Methoden zur Sequenzierung von DNA

Anne Röschenkemper

SS 2006

DNA-Sequenzierung

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Was ist DNA-Sequenzierung?

• Die Analyse der DNA-Struktur auf Nucleotid-Ebene

• Erst seit 1977 gibt es DNA-Sequenzierungstechniken• Gründe dafür:• Erst seit dieser Zeit gibt es Klonierungstechniken, durch

die DNA in ausreichender Menge erhalten werden kann• Auch Restriktionsendonucleasen kennt man erst seit

Mitte der 70er Jahre; nur durch Behandlung mit diesen Enzymen kann DNA in kleine Fragmente zerteilt werden (& auch rekonstruiert werden)

DNA-Sequenzierung

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Welche Methoden gibt es?

1) Sequenzierung durch chemische Spaltung Die Maxam-Gilbert-Methode

2) Sequenzierung durch Kettenabbruch Die Sanger-Methode

3) weitere Methoden: zB.

Pyrosequenzierung

Sequenzierung durch Hybridisierung

DNA-Sequenzierung

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Sequenzierungsstrategien

• Problem: nur ca. 1000 bp können mit dem Sanger-Verfahren sequenziert werden

• Lösung:

1) Spezifischer Abbau und Fraktionierung durch Restriktionsendonucleasen kleine, vollständig sequenzierbare Fragmente

2) Sequenzierung

3) Rekonstruktion der Fragmente (durch „overlap“)

Komplette Sequenz

RE 1

RE 2

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Sequenzierung durch chemische Spaltung:Die Maxam-Gilbert-Methode

• Von Allan Maxam und Walter Gilbert entwickelt; erste Veröffentlichung: Februar 1977 (PNAS)

Prinzip: basenspezifische Spaltung

spezifische Spaltung an einem einzigen Nucleotid-Typ durch bestimmte Reagenzien

Jedes DNA-Fragment wird im Durchschnitt nur einmal gespalten (zufällig an einer der chemisch sensiblen Bindungen)

radioaktive Markierung des 5` - Endes mit 32P

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Markierung des 5´-Endes mit 32P

•Wenn schon P an 5´ vorhanden:

•Im zweiten Schritt wird nun radioaktiv markiertes ATP benötigt (am γ-Phosphor-Atom)

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Die Maxam-Gilbert-Methode

Beispiel für eine basenspezifische Spaltung

32P- A T G T A G G T C A G A -3´- T

Spaltung an der 5´-Seite von G:

32P- A T G T A G G T C A

32P- A T G T A G

32P- A T G T A

32P- A T

Die 5´-markierten Fragmente können nun

detektiert werden

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Die Maxam-Gilbert-Methode Detektion der 5´-markierten Fragmente:• mittels PAGE Trennung nach Größe• Autoradiogramm:

A T G C

Laufrichtung Leserichtung

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Die Maxam-Gilbert-Methode

• Spezifische Spaltung an G:

• Reagenzien:

Dimethylsulfat

Piperidin

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Die Maxam-Gilbert-Methode

Spezifische Spaltung an A & G• ähnlich der „G-Spaltung“ • Reagenzien: Dimethylsulfat

Piperidin• Methylierung von A an N(3) und nicht an N(7)• Reaktion unter sauren Bedingungen (Spaltung von A unter

basischen Bedingungen: 5 mal langsamer als G-Spaltung) A & G werden in gleichen Anteilen gespalten

• Ermittlung der A-Positionen durch Vergleich von „G“ und „G&A“

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Die Maxam-Gilbert-Methode

Spezifische Spaltung an C & T

• Reagenzien: Hydrazin

Piperidin

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Die Maxam-Gilbert-Methode

Spezifische Spaltung an C

• Ähnlich der „C&T-Spaltung“• Reagenzien: Hydrazin

Piperidin• Zusätzlich: Lösung enthält NaCl• Dadurch findet die Spaltung fast nur an C statt

• Ermittlung der T-Positionen durch Vergleich von „C“ und „T&C“

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Die Maxam-Gilbert-Methode

Vorteile• Eine Sequenz kann allein mithilfe der Restriktionskarte entschlüsselt

werden• Die Sequenz kann fast vollständig ermittelt werden• Die Sequenz kann vom ursprünglichen DNA-Molekül stammen

(nicht von einer enzymatisch hergestellten Kopie) keine Kopierfehler

Nachteile• Nur relativ kurze Sequenzen können ermittelt werden• Relativ langsame und unzuverlässige Methode (im Vergleich zur

Sanger-Methode)• Gefährliche Chemikalien werden verwendet

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Sequenzierung durch Kettenabbruch:Die Sanger-Methode

Nach Frederick Sanger (et al.); erste Veröffentlichung: Dezember 1977

Prinzip: in-vitro-Synthetisierung mit Kettenabbruch• Zu einem denaturiertem DNA-Strang wird mithilfe von

DNA-Polymerase ein komplementärer Strang synthetisiert

• Die Reaktion wird an einer bestimmten Base gestoppt, indem ein Didesoxynucleotid in den Strang eingebaut wird

• Detektion: per Autoradiographie oder Fluorimetrie

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Didesoxynucleotide

die DNA wird in 3´-5´-Richtung verlängert der ddNTP fehlt in der 3´-Position die OH-Funktion, an der ein

weiteres Nucleotid andocken könnte wird ein ddNTP in den Strang eingebaut, stoppt die Synthese um genügend lange Sequenzen zu erfassen, darf der ddNTP -

Anteil nur gering sein (~ 1:200 ddNTP : dNTP) man macht vier Ansätze: ddATP, ddGTP ,ddCTP, ddTTP

Die Sanger-Methode

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Die Sanger-Methode

Benötigte Komponenten• DNA-Einzelstrang • Primer• DNA-Polymerase• dNTPs• ddNtp (pro Ansatz nur eine Sorte)• Markierung • Elektrophoresesystem

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Die Sanger-Methode

Die Kettenabbruchmethode im Überblick

vier Ansätze

zufällige Verteilung der ddNTPs

Nur die synthetisierten Stränge werden erfasst

Prinzip: kleine Moleküle wandern schneller!

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Die Sanger-Methode

• Fluoreszenzsequenzierung•Man kann Primer, ddNTPs oder dNTPs kovalent an Fluorophore knüpfen wenn man pro Reaktionsansatz ein anderes Fluorophor verwendet, benötigt man nur eine Gelelektrophorese-Laufspur

•Vorteil:

schneller als AutoradiographieUngefährliche Substanzenleicht automatisierbar (~10.000 Basen können pro Tag identifiziert werden; manuelle Methode: ~ 150 / d)

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Die Sanger-Methode

Zyklische Sequenzierung I• Problem der Standardkettenabbruchmethode:

Empfindlichkeit der Methode wird durch die Molarität der

DNA-Sequenz begrenzt • Lösung:

zyklische Sequenzierung

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Die Sanger-Methode

Zyklische Sequenzierung II

Vorteile:• wenig DNA wird benötigt• hohe T verhindert „Sequenzartefakte“• leicht automatisierbar

Nachteile:• Taq-Polymerase baut Fluoreszenz-ddNTPs recht

schlecht ein• Taq.Polymerase liest hochpolymere Basenfolgen

schlechter

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Die Sanger-Methode

Vorteile• Man kann längere Sequenzen als mit dem Maxam-

Gilbert-Verfahren sequenzieren• Schnelle & recht zuverlässige Methode; leicht

automatisierbar• Man kann radioaktive Reagenzien mit der Fluorimetrie

umgehen

Nachteile• Man benötigt einen Primer ein Teil der Sequenz muss bekannt sein

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Fazit

• Die Sanger-Methode ist besser als die Maxam-Gilbert-Methode!!!

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Alternative Methoden

• Sequenzierung durch Hybridisierung• Pyrosequenzierung

• Mikrokanal-Sequenzierung• Massenspektrometrie• Rastertunnelmikroskopie• Nanoporen

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Alternative MethodenSequenzierung durch Hybridisierung• gelfreie Sequenzierungsmethode micro arrays• Matrize von kurzen Oligonucleotiden, die sich auf einer Glas- oder

Siliciumoberfläche befinden• die zu sequenzierenden DNA-Fragmente werden markiert und auf

die Oligonucleotidmatrix gebracht, so dass komplementäre Strukturen hybridisieren

• aus den Hybridisierungsmustern (Position und Signalintensität) kann auf die Sequenz geschlossen werden

• Probleme: Fehlhybridisierungen repetitive Sequenzen sind schwer zu analysieren• Aber: kürzere Sequenzabschnitte oder Mutationen können mit dieser

Methode erkannt werden Medizinische Diagnostik (z.B. SNPs)

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Alternative MethodenSequenzierung durch Synthetisierung: Pyrosequenzierung I

• Methode ohne Gele und Marker• Prinzip: „Beobachten der Synthese“• zu der einzelsträngigen DNA werden Enzyme gegeben

und dann abwechselnd die verschiedenen Nucleotide• man benötigt vier Enzyme:

1) DNA-Polymerase Einbau der Nucleotide

2) Apyrase Abbau ungenutzter Nucleotide

3) Sulfurylase Erzeugung von Licht aus PPi

4) Luciferase „

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Alternative MethodenPyrosequenzierung II

•die Lichtemission wird aufgezeichnet und ist in einem Pyrogramm® als Peak erkennbar

•die Intensität des Lichts ist proportional zur Anzahl der in den Strang eingebauten Basen

•schnelle Methode

•ideal für die medizinische Diagnostik

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Bedeutung der DNA-Sequenzierung

Das Humangenomprojekt

• Sequenzierung der menschlichen DNA (3,2 Mrd. bp!!!)• Erkennung von codierenden Sequenzen (~30.000 –

40.000 Gene) für z.B. monogene Krankheiten wie Alzheimer, Brustkrebs,

Diabetes (jeweils die vererbbaren Formen) Enzymmutationen und damit verbundene

Medikamentenunverträglichkeiten (z.B. CYP-450-Enzyme)

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Bedeutung der DNA-Sequenzierung

DNA-Chips für CYP-450• bestimmte Enzyme dieser Familie sind an der Metabolisierung von

Arzneimitteln beteiligt• Fehlerhafte Gene führen zu veränderter Metabolisierung: z.B. das

CYP-2D6-GenVariante A: normale AktivitätVariante B: verstärkte Aktivität („ultraschneller Metabolisierer“)Variante C: inaktives Enzym („langsamer Metabolisierer“)• bei Prodrugs: B toxische Effekte C keine Effekte (z.B. wird Codein durch dieses Enzym zu Morphin metabolisiert)

• Lösung für diese Probleme:DNA-Chip, der fehlerhafte Varianten des Gens erkennt und dadurch eine verbesserte Therapie ermöglicht

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Bedeutung der DNA-Sequenzierung

Ausblick• durch die Verwendung von DNA-Chips in der medizinischen

Diagnostik können SNPs und andere genetische Veränderungen erkannt werden

• dies macht eine auf den „zugeschnittene“ Therapie, die nicht nur äußere Faktoren wie Gewicht und Geschlecht berücksichtigt, möglich

• Möglichkeit der Früherkennung genetisch bedingter Krankheiten• Methoden wie die von Sanger eignen sich eher zur Sequenzierung

des kompletten Genoms, sind für die medizinische Diagnostik meist zu langsam und kompliziert, dafür aber genauer

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Literatur• Voet, Voet – Biochemie• Luke Alphey – DNA-Sequenzierung, 1998 Spektrum

Akademischer Verlag• Müller-Esterl – Biochemie, 2004 Elsevier Verlag• Lottspeich, Zorbas – Bioanalytik, 1998 Spektrum

Akademischer Verlag• www.pyrosequencing.com• „Die Humangenomforschung in Deutschland“ – BMBF• Sanger et al.: „DNA-Sequencing with chain-terminating

inhibitors“ – Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74 (1977), pp. 5463-5467

• Maxam, Gilbert: „A new method for Sequencing DNA“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74 (1977), pp. 560-564