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Zentrum Angewandte Chemie Institut für Technische Chemie Callinstr. 5, 30167 Hannover Mittel- und Nahinfrarotspektroskopie zur Online- Überwachung von CHO-Kultivierungen M. Sandor 1 , F. Rüdinger 1 , R. Bienert 2 , D. Solle 1 , C. Grimm 2 , T. Scheper 1 1 Institut für Technische Chemie, Leibniz Universität Hannover, Callinstraße 5, 30167 Hannover 2 Sartorius Stedim Biotech GmbH, August-Spindler-Straße 11, 37079 Göttingen Einleitung CHO-Zellen (chinese hamster ovary) gehören in der pharmazeutischen In- dustrie zu den am häufigsten eingesetzten Säugertierzellen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen. Eine Online-Überwachung von CHO-Kultivie- rungen ermöglicht es, den Prozess genauer zu verstehen und auf Änderun- gen sofort reagieren zu können. Mit Hilfe der Nah- und Mittelinfrarotspektroskopie können mehrere kritische Prozessvariablen (Analytkonzentration, Zelldichte) in situ überwacht werden. Mittels multivariater Datenanalysen können für jeden einzelnen Analyten Kalibrationsmodelle erstellt werden, die zur Quantifizierung des Analyten in Echtzeit verwendet werden. CHO-Kultivierung Für die Evaluierung der Infrarotspektroskopie wurde die Zelllinie CHO-K1-HP (Universität Bielefeld, AG Zellkulturtechnik) in einem komplexen Kulturme- dium (TC-42, TeutoCell AG, Bielefeld) kultiviert. Alle Kultivierungen erfolgten in einem 10-L-Edelstahl-Reaktor (BIOSTAT® Cplus, Abb. 1). Eine detaillierte Beschreibung der Kultivierungsparameter befindet sich in Tab. 1. Abb. 1: BIOSTAT® Cplus 10-L-Bioreaktor mit NIR- und MIR-Spektrometer. BIOSTAT® Cplus NIR-Spektrometer MIR-Spektrometer 10-L-Bioreaktor IR-Spektroskopie 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1 2 3 4 5 6 7 8 Viabilität (%) Zeit (h) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Laktat (g/L) Zeit (h) 1 2 3 4 5 6 7 8 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 Glucose (g/L) Zeit (h) Abb. 3: Glucoseverlauf inklsuvie Feed (links), Laktatverlauf (rechts). 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 2 3 4 5 6 7 8 Zelldichte (Mio. Z/mL) Zeit (h) Abb. 4: Entwicklung der Zelldichte (links) und der Viabilität (rechts). Abb. 5: NIR - Kalibration (links) und Vorhersage der Zelldichte (rechts). NIR RMSEC RMSEP RMSEP R 2 DVB PC Glucose 1,21 g/L 0,42 g/L 10,4 % 0,77 SNV 4 Laktat 0,43 g/L 0,37 g/L 18,5 % 0,86 SNV 5 Zelldichte 1,08 Mio. Z/mL 0,39 Mio. Z/mL 5,4 % 0,97 keine 2 Viabilität 4,25 % 3,62 % 7,3 % 0,92 keine 4 Tab. 3: NIR-Ergebnisse Tab. 4: MIR-Ergebnisse 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Gesamtzelldichte (Mio. Z/mL) Zeit (h) Vorhersage Referenz 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 Glucose (g/L) Zeit (h) Vorhersage Referenz 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Vorhersage (Mio. Z/mL) Referenz (Mio. Z/mL) Gesamtzelldichte R 2 = 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Vorhersage (g/L) Referenz (g/L) Glucose R 2 = 1 Zusammenfassung und Ausblick NIR- und MIR-Spektroskopie können dazu verwendet werden kritische Vari- ablen online bei einer CHO-Kultivierung zu überwachen. Beruhend auf Lichtstreueffekten, die durch CHO-Zellen hervorgerufen wer- den, eignet sich die NIR-Spektroskopie hervorragend zur Bestimmung der Zellzahl. Aufgrund der Feed-Experimente ist es möglich Glucose unabhängig von der Zellzahl zu bestimmen. Neben Lactat ist auch die Vorhersage der Viabilität möglich. Während der Apoptose ändert sich die Zellmorphologie, die einen Einfluss auf die NIR-Absorption hat. Dieser Effekt steht im Fokus weiterer Untersuchungen. Mittels der MIR-Spektroskopie ist es möglich auch geringe Konzentrations- änderungen von Glucose und Lactat zu detektieren und quantitativ vorher- zusagen. Die Vorhersage der Zellzahl ist mittels MIR nicht direkt möglich. Vorhersagen von Glutamin sind wegen der geringen Konzentrationen von unter 1 g/L nicht möglich. Weitere Möglichkeiten der Prozesskontrolle beruhen auf dem Einsatz von Prozesstrajektorien. Ideal verlaufende Kultivierungen („golden batch“) dienen hierbei als Referenzmaßstab. Anhand der IR-Spektroskopie kann ein abdrif- ten vom idealen Verlauf zeitnah erkannt werden. Der Vorteil dabei ist, dass keine zeitraubende Probenahme inklusive Analytik notwendig ist, da nur die IR-Spektren verwendet werden. Abb. 6: NIR - Kalibration (links) und Vorhersage der Glucosekonzentration (rechts). Projekt gefördert durch: Sartorius AG Abb. 2: MATRIX-MF (links, Bruker Optik GmbH) und BioPAT® Spectro (rechts, Sartori- us Stedim Biotech GmbH). Eigenschaften BioPAT® Spectro MATRIX-MF Spektralbereich 1050 - 1650 nm 3000 - 700 cm -1 Detektor Diodenarray (InGaS) MCT (Peltier-Element) Optische Anbindung Freistrahloptik ATR-Sonde (2x Diamant) Messzeit pro Spektrum 1 min 2 min (1000 Scans) Software SX-Center 2.1 OPUS 6.5 Tab. 2: Geräteeigenschaften - NIR- und MIR-Spektrometer Parameter Bedingungen Kulturmedium TC-42 inkl. HT, 8 mM L-Glutamin Rührerdrehzahl 200 rpm Rührwerk 6-Blatt Rushton + 3-Blatt Propeller Temperatur 37 °C pH-Wert 7,1 Begasung Ringsparger + Overlay, pO 2 40 % bei 0,1 bar Animpfdichte 4 · 10 5 Z/mL Tab. 1: Geräteeigenschaften - NIR- und MIR-Spektrometer Ziel der Arbeit war es, reproduzierbare Kultivierungen durchzuführen und die Varianzen zwischen den Kultivierungen gering zu halten. Durch Zufütterung von Glucose und Glutamin wurden korrelierende Verläufe der Analyten bewusst durchbrochen. Auf diese Weise können Glucose und die Zelldichte bzw. Glucose und Laktat im Spektrum unterschieden werden. Das Ziel ist es robuste multivariate Kalibrationsmodelle für jeden Analyten zu erstellen, die nicht durch andere Analyten beeinflusst werden. Die Abb. 3 und 4 zeigen die Konzentrationsverläufe von Glucose und Laktat, sowie der Viabilität und der Zelldichte. 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 Online Referenz Glucose (g/L) Zeit (h) -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6 4.0 Online Referenz Laktat (g/L) 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 Vorhersage (g/L) Referenz (g/L) Glucose R 2 = 1 Abb. 7: MIR - Kalibration für Glucose (links); Vorhersage für Glucose und Laktat (rechts). Kalibration und Validierung Für jeden Analyten und jede Spektroskopieart wurden drei bis fünf Kulti- vierungen ausgewählt und je ein Kalibrationsmodell mittels „partial least squares regression“ (PLSR) erstellt. Die Kalibrationsmodelle werden anhand weiterer Kultivierungen, die nicht Teil der Kalibration sind, validiert. Als mul- tivariate Software wurde der Unscrambler X Ver. 10.1 (Camo, Norwegen) verwendet. Für die Kalibration und Validierung wichtige Größen sind der RMSEC und RMSEP (root mean square error of calibration and prediction). Ein niedriger RMSEP gibt an, dass das Modell gut auf neue Kultivierungen übertragbar ist. Abb. 5 und 6 zeigen die Vorhersage der Zelldichte bzw. Glucose mittels NIR mit jeweils einem niedrigen RMSEP (Tab. 3). Angegeben ist auch die Me- thode der angewendeten Datenvorbehandlung (DVB). Im Vergleich zum NIR lassen sich anhand der MIR-Spektroskopie Analyte wie Glucose und Lactat gerade bei niedrigen Konzentrationen genauer vorhersagen (Abb. 7, Tab. 4). MIR RMSEC RMSEP RMSEP R 2 DVB PC Glucose 0,07 g/L 0,09 g/L 2,7 % 0,99 Detrend 2 5 Laktat 0,13 g/L 0,10 g/L 5,9 % 0,99 Detrend 2 3 Zelldichte 1,28 Mio. Z/mL 0,99 Mio. Z/mL 11,2 % 0,95 Detrend 2 5
