Acta histochem. 64, 157 -163 (1979)

A~s dem C. und O. VOGT-Institut fUr Hirnforschung. der Universitat Diisseldorf

(Direktor: Prof. Dr. A. HOPF)

Mikrophotographie von Autoradiogrammen

Photomicrography of autoradiographs

Von JURGEN KONRAD MAl und S'fEFAN POST

Mit 4 Abbildungen ~nd Tafel VI

(Eingegangen am 27. Oktober 1978)

Zusammenfassung

I Die allgemein iibliche photographische Dokumentation von Autoradiogrammen mittels ent­weder D~nkelfeld-oder Hellfeld-Durchlicht-Bele~chtungbesitzt den Nachteil, Silberkornansamm­lungen nur mit Schwierigkeit mit der Schnitt- bzw. Strukt~rtopographiezur Deckung bringenzu konnen. Daraus ergeben sich trotz des prinzipiell hohen Amlosungsvermogens (das mit dieserMethode erzielt werden kann) Schwierigkeiten, die Beziehung zwischen inkorporierter Radio­aktivitat einerseits ~nd topographischen Parametern andererseits zu definieren. Es werden Vor­schlage gemacht, wie die Dok~mentationdes Silberkornverteilungsm~stersiiber groJJeren Schnitt­arealen und bei mittleren mikroskopischen VergroJJer~ngenverbessert werden kann. Letztereswird durch eine einfache Modifikation der Dunkelfeldbele~chtungerreicht.

Summary

It is often desirable to delineate the areas of a~toradiogramswhere acc~mulationsof silvergrains are observed in order to establish topographic landmarks. This is prevented by either brightfield or darkfieldill~minatiatedphotographs, where the topography of the silver grains is neglecteddespite the high resolution obtainable by autoradiography, but may be done by taking advantageof a modification of dark field illumination thus generating an additional bright field effect. Thismodification aleo enables to correlate selective histochemical reaction sites with the area of silvergrain accumulation.

Einleitung

Die autoradiographische Technik gestattet die Durchfiihrung funktionell mor­phologischer Untersuchungen ohne Beeintrachtigung der strukturellen Integritatdes untersuchten Organs. Sie hat sich daher eine hervorragende Stellung innerhalbder histologischen Techniken erobert. Obwohl die in der Emulsionsschicht entstehen­den photographisch entwickelten Schwarzungsbilder (Autoradiogramme) in direk­tem Verhaltnis zu Vertdlung und Menge (ortsgebundenen) radioaktiv markiertenMaterials stehen, ist die zur Zeit geiibte Dokumentation der mit dieser Technik er-

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hobenen Befunde noch unbefriedigend. Sie erfolgt fast ausnahmslos mittels Hell­feld- (HF-) sowie Dunkelfeld- (DF-) Photographie oder der zeichnerischen Darstel­lung von Silberkorndichten.

Die HF-Photographie laBt sich wegen der geringen StrukturgroBe der Silberkornernur bei hohem VergroBerungsmaBstab anwenden, wobei auf Farbungen verzichtetwerden muB, bei denen der Kontrast (Grauwertunterschied) zwischen Strukturelemen­ten und Silberkornern gering ist. Die hohe VergroBerung bedingt wegen der unter­schiedlichen Fokusebene zwischen Schnitt und Silberkornern eine erhebliche Beein­trachtigung der photographischen Qualitat und macht die Darstellung der topischenAnordnung der SiIberkorner in groBeren Schnittarealen unmoglich.

Bei Analyse der Autoradiogramme im Dunkelfeld geht andererseits die Beziehungder deutlich erkennbaren Markierungsbereiche zu histologisch odeI' selektiv histo­chemisch gefarbten Schnittarealen verloren.

Die zeichnerische Darstellung negiert sowohl quantitative MeBgroBen (Silber­korn-Anzahl, -Konzentration) als auch die Lokalisierbarkeit del' SiIberkorner in mikro­skopischen Dimensionen.

Fur die Neuroanatomie als speziellem Anwendungsgebiet der Autoradiographiemussen die beobachtete Dichte und Verteilungsart der Silberkorner in enge Beziehungeinerseits zur allgemeinen zerebralen Topographie (Schnittopographie) und anderer­seits zu histologisch definierten Arealen und deren Substruktur (spezielle Topographie)gebracht werden. Fur beide Zielsetzungen sollen im folgenden Verbesserungsvor­schlage der Dokumentation autoradiographischer Befunde unterbreitet werden, dieuber das erwahnte Anwendungsbeispiel hinaus gelten.

Methode und Resultate

1. Beziehung markierter Areale zur Schnittopographie

Abbildung 1 zeigt die retlaive Silberkornverteilung im Bereich del' gekreuzten subcortiealenProjektion optischer Fasern nach Injektion tritiierten Leueins in den Augapfel del' Albinoratte.Die Darstellung del' Silberkornverteilung als Konzentration von SchwB.rzungspunkten al.l-fweil3emBildtrager ergibt ubersiehtliche und topographisch leieht einzuordnende Abbildungen, die dieBeziehung auch zu raumlieh getrennten Markierungsarealen herstellen.

Fur diese Darstellungsart wurden von relevanten Arealen des Autoradiogramms unter kon­stanteI' Beleuchtung (Leitz-Trocken-Kondensor D 0,80) und konstanter Belichtungszeit Negativeauf Dokumentenfilm hergestellt. Hiervon wurden Kontaktabziige als Zwischenpositive und End­kopien angefertigt, aus deren Montage sich komplexe Darstellungen, wie in Abb. 1 gezeigt, er­geben. Unter Verwendung ausreichend grol3er Bildtrager fUr die Zwisehen- und Endkopien (34 X30 em) entfiillt die langwierige Verarbeitung von Einzelabziigen, da alle Abbildungen denselbenstandardisierten photographischen Bedingungen unterworfen sind. Daher steht die Darstellungmarkierter Areale in engel' Korrelation zUI' tatsachlichen Silberkornanzahl sowohl del' Einzel­abbildungen als del' Vergleichsschnitte. Die auf die Zeichengrundlage montierten Endkopienwurden mit den wesentlichen Schnittmerkmalen mittels Projektionsmikroskop umzeiehnet. Diehistologisehe Charakterisierung wurde durch die Angabe stereotaktiseher Daten erganzt; del' Ver­grol3erungsmal3stab bleibt bei allen Montagen konstant.

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Mai und Post

VEB GUSTAV FISCHER VERLAG lENA

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Abb. 1. Verteilung der Silberkorner im VerIauf des visuellen Systems der Albinoratte. Die Silber­kornansammlungen (schwarz) entsprechen radioaktiv markiertem Material innerhalb der Seh­fasern und -zentren nach ocularer Applikation von tritium-dotierten Aminosauren. Frontal­schnittserie durch das Gehirn der Albinoratte im Abstand von jeweils 200 p.m. Positivkopien vonDunkelfeldaufnahmen mit Cresylviolett gefarbter Prapai'ate, die mit Hilfe eines Projektionsmikro­skops umzeichnet und montiert wurden. (Abkiirzungen: AP = Area praetecti; dcgl = Corpusgeniculatum laterale, pars dorsalis; vcgl = Corpus geniculatum laterale, pars ventralis; as =

Colliculus superior; T 11 = Tractus opticus.

2. Beziehung der einzelnen Silberkorner zur Cyto- und Myeloarchitek­tonik (spezielle Topographie)

Urn die Zuordnung von Silberkornern zu Perikaryen, Nervenfasern und praterminalen Struk­turen liber gro13eren Arealen im Lichtmikroskop erkennen zu konnen, haben wir 2 Verfalmmentwickelt, die ohne umstandliche Eingriffe und ohne finanziellen Aufwand an jedem Mikroskopangewandt werden konnen, das mit einem Trocken-DF-Kondensor ausgestattet ist. Im Prinzipwurde ein Teil der konvergenten DF-Strahlung zwischen Kondensor und Praparat in die optischeAchse abgelenkt und dadurch ein zusatzlicher Hellfeldeffekt erzeugt.

Verfahren a: Der Hellfeldeffekt wird durch Streuung eines Teils der DF-Strahlung in einem dif­fus lichtbrechenden Medium erzeugt. Dies wird durch eine Reihe von Manipulationen zwischenObjekt- und Kondensorebene erreicht (z. B. durch Auflage einer aufgerauhten Glasscheibe bzw.eines feinen gespannten Nylonma~chengittersauf dem Kondensor, oder, mit den giinstigsten Er­gebnissen, durch Anbringen eines Tropfens einer lichtbrechenden Aufschwemmung an der Unter­seite des Objekttragers, z. B. der belichteten Emulsion, die in der Autoradiographie Anwendungfand (vgl. Tafel VIa).

Verfahren b: Der Hellfeldeffekt wird durch Ausblendung der aUS dem unteren Anteil der Grenz­flache des Kondensors austretenden Strahlen \Uld deren anschlie13ende mehrfache Reflektion an2 Aluminiumplattchen (A, B, in Tafel VIb) und einen Reflektionskonus (C) erreicht. Diese ab­gelenkten Strahlen treten durch die zentrale Offnung des Plattchens B in 8.chsenparalleler Anord­nung auf das Praparat (P). Durch Veranderung des Durchmessers des leicht austauschbaren Platt­chens B oder durch Auflage von Graufiltern auf dessen zentrale Offnung oder durch Anderung

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Abb. 2 und 3

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Abb. 4

Abb. 2 bis 4. Anwendungsbereich der Dunkelfeldbeleuchtung (Verfahren b) zur SchwarzweiJ3·

Photomikrographie bei verschiedenen Vergro£!erungen. Abb. 2: Ubersichtsaufnahme eines Frontal­

schnitts durch die Area praetecti der Ratte (Luxol-Fast-Blue-Cresylviolett-Farbung; Objektiv4: I). Abb. 3: Detailaufnahme des in Abb. 2 schwarz umrandeten Areals; Markierung liber dem

Nucleus praetectalis (Objektiv 10: I). Abb. 4: Detailaufnahme des in Abb. 2 wei£! umrandetenAreals im Bereich der Commissura posterior (Objektiv 25: I).

der Form (Wolbung, i. e. Reduktion der Streuung zwischen Austrittsoffnung und Prii.parat) lii.l3tsich der Anteil des Hellfeldes in weiten Grenzen variieren.

Wegen der Trennung der Strahlenwege fiir Dunkel- und Hellfeldanteilla£!t sich das Hellfeldisoliert durch Auflage von Farbfiltern (0,8 X 0,8 em aus einem Farbfolienfiltersatz fUr Dunkel­kammergebrauch) verandern. Dies bedeutet insbesondere fUr die Farbmikrophotographie, dal3der Farbwert des histologischen Praparates akzentuiert werden kann, ohne da£! die Intensitatder reflektierenden Silberkorner beeintrachtigt wlirde. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens

gegeniiber dem vorher geschilderten besteht in der Konstanz der Beleuchtungsverhaltnisse (vgl.

Serienaufnahme von Tafel VI) und der Homogenitat des Hellfeldes.

Diskussion

Nur die gleichzeitige Erfassung von Silberkorndichten und -Verteilungsmustern mit histolo­

gischen und (stoff-, enzym-, immuno-) histochemischen Parametern gibt den gesamten Informa­

tionsgehalt von Autoradiogrammen wieder. Es bedeutet daher einen Verzicht auf wesentliche

Vorteile der Autoradiographie, wenn nicht Struktur und Silberkorner gleichzeitig dokumentiert

werden. Urn dieses Ziel zu erreichen, wurden in der Vergangenheit verschiedene Vorschlage unter­breitet. Wegen des giinstigeren Auflosungsvermogens, des hoheren Kontrastes und der gesteiger­

ten Fokusbreite der DF-Beleuchtung (siehe DORMER [1972]; EKTINGH und CAPOWSKI [1972])wurden diese in der Regel mit anderen Beleuchtungsverfahren gekoppelt.

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Die Autoren empfahlen die Doppelbelichtung mit alternativer DF- und HF-Beleuchtung(ROGERS 1964; MONTERO 1976) oder - bei ungefarbten Schnitten - die wechselweise DF- undPhasenkontrastbeleuchtung (BRUCK 1967). Da die verwendeten Beleuchtungssysteme in der Regelnicht simultan anwendbar sind, mussen diese gewechselt werden, was umstandlicher Rejustierungbedarf, da sich selbst geringe Abweichungen der mechanischen Teile sowohl in der Langs- als inder Abbildungsachse als Beleuchtungsschwankungen bemerkbar machen mussen. Zusatzlich ent­stehen Schwierigkeiten in der Abstimmung der Relation der Hellfeld- und Dunkelfeldanteile. Dies

bedeutet eine empfindliche Einschrankung der Abbildungsqualitaten, besonders dann, wenn sehrunterschiedliche Silberkorndichten erfaJ3t werden, oder wenn Serienphotographien hergestelltwerden. Bei dem hier vorgestellten Verfahren hingegen entfallen diese Schwierigkeiten (vgl. Ta­fel VI). Die Helligkeits- und Farbabstimmung sind direkt optisch kontrollierbar. Die Praparatelassen sich mittels einer automatischen Mikroskopkamera problemlos photographieren.

In der kombinierten Hellfeld-Dunkelfeldabbildung erscheinen die Silberkorner, wie bei derDF-Beleuchtung als leuchtende Punkte, wiihrend sich der histologische Schnitt homogen ausge­

leuchtet darstellt.Der Anwendungsbereich dieser Methode erstreckt sich auf denselben VergroJ3erungsbereich

wie er fur die reine DF-Mikroskopie mit dem Trocken-Kondensor akzeptabel ist (Abb. 2-4).Neben den Vorteilen, die sich aus dem Wegfall von Beleuchtungsproblemen und aus dem Ver­

zicht auf aufwendige photographische Methoden ergeben, ist fUr den praktischen Gebrauch dieTatsache hervorzuheben, daJ3 bei dieser Beleuchtungstechnik storende Reflexionen (z. B. durchkleine Staubpartikel), die bei reiner DF-Photographie meist mit groJ3em Zeitaufwandt entferntwerden mussen, weitgehend entfallen. AuJ3erdem wird die Interpretation des Schnittes dadurcherleichtert, daJ3 sich nicht nur aile Schnittparameter, sondern auch aile Artefakte, wie Gewebe­absprengungen (Geweberisse), Schnittfalten, Reflexionen am GefiiJ3saum und artfizielle Silber­kornerhohungen leicht zuordnen lassen.

Literatur

BRUCK, H. J., Ein Beitrag zur Mikrophotographie ungerarbter Autoradiographie-Praparate.Leitz-Mitt. Wiss. u. Techn. 4, 83-85 (1967).

DORMER, P., photometric methods in quantitative autoradiography. In: Microautoradiographyand Electron Probe Analysis. Their Application to Plant Physiology, (Ed. U. LUTTGE), p. 7­48. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1972.

ENTlNGH, D. J., and CAPOWSKl, J. J., Automatic silver grain counting with area accumulation.In: Automatic Cytology Conference, Asilomar, Calif. 1975.

MONTERO, V. M., Light-dark-field double exposure photomicrographic method for autoradiographicpreparations. Brain Res. 113, 171-173 (1976).

ROGERS, A. W., Die Mikroskopie von Autoradiographien; Leitz-Mitt. Wiss. u. Techn. 3, 43-47

(1964).

Anschrift der Verfasser: Dr. JURGEN KONRAD MAl, C. und O. Vogt-Institut fUr Hirnforschung,

Universitat Dusseldorf, MoorenstraJ3e 5, Gebaude 22.03, D - 4000 Dusseldorf.

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Tafelerklarung

Tafel VI

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Abb. 1. Schematische Darstellung del' Strahlengange bei modifizierter Dunkelfeldbeleuchtung.a Erzeugung des zusatzlichen Hellfeldeffektes im Praparat (P) durch Streuung im Tropfen (T) ;b Hellfeldeffekt durch mehrfache Reflexion des ausgeblendeten Beleuchtungsstrahls (rot) an denAluminiumelementen (A, B, C). Elemente B und Classen sich leicht entfernen, urn reine Dunkel·feldbeleuchtung herzustellen.

Abb. 2. Modifizierte Durchlicht-Dunkelfeldphotographie eines Autoradiogramms, das die Aus.breitung del' praecommissuralen Stria terminalis im Bereich des sagittal geschnittenen Hypothala·mus del' Ratte demonstriert. Die Silberkorner stellen sich als leuchtend weiI3e Punkte, Faserzuge(streifige Zeichnung) und Endigungsgebiete (diffuse Anordnung) dar. Die Abbildung setzt sichaus einer Serie von 18 Mikroaufnahmen zusammen (Objektiv 10: 1), die mit Hilfe des Leitz·Grobscanningtisches uberlappungsfrei hergestellt wurden. Luxol-Fast-Blue-Cresylviolett-Far­

bung.

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