Zellzykluskontrolle teilhat. Auch das Antibiotikum Rapamycin und das
Immunsuppressivum Sirolimus führen über eine Inhibition der mTOR-Aktivität zu
einem Wachstumsstopp von Tumoren. Diese und andere mTOR-Inhibitoren finden
sich derzeit in präklinischen Studien zur HCC-Therapie wieder. Eine Phase I/II zu
Everolimus (RAD001), ebenfalls ein mTOR-Inhibitor wurde kürzlich veröffentlicht. In
23
Phase II erhielten 25 Patienten täglich 10 mg, partielle Remission wurde in einem
Patienten erreicht, die mediane progressionsfreie Überlebenszeit lag bei 3,8
Monaten die mittlere Überlebenszeit bei 8,4 Monaten. Nebenwirkungen waren unter
anderem Lymphopenie, Hyponatriämie und Anämie. [90]
Weiterer Angriffspunkt ist der Wnt-Signalweg, der in 40% der hepatozellulären
Karzinome eine Aktivierung zeigt. Präklinische Studien zu Medikamenten, die an
verschieden Proteinen, die Teil des genannten Signalwegs sind, angreifen, zeigen
vielversprechende Erfolge. [83]
Auch die epigenetische Modifikation des Genoms, vor allem Histon-Deacetylase-
Inhibitoren gehören zum Forschungsspektrum in der HCC-Therapie. Ein solcher
Inhibitor, PXD-101, auch als Belinostat bezeichnet, wurde bereits präklinisch
studiert, zeigte dabei eine Apoptoseinduktion und wird derzeit in Phase II Studien
erprobt. [49]
Weiterer Angriffspunkt ist die Inhibition der Telomerase, welche der Verkürzung von
Chromosomen bei Replikation entgegenwirkt und so Tumorzellen hilft, sich quasi
endlos oft teilen zu können. Tierexperimentell konnte in Nacktmäusen dadurch ein
Wachstumsstopp des menschlichen Hepatoms der Zellinien Hep3B und Huh7
gezeigt werden. [15]
2.3 Fragestellung
Kann der duale Tyrosinkinaseinhibitor AEE788 das Wachstum des hepatozellulären
Karzinoms beeinflussen?
Mit zunehmendem Erfolg und Ausweitung der Angiogenesforschung zeigt sich
VEGF (vascular endothelial growth factor) als einer der maßgeblich beteiligten
Einflussgrößen der Entstehung und des Wachstums des hepatozellulären
Karzinoms. Mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ist ein weiterer
wachstumsfördernder Faktor im HCC bekannt. Beide Wachstumsfaktoren binden an
Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität und fördern so die Zunahme der
Tumormasse.
Bisher konnten vor allem mit den Multikinaseinhibitoren Sorafenib und Bevacizumab
erfolgversprechende systemische Therapieansätze des HCC gefunden werden [64].
Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung des dualen Tyrosinkinaseinhibitors
AEE788 auf die Wachstumsfaktoren EGF und VEGF und deren Rezeptoren. Dafür
wurde im Rattenmodell die Auswirkung nach oraler Gabe von AEE788 auf
Wachstum, Proliferation und Apoptose im Morrishepatom überprüft.
24
3. Material und Methoden
3.1 Material
Chemikalien und Verbrauchsmittel
Tabelle 6 Chemikalien und Verbrauchsmittel
3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Merck, Darmstadt Chloroform Roth, Karlsruhe Citronensäure-Monohydrat Merck, Darmstadt Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Complete Prot-I)
Roche, Mannheim
DAB Substrate Roche, Mannheim Dexamethason Merck, Darmstadt Desoxyadenosintriphosphat (dATP) Peqlab, Erlangen Desoxycytidintriphosphat (dCTP) Peqlab, Erlangen Desoxyguanosintriphosphat (dGTP) Peqlab, Erlangen Desoxythimidintriphosphat (dTTP) Peqlab, Erlangen Developer G153B AGFA, Mortsel, Belgien Diethyldicarbonat (DEPC) Sigma, Steinheim Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma, Steinheim Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt DTT 0,1M (Dithiothretiol) Invitrogen, Karlsruhe Dulbecco´s modified eagle medium (DMEM) Biochrom, Berlin Ethanol Merck, Darmstadt Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) Merck, Darmstadt First Strand Buffer 5x Invitrogen, Karlsruhe Fötales Kälberserum (FCS) Biochrom, Berlin Glycin Serva, Heidelberg Hämalaunlösung Roth, Karlsruhe Insulin Isopropanol Merck, Darmstadt Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt Luminol AppliChem, Darmstadt Magermilchpulver Heirler Cenovis GmbH, Radolfzell Magnesiumchlorid – Hexahydrat (MgCl2) Merck, Darmstadt Mark12 Unstained Standard (1x) Invitrogen, USA Methanol Roth, Karlsruhe Methyl Green, zinc chloride salt 83% Sigma-Aldrich, USA Natriumchlorid (NaCl) Marck, Darmstadt Natrium-Citrat Calbiochem, USA NONIDET NP-40 Amresco, Ohio, USA NuPAge Antioxidant Invitrogen, USA NuPage LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen, USA NuPage Reducing Agent (10x) Invitrogen, USA NuPage Transfer Buffer (20x) Invitrogen, USA Oligo (dT)-15-Primer Promega, USA Para-Hydroxycoumarinsäure Sigma, Steinheim Penicillin Biochrom, Berlin Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) Sigma, Steinheim
25
Phosphat Buffet Saline (PBS) Biochrom, Berlin Random Primers Invitrogen, USA Rapid Fixer G354 AGFA, Mortsel, Belgien RNase OUT™ Invitrogen, Karlsruhe RNA-Pure Peqlab, Erlangen StreptABComplex/HRP (Streptavidin, Biotinylated Peroxidase)
Dako Cytomation, Dänemark
Streptomycin Biochrom, Berlin Sodium Dodecyl Phosphate (SDS) Sigma, Steinheim SuperScript® II Reverse Transcriptase Invitrogen, USA Tissue Clear Sakura, Niederlande Tris Base Calbiochem, USA Trishydroxymethylaminomethanhydrochlorid (Tris-HCl)
Merck, Darmstadt
Trypsin Biochrom, Berlin Tween 20 Sigma, Steinheim Wasserstoffperoxid (H2O2) Sigma, Steinheim Xylol Roth, Karlsruhe
Antikörper
Tabelle 7 Antikörper
anti-AKT Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-Beta-Aktin, mouse IgG Sigma, Steinheim Anti-Epidermal-Growth-Factor-Receptor (EGFR) Upstate, New York Anti-MAPK1 (mitogen activated proteine kinase) p44/42
Cell Signaling, Frankfurt a.M.
Anti-mouse Sigma, Steinheim Anti-P-AKT Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-P-EGFR (Tyr 1068) Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-P-EGFR (Phosphor S1070) Abcam, Cambridge, U.K. Anti-P-MAPK p42/44 Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-P-VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor-2) (Tyr 1223)
Millipore, New York
Anti-P-VEGFR2 (phospho Y1054) Abcam, Cambridge, U.K. Anti-rabbit Sigma, Steinheim Anti-Rat-KI-67 Clone MIB-5 Dako Cytomation, Dänemark Anti-VEGFR2 Abcam, Cambridge Anti VEGFR-2 (Flk-1) (C-1158) :sc-504 Santa Cruz, USA
Light-Cycler PCR-Primer
Tabelle 8 Light-Cycler-PCR-Primer
Rn_bax_1SG QuantiTect Primer Assay Qiagen, Hilden Rn _bcl2_1_SG QuantiTect PrimerAssay Qiagen, Hilden Rn_GAPD_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen, Hilden Rn_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen, Hilden Rn_RGD :2543_1_SG QuantiTect Primer Assay
Qiagen, Hilden
Rn_RGD :619991_1_SG QuantiTect Primer Qiagen, Hilden
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Assay
Verbrauchsmittel
Tabelle 9 Verbrauchsmittel
4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen, USA Amersham™Hyperfilm™ECL GE Healthcare, Buckinghamshire, U.K. BD Falcon (15ml, 50ml) BD Biosciences, Erembodegem, Belgien Cryoröhrchen Nalge Nunc International, Dänemark Einbettkassetten Langenbrinck, Emmendingen Einmal-Skapelle, steril Feather, Japan Eppendorf Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg Filterpapier Whatman, England Kunststoffpipettenspitzen Biozym, Hannover Kunststoffpipettenspitzen Eppendorf, Hamburg LightCycler® Capillaries 20µl Roche, Mannheim Menzel-Gläser Superfrost Plus Menzel GmbH, Braunschweig Microtom-Einmalklingen Leica, Wetzlar Nahtmaterial Johnson&Johnson, Neuss Nitrocellulose Transfer Membran Schleicher und Schüll, Dassel Novex Sharp Standard Invitrogen, USA Objektträger Langenbrinck, Emmendingen PP-Test Tubes (15ml und 50 ml) Greiner, Nürtingen Western Blot Papier Schleicher und Schüll, Dassel Zellkulturflaschen (25,75 und 175cm²) Nalge Nunc International, Dänemark FALCON® Pipetten (2ml, 5ml, 10ml, 25ml, 50ml)
Becton Dickison Labware, Franklin Lakes, USA
Fertigkits
Tabelle 10 Fertigkits
Amersham™ECL™ Western Blotting Detection Reagent
GE Healthcare, Buckinghamshire, U.K.
BCA™ Protein Assay Kit Pierce, USA In situ cell death detection POD Roche, Mannheim Light Cycler® FastStart DNA Master SYBR Green 1
Roche, Mannheim
Geräte
Tabelle 11 Geräte
Analysewaage Sartorius, Göttingen Autoklav Systec, Wettenberg Biofuge Heraeus Christ, Osterode Bio-Photometer Eppendorf, Hamburg Blot-Kammer Biometra, Göttingen Clean Bench DLF/BSS 6 Kl IIa Clean Air, USA CO2-Schrank mit Heizluftsterilisation CB210 Binder, Tuttingen Electrophoresis Power Supply EPS 3500 Pharmacia, Freiburg Flowmeter Typ SF2 UNO Roestvaststaal BV, Didam,
Niederlande
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Gefrierschrank -80° Thermoscientific, USA Heizblockthermomixer HLC Haep Labor Consult, Bovenden
Kühlschrank -20° Liebherr, Germany Kühlschrank +4° Liebherr, Germany Magnetrührer Heidolph, Schwabach Megafuge 1.0 R Heraeus Christ, Osterode Microtom Leica, Wetzlar Neubauer Zählkammer Hecht-Assistent, Sondheim PCR-Light Cycler Roche, Mannheim pH-Meter Hanna Instruments, Kehl a. Rhein Picofuge Stratagene, U.K. Pipettierhilfen Eppendorf, Hamburg Präzisionswaage Sartorius, Göttingen PTC-200 Peltier Thermal Cycler BioRad, München Rollmischer Hecht-Assistent, Sondheim Schüttler Janke und Kunkel, Freiburg Shandon Cover-Plates Thermo-Shandon, Frankfurt Sigma Delta Vaporizer Penlon Limited, Abingdon, U.K. Vortexter VF 2 Janke&Kunkel, Freiburg Wasserbad Memmert, Schwabach Xcell SureLock® Mini Cell invitrogen
Substanzen und Medikamente
Tabelle 12 Substanzen und Medikamente
AEE 788 Novartis, Basel, Schweiz Forane, Isoflurane Abbott, Indien Ketanest, Ketamin Pfizer, Berlin Novaminsulfon Ratiopharm, Ulm
Lösungen und Puffer Zellkulturmedium Dulbecco´s MEM 84,5g/l Glucose) 10% Fötales Kälberserum (FCS). 20min bei 56°C inaktiviert 105 U/l Penicillin 100 mg/l Streptomycin 1 mg/l Humaninsulin 0,4 mg/l Dexamethason (Aufbewahrung bei 4°C) 10x Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) pH 7,4 80 g NaCl 2 g KCl 11,5 g Na2HPO4
2,0 g KH2PO4
Ad 1 l Aqua dest. Tris Puffer (TBS) pH 7,4 30,25 g Tris 45 g NaCl Ad 5 l Aqua dest.
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Citrat-Puffer pH 6,0 2,94 g Natrium-Citrat Ad 1 l Aqua dest. MOPS-Buffer pH 7,7 50 mM MOPS 50 mM Tris Base 0,1% SDS 1 mM EDTA Glycin-Puffer pH=2 3,76 g Glycin Ad 500 ml Aqua dest. ECL (Enhanced Chemiluminescence) Solution A (store at 4° C) 200 ml 0,1M Tris-HCl (pH 8,6) 50 mg Luminol Solution B 11 mg para-Hydroxycoumarinsäure 10 ml DMSO 4 ml Solution A + 1,2 µl H2O2(30%) – 400µl Solution B DEPC-H2O 0,1 % DEPC H2O Jie´s Puffer 10 MM NaCl 0,5% Nonidet NP-40 20 mM Tris-HCl 5 mM MgCl2
10 µg/ml Complete, Prot-I 1 mM PMSF Auffüllen mit Aqua dest. RT-Mix (Reserve Transkriptase Mix) Desoxyribonukleosidtriphosphate-Mix 20 µl 100 mM dATP 20 µl 100 mM dTTP 20 µl 100 mM dGTP 20 µl 100 mM dCTP = 80 µl of 25 mM dNTPs mix 400 µl DTT 800 µl 5x First Strand Buffer Blockierlösung 1x PBS/TBS 4% Magermilch 0,1% Tween Glycin 0,1M 3,75 g Glycin 500 ml H2O
29
Zelllinie MH – 7777A : murine Hepatomzellen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweis, Deutschland) Tiere Buffalo-Ratten BUF/SimRijHsd Firma Harlan, Niederlande
3.2 Zellkultur
3.2.1 Verwendete Zellen
Bei den für die Tumorinokulation verwendeten Zellen handelt es sich um
Rattenhepatomzellen der Zelllinie mit der Bezeichnung MH – 7777A, welche
ursprünglich aus Lebertumoren der Buffalo-Ratte gewonnen worden waren.
Morris et al induzierten in den 50er und 60er Jahren in weiblichen Buffalo-Ratten
durch Gabe des langwirksamen Karzinogens N-2-Fluoranylphthalamsäure die
Entstehung eines Hepatoms mit möglichst geringer biologischer und biochemischer
Abweichung vom humanen HCC. [53,54]
Die Zellen können nur auf Buffalo-Ratten transplantiert werden und haben eine
Anwachsrate von ca. 90 – 100%.
Bezogen wurden die Zellen über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig.
Die runden und polymorphen Zellen zeichnen sich durch ein Wachstum in
Monolayern aus und sind laut Herstellerangaben frei von Mycoplasmen und
Reverse Transkriptase negativ.
3.2.2 Kulturbedingungen und Passage
Die MH – 7777A – Zellen wurden im Zellkulturschrank bei 37°C und einem CO2-
Partialdruck von 5% im oben genannten Medium kultiviert. Aufbewahrung im
Kühlschrank bei 4°C.
Nach dem Auftauen der Zellen wurde diese zunächst in Zellkulturflaschen von
25 cm² mit 10 ml Kulturmedium gegeben und bei nahezu 70% Konfluenz, welche
unter dem Lichtmikroskop beurteilt wurde, in größere Kulturflaschen umgesetzt.
Konfluenz war nach ca. 1-3 Tagen erreicht.
Die Passage wurde folgendermaßen durchgeführt:
Nach Absaugen des Kulturmediums wurde die Zellkultur mit 5 ml PBS gespült und
anschließend mit 5 ml Trypsin befeuchtet. Während der nun folgenden Ablösung der
Zellen vom Flaschenboden im Brutschrank erfolgten regelmäßig optische
Verlaufskontrollen. Nach ca. 10 min wurde die Trypsinaktivität durch Zugabe von
Nährmedium gestoppt und die Zellen abzentrifugiert (1200 min-1, 5 min, 4°C).
30
Nachdem der Überstand abpipettiert worden war, konnten die Zellen erneut
ausgesät werden, dies erfolgte zumeist in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:5.
3.2.3 Vorbereitung der Zellen zur Inokulation
Um eine konstant große Anzahl an zu inokulierenden Tumorzellen zu erhalten,
mussten die Zellen jeweils ausgezählt und der erwünschten Konzentration
angeglichen werden.
1. Das alte Medium der Zellkultur wurde abgesaugt, die Zellen wie bei der
Passage üblich mit PBS gespült, dann mit 5 ml Trypsin abgelöst.
2. Anschließend wurde dieser Prozess mit 20 ml Medium gestoppt, und der
Zellrasen unter mehrmaligem Wiederaufnehmen der Flüssigkeit abgespült,
sodass man ein Volumen von 25 ml erhielt.
3. Aus der gut durchmischten Lösung entnahm man 10 µl und trug diese in
eine Neubauer-Zählkammer auf.
4. Nach auszählen der Felder ergab sich die Zellanzahl pro 25 ml Lösung
eines Falcons.
5. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert (1000 U, 10 min) und das
Pellet in 400 µl PBS gelöst
Auf diese Weise wurden jeder Ratte 10 Millionen Zellen in einem Volumen von
200 µl PBS injiziert.
3.3 Tierexperimentelle Arbeiten
Bei den Tieren handelte es sich um den Inzuchtstamm BUF/SimRijHsd bezogen
über die niederländische Zweigstelle von Harlan Laboratories Inc., Indianapolis.
Die männlichen Buffalo-Ratten hatten bei Lieferung ein Gewicht von ca. 200-250 g.
Das Tierversuchsvorhaben Nr. 54-2531.31-23/07 wurde von der zuständigen
Regierungsbehörde im Vorfeld genehmigt.
3.3.1 Tumorinokulation
Die Operation zur Implantation der Tumorzellen verlief wie folgend beschrieben:
1) Die Tiere wurden jeweils einzeln in einen speziellen Käfig gesetzt, an
welchen man die Leitung zur Begasung mit Isofluran anschließen kann.
2) Nachdem die Tiere narkotisiert waren, wurden sie auf den Operationstisch
gelegt und per Saugglocke, welche man über der Schnauze des Tiers
anbrachte, weiterhin mittels Inhalationsanästhetikum in Narkose gehalten.
3) Anschließend erfolgte die Fellrasur am Abdomen.
4) Ein 1-2 cm großer Schnitt links unterhalb des Sternums erlaubte den Zugang
zum linken Leberlappen.
31
5) Nach Sondierung des selbigen wurden den Tieren langsam die Tumorzellen
in einem Volumen von 200 µl injiziert.
6) Anschließend wurde die Wunde per Subkutan- und Kutannaht wieder
verschlossen. (Nahtmaterial: Vicryl Polyglactin 910, Ethicon, Inc., Johnson &
Johnson)
7) Zur Schmerzlinderung wurde dem Trinkwasser der Tiere Novaminsulfon®
zugegeben.
3.3.2 Medikamentengabe
Drei Wochen nach Tumorinokulation wurde den Tieren zwei Mal pro Woche der
Tyrosinkinaseinhibitor AEE788 oral mit Hilfe einer Knopfkanüle verabreicht. Zur
Applikation wurde eine Insulinspritze verwendet, so dass auch kleine Mengen genau
verabreicht werden konnten.
Den Buffalo-Ratten wurden jeweils 50 mg pro kg Körpergewicht appliziert. Im
Beispiel einer 300 g schweren Ratte wären dies somit 15 mg, gelöst in 200 µl einer
Lösung von 10% N-Methyl-pyrrolidone (NMP) und 90% PEG300.
Dies geschah jeweils unmittelbar vor Verwendung des Medikaments.
3.3.3 Verlaufskontrollen
Um das Wachstum des Karzinoms zu überprüfen, sowie vor Medikamentengabe die
Menge des zu applizierenden AEE788 berechnen zu können, wurden die Ratten
zweimal wöchentlich gewogen.
Außerdem wurden sonographische Kontrollen der Tumoren mit Hilfe von Herrn Dr.
Till Wissniowski, Medizinische Klinik I, Universität Erlangen-Nürnberg, durchgeführt.
Auch für die Ultraschalluntersuchungen wurden die Tiere mittels Inhalationsnarkose
(Isofluran) ruhiggestellt. Zur Feststellung der Tumorgröße wurde der Tumor mit Hilfe
der Ultraschalluntersuchung vermessen, jeweils in ihrem größten vertikalen und
horizontalen Durchmesser.
3.3.4 Tötung der Tiere
Hauptkriterium zur Tötung der Tiere war der vor Beginn der Experimente festgelegte
Beobachtungszeitraum von 3 Wochen nach der Tumorinokulation bzw. das
Erreichen von Abbruchkriterium gem. dem Tierschutzgesetz (z.B.
Gewichtsabnahme > 20%). Die Tiere wurden durch CO2-Inhalation getötet und das
Tumorgewebe für weitere Analysen (s.u.) asserviert.
3.4 Western Blot
Der Western Blot, auch als Immunoblot bezeichnet, dient dem Nachweis
verschiedener Proteinfraktionen zu untersuchender Proben.
32
Dabei werden die Proteine zunächst mithilfe der Elektrophorese getrennt um
anschließend auf Nitrocellulose übertragen – geblottet – zu werden.
Mit Hilfe von Antikörpern kann das entsprechende Protein sichtbar gemacht werden.
Zunächst bindet der 1. Antikörper an das nachzuweisende Protein, anschließend
bindet an diesen ein 2. Immunglobulin, welches mit einem Enzym gekoppelt ist, das
sein Substrat in einer chemilumineszenten Reaktion umsetzt und zu einer
Schwärzung des Röntgenfilms führt.
Im Folgenden werden die einzelnen Schritte zur Erstellung eines Westernblots kurz
erläutert.
3.4.1 Proteinextraktion
Die Gewebeproben wurden mit jeweils 500 µl des Extraktionspuffers (Jie´s Puffer)
versetzt. Anschließend wurden die Proben 30 min lang auf Eis gestellt,
zwischenzeitlich 2 – 3-mal gevortext. Weitere 30 min wurde das Material bei
13.000 rpm und bei 4°C im Kühlraum zentrifugiert, danach der Überstand mit den
benötigten Proteinen in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt, das Pellet verworfen.
Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proben bei -20°C gelagert.
3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der BCA Protein Assay Kit der
Firma PIERCE, Thermo Scientific, USA verwendet. Je 25 µl pro Probe wurden in
eine Mikroplatte pipettiert. Anschließend wurden die zu bestimmenden
Proteinproben aus dem Tumorgewebe 1:25 verdünnt pipettiert, je 1 µl aus der
Proteinisolation und 24 µl Aqua dest. Als nächster Schritt folgte die Zugabe des
BCA Working Reagent, welches zwei Reaktionen zur Quantifizierung benutzt.
Lösung A enthält Kupferionen und führt so zur Biuret-Reaktion, bei der
Peptidbindungen eine Bindung mit zweiwertigen Kupferionen eingehen, so dass ein
Farbumschlag nach blau entsteht. Lösung B enthält Bicinchoninsäure welche mit
einwertigen Kupferionen, die nach Reaktion mit Peptidbindungen aus zweiwertigen
Cu-Ionen hervorgehen, einen violetten Komplex eingeht.
200 µl dieses Working Reagent, in einem Verhältnis von 50 Teilen A und 1 Teil B
wurden nun sowohl zur Standardreihe als auch den zu bestimmenden
Proteinproben zugegeben. Der violette Farbstoff konnte nach einer Inkubationszeit
von 30 min bei 37°C und erneuter Abkühlung auf Raumtemperatur photometrisch
bei einer Wellenlänge von 562 nm quantitativ bestimmt werden.
Anhand der Standardkurve konnte anschließend der Proteingehalt der Proben
berechnet werden.
33
3.4.3 Gelelektrophorese
Für die Gelelektrophorese wurden NuPAGE Novex 4 – 12% Bis-Tris Mini Gele
sowie Puffersysteme der Firma invitrogen: NuPAge Antioxidant, NuPage LDS
Sample Buffer (4x), NuPage Reducing Agent (10x), NuPage Transfer Buffer (20x)
verwendet.
Bei der SDS-Gelelektrophorese wird durch das verwendete Sodiumdodecylsulfat die
Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine zerstört, die
Ladungsunterschiede werden weitgehend aufgehoben. In der Gelelektrophorese
folgt schließlich die Auftrennung der Proteine nach ihrer Molekülmasse.
Die Proteinproben wurden vor der Elektrophorese folgendermaßen vorbereitet:
- 13 µl Probe (enthielt je 15 µg Protein, verdünnt mit H2O)
- 2 µl Reducing Agent
- 5 µl LDS Sample Buffer
Dann wurden die Proben für 10 min auf 70°C erhitzt, die Proteine so denaturiert.
Das Gel wurde in die Kammer Xcell SureLock® Mini Cell eingebracht und folgende
Puffer gemischt:
1. 25 ml 20fach MOPS-Puffer und 475 ml Aqua dest.
2. 200 ml aus dieser Lösung mit 500 µl NuPage Antioxidant mischen
Die Lösung aus 2. wurde in die entstandene innere Kammer gefüllt, nach
Überprüfung der Dichtigkeit wurde die verbleibende Lösung aus 1. in die äußere
Kammer gefüllt.
Anschließend wurden die Taschen des Gels mit den Proben befüllt.
In die erste Tasche wurde der Marker MagicMark gegeben, in die folgenden die
jeweiligen Proben. Dann wurde die Kammer mit dem Transformator verbunden und
die Elektrophorese wurde gestartet. (50 min, 200 V, 125 mA)
3.4.4 Transfer auf Nitrocellulosemembran
Für das Blotten, also den Übertrag auf die Nitrocellulosemembran wurde stets ein
neuer Transferbuffer zubereitet:
10 ml enthalten
- 5 ml Transferbuffer 20x
- 100 µl Antioxidant
- 10 ml Methanol
- 84,9 ml Aqua dest.
Die Filterpapiere und die Nitrocellulosemembran wurden darin getränkt und die
Blotkammer anschließend in folgender Reihenfolge bestückt:
- 2 Lagen Filterpapier
34
- Gel
- Nitrocellulosemembran
- 2 Lagen Filterpapier
Geblottet wurde jeweils 30 min mit 200 V und 125 mA.
Schlussendlich wurde die entstandene Membran dreimal für jeweils 10 min in PBS
oder TBS + 0,1% Tween20 gewaschen und über Nacht in 4% Magermilch/PBS oder
TBS/0,1%Tween20 blockiert.
3.4.5 Antikörperinkubation und Röntgenfilmentwicklung
Vor Inkubation mit dem 1. Antikörper wurde die Membran zunächst wie oben
beschrieben blockiert und anschließend dreimal für 10 min mit PBS oder, bei
phosphorylierten Proteinen, mit TBS, gewaschen. Der 1. Antikörper wurde je
nachdem entweder 1:200, 1:500 oder 1:1000 in 5ml PBS oder TBS verdünnt, die
Membran damit auf dem Schüttler eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde die Membran wiederum dreimal 10 min lang mit PBS oder
TBS-Puffer gewaschen.
Der 2.Antikörper wurde 1:1000 verdünnt und anschließend auf die Membran
gegeben und bei Raumtemperatur für eine Stunde belassen. Nachdem die
Membran nochmals dreimalig für 10 Minuten mit entsprechendem Puffer
gewaschen worden war, wurde das Ergebnis mittels Röntgenfilmentwicklung
sichtbar gemacht.
Hierzu wurde die Membran für 2 Minuten mit ECL inkubiert (Amersham™ECL™
Western Blotting Detection Reagent) und anschließend von einer Folie bedeckt in
die Entwicklungskassette gegeben. In der Dunkelkammer wurde anschließend das
Röntgenpapier (Amersham™ Hyperfilm™ECL) auf die Membran gelegt und die
Kassette verschlossen. Je nach Antikörper wurde der Film zwischen 30 Sekunden
und 10 Minuten exponiert und anschließend in einer Filmentwicklungsmaschine
entwickelt.
3.4.6 Antikörperentfernung
Zur Entfernung der Antikörper, dem sogenannten „Stripping“, wurde die Membran
für eine Stunde mit Glycin-Puffer inkubiert, welches anschließend wieder entfernt
wurde (Waschung mit PBS/TBS 3 mal, 10 min).
Bis zur nächsten Verwendung des Blots wurde die Membran über Nacht in 4%
Magermilch/PBS oder TBS/0,1% Tween20 blockiert.
35
3.4.7 Auswertung
Die Auswertung der Western Blots erfolgte mittels Densitometrie, d.h. durch
quantitative Messung der Farbdichte. Normalisiert wurden die Werte anschließend
zu ß-Aktin, welches auf der gleichen Membran ausgewertet wurde. Nach der
Berechnung der Mittelwerte der Expressionsniveaus sowie der dazugehörigen
Standardabweichungen, wurde durch den t-Test, Signifikanz gleich p<0.05,
versucht, signifikante Unterschiede herauszustellen.
3.5 PCR
3.5.1 RNA-Isolation aus Tumorgewebe
Zum Tumorgewebe wurden jeweils 500 µl RNA-Pure zugegeben und mittels des
Tissue-Lysers gemischt und so gelöst. Nach Zugabe von weiteren 200 µl RNA-Pure
wurde gemischt bis eine vollständige Homogenisierung erreicht war, 140 µl
Chloroform zugesetzt und so die RNA-Isolierung begonnen.
Nach Vermengung des Gemischs, bis zur Trübung der Lösung, wurde dieses 5 min
bei Raumtemperatur stehen gelassen, um danach für 20 min zentrifugiert zu werden
(4°C, 13.000 rpm). Anschließend wurde die wässrige Phase in 100 µl Schritten
abpipettiert und 1:1 mit Chloroform vermischt, anschließend erneute Mischung bis
zur Trübung.
Im nächsten Schritt wurde nochmals für 10 min mit 13.000 rpm bei 4°C zentrifugiert,
die so entstandene wässrige Phase abgenommen und in ein neues Eppendorf-
Gefäß überführt, welches bereits 700 µl Isopropanol enthielt. Nach vortexen und
Zentrifugation (20 min, 4°C, 13.000 rpm) wurde die RNA gewaschen, das
überstehende Isopropanol abpipettiert und das verbleibende RNA-Pellet mit 70%
Ethanol (gelöst in DEPCH2O) vermischt, anschließend zentrifugiert (7 min, 4°C,
13.000 rpm).
Der Waschvorgang wurde zwei Mal wiederholt und die RNA anschließend
getrocknet, die dabei durchsichtig wird. Zum Schluss wurde die RNA in 50 µl
DEPCH2O gelöst.
3.5.2 RNA-Konzentrationsbestimmung
Zur Konzentrationsbestimmung per Photometrie wurden jeweils 1 µl Probe mit 99 µl
DEPCH2O verdünnt und bei einer Längenwelle von 230 nm vermessen.
Das erhaltene Ergebnis wurde wegen des Verdünnungsfaktors mit 100 multipliziert
und anschließend berechnet, in wieviel µl Probe sich ein µg RNA befindet.
Der Wert in µl wurde mit DEPCH2O auf 10 µl verdünnt.
36
3.5.3 RNA-Transkripition in cDNA
Es wurden jeweils 1 µg RNA gelöst in 10 µl DEPCH2O transkribiert. Den auf Eis
gestellten Proben wurden jeweils 1µl Oligo-dT-Primer sowie 1 µl Random Primer
zugesetzt. Dieser Ansatz wurde für 10 min auf 70°C erhitzt.
Nach Zugabe von 7 µl RT-Mix und 1 µl RNAse-out wurde für 2 min auf 42°C erhitzt.
Im letzten Lauf wurde 1 µl SuperScriptII zupipettiert und für 1 Stunde auf 42°C
erhitzt.
3.5.4 Light-Cycler PCR
Die PCR wurde mit Hilfe des LightCycler Faststart DNA Master SYBR Green 1 Kits
der Firma Roche durchgeführt. Die Probe, welche als Standard verwendet wurde,
wurde mit H2O zu folgender Konzentrationsreihe verdünnt: unverdünnt, 1:4, 1:8,
1:16, 1:32.
Für den Master-Mix wurden immer 10µl aus dem Gefäß 1a (FastStart Taq-
Polymerase) des Kits in das Gefäß 1b(Ready-to-use Hot Start PCr Reaction Mix)
gegeben.
Je Ansatz wurde folgender Mix benötigt:
- 2µl Master-Mix
- 3,2 µl MgCl2
- 1,83 µl Primer
- 11 µl H2O
Nach dem Pipettieren in spezielle Kapillaren wurde kurz abzentrifugiert und die
Ansätze anschließend in das LightCycler® Carousel-Based System eingegeben und
die Real-Time-PCR gestartet.
3.5.5 Auswertung
Die Analyse der Rohdaten erfolgte mit der GenEx Software. Durch Berechnung der
Mittelwerte der Expressionsniveaus sowie der dazugehörigen
Standardabweichungen. Durch den t-test, Signifikanz gleich p<0.05, wurden
signifikante Ergebnisse von irrelevanten separiert.
3.6 Histologische Verfahren
3.6.1 Anfertigung der Präparate
Die in Paraffin gebetteten Blöcke (Pathologisches Institut, Universität Erlangen-
Nürnberg) wurden mithilfe eines halbautomatischen Mikrotoms in 2 – 3 µm dünne
Schnitte aufgeteilt. Nach überbringen der Schnitte in ein Warmwasserbad wurden
sie manuell auf die Objektträger aufgebracht und zum Trocknen aufgestellt.
37
3.6.2 HE – Färbung
Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurde vom pathologischen Institut der Universität
Erlangen-Nürnberg nach dort üblichem Protokoll durchgeführt.
3.6.3 TUNEL – Färbung
Für die TUNEL – Färbung (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling), welche
zum Nachweis der Apoptose in Zellkernen dient, wurde der In Situ Cell Death
Detection POD Kit von Roche verwendet.
Dabei ermöglicht eine terminale Desoxynukleotidyltransferase die Markierung freier
DNA-Strangbrüche mittels Fluoreszein-markierter dUTP-Moleküle, die sichtbar
gemacht werden können. Obwohl eine unspezifische Mitfärbung von vereinzelten
Nekrosen bei massivem DNA-Abbau nicht ausgeschlossen werden kann, stellt die
TUNEL-Färbung ein hochspezifisches und –sensitives Verfahren zum
Apoptosenachweis dar.
Zunächst wurden die Schnitte wie folgend beschrieben entparaffiniert:
- 30 min Inkubation mit Tissue Clear
- 2 x 5 min Waschung mit Isopropanol
- 10 min waschen mit 96% Ethanol
- 10 min waschen mit 70% Ethanol
- 2 x 5 min Waschung mit Aqua dest.
Danach wurde nach entsprechendem Protokoll gefärbt:
- Inkubation mit Proteinkinase K 30 min bei 37°C
- 2x waschen mit 1xPBS
- Inkubation in Blocking Solution für 10 min bei RT
- 2x waschen mit 1xPBS
- Pro Schnitt auftragen von 50 µl Reaktionslösung, Inkubation unter
Parafilm 60 min bei 37°C
- 3x waschen mit 1xPBS
- Pro Schnitt auftragen von 50 µl POD Konverter, Inkubation 30 min
bei 37°C
- 3x waschen mit 1x PBS
- 50-100 µl DAB Substrat-Lösung für 10 min bei RT
- 3x waschen mit 1xPBS
- Gegenfärbung mit Methylengrün 2,5% für 7 min
- Kurz mit Aqua dest. waschen
- Aufbringen der Deckgläser
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3.6.4 KI-67-Färbung
Das Antigen KI-67 ist ein Proliferationsmarker. In der histologischen Färbung
werden sich gerade in der Wachstumsphase befindliche Zellen angefärbt.
Die Färbung wurde nach folgendem Protokoll angefertigt:
Entparaffiniert wurde wie unter Punkt 2.6.3 bereits beschrieben.
Anschließend folgte das Kochen der Schnitte in Citratpuffer:
- 1 x 8 min bei 600 Watt
- 1 x 8 min bei 800 Watt
- 20 min abkühlen lassen, danach 3x2 min mit Aqua dest. waschen
Der Peroxidaseblock wurde mit 3% H2O2 durchgeführt. Danach zweimalige Spülung
mit Tris-Puffer.
Die Primärantikörperinkubation verlief folgendermaßen:
- Über 16 h bei 4°C oder 1h bei RT
- Verdünnung 1:200 mit Tris-Puffer
- Für Rattengewebe: ki-67 Klon MIB-5 (Dako)
- Spülen 1x mit Tris-Puffer Brij und 1x mit Tris-Puffer
Die Zweitantikörperinkubation:
- Mit biotinyliertem Brücken-AK Kaninchen anti-Maus für 60 min bei RT
Verdünnung 1:50 mit Tris-Puffer
- Spülen mit Tris-Puffer
Der Streptavidin-Biotin-Komplex (Dako) muss eine halbe Stunde vor Verwendung
nach Protokoll des Kits angefertigt werden und wird 30 min bei RT auf den Schnitten
belassen. Nach Gegenfärbung mit Hämalaunlösung wurden die Schnitte gespült
und die Deckgläser aufgebracht.
3.6.5 VEGF- und VEGFR-Färbung
Die Färbungen mit den Antikörpern gegen den vascular endothelial growth factor
und dessen Rezeptor wurden vom Pathologischen Institut der Universität Erlangen-
Nürnberg durchgeführt.
3.6.6 EGF- und EGFR-Färbung
Die Färbungen mit den Antikörpern gegen den endothelial growth factor und dessen
Rezeptor wurden vom Pathologischen Institut der Universität Erlangen-Nürnberg
durchgeführt.
3.6.7 Auswertung
Die Schnitte wurden analysiert mithilfe eines kombinierten Licht- und
Fluoreszenzmikroskops (Nikon ECLIPSE 80i, Nikon Deutschland). Fotografien
39
wurden mit einer Digitalkamera (DS5-Mc) unter Gebrauch einer Analysesoftware
(NIS software Version 2.2, Nikon Japan) aufgenommen. Mit der
Bearbeitungssoftware Adobe Photoshop 5.5 wurden anschließend Helligkeit und
Kontrast der Aufnahmen angepasst.
Die Quantifizierung der immunhistochemischen Färbungen für KI-67 und TUNEL
erfolgten durch Auszählung der positiv reagierenden Hepatozyten. Daraus wurde
der Anteil im Schnittpräparat in Prozent ermittelt. Als positiv wurden Zellen mit
einem eindeutig stärkeren Signal als das umliegende Gewebe gewertet.
Die Färbungen für die EGFR, VEGFR bzw. P-EGFR und P-VEGFR-Antikörper
wurden semiquantitativ bestimmt, indem der prozentuale Anteil positiven Gewebes
im Schnittpräparat geschätzt wurde. Außerdem wurde die Intensität mit einem Wert
zwischen 1 und 3 bestimmt. Die Multiplikation der beiden Werte stellt dann den
Ausprägungsgrad der Färbung am jeweiligen Schnitt dar.
Durch die statistische Auswertung mittels des zweiseitigen t-test auf Mittelwert für
normalverteilte Werte, Signifikanz gleich p < 0.05, wurden signifikante Ergebnisse
von irrelevanten separiert. Die signifikanten Ergebnisse sind in den graphischen
Darstellungen mit * markiert.
40
4. Ergebnisse
Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung des dualen Tyrosinkinaseinhibitors
AEE788 im Rattenmodell. Hierzu wurden wie oben ausführlich beschrieben,
zunächst Tumoren der Morris-Hepatom Zelllinie in Buffaloratten transplantiert und
nach erfolgter oraler Verabreichung des Medikaments das Tumorgewebe zu
Untersuchungen entnommen. Zur Auswertung des Materials wurden verschiedene
Methoden angewandt, darunter sonographische Überprüfung des
Tumorwachstums, laborchemische Verfahren wie der Western Blot, die PCR und
histologische Färbungen. Alle Analysetechniken wurden mit dem Ziel eingesetzt, die
Arbeitshypothese zu überprüfen, welche besagt, dass die Behandlung mit AEE788
zu einem signifikanten Unterschied im Tumorwachstum im Vergleich zu
unbehandelten Stichproben führt.
Im Folgenden soll dargelegt werden, inwiefern dieses Vorhaben umgesetzt werden
konnte.
4.1 Sonographischer Wachstumsverlauf
Nach einer Behandlungsdauer von drei Wochen wurde die Tumorgröße der
behandelten und unbehandelten Tiere sonografisch transversal in Millimetern
vermessen. Dabei ergab sich ein signifikanter Unterschied (p < 0,05) zwischen den
beiden Gruppen, bei einem Mittelwert von 25,44 mm (SEM 5,01) in der
unbehandelten und 11,21 mm (SEM 0,95) in der Gruppe mit durch AEE788
behandelten Hepatomen.
Abb.7 Beispiel einer repräsentativen unbehandelten Kontrolle
Links ist eine Ultraschallaufnahme mit Vermessung des Tumors zu sehen, rechts der makroskopische
Befund nach Tumorentnahme
41
Abb.8 Beispiel eines repräsentativen mit AEE788 behandelten Tieres
Links ist eine Ultraschallaufnahme mit Vermessung des Tumors zu sehen, rechts der makroskopische
Befund nach Tumorentnahme
4.2 Western Blot
Im Western Blot wurde die Expression der Mitogen-aktivierten-Proteinkinase, kurz
MAPK, und ihrer phosphorylierten, aktivierten Form, sowie der Proteinkinase B, kurz
als AKT bezeichnet, ausgewertet. Standardisiert wurden die Ergebnisse zu ß-Aktin.
Beide Kinasen finden sich im Signalweg sowohl des VEGF- als auch des EGF-
Rezeptors. Die jeweils phosphorylierte Form der Kinasen ist dabei die aktivierte,
signalübertragende.
In der Darstellung der Blots finden sich mit 7 – 11 die Kontrollen, mit den Ziffern
12 – 16 die behandelten Tiere bezeichnet. Unter der jeweiligen Spur ist das
Ergebnis der densitometrischen Auswertung aufgeführt, normalisiert zum jeweils
darunter stehenden ß-Aktin-Blot.
Während das Signalmolekül MAPK (1:1000) konstant gleich in der Kontrollgruppe
und der Gruppe behandelter Tiere zu detektieren war, fand sich ein Unterschied in
der Expression der phosphorylierten Isoformen (1:1000). So kann man die im
Western Blot gezeigte Expression der p-MAPK in den Kontrolltieren 7, 10 und 11 als
stärker interpretieren, im Vergleich zu der Gruppe behandelter Tiere.
Auch die P-AKT war in den behandelten Tumoren im Vergleich zu den
Unbehandelten vermindert detektierbar.
42
Diese auf den ersten Blick sichtbaren Unterschiede werden unterstützt durch die
densitometrische Auswertung. Demnach kann ein Trend hin zu verringerter
Expression der P-MAPK und auch der P-AKT festgestellt werden, wie nachfolgende
Abbildung zeigt:
Abb.10 Densitometrische Auswertung des Western Blot
Die Abbildung zeigt die unterschiedlich starke Expression der untersuchten Signalmoleküle MAPK, P-
MAPK, AKT und P-AKT, jeweils in unbehandelten und behandelten Tumoren.
Signifikante Werte erbrachte das Western-Blotting nicht, doch auch der statistische
Vergleich des Verhältnisses der jeweils inaktiven und aktivierten Form der
Signalmoleküle (Abb.10) zeigt einen Trend hin zur verminderter Aktivität der
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
MAPK P-MAPK AKT P-AKT
no
rma
lisi
ert
e E
xp
ress
ion
Kontrolltiere
AEE788
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
MAPK
1,20 1,47 2,23 0,98 0,65 0,72 0,54 2,12 1,39 1,28
P-MAPK
0,93 0,19 0,28 0,69 0,26 0,81 0,13 0,15 0,09 0,16
ß-Aktin
AKT
1,33 0,75 1,24 0 0 0 0,19 0,88 0,96 0,16
P-AKT
0,98 0,56 2,38 1,85 0,88 2,44 0,37 0,27 0,29 0,07
ß-Aktin
Abb.9 Darstellung der Western Blots
43
Signalwege in mit AEE788 behandelten Tumoren, und somit eine Bestätigung der
Arbeitshypothese.
Abb.11 Vergleichende Darstellung des Verhältnisses P-MAPK/MAPK und P-AKT/AKT
Die statistische Auswertung bestätigt einen Trend zu verminderter Aktivität der Signalwege in den
behandelten Tumoren im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen.
4.3 Immunhistochemie
4.3.1 KI-67 Färbung
Die Auszählung der positiven Zellkerne der Schnittpräparate der 5 Kontrollen ergab
einen Mittelwert an positivem Signal von 52,99% mit einer SEM von 6,7%.
Bei den mit AEE788 behandelten Tumoren ergab sich für die 5 Präparate ein
Mittelwert von positiven Zellkernen von 25,47% mit einer SEM von 8,4%.
Das KI67-Antigen ist ein Proliferationsmarker, d.h. es färbt sich die
Wachstumsfraktion im Gewebe an, und gibt so Aufschluss über die
Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors. Dies bedeutet, dass eine verringerte
Anzahl positiver Zellkerne eine verminderte Proliferation des untersuchten Materials
angibt. Im vorliegenden Fall ist also eine geringer ausgeprägte Anfärbung in mit
AEE788 behandeltem Tumorgewebe wünschenswert, deutet es doch auf ein
vermindertes Tumorwachstum hin.
Und tatsächlich konnten signifikant weniger positive Zellkerne in mit AEE788
behandelten Tumorzellen als in unbehandelten (p < 0,01) nachgewiesen werden.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
P-MAPK/MAPK P-AKT/AKT
Kontrolltiere
AEE78
44
Abb.12 Graphische Auswertung KI67-Färbung
*p<0,01 vs. Kontrolle
Abb.13 KI67-Färbung, 20x Vergrößerung
Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die
rechte einer unbehandelten Kontrolle
4.3.2 TUNEL-Färbung
Die Bestimmung der positiven Zellen in der TUNEL-Färbung der Schnittpräparate
der unbehandelten 5 Kontrollen ergab einen prozentualen Anteil von 7,3% mit einer
SEM von 1,8%. Die Auszählung der signalstarken Zellkerne in den Präparaten der
mit AEE788 behandelten Tumoren ergab einen Anteil von 10,3% mit einer SEM von
3%.
Die TUNEL-Färbung dient der Apoptosedetektion. D.h. im vorliegenden Falle wäre
in dieser Färbung eine signifikant stärkere Anfärbung in mit AEE788
vorbehandeltem Material wünschenswert, jedoch konnte kein signifikanter
Unterschied gezeigt werden.
0
10
20
30
40
50
60
70
% K
i67
po
siti
ve Z
ellk
ern
e
Kontrolle
AEE788*
45
Abb.14 Graphische Auswertung TUNEL-Färbung
Abb.15 TUNEL-Färbung, 20x Vergrößerung
Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die
rechte einer unbehandelten Kontrolle
4.3.3 Färbung des EGF- und des VEGF-Rezeptors
Wie bereits erwähnt, wurden die Präparate mit den Färbungen für die EGFR,
VEGFR bzw. P-EGFR und P-VEGFR-Antikörper semiquantitativ bestimmt. Der
prozentuale Anteil positiven Gewebes im Schnittpräparat wurde geschätzt,
anschließend die Intensität mit einem Wert zwischen 1 und 3 bestimmt. Die
Multiplikation der beiden Werte stellt dann den Ausprägungsgrad der Färbung am
jeweiligen Schnitt dar.
Die semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen des EGF-
und des VEGF-Rezeptors ergaben folgende Ergebnisse:
Mit 93 wurde die positive Anfärbung des Gewebes der unbehandelten Kontrollen in
der EGFR-Färbung (SEM 8,86) bewertet, die der mit AEE 788 Behandelten mit 63
(SEM 8,34). Die VEGFR-Färbung resultierte mit 53 Punkten des unbehandelten
0
2
4
6
8
10
12
14
16
%TU
NE
L-p
osi
tive
r Ze
llke
rne
Kontrolle
AEE788
46
Gewebes positiv (SEM 8,57), die des unbehandelten Gewebes reagierten ebenfalls
positiv und wurde mit 37 bewertet (SEM 6,55).
Wünschenswerter und hier hinterfragter Effekt des Tyrosinkinaseinhibitor AEE 788
ist die Inhibition sowohl des VEGF als auch des EGF Rezeptors. Eine signifikant
geringere Anfärbung der Rezeptoren in der Immunhistochemie gäbe einen positiven
Nachweis dieser Wirkung.
Die vorliegende Arbeit konnte signifikante Unterschiede im Sinne der
Arbeitshypothese erbringen (p < 0,1 für EGFR-Färbung, p < 0,2 für VEGFR-
Färbung).
Abb.16 Graphische Auswertung EGFR-Färbung
*p<0,1 vs. Kontrolle
Abb.17 Graphische Auswertung VEGFR-Färbung
*p<0,2 vs Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
Pu
nkt
we
rt E
GFR
-p
osi
tive
r Ze
llen
Kontrolle
AEE788
*
0
10
20
30
40
50
60
70
Pu
nkt
we
rt V
EG
FR-p
osi
tive
r Ze
llen
Kontrolle
AEE 788
*
47
4.3.4 Färbung der phosphorylierten EGF- und VEGF-Rezeptoren
Die Bestimmung der positiv gefärbten Flächenanteile und ihrer Intensität für den
phosphorylierten, somit aktiven EGF-Rezeptor ergab folgende Werte:
Im Mittel ergab die semiquantitative Bestimmung einen Wert von 63 positiv gefärbter
Fläche (SEM 7,04) sowie 32,5 bei der Bestimmung der mit AEE788 behandelten
Schnitte (SEM 3).
Der Vergleich dieser Werte zeigt einen hochsignifikanten Unterschied (p < 0,01) und
bedeuten wohl eine Herabregulierung der aktiven Form des epidermal growth factor
receptors in denen mit dem Tyrosinkinaseinhibitor behandelten Tumoren.
Für den phosphorylierten VEGF-Rezeptor wurden folgende Werte ermittelt:
Mittelwert in der Kontrollgruppe war 118,5 (SEM 9,37), in der behandelten Gruppe
72 (SEM 9,37). Da auch dieser Unterschied als hochsignifikant (p < 0,01) ermittelt
wurde, zeigt sich, dass auch der P-VEGFR in mit AEE788 behandelten Tumor
deutlich weniger exprimiert wird als in der unbehandelten Kontrollgruppe.
Beide Werte sprechen für eine Bestätigung der Hypothese, dass AEE788 Angriff an
den Rezeptoren von EGF und VEGF im Morrishepatom nimmt. Sowohl die
unphosphorylierte als auch die aktivierten Formen der Rezeptoren der
Wachstumsfaktoren zeigten eine geringergradige Ausprägung in behandeltem
Tumorgewebe.
Abb.18 Graphische Auswertung P-EGFR-Färbung
*p<0,01 vs Kontrolle
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Pu
nkt
we
rt P
-EG
FR-p
osi
tive
r Ze
llen
Kontrolle
AEE788*
48
Abb.19 Graphische Auswertung P-VEGFR-Färbung
*p<0,01 vs Kontrolle
Abb.20 VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung
Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die
rechte einer unbehandelten Kontrolle
Abb.21 EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung
Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die
rechte einer unbehandelten Kontrolle
0
20
40
60
80
100
120
140
Pu
nkt
we
rt P
-VE
GFR
-po
siti
ver
Zelle
n
Kontrolle
AEE 788
*
49
Abb.22 P-VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung
Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die
rechte einer unbehandelten Kontrolle
Abb.23 P-EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung
Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die
rechte einer unbehandelten Kontrolle
4.4 Light-Cycler® PCR
In der PCR im Light Cycler® Verfahren wurden folgende Proteine untersucht: Das
humane vascular endothelial growth factor – A – Protein (VEGF-A), das endothelial
growth factor-receptor-Protein (EGFR), das kinase insert domain receptor – Protein
(KDR), welches einen der beiden Rezeptoren für VEGF darstellt, die
Glyceraldehyddehydrogenase (GAPDH), das BCL2-assoziierte-X-Protein (bax),
sowie Bcl-2.
Bcl-2 sowie das bax-Protein spielen eine Rolle beim programmierten Zelltod, der
Apoptose. Bekanntermaßen gibt es zwei Wege, den extrinsischen und den
intrinsischen, mitochondrialen, Weg der Apoptose.
Bax und Bcl-2, beide Mitglieder der Bcl-2-Familie, finden sich beim intrinsischen
Weg wieder. Hierbei wird das Mitochondrium durch verschiedene Proteine, sog.
Pro-apoptotische, wie z.B. bax, zur Ausschüttung von Cytochrom c angeregt. Auf
dem weiteren Weg findet man die Aktivierung der Zelle zum programmierten Tod.
Bcl-2 hingegen gehört zu den anti-apoptotischen Proteinen. [14 Debra]
50
Eine Unterstützung der Arbeitshypothese würde nach folgenden Ergebnissen
verlangen: Verminderte Expression von VEGF-A, EGFR und KDR würden die
Vermutung, dass AEE788 zu einer Beeinflussung dieser Wachstumsfaktoren und
ihrer Signalweitergabe führt, unterstützen. Inwieweit die Abläufe der Apoptose
involviert sind, sollte Expression von bax und Bcl-2 zeigen. Erhöhte bax und
verringerte Bcl-2 Werte im Tumorgewebe würden für eine Apoptoseinduktion
sprechen.
Die Auswertung der Daten der behandelten und unbehandelten Tiere führten zu
folgendem Ergebnis.
Abb.24 Graphische Auswertung der PCR
*p<0,05 vs Kontrolle
Ein signifikanter Unterschied ergibt sich hierbei nur bei der Expression des BCL2-
Proteins (p<0,05), mit deutlich geringerem Wert in der behandelten Gruppe, was für
einen Anstoß Richtung Apoptoseinduktion durch AEE788 gedeutet werden kann.
Zwar zeigt sich eine wünschenswert geringer ausgeprägte Expression von VEGF
und EGF-Rezeptor in den behandelten Tieren, allerdings nicht signifikant. Auch die
Apoptose scheint nach Ergebnissen der PCR nicht positiv durch die Behandlung
beeinflusst zu werden.
-2
0
2
4
6
8
10
BAX BCL2 VEGF VEGFR EGFR
Kontrolle
AEE788
*
51
5. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des dualen Tyrosinkinaseinhibitors
AEE788 bei oraler Applikation auf das Morrishepatom der Zelllinie MH-7777 bei
männlichen Buffalo-Ratten untersucht.
Das hepatozelluläre Karzinom gilt weltweit als fünfthäufigste Todesursache und
erweckt somit großes Interesse in der medizinischen und pharmakologischen
Forschung. Es ist bereits bekannt, dass das HCC zu den hochvaskularisierten
Tumoren des Menschen zählt und die Beeinflussung der
Wachstumsfaktorrezeptoren, welche am Gefässwachstum beteiligt sind, einen
Ansatzpunkt zur Therapie darstellen [9, 12, 47, 55, 89, 90]
Dieser Arbeit lag die Hypothese zugrunde, dass bei oraler Applikation des
Tyrosinkinaseinhibitors AEE788 sowohl die Aktivierung des EGF- als auch des
VEGF-Rezeptors vermindert und somit auch deren schlussendlicher Effekt, das
Tumorwachstum selbst, negativ beeinflusst werden können.
Die Arbeitsgruppe Ocker et al konnte im Maus-Modell einen solchen Effekt bereits
nachweisen. [56] Dabei untersuchte man sowohl die in vitro Wirkung von AEE788 in
der menschlichen Zelllinie HepG2 und der Zelllinie Heb3B, als auch den in vivo
Einfluss im Nacktmaus-Modell. Die Studie konnte eine Reduktion der
Proliferationsrate der Zellen und die Apoptoseinduktion nach Applikation des
Tyrosinkinaseinhibitors nachweisen.
In den Zellkulturen konnte nach einer Applikation von 10 µM AEE788 oder mehr
eine Apoptoseinduktion in den Zellen beobachtet werden. Die Auswertung des
Western-Blottings zeigte eine Reduktion der Expression der phosphorylierten, also
aktivierten, Form des EGF-Rezeptors und von EGF selbst, während VEGF und sein
Rezeptor unverändert im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen nachweisbar
waren. Die weiterführenden Signalwege der MAPK und der AKT wurden ebenfalls
untersucht, hierbei zeigte sich eine Suppression der P-MAPK und der p-AKT, die
Expression der inaktivierten Formen der Kinasen wurden durch die Behandlung
nicht verändert.
Im in vivo Versuch wurde männlichen Nacktmäusen ein HepG2-Heterotransplantat
subkutan beigebracht, anschließend wurden sie mit 50 mg/kg AEE788 dreimal
wöchentlich peroral behandelt, nachdem der Tumor eine Größe von 7mm im
Durchmesser erreicht hatte. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied im
Tumorwachstum zwischen behandelten und unbehandelten Tieren: die mittlere
Fläche betrug im Durchschnitt 59,6mm² bei den Kontrolltieren im Vergleich zu
13,2mm² bei behandelten Mäusen. Die immunhistologische Färbung mit dem Meca-
32-Antikörper, welcher gegen Endothelzellen in der Maus gerichtet ist, zeigte eine
52
signifikant verringerte Vaskularisierung in mit AEE788 behandelten Tieren. Auch
konnte eine verringerte Proliferationsrate, eine verminderte Expression von EGFR
und eine erhöhte Apoptoserate in der Immunhistochemie nachgewiesen werden.
Eine Down-Regulation des MAPK-Signalweges konnte auch im Mausmodell
nachgewiesen werden.
Die soeben kurz beschriebene Studie liegt dieser Arbeit und ihrer Arbeitshypothese
zugrunde. Um die Ergebnisse zu reproduzieren und anschließend eventuell andere
Applikationswege für AEE788 finden zu können, wurde AEE788 oral im
Homotransplantat der Zelllinie MH-7777 im Ratten-Modell verabreicht.
Den Buffalo-Ratten wurden Zellen der Linie MH-7777A orthotop in die Leber injiziert
und nach drei Wochen mit 50 mg/kg Körpergewicht zweimal wöchentlich für 21
Tage peroral behandelt. Makroskopisch zeigte sich ein signifikanter Unterschied im
mittleren Tumordurchmesser, 11,21 mm im Gegensatz zu 25,44 mm in der
Kontrollgruppe. Im Western-Blot konnte eine verminderte Expression der aktivierten
MAPK (P-MAPK) nachgewiesen werden, wohingegen alle anderen untersuchten
Proteine unverändert im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nachzuweisen
waren. Die immunhistologische Färbung mit dem Proliferationsmarker KI-67 zeigte
eine signifikante Abnahme der Proliferationsrate in behandelten Tieren, jedoch
konnte mittels TUNEL-Färbung kein signifikanter Unterschied in der Apoptosrate
nachgewiesen werden. Sowohl EGFR, P-EGFR, VEGF und P-VEGF zeigten eine
signifikant geringere Expression in der immunhistochemischen Färbung. Die PCR
zeigte eine signifikant verminderte Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2
in der behandelten Gruppe.
So kann die vorliegende Arbeit also einen Teil der bereits gewonnen Erkenntnisse
aus der Studie von Ocker et al [56] bestätigen bzw. wiederholen: beide Arbeiten
zeigen ein vermindertes Tumorwachstum nach Behandlung mit AEE788 und in
beiden Experimenten konnte eine verringerte Proliferationsrate, eine verminderte
aktivierte MAPK und eine verringerte Expression des EGF-Rezeptors gezeigt
werden.
Llovet et al [43] verwendeten AEE788 ebenfalls tierexperimentell im Nacktmaus-
Modell. Sie implantierten je Maus 5x106 Zellen der menschlichen Linie Huh7.
Anschließend wurden Gruppen von je 9 bzw. 7 Tieren ein Placebo, AEE788,
RAD001(Everolimus) oder eine Kombination aus beiden Medikamenten oral
verabreicht. Die mit AEE788 behandelten Tumoren zeigten sowohl eine signifikante
Wachstumshemmung, als auch eine Verlängerung der Überlebenszeit, verglichen
mit der Placebo-Gruppe. Die immunhistochemische Auswertung zeigte außerdem
einen signifikanten Anstieg der Apoptoserate in der mit dem Tyrosinkinaseinhibitor
53
behandelten Gruppe. Auch eine Abnahme der immunhistochemischen Reaktivität
von p-EGFR in behandelten Tumoren konnte nachgewiesen werden.
Beide Arbeiten, sowohl die vorliegende als auch die Studie von Llovet et al,
kommen zu dem Ergebnis, dass die Gabe von AEE788 das Tumorwachstum hemmt
und weisen eine signifikante Abnahme der Expression des aktivierten EGF-
Rezeptors nach.
Auch in anderen Tumoren kommen Forschungsarbeiten zu AEE788 zu einem
ähnlichen Ergebnis. So konnte zum Beispiel in Schilddrüsenkarzinomzellen eine
Apoptoseinduktion und Proliferationshemmung gezeigt werden. Auch hier wurde
eine verminderte Expression von P-EGFR, P-VEGFR, P-AKT und P-MAPK als
Grund für das verminderte Wachstum gefunden. [31]
Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit belegt also eine Wachstumshemmung
durch AEE788 in der Ratten-Hepatomzellinie MH-7777 nach oraler Applikation..
Die Wachstumsverzögerung scheint durch eine Aktivitätsminderung im MAPK-
Signalweg vermittelt zu werden, worauf man aus der vermindert P-MAPK-
Expression schließen kann, wie z.B. auch in der Arbeit von Ocker et al [56] gezeigt
wurde. Dass sich eine Abnahme der Expression der p-AKT und p-MAPK nicht
eindeutig feststellen lässt, kann durch mehrere Umstände begründet sein:
Mögliche technische Fehler wurden bereits während der Analysearbeit vermutet.
Aus diesem Grund wurden das Blotting und die PCR nach Überprüfung und
Kontrolle der einzelnen Arbeitsschritte erneut durchgeführt. Da sich jedoch auch
durch mehrmalige Wiederholungen der Westernblots inklusive vorausgehender
Proteinextraktion und Konzentrationsbestimmung, sowie der PCR inklusive RNA-
Gewinnung, keine eindeutigen Ergebnisse zeigen ließen, konnte die fehlerhafte
Durchführung der Analyse als Fehlerquelle ausgeschlossen werden.
Die vorliegende Arbeit berücksichtigt in ihrer Auswertung alle wichtigen Schaltstellen
der durch die Wachstumsfaktoren EGF und VEGF verwendeten
Signaltransduktionsmechanismen, d.h. die MAPK und die AKT. Darüber hinaus
wurde in der PCR versucht, eine mögliche Apoptoseinduktion nachzuweisen.
Eventuell hätten andere Schlüsselstellen, wie etwa die mTOR berücksichtigt werden
müssen, um ein noch klareres Ergebnis herauszustellen.
Beim Vergleich mit den Arbeiten der oben genannten Arbeitsgruppen muss
außerdem bedacht werden, dass zwischen den Studien bedeutende Unterschiede
in der Durchführung bestehen. Zwar wurde das gleiche Medikament verabreicht,
jedoch unter unterschiedlichen Bedingungen: Sowohl Ocker et al [56], als auch
Llovet et al [43], verwendeten männliche Nacktmäuse. Bei diesen Tieren handelt es
sich um immundefiziente Lebewesen, wohingegen die in dieser Arbeit verwendeten
54
Buffalo-Ratten immunkompetente Tiere sind. Den Ratten wurde das
Tumortransplantat orthotop in die Leber gesetzt, den Mäusen wurden die
Tumorzellen subkutan in die Flanken injiziert. Diese beiden Tatsachen sprechen für
ein wesentlich komplexeres System in den hier verwendeten Ratten, sodass ein
Vergleich zwischen den Arbeiten erschwert ist.
Zu berücksichtigen bleibt auch die Anzahl der Versuchstiere. Durch die kleine
Gruppengröße von jeweils fünf Tieren wird das Erbringen signifikanter Werte
erschwert, denn „Ausreißer“ verzerren sofort das Bild.
Festzuhalten bleibt also der Nachweis einer eindeutigen Proliferationshemmung
durch AEE788, welche möglicherweise durch eine Inhibition der Aktivierung des
EGF-Rezeptors und des anschließenden MAPK-Signalweges erreicht wird. Dass
der VEGF-Rezeptor im Gegensatz zum EGF-Rezeptor ein geringeres Ansprechen
auf den Tyrosinkinaseinhibitor zeigte, könnte durch die geringere Affinität von
AEE788 zum VEGFR erklärt werden. [78] Doch wie zum Beispiel die vergleichende
Analyse verschiedener molekularer Therapien von Greten et al [21] zeigt, außerdem
erscheint zumindest der alleinige Ansatz am VEGFR in der HCC-Therapie als wenig
erfolgversprechend. Dies würde die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stützen, da
wir den Grund für die Proliferationshemmung im Hepatom vor allem in der Inhibition
des EGF-Rezeptors gefunden haben.
Ebenso wie eine Sensibilisierung der Zellen in Richtung Apoptose: die Expression
von bcl-2 war in behandelten Tumoren signifikant erniedrigt. Allerdings finden sich in
der Literatur Angaben über eine vergleichsweise geringe Expression von bcl-2 in
Zellen des hepatozellulärem Karzinoms, sodass dies die Erklärung für einen nicht
genügenden Anstoß Richtung Apoptose sein könnte. [11]
Was bedeutet diese Ergebnisse nun für die Verwendung von AEE788 in der
Therapie des HCC?
Mit der Suche nach einer geeigneten systemischen Therapie will man vor allem
einen Ansatz für die fortgeschrittenen Tumorstadien finden. Bislang konnte keine
Substanz identifiziert werden, die zu einer Heilung führen konnte, jedoch ist dies
auch nicht das erklärte Ziel einer solchen Therapie, sondern vielmehr die
Verlängerung der progressionsfreien Überlebenszeit und der
Gesamtüberlebenszeit.
In bisherigen Phase II Studien zu Tyrosinkinaseinhibitoren wurde in den seltensten
Fällen eine Vollremission erreicht. Eine Verlängerung des progressionsfreien-
Überlebens stellt jedoch für jeden Tumorpatienten, sofern die dafür notwendige
Therapie nicht zu viele Nebenwirkungen verursacht, einen Zugewinn an qualitativ
55
hochwertiger Lebenszeit dar. Und zumindest eine Verlängerung der mittleren
Überlebenszeit konnte für AEE788 im Tiermodell bereits gezeigt werden. [43]
Vermutlich kann einer Therapie, welche einen Wachstumsstopp im HCC
hervorrufen kann, nicht nur ein Ziel, wie etwa alleinig der EGF- oder VEGF-Rezeptor
zugrunde liegen. Die vorliegende Arbeit lässt den richtigen Weg, mehrere
Zielmoleküle anzugehen, bereits erkennen. Interessant wäre eventuell eine
Kombination von AEE788 mit bereits erprobten systemischen Therapien, wie etwa
Sorafenib. Möglicherweise könnte eine solche Kombination sich gegenseitig in ihrer
Wirkung potenzieren.
Zu erproben bleibt auch eine andere Art der Medikamentenapplikation. Die
transarterielle Chemoembolisation, welche derzeit in palliativen Fällen unter
Verwendung herkömmlicher Zytostatika wie etwa Cisplatin oder Doxorubicin
durchgeführt wird, könnte ebenfalls durch den Effekt von AEE788 potenziert
werden, indem verbleibende Zellen nach herkömmlicher Chemotherapie erneut
durch AEE788 angegegangen, und in ihrem Wachstum gehemmt werden. Man
würde eine höhere Konzentration am Tumor erreichen, ohne eine erhöhte
systemische Belastung einzugehen.
Für Studien zur Verabreichung via TACE ist das Rattenmodell besser geeignet als
die bisher verwendeten Nacktmaus-Modelle. Zum einen erleichtert die Größe der
Ratten das Handling mit zur Verabreichung notwendigen Instrumenten, zum
anderen gibt es mit den Morrishepatom-Zellen ein gut erprobtes orthotopes HCC-
Modell. Empfehlenswert wäre eine eventuelle Wiederholung der Studie mit
vergleichender kombinierter Medikamentengabe oder Gabe von AEE788 via TACE.
Zusammenfassend konnten mit der vorliegenden Arbeit einige der bereits
bekannten Ergebnisse in der Behandlung hepatozellulärer Karzinome im Tiermodell
mit AEE788 bestätigt werden. Sie zeigt, dass das Verständnis der molekularen
Vorgänge auf Ebene der Signaltransduktion in der Hepatokarzinogenese weiterhin
wichtigster Bestandteil für die Erforschung einer systemisch medikamentösen
Therapie des HCC bleibt. Eine gleichzeitig auf mehrere Ziele ausgerichtete Therapie
scheint der richtige Ansatz zu sein, eine verlängerte Überlebenszeit bei Patienten
mit fortgeschrittenem HCC zu erreichen. Der Anfang der Suche nach einer solchen
Therapie ist gemacht und AEE788 könnte eine Rolle dabei spielen.
56
6. Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung AFP Alpha-Feto-Protein AKT Proteinkinase B BCLC Barcelona Clinic Liver Cancer CT Computertomographie cDNA complementary deoxyribonucleic acid EGF endothelial growth factor EGFR endothelial growth factor receptor GIST Gastrointestinale Stromatumoren HBsAg Hepatits B surface Antigen HBV Hepatitis B Virus HCC hepatozelluläres Karzinom HCV Hepatitis C Virus HE Hämatoxylin-Eosin ICH Immunhistochemie KIT stemm cell factor receptor MAPK Mitogen-aktivierte-Proteinkinase MRT Magnetresonanztomographie NASH nicht-alkoholische Steatohepatitis NET neuroendokrine Tumoren OLT orthotope Lebertransplantation P- phosphoryliert PCR polymerase chain reaction PEI perkutane Ethanolinjektion PIGF Plazentawachstumsfaktor Rb Retinoblastomgen RFA Radiofrequenzablation RNA ribonucleic acid SEM standard error of the mean TACE transarterielle Chemoembolisation TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling VEGF vascular endothelial growth factor VEGFR vascular endothelial growth factor receptor vHL von-Hippel-Lindau-Gen
57
7. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Pro- und antiangiogentische Faktoren ..................................................................... 5
Tabelle 2 Antiangiogeneteische Medikamente in der Krebstherapie ..................................... 7
Tabelle 3 TNM-Klassifikation des HCC ................................................................................... 16
Tabelle 4 Barcelona Clinic Liver Cancer Klassifikation[45] ..................................................... 17
Tabelle 5 Child-Pugh-Score .................................................................................................... 17
Tabelle 6 Chemikalien und Verbrauchsmittel ........................................................................ 24
Tabelle 7 Antikörper .............................................................................................................. 25
Tabelle 8 Light-Cycler-PCR-Primer ......................................................................................... 25
Tabelle 9 Verbrauchsmittel .................................................................................................... 26
Tabelle 10 Fertigkits ............................................................................................................... 26
Tabelle 11 Geräte ................................................................................................................... 26
Tabelle 12 Substanzen und Medikamente............................................................................. 27
8. Abbildungsverzeichnis
Abb.1 Signaltransduktion nach EGFR- und VEGFR-Aktivierung in der Zelle [21] ............... 4
Abb.2 Angiogenese im Tumor [40] ..................................................................................... 6
Abb.3 Klassifikation in geographische Zonen unterschiedlich hoher Inzidenzraten [61] .. 9
Abb.4 Graphische Veranschaulichung der Verteilung der unterschiedlichen
Inzidenzzonen ........................................................................................................................ 10
Abb.5 Simultane HBV bzw. HCV Infektion bei Patienten mit HCC, länderspezifisches
Vorkommen [80] .................................................................................................................... 12
Abb.6 Therapiealgorithmus nach der BCLC-Klassifikation [14] ........................................ 18
Abb.7 Beispiel einer repräsentativen unbehandelten Kontrolle...................................... 40
Abb.8 Beispiel eines repräsentativen mit AEE788 behandelten Tieres ........................... 41
Abb.9 Darstellung der Western Blots ............................................................................... 42
Abb.10 Densitometrische Auswertung des Western Blot .................................................. 42
Abb.11 Vergleichende Darstellung des Verhältnisses P-MAPK/MAPK und P-AKT/AKT ..... 43
Abb.12 Graphische Auswertung KI67-Färbung .................................................................. 44
Abb.13 KI67-Färbung, 20x Vergrößerung ........................................................................... 44
Abb.14 Graphische Auswertung TUNEL-Färbung ............................................................... 45
Abb.15 TUNEL-Färbung, 20x Vergrößerung ....................................................................... 45
Abb.16 Graphische Auswertung EGFR-Färbung ................................................................. 46
Abb.17 Graphische Auswertung VEGFR-Färbung ............................................................... 46
Abb.18 Graphische Auswertung P-EGFR-Färbung ............................................................. 47
Abb.19 Graphische Auswertung P-VEGFR-Färbung ........................................................... 48
Abb.20 VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung ....................................................................... 48
Abb.21 EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung ......................................................................... 48
Abb.22 P-VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung .................................................................... 49
Abb.23 P-EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung ...................................................................... 49
Abb.24 Graphische Auswertung der PCR ........................................................................... 50
58
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10. Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Matthias Ocker möchte ich für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe danken. Über seine Zeit an der Medizinischen Klinik 1 der Friedrich-Alexander-Universität hinaus stand er mir jederzeit mit Rat und Tat zur Verfügung und hat so maßgeblich zum Erfolg dieser Dissertation beigetragen.
Weiterhin möchte ich mich bei den Mitgliedern der ehemaligen Arbeitsgruppe bedanken. Allen voran bei den Technischen Assistentinnen Astrid Taut und Isabel Zeitträger, die immer ein offenes Ohr für alle Fragen hatten. Außerdem bei Dr. med. Till Wissniowski und Dr. med. Susanne Gahr für ihre Hilfe bei der Durchführung der tierexperimentellen Arbeiten. Ebenfalls bedanken möchte ich mich für die hervorragende Unterstützung bei der Auswertung der Ergebnisse bei Dr. med. Karl Quint. Nicht unerwähnt möchte ich Herrn Dr. Thomas Appl für seine Hilfestellung am Mikroskop lassen.
Zu guter Letzt möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die sich meine Arbeit zu Gemüte geführt und Korrektur gelesen haben: meinem Bruder Dominik, Herrn Dr. Christian Dreyer und meinem Freund Lukas Koch-Weser, der mir zudem während der ganzen Zeit eine große Hilfe und moralische Stütze war.
67
11. Lebenslauf
Nicht in Veröffentlichung enthalten.