LABORWELT 06/2011

Synbio & Systembiologie Der virtuelle Patient – Modellierung als neuer Weg in der Krebsforschung

Paper des Monats: Aptamerkonstrukt reguliert Expression von Säugergenen

Quantitative Physiologie: Basis für die Entwicklung von Produktionsstämmen

Expertenpanel

BIO-IT

Nr. 6 / 2011 – 12. Jahrgang

laborwelt

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❏ Anmeldung per FAX (069) 82 34 93Termine:❏ 19. – 20.3.12 ❏ 6. – 7.9.12

Absender:

In immer mehr Produktionsverfahren fi nden gentechnisch veränderte Organismen Anwendung. Somit nimmt auch die Anzahl der Anlagen zu, in denen mit solchen Organismen umgegangen wird.

Deshalb ist es für alle Personen, die mit gentechnischen Anlagen zu tun haben, wichtig, das erforderliche Wissen und die entsprechende Sach-kunde zu besitzen, um

■ gentechnische Anlagen errichten und sicher betreiben zu können

■ die Aufgaben als Projektleiter oder Beauftragter für die Biologische Sicherheit wahrnehmen zu können oder

■ als Mitarbeiter oder Führungskraft die Gefahren zu kennen, damit sicher umgehen und fundierte Entscheidungen treffen zu können.

Der Fortbildungslehrgang ist bundesweit staatlich anerkannt. Sie erhalten aktuell und praxisnah in 2 Tagen die erforderlichen Kenntnisse zur Er-langung der Sachkunde für Projektleiter und Beauftragte für die Biolo-gische Sicherheit nach § 15 Abs. 4 der Gentechniksicherheitsverordnung (GenTSV).

Sie profi tieren von der klaren Erläuterung der Inhalte aktueller Regelungen im Gentechnikrecht , den Tipps für die Umsetzung und dem Erfahrungs-austausch mit Referenten und Fachkollegen.

Zielgruppen:■ Biologen, Chemiker, Mediziner, Ingenieure, die als Projektleiter oder

Beauftragte für die Biologische Sicherheit bestellt werden sollen

■ Fach- und Führungskräfte, die Wissen auf dem Gebiet des Gentechnik-rechts benötigen, um fundierte Entscheidungen zu treffen

Inhalt:■ Rechtsvorschriften für gentechnische Anlagen und Freisetzungen und

zum Arbeitsschutz

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Risikobewertung und Sicherheitseinstufung■ Sicherheitsmaßnahmen

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Leitung:

Dipl. Biol. Christine Jansen, Umweltinstitu Offenbach

Referenten:

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Dr. Halil Gültekin, Beauftragter für die Biologische Sicherheit, Abbott GmbH & Co. KG, Wiesbaden;

Matthias Mann, Rechtsanwalt, Egelsbach;

Dr. Jürgen Mertsching, Beauftragter für die Biologische Sicherheit, Medizinische Hochschule Hannover;

Dr. Tobias Jacobi, Ministerium für Umwelt und Forsten Rheinland-Pfalz;

Unterrichtszeiten: erster Tag: 9.00 – 18.00 Uhrzweiter Tag: 9.00 – 17.00 Uhr

inkl. Kaffeepausen und gemeinsames Mittagessen

Lehrgangsgebühr EUR 680,– (mehrwertsteuerfrei)

Nach Anmeldung erhalten Sie eine Anmeldebestätigung und eine Rech-nung. In der Teilnahmegebühr sind ausführliche Seminarunterlagen sowie Kaffee, Pausengetränke, Gebäck, Obst und Mittagessen enthalten.

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Hotelverzeichnis und Anfahrtsplan werden der Anmeldebestätigung beigelegt.

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Sicherheit bei Arbeiten in gentechnischen AnlagenBundesweit staatlich anerkannte 2-tägige Ausbildung zum Projektleiter und Beauftragten für die Biologische Sicherheit gem. § 15 Abs. 4 GenTSV.

Termine: 19. – 20.3.12, 6. – 7.9.12

Bundesweit staatlich anerkannte 2-tägige Ausbildung zum Projektleiter und Beauftragten für die Biologische Sicherheit gem. § 15 Abs. 4 GenTSV.

Begrenzte Teilnehmerzahl.

Bitte melden Sie sich rechtzeitig an.

Umweltinstitut OffenbachFrankfurter Straße 48, 63065 OffenbachTel: (069) 81 06 79, Fax: (069) 82 34 [email protected]

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Editorial | InhaltEditorial | Inhalt

LABORWELT 12. Jahrgang | Nr. 6/2011 | 3

Expertenpanel: BIO-IT

MitdemimmerschnellerenundimmerbilligerenNext-Generation-SequencingwächstauchderBergzuanalysierenderDaten–derzeitdoppeltsoschnellwiedieRechnerkapazität.DieZeichenderZeithabenauchdieIT-Firmenerkannt.SiebereitensichaufdieÄradesExa-Scale-Computings,dieSpeicherunginsicherenCloudsunddieDatenintegrationinMulticore-Prozessorenvor.VorwelchenAnfor-derungendasFeldBio-ITdurchdieStratifizierungderMedizinunddieModellierungganzerindividuellerPatientensteht,beleuchtetdasLABORWELT-ExpertenpanelabSeite38.

IndiesemHeft

Lernen von der NaturSowohl die Systembiologie als auch die Synthetische Biologie verwirren konventionelle Biologen. Ging es jahrzehntelang darum, die komplexen biologischen Systeme bis auf wenige zu untersuchende Parameter zu reduzieren, haben die beiden Disziplinen gerade das Gegenteil zum Ziel – eine Gesamtbeschreibung der sich zeitlich ständig ändernden Komple-xität zellulären Geschehens. Wie die Beiträge in dieser Themenausgabe „Systembiologie und Synthetische Biologie“ zeigen, geht es dabei zunächst um die quantitative Erfassung biologischer Parameter wie des Mutanoms, Proteoms, (Epi-)Genoms etc., die Integration der Daten in Modellen, die den Prozess möglichst gut beschreiben, und den Abgleich mit der Realität. Die Synthetische Biologie geht dabei noch einen Schritt weiter und nutzt die erkannten Prinzipien zur Konstruktion neuartiger Systeme.

In der Mikrobiologie sollen auf diese Weise neue Chassis-Organismen entstehen, die sich zur heterologen Produktion synthetisch schwer zu-gänglicher Chemikalien eignen (vgl. Seite 10, 16). In der Medizin warten Forscher bereits mit synthetischen Zellprothesen auf, die Stoffwechselde-fekte wie Gicht reparieren (vgl. Seite 6, 8). Auch die mathematischen Mo-dellierungsansätze zur Simulation biologischer Vorgänge werden immer ambitionierter: Sie reichen von der Beschreibung von osmotischem Stress (vgl. S. 26) über die Interaktionen des Hepatitis C-Virus mit Leberzellen (vgl. S. 13) bis hin zu individualisierten Krebsmodellen (vgl. S. 19).

Zukunftspfade beschreitet im nächsten Jahr auch LABORWELT. Statt einem Thema präsentieren wir Ihnen gleich drei pro Heft, die vorab auf einer neuen Online-Plattform zusammen mit aktuellen Nachrichten, Publikationen, Jobangeboten und allen relevanten Informationen rund ums Labor monatlich erscheinen. Einen Eindruck der ausgebauten On-line-Plattform können Sie sich unter www.laborwelt.de verschaffen.� Thomas�Gabrielczyk

Titel: SynBio & SystembiologieEinen virtuellen Patienten wollen Forscher im EU-Flagship-Projekt IT Future of Medicine auf Basis von Omics-Daten im Computer entstehen lassen. Mehr dazu ab Seite 19.

Bild: Tonis Pan at http://ClipartOf.com/20405

Inhalt

Paperwelt Highlight des Monats4 Artifizieller Aptamer-Schalter reguliert Säuger-Genexpression

David Ausländer et al., ETH Zürich, DBSE, Basel

Report Synthetische Netzwerke6 Synthetische genetische Schalter in medizinischen Anwendungen

Wilfried Weber, Fakultät für Biologie, Universität Freiburg

Blitzlicht Mikrobiologie10 Quantitative Physiologie als Basis für rationale Stammentwicklung

Jan Förster und Lars Blank, RWTH Aachen

Blitzlicht Virus-Wirt-Interaktion13 Systembiologie der Hepatitis C-Virus-Wirts-Interaktionen Lars Kaderali et al., Universität Heidelberg

Blitzlicht Synthetische Biologie16 Hefe – eine universelle chemische Mikrofabrik

Jutta Heim et al., Evolva SA, Reinach, Schweiz

Blitzlicht Modellierung19 Der virtuelle Patient – neue Wege in der Krebsforschung

Alexander Kühn und Christoph Wierling, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin

Blitzlicht Medizinische Biotechnologie21 Biopeptide: synthetische Biologie zur Produktion von Peptiden

Alexander Craig et al., ATG:biosynthetics GmbH, Merzhausen

Wissenschaft Epidemiologie24 Sequencing offenbart Reservoir für Ebola-ähnliche Viren in Europa

Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg

Blitzlicht Systembiologie26 Zellprozesse: zwischen Modell und gezieltem Experiment

Edda Klipp, Theoretische Biophysik, Humboldt-Universität zu Berlin

Wissenschaft Landesexzellenzinitiative29 Fundamentals for synthetic biological systems – SynBio

An-Ping Zeng, Technische Universität Hamburg-Harburg,

Blitzlicht Maschinelles Lernen32 Vorhersage der Interaktion von Zielgenen mit Proteinen

Tobias Bauer und Rainer König, DKFZ und Universität Heidelberg

Blitzlicht Bioinformatik35 Neues Tool zur Vorhersage des Alzheimer-Risikos

Thomas Willnow et al., Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin, Berlin

Blitzlicht Mikrobiologie40 SYNMIKRO: Synthetische Mikrobiologie in Marburg

Bruno Eckhardt, Universität Marburg, MPI für terrestrische Mikrobiologie

42 Stellenmarkt45 Verbände/Produktwelt49 Termine50 Ausblick / Impressum

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Paperwelt Highlight des Monats

4 | 12. Jahrgang | Nr. 6/2011 LABORWELT

David Ausländer M.Sc., Jahrgang 1985, ist seit November 2010 Doktorand im Department Biosystems, Science and Engineering der ETH Zürich in Basel. Sein Studium der Biochemie absolvierte er an der TU München, das mit dem Jürgen-Manchot-Studienpreis gewürdigt wurde. Während seines Masterstudiums forschte er im Rahmen eines Auslandssemesters in England am Cancer Research Institute in Cambridge. In der Gruppe von Professor Martin Fussenegger an der ETHZ fertigte der formal an der TU München studierte Biochemiker von Mai bis Oktober 2010 extern seine Masterarbeit an.

LABORWELT:Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse?

Ausländer:Wir konnten mit unserer Arbeit zeigen, dass das zuvor in Bakterien verwendete TetR-Aptamer auch in höheren Organismen aktiv ist und dadurch die in Säugerzellen weitverbreiteten Tet-Systeme regulieren kann. In einem nächsten Schritt konnten wir die Aktivität des TetR-Apta-mers unter die Kontrolle eines weiteren Apta-mers setzen, welches das Medikament Theo-phyllin bindet. Dieses neuartige, bispezifische RNA-Konstrukt wies sowohl in Säugerzellen als auch im Reagenzglas vergleichbare Eigen-schaften auf. Die neue Regulationsmöglichkeit der Genexpression in Säugerzellen stellt einen weiteren, wichtigen Baustein für synthetische Netzwerke dar.

LABORWELT:Was hat Sie motiviert, einen Theophyllin-abhängigen artifiziellen Genschalter zu kon-struieren?

Ausländer:In den letzten Jahrzehnten wurde eine Viel-zahl an unterschiedlichen Tet-Systemen in Säugerzellen entwickelt, welche meist auf der Proteinebene unterschieden werden können – zum Beispiel ob ein Gen an- oder ausgeschaltet wird. Bisher war die Regulation des Tet-OFF-Systems auf eine Molekülklasse beschränkt und konnte nur mit den Tetracyclin-Antibiotika reguliert werden. Wir wollten die Regulations-möglichkeiten um ein anderes kleines Molekül erweitern und haben dafür auf RNA-Ebene die Aptamer-Technologie genutzt und das be-kannte Theophyllin-Aptamer verwendet. Eine

ist ein Schalter, der nach Einstrahlung blauen Lichtes ein Peptidhormon aktiviert, das die Insu-linproduktion in Typ2-Diabetes-Mäusen anregt. Wir nennen diese Schaltkreise, die den Ausfall bestimmter Funktionen kompensieren, Prothe-senetzwerke. Im vergangenen Jahr haben wir erstmals solch ein Netzwerk vorgestellt, das die Blutharnsäure-Konzentration in gichtkranken Mäusen reguliert.

LABORWELT:Welche weiteren Anwendungen solcher Ri-boswitches haben Sie noch im Sinn und wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter?

Ausländer:Aptamere können eine Vielfalt verschiedenster Molekülklassen binden und werden deshalb auch als chemische Antikörper bezeichnet. Je nach Funktion des Liganden können Genex-pression, Protein-Protein-Interaktionen oder andere wichtige biochemische Prozesse einer Zelle moduliert werden. Ich glaube, dass das mit unserem RNA-Schalter gezeigte Prinzip beispiel-haft sein kann für eine Vielzahl an neuartigen Schaltern. Der modulare Aufbau erlaubt es theoretisch, nahezu jedes erdenkliche Aptamer als Effektor- oder Sensor-Modul zu verwenden. In Zukunft möchten wir diese Art RNA-Schalter in synthetische Netzwerke implementieren, wo es zum Beispiel ein Krankheit-relevantes Molekül erkennt und dadurch als Antwort ein therapeutisches Protein aktiviert.

Artifizieller Aptamer-Schalter reguliert Säuger-GenexpressionDavid Ausländer, Markus Wieland, Simon Ausländer, Marcel Tigges und Martin Fusseneg-ger, ETH Zürich, Department of Biosystems Science and Engineering , Basel: Rational design of a small molecule-responsive intramer controlling transgene expression in mammalian cells, Nucl. Acids Res. (2011) doi: 10.1093/nar/gkr829

Aptamere erkennen mit hoher Affinität verschiedenste Liganden in und auf Zellen und sind als sogenannte Riboswitches in der Lage, durch Liganden-Bindung deren Funktion zu modulieren. Ein neues, im Oktober vorgestelltes Aptamerkonstrukt reguliert in Säugerzellen die Genexpression ab-hängig von der Dosis extern zugegebenen Theophyllins. Um dies zu erreichen, schleusten Auslän-der et al. das sogenannte Tet-OFF-System in Säugerzellen ein und konstruierten ein bispezifisches RNA-Molekül, das ein Theophyllin-bindendes Sensor-Aptamer mit einem Tet-Repressor-Aptamer (TetR-Aptamer) vereint, welches in Anwesenheit von Theophyllin das Tet-Transaktivator (tTA)-Protein bindet. Durch die Bindung dissoziiert das DNA-bindende tTA-Protein von dem Tet-Promotor und verhindert damit die Expression des Gens, das unter Kontrolle des Tet-Promotors steht.

Erweiterung um weitere Liganden-spezifische Sensoraptamere ist in der Zukunft denkbar.

LABORWELT:Wie sind Sie experimentell vorgegangen?

Ausländer: Ein wichtiger Aspekt in der Synthetischen Biologie ist das rationale Design. Durch die lo-gische Zusammensetzung von zwei bekannten RNA-Bausteinen konnten wir ein modulares, bispezifisches RNA-Molekül konstruieren. Dieses Konstrukt besteht aus drei verschiedenen Mo-dulen: Das Sensor-Modul stellt das Theophyllin-Aptamer dar, welches nach Bindung seines Liganden seine Struktur ändert. Dabei wird das über ein Verbindungsmodul verknüpfte Effektor-Modul, das TetR-Aptamer, in einer Weise beein-flusst, dass es seinen Liganden, das tTA-Protein, ebenfalls binden kann. Interessanterweise hat sich herausgestellt, dass die Länge und der Aufbau der Verbindungssequenz das Verhalten des Konstruktes in Säugerzellen signifikant verändert.

LABORWELT:Wo liegen die konkreten Anwendungsfelder solcher Schalter?

Ausländer:Die Konstruktion von komplexen genetischen Netzwerken in Säugerzellen ist eine Zukunfts-technologie, mit der man therapeutische oder biotechnologische Probleme lösen möchte. In diesen synthetischen Netzwerken werden eine Vielzahl an Regulatoren in Reihe oder parallel geschaltet. Deshalb ist man auf die Entwick-lung neuartiger Schalter angewiesen, um eine höhere Komplexität zu erreichen. Ein Beispiel

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Report Synthetische Regelkreise

Synthetische genetische Schalter in medizinischen AnwendungenSabrina Wend1,2, Kathrin Jakobus1 und Wilfried Weber1,2,3, 1 Fakultät für Biologie, Universität Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine SGBM, Universität Freiburg, 3BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, Universität Freiburg

Das Ziel der Synthetischen Biologie ist der rationale Entwurf und die Konstruktion von bio-logischen Verfahren und Systemen mit gewünschten Eigenschaften. Die Basis hierfür ist eine ständig wachsende Anzahl von gut charakterisierten Biomolekülen, die modular zu den gewünschten Systemen zusammengesetzt werden können. In diesem Übersichtsartikel soll dargestellt werden, wie einzelne biologische Komponenten zu genetischen Schaltern und Regelkreisen in tierischen Zellen kombiniert werden können, um damit neue Anwendungen in der medizinischen Forschung zu eröffnen. Im zweiten Teil wird dargestellt, wie die gene-tischen Schalter aus der Synthetischen Biologie in die Materialwissenschaften übertragen werden können, um dort neuartige Biomaterialien für zukünftige biomedizinische Anwen-dungen zu synthetisieren.

die Protein-DNA-Bindung aufhebt und somit die Genexpression wiederhergestellt wird. In der sogenannten Aktivierungs-basierten Konfiguration wird der Repressor an eine Ak-tivierungsdomäne fusioniert. Dieses chimäre Protein kann nun dazu verwendet werden, um einen Minimalpromoter zu aktivieren, der an eine entsprechende Operatorsequenz fusi-oniert wurde. In dieser Konfiguration führt die Zugabe des externen Stimulus zu einer Abschwächung der Genexpression, da das aktivierende Protein von dem Zielpromoter abgelöst wird (Abb. 1B).

Anwendungen biologischer Schalter im Gesundheitsbereich

Entdeckung neuer Wirkstoffe gegen Antibio-tika-resistente Bakterien: In diesem Beispiel soll dargestellt werden, wie ein genetischer Schalter in menschlichen Zellen dazu verwen-det werden kann, um neue Wirkstoffe gegen Antibiotika-resistente Bakterien zu entde-cken. Die Verwendung tierischer Zellen hat zum Vorteil, dass schon im ersten Screening-Schritt Substanzen ausgeschlossen werden können, die entweder toxisch auf menschli-che Zellen wirken oder die nicht in der Lage sind, in menschliche Zellen einzudringen, was besonders für die Bekämpfung intrazellulärer Krankheitserreger, wie zum Beispiel von Tu-berkulosebakterien, notwendig ist.

In einer kürzlich veröffentlichten Stu-die1 wurde ein genetischer Schalter verwen-det, um neue Wirkstoffe zu entdecken, die in der Lage sind, die intrinsische Resistenz von Tuberkulosebakterien gegen das Antibiotikum Ethionamid auszuschalten. In Tuberkulose-bakterien führt die Interaktion des Repres-sorproteins EthR mit seiner Operatorsequenz OEthR zur Ethionamid-Resistenz. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine nieder-molekulare Verbindung, die die EthR-OEthR-Interaktion hemmt, zu einer Abschwächung der Medikamentenresistenz führen sollte. Um solche Wirkstoffe zu entdecken, wurde analog zu dem Tetrazyklin-basierten System (Abb. 1B) ein genetischer Schalter konstruiert, der auf dem Repressorprotein EthR aus Mycobacteri-um tuberculosis und seiner Operatorsequenz OEthR beruht (Abb. 2). Dieser Schalter wurde in menschlichen Zellen implementiert und zum Screening einer chemischen Wirkstoffbi-bliothek verwendet. In diesem Prozess wurde der niedermolekulare Ester 2-Phenylethylbu-tyrat als Wirkstoff charakterisiert. Er ist in der Lage ist, in menschliche Zellen einzudringen, hat keine offensichtlichen Nebenwirkungen auf Zellen und ist in der Lage, die Bindung von EthR an seine Operatorsequenz zu inhibieren. Nachfolgende Untersuchungen an Tuberku-

bakterien führt die Interaktion des Repressorproteins EthR mit seiner Operatorsequenz OEthR zur Ethionamid-Resistenz. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine niedermolekulare Verbindung, die die EthR-OEthR-Interaktion hemmt, zu einer Abschwächung der Medikamentenresistenz führen sollte. Um solche Wirkstoffe zu entdecken, wurde analog zu dem Tetrazyklin-basierten System (Abb. 1B) ein genetischer Schalter konstruiert, der auf dem Repressorprotein EthR aus um tuberculosisOEthR beruht (Abb. 2). Dieser Schalter wurde in menschlichen Zellen implementiert und zum Screening einer chemischen Wirkstoffbi

Abb. 1: Konstruktion und Anwendung synthetischer biologischer Schalter. (A) Repressions-gesteuerter Schalter zur Kontrolle der Genexpression. Die Bindung des Tetrazyklin-Repressors TetR an seine DNA Operatorsequenz (tetO) reprimiert die Expression des Zielgens ZG (rotes Kreuz). Nach Zugabe von Tetrazyklin (rote Raute) löst sich TetR von tetO und der konstitutive Promotor (Pconst) wird de-reprimiert (grüner Pfeil). (B) Aktivierungs-gesteuerter Schalter zur Kontrolle der Genexpression. Der Tetra-zyklin-Repressor TetR wird an eine Aktivierungsdomaine A fusioniert. Die Bindung dieses chimären Transkriptionsfaktors an den Operator tetO führt zur Aktivierung des Minimalpromoters Pmin und zur Induktion der Genexpression. Durch Zugabe von Tetrazyklin wird die TetR-tetO-Interaktion gehemmt, und die Genexpression wird ausgeschaltet.

Die Grundlage komplexer synthetischer Gen-Netzwerke in tierischen Zellen sind molekula-re Schalter, die es ermöglichen, die Aktivität eines Gens über einen externen Stimulus zu steuern. Ein prominentes Beispiel eines sol-chen Schalters ist das sogenannte TET-System, mit dem einzelne Gene über die Gabe des An-tibiotikums Tetrazyklin an- oder abgeschaltet werden können. Das TET-System basiert auf dem Tetrazyklin-Repressor TetR sowie seiner spezifischen Operator-Binde-Sequenz tetO.

In Gegenwart steigender Tetrazyklin-Konzen-trationen wird diese Protein-DNA-Interaktion dosisabhängig geschwächt. Solche Liganden-abhängigen Protein-DNA-Paare können verwendet werden, um die Genexpression in tierischen Zellen durch verschiedene Prinzipi-en zu steuern: In einer Repressions-basierten Konfiguration verhindert die Bindung des Repressors an seinen Operator die Aktivität eines konstitutiven Promoters (Abb. 1A), wogegen die Zugabe des externen Stimulus

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genetisches Kontrollsystem konstruiert, so dass das Ziel-Gen nur bei erhöhten Harnsäu-rekonzentrationen angeschaltet wird (Abb. 3). Dieser Schalter wurde nun zur Konstruktion eines genetischen Regelkreises verwendet, indem als Zielgen eine Harnsäureoxidase eingefügt wurde. In dieser Konfiguration führen erhöhte Harnsäurekonzentrationen zur Produktion der Harnsäureoxidase, die wiederum zum Abbau der Harnsäure führt. Bei physiologischen Harnsäurekonzentrati-onen hingegen ist der genetische Schalter inaktiv, und es wird keine Harnsäureoxidase produziert (Abb. 3, rechts). Dieser Regelkreis wurde in menschlichen HeLa-Zellen imple-mentiert, die anschließend in Alginatkapseln eingebettet und in ein Gicht-Mausmodell appliziert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass dieses System zur Absenkung patho-logischer Harnsäurekonzentrationen sowie zu einer Reduktion der Gicht-assoziierten Entzündungen führt2.

Verwendung genetischer Schalter zur Synthese interaktiver Biomaterialien

Die oben aufgeführten Beispiele (für weitere Beispiele siehe Referenzen [3] sowie [4]) zei-gen das Anwendungspotential genetischer Schalter in der Synthetischen Biologie. In einer kürzlich erschienenen Studie5 wurde jedoch auch eindrücklich gezeigt, dass diese molekularen Schaltprinzipien nicht auf die Biologie beschränkt sind, sondern ebenso ein großes Anwendungspotential in den Materialwissenschaften besitzen, zum Bei-spiel um Materialien mit extern steuerbaren Eigenschaften herzustellen3.

Dieser Transfer eines genetischen Schal-ters aus der Synthetischen Biologie in die Materialwissenschaften wurde exemplarisch anhand des Tetrazyklin-Repressors TetR (Abb. 1A) gezeigt. Zur Synthese eines Tetrazyklin-sensitiven Materials wurde sowohl TetR als auch die Operatorsequenz tetO an lineares Polyacrylamid gekoppelt. Durch Bindung von TetR und tetO erfolgte somit eine Querver-netzung der Polymerketten, was zur Ausbil-dung eines stabilen Hydrogels führte (Abb. 4). Durch Zugabe von Tetrazyklin konnte dieses Hydrogel dosisabhängig wieder aufgelöst werden. Es wurde gezeigt, dass sich dieses Material als extern steuerbares Depot für Wachstumsfaktoren oder therapeutische Protein verwenden lässt. Hierzu wurde als Modelprotein Interleukin-4 eingebaut, und es konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung dieses Proteins graduell über die Zugabe steigender Tetrazyklin-Konzentrationen gesteuert werden konnte (Abb. 4). Basierend auf diesem ersten Prototyp eines interaktiven Materials das auf einem genetischen Schalter aus der Synthetischen Biologie beruht, sollte es nun möglich sein, Biomaterialien herzu-stellen, die auf verschiedenste Stimuli re-

losebakterien zeigten, dass die Kombination von Ethionamid und 2-Phenylethylbutyrat zu einer effizienten Abtötung der Krankheits-erreger führte, wogegen gleiche Konzentra-tionen der individuellen Wirkstoffe keinen abtötenden Effekt zeigten1.

Ein genetischer Regler zur Kontrolle der Harnsäurekonzentration bei Gicht

Etwa 1,4% der westlichen Bevölkerung leidet an Gicht, welche durch eine zu hohe Konzent-ration an Harnsäure im Blutserum verursacht wird. Die daraus resultierende Kristallisation von Harnsäure in Gelenken führt zu schmerz-

vollen Entzündungsreaktionen und Gewe-beschäden. Auf der anderen Seite jedoch stellt Harnsäure einen effizienten Schutz gegen reaktive Sauerstoffradikale dar. In einer kürzlich erschienenen Studie wurde ein genetischer Regelkreis entwickelt, der zum Abbau erhöhter Harnsäurekonzentrationen führt, jedoch physiologische Harnsäure-konzentrationen nicht beeinflusst2. Dieser Regelkreis basiert auf dem Deinococcus radiodurans-Repressorprotein HucR und seiner spezifischen Operatorsequenz hucO. Diese Protein-DNA-Interaktion wird durch pathologische Harnsäurekonzentrationen geschwächt. Analog zu dem Tetrazyklin-abhängigen Schalter (Abb. 1A) wurde ein

Abb. 2: Genetischer Schalter zur Entdeckung von pharmazeutischen Wirkstoffen. Analog zu dem Tetrazyklin-abhängigen genetischen Schalter (Abb. 1B) wurde der Repressor EthR aus Mycobacterium tuberculosis sowie die dazugehörige Operatorsequenz OEthR verwendet, um die Expression des Zielgens sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) zu kontrollieren. Dieses System kann verwendet werden, um in einer chemischen Bibliothek Substanzen zu identifizieren, die in der Lage sind, EthR von OEthR abzulösen, was durch eine erniedrigte SEAP-Expression angezeigt wird. Gleichzeitig können bei dieser Suche Substanzen ausgeschlossen werden, die zytotoxisch sind oder die nicht in der Lage sind, in Zellen einzudringen.

Abb. 3: Regelkreis zur Kontrolle der Harnsäure-Homöostase bei der Gicht-Erkrankung. Analog zu dem Tetrazyklin-abhängigen Kontrollsystem (Abb. 1A) wurde basierend auf dem HucR-Repressor und seinem oktameren Operator hucO8 ein Harnsäure-induzierbarer genetischer Schalter implementiert. Der Harnsäure-sensitive Repressor HucR wird als Fusionsprotein mit dem transkriptionellen Silencer KRAB exprimiert. Dieser chimäre Transkriptionsfaktor kann an seine Operatorsequenz (hucO8) binden und die Expressi-on der Harnsäureoxidase (UOX) reprimieren. Bei erhöhter Harnsäurekonzentration im Medium steigt die intrazelluläre Harnsäurekonzentration, die durch das Transportpro-tein URAT1 vermittelt wird (grüner Pfeil). Mit steigender intrazellulärer Harnsäurekon-zentration sinkt die Affinität von HucR zu hucO8, und die Uratoxidase wird exprimiert (Schema rechts oben) wodurch eine Absenkung der Harnsäurekonzentration erfolgt. Sobald physiologische Konzentrationen dieses Metaboliten erreicht werden, bindet HucR-KRAB wieder an hucO8 woraufhin die Neuproduktion der Harnsäureoxidase wieder reprimiert wird. Somit stellt dieses Netzwerk einen Regelkreis zur autonomen Kontrolle der Harnsäurekonzentration dar.




agieren, indem TetR/tetO durch ein anderes Repressor/Operator-Paar mit gewünschter Stimulus-Spezifizität (z.B. für diverse Metaboliten, Medikamente oder Ionen) ersetzt wird. Dies würde die Entwicklung von Materialien für verschiedenste biomedizinische und analytische Anwendungen ermöglichen.

Ausblick

Der rasante Wissensanstieg über biologische Komponenten er-möglicht das rationale Design und die Konstruktion synthetischer biologischer Systeme mit gewünschten Eigenschaften. Im Laufe des vergangenen Jahrzehnts gelang es, grundlegende Designprinzipien für synthetische biologische Systeme zu erarbeiten, mit denen nun erste Anwendungen der Synthetischen Biologie in der Gesundheits-forschung realisiert werden konnten. Diese Anwendungen sowie die Expansion der Synthetischen Biologie in andere Bereiche wie die Materialwissenschaften zeigen eindrücklich das große Potential dieser neuen Disziplin zur Entwicklung neuartiger Lösungsansätze für unerfüllte Herausforderungen.

Literatur

[1] Weber et al. 2008. Proceedings of the National Academy of Sciences 29: 9994–9998[2] Kemmer et al. 2010. Nature Biotechnology 4: 355–360[3] Jakobus et al. 2012. Chemical Society Reviews. doi: 10.1039/C1CS15176B[4] Ruder and Collins 2011. Science 333: 1248-1252[5] Christen et al. 2011. Advanced Functional Materials 21: 2861-2867

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Wilfried WeberFakultät für BiologieAlbert-Ludwigs-Universität FreiburgTel: +49-(0)761-203-97654Fax: +49-(0)[email protected]

Abb. 4: Konstruktion eines Tetrazyklin-sensitiven Hydrogels zur induzierbaren Freisetzung eines Zielproteins. Das Hydrogel besteht aus linearem Polyacrylamid das entweder mit dem Tetrazyklinrepressor TetR oder seiner Operatorsequenz tetO funktionalisiert wurde. Durch die spezifische Affinität zuein-ander vernetzen TetR und tetO die Polymerstränge zu einem Hydrogel, das durch die anschließende Zugabe von Tetrazy-klin dosisabhängig wieder aufgelöst werden kann. Dieses induzierbare Auflösen kann dazu verwendet werden, um ein therapeutisches Zielprotein auf Kommando aus diesem Hydrogel-Depot freizusetzen.

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Blitzlicht Mikrobiologie

Quantitative Physiologie als Basis für die rationale StammentwicklungDipl.-Biol. Jan Förster, Univ.-Prof. Dr.-Ing. Lars M. Blank, Institut für Angewandte Mikrobiologie, Aachener Biologie und Biotechnologie, RWTH Aachen

Ein Ziel der Synthetischen Biologie, deren Grundgerüst ein Ingenieursansatz aus Analyse, Design und Synthese ist, ist die rationale Entwicklung von Hochleistungsstämmen als Biokatalysatoren für den Einsatz in der industriellen Biotechnologie (Abb. 1). Dazu werden sogenannte Chassis zellen mit den für die katalytische Aufgabe notwendigen Funktionen ausgerüstet. Ein Teil der Analyse und das Design finden dabei in silico statt, die Synthese erfolgt anschließend in vivo. Für das in diesem Beitrag vorgeschlagene rationale Vorgehen der Stammentwicklung werden quantitative Daten benötigt, die vermehrt durch neueste Analytikmethoden gewonnen werden können. Hier wurde am Beispiel des Bakteriums Escherichia coli und der Hefe Pichia pastoris der Frage nachge-gangen, ob der mikrobielle Metabolismus die Produktion von rekombinanten Proteinen limitiert. Um dies zu untersuchen, wurden quantitative Physiologie-Experimente durchgeführt. Hierbei wurden die Substrataufnahmerate und Produktbildungsraten bestimmt und mittels stabiler Isotopen-Flussanalyse intrazelluläre Reaktionsraten berechnet. Die Daten zeigen, dass während der rekombinanten Proteinproduktion weniger Nebenprodukte entstehen und mehr Energie über den TCA-Zyklus gebildet wird, um die Last aus der Proteinproduktion auf den Metabolismus aus-zugleichen. Durch eine Zugabe von Co-Substraten ließ sich eine Steigerung der Proteinproduktion erzielen. All dies deutet auf eine metabolische Limitation hin. Aus den aufgezeigten Ergebnissen wird deutlich, wie wichtig ein quantitatives Verständnis für die Auslegung von Chassiszellen ist.

Abb. 1: Rationale Stammentwicklung mittels eines Ingenieursansatzes von Analyse, Design und Synthese.

Die mikrobielle Proteinproduktion gewinnt in der Pharma- und Chemie- Industrie immer mehr Bedeutung. Einer der ersten hierfür ver-wendeten Organismen ist das Bakterium Esche-richia coli. Als einfacher Eukaryot wird immer häufiger die Hefe Pichia pastoris genutzt, wobei ihre Verwendung als Produktionswirt sich in der Pharma-Industrie erst in den Anfängen be-findet. Es gibt für beide Organismen viele Tech-niken zur molekularen Manipulation. Somit können die Chassiszellen durch das Einbringen von rekombinanten Genen (sogenannten Mo-dulen) für eine spezielle Syntheseleistung, wie die Produktion von rekombinanten Proteinen, ausgerüstet werden. Beide Organismen eignen sich für die Untersuchung der Interaktion des

mikrobiellen Metabolismus des Wirtes (der Chassiszellen) und der erwünschten Synthe-seleistung (des Moduls)1.

Seit vielen Jahren ist bekannt, dass Zellen, wenn sie rekombinante Proteine produzieren, schlechter wachsen, mehr Energie benötigen und zum Teil eine molekulare Stressantwort zeigen. Dieser Stress wird in der Literatur auch als metabolische Last („metabolic burden“) bezeichnet2. Um die Proteinproduktion so erfolgreich wie möglich zu gestalten, gilt es, diese Last auf den Metabolismus so gering wie möglich zu halten. Wird der Metabolismus durch Faktoren wie eine niedrigere Temperatur, optimalen pH oder osmotische Bedingungen entlastet, lässt sich eine verbesserte Protein-

produktion feststellen2,3. Wenn nicht optimal angepasst, belasten diese Faktoren den Me-ta bolismus. Aus diesem Grund könnte die rekombinante Proteinproduktion durch den Metabolismus selbst limitiert sein. Dies wäre für die Optimierung des Produktionswirtes bzw. der Chassiszellen von großer Bedeutung, da bis jetzt andere Optimierungskriterien im Vordergrund standen, wie zum Beispiel die Transkriptionsleistung (Verwendung von starken Promotoren), die Produktstabilität (Entfernung von Proteasen) oder die die Pro-duktlöslichkeit (Verwendung von Tags). Unter Einsatz moderner Analytik wurde in quantitati-ven Physiologie-Experimenten die Auswirkung der rekombinanten Protein produktion auf den Wirtsmetabolismus ermittelt. Erste Op-timierungsvorschläge und die Produktion des Zielproteins in Hochzelldichtefermentationen wurden erarbeitet. Sie bilden die Basis für die weitere Optimierung der Chassiszellen.

Intrazelluläre Stoffflussverteilung bei E. coli

Um die Belastung des Metabolismus durch die heterologe Proteinproduktion zu untersu-chen wurden rekombinante E. coli, die DmpA aus Ochrobactrum anthropi produzieren, in quantitativen Physiologie-Experimenten un-tersucht. DmpA gehört zu einer neuen Klasse von b-Aminopeptidasen, die den Abbau und die Synthese von b-Peptiden auf einzigartige Weise katalysieren4. Für die Bestimmung der intrazellulären Stoffflussverteilung in unter-schiedlich stark mit IPTG induzierten Zellen wurden 13C-basierte Flussanalysen durchge-führt. Das produzierte Protein fungierte dabei als „flux probe“, wobei das Markierungsmuster des rekombinanten Proteins als Hinweis für die Stoffflussverteilung benutzt wurde, da sich mit der Induktion die Wachstumsrate veränderte. Messungen ergaben, dass mit zunehmender Proteinproduktionsrate die Wachstumsrate ab-nimmt. Interessanterweise blieb der Fluss durch den Citrat-Zyklus unter den getesteten Bedin-gungen konstant bei 2,5± 0,1 mmolgCDW

-1h-1. E. coli reduzierte seine Biomassebildung um fast 40%, um den durch die rekombinante Proteinsynthese zusätzlichen Energiebedarf zu kompensieren. Die metabolische Ausbeu-te wurde in dieser Arbeit als Biomasse pro ATP gemessen. Sie nahm konstant ab – vom Referenzstamm mit 11,7 gCDWmmolATP

-1 auf 4,9 gCDWmmolATP

-1 beim Stamm mit der höchsten Proteinausbeute (höchsten Induktion)5. Diese Ergebnisse lassen auf eine hohe metabolische Last durch die rekombinante Protein produktion schließen.

Glukose als C-Quelle für P. pastoris

Die Vorteile der Hefe P. pastoris als Produktions-organismus liegen in der Möglichkeit zur Hoch-

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Blitzlicht Synthetische Biologie

des höchstproduzierenden Stammes BapAhigh, durchgeführt. Das Protein wurde mit Glukose als C-Quelle in sehr hohem Maße gebildet (Biomassekonzentrationen von über 200 gCDWL-1 und ein Produkttiter von 6,5 gL-1 BapA). Betrachtet man die Biomasseausbeute pro Glukose, ergeben sich sowohl in Batch-Kultur (0,35 gCDWgGlukose

-1) als auch in Fed Batch-Kultur (0,50 gCDWgGlukose

-1) signifikant höhere Werte als in der Methanolkultivierung (0,71 gCWWgMethanol

-1 entspricht ca. 0,20 gCDWgMethanol-1

für Batch-Kulturen und 0,15 gCDWgMethanol-1 für

Fed Batch-Kulturen)8. Somit ist Glukose für P. pastoris eine interessante alternative C-Quelle zu Methanol.

Fazit

All diese Ergebnisse zeigen, dass der mik-robielle Metabolismus einen Einfluss auf die rekombinante Proteinproduktion hat. Die grundlegende Idee der Synthetischen Biologie, einen ingenieurwissenschaftlichen Ansatz aus Analyse, Design und Synthese in die Biologie zu übertragen, wurde hier am Beispiel der rekombinanten Proteinproduk-tion mit E. coli und P. pastoris demonstriert. Aus einem quantitativen Verständnis heraus können neue Strategien der Prozess- und Stammoptimierung erarbeitet werden.

Literatur

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[8] Heyland, J., Fu, J., Blank, L.M., Schmid, A., Biotechnol. Bioeng. 107 (2010), 357-368.

Die Originalarbeiten sind am Lehrstuhl Biotechnik von Herrn Prof. Dr. Andreas Schmid an der TU Dortmund durchgeführt worden. Wir danken für die Unterstützung von Herrn Dr. Holger Müller von der Firma BlueSens gas sensor GmbH bei der Abgasanalytik. Die Originalarbeiten entstanden in einem von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) geförderten Projekt. Allen Projektpartnern wird für die gute Zusammenar-beit gedankt.


Univ. Prof. Dr.-Ing. Lars M. BlankRWTH Aachen Institut für Angewandte MikrobiologieWorringerweg 152074 Aachen Tel.: +49-(0)241-80-26600Fax: +49- (0)[email protected]

zelldichtefermentation sowie im sehr gut durch Methanol induzierbaren und starken AOX1-Promotor. Mit Hilfe dieses Promotors ist die Proteinproduktion auf Methanol oder auf Methanol-/Glyceringemischen möglich und in der Industrie etabliert. Jedoch bringt Methanol als Induktor und C-Quelle Limita-tionen mit sich. Es kann bei der Verwendung von Methanol nicht nur zur Zelllyse kommen, die Zellen wachsen auch langsam und pro-duzieren signifikante Mengen an Abwärme, die kostspielig abgeführt werden muss. Die Installationskosten für einen Fermenter mit einem hohen Methanolanteil sind durch die erforderlichen Maßnahmen zur Vermeidung von Explosionsgefahr erheblich. Aufgrund dieser Limitationen werden alternative C-Quellen (Glycerin oder Glukose) und – damit verbunden – andere, zum Beispiel syntheti-sche6 Promotoren immer attraktiver.

Die Auswirkung der rekombinanten Pro-teinproduktion auf den Metabolismus bei P. pastoris auf Glukose als C-Quelle wurde betrachtet. Dazu wurden Stämme erstellt, die unterschiedlich viele Expressionskassetten für die Produktion der b-Aminopeptidase BapA aus Sphingosinicella xenopeptidilytica tragen und somit verschieden große Mengen an Protein produzieren4. Die Auswirkung der unterschiedlich starken BapA-Produktion auf die Physiologie der Zelle wurde mit Hilfe der 13C-Flussanalyse und moderner Abgasanalytik (CO2-, O2-, Ethanol-Sensoren von BlueSens) quantifiziert. Die spezifische Wachstumsrate nahm von 0,28 h-1 für den Referenzstamm auf 0,16 h-1 für den am besten produzierenden Stamm (BapAhigh) ab. Obwohl mit dem Rück-gang der Wachstumsrate auch eine Abnahme der Glukoseaufnahmerate einherging, war der Fluss durch den Citrat-Zyklus mit 2,1 ± 0,1 mmolg-1h-1 konstant. Dies kann auf die veränderte Produktion von Nebenprodukten während der rekombinanten Proteinsynthese zurückgeführt werden. Die Ethanolproduktion nahm von 1,7 ± 0,4 mmolgCDW

-1h-1 für den Re-ferenzstamm auf null für den BapAhigh-Stamm ab. Betrachtet man die Biomasseausbeute pro ATP, lässt sich feststellen, dass es zu einer Ab-nahme vom Referenzstamm mit 13,2 gCDWmo-lATP

-1 auf 9,9gCDWmolATP-1 für den am höchsten

exprimierenden Stamm kommt. Dessen gerin-gere Ausbeute deutet erneut auf die metabo-lische Last durch die rekombinante Proteinpro-duktion hin. Um diese auszugleichen, kommt es zu einer Änderung in der Flussverteilung in Richtung einer besseren ATP pro Glukose-Ausbeute. Der Referenzstamm hat eine Aus-beute von 4,2 molATPmolGlukose

-1. Der BapAhigh-Stamm liefert dagegen eine Ausbeute von 6,5 molATPmolGlukose

-1. Die zugleich beobachtete geringe Wachstumsrate zeigt, dass die Zellen nicht in der Lage sind, genügend Kohlenstoff

Abb. 2: Einfluss der Medienzusammenset-zung auf die BapA-Produktion. Es wurde ein Minimalmedium (Ver-duyn), ein mit Aminosäuren komple-mentiertes Minimalmedium (Ver-duynAA) und ein Komplexmedium (YPD) verwendet7.

über den TCA-Zyklus zu katabolisieren, um den erhöhten Energiebedarf zu decken. Außerdem deuten die Ergebnisse auf eine begrenzte Kapazität des Energiemetabolis-mus der Zelle hin, die somit limitierend für die rekombinante Proteinproduktion sein könnte7.

Erhöhte Proteinproduktion durch Entlastung des Metabolismus

In einem ersten Ansatz wurde dieser me-tabolischen Limitation durch Co-Subs-trat-Zugabe entgegengewirkt. Die Ver-suchsbedingungen waren wie folgt: Ent-weder wurde Minimalmedium mit sup-plementierten Aminosäuren (VerduynAA) bzw. ohne Aminosäuren (Verduyn) oder ein Komplexmedium (YPD) verwendet. Da Ami-nosäuren sowohl als Energie- als auch als C-Quelle dienen können, war davon auszu-gehen, dass sie die metabolische Last auf die Zellen in der Proteinproduktion verringern. Die in Abbildung 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass sowohl das Medium mit Ami-nosäuren als auch das Komplexmedium er-höhte BapA-Produktionsraten ermöglichen. Weiterhin bestätigen die Ergebnisse die Richtigkeit der Annahme, dass unter diesen Bedingungen die Produktion von BapA nicht durch die Transkription oder Translation limitiert ist, sondern durch metabolische Faktoren, wie zum Beispiel die Verfügbarkeit von Vorläufermolekülen oder Energie. Wird nur der am besten produzierende Stamm betrachtet, zeigt sich eine Zunahme der Wachstumsrate von 0,16 h-1 auf Verduyn, 0,18 h-1 auf VerduynAA bis auf 0,24 h-1 auf YPD und damit verbunden eine ca. 70%ige Steigerung der BapA-Produktion7.

Diese metabolische Quantifizierung wurde anschließend unter Produktionsbedingungen in einem Zulaufverfahren, unter Verwendung

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Blitzlicht Virus-Wirt-Interaktion

Systembiologie der Hepatitis C-Virus- Wirts-InteraktionenDiana Clausznitzer*1,2, Nurgazy Sulaimanov*1,2, Marco Binder3, Volker Lohmann3, Ralf Bartenschlager3 und Lars Kaderali1,2; 1BioQuant, Universität Heidelberg, 2 Institut für Medizinische Informatik und Biometrie (IMB), Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 3Department für Infektiologie, Molekulare Virologie, Medizinische Fakultät, Universität Heidelberg

Hepatitis C ist eine Viruserkrankung, die global verbreitet ist. Der meist chronische Verlauf der Infektion führt bei vielen Patienten zu schweren Lebererkrankungen bis hin zum Leberkrebs. Der-zeit gibt es keinen Impfstoff gegen Hepatitis C. Darüber hinaus schlägt die Standardbehandlung mit Ribavirin und pegyliertem Interferon bei vielen Patienten nicht an oder muss wegen schwerer Nebenwirkungen abgebrochen werden. Wir stellen hier einen systembiologischen Ansatz vor, um die intrazelluläre Replikationsdynamik des Hepatitis C-Virus (HCV) und seine Interaktionen mit der Wirtzelle besser zu verstehen. Basierend auf zeitaufgelösten, quantitativen experimentellen Daten, Life Cell Imaging, genomweiten RNAi-Screens zur Identifizierung neuer Wirtsfaktoren, Yeast-Two-Hybrid-Screens zur Charakterisierung von Protein-Interaktionen sowie unter Verwen-dung von Textmining- und Bioinformatik-Verfahren entwickeln wir ein mathematisches Modell, welches die entscheidenden Schritte der Virusreplikation in Zellen beschreibt. Schrittweise werden hierbei die angeborene Immunantwort und weitere pro- und antivirale Wirtsprozesse integriert. Unser langfristiges Ziel ist es, eine virtuelle, infizierte Leber im Computer zu entwickeln, um so die Dynamik der Hepatitis-C-Virusreplikation und Effekte von potentiellen Inhibitoren simulieren zu können. Dies erlaubt es, im Computer die sensitivsten Angriffspunkte für neue Medikamente zu identifizieren und so die Entwicklung auf die vielversprechendsten Kandidaten zu fokussieren. Im Rahmen des von der EU geförderten Projektes „SysPatho“ arbeiten neun akademische und zwei industrielle Partner zusammen, um mit einem systembiologischen Ansatz neue Erkenntnisse über die Interaktionen zwischen HCV und seinem Wirt zu gewinnen.

Hepatitis C betrifft mit mehr als 170 Millionen infizierten Menschen weltweit ca. 3% der Welt-bevölkerung. Die Infektionskrankheit wird vom Hepatitis C-Virus (HCV) verursacht, welches die Zellen der Leber infiziert. Die Infektion verläuft zu Beginn meist asymptomatisch, nimmt aber in den meisten Patienten einen chronischen Verlauf, welcher zu Leberzirrhose und letzend-lich zu Leberkrebs führen kann1-3.

Derzeit gibt es keinen wirksamen Impfstoff gegen HCV, und die Standardbehandlung mit pegyliertem Interferon und Ribavirin schlägt nur in einem Teil der Patienten an (abhängig unter anderem vom Genotyp des Virus und der Ethnie des Patienten) und hat zahlreiche Nebenwirkungen4,5. Deshalb ist ein detailliertes Verständnis der Infektionsdynamik dringend notwendig, um die Möglichkeiten der medizi-nischen Behandlung zu verbessern.

Virusinfektionen sind komplexe biologische Prozesse, die eine Vielzahl von Interaktionen zwischen Virus und Wirtszelle erfordern. Zum einen benötigt das Virus Zellproteine: um in die Zelle einzutreten, sich zu replizieren, und die Zelle zu verlassen, um dann weitere Zellen infizieren zu können und die Infektion im Orga-nismus auszubreiten. Zum anderen erkennt das Immunsystem – sowohl mittels spezialisierter

Immunzellen als auch zellulärer Signalwege – das Pathogen und schaltet Abwehrmecha-nismen an, um das Virus zu eliminieren. Der dynamische Wettkampf zwischen Virus und Immunsystem entscheidet darüber, ob es zu einer erfolgreichen Infektion kommt.

Wegen der großen Komplexität der Interak-tionen zwischen Virus und Wirtszelle, die sich zudem räumlich und zeitlich über den viralen Lebenszyklus verändern, ist ein systembiolo-gischer Ansatz erforderlich. Dieser beinhaltet, dass möglichst viele Determinanten des In-fektionsprozesses – zum Beispiel die zellulären Konzentrationen genomischer RNA und viraler Proteinkomponenten – quantitativ und zeitauf-gelöst gemessen werden. Darauf aufbauend wird dann ein mathematisches Modell entwi-ckelt, das das Wechselspiel aller Komponenten in seiner vollen Komplexität beschreibt.

Mit einem solchen Modell ist es möglich, im Computer mittels Sensitivitätsanalysen kritische Teilprozesse im viralen Lebenszyklus zu identifizieren und so mögliche neue Ziele für antivirale Medikamente zu finden sowie deren Effekte zu simulieren.

RNA-Viren wie HCV weisen hohe Mutations-raten auf und entwickeln dadurch schneller Resistenzen gegen Medikamente. Deshalb

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Blitzlicht Virus-Wirt-Interaktion

stanten der verschiedenen Prozesse und die Gesamtkonzentrationen an RNA und Protein, die möglichst akkurat bestimmt werden müssen, um das Modell prädiktiv zu machen .

Einige Parameter werden durch unabhängige Messungen direkt bestimmt. Die übrigen müs-sen durch Optimierungsalgorithmen („model fitting“) bestimmt werden, die Computersimu-lationen des Modells mit den zeitaufgelösten Daten vergleichen. Die Raten für einzelne Pro-zesse innerhalb des Modells können biologisch interpretiert werden. So kann damit die Frage beantwortet werden, welche Prozesse schnell oder langsam ablaufen oder welche Schritte die virale Replikation limitieren („Bottlenecks“).

Abbildung 2 zeigt beispielhaft gemessene Konzentrationen für virale RNA und Proteine in einer Zelllinie, zusammen mit Modellvorher-sagen. Bei der Adaptierung des Modells an die experimentellen Daten verschiedener Zelllinien zeigte sich schnell, dass, um die Dynamik für verschiedene Zelllinien korrekt beschreiben zu können, die Modellierung eines zelleigenen Faktors notwendig ist, der an der Bildung der Replikationsvesikel beteiligt ist. Dieser zelleigene Faktor ist eine entscheidende Hypothese, die aus dem Modell resultiert. Mit diesem Wirtsfaktor kann das Modell die experimentell gemessene Dynamik von RNA und Polyprotein in verschie-denen Huh7-Subtypen unterschiedlicher HCV-Replikationseffizienz akkurat beschreiben (Abb. 2). Entscheidend für die Unterschiede in der Replikationseffizienz ist die Konzentration des zelleigenen Faktors, der an der Vesikelbildung beteiligt ist und der in höherer Konzentration in der Zelllinie vorkommt, in der HCV besser repliziert. Mittels Genexpressionsexperimenten konnte dieser Faktor weiter eingegrenzt werden, eine Publikation ist derzeit in Vorbereitung.

Wirtsfaktoren und Immunantwort

Um weitere Wirtsfaktoren zu identifizieren und näher zu charakterisieren wurde darüber hinaus ein genomweiter RNAi-Screen durchgeführt. Die Idee hierbei ist, Gene der Wirtszelle mittels RNA-Interferenz einzeln auszuschalten und die so behandelten Zellen anschließend mit HCV zu infizieren. Ist die Infektion nicht erfolgreich, hat man ein potentielles Kandidatengen gefunden, das das Virus für seine Vermehrung benötigt. Mittels weiterer biochemischer Experimente muss dieser Befund nun bestätigt werden. Hierbei spielen Bioinformatik-Verfahren eine we-sentliche Rolle, um entsprechende Kandidaten in ihren funktionellen Kontext zu stellen.

In gemeinsamer Arbeit konnten wir in einem genomweiten Screen das Phosphatidyl-Inositol-System als wichtigen Wirtsprozess identifizie-ren9. Insbesondere die Kinase PI4KIIIa konnte dabei als kritischer Faktor identifiziert werden, der essentiell für den HCV-Replikationskomplex ist – in guter Übereinstimmung mit dem durch das mathematische Modell vorhergesagten Wirtsfaktor.

erscheint die Hemmung von Wirtsfaktoren, die für die effiziente Virusvermehrung benötigt werden, als attraktive Alternative zur direkten Hemmung viraler Faktoren. Gelingt es, dem Virus wichtige zelluläre Prozesse zu entziehen, die es für seine Vermehrung braucht, dürfte die Resistenzentwicklung wesentlich länger dauern. Denn dazu müsste das Virus den ent-sprechenden Wirtsfaktor ersetzen. Allerdings ist für diese Strategie ein genaues Verständnis der komplexen Interaktionen von Virus und Wirt erforderlich, und selbstverständlich darf das Inhibieren der Wirtsfaktoren nicht zu einer dau-erhaften Schädigung der Wirtszelle führen.

Mathematisches Modell der HCV-Replikation

Als ersten Schritt zur Entwicklung eines umfas-senden Models des intrazellulären HCV-Lebens-zyklus haben wir ein Computermodell der Trans-lation und Replikation des HCV-RNA-Genoms entwickelt, das in weiterer Arbeit sukzessive auf den gesamten viralen Lebenszyklus sowie um Wirtsfaktoren, die zelluläre Immunantwort und Effekte von Medikamenten erweitert wird.

Grundlage dafür sind zeitaufgelöste Messun-gen der viralen RNA- und Proteinkonzentration über 72 Stunden in verschiedenen Leberzell-linien (Huh7)6, die die Replikationsdynamik abbilden (Abb. 1A).

Abb. 1: Wechselwirkungen zwischen Hepatitis C-Virus und Wirtszelle während (A) Virusreplika-tion und (B) zellulärer RIG-I-Immunantwort. (A) In die Zelle eingetretene Plusstrang-HCV-RNA wird an Ribosomen in Polyprotein übersetzt. Das Polyprotein wird in funktionelle Virusproteine gespalten, unter anderem die Polymerase. Virale Proteine und zelleigene Faktoren führen gemeinsam zur Bildung von Replikationsvesikeln, in denen die eigent-liche Replikation des viralen Genoms in geschützter Umgebung stattfindet. Innerhalb des Vesikels produziert die Polymerase den komplementären Minusstrang unter Bildung eines intermediären Doppelstrangs. Der Minusstrang dient als Matrize zur Bildung von Plusstrang-RNA. Diese wird mit einer gewissen Rate aus dem Vesikel exportiert und kann dann entweder verwendet werden, um neue Viruspartikel zusammenzusetzen, die anschließend andere Zellen infizieren oder aber wieder als Matrize zur Produktion neuer viraler Proteine dienen. (B) RIG-I bindet zytoplasmatische, doppelsträngige Virus-RNA. Das so aktivierte RIG-I bindet MAVS, welches in der äußeren Mitochondrienmembran sitzt. Diese Bindung aktiviert weitere Proteine und führt schließlich zur Transkription von anti-viralen Genen. HCV interagiert auf vielfältige Weise mit diesem Signalweg, um die zellu-läre Immunantwort zu behindern. So produziert HCV zum Beispiel eine Protease (NS3/4A), welche MAVS spaltet und damit die Immunantwort des RIG-I Signalwegs abschwächt.

Nach Eintritt in die Zelle wird das HCV-Plus-strang-RNA-Genom an den Ribosomen der Zelle zur Synthese eines sogenannten Polyproteins genutzt. Dieses wird in mehrere Proteine gespal-ten, die an der Replikation des Virus beteiligt sind – so auch die Viruspolymerase. Die Virusreplika-tion findet an sogenannten Replikationsvesikeln statt – intrazellulären Membranstrukturen, die vom Virus erzeugt werden und die die virale Replikationsmaschine vor Degradierung durch zelluläre Proteasen und Nukleasen und ver-mutlich auch vor der zellulären Immunantwort schützen7. Während der Replikation wird zu-nächst ein zum RNA-Plusstrang komplementä-rer Minusstrang synthetisiert, welcher dann als Matrize für die Herstellung weiterer Plus stränge dient und so zur Amplifikation des Virus in der Zelle führt. Der RIG-I-Immunsignalweg, der grundsätzlich für die Erkennung von HCV-RNA in Zellen verantwortlich ist (Abb. 1B), ist in der Huh-7-Zelllinie zu vernachlässigen8. Damit kann die Replikationsdynamik von HCV als Teilsystem und unabhängig von der Immunantwort unter-sucht werden.

Diese Prozesse wurden in ein mathematisches Modell übersetzt, das auf chemischen Reakti-onskinetiken und dem Massenwirkungsgesetz basiert. Es hat Parameter, wie ewa Ratenkon-

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Abb. 2: Modellvorhersage und Messdaten zur Replikation des Hepatitis C-Virus in Huh-7-Zellen. Die zellulären Mole-külzahlen von Virus-Plusstrang-RNA (oben), Minusstrang-RNA (Mitte), und Polyprotein (unten) wurden über 72 Stunden gemessen (Symbole) oder im Computer simuliert (Linien). Am Anfang des Experimentes wer-den die Zellen mit Plusstrang-RNA transfiziert. Diese wird sehr schnell degradiert, während gleichzeitig der Replikationszyklus beginnt. Minusstrang-RNA und Polyprotein werden gebildet, und nach etwa 10 Stunden steigt auch die Anzahl der Plusstrang-RNA-Moleküle an. Nach etwa 30 Stunden erreicht die Virusre-plikation einen stationären Zustand, das heißt, die Anzahl der RNA- und Proteinmolüle bleibt konstant.

Unsere Studie zur Replikationsdynamik von HCV ist ein erster Schritt zum detaillierten Verständ-nis von HCV-Infektionen. Die Virusreplikation in Zellen, in denen die zelluläre Immunantwort ausbleibt, ermöglichte eine von der Abwehr-reaktion unbeeinflusste Charakterisierung seiner Replikation. Künftig müssen diese Er-gebnisse mit der Dynamik der Immunantwort kombiniert werden. Dazu haben wir erste Arbeiten zur Modellierung des Rig-I-Pfades des angeborenen Immunsystems begonnen, um die Aktivierung der Signaltransduktion durch virale RNA zu modellieren10. Desweiteren wur-den bisher die Bildung von Viruspartikeln und deren Export aus der Zelle sowie die Infektion benachbarter Zellen nicht berücksichtigt. Mit Hilfe des systembiologischen Ansatzes können Teilsysteme zunächst akkurat charakterisiert und entwickelten quantitativen Modelle dann zu einem Gesamtmodell kombiniert werden. Dies ist vielversprechend für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, denn innerhalb des Modells können die wichtigsten Angriffsstellen gegen das Virus mittels medikamentöser Behandlung relativ einfach durch Computersimulationen identifiziert werden.

Literatur

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Funding: Die Autoren bedanken sich beim Bundesministerium für Bil-dung und Forschung für Förderung im Rahmen des ForSys-Verbund-projektes „ViroQuant“, bei der Europäischen Union für Förderung des Projektes „SysPatho“ sowie der Deutschen Forschungsgemein-schaft für die Förderung der Forschergruppe FOR 1202.


Prof. Dr. Lars KaderaliInstitut für Medizinische Informatik und Bio-metrie (IMB) – Medizinische Fakultät Carl Gus-tav Carus – Technische Universität DresdenFetscherstr. 74, 01307 DresdenTel./Fax: +49-(0)351-3 177-218/ -3 177 [email protected]

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Hefe – eine universelle chemische MikrofabrikDr. Harald Heider, Dr. Markus Schwab und Prof. Dr. Jutta Heim; Evolva SA, Reinach, Schweiz

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird durch den Menschen seit Jahrtausenden zur Pro-duktion unterschiedlichster Nahrungs- und Genussmittel eingesetzt. Ihr Beitrag zur alkoholischen Gärung in der Wein- und Bierproduktion oder bei der Herstellung von Brot ist auch dem Laien geläufig. Weniger bekannt ist die Tatsache, dass sich Bäckerhefe ebenfalls hervorragend für die Produktion chemischer Moleküle eignet, die in der Natur nur in geringen Mengen vorkommen, schwierig zu isolieren sind oder bisher noch nicht entdeckt wurden. Evolva hat es sich zur Auf-gabe gemacht, Saccharomyces cerevisiae als Mikrofabrik für die Herstellung solcher Moleküle zu entwickeln. Hierfür bedienen wir uns der synthetischen Biologie, um die Hefe für diese bisher nur ansatzweise genutzten Zwecke entsprechend umzuprogrammieren. Mit Hilfe künstlicher Chromo-somen bauen wir nicht nur komplette Biosynthesewege aus Pflanzen oder anderen Organismen in die Hefe ein, wir können auch völlig neuartige Kombinationen enzymatischer Aktivitäten zur Herstellung bisher unbekannter Moleküle in die Hefe einschleusen.

taboliten eingesetzt werden, ist die Produktion in Hefe wesentlich sicherer – speziell im Hinblick auf Beiprodukte bei der nachfolgenden Isolation der Substanzen. Darüber hinaus können funk-tionsfähige komplexe pflanzliche Stoffwech-selwege im Eukaryot S. cerevisiae leichter als in Bakterien etabliert werden. Prokaryotischen Bakterienzellen fehlen zum Beispiel Gene für posttranslationale Modifikationen, die für die Aktivität eukaryotischer Enzyme essentiell sind. Zudem können Hefen größere DNA-Fragmente aufnehmen – ein Phänomen das wir mit unse-rer Technologie nutzen. Die gezielte Einführung großer Mengen an genetischem Material in die Hefe in Form von künstlichen Chromosomen eröffnet völlig neuartige Möglichkeiten für die Herstellung unterschiedlichster Verbin-dungen3.

In der Vergangenheit wurden verschiedene Anstrengungen unternommen, um komplexe heterologe Stoffwechselwege mit Hilfe von Plasmiden in Bäckerhefe einzubauen. Ein Konsortium universitärer und industrieller Forscher hat eine ganze Reihe von Plasmiden in Bäckerhefe eingeschleust, die den kompletten Stoffwechselweg zur Produktion des klinisch relevanten Steroidhormons Cortisol enthielten – ausgehend vom hefeeigenen Primärmetabolit Ergosterol4. Leider ist das Verfahren äußerst komplex, die Ausbeute eher gering und die Stabilität der eingeschleusten Gene in der Hefe aufgrund der Vielzahl der notwendigen Selek-tionsmarker vermutlich nicht ausreichend für eine industrielle Nutzung.

Mit unserer eYAC (expressable Yeast Artifi-cial Chromosomes)-Technologie haben wir die Möglichkeit, Hunderte von Genen gleichzeitig in die Hefe einzuschleusen und damit komplette mehrstufige Biosynthesewege in einem Schritt aufzubauen (Abb. 1). Wir haben diesen Ansatz beispielsweise erfolgreich für die Herstellung pflanzlicher Flavonoide in Hefe genutzt5. Zusätz-lich sind wir auch in der Lage, unvollständige metabolische Synthesewege zu komplemen-tieren. Hierzu verwenden wir – neben den speziell eingeführten bekannten Enzymen eines Biosynthesewegs – komplette Genbibliotheken aus Organismen, die einen gewünschten che-mischen Metaboliten produzieren.

Die eYAC-Technologie wird momentan in zwei Hauptanwendungsgebieten eingesetzt:| Etablierung von neuen Produktionswegen

für bekannte Substanzen. Schwer zugängli-che oder seltene und somit teure sekundäre Pflanzenmetabolite, wie zum Beispiel Pat-choulol oder kalorienneutrale pflanzliche Süßstoffe, können in der Hefe in großen Quantitäten und sehr guter Reinheit biosyn-thetisch produziert werden. Hierzu werden die für die Biosynthese benötigten Gene via eYACs in die Hefe eingebracht.

| Herstellung von bisher unbekannten, phar-mazeutisch aktiven Substanzen. Gene, die für Enzyme aus Stoffwechelsynthesewegen kodieren, werden mit cDNA-Bibliotheken aus unterschiedlichen Organismen kombi-

Abb. 1: Beispiele für neue Stoffwechselwege in Bäckerhefe. Ausgehend von einem hefeeige-nen Stoffwechselmetaboliten werden mit Hilfe der in die Hefe eingeschleusten syn-thetischen Chromosomen völlig neuartige, in der Hefe nicht vorkommende Produkte hergestellt. Die Anzahl der für die neuen Moleküle notwendigen Biosyntheseschritte, ausgehend vom jeweiligen Hefemetaboliten, sind mit roten Zahlen angegeben.

Saccharomyces cerevisiae gehört zur Zeit sicher zu den bestuntersuchten Organismen unseres Planeten. Die Hefe war der erste Eukaryot dessen Genom komplett sequenziert wurde1; sie besitzt ca. 6.000 Gene, die auf 16 Chro-mosomen verteilt sind. S. cerevisiae lässt sich leicht mit einer Reihe genetischer Methoden modifizieren, ist sehr robust und kann Pro-dukte im Gramm-Maßstab herstellen. Zudem wird sie als GRAS (generally regarded as safe) eingestuft und ist deshalb auch im Nahrungs-mittelbereich bestens einsetzbar. Beispiele für erfolgreiche heterologe Biosynthese in Hefe

sind Alkohole wie n-Butanol oder Ethanol, ausgehend von dem natürlichen Holzabfall-produkt Hemizellulose. Aber auch das Malaria-medikament Artemisinin oder Taxadien, eine Vorstufe des Krebsmittels Taxol, kann in Hefe produziert werden. Hinzu kommen eine große Zahl kommerziell interessanter chemischer Verbindungen aus anderen Anwendungs-gebieten, wie etwa der Aromastoff Vanillin, Patchoulol oder Flavonoide2+ Ref..

Im Gegensatz zur Herstellung solcher Pro-dukte in Bakterien, die verschiedentlich auch für die Synthese von sekundären Pflanzenme-

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Da die rein zufällige Zusammensetzung der eYACs auch zur Entstehung von nicht produ-zierenden Hefezellen führt, müssen in einem geeigneten Selektionsverfahren die relevanten Hefezellen identifiziert werden. Bei der Imple-mentierung von heterologen Biosynthesewe-gen zur Produktion bekannter Substanzen kann dies über den Einsatz analytischer Chemie erfol-gen. Entstandene Zwischen- und Endprodukte werden in qualitativer und quantitativer Weise über LC/MS erfasst und die produktivsten Klone für die weitere Verwendung selektiert. In phar-mazeutisch geprägten Projekten kombinieren wir die Biosynthese von Substanzen mit einem High-Throughput-Screening-Verfahren auf ein pharmazeutisch relevantes Zielprotein. Hierzu wird ein Testsystem in den Produktionsstamm eingebaut, das es uns erlaubt, große Hefe-bibliotheken mit bis zu 109 unterschiedlichen Hefezellen zu screenen und anschließend die positiven Hefeklone zu isolieren. Auch hier findet die anschließende Isolierung der neuen Verbindung mittels analytischer Chemie statt.

Mit unserer Technologieplattform sind wir bestrebt, die bisher nur unzulänglich aus-geschöpften Möglichkeiten der Biosynthese seltener oder schwierig zu synthetisierender Moleküle in Hefe auszubauen. Die syntheti-sche Biologe, wie wir sie anwenden, bietet die Möglichkeit der Pharma-, Kosmetik- und Nahrungsmittelindustrie eine der klassischen chemischen Synthese nicht zugängliche, neuartige Chemie zur Verfügung zu stellen. Zudem sehen wir ein großes Potential in der Etablierung von neuen, effizienten und gleichzeitig naturnahen, Produktionswegen. Nach unserer Überzeugung ist die von Evolva etablierte Technologie ein Meilenstein auf dem Weg zu einer „grünen Chemie“.

Literatur

[1] Goffeau A, Barrell BG, Bussey H, Davis RW, Dujon B, Feld-mann H, Galibert F, Hoheisel JD, Jacq C, Johnston M, Louis EJ, Mewes HW, Murakami Y, Philippsen P, Tettelin H, Oliver SG., Science. 1996 Oct 25;274(5287):546, 563-7

[2] Huang B, Guo J, Yi B, Yu X, Sun L, Chen W, Biotechnol Lett 2008, 30:1121-1137

[3] Goldman S, Curr Op Chem Biol. 2010, 14:390-395.[4] Szczebara FM, Chandelier C, Villeret C, Masurel A, Bourot

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[5] Naesby M, Nielsen SV, Nielsen CA, Green T, Tange TO, Simón E, Knechtle P, Hansson A, Schwab MS, Titiz O, Folly C, Archila RE, Maver M, van Sint Fiet S, Boussemghoune T, Janes M, Kumar AS, Sonkar SP, Mitra PP, Benjamin VA, Korrapati N, Suman I, Hansen EH, Thybo T, Goldsmith N, Sorensen AS., Microb Cell Fact. 2009 Aug 13;8:45


Prof. Dr. Jutta HeimEvolva SADuggingerstr. 23CH-4153 [email protected]

niert und in die Hefe eingeschleust. Diese Mischung aus bekannten Synthesewegen und zusätzlichen enzymatischen Aktivitäten generiert eine große Anzahl von Katalysato-ren enzymatischer Reaktionen, die eine hohe chemische Diversität der resultierenden Produkte garantiert. Durch die anschließen-de Kopplung der Biosynthese chemischer Verbindungen mit einem Screeningver-fahren können funktionelle neue Moleküle identifiziert werden.

eYAC-Technologie

Die eYAC-Technologie beruht auf der Her-stellung von künstlichen Hefechromosomen außerhalb der Zelle und deren anschließender Einführung in die Hefe. Die künstlichen Chro-mosomen können sowohl isolierte Gene aus verschiedensten Organismen als auch de novo synthetisierte Gene beinhalten– zum Beispiel in den bevorzugten Hefecodons. Die kodierenden Sequenzen werden in Eingangsvektoren klo-niert und mit hefeeigenen regulatorischen Ele-menten (Promotoren, Terminatoren) versehen. Üblicherweise verwenden wir induzierbare Promotoren, die es erlauben, die Genaktivität zu kontrollieren, aber auch konstitutiv aktive Promotoren finden Verwendung. Aus den somit entstandenen, plasmidbasierten Gen-bibliotheken werden die Expressionskassetten ausgeschnitten und in einer Ligationsreaktion zu linearen Konkatemeren in rein zufälliger Anordnung zusammengesetzt. Um diesen synthetischen DNA-Fragmenten die Eigen-schaften von natürlichen Hefechromosomen zu verleihen, werden sie mit einem Zentromer, einem Replikationsursprung und mit Telome-ren versehen. Zusätzlich verwenden wir Selek-tionsmarker, um transformierte Hefen isolieren zu können (Abb. 2). Wir sind mittlerweile in der

Abb. 2: eYAC-Technologie. Zur Herstellung der synthetischen Hefechromosomen werden hetero-lo ge Gensequenzen mit hefespezifischen regulatorischen Sequenzen kombiniert und diese genetischen Einheiten („Genkassetten“) in Bakterien amplifiziert (a). Die Plasmide werden anschließend isoliert und die Genkassetten mit geeigneten Restriktionsenzy-men freigesetzt (b). In einer Ligationsreaktion fügen wir Genkassetten (c) zusammen und vervollständigen die DNA-Fragmente mit geeigneten Chromosomenenden.

Lage, den Hefen zusätzliches genetisches Ma-terial in Form von künstlichen Chromosomen mit einer Länge von bis zu 300 000 Basenpaa-ren einzusetzen. Diese Chromosomen können zwischen 50 und 150 Genkassetten aufnehmen. Üblicherweise verwenden wir pro Schritt eines Biosynthesewegs mehrere homologe Enzyme aus verschiedenen Organismen, um die Chan-cen der Synthese der gewünschten Produkte zu erhöhen.

Besonderer Aufmerksamkeit bedürfen bei dieser Methodik die für die jeweiligen Genkassetten verwendeten Promotoren und Terminatoren. Würden immer die gleichen Sequenzen eingesetzt, bestünde bei der schie-ren Anzahl der vorliegenden Genkassetten die Möglichkeit, dass durch den hefeeigenen Rekombinationsprozess Genkassetten verlo-rengingen.

Des weiteren muss analysiert werden, ob eventuelle Modifikationen im hefeeigenen Stoffwechsel für eine effiziente Produkti-on notwendig sind. Falls Zwischenstufen des neuen Biosynthesewegs von der Hefe in unbrauchbare Produkte umgewandelt werden, können die dafür verantwortlichen hefeeigenen Enzyme ausgeschaltet werden. Selbstverständlich muss dabei die Vitalität der Hefe gewährleistet bleiben. Ist das für den neuen Syntheseweg notwendige Startmolekül nur in geringen Mengen vorhanden, kann das Ausgangsprodukt den Hefezellen auch im Nah-rungscocktail zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus ergibt sich die Möglichkeit, mo-difizierte Ausgangsprodukte (z.B. halogenierte Vorstufen) in den Stoffwechselweg einfließen zu lassen, um somit zu neuartigen Derivaten zu gelangen.

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Blitzlicht Modellierung

Der virtuelle Patient – neue Wege in der KrebsforschungAlexander Kühn und Christoph Wierling, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin

Die mathematische Modellierung kann wesentlich zu einem besseren Verständnis biologischer Sys-teme beitragen. Sie bietet die Möglichkeit, Vorhersagen über das Verhalten des Systems zu machen und mögliche Effekte von Störungen, wie Mutationen oder Medikamentenwirkungen, zu testen. Dies ermöglicht neue Wege in der Aufstellung von Hypothesen, der Planung von Experimenten, aber auch in der Optimierung von Therapien. Krankheiten wie Krebs, die durch umfangreiche Stö-rungen im komplexen regulatorischen zellulären Netzwerk entstehen, könnten somit in Zukunft auf Basis von durch Hochdurchsatz-Sequenzierverfahren personalisierten Modellen besser verstanden werden. Schließlich bietet dies die Möglichkeit einer individualisierten Medizin.

Medikamente die Möglichkeit einer gezielten und individualisierten Tumortherapie. Während also bislang Tumore gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einer Tumorklasse behandelt wurden, rückt nun eine spezifische Behandlung von Tumoren entsprechend ihrer molekularen Eigenschaften in greifbare Nähe.

Obwohl die prinzipielle Wirksamkeit solcher neuen Therapien inzwischen in verschiedenen Tumorentitäten eindrucksvoll belegt wurde4,

Für die Aufrechterhaltung mehrzelliger Or-ganismen ist eine strenge Kontrolle von Zell-wachstum und -teilung, Differenzierung und kontrolliertem Zelltod (Apoptose) essentiell. Dies erfordert ein koordiniertes Zusammenspiel insbesondere auf zellulärer Ebene. Kommt es hier bei einzelnen Zellen zu massiven Verände-rungen in der Kontrolle und Regulation, können entartete Zellen entstehen, die sich ungehemmt vermehren, ausbreiten und letztendlich zur Ent-stehung von Krebs führen können.

Modellierung von Krebs

Die molekularbiologische Untersuchung der zellulären Regulation und Kommunikation ist Gegenstand langjähriger Forschung. Mittler-weile haben wir bereits ein sehr umfassendes Bild vieler zellulärer Signaltransduktionswege und der zu Grunde liegenden regulatorischen Prozesse. Diese bilden ein sehr komplexes Netz-werk auf molekularer Ebene. Die mathemati-sche Modellierung dieser komplexen Netzwerke bietet eine Möglichkeit, diese Systeme besser zu verstehen. Im Laufe der letzten Jahre hat sich hierfür die Systembiologie als ein Forschungs-zweig in der Biologie etabliert.

Eine sehr bewährte Herangehensweise für die mathematische Modellierung biologischer Systeme ist die Beschreibung in Form von Dif-ferentialgleichungssystemen. Diese können anschließend genutzt werden, um quantitative Simulationen durchzuführen und das Verhalten der Modelle zu studieren. Wichtig hierbei ist eine stetige Verfeinerung und Optimierung der Modelle auf Basis neuer Daten und Ergebnisse aus Validierungsuntersuchungen.

Die Erstellung mathematischer Modelle benötigt eine Vielzahl an Informationen zur Struktur der molekularen Netzwerke, den Kinetiken und kinetischen Parametern der einzelnen Reaktionen sowie den Konzentrati-

onen und Mengen der beteiligten Moleküle. Viele dieser Informationen sind mittlerweile in umfassenden Datenbanken integriert und stehen somit für die Erstellung von Modellen zur Verfügung (Tab. 1). Geeignete Programme, wie das Modellierungs- und Simulationssystem PyBioS1,2, ermöglichen dann die Integration der Informationen über Signalwege und die Durch-führung von in silico-Experimenten.

Am Max-Planck-Institut für molekulare Genetik haben wir auf Basis der von Hanahan und Weinberg3 formulierten Eigenschaften von Krebs ein mathematisches Modell krebsrele-vanter Signaltransduktionswege entwickelt. Es integriert unter anderem wesentliche Eigen-schaften wie Proliferation, Apoptose und An-giogenese, die bei Krebs dereguliert sind (Tab. 2). Dieses Modell bietet die Möglichkeit, geeignete Ansatzpunkte für neue Medikamente zu identi-fizieren oder auf Basis bekannter Medikamente mögliche Therapieansätze zu optimieren.

Entwicklungen in der Krebstherapie

Die molekularbiologische Forschung hat mitt-lerweile mehrere Hundert Gene identifiziert, deren Mutation beziehungweise genetische Änderung bei der Tumorentwicklung invol-viert sind und daher als Krebsgene bezeichnet werden. Darüber hinaus wurde eine Vielzahl der komplexen Aktivierungsmechanismen zellulärer Signalwege und deren molekulare Vernetzung entschlüsselt. Diese Ergebnisse ermöglichten die Entwicklung einer neuen Ge-neration von innovativen Krebsmedikamenten, die gezielt in die Signalwege von Tumorzellen eingreifen.

Im Gegensatz zu einer bisher stark empirisch ausgerichteten zytotoxischen Chemotherapie, deren Wirkungsnachweise in der Regel statis-tisch an großen Patientengruppen durchgeführt wurde, bieten die molekularen zielgerichteten

Tab. 1: Informationsquellen für die System-biologie

Datenbank URL

Sequenzinformationen und Mutationen

GeneBank www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank

EMBL Nucleotide Database www.ebi.ac.uk/embl

UniGene www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene

Ensembl www.ensembl.org/index.html

Cosmic www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic

Pathway- und Interaktionsdatenbanken

BioCyc www.biocyc.org

KEGG www.genome.jp/kegg

Reactome www.reactome.org

IntAct www.ebi.ac.uk/intact

DIP http://dip.doe-mbi.ucla.edu

MINT http://mint.bio.uniroma2.it/mint

Consensus-PathDB http://cpdb.molgen.mpg.de

Kinetische Parameter

BRENDA www.brenda-enzymes.org

SABIO-RK http://sabio.villa-bosch.de/SABIORK

Expressionsdaten

Gene Express Omnibus (GEO)

www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo

ArrayExpress www.ebi.ac.uk/arrayexpress/index.html

Systembiologische Modelle

BioModels www.biomodels.org

JWS http://jjj.biochem.sun.ac.za

Reaktionen 4024

Kinetische Parameter 4439

Komponenten 2778

Gene 507

Mutierte Gene 62 (3 Onkogene, 58 Tumorsuppressorgene, 1 Genfusion)

Externe Aktivatoren (Wachstumsfaktoren, Hormone etc.)

67

Inhibitoren 53 (40 Medikamente)

Tab. 2: Statistik des mathematischen Krebs-modells

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Blitzlicht Modellierung

darstellt, der eine auf den einzelnen Patienten maßgeschneiderte Therapie erfordert.

Der virtuelle Patient

Aufgrund der rasanten technologischen Fort-schritte ist heute die Analyse von Genomen und Transkriptomen in nur wenigen Stunden möglich. Es ist daher zu erwarten, dass die Me-dizin der Zukunft auf diese generierten Daten zugreift und mit Hilfe von Computern virtuelle Modelle von individuellen Menschen produziert. Diese virtuellen Patienten erlauben es Ärzten, die Wirkung von Behandlungen gemäß individueller genetischer und physiologischer Eigenschaften zu simulieren und zu optimieren. Dadurch, so hoffen wir, können unerwünschte Nebenwir-kungen vermieden und Behandlungen effektiver werden. Daher soll unser Modellierungsansatz im IT Future of Medicine-Projekt (www.itfom.eu), eines der sechs visionären Zukunftskonzepte im Rahmen der EU-Flagship-Initiative, weiter verbes-sert, auf weitere Krankheiten übertragen und in die klinische Routine gebracht werden (Abb. 2).

Literatur

[1] Wierling C, Herwig R, and Lehrach H (2007) Briefings in Func-tional Genomics and Proteomics 6(3):240-251.

[2] Klipp E, Liebermeister W, Wierling C, et al. (2009) Systems Biology – A Textbook, Wiley VCH, Weinheim.

[3] Hanahan D and Weinberg RA (2011). Cell 144: 2646-674.[4] Bollag G, Hirth P, Tsai J, et al. (2010). Nature 467:596–599.[5] Vogelstein B and Kinzler KW (2004) Nat Med 10:789–799.[6] Manolopoulos VG, Dechairo B, Huriez A, et al. (2011). Pharma-

cogenomics 12(5):597-610.


Dr. Alexander KühnDr. Christoph WierlingMax-Planck-Institut für molekulare [email protected]@molgen.mpg.de

zeigte sich auch, dass die Inhibition eines einzigen identifizierten onkogenen Ziels nicht ausreichend ist, um das Tumorwachstum und die Tumorausbreitung im Patienten nachhaltig zu blockieren. Neben der von Patient zu Patient unterschiedlichen Pharmakodynamik, die eine personalisierte und optimierte Therapie limi-tiert, ist eine auf ein onkogenes Ziel gerichtete Therapie dadurch erschwert, dass Tumorzellen variable Reaktionsmöglichkeiten besitzen, die es ihnen erlauben, eine medikamentöse Ausschal-tung eines onkogenen Ziels zu kompensieren oder zu umgehen. So existieren nebeneinan-der mehrere Signaltransduktionswege, die miteinander interagieren und parallel oder in zeitlicher Reihenfolge aktiviert werden können5. Die molekularen Netzwerke und Interaktionen sind dabei so komplex, dass sie nur mit Hilfe systembiologischer Methoden effektiv analy-siert werden können.

Personalisierte Krebstherapie

Unser Modellierungsansatz versucht daher mit Hilfe des Krebsmodells, das Informationen über Signalwege und deren Interaktionen als Resultat aus Jahrzehnten der Krebsforschung enthält, und der individuellen molekularen Charakterisierung des Genoms und Transkriptioms des Tumors die mitogenen und onkogenen Signale zu identifi-zieren, die maßgeblich für die Tumorentwicklung verantwortlich sind. Anschließend können unter Einsatz entsprechender Rechnerkapazitäten die Effekte verschiedener Krebsmedikamente sowie von Medikamentenkombinationen in silico modelliert werden, um so die Basis für eine sys-tematische Optimierung der Therapie für jeden Krebspatienten gemäß des genetischen Profils seines Tumors zu legen (Abb. 1)6.

Da noch immer viele Komponenten, die bei der Tumorentstehung und der Metastasierung eine Rolle spielen und/oder die Reaktion eines Tumors auf bestimmte Medikamente beeinflus-sen könnten, noch nicht im Modell enthalten

sind, ist unser Krebsmodell in verschiedenen Krebs-Forschungsprojekte involviert. Einer-seits versuchen wir, in diesen Projekten das existierende Krebsmodell durch Genom- und Transkriptomsequenzierung weiterer Tumore zu erweitern, um zunehmend verlässlichere prädiktive Aussagen treffen zu können. Ande-rerseits sollen die Modellvorhersagen validiert und die klinische Umsetzbarkeit unseres Mo-dellierungsansatzes gezeigt werden.

Im OncoTrack-Projekt werden zum Beispiel die Tumore von Darmkrebspatienten analysiert und mit Hilfe des Krebsmodells neue Biomarker identifiziert, im PREDICT-Projekt wird retrospek-tiv das Ansprechen von Lungenkrebspatienten auf verschiedene Medikamente vorhergesagt und im TREAT20-Projekt werden mittels unseres Modellierungsansatzes die Behandlungen von Melanompatienten unterstützt. Wir erwarten, dass durch diesen Modellierungsansatz eine personalisierte Medizin im Bereich der Onkolo-gie ermöglicht wird, die der Tatsache Rechnung trägt, dass aufgrund der zahlreichen somati-schen Änderungen jeder Tumor einen Einzelfall

Abb. 1: In silico-Prognose von Medikamentenwirkungen. Darstellung von Tumoren zweier Lungenkrebspatienten. Das Computermodell sagt ein Ansprechen des Tumors von Patient 1 und eine Immunität des Tumors von Patient 2 gegenüber Cetuximab voraus, wie anhand von CMYC, einem Marker für Proliferation, zu sehen ist.

Abb. 2: Computermodellgestützte Medizin der Zukunft. Auf Basis patientenspezifischer Ge-nom- und Transkriptomdaten werden individualisierte Computermodelle erstellt. An diesen virtuellen Patienten können in silico Medikamente getestet und somit Therapien patientenspezifisch optimiert werden.

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LABORWELT

Biopeptide: synthetische Biologie zur Produktion von Peptiden Dipl-Biol. Alexander Craig, Dr. Hubert Bernauer, Dr. Josef Maier, ATG:biosynthetics GmbH, Merzhausen und IstLS, Oberndorf/Neckar

Die Entwicklung von Nachweisverfahren für bakterielle und virale Krankheitserreger sowie von passenden Impfstoffen erfordert profunde biologische Kenntnis des Pathogens und der Immunvorgänge im Wirt. Die Entschlüsselung der Genome zahlreicher Mikroorganismen und Viren sowie die parallel dazu verlaufende intensive Forschung am Säugerimmunsys-tem lieferten wesentliche Beiträge, um die komplexen und vielfältigen Immunvorgänge im gesunden und kranken Organismus zu verstehen. Diese Entwicklungen der Omics-Ära haben neue Wege in der Impfstoffforschung eröffnet, wobei die die synthetische und Sys-tembiologie (Gensynthese, Pathway Engineering, etc.) methodische Neuerungen bringen. Die Bio-Peptid-Technologie der Firma ATG:biosynthetics ist eine solche Entwicklung, die hier kurz vorgestellt werden soll.

Immunomics tauchte als Begriff vor rund 10 Jahren erstmals in der Literatur auf1,2 und bezeichnet den Ansatz, das Gesamtarsenal an Effektormolekülen und -mechanismen im Säu-gerimmunsystem zu charakterisieren. Forscher in diesem Gebiet verfolgen das ehrgeizige Ziel, das vollständige Repertoire an Antikörpern, beteiligten Immunzelltypen, Signalmolekülen (wie z.B. Cytokinen oder Interferonen) sowie die große Vielfalt immunologisch relevanter Peptidantigene funktionell in einen Kontext zu bringen. Diese systembiologische Stoßrich-tung liefert im Zusammenspiel mit Genomics und Proteomics auch neue Impulse für die Impfstoffentwicklung3. Waren die Vakzine der

ersten und zweiten Generation noch Produkte einer relativ „ungerichteten“ Immunisierung mit ganzen Organismen oder ihren aufbereite-ten zellulären Bestandteilen, so ermöglicht die systematische Analyse des Immungeschehen die Entwicklung einer dritten Generation von Vakzinen, die teilweise rational am bioinforma-tischen Reißbrett entworfen wird3.

Peptide sind wichtige Agentien im Immun-geschehen, die Prozesse der humoralen und zellulären Immunabwehr auslösen, aber auch dämpfen können4,5. Auch in Forschung und Entwicklung wurde ihre Bedeutung erkannt6. Um ihre biologische Rolle zu entschlüsseln, können umfangreiche Bibliotheken dieser

Abb. 1: Übersicht über das PepID-Verfahren. Details siehe Haupttext Die Life Science Nord Jobbörse vermittelt Stellenangebote und -gesuche aus den Branchen Medizintechnik, Biotech und Pharma in Hamburg undSchleswig-Holstein. Mit unserer ausgezeichnet vernetzten Branchen-struktur an einem der attraktivstenStandorte Deutschlands verbinden wirArbeiten, Forschen und Lebensqualität auf eine Art, wie man sie nur hier bei uns im Norden findet.www.life-science-nord.net/jobs

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Blitzlicht Medizinische Biotechnologie

Differenzierung zwischen Infektionen mit nahe verwandten Erregern erlauben. Dies ist mit bestehenden Methoden bis dato nur bedingt möglich. Daraus lassen sich, in weiterer For-schung, differentialdiagnostische Schnelltests für Patientenseren entwickeln.

Epitop-Vorhersage

Eine bedeutende Rolle bei rationalen Ansätzen kommt den vorgeschalteten in silico-Analysen zu, die in das Peptiddesign einfließen. In diesem Bereich arbeitet die Firma ATG:biosynthetics eng mit dem Bioinformatiker Dr. Josef Maier (IstLS, Oberndorf) zusammen. Der Umfang im-munologisch relevanter Peptidsequenzen eines Pathogens kann durch Metagenomanalysen und die Auswertung verschiedener Omics-Datensätze (sowohl aus dem Wirt als auch dem Pathogen) auf ein sinnvolles Maß eingegrenzt werden. Der bioinformatische Vergleich von Genomen pathogener und nichtpathogener nahe verwandter Arten und Stämme erlaubt es zum Beipiel, Virulenzfaktoren zu identifizieren, die für Diagnostik und Therapie hohen Wert haben. Gleichzeitig lassen sich mittels Genom-übergreifender Untersuchungen konservierte, potentiell antigene Epitope vermeiden, die auch bei nützlichen Darmbakterien (Kommensalen) oder harmlosen Artverwandten vorkommen3.

Algorithmen für die Vorhersage B-Zell- (An-tikörper-Stimulierung) und T-Zell-spezifischer Epitope (zelluläre Immunantwort) identifizieren Peptide, welche für eine Peptidbibliothek geeig-net sind. Für B-Zell-Epitope sind dabei unter an-derem strukturelle Aspekte der Antigene wie gut zugängliche Oberflächenbereiche entscheidend, für T-Zell-Epitope, wie effektiv sie auf den in der Wirtspopulation weitverbreiteten MHC-Typen präsentiert werden – und damit ihre Fähigkeit, eine starke zelluläre Immunantwort zu stimulie-ren (z.B. bei Tuberkulose-Erregern, Viren). Detail-liertere Auswertung und Integration der Daten aus Metagenom- und Immunomicsanalysen ermöglichen Peptidbibliotheken mit populati-onsspezifisch oder personenspezifisch optimier-ter Sichtbarkeit für das Immunsystem.

Immunologischer Fingerabdruck

Die Biopeptid-Technologie von ATG:biosyn-thetics kann auch in anderen Gebieten zum Einsatz kommen (siehe Abb. 2), zum Beispiel um den Immunstatus von Patienten zu unter-suchen. Über die Peptide könnten charakteris-tische Antikörperrepertoires oder die Ausstat-tung mit Immunzellen ermittelt werden. Solch ein immunologischer Fingerabdruck wäre bei Autoimmunerkrankungen oder Infektion ein wertvolles diagnostisches Werkzeug, um zum Beispiel Therapien optimal auf den Patienten abzustimmen (personalisierte Medizin).

Neben der Validierung neuer Antikörper wären Peptid- oder Protein-Microarrays für

Antigene angelegt und getestet werden. Bis dato wurden randomisierte Peptidfragmente entweder chemisch synthetisiert7,8 oder in Phagenbibliotheken9 zusammengefasst. Oft wurde mit diesen gewaltigen Bibliotheken aber im Schrotschussverfahren gearbeitet, da die zahllosen Aminosäurekombinationen nicht mit Blickwinkel auf ihre biologische Relevanz produziert wurden7.

Maßgeschneiderte Peptidbibliotheken

In bestimmten Fällen dürfte es sinnvoller sein, maßgeschneiderte, fokussierte Peptidbibliothe-ken aus den immunologisch relevanten Prote-inen genetisch gut charakterisierter Erreger anzulegen. Die Firma ATG:biosynthetics bietet hier ein patentiertes Verfahren zur Herstellung von Peptiden in biologischen Systemen an (sie-he Abb. 1). Zuerst zerlegt ein bioinformatischer Algorithmus in silico Proteinsequenzen von Inte-resse in überlappende oder nicht-überlappende Peptidfragmente definierter, aber flexibel wählbarer Länge. Die auf DNA-Ebene Codon-optimierten Peptidfragmente werden mittels Gensyntheseverfahren in Gruppen von neun bis 11 Peptiden in DNA „gegossen“ und liegen als kompakte Bibliothek auf einem Plasmid (source vector) vor. Dieser kann als rekombinantes Konstrukt in E. coli-Laborstämmen vermehrt werden. Durch einen einfachen Doppelverdau mit Restriktionsenzymen werden die Peptid-kodierenden DNA-Abschnitte freigesetzt und können dann in einen passenden Expressi-onsvektor kloniert werden, wo zugleich eine Kopplung an die Sequenz für ein Trägerprotein stattfinden kann. Als Trägerproteine kommen etwa abspaltbare Tags zur Affinitätsaufreini-gung in Frage. Die Expressionsbibliothek wird

in E. coli transformiert, um für jedes Peptid Einzelklone zu erhalten, die nach Verifikation als Dauerkulturen aufbewahrt werden.

Ein Vorteil dieses Verfahrens liegt auf der Hand: Die Peptide können jederzeit aus dem source vector regeneriert und nahezu unbe-grenzt produziert werden. Mit steigender Men-ge und Peptidlänge bedeutet dies gegenüber der chemischen Synthese einen Kostenvorteil. Das Verfahren ist geeignet, die kodierenden Sequenzen ganzer Genome in Form von Pep-tidbibliotheken abzubilden. Die Analyse kann mittels verschiedener „Display Technologien“ (Phage, E. coli, Yeast display etc.) erfolgen, aber auch mittels Mikrotiterplatten und Arraysyste-men. Solche Hochdurchsatzverfahren, die für randomisierte Bibliotheken bereits umgesetzt wurden10, sind für spätere Massenscreenings wünschenswert.

Entwickelt wurde das System ursprünglich, um Patientenseren mittels Phagendisplay randomisierter Peptidfragmente des humanen Papillomvirus auf Virenbelastung zu testen. Eine erste Anwendung des Verfahrens wird momen-tan mit der Arbeitsgruppe von Dr. Sebastian Ulbert am Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie in Leipzig umgesetzt. Dabei wird die Immunreaktion auf Infektionen mit dem West-Nil-Virus untersucht11.

Der Leipziger Forscher sieht einen Vorteil von rationalen Peptidbibliotheken, die aus dem kompletten Proteom eines viralen Krankheits-erregern konstruiert werden, in der schnellen Vorsortierung geeigneter Epitopkandidaten. Da die Epitope auch umfangreicher sein dürfen, kann ab 20 bis 30 Aminosäureresten neben den linearen B-Zell-Epitopen bereits ein Teil einfacherer struktureller Epitope erfasst werden. Weiterhin ermöglicht dieses Verfah-ren, Bereiche zu identifizieren, die eine exakte

Abb. 2: (Potentielle) Anwendungen der BiopeptID-Technologie in der Biomedizin. Diese de-cken sich in weiten Bereichen mit denen chemisch synthetisierter Peptide.


LABORWELT

die Forschung oder Diagnostik ein weiteres Einsatzgebiet4,7,12-14, genau wie die Krebsthera-pie5. Das Verfahren bietet sich zudem an, um Protein-Protein-Interaktionen jeglicher Art zu untersuchen15. Proteine oder Proteinabschnitte werden dazu so lange gezielt verkürzt, bis mi-nimale Interaktionsdomänen definiert werden können. Die Peptide unterschiedlicher Länge würden in einer oder wenigen Peptidbibliothe-ken zusammengefasst und exprimiert.

Bottlenecks

Das Verfahren hat auch Grenzen. Modifi-zierte Aminosäuren lassen sich noch nicht in die Peptide einbauen. Hier könnte sich die nicht-ribosomale Peptidsynthese in Mikroor-ganismen zu einer Alternative entwickeln16. ATG:biosynthetics arbeitet an solchen Ver-fahren in Kooperationen und bietet für solche Projekte Multigen-Expressionsvektoren und geeignete Verfahren zur Assemblierung von Pathways an. Bei den Mimotopen sind sie hin-gegen keine Alternative, da diese noch nicht rational definiert werden können.

Die Herstellung in Mikroorganismen er-fordert, die Peptide bei der Aufreinigung von den Entzündungs-auslösenden Endotoxinen zu trennen. Dies ist ein Nachteil gegenüber chemischen Peptiden, der aber heutzutage technisch keine wesentliche Herausforderung darstellt. Dass Peptide mit unterschiedlicher Effizienz produziert werden, kann auch bei den Biopeptiden vorkommen, wobei aber die oben erwähnten bioinformatischen Verfahren helfen, beispielsweise potentiell aggregierende Peptide auszuschließen. Dies ist angemessen, da diese für das Immungeschehen in der Regel eine untergeordnete Rolle spielen dürften. Ein zeitraubender Schritt ist die Validierung der Klone, auch wenn robotische Verfahren die Ana-lyse deutlich beschleunigen. Will man ähnlich rigorose Standards wie bei den chemisch syn-thetisierten Peptiden anlegen, empfiehlt sich eine Überprüfung der Peptididentität mittels Massenspektrometrie. Diese muss nur einmal vorgenommen werden, da man bei den Biopep-tiden von einer Stabilität der auf den Plasmiden kodierten DNA ausgehen kann.

Ein nicht unerheblicher Gesichtspunkt ist der ökologische Fingerabdruck (nachhaltige Produk-tion): unter diesem Aspekt dürften Bio-Peptide17 ihren vollsynthetischen Pendants in Zukunft vorzuziehen sein. Die chemische Synthese von Peptiden verbraucht enorme Mengen an Rohstoffen und vor allem Wasser18. Substanzen wie Acetonitril, die in der Synthese zum Einsatz kommen, sind giftig. Bei den Bio-Peptiden müssen zwar ebenfalls die Peptid-kodierenden DNA-Konstrukte chemisch synthetisiert wer-den, aber hier liegen die benötigten Mengen im Mikrogramm-Bereich, da Mikroorganismen den Rest des Produktionsprozesses übernehmen. Rational konstruierte Bio-Peptide bieten sich in vielen Bereichen als gute Alternative oder

Ergänzung zu chemisch hergestellten Pepti-den an. Die kommenden Jahre werden zeigen, wie die Forschung diese neue Technologie aufnimmt.

Literatur

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Wissenschaft Epidemiologie

Sequenzanalyse offenbart erstes Reservoir für Ebola-ähnliche Viren in EuropaDr. Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg

Natürliche Infektionen mit Filoviren, wie dem Ebola- oder dem Marburg-Virus, waren bislang ausschließlich aus Zentralafrika und den Philippinen bekannt. In einer aktuellen Studie berich-ten Negredo et al.1 von der Entdeckung des ersten Filovirus-Reservoirs in Europa in insektivoren Fledermäusen. Eine Sequenzanalyse mit dem Genome Sequencer FLX (454 Life Sciences, Bran-ford, USA) zeigt, dass das in der nordspanischen Höhle Cueva del Lloviu entdeckte Lloviu-Virus (LLOV) sich genetisch signifikant von den in Zentralafrika verbreiteten humanpathogenen Ebola (EBOVs)- und Marburgviren (MARVs) unterscheidet und eine eigene neue Gattung bil-det. Die genomische Sequenz von LLOV weicht bei voller Konservierung sämtlicher offener Leserahmen (ORFs) um etwa 50% von jener bekannter Ebolaviren ab. Obgleich ein kausaler Nachweis noch aussteht, könnte LLOV im Gegensatz zu den in Fledermäusen apathogenen EBOVs und MARVs in Zusammenhang mit schnell verlaufenden, tödlichen Ausbrüchen in Populationen der Fledermausart Miniopterus schreibersii in Frankreich, Nordspanien und Portugal stehen. Darauf deutet das Auftreten des -ssRNA-Virus in von dem Fledermausster-ben betroffenen Subpopulationen, nicht aber benachbarten gesunden Populationen hin. Die Analyse und Vorhersage der geographischen Verbreitung der verschiedenen Filovirusty-pen legt nahe, dass lokal auftretende Virussubpopulationen phylogenetische Gruppen mit stabiler Wirt-Parasit-Beziehung bilden und dass LLOV eine eigenständige ökologische und geographische Nische besetzt.

RNA-abhängigen RNA-Polymerase nachge-wiesen werden. In nachfolgenden real-time PCR-Analysen konnten die Wissenschaftler zwischen 103 bis 106 Kopien der Filovirus-ss-RNA in allen 20 Exemplaren mit ähnlicher Pathologie durchweg in Lungengewebe und teilweise in den anderen untersuchten Geweben quantifizieren. Ähnliche Resultate fanden sie in fünf verendeten M. schreibersii, die aus einer anderen nordspanischen Höhle stammten. Keine Filovirus-RNA konnten sie dagegen in neun in derselben Höhle verstor-benen Exemplaren von M. myotis sowie 1.295 gesunden Fledermäusen von verschiedenen spanischen Standorten detektieren.

Zur Sequenzanalyse mit dem GS FLX System wurde die aus M. schreibersii vom Original-standort isolierte Probe mit der höchsten Vi-ruslast (4,0 x 106 Genomkopien) ausgewählt. Lücken der aus 225.758 Reads erhaltenen 12,1 kb-Virussequenz sowie die Termini wurden mittels RACE-PCR geschlossen und lieferten eine für Filoviren charakteristische genomi-sche Organisation. Das von Negredo et al.1

nach seinem Fundort benannte LLOV-Virus codiert sieben offene Leserahmen (ORF) auf einem 19 kb einzelsträngigen, negative sense RNA-Genom (–ssRNA). Allerdings unterschei-det sich die Transkription von LLOV und den bekannten Filoviren;| Die sieben ORFs werden von fünf mRNA-

Transkripten sowie einem bicistronischen Transkript codiert, das zugleich das VP25- und L-Protein exprimiert

| Die Transkriptionsinitiations-Sequenz unterscheidet sich von jener aller bisher bekannten Ebolaviren.

Filovirusinfektionen sind vor allem als Ursa-che tödlich verlaufender hämorrhagischer Fieber im Menschen und in Primaten bekannt. Die Familie der Filoviridae umfasst zwei Gat-tungen: Marburgvirus, mit diversen Stämmen des Viktoriasee-Marburgvirus (MARVs), so-wie Ebolavirus (EBOVs) mit den vier Species Sudan-Ebolavirus (SEBOV), Zaire-Ebolavirus (ZEBOV),, Elfenbeinküsten-Ebolavirus (ICE-BOV) und Reston-Ebolavirus (REBOV) sowie die vermutliche Species Budibugyo-Ebolavirus (BEBOV). Bis auf das auf den Philippinen endemische REBOV sind die bisher bekann-ten Filoviren humanpathogen und in Afrika verbreitet. Obgleich das Wissen zu natürli-chen Reservoiren noch lückenhaft ist, gibt es verschiedene Hinweise auf Fledermäuse. So konnten Leroy2 und Swanepoel3-4 nachweisen, dass natürlich oder künstlich mit ZEBOV oder MARV infizierte Fledermausarten die Filoviren länger als drei Wochen über den Faeces aus-scheiden. Ein massives Fledermaussterben in Populationen von Miniopterus schreibersii in Frankreich, Portugal und Spanien war der Anstoß für Negredo et al.1, nach Ursachen

zu suchen. Die state-of-the-art-Analyse und genomische Sequenzierung von in der Cueva del Lloviu verendeten Exemplaren mit dem GS FLX System führte zur Entdeckung des neuar-tigen Ebolavirus-ähnlichen Filovirus LLOV.

Ergebnisse

Basis der Untersuchung von Negredo et al.1

war die Untersuchung von 20 im Zuge des großen Fledermaussterbens von 2002 in der Cueva del Lloviu verendeten M. schreibersii. Bei der pathologischen Inspektion formalin-fixierter Abstriche des Rektums, des Rachens sowie von Milz, Hirn, Lunge und Leber zeigten sich keine makroskopischen Läsionen. Mikros-kopisch waren jedoch interstitielle Lungenin-filtrate von Lymphozyten und Makrophagen sowie eine Lymphozyten-Depletion in der Milz sichtbar, die auf eine virale Pneumonie hindeuteten. In PCR-Analysen von Extrak-ten aus Lungen, Milz- und Lebergewebe sowie Rektumabstrichen konnte in 5 von 6 Tieren die Filovirus-spezifische Sequenz der

Abb. 2: Organisation von LLOV. Die schwarzen Balken stehen für offene Leserahmen, die roten Pfeile für bioinformatisch ermittelte mRNAs. Transkriptionsinitiations- und -terminations-Stellen sind in hellbau bzw. orange dargestellt [nach Negredo et al. aus 1].

Abb. 1: GS FLX System

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Wissenschaft Epidemiologie

Ein Vergleich der Sequenzen von LLOV, EBOVs und MARVs zeigte einen hohen Konservie-rungsgrad der ORFs:| Die C-terminale Domäne von VP35, die in

EBOVs den Schutz gegen eine Typ I-Inter-feron-Antwort des Wirtimmunsystems vermittelt, ist in LLOV konserviert.

| Für die Reifung von LLOV wichtige Peptid-motive des VP40-Matrixproteins ähneln stärker MARV- als EBOV-Motiven.

| Das in Filoviren immunsupprimierende Mo-tiv in GP2 ist auch in LLOV hochkonserviert.

| Die zwei für die Hemmung der Interferon-b -induzierten Genexpression im Wirt erforderlichen VP24-Domänen aus EBOVs sind auch in LLOV konserviert.

| Ebenso zeigte eine phylogenetische Analyse der konservierten Domäne III der RNA-ab-hängigen RNA-Polymerase, dass LLOV zu den Filoviridae zählt und nahe verwandt zu den EBOVs ist.

Die phylogenetische Analyse des kompletten LLOV-Genoms (21.800 Nukleotide) bestätigte aber, dass LLOV eine eigenständige genetische Linie ist, die nach den MARVs vor 7100 Jahren entstanden ist. Darauf deutet der Sequenz-vergleich von LLOV mit MARVs hin, der zu 57,3-57,7% verschiedene Sequenzen lieferte. Der Unterschied zu EBOVs ist mit 51,8-52,6% etwas weniger ausgeprägt.

Diskussion

Trotz detaillierter Untersuchungen über die Ver-breitung filoviraler Erkrankungen in Menschen, Menschenaffen und anderen Primaten, sind die Informationen über ihre Übertragungswege und Reservoire lückenhaft. Untersuchungen potentieller Reservoire mit long-read Next-Ge-neration Sequencing eröffnen die Möglichkeit, diese Lücken zu schließen. So identifizieren die Arbeiten von Negredo et al. nicht nur Fleder-mäuse als eines der zahlreichen diskutierten Filovirus-Reservoire. Sie deuten auch darauf hin, dass Filoviren viel weiter verbreitet sind als bisher bekannt und in Europa bisher unbekannte geographische und ökologische Nischen beset-zen. Tatsächlich deutet die sequenzbasierte Ent-deckung der neuen Gattung Cuenavirus mit dem bisher einzigen Vertreter LLOV von Negredo et al. auf das Vorhandensein weiterer Filoviren. Die Wahrscheinlichkeit, dass das für M. schreibersii pathogen erscheinde LLOV für den Menschen gefährlich sein könnte, ist indes unwahrschein-lich: Bislang wurden von dem von Touristen auch während des Fledermaussterbens von 2002 viel-besuchten Fundort in Spanien – und auch von Fundorten in Frankreich und Portugal – keinerlei Erkrankungen des Menschen gemeldet. State-of-the-art-Untersuchungen mit dem Genome

Sequencer FLX erscheinen geeignet, hilfreich beim Aufspüren weiterer Filovirus-Vertreter zu sein und so Untersuchungsergebnisse aus den achtziger Jahren zu erklären, die anhand der im Blutserum gebildeten Antikörper gegen Filoviren eine weltweite Verbreitung dieser Virusklasse nahelegen.

Literatur

[1] Negredo A, Palacios G, Vázquez-Morón S, González F, Dopazo H, et al. (2011) Discovery of an Ebolavirus-Like Filovirus in Europe. PLoS Pathog 7(10): e1002304. doi:10.1371/journal.ppat.1002304

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Dr. Burkhard ZiebolzRoche Applied Science 82377 [email protected]

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Blitzlicht Systembiologie

Zellprozesse: zwischen mathematischem Modell und gezieltem ExperimentEdda Klipp, Theoretische Biophysik, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin

Bei der Reaktion von Zellen auf Veränderungen der Umwelt greifen verschiedene Prozesse inein-ander. Wir untersuchen insbesondere die Antworten von Zellen auf unterschiedliche Reize, wie Veränderung der Nährstoffbedingungen, die Stimulation mit Wachstumsfaktoren und Pheromonen oder den Wechsel von physiko-chemischen Bedingungen wie Osmolarität oder Temperatur. Als Mo-dellorganismus nutzen wir meist die vollständig sequenzierte Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, für die Abschätzungen von Proteinzahlen pro Zelle (siehe yeastgfp.yeastgenome.org) bekannt und deren Stoffwechselwege und Signalnetzwerke relativ gut aufgeklärt sind. Außerdem eignet sie sich gut für genetische Manipulationen, die ethisch unbedenklich sind.

Aktivierung der stressaktivierten Kinase Hog1 sowohl die Transkription des Zyklins Cln1/2 als auch den Abbau von Sic1 durch Phosphorylie-rung hemmt und damit den Zellzyklusfort-schritt verzögert, haben wir ein einfaches ma-thematisches Modell in Form von Differential-gleichungen formuliert. Obwohl in keiner Form kalibriert, gab dieses Modell erste interessante Hinweise: Simulation mit unterschiedlichen Niveaus an osmotischer Stimulation führten zu unterschiedlich langen Verzögerungen des Zellzyklus. Dagegen bewirkte die Aktivierung von Hog1 zu verschiedenen Zeiten nur dann einen Zellzyklusarrest, wenn diese Aktivierung in der frühen G1-Phase stattfand.

Diese Ergebnisse erschienen auch aus experimenteller Sicht plausibel, erforderten nun aber eine quantitative Absicherung. Un-sere spanischen Kooperationspartner haben daraufhin für zellzyklussynchronisierte Zellen die Dynamik in der Antwort auf osmotischen Stress ausführlich vermessen. Sie haben Zellen untersucht, die entweder jeweils in der frühen G1-Phase mit unterschiedlichen Salzkonzen-trationen (0,2 M NaCl bis 0,8 M NaCl) oder jeweils mit gleichen Salzkonzentrationen (0,4 M NaCl), aber zu verschiedenen Zeitpunkten (0 min, 10 min, 20 min, 30 min nach Beendigung des pheromoninduzierten Zellzyklusarrestes) behandelt wurden. Für diese Zellen haben sie die Aktivierung von Hog1, die Expression von Cln2 und Clb5 sowie die Menge von Sic1 per Western Blot über den Zeitraum von bis zu zwei Stunden alle 10 min gemessen. Außerdem wurde mit fluoreszenzaktivierter Zellsortie-rung (FACS) die Anzahl der Zellen bestimmt, die in die G2-Phase übergegangen sind.

Diese Daten wurden benutzt, um ein – inzwischen weiter verbessertes – Modell zu kalibrieren, also die Parameter für die einzelnen Differentialgleichungen zu bestimmen. Es zeigte sich jedoch, dass eine gute Übereinstim-mung zwischen Daten und Simulation nicht allein durch Parameteranpassung zu erzielen war, sondern nur, wenn man einen bisher nicht bekannten Aspekt miteinbezieht, nämlich dass aktives Hog1 auch die Transkription von Clb5/6 hemmt.

Damit lieferte das Modell eine neue erste Hypothese, die experimentell zu verifizieren war. Modellsimulationen (in silico) indizierten, dass die Überexpression von CLB5, aber nicht von CLN2, den G1-Arrest aufheben. Während die Überexpression von CLN2 in vivo (mittels GAL-Promoter) unter Osmostress zu normalem Zellzyklusarrest führte, bewirkte die CLB5-Überexpression ein Fehlen des Arrestes nach osmotischem Stress.

Dieses und weitere Experimente haben bestätigt, dass das mathematische Modell die Prozesse bei der Zellzyklusregulation unter os-motischem Stress sehr gut beschreibt. Auch die Anfangsbeobachtung, dass stärkerer Stress zu längerem Arrest führt und dass es ein gewisses Zeitfenster für den Arrest gibt, konnte über-prüft und quantitativ beschrieben werden.

Hier untersuchen wir unter anderem die Re-aktion der Hefezellen auf hyperosmotischen Stress. Dazu werden die Zellen durch Zugabe von Salz oder Sorbitol zum Medium osmotisch gestresst und schrumpfen. Zur Kompensation produzieren die Zellen verstärkt Glyzerin, das sich vorübergehend akkumuliert. In einem kombinierten Ansatz von theoretischer Mo-dellentwicklung und gezielten Experimenten konnten wir die Dynamik des verantwortlichen Signalweges, des High Osmolarity Glycerol (HOG)-Signalweges aufklären und verstehen, wie die Regulation von Genexpression, Stoff-wechsel und einem Glyzerinkanal zusammen-spielen, um das Volumen der Zellen und den internen Turgordruck wiederherzustellen1. Es zeigte sich jedoch, dass die gewonnenen Er-kenntnisse viele neue und spannende Fragen aufwerfen.

In einem aktuellen Projekt haben wir ge-meinsam mit unserem Kooperationspartner Francesc Posas von der Universitat Pompeu

Fabra in Barcelona versucht zu verstehen, wie die Aktivierung des HOG-Signalweges wiede-rum Einfluss auf die Progression des Zellzyk-lus nimmt2. Es ist seit langem bekannt, dass die Zellen ihr Wachstum unter Osmostress vor übergehend einstellen, bis sie sich an die neuen Bedingungen angepasst haben.

Bei unserer Untersuchung haben wir uns zunächst auf die Regulation der G1-Phase des Zellzyklus und den Übergang in die S-Phase konzentriert. In dieser Phase wird der Zellzyklus-fortschritt wesentlich durch die koordinierte Pro-duktion von Zyklinen (Cln3, Cln1/2, Clb5/6), ihre Bindung an die zyklinabhängige Kinase Cdk1 und damit Bildung von aktiven Komplexen sowie die Hemmung des Komplexes Clb5/6-Cdk1 durch den Inhibitor Sic1 bestimmt. Der Abbau von Sic1 aktiviert Clb5/6-Cdk1, das die DNS-Replikation steuert. Cln1/2-Cdk1 koordiniert dagegen die Bildung der Zellknospe.

Zur Beschreibung der bekannten Fakten unter osmotischem Stress, nämlich dass die

Abb.1: Einfluss von osmotischem Stress auf den Zellzyklus. Einzelheiten siehe Text. Modifi-ziert nach Abb. 1 in [2]

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Blitzlicht Systembiologie

Differentialgleichungen. Für die Simulation von Genregulationsnetzwerken, aber auch für die Interaktion von verschiedenen Signalwegen mit dem Zellzyklus werden auch Boole’sche Netzwerke benutzt, die bei der zeitlichen Simu-lation jeweils nur zwei Zustände (z.B. „an“ oder „aus“) von Genen oder anderen Komponenten betrachten7.

Im Rahmen von verschiedenen Kooperations-projekten werden diese Methoden auf unter-schiedliche Zellsysteme und Fragestellungen angewendet. Im BMBF-finanzierten Projekt Drug-iPS wird untersucht, wie die Netzwerke für die Transformation von ausdifferenzierten Zellen in pluripotente Zellen gezielt beeinflusst und eventuell durch kleine Molekule angeregt werden können. Im BMBF-Projekt ColoNet werden die für die Entstehung von Dickdarm-krebs relevanten Signalwege auf Biomarker hin untersucht. Im BMBF-Projekt Translucent2 wird die Homöostase von Kationen in Hefezellen mit thermodynamischen Modellen beschrieben. Das EU-geförderte Projekt UniCellSys zielt darauf ab, die einzelnen Stoffwechsel- und Signalwege in Hefezellen genau zu verstehen und experi-mentell zu beschreiben. Andererseits werden mit Hochdurchsatzmessungen Genexpressi-onsprofile, Proteinmengen und andere globale Eigenschaften der ganzen Zellen gemessen. Ziel ist eine Integration der verschiedenen Modelle und Daten in ein umfassendes Bild – sowohl als theoretische Modellstruktur als auch als geordnete Sammlung von experimentellen Fakten – des Zellgeschehens, dass es erlaubt, auch bisher unverstandene oder nicht zusam-men betrachtete Aspekte zu verstehen und in Relation zu setzen.

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Prof. Dr. Dr. h.c. Edda Klipp Humboldt-Universität zu Berlin Institut für Biologie – Theoretische Biophysik Invalidenstr. 42, 10115 Berlin Tel./Fax: +49-(0)30-2093-9040 /-2093-8813 [email protected]

Es blieb jedoch die Frage offen, warum sich ein Regulationssystem entwickelt hat, dass drei verschiedene Mechanismen für die Realisierung des Zellzyklusarrestes benutzt: die Regulation von Cln1/2 auf der Transkriptionsebene, die tran-skriptionelle Regulation von Clb5/6 und sowie die stabilisierende Sic1-Phosphorilierung durch Hog1. Um das besser zu verstehen, haben wir mit dem Modell verschiedene Szenarien simuliert, die im Experiment nur aufwendig umsetzbar sind. So haben wir für virtuelle Mutanten, bei denen zum Beispiel die Transkriptionsregula-tion von CLN2 oder CLB5 nicht möglich war, die Stressantworten der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten simuliert. Als weitere virtuelle Mutante haben wir eine Form von Sic1 betrach-tet, die durch Hog1-Phosphorilierung nicht stabilisiert werden konnte. Diese Simulationen ergaben folgende Ergebnisse: Wenn die Zellen kurz nach dem Beginn der G1-Phase osmotisch gestresst wurden, zeigten die virtuellen Mu-tanten, die CLN2 nicht regulieren können oder die Sic1 nicht stabilisieren können, einen Arrest von nahezu der gleichen Dauer wie im Wildtyp. Virtuelle Mutanten, die CLB5-Transkription nicht hemmen können, hatten jedoch kaum einen Arrest unter Osmostress. Das bestätigte noch einmal die bereits oben formulierte Erkenntnis, dass die transkriptionelle Inhibition von CLB5 essentiell für den korrekten Zellzyklusarrest ist. Wurden die Zellen jedoch 20 min später osmotisch gestresst, zeigte sowohl die Mutante ohne Regulation der CLN2-Expression als auch die virtuelle Sic1-Mutante einen deutlich ver-kürzten Arrest. Dies weist darauf hin, dass die Stabilisierung von Sic1 durch Hog1 insbesondere dann wichtig wird, wenn die Zellen in der spä-ten G1-Phase gestresst werden und wenn sich bereits so viel Clb5/6 akkumuliert hat, dass die Zellzyklusprogression durch transkriptionelle Kontrolle nicht mehr gestoppt werden kann. Hier erlaubt Sic1-Stabilisierung offensichtlich einen späten, alternativen Schutzmechanismus.

Es hat sich herausgestellt, dass die Implika-tionen dieser Modellsimulationen auch in vivo

getestet werden können. Dazu wurde in Sic1 die durch Hog1 zu phosphorylierende Aminosäure ausgetauscht, SicT173A, und dann wiederum FACS-Experimente zum Übergang der Zellen in die G2-Phase bei Stress zu verschiedenen Zeitpunkten gemacht. Es hat sich bestätigt, dass diese Zellen tatsächlich schneller in die G2-Phase übergehen – hier gemessen als Verdopplung des DNS-Gehaltes. Allerdings ist die Dynamik von Knospen (also Bildung von Tochterzellen) unverändert, was darauf hindeuten kann, dass die Stabilisierung von Sic1 auch eine Rolle bei der Synchronisation der Knospenbildung und DNS-Replikation spielt.

Die hier beschriebene Interaktion von Mo-dellbildung und Experiment hat uns geholfen, die zeitliche Interaktion von prototypischen Signalwegen in der Zelle – Stressantwort und Zellzyklusmaschinerie – qualitativ und quanti-tativ besser zu verstehen.

Wir benutzen solche Ansätze auch für weitere interessante Fragen, insbesondere in solchen Fällen, in den die Antworten nicht direkt aus dem Experiment ablesbar sind, zum Beispiel weil (bisher) kein geeignetes Experiment zur Verfü-gung steht. So berechnen wir unter anderen die Interaktionen und Phosphorylierungszustände der Proteine in verschiedenen Signalkaskaden und versuchen die Weiterleitung von Infor-mation innerhalb dieser Kaskaden, aber auch zwischen unterschiedlichen Signalwegen zu quantifizieren3,4] Außerdem lassen sich physi-kalische Größen wie der Turgordruck, der bei Bäckerhefe bisher nicht direkt gemessen werden konnte, aus Daten über die Signalwege und die Volumenveränderung berechnen5.

Die Spannbreite der mathematischen Mo-dellierungsmethoden reicht dabei von ge-wöhnlichen Differentialgleichungen für viele Stoffwechsel- und Regulationsprozesse über stochastische Ansätze für Prozesse mit kleinen Teilchenzahlen (wie z.B. die Genregulation bei geringen mRNS-Stückzahlen6) bis hin zu räum-lichen Simulationen von gerichteten Zellantwor-ten mit stochastischen Ansätzen oder partiellen

Abb.2: In silico-Knock out der Zellzyklusregulation durch osmotischen Stress. Erklärungen siehe Text. Modifiziert nach Abb. 1 in [2]

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Blitzlicht Landesexzellenzinitiative

Fundamentals for synthetic biological systems – SynBioPD Dr. Monika Johannsen, Prof. Dr. An-Ping Zeng, Technische Universität Hamburg-Harburg, Institut für Bioprozess- und Biosystemtechnik, Hamburg

Durch die von der TU Hamburg-Harburg initiierte, weltweit erstmalige Verknüpfung von Moleku-larbiologie, Verfahrenstechnik, Mikrosystemtechnik, Bioinformatik und Nanotechnologie erschlie-ßen sich in den Bio- und Ingenieurwissenschaften völlig neue Forschungsfelder. Angestrebt sind neuartige biosynthetische Reaktionskaskaden und Bioproduktionsprozesse, die es bis dato nicht gibt. Die biologischen und technologischen Grundlagen für diese Entwicklung sind Gegenstand der Forschung im Hamburger Landesexzellenzcluster „Fundamentals for Synthetic Biological Systems – SynBio“. Ein wesentliches Ziel dabei ist, komplexe Stoffwechselprozesse und Biosynthesereakti-onen, wie sie beispielsweise in Bakterienzellen ablaufen, in einzelne austauschbare Bioreaktions-Bausteine zu zerlegen. Diese Bausteine, sogenannte Biobricks, sollen nach dem Baukastenprinzip zu neuartigen, technologisch besonders effizienten, biologischen Systemen zusammengefügt werden, die einzigartige Prozessbedingungen bieten. Durch die dadurch in Aussicht stehenden Entwicklungen hocheffizienter Produktionssysteme ergibt sich ein großes Potential für eine Vielzahl von Anwendungen wie die gezielte Synthese von Biopharmazeutika, die Herstellung von smarten (Bio-) Materialien und Feinchemikalien sowie die Produktion von Bioenergie.

In „SynBio“ widmen wir uns zunächst grund-legenden Fragestellungen der sogenannten in vitro-Synthetischen Biologie. Im Gegen-satz zur in vivo-Synthetischen Biologie, wo hauptsächlich modifizierte DNA-Sequenzen für neuartige Biosynthesen in Mikroorganis-men verwendet werden, strebt die in vitro-Synthetische Biologie an, biologisch gefertigte Bausteine („Biobricks“) und Komponenten (z.B. Enzyme) für gezielte Anwendungen außer-halb von Mikroorganismen, zum Beispiel in einer zellfreien Biosynthese, einzusetzen. Eine vielversprechende Entwicklung ist das Design neuer Stoffwechselwege zwecks nachhaltiger Produktion maßgeschneiderter Medikamente und Feinchemikalien sowie für die Herstellung von Bioenergie.

Die Untersuchung von in vitro syntheti-schen, enzymatischen Wegen, die aus einer Vielzahl von Reaktionsschritten bestehen, stellt eine große Herausforderung dar. Die grundsätzliche Machbarkeit wurde in Form von „Eintopf-Verfahren“ gezeigt, jedoch sind diese üblicherweise sehr ineffizient (Abb. 2). Dafür sind folgende Limitierungen in mehr-stufigen biokatalytischen Reaktionssystemen verantwortlich: Reversibilität der Reaktionen, Inhibition der Enzyme durch das Produkt oder Zwischenprodukte und unterschiedliche Anforderungen der einzelnen Enzyme an opti-male Reaktionsbedingungen. Weitere kritische Punkte sind die Stabilität der Enzyme und Cofaktoren, die Kosten der Enzyme sowie die Skalierbarkeit des Prozesses.

Um das Potential der in vitro-Synthetischen Biologie nutzen zu können, werden neue Kon-zepte benötigt. Hierfür wird in „SynBio“ eine Reihe von Innovationen angestrebt. Durch Screening und molekulares Design sollen neuartige Biokatalysatoren (z.B. Extremozyme) gefunden werden. Enzymatische Reaktionen sollen an Nanomaterialien in mikrofluidischen Systemen durchgeführt werden, die einzigarti-ge Prozessbedingungen bereitstellen können (z.B. hohes Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis und räumlich getrennte Reaktionen unter verschiedenen optimalen Bedingungen), die in konventionellen Bioreaktionssystemen nicht möglich oder tragfähig sind2. Dies ist insbeson-dere der Fall, wenn empfindliche Substanzen für die Reaktion eingesetzt werden. Mikrosys-teme sind ebenfalls reizvoll in Fällen, wo eine hohe Reaktionsrate oder ein kompaktes Reak-torvolumen erwünscht ist, zum Beispiel bei der Realisierung eines sogenannten „Zuckerautos”, das mit an Bord aus Biomasse hergestelltem Wasserstoff betrieben werden soll.

Die Projektpartner konzentrieren sich in ihren Arbeiten auf zwei Modellsysteme: | einen synthetischen Stoffwechselweg für

die hocheffiziente Produktion von Wasser-stoff aus Biomasse und

| einen neuartigen Produktionsweg für das hochwertige Produkt 1,3-Propandiol aus dem Abfallprodukt Glycerin.

Rasante Fortschritte in Technologiefeldern wie der Gensequenzierung, funktionellen Genomik, Computersimulation, Mikrofluidik und Nanotechnologie eröffnen den Bio- und Ingenieurwissenschaften neue herausfor-dernde Forschungsfelder1. Im Hamburger Landesexzellenzcluster „Fundamentals for Synthetic Biological Systems (SynBio)“ unter-sucht ein interdisziplinäres Team (Abb. 1) die biologischen und technologischen Grundlagen der Synthetischen Biologie. Die Synthetische Biologie als noch junges, aber schnell wach-

sendes Forschungsgebiet schafft ein besseres Verständnis komplexer, natürlicher Bioprozesse. Darüber hinaus zielt sie insbesondere darauf ab, effiziente und austauschbare Bausteine entweder auf molekularbiologischem Weg oder direkt aus der natürlichen Biologie mittels Screening zu gewinnen und sie anschließend zu technologisch hocheffizienten, nützlichen, biologischen Modulen und Systemen zusam-menzufügen. Mit diesem Ansatz werden auch neue Biosyntheseprozesse möglich, die es in der Natur bisher nicht gibt.

Abb. 1: Forscherteam des Hamburger Landesexzellenzclusters „Fundamentals for Synthetic Biological Systems (SynBio)“, Koordinatoren: Prof. Dr. An-Ping Zeng (v.4.r.) und Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian( v.2.r).

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silico-Untersuchungen (Grad der Konservie-rung, chemische Beschaffenheit und Position der Aminosäure relativ zum aktiven Zentrum) wurden Mutationen in die G6PDH einge-bracht. Diese Enzymvarianten weisen, wenn sie als gelöstes Enzym eingesetzt werden, vergleichbare Aktivitäten zum rekombinan-ten Wildtyp-Enzym auf. Desweiteren werden Untersuchungen zur Charakterisierung von Biokatalysatoren durchgeführt. Die kineti-schen Parameter und Reaktionsbedingungen der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase wurden für den in vitro-Einsatz in einer Reaktionsse-quenz bestimmt. Um Zugang zu der Hydro-genase aus Pyrococcus furiosus zu etablieren, wurde mit der Kultivierung, Stammhaltung und Fermentation des Archaeon in Zusam-menarbeit mit dem Institut für Bioprozess- und Biosystemtechnik begonnen und ein Scale-up durchgeführt.

Die Arbeiten am Institut für Thermische Verfahrenstechnik (Prof. I. Smirnova, TUHH) konzentrieren sich auf die Entwicklung von Kieselgel-basierten, porösen Materialien, die sich für die Immobilisierung von Enzymen wie Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase eignen. Mehrere Varianten des Sol-Gel-Prozesses wer-den benutzt, um Materialen zu erhalten, die:| hochporös sind, damit sie hohe Permeabili-

tät aufweisen, | mechanisch stabil sind, damit sie den geeig-

neten Fluss von Substraten erlauben und | eine geeignete Aktivität von immobilisierten

Enzymen gewährleisten7. Am Institut für Anorganische und Angewandte Chemie (Prof. M. Fröba, UHH) wird die Synthese biokompatibler nanoporöser Organosilica-Hy-bridmaterialen untersucht, die aufgrund ihrer Porenstruktur und Oberflächenchemie in der Lage sind, aktive Biomoleküle gezielt aufzuneh-men, zu stabilisieren und vor Deaktivierung zu schützen8. Diese Kompositstrukturen werden in Mikroreaktoren überführt, um eine verfahrens-technische Anwendung zu ermöglichen.

Am Institut für Mikrosystemtechnik (Prof. J. Müller, TUHH) werden die mikrofluidischen Sys-teme in Glas-Silizium-Glas-Technik entworfen, hergestellt und charakterisiert. Unerlässlich für die Realisierung eines mehrstufigen enzyma-tischen Mikrobioreaktors sind Reaktionskam-mern mit integrierten neuartigen, nanoporösen Materialien für die Enzymimmobilisierung und die fluidische Umgebung, um einen kontinu-ierlichen Betrieb der Reaktionskammern zu gewährleisten9. Die Modellierung von Mikro/Nanoscale-Transportprozessen wird am Insti-tut für Thermofluiddynamik (Prof. H. Herwig, TUHH) durchgeführt. Für Mikrokanäle wurde auf Basis des zweiten Hauptsatzes der Ther-modynamik ein Modell zur Bestimmung von Strömungsverlusten entwickelt, das sowohl das Design des Mikroreaktors als auch die Aus-legung des Gesamtsystems vereinfacht10.

Die Verknüpfung von Chemie, Biologie und Ingenieurwissenschaften in diesem Cluster

Diese Prozesse stellen im Vergleich zu konven-tionellen Prozessen erhebliche Verbesserun-gen dar. Für die Wasserstoffherstellung sollen etwa anstelle von zwei bis vier Molekülen Wasserstoff aus einem Molekül Glucose und Wasser 12 Moleküle Wasserstoff gebildet werden, was eine 3 bis-6-fache Erhöhung der Ausbeute bedeutet (Abb. 3).

Dafür sind eine Reihe von technischen Fort-schritten erforderlich. Im wissenschaftlichen Fokus von „SynBio“ werden folgende drei Schlüsselfragen interdisziplinär bearbeitet: | Wechselwirkungen von Biomolekülen

(Enzymen) mit Oberflächen und Nanoma-terialien,

| Prinzipien von mehrstufigen Bioreaktionen, insbesondere in Mikrostrukturen und

| Mechanismen und Design von Biokatalysa-toren (Enzymen) für eine gezielte Biokataly-se.

Am Institut für Bioprozess- und Biosystem-technik (Prof. A.-P. Zeng, TUHH) werden mehrstufige Bioreaktionssysteme entwickelt. Am Beispiel der enzymatischen Propandiolpro-duktion konnte für eine Prozessstufe, in der 3-Hydroxypropionaldehyd durch das rekom-binant produzierte Propandioloxidoreduktase-Isoenzym zu 1,3-Propandiol reduziert wird, der „Proof-of-concept“ bereits erfolgreich erbracht werden. Es wurden ein Genexpressionsystem und Aufarbeitungsmethoden für die Bereit-stellung des Vit-B12-unabhängigen Enzyms Glycerindehydratase aus Clostridien etabliert. Zudem ist es gelungen, die enzymgekoppelte Cofaktorregeneration für NADP(H) zu realisie-ren und zu verifizieren. Desweiteren wird am Institut die Modellierung von Stoffwechselwe-gen durchgeführt. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Entwicklung von mathematischen Modellen für die quantitative und dynamische Analyse der in „Synbio“ relevanten Stoffwech-selwege und für die Konfiguration der Reakti-onssequenz und Bioreaktoren.

Die Suche nach neuartigen Biokatalysatoren wird am Institut für Technische Mikrobiologie (Prof. G. Antranikian, TUHH) durchgeführt. Dabei wurden neue Enzyme wie Glycerin-

Dehydratase und 1,3-Propandioloxidoreduk-tase aus dem anaeroben Bakterium Pelobacter carbiolicus und aus dem aeroben Bakterium Pectobacterium atrosepticum identifiziert. Die entsprechenden Gene wurden in Escherichia coli-spezifische Expressionsvektoren kloniert und erfolgreich exprimiert. Die Enzyme wur-den hinsichtlich Ihrer Eignung für die syntheti-schen Stoffwechselwege charakterisiert.

Die Strukturbiologie von Proteinen wird am Europäischen Laboratorium für Molekularbio-logie (Dr. M. Wilmanns, EMBL) untersucht. Die Arbeiten beinhalteten die biophysikalische und strukturelle Charakterisierung von neu-en Enzymen, wie Mutanten der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase von Leuconostoc mesenteroides, sowie die Untersuchung des Aktivierungsmechanismus der Glycerin-Dehy-dratase von Clostridium butyricum.

In der Abteilung für Algorithmisches Mo-lekulares Design (Prof. M. Rarey, Zentrum für Bioinformatik, UHH) wurde eine Bibliothek der Strukturen der Enzyme und Moleküle des H2- und des Propandiol-Reaktionsweges erstellt. Für jedes Enzym wurden sowohl allosterische Bindungstaschen vorhergesagt als auch mögliche kompetitive Inhibitoren des jewei-ligen Substrats in der aktiven Bindetasche identifiziert. In einer neuen Anwendung des Dockings wurde vorhergesagt, welche Puffer zu einer verringerten Aktivität des Enzyms führen können. Die Abteilung Biomolekulare Modellierung (Prof. A. Torda, Zentrum für Bioinformatik, UHH) arbeitet mit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Strukturen und dem Vorhersagen von Mutationen, die zu einem aktiven monomerischen Zustand füh-ren sollen4. Die Methode bezieht sich auf eine Mischung von freien Energie-Approximationen mit evolutionären Eigenschaften.

Am Institut für Technische Biokatalyse (Prof. A. Liese/Dr. L. Hilterhaus, TUHH) werden die Immobilisierung und Wechselwirkungen von Enzymen an Oberflächen untersucht5-6. Die rekombinante Produktion des Enzyms Glucose-6-phoshat-Dehydrogenase (G6PDH) wurde erfolgreich etabliert. Basierend auf in

Abb. 2: Modularisierung, Kompartimentierung und „Synthese“ von Bioreaktionen als neues Konzept zur Durchführung von mehrstufigen Bioproduktionsprozessen im Kooperati-onsprojekt „SynBio“

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– zusammen mit dem dargestellten Konzept für die Entwicklung von kontrollierten, mehrstufigen Bioreaktionskaskaden an der Oberfläche von Nanomaterialien und integriert in Mikrostrukturen – ist einzigartig und eröffnet völlig neue Wege für synthetische Bioproduktionssysteme.

Literatur

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[3] Ye, X., Wang, Y., Hopkins. R., Adams, M.W., Evans, B.R., Mielenz, J. R., Zhang, P., Spontaneous High-Yield Production of Hydrogen from Cellulosic Materials and Water Catalyzed by Enzyme Cocktails. ChemSusChem 2 (2009) 149-152.

[4] Mosisch, M., Simons, J., Hilterhaus, L., Torda, A., Molecular side-chain optimisation of Glucose-6-phosphate dehydrogenase for industrial use. 25th German Conference on Bioinformatics, September 2010, Braunschweig, Germany.

[5] Simons, J., Asano, Y., Hilterhaus, L., Optimization of a Two Step Reaction Sequence Using Covalent Immobilization Techniques. German Japanese Workshop on Enzyme Technology, September 13 – 15, 2011, Toyama, Japan.

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[7] Cumana, S., Götz, K., Bohne, S., Liese, A., Müller, J., Smirnova, I., Roth, S., Mesoporous silica mono-liths for enzyme–catalyzed reactions in microfluidic systems. ProcessNet Jahrestagung, September 2010, Aachen, Germany.

[8] Fried, D. I., Götz, K., Liese, A., Fröba, M. (2011) Covalent immobilization of Glucose-6-phosphate dehydrogenase on a mesoporous silica support. 23. Deutsche Zeolithtagung, March 2011, Erlangen-Nürnberg, Germany.

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[10] Herwig, H., Schmandt, B., Uth, M.-F., Loss coefficients in laminar flows: Indispensable for the design of micro flow systems, Proc. Int. Conference on Nanochannels, Microchannels and Minichannels, ICNMM2010-30166 (key note), August 1-5, 2010, Montreal, Canada.


Prof. Dr. An-Ping ZengInstitut für Bioprozess- und BiosystemtechnikTechnische Universität Hamburg-HarburgDenickestr. 15D-21073 HamburgTel.: +49-40-42878-4183, Fax: [email protected], www.tu-harburg.de/ibb

Abb. 3: Modellsystem für eine hocheffiziente H2-Bioproduktion aus Biomasse in einem synthetischen Stoffwechselweg[3]

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Blitzlicht Maschinelles Lernen

Automatische Vorhersage der Interaktion von Zielgenen mit Proteinen Dr. rer. nat. Tobias Bauer, PD Dr. sc. hum. Rainer König, Deutsches Krebsforschungszentrum und Universität Heidelberg

Die hier vorgestellte neuartige Maschinenlernmethode dient der automatisierten genomweiten Vorhersage regulatorischer Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren Zielgenen speziell für die Anwendung in höheren Eukaryoten. Der Algorithmus integriert dabei verschiedene wichtige Aspekte der Genregulation.

Beim Menschen sind eine Menge verschiedener Zelltypen bekannt. Obgleich alle Zellen ursprünglich das gleiche Genom enthalten, ist die Fülle an pathologischen Phänotypen wie zum Beispiel Krebszellen, die sich aus diesen Zellen entwickeln können, noch größer. Der Phänotyp und die Funktion einer Zelle wird maßgeblich durch die exprimierten Proteine bestimmt, die ihrerseits durch die fein kontrollierte und koordinierte Expression ihrer kodierenden Gene entstehen. Die Suche nach den Ursachen für diese Diversität ist also eng verknüpft mit der Identifikation regulatorischer Mechanismen auf der Genexpressionsebene. Es gibt viele Mechanismen auf verschiedenen Ebenen, die die Genexpression beeinflussen, aber genregulatorische Proteine, die Transkriptionsfaktoren (TF), spielen dabei die zentrale Rolle. Um zu verstehen, welche Transkriptionsfaktoren

beispielsweise in Krebszellen proliferationsrelevante Signalwege aktivieren, muss bekannt sein, welche Gene von welchen Transkriptionsfaktoren reguliert werden. Bisher sind hunderte menschliche Transkriptionsfaktoren1 bekannt, die die Transkription der gut 20.000 Gene1 regulieren. Daraus ergibt sich eine sehr große Zahl möglicher Kombinationen von Transkriptionsfaktoren und Zielgenen, die zur Komplexität menschlicher Genregulation beiträgt. Der Mangel an verfügbaren experimentellen Techniken und Daten ist ein erhebliches Hindernis bei der detailgetreuen Rekonstruktion genomweiter regulatorischer Netzwerke zwischen Transkriptionsfaktoren und Zielgenen. Um dem zu begegnen, haben wir eine neue bioinformatische Methode entwickelt, die Analysen aus drei unterschiedlichen Datenquellen miteinander kombiniert und die genomweite

Vorhersage von regulatorischen Interaktionen (RI) zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren Zielgenen mit deutlich verbesserter Präzision ermöglicht2. In der Anwendung (z.B. bei Genexpressionsanalysen von Tumoren) lassen sich mit Hilfe der vorhergesagten regulatorischen Interaktionen gute Hypothesen darüber formulieren, welchen Transkriptionsfaktoren eine Schlüsselfunktion bei der Genregulation im untersuchten Zellsystem zukommt.

Die Methode

Abbildung 1 zeigt schematisch den methodischen Ablauf. Verschiedene Merkmale von regulatorischen Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren Zielgenen wurden zusammengestellt. Als erstes analysierten wir potentielle TFBindestellen in den regulatorischen Sequenzen (Promoter) der potentiellen Zielgene. Viele der kurzen Nukleotidsequenzen, die typischerweise von bestimmten Transkriptionsfaktoren gebunden werden, sind mittlerweile bekannt und in Datenbanken verfügbar. Sie ermöglichen die Vorhersage potentieller TranskriptionsfaktorBindestellen auf genomweiter Ebene. Für unseren Ansatz wurden Motivsuchen für 303 Transkriptionsfaktoren in den Promotorsequenzen von 13.069 Genen verwendet. Anschließend integrierten wir weitreichende Genexpressionsanalysen. Gene, die an gleichen biologischen Funktionen beteiligt sind, sind häufig koreguliert und infolgedessen koexprimiert. Deshalb wurde für jedes Genpaar der 13.069 Gene bestimmt, wie stark ihre Expression miteinander korreliert, also inwiefern sie sich in einer größeren Anzahl von Zelltypen ähnlich verhalten. Dazu wurden Genexpressionsdaten von 4.064 mRNAMicroarrays aus Primärgeweben (meist von Tumoren) 76 verschiedener Experimente ausgewertet.

Entscheidend für das Gelingen des Maschinenlernens war die Verknüpfung der beschriebenen Teilbereiche miteinander und deren Übersetzung in quantifizierbare Merkmale der regulatorischen Interaktionen. Zum Beispiel ergab sich ein Merkmal wie folgt: für ein potentielles Zielgen eines Transkriptionsfaktors wurden alle Gene, die häufig mit dem Zielgen koexprimiert waren, daraufhin untersucht, ob in den Promotern dieser koexprimierten Gene TFBindestellenmotive des entsprechenden Transkriptionsfaktors angereichert sind. Diese Anreicherung lässt sich als Signifikanzwert (PWert) eines exakten Tests nach Fisher darstellen und so als Merkmal weiterverwenden. Analog wurde für ein weiteres Merkmal die Anreicherung von bekannten regulierten Genen innerhalb der koexprimierten Gene bestimmt. Mit diesen Merkmalen wurde ein Lernalgorithmus (eine „SupportVektorMaschine“, SVM) trainiert. Zunächst musste der Algorithmus von einem definierten „Goldstandard“ bereits bekannte regulatorische Interaktionen von Nichtinteraktionen (zufällig gewählte TFGenPaare ohne

Abb. 1: Übersicht der RIP-Klassifikatormethode. Zur Vorhersage regulatorischer Interaktionen (RI) zwischen Transkriptionsfaktoren (TF) und Zielgenen werden Merkmale aus den ver-schiedenen Bereichen der Motivsuchen, experimentelle Bindedaten und Genexpressi-onsdaten integriert. Mit Hilfe insgesamt 10 zusammengestellter Merkmale lernen 2.000 Support-Vektor-Maschinen anhand eines kleineren Satzes bekannter regulatorischer Interaktionen und können dann auf einen größeren Satz von Transkriptionsfaktoren und deren potentiellen Zielgenen angewendet werden, um neue regulatorische Interaktio-nen vorherzusagen. Mit den Vorhersagen lassen sich z.B. aktive Transkriptionsfaktoren mit Schlüsselfunktionen in experimentellen Fragestellungen identifizieren.

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Tab. 1: Signifikante Anreicherungen vorhergesagter Transkriptionsmodule in differenziell exprimierten Genen nach IFNg-Stimulation von Monozyten.

Blitzlicht Maschinelles Lernen

Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt). An erster Stelle der Liste war der „Interferon Stimulatory Gene Factor 3“ (ISGF3), bei dem von 28 vorhergesagten Zielgenen 20 (=71,4%) stark differenziell exprimiert waren.

Fazit

Insgesamt ergaben sich eine Reihe solider Indi-zien dafür, dass die vorhergesagten regulatori-schen Interaktionen von guter Qualität sind und sich gut eignen, aktive Transkriptionsfaktoren vieler verschiedener biologischer Zellsysteme zu identifizieren. Der hier vorgestellte RIP-Klassifikator ist eine neuartige Maschinenlern-methode zur Vorhersage von regulatorischen Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und Zielgenen speziell für die Anwendung in höheren Eukaryoten. Der Algorithmus integriert dabei verschiedene wichtige Aspekte der Genre-gulation. Dabei werden zweifelhafte Annahmen anderer Methoden vermieden, wie zum Beispiel eine prinzipielle Koexpression von Transkriptions-faktoren mit ihren Zielgenen. Stattdessen kann die Methode grundsätzlich auch dann regula-torische Interaktionen vorhersagen, wenn die Aktivität des betroffenen Transkriptionsfaktors vermehrt auf der Proteinebene reguliert wird, da die verwendeten Merkmale sich auf Analysen zwischen koregulierten Zielgenen beschränkt. Darüber hinaus liefern Sequenzanalysen mit wohldefinierten potentiellen TF-Bindestellen unabhängig vom betrachteten Zelltyp Hinweise auf mögliche Genregulation. Die Methode ist grundsätzlich erweiterbar auf weitere Tran-skriptionsfaktoren oder Gene. Auch weitere Merkmale (z.B. im Hinblick auf zu erwartende Hochdurchsatzdaten auf Proteinebene etc.) sind integrierbar. Der RIP-Klassifikator ist als Paket für die frei verfügbare statistische Analyse- und Softwareentwicklungsplattform R implemen-tiert und frei verfügbar unter www.ichip.de/software/RIP.html.

Literatur

[1] Alberts, B., Wilson, J.H., Hunt, T., Molecular biology of the cell (2008) Garland Science.

[2] Bauer, T., Eils, R., König, R., Bioinformatics 27 (2011), 2239-2247.[3] Wingender, E., Dietze, P., Karas, H., et al., Nucleic Acids Res 24

(1996), 238-241.[4] Faith, J.J., Hayete, B., Thaden, J.T., et al., PLoS Biol 5 (2007), e8.[5] Margolin, A.A., Nemenman, I., Basso, K., et al. BMC Bioinfor-

matics 7 Suppl 1 (2006), S7.[6] Zhao, F., Xuan, Z., Liu, L., et al., Nucl. Acids Res 33 (2005), D103-

107.


PD Dr. Rainer KönigInstitut für Pharmazie und molekulare Biotechnologie – BioquantUniversität Heidelberg, INF 26769120 [email protected]

bekannte RI) unterscheiden lernen. Insgesamt 2.896 bekannter regulatorischer Interaktionen aus experimentellen Arbeiten zwischen 303 Transkriptionsfaktoren und 949 Genen (ent-nommen aus [3]) dienten als Richtig-Positive gegenüber allen unbekannten RI, die sich aus allen übrigen Kombinationen der 303 Transkrip-tionsfaktoren und der 949 Gene ergaben. Die unbekannten regulatorischen Interaktionen wurden als Richtig-Negative verwendet, in der Annahme, dass die große Mehrzahl dieser möglichen TF-Zielgen-Kombinationen nicht regulatorisch ist. In der Tat gab es statistisch hochsignifikante Unterschiede zwischen den RI nach dieser Einteilung, was darauf schließen lässt, dass diese praktikabel ist.

Validierung der Methode

Nach Berechnung der insgesamt zehn definier-ten Merkmale für alle TF-Zielgen-Kombinationen des Goldstandards wurden mit Hilfe eines Kreuzvalidierungsverfahrens insgesamt 2.000 SVMs trainiert. Die 2.000 SVMs ergaben zusam-men den Gesamtklassifikator „RIP“ („Regulatory Interaction Predictor“). Dieser wurde dann auf die Gesamtheit der 13.069 getesteten Gene angewandt. Das Ergebnis waren 73.923 vorher-gesagte RI für nicht weniger als 301 TF und 11.263 Gene bei einem erwarteten Sensitivitätswert von >17,7% und einem positiven Vorhersagewert von >31,5%. Damit schnitt der RIP-Klassifikator deutlich besser ab als vergleichbare Methoden zur Vorhersage regulatorischer Interaktionen auf genomweiter Ebene (z.B. CLR4 und ARACNE5 auf dem verwendeten Datensatz von 4.064 Genexpressionsprofilen). Wir verglichen unsere Ergebnisse mit regulatorischen Interaktionen aus einer unabhängigen Datenbank6 und konnten die vorhergesagten regulatorischen

Interaktionen gemeinsamer Transkriptions-faktoren gut (88 von 103 TF) validieren. Als nächstes untersuchten wir die Anreicherung von vorhergesagten regulatorischen Interakti-onen in einer großen Bandbreite verschiedener Signaltransduktions- und Stoffwechselwege. So konnte eine große Zahl bekannter Assoziationen zwischen Transkriptionsfaktoren und Signal- und Stoffwechselwegen wiedergefunden und darüber hinaus neue Hypothesen aufgestellt werden. Gute Assoziationen fanden sich vor allem in den Signaltransduktionswegen für Proli-feration, Zellzyklus, MAP-Kinase, Zytokinantwort, Signalwege des hematopoetischen Systems sowie der Stoffwechselwege des Steroid- und Retinolmetabolismus.

Anwendung: IFNa-induzierte Veränderung der Genregulation

Die vorhergesagten regulatorischen Interak-tionen wurden auf ihre Verwendbarkeit zur Assoziation von Schlüssel-TF mit biologischen Zellphänotypen getestet. Als Fallbeispiel wähl-ten wir eine publizierte Microarray-mRNA-Genexpressionsstudie, in der menschliche Blut-Monozyten mit Interferon-a (IFNa) induziert wurden. Diese war deshalb gut geeignet, da die durch Interferon ausgelöste Signaltransduktion in Bezug auf die transkriptionale Zellantwort ein gut untersuchtes System ist. In den IFNa-induzierten Monozyten waren im Vergleich zu nichtinduzierten Kontrollen 241 von 8.159 Genen signifikant differenziell exprimiert. Wir unter-suchten, welche der vorhergesagten TF-Zielgene in diesen Genen angereichert sind. Es ergab sich eine Assoziation von 13 TF aus den Familien von IRF-, STAT- NFkB- und ETS-Proteinen, die ohne Ausnahme im Zusammenhang mit IFNa-Sig-nalantwort in der Literatur beschrieben sind (die

Transkriptionsfaktor

Vorhergesagte Zielgene

P-Wertgesamtdifferentiellexprimiert %

STAT1:STAT2:IRF9 28 20 71.4 6.95e-23

IRF1 1187 58 4.9 5.72e-03

IRF2 169 15 8.9 1.07e-02

STAT1 1513 67 4.4 1.15e-02

GAF 5 3 60 1.15e-02

NFKB1 681 36 5.3 1.59e-02

STAT3 384 23 6 3.21e-02

IRF7 17 4 23.5 3.53e-02

ETS1 1065 48 4.5 3.53e-02

RELA 762 37 4.9 3.53e-02

IRF3 18 4 22.2 3.53e-02

ELF2 9 3 33.3 3.70e-02

SPI1 439 24 5.5 4.63e-02

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Blitzlicht Bioinformatik

Neues Tool zur Vorhersage des Alzheimer-RisikosVanessa Schmidt1, Katharina Baum1, Angelyn Lao2, Katja Rateitschak2, Yvonne Schmitz2, Anke Teichmann3, Burkhard Wiesner3, Claus Munck Petersen4, Anders Nykjaer4, Jana Wolf1, Olaf Wolkenhauer2 und Thomas E Willnow1, 1Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin, Berlin, Deutschland, 2Universität Rostock, Rostock, 3Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, und 4Universität Aarhus, Dänemark

Morbus Alzheimer ist die vierthäufigste Todesursache weltweit und die häufigste Demenzerkran-kung bei über 65-Jährigen. Nach wie vor steht die Wissenschaft vor dem Rätsel, warum bestimmte Menschen bereits in jungen Jahren an Alzheimer erkranken, andere dagegen ohne geistige Beeinträchtigungen weit über 90 Jahre alt werden. Ein Grund dafür liegt in unseren Genen. Erst kürzlich haben wir ein Protein namens SORLA entdeckt, welches bei Menschen in unterschied-lichen Mengen auftritt. Eine Unterversorgung von SORLA in den Nervenzellen des Gehirns hat fatale Auswirkungen auf die Entstehung der Alzheimer-Krankheit. In der aktuellen Studie konnte erstmalig ein neuartiges Zellsystem entwickelt werden, welches Vorhersagen darüber ermöglicht, wie anfällig eine Person im Laufe ihres Lebens ist, an Alzheimer zu erkranken. Es ist uns gelungen, in Nervenzellen die Menge von SORLA zu variieren und dadurch die amyloidogene Spaltung des Amyloidvorläuferproteins APP in toxische Ab-Peptide zu verändern. Die am Max Delbrück Centrum für molekulare Medizin in Berlin (MDC) erhobenen experimentellen Daten lieferten Partnern an der Universität Rostock die Basis, um ein mathematisches Modell aufzustellen, das die Prozessierung von APP in seine Fragmente und den Einfluss von SORLA in diesem System analysiert.

Weltweit leiden 27 Millionen Menschen an Morbus Alzheimer. Mit erhöhter Lebenserwar-tung steigt auch das Risiko, an dieser Demenz zu erkranken. Bei den über 80-Jährigen weist bereits jede zweite Person Morbus Alzheimer auf. Nicht nur gesellschaftlich, sondern auch volkswirtschaftlich gesehen ist es daher zwingend notwendig, genau zu ergründen, welche Faktoren diese Krankheit auslösen und wie sie sich bekämpfen lässt. Obwohl bereits große Anstrengungen in die Suche nach einer erfolgreichen Therapie investiert wurden, ist Morbus Alzheimer nach wie vor unheilbar. Jedes Jahr werden neuartige Substanzen entwickelt, doch keine vermag die Krankheit endgültig zu besiegen. Hinzu kommt, dass die heutigen diagnostischen Methoden un-zuverlässig sind, bereits frühe Anzeichen der Krankheit zu erkennen.

Die Entstehung von Morbus Alzheimer

Das Besondere im Gehirn eines Morbus Alzhei-mer-Patienten sind Proteinablagerungen im Nervengewebe1. Der Hauptbestandteil dieser Ablagerungen sind die Ab-Peptide, welche auf natürlichem Wege in allen Zellen des Körpers entstehen – sowohl bei kranken als auch bei gesunden Menschen. Problematisch wird es jedoch, wenn aufgrund von Störungen eine zu große Menge an Ab-Peptiden produziert wird. Denn in hohen Konzentrationen sind diese Peptide für die Nervenzellen toxisch. Darüber hinaus aggregieren sie zu sogenannten amy-loiden Plaques, welche zu weiterer neuronaler Schädigung führen. Die Entstehung der Ab-Peptide ist somit einer der Hauptgründe für das Absterben der Nervenzellen. Ein Alzheimer-Patient im fortgeschrittenen Stadium weist bereits 20% weniger Gehirnmasse auf als eine gesunde Person.

Obwohl die Alzheimerforschung in den vergangenen 20 Jahren große Fortschritte gemacht hat, ist immer noch nicht genau ver-standen, wie die Krankheit tatsächlich verläuft. Im Jahr 1987 gelang mit der Entdeckung des Amyloidvorläuferprotein (APP) ein wissen-schaftlicher Durchbruch2. Die Funktion von APP ist bis heute noch nicht vollständig geklärt. Jedoch konnten Wissenschaftler zeigen, dass APP durch mehrere proteinspaltende Enzyme, den sogenannten a-, b- und g-Sekretasen, prozessiert wird, wodurch es zur Freisetzung der Ab-Peptide kommt (Abb. 1A)3. Über die Jahre häufen sich diese Peptide an, und mit dem Absterben der Nervenzellen bricht die Demenzerkrankung aus.

Die Entscheidung darüber, welche Enzyme schneiden und wieviele Ab-Peptide entste-hen, wird von der Zelle präzise gesteuert. Wird diese Regulation durch erbliche oder

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Abb. 1: A. Prozessierungswege des Amyloidvorläuferproteins (APP) und die Entstehung von Ab-Peptiden. APP kann entweder über den amyloidogenen Prozessierungsweg (linke Seite) via b- und g-Sekretase oder den nicht-amyloidogenen Prozessierungsweg (rechte Seite) via a- und g-Sekretase prozessiert werden. Beim amyloidogenen Weg entstehen sAPPb-Fragmente und Ab-Peptide, beim nicht-amyloidogenen Weg werden dagegen keine Ab-Peptide gebildet, sondern lediglich sAPPa-Fragmente und P3-Peptide. B-D: Der inhibito-rische Effekt von SORLA auf die APP-Prozessierungsprodukte. Durch Zugabe bestimmter Antibiotikakonzentrationen wurden eukaryotische Zellen veranlasst, unterschiedliche Mengen an APP zu bilden. Nach 24 Stunden wurde die Menge der sekretierten Prozes-sierungsprodukte sAPPa (B), sAPPb (C) und Ab (D) im Zellmedium gemessen und die En-zymkinetik der APP-Spaltung grafisch aufgetragen. Eine Erhöhung der APP-Menge führt zu einer Zunahme der APP-Produkte, in Anwesenheit von SORLA ist jedoch die Stärke des Anstiegs durch den SORLA-inhibitorischen Effekt stark vermindert.

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des Aufhebens der positiven Kooperativität durch SORLA werden die Sekretasen in einen ineffizienten Zustand versetzt, so dass weni-ger APP-Moleküle in Ab-Peptide prozessiert werden. Diesen Mechanismus konnte die Gruppe von Olaf Wolkenhauer an der Uni-versität Rostock anhand eines detaillierten mathematischen Modells unter Zuhilfenahme der experimentellen Daten genauer beschrei-ben. Das Modell stellt das biochemische Reaktionsnetzwerk dar, welches die Kinetik der APP-Prozessierung und den Effekt von SORLA in diesem System beschreibt (Abb. 2). Für den Aufbau des Netzwerks wurden sowohl die experimentellen Daten als auch Daten aus der aktuellen Literatur verwendet. Das Reaktionsnetzwerk konnte anschließend in ein mathematisches System mit normalen Differentialgleichungen (ODE) transformiert werden, welches die zeitlichen Änderungen der Netzwerkkomponenten als Funktion von Interaktion und Dissoziation beschreibt. Die kinetischen Parameter des Modells wurden mittels der experimentellen Daten optimiert und als Funktion von APP und APP-Produkt in Abhängigkeit von der SORLA-Menge abgebil-det (Abb. 3). Anhand des Modells konnten die Wissenschaftler die SORLA-Menge bestim-men, die notwendig ist, um die Umwand-lung von APP-Dimeren in APP-Monomere zu bewerkstelligen. Erstaunlicherweise sind nur geringe SORLA-Konzentrationen nötig, um ein Umschalten zwischen allosterischer (Dimere) und nicht allosterischer (Monomere) Enzym-aktivität zu bewirken, und dadurch effektiv die Prozessierung von APP in Ab-Peptide zu ver-hindern. Reduziert sich jedoch aufgrund von Genvariationen die SORLA-Menge in den Ner-venzellen, so führt das zu einem dramatischen Konzentrationsanstieg der toxischen Peptide und zur gehäuften Bildung amyloider Plaques. Somit scheint SORLA heute tatsächlich zu den wichtigsten genetischen Risikofaktoren der Alzheimer-Krankheit zu gehören.

SORLA als mögliche Therapieform gegen Alzheimer

Welche Bedeutung haben nun diese Ergebnis-se für die medizinische Forschung? Wie kann SORLA zur Therapie von Alzheimer-Patienten genutzt werden? Bisher ist bekannt, dass gesunde Menschen eine normale Menge an SORLA in den Nervenzellen bilden. Des Weite-ren konnte gezeigt werden, dass Alzheimer-Patienten zu wenig SORLA produzieren. Wenn es gelänge, die SORLA-Produktion in den Nervenzellen von Alzheimer-Risikopatienten durch pharmakologische Substanzen anzure-gen, könnte man langfristig die Ab-Menge im Gehirn reduzieren. Dies setzt jedoch voraus,

äußere Faktoren gestört, steigt das Risiko, an Alzheimer zu erkranken. Wir haben nun solch einen regulatorischen Faktor namens SORLA identifizieren können, der diesen Mechanismus nachhaltig beeinflusst4. Wir konnten nachweisen, dass Alzheimer-Pati-enten im Vergleich zu gesunden Personen weniger SORLA in Nervenzellen produzieren. Die detaillierte Funktion von SORLA in der Alzheimer-Krankheit war zu Beginn der Stu-dien noch völlig unklar. In jüngerer Zeit konnte unsere Arbeitsgruppe am MDC jedoch zeigen, dass SORLA ein neuraler Rezeptor ist, der den Transport anderer Proteine in den Nerven-zellen reguliert5. Unter anderem kontrolliert SORLA den Transport von APP – durch den Einfluss von SORLA wird das Protein im Trans-Golgi-Netzwerk der Zelle zurückgehalten, was den Zugriff durch Sekretasen erschwert. Als Konsequenz der Transportregulierung kommt es zu einer reduzierten Bildung von Ab-Peptiden und anderen APP-Fragmenten in den Nervenzellen (Abb. 1B).

SORLA – ein genetischer Risikofaktor der Alzheimer-Krankheit

Mit Hilfe von Genbanken konnte gezeigt werden, dass Menschen unterschiedliche Genvarianten von SORLA aufweisen6. Diese Genvariationen führen zu unterschiedlichen SORLA-Mengen im Körper. Bildet ein Patient

nur wenig SORLA, sind die Nervenzellen zu wenig gegen die enzymatische Spaltung von APP geschützt. Es kommt zur Überproduktion von Ab-Peptiden. Um genaue Vorhersagen treffen zu können, wie viele Ab-Peptide in Ab-hängigkeit von der jeweiligen SORLA-Menge gebildet werden, hat unsere Arbeitsgruppe ein neuartiges Zellkultursystem entwickelt, um die Menge an SORLA und APP in der Ner-venzelle variieren zu können7. Diese Zelllinien wurden für die Erfassung quantitativer Daten und für die Etablierung eines systembiologi-schen Modells generiert, welches die genauen Reaktionskonstanten der proteolytischen Prozessierung von APP in seine Fragmente in Abhängigkeit von der SORLA-Menge liefert. Anhand dieser Daten konnte nachgewiesen werden, dass im Gegensatz zu vorherigen Annahmen, die Enzyme nicht nur sogenannte APP-Monomere, sondern gerade auch be-vorzugt APP-Oligomere spalten – ein Effekt den Enzymwissenschaftler positive Koope-rativität nennen. Durch eine Kooperativität der Substrate untereinander können Enzyme mittels schneller Aktivitätsänderungen auf geringste Veränderungen von Substratkon-zentrationen in der Zelle reagieren. Wird diese Kooperation gestört, so arbeiten die Enzyme nur noch ineffizient. In der aktuellen Studie konnten wir sowohl in Zellkulturen als auch im Mausgehirn zeigen, dass SORLA mit APP interagiert und dass diese Interaktion die Bil-dung von APP-Oligomeren verhindert. Infolge

Abb. 2: Die Kinetik der APP-Prozessierung und der Einfluss von SORLA, dargestellt an einem biochemischen Reaktionsnetzwerk. APP als Monomer (blau, oben) oder Dimer (blau, unten), mit den a- und b-Sekretasen (grün) und die APP-Prozessierungsprodukte (orange). Der Komplex aus APP und Sekretase wurde als weiße Box und der Komplex aus APP und SORLA als graue Box symbolisiert. SORLA reduziert sowohl die APP-Dimerisierung als auch die APP-Menge für die Sekretasen im System.. www.laborwelt.de




Abb. 3: Simulationsergebnis des mathematischen Modells für die verschiedenen APP-Prozes-sierungsprodukte sAPPa (A,C,E) und sAPPb (B,D,F) bei unterschiedlichen SORLA-Kon-zentrationen (3% (A,B), 12% (C,D) und 30% (E,F)) in Abhängigkeit von der APP-Menge. Dargestellt ist die gesamte APP-Prozessierung (schwarze Linie), wie auch die Teilberei-che APP-Dimer- (grüne Linie) und APP-Monomer (rote Linie)-Prozessierung. Die Um-kehr von Dimer- zu Monomerprozessierung ist bei 12% SORLA zu verzeichnen.

dass die SORLA-Menge – und damit das Risiko an Alzheimer zu erkranken – bereits in jungen Jahren vor Ausbruch der Krankheit mittels zuverlässiger Methoden bestimmt wird, wie beispielsweise mit dem oben beschriebenen systembiologischen Modell. Auch hier können wir bereits erste Ergebnisse vorweisen. Durch Zugabe bestimmter neurotropher Substan-zen konnte eine künstliche Anhebung der SORLA-Produktion in Nervenzellen erreicht und damit auch die Ab-Menge dauerhaft im Tiermodell reduziert werden8. Auch wenn diese Ergebnisse lediglich den Anfang einer möglichen Therapie darstellen, ist die Alzhei-merforschung dem Ziel, eine weitverbreitete Volkskrankheit zu besiegen, einen weiteren Schritt näher gekommen.

Literatur

[1] O´Brien, R.J., und Wong, P.C., Annu Rev Neurosci. 34 (2011), 185-204

[2] Kang, J., Lemaire, H.-G., Unterbeck, A., Salbaum, J.M., Masters, C.L., Grzeschik, K.-H., Multhaup, G., Beyreuther, K., Müller-Hill, B. Nature 325 (1987), 733-736

[3] Chow, V.W., Mattson, M.P., Wong, P.C., Gleichmann, M., Neuromolecular Med. 12(1) (2010), 1-12

[4] Andersen, O.A., Reiche, J., Schmidt, V., Gotthardt, M., Spoelgen, R., Behlke, J., von Arnim, C.A.F., Breiderhoff, T., Jansen, P., Wu, X., Bales, K.R., Cappai, R., Masters, C.L., Gliemann, J., Mufson, E.J., Hyman, B.T., Paul, S.M., Nykjaer, A., Willnow, T.E. PNAS 102 (2005), 13461-13466

[5] Schmidt, V., Sporbert, A., Rohe, M., Reimer, T., Rehm, A., Andersen, O.A., Willnow, T.E. The Journal of Biological Chemistry 45 (2007), 32956-32964

[6] Caglayan, S., Bauerfeind, A., Schmidt, V., Carlo, A.-S., Pra-bakaran, T., Hübner, N., Willnow, T.E. Archives of Neurology (2011) in Druck

[7] Schmidt, V., Baum, K., Lao, A., Rateitschak, K., Schmitz, Y., Teichmann, A., Wiesner, B., Petersen, C.M., Nykjaer, A., Wolf, J., Wolkenhauer, O., Willnow, T.E. The EMBO Journal (2011), 1-14

[8] Rohe, M., Synowitz, M., Glass, R., Paul, S.M., Nykjaer, A., Willnow, T.E. The Journal of Neuroscience 29(49) (2009), 15472-15478


Dr. Vanessa SchmidtMax Delbrück Centrum f. Molekulare MedizinRobert-Rössle-Str 10, 13125 BerlinTel.: +49 (0)[email protected]

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Wissenschaft Expertenpanel

Expertenpanel: Bio-IT Getrieben vom Einzug der billiger und schneller High-Throughput-Technologien, zum Beispiel zur Analyse des Genoms, Transkriptoms, Epigenoms, Proteoms und Metaboloms, wächst der Bedarf an Hardware- und Softwarelösungen zur Verarbeitung der rapide zunehmenden Datenmengen. Derzeit entstehen in ambitionierten Infrastrukturprojekten wie ELIXIR oder im Rahmen der Internationalen Krebsgenom- und Epigenom-Konsortien Datenpools, für die noch keine angemessenen Modellierungstools verfügbar sind. LABORWELT hat die Bio- und IT-Experten gefragt, wohin die Entwicklung geht und was erforderlich ist, um die Daten möglichst effizient zu nutzen.

LABORWELT:Vor welchen Hauptherausforderungen steht die IT-Industrie bei der Integration großer Datenmengen aus den omics-Technologien in eine stärker personalisierte Medizin?

Porsche:Die Herausforderungen, denen die IT-Industrie bei der Verknüpfung patientenspezifischer Daten mit neuesten wissenschaftlichen Er-kenntnissen zum Zwecke einer personalisierten Medizin gegenübersteht, sind vielfach. Stark anwachsende Datenmengen, zunehmende Anforderungen an das Datenmanagement, besonders aber die Integration und Analyse der Daten.

Die derzeit rasante Entwicklung der Leis-tungsfähigkeit von Next-Generation Sequen-cern (NGS), die in kürzester Zeit Datenmengen im Petabereich liefern, erfordert die Entwick-

Dr. Rolf Porsche Rolf Porsche ist Head of Pharma/Life science/Healthcare der Global Business Services von IBM Deutschland GmbH. Der Doktor der Medizin stieg nach einigen Jahren in das Beratungsgeschäft um und arbeitete in den letzten 15 Jahren in führenden strategischen Consulting-Unternehmen in Europa und den USA. Der Schwerpunkt seiner Arbeit lag dabei in der Gesundheits-, Pharmazie, Medi-zintechnik- und Life Sciences-Branche.Kontakt: [email protected]

lung von Speichersystemen, die zu tragbaren Kosten einen schnellen Datenzugriff ermög-lichen. Wichtig dabei: die hocheffiziente Kombination mit Datenbanksystemen für verschiedenste Technologien. Automatische Kompressionsapplikationen helfen, die Da-ten ohne Performance-Einbußen zumindest um ca. 25% zu komprimieren. Auch Daten-sicherungen müssen spezifisch angepasst werden.

Bei der Rechnerleistung ist die Petascale-grenze ist längst überschritten und die Exa-scale-Performance klar erkennbar. Statt mehr Rechnerleistung zusammenzupacken, muss die Performance aber auf verschiedensten Ebenen (verbesserte CPU, noch feinere 3D-Strukturen, neuer Phase-Changespeicher, neue Materialien und neue Applikationen) gesteigert werden, um das Ziel bis 2017/2018 zu erreichen.

Immer mehr Gewicht kommt auch dem Verhältnis von Rechenleistung zu eingesetzter Energie zu. Schon heute machen die Energie-kosten bis zu 45% des Gesambudgets eines Rechenzentrums aus – entscheidend wird es sein, die Performance von heute etwa 1,0 linpack GF/Watt auf bis 3,0 zu optimieren. Auch die notwendigen Leitungssysteme und Datenübertragungstechnologien müssen angepasst werden, insbesondere wenn immer mehr Arbeiten in flexiblen internen und exter-nen Cloudumgebungen stattfinden.

Neben der Hardware wird auch die Frage nach den richtigen Applikationen immer wichtiger, gerade im analytischen -omics- Bereich. Bei der Integration der Daten zeigen Datenintegrations-Systeme wie Watson, wie man mit großen strukturierten und unstruktu-rierten Datenmengen künftig in der Forschung umgeht.

Gerade das komplexe Zusammenführen un-terschiedlichster strukturierter und unstruktu-rierter Datenmengen ist die Herausforderung bei der personalisierten Medizin – damit der Arzt die bestmögliche Diagnose und Therapie anbieten kann, müssen Patienten-spezifische Daten (Genomdaten, Imagedaten, Kranken-geschichte, etc.) analysiert und mit neuesten wissenschaftlichen Erkenntnissen verknüpft werden. Erste Pilotstudien mit dem Watson-Ansatz zeigen, dass das Ziel einer personalisier-ten Medizin erreicht werden kann.

LABORWELT:Wie funktioniert und lernt ein Zellmodell, wie es im Rahmen des IT Future of Medicine-Projektes entwickelt wird, und welche IT-Erfordernisse stellt es?

Lehrach:Unser Ziel ist es, individualisierte Modelle von Patiententumoren zu erstellen und auf dieser Basis vorherzusagen, welches die optimale Therapie für den Patienten ist. Grundlage dafür ist ein allgemeines Referenzmodell der biolo-gischen Prozesse im Menschen. Wir nehmen also gesicherte Erkenntnisse aus der Literatur und bauen daraus ein Modell der biologischen Prozesse in den verschiedenen Geweben und Zelltypen des Patienten, einschließlich der verschiedenen Zelltypen im Tumor im Falle eines Krebspatienten.

Um ein individualisiertes Modell zu er-halten, müssen wir leicht messbare Daten des Patienten in das Modell eingeben. Dabei können wir einerseits Informationen aus dem Genom oder Transkriptom etc. verwenden, die bestimmte Konsequenzen haben. Wenn zum Beispiel ein Gen im Tumorgenom mutiert ist, dann kann dies zum Beispiel im Fall eines mutierten ras-Gens eine Änderung in der Funktion des entsprechenden Proteins zur Folge haben. Andererseits können wir zum Beispiel Metaboliten im Blut oder Urin des Patienten messen. In diesem Fall können wir keine direkten Voraussagen daraus ableiten.

Prof. Dr. Hans Lehrach

Hans Lehrach, seit 1994 Direktor am Berliner Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, beschäftigt sich seit mehr als 10 Jahren mit der Modellierung komplexer biologischer Prozesse. Der Mitherausgeber mehrerer Journals und Pionier der Humangenomfor-schung promovierte 1974 in Göttingen und gelangte über die Harvard Medical School, das EMBL und den Imperial Cancer Research Fund London in seine jetzige Position.Kontakt: [email protected]

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Wissenschaft Expertenpanel

Wir müssen also das Modell so lange anpassen (indivualisieren), bis wir eine möglichst gute Übereinstimmung zwischen Messresultaten und Voraussagen bekommen. Wenn wir also im Fall eines Krebskranken das Genom des Pa-tienten und das Genom und Transkriptom des Tumors sequenzieren, finden wir zum Beispiel bekannte Mutationen, die nur im Tumorge-nom vorkommen (somatische Mutationen). Diese Information können wir verwenden, um die entsprechenden Teile des Modells zu ändern. Eine ‚change of function’-Mutation führt zu einer Funktionsänderung im Protein. Ein frühes Stopp-Codon, eine Deletion eines Gens, seine Nichtexpression oder ein Fehler im Splicen führt zur Eliminierung des ent-sprechenden Objektes im Modell. Durch die Integration aller verfügbaren Daten können wir die Konzentration vieler Komponenten des Modells entsprechend setzen. Wir können aber auch nur einen Teil fixieren, zum Beispiel die RNA-Konzentrationen, und versuchen, andere Konzentrationen vorauszusagen, zum Beispiel die Metaboliten, und damit die Voraussagen des Modells validieren.

Im nächsten Schritt geht es darum, die Modelle einzelner Zellen oder Gewebe zu vernetzen, indem wir diese Einzelmodelle entsprechende Signale austauschen lassen, die den Zustand der anderen ‚Zell’-Modelle modifizieren. Dabei können wir auch Bildda-ten einbauen und so zum Beispiel die Sauer-stoffkonzentration verschiedener Regionen des Tumors im Modell berücksichtigen.

Ich habe einmal durchgerechnet, was von der IT-Seite her benötigt wird, wenn wir das, was wir derzeit machen, in größerem Maßstab tun würden – also 1.000 verschiedene Zellty-pen, 1.000 verschiedene Bedingungen, 1.000 verschiedene Parametersätze, die wir in der Modellierung ausprobieren. Insgesamt also eine Milliarde Modellierungsläufe. Ein Lauf dauert momentan ein bis drei Stunden auf einem Core eines schnellen Computerchips. Damit würden wir also insgesamt mehrere Milliarden Core-Stunden an Rechnerzeit brauchen, selbst auf einem Supercomputer mit 100.000 Cores also ungefähr ein Jahr an Rechenzeit. Glücklicherweise werden die Computer ja immer schneller, die Program-me können sicher auch effizienter gemacht werden, und bei vielen Krankheiten wird es auch vielleicht gar nicht notwendig sein, so viele verschiedene Zelltypen, und so viele verschiedene Bedingungen (Therapien) im Computermodell zu testen.

LABORWELT:Welche BIO-IT-Konzepte sollen in dem von Ihnen koordinierten EU-Projekt p-medicine verwirklicht werden?

Grafp-medicine (www.p-medicine.eu) ist ein eu-ropäisches Großforschungsprojekt, in dem sich IT-Spezialisten, Kliniker, Biologen, Ethiker, Juristen und Datenschutzexperten zusam-mengeschlossen haben, um mittels IT-Tools und -Strukturen die Durchführung und Ver-netzung von klinischen Studien zu erleichtern und künftig eine individualisierte medizinische Versorgung zu ermöglichen. Um die Daten für die individuelle Diagnose, Prognose und Therapie von Patienten nutzbar zu machen, werden Software, Module und Tools entwi-ckelt, die die Durchführung und Vernetzung von klinischen Studien und Simulationen von Krankheitsverlauf und Therapieansprechen erleichtern sollen.

Eine Grundlage des Projektes bildet ein Datenmanagementsystem für klinische Stu-dien, das Daten zu diagnostischen und the-rapeutischen Zwecken rasch zum Nutzen der Patienten verfügbar macht. Das Softwarepro-dukt ObTiMA zur Eingabe, Speicherung und Analyse klinischer Daten, dessen Entwicklung im Vorgängerprojekt ACGT (www.eu-acgt.org) begonnen wurde, wird nun in p-medicine aus-gebaut und validiert. ObTiMA wurde unter den Kriterien von Open Source entwickelt, und über einen modularen Aufbau der Software lässt sich diese kontinuierlich erweitern.

Die so gewonnenen und verknüpften Daten aus klinischen Studien und der Forschung können dann für einzelne Patienten nach Anonymisierung in einem ‚Data Warehouse’ gespeichert werden. Durch den Aufbau eines ‚Data Warehouse’ ergeben sich ungeahnte Möglichkeiten des Erkenntnisgewinnes, indem bestimmte Fragen eines Forschers unmittelbar an dem Datenpool analysiert werden können, ohne zunächst eine aufwendige Datensamm-lung starten zu müssen. Für die Forscher wird diese Datenbasis durch den Zugang zu Tumor-material aus Biobanken noch entscheidend er-gänzt. Dies führt zu einer erheblichen Beschleu-nigung der Translation von Erkenntnissen der Grundlagenforschung in die Klinik, wie dies heute nicht vorstellbar ist. Mit den vielfältigen Informationen werden in p-medicine in einer nächsten Stufe Computer-Simulations-Modelle zur Modellierungen von Krankheiten und deren Ansprechen auf Therapien sowie klinische ‚Decision Support Tools’ entwickelt.

Um die individuelle Therapie für zum Bei-spiel einen Krebspatienten zu verbessern und ihn mit einer auf ihn abgestimmten Therapie wirksamer und nebenwirkungsärmer zu be-handeln, sollen dem Arzt zukünftig umfang-reiche Vergleichsdaten aus klinischen Studien und die Computer-Simulationen der Tumorer-krankung und Therapie erlauben, seine The-rapieplanung entscheidend zu unterstützen. Gleichzeitig sollen auch die Patienten durch die entsprechend zu entwickelnden Techno-logien und Computer-Anwendungen besser informiert und bei ihren Entscheidungen über ihre Behandlung und die Verwendung ihres Tumormaterials für die Forschung unterstützt werden. In der zukünftigen Struktur wird dem Patienten insgesamt eine stärkere Rolle in der Behandlung ermöglicht, die ihn aktiv an der Therapieoptimierung beteiligt.

Eine verbindliche Einverständniserklärung zwischen Klinik und Patient, eine Anonymi-sierung der Daten und eine unabhängige, zentralverantwortliche Stelle, das ‚Center for Data Protection’ (CDP), das eine professionelle Unterstützung für alle Fragen rund um die Datensicherheit bietet sollen helfen, maximale Datensicherheit und eine uneingeschränkte Vertrauensbasis zwischen Arzt und Patient aufzubauen.

Im Rahmen von klinischen Studien werden die p-medicine-Tools und -Technologien inner-halb der Projektlaufzeit geprüft. Pilotversuche in den Bereichen Wilms-Tumor/Nephroblas-tom, Brustkrebs und akute lymphoblastische Leukämie wurden auf der Grundlage von klar formulierten Forschungszielen ausgewählt, wo-bei ein Schwerpunkt auf die Notwendigkeit der Integration und Analyse von heterogenen Da-tensätzen gelegt wurde, um die Modellierung von Krankheiten und Therapieansprechen zu simulieren. Außerdem soll auch ein sogenannter Oncosimulator, das Ansprechen von Therapien im Computer simulieren, um so die bestmögli-che Therapie für einen Patienten zu finden.

Prof. Dr. Norbert Graf

Norbert Graf ist Direktor der Klinik für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie sowie Studiendekan der Universität des Saarlandes. Der Spezialist für Nephro-blastome hat ausgewiesene Expertise in Medizinischer Informatik und Kliniko-genomischen Studien. Kontakt: [email protected]

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SYNMIKRO: Synthetische Mikrobiologie in Marburg Bruno Eckhardt1, Johann Heider1, Roland Lill1, Anke Becker1, Uwe G. Maier1, Erhard Bremer1, Martin Thanbichler1,2, Lotte Sogaard-Andersen1,2, Peter Graumann1, Peter Lenz1, Ekaterina Kostina1, Torsten Waldminghaus1, 1Zentrum für Synthetische Mikrobiologie, Philipps-Universität Marburg, 2Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg

Algen, Bakterien und Pilze stellen den größten Teil der Biomasse und kommen in einer schier un-erschöpflichen Zahl und Vielfalt vor. Nur ein Bruchteil von ihnen lässt sich kultivieren und damit in allen Details charakterisieren. Ihr biotechnologisches Potential reicht von der Produktion von Medikamenten bis zur Entsorgung von Plastik oder der Erzeugung von Biosprit. Neue Möglichkei-ten eröffnen sich über die gezielte Kombination von Genen verschiedener Organismen, aus der Entwicklung neuer Organismen als Bioreaktoren und durch die Optimierung bekannter Synthe-sewege. Die interdisziplinär geprägten Forschungsaktivitäten an dem von der Philipps-Universität Marburg und dem Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie gemeinsam getragenen Zentrum für Synthetische Mikrobiologie (SYNMIKRO) reichen von grundlegenden Fragen bis zu biotechnologischen Anwendungen.

Funktionsanalysen von mikrobiellen Zellen hin zu einem quantitativen, dynamischen, theoretisch modellierbaren Funktionsverständnis weiterentwickelt werden.

Synthetische Mikrobiologie für biotechnologische Anwendungen

Succinat, Glutarat und andere Dicarbonsäuren sind äußerst interessante PlattformChemikalien, die für die Herstellung biobasierter Kunststoffe eingesetzt werden können. Während das natürliche Gärungsendprodukt Succinat im vorindustriellen Maßstab bereits biologisch hergestellt wird, können andere Dicarbonsäuren bisher nicht biotechnologisch produziert werden, weil im Stoffwechsel der dazu üblicherweise verwendeten aeroben Mikroorganismen die geeigneten Enzyme fehlen. Prinzipiell ist jedoch die biologische Synthese von Glutarat aus Glucose durch die Verwendung von Enzymen aus anaeroben Glutaminsäurefermentierenden Bakterien möglich; allerdings werden diese meist durch Sauerstoff inaktiviert. Deshalb wurde ein anaerober Stoffwechselweg entworfen, mit dem modifizierte Escherichia coliWirtszellen als „künstliche Anaerobier“ die gewünschte Dicarbonsäure als Gärungsendprodukt herstellen. Kürzlich wurde als erster Schritt tatsächlich die Produktion von kleinen Mengen der Vorläuferverbindung Glutaconat durch entsprechend modifizierte E. coliZellen nachgewiesen1. In ähnlicher Weise sollen auch die stereochemisch definierten Dicarbonsäuren (E)Phenylitaconat oder (R)Benzylsuccinat, die chemisch schwierig herzustellen sind und Anwendungspotential als Feinchemikalien und PharmaGrundstoffe haben, gewonnen werden (Abb. 1). In einem ersten Schritt wurden dazu die Gene für die Aufnahme und Aktivierung der aromatischen Säure Benzoat in Wirtsbakterien eingebracht, die dann BenzoylCoA als aktiviertes StarterSubstrat für weitere biosynthetische Reaktionen bereitstellen. Über den normalen Gärungsweg von E. coli soll dann das endogene Endprodukt Succinat hergestellt werden, das schließlich durch die eingeschleusten Enzyme des anaeroben Toluolabbaus mit zugefüttertem Benzoat zu Benzylsuccinat als neuem Gärungsendprodukt umgesetzt würde. Insgesamt stellen die künstlichen Anaerobier einen neuen Typ industrieller Mikroorganismen dar, der in den Ansätzen der synthetischen Mikrobiologie bisher unterrepräsentiert ist. Die Schaffung synthetischer anaerober Gärungswege ist sehr vielversprechend und führt das uralte Prinzip der biotechnologischen Nutzung von Gärungsprozessen, wie es bereits hinter der alkoholischen oder der Milchsäuregärung steckt, mit neuen Methoden weiter.

In synthetischen Ansätzen zur Herstellung von Biomolekülen wie isoButanol oder Isoprenderivaten, die als vielseitige Ausgangsstoffe für Medikamente, Kosmetika und Feinchemikalien dienen, zeigt sich die Verfügbarkeit

Die ChemieIndustrie unternimmt seit Jahren große Anstrengungen, um Grundbausteine und Feinchemikalien auf biotechnologischem Weg zu produzieren. Damit sollen wirtschaftlich alternative Strategien zu bisherigen petrochemischen RohstoffQuellen erschlossen und die Stärke der biologischen Verfahren in der Produktion von Stoffen, die für die chemische Synthese schwer zugänglich sind, genutzt werden.

Die klassischen Verfahren für die Biotransformation chemischer Verbindungen nutzen im Wesentlichen Enzyme, die aus Mikroorganismen gereinigt und direkt eingesetzt werden, sowie Mikroorganismen, die Produkte ihres Stoffwechsels in großem Maßstab produzieren. So werden Aminosäuren und Antibiotika ebenso wie Alltagsprodukte wie Alkohol oder Essigsäure gewonnen. Eine wesentliche Idee

der Synthetischen Biologie ist es, die normalen biochemischen Wege von Mikroorganismen durch genetische Manipulation so auszubauen, dass eine Zelle Verbindungen produziert, die sonst nicht oder nur in anderen Lebewesen synthetisiert würden. Gleichzeitig gilt es, die Prozesse so zu optimieren, dass sie für die biotechnologische Produktion relevant werden.

Hier setzt das Zentrum für Synthetische Mikrobiologie SYNMIKRO mit seinen wissenschaftlichen Leitzielen an: Es sollen neue Funktionseinheiten synthetisiert, kombiniert und in den Funktionsapparat der Zelle integriert werden, um Mikroorganismen mit neuen Eigenschaften und Anwendungspotential herzustellen. Zudem sollen unter Einbeziehung von synthetischen und analytischen Forschungsansätzen die bisher statischen Komponenten und

Abb. 1: Biotechnologische Produktion von Dicarbonsäuren als Gärungsprodukte. Der Verlauf der normalen gemischten Säure-Gärung von E. coli (rot) wird bereits für die Produkti-on von Succinat manipuliert. Durch das Einschleusen von zusätzlichen Genen der Glu-tamat-Gärung (braun) oder des anaeroben Toluolabbaus (violett) soll der Gärungsweg nun dahingehend verändert werden, dass anstelle von Succinat die Produkte Glutarat oder Benzylsuccinat produziert werden.

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Netzwerk an raum- und zeitabhängigen Interaktionen zwischen den beteiligten Kom-ponenten zu verstehen. Auf der Grundlage des erhaltenen Modells können anschließend die Eigenschaften des regulatorischen Netzwerks gezielt verändert und die Voraussetzungen für eine Adaption an neue zelluläre Umgebungen abgeleitet werden.

Die Bewegung von Bakterien und insbeson-dere die Richtungswechsel erfordern einen Taktgeber, der unabhängig vom Zellzyklus ist6. Wie am Beispiel der Mobilitätsproteine des Bakteriums Myxococcus xanthus gezeigt werden konnte, stehen die Richtungswechsel im Zusammenhang mit unregelmäßigen Os-zillationen zwischen den Zellpolen. Zusammen mit theoretisch arbeitenden Gruppen aus der Physik und Mathematik wird derzeit untersucht, welche minimalen Bestandteile erforderlich sind, um diese räumlichen Oszillationen zu er-möglichen. Parallel dazu werden die beteiligten molekularen Spieler experimentell bestimmt.

Doch auch diese aufwändigen Modifikatio-nen einer Zelle sind nur ein Schritt auf dem Weg zu dem ultimativen Ziel, das mit der Synthese von Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 vorge-zeichnet wurde7: der vollständigen Herstellung eines neuen Organismus aus frei kombinier-baren genetischen Modulen. Die Möglichkeit, über eine vollständige chemische Synthese komplette synthetische Chromosomen her-zustellen erlaubt gezielte Untersuchungen, welche Komponenten für welche Funktionen gebraucht werden. Die so gewonnenen Er-kenntnisse werden helfen zu verstehen, was ein Chromosom zu einem Chromosom macht.

Literatur

[1] Djurdjevic, I., Zelder, O., Buckel, W., Appl Environ Microbiol. 77 (2011), 320 - 332.

[2] Lill, R., Nature 460 (2009), 831 – 838.[3] McIntosh, M., Meyer, S., Becker, A., Mol. Microbiol. 74 (2009),

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Steinbuchel A., Maier, U.G., Microbial Cell Factories 10 (2011) (online first).

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Algire, M.A., Benders, G.A., Montague, M.G., Ma., L., Moodie, M.M., Merryman, C., Vashee, S., Krishnakumar, R., Assad-Gar-cia, N., Andrews-Pfannkoch, C., Denisova, E.A., Young, L., Qi, Z.Q., Segall-Shapiro, T.H., Calvey, C.H., Parmar, P.P., Hutchison, C.A. 3rd, Smith, H.O., Venter, J.C., Science 329 (2010), 52 - 56.

Das Zentrum für Synthetische Mikrobiologie wird vom Land Hessen im Rahmen der Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE) gefördert.


Prof. Dr. Bruno EckhardtLOEWE-Zentrum f. Synthetische MikrobiologieHans Meerwein-Straße, MZVG, 35032 MarburgTel./Fax.: +49 (0)6421-28-24401/ [email protected]

von Eisen-Schwefel-Clustern als limitierendes Element. Den Clustern kommt als Co-Faktoren von Proteinen eine zentrale Bedeutung bei der Synthese von DNA, der Modifikation von Nuk-leinsäuren, der Umsetzung von Aminosäuren und Metaboliten, oder der Übertragung von Elektronen bei biochemischen Reaktionen zu2. Meist werden für die gezielte Synthese der gewünschten Moleküle in Bakterien oder Hefen neue Reaktionswege konstruiert. Die Erfahrung hat allerdings gezeigt, dass die Assemblierung der wirtsfremden Eisen-Schwefel-Proteine häufig ineffizient verläuft und eine höhere Ak-tivität der Fremdproteine nur über ein besseres Verständnis der Assemblierungsprozesse zu erreichen ist.

Isogene bakterielle Populationen neigen zur Heterogenität im Phänotyp, wodurch die biotechnologische Ausbeute der gewünschten Produkte stark beeinflusst wird. So zeigen Kultu-ren von Exopolysaccharid-produzierenden Zellen während des Kulturverlaufs eine Aufspaltung in Subpopulationen stark produzierender Zellen und solche, die wenig oder gar kein Exopolysac-charid produzieren. Am Beispiel des symbioti-schen Bakteriums Sinorhizobium meliloti wurde gezeigt, wie eine dichteabhängige Autoindukti-on durch ein Quorum-Sensing-System aus einer Autoinduktorsynthase und zwei regulatorischen Proteinen diese Aufspaltung kontrolliert3. Mit diesem detaillierten Modell und Prozessver-ständnis eröffnen sich Möglichkeiten, die phäno-typische Heterogenität in isogenen bakteriellen Produktionskulturen zu reduzieren.

Neue Potentiale für eine umweltfreundliche Produktion ergeben sich durch den Wechsel der Wirtsorganismen. Diatomeen (Kieselalgen) lassen sich einfach kultivieren, können CO2-freie

Synthesen durchführen und gewinnen die erforderliche Energie kostengünstig aus dem Sonnenlicht4. Die biotechnologischen Verfahren sind bereits so weit fortgeschritten, dass Spinn-seide, Bioplastik (Abb. 2) sowie ein Antikörper und ein potentieller Impfstoff mit zum Teil sehr hohen Ausbeuten biotechnologisch hergestellt werden können.

Interdisziplinäre Ansätze zur Untersuchung zellulärer Organisation Die synthetische Mikrobiologie strebt die Ent-wicklung frei kombinierbarer und modularer Einheiten an, sogenannter Biobricks. Neben den kleineren, im vorherigen Abschnitt beschriebe-nen biochemischen Reaktionspfaden werden dabei auch größere Module, etwa zur Stressre-sistenz oder zur Zellteilung, angestrebt. Voraus-setzung für die erfolgreiche Implementierung derartiger Biobricks ist allerdings das Verständ-nis grundlegender Mechanismen zellulärer Organisation in Mikroorganismen. Hier kommt mit der interdisziplinären Zusammenarbeit von Mikrobiologen mit Physikern, Mathematikern und Informatikern eine der Stärken von SYN-MIKRO zum Tragen. Gerade die räumliche Positi-on makromolekularer Strukturen innerhalb der Zelle wirft viele spannende Fragen auf. Exemp-larisch stehen dafür die Untersuchungen eines regulatorischen Netzwerkes, das im Bakterium Caulobacter crescentus für die korrekte Platzie-rung des Zellteilungsapparats verantwortlich ist5. Neben einer detaillierten zellbiologischen und biochemischen Analyse der beteiligten Komponenten wird eine in silico-Modellierung des Systems angestrebt, um das komplexe

Abb. 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum, welche durch genetische Manipulation das Bioplastik PHB (Poly-3-hydroxybutyrat) in großen Mengen produzieren kann. Das PHB akkumuliert in Granula-artigen Struktu-ren im Cytosol der Zelle, (Pfeile).

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Service Stellenmarkt

Akademischer Stellenmarkt Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt (auch online), der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (Ausschreibungstext als Word-Datei, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi Auflösung) an [email protected]. Annahmeschluss für die nächste LABorWeLt-Ausgabe „Zellbiologie“ (erschei-nungstermin 15.03.2012) ist der 02. März 2012.

Die Translationale Onkologie an der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz (TRON) ist ein innovatives, schnell wachsendes, biopharmazeutisches Institut mit dem Ziel, innovative Diagnostika und Arz-neimittel zur Behandlung von Krebs und Erkrankungen des Immunsystems zu entwickeln. TRON arbeitet in intensiver Kooperation mit der Universität Mainz, der Universitätsmedizin Mainz sowie nationalen und internationalen Unternehmen und Instituten zusammen.

Zur Verstärkung unserer Funktionseinheit „Stem Cells“ suchen wir zum nächstmöglichen Zeitpunkt

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Die Funktionseinheit „Stem Cells“ beschäftigt sich mit der Reprogrammierung somatischer Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen). Die iPS-Zell Technologie ist für zukünftige Zelltherapien hoch relevant und wird derzeit intensiv beforscht. Innerhalb unserer Funktionseinheit sind Sie direkt an der Entwicklung unserer eigenen Methoden zur iPS-Zell Generierung beteiligt. Dabei werden Sie hauptsächlich in der Zellkultur und im moleku-larbiologischen Bereich tätig sein. Sie können proaktiv persönliche Akzente setzen und bekommen Einblicke in die vielschichtigen Fragestellungen der Stammzellbiologie. Nach entsprechender Einarbeitung übernehmen Sie die Planung und Durchführung von eigenen Experimenten, die sie in Absprache mit Ihren Teamkollegen durchführen. Hierbei helfen Ihnen Ihre strukturierte und zu-verlässige Arbeitsweise und Ihre Freude an wissenschaftlichen Experimenten.

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Sie erwartet bei uns ein angenehmes Betriebsklima, gründliche Einarbeitung und herausfordernde Aufgaben im Bereich der Stammzellforschung, sowie ein abwechslungsreiches und spannendes Arbeitsumfeld. Wir suchen hoch motivierte Mitarbeiter, die unsere Begeisterung für Forschung und Wissen-schaft teilen, Spaß an der Bewältigung neuer Aufgaben haben und Teil unseres engagierten Teams werden wollen.

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Translationale Onkologiean der Universitätsmedizinder JGU Mainz

10 Fellowships for Doctoral Candidates

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Online Application will start on October 15, 2011Deadline for Application – January 15, 2012

The ZIBI Graduate School Berlin is an international doctoral program for research in infection biology and immunology. Research projects are in the areas of– Host-pathogen interaction– Pathogenicity mechanisms– Host-pathogen co-evolution– Chronic inflammations– Autoimmune diseases– Development and differentiation of immune cells– Neuroimmunology– Antiviral and antimicrobial strategies and vaccine development

We offer outstanding training and support in an excellent scientific network. Faculty members are affiliated with well-known institutes such as the Max Planck Institute for Infection Biology, the German Rheumatism Research Center, the Institute for Zoo and Wildlife Research as well as with institutes of the Humboldt-Universität zu Berlin, the Freie Universität Berlin and the Charité – University Medicine Berlin.

Our mission is to develop students into creative, responsible and self-confident young researchers. We are looking for highly motivated students of all nationali-ties who are strongly committed to research and share our vision to improve world health.

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Contact: ZIBI Graduate School, c/o Dr. Christoph Scherfer,Max Planck Institute for Infection BiologyCampus Charité Mitte, Charitéplatz 1, 10117 Berlin, GermanyPhone: +49(0)-30-28460160, email: [email protected]

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International Max Planck Research School for InfectiousDiseases and Immunology (IMPRS-IDI)funded by the Max Planck Society (MPG)

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Doctoral Program graDuate

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call for aPPlicationSthe graduate School life Science munich (lSm) announces the call for applications for its international doctoral program. lSm is looking for highly motivated applicants with excellent grades and a strong scien-tific interest to apply for the PhD program in life sciences covering ar-eas of anthropology, biochemistry and cell biology, ecology, evolution, genetics, microbiology, plant sciences, systematics and zoology. the program will be taught entirely in english and provides comprehensive scientific training. the members of the graduate School are part of the faculty of Biology and the faculty of chemistry, Biochemistry and Pharmacy of lmu munich. the lSm does not charge tuition fees for attending the doctoral program.

the research training on a specific project will be supplemented by seminars, summer schools, methods courses, training in soft skills and participation in international conferences. the PhD program is open for students who hold either a master´s or Diploma degree or, in the fast track version, a three-year Bachelor´s degree. Successful students of the graduate school will be awarded a doctoral degree (Dr. rer. nat.) by the lmu after 3 to 4 years. candidates need to prove a strong qualitative background as well as interest and ability to conduct independent research.

Deadline for application is January 10th, 2011.

further information and details about the online application process and the available research projects can be found on:

www.lsm.bio.lmu.de/application.

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Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmen-tal Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus.

Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e.V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.

Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderprei-ses sowie des Total E-Quality Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.

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telle Arbeiten– ausgeprägte Teamfähigkeit und Flexibilität– Fähigkeit zu eigenständigem Arbeiten– sehr gute Englischkenntnisse

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Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an:Dr. Susanne HofmannE-Mail: [email protected]: +49-(0)89 3187-4435

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)Institut für Experimentelle GentechnikIngolstädter Landstraße 185764 Neuherberg

Das Paul-Ehrlich-Institut ist eine wissenschaftliche Einrichtung des Bundes, das als Bundesinstitut für Impfstoffe und biomedizinische Arzneimittel zuständig ist und auf den damit verbundenen Gebieten der Lebenswissenschaften (z. B. Virologie, Bakteriologie, Allergologie, Immunologie, Medizinische Biotechnologie, Hämatologie) Forschung betreibt.

Im Fachgebiet Pr1-Forschung „Molekulare Biotechnologie und Gen-therapie“ ist folgende Position vakant:

Doktorandin/DoktorandStellenbewertung: E 13/2 TVöD

Arbeitsbeginn: zum nächstmöglichen Zeitpunkt

Aufgabenprofil:Im Zentrum unserer Forschung steht die Analyse des Zelleintritts von viralen Vektoren. Dazu wurde von uns eine neue Methode entwickelt, mit der Viren so verändert werden können, dass sie einen beliebigen Rezeptor der Wahl für den Zelleintritt verwenden (Anliker et al., 2010; Nature Methods 7, 929; Münch et al., 2011; Molecular Therapy 19, 686). Basierend auf diesem Verfahren soll mit Hilfe von zellbiologischen und biochemischen Methoden (z.B. Partikeltracking, Mikroskopie, Affinitäts- und Kinetikmessungen) die Anpassung von Viren an ihren zellulären Rezeptor untersucht werden.

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IKDT

Molekularer Service für Forschung und Klinik

Durch seine Serviceplattform Innovative Dia-gnostics bietet die IKDT GmbH durch seinen modernen Gerätepark Kunden den direkten Zugang zu drei innovativen Technologien mit zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten für individuelle Projekte in Forschung, molekularer Diagnostik oder für klinische Studien.

Die TaqMan Low-Density-Arrays (Firma Life Technologies) sind nach Nutzerwünschen konfigurierte Genkarten, welche die simultane, quantitative Messung von 12 bis 384 Genen, mi-croRNAs oder SNPs in einer Probe für Expressi-onsstudien oder microRNA Profiling erlauben.

Die Luminex-Technologie (Firma Luminex) ermöglicht die Mikropartikel-basierte, hoch-parallele Messung von Zytokinen, Phospho-proteinen, immunologischen Profilen sowie

microRNA-Sets in geringsten Probenmengen. Für diese Multiplex-ELISA können eigene oder kommerziell erhältliche Systeme für verschiedene Spezies (Mensch, Maus, Ratte) von verschiedenen Anbietern eingesetzt werden. Die GeXP Genanalyse-Technologie (Firma Beckman Coulter) basiert auf der Fragmentlängen-Unterscheidung durch Kapillarelektrophorese. Anwendungsgebiete sind SNP-Sequenzierungen, die Bestimmung von pluripotenten Stammzellen oder die Cha-rakterisierung von Zellpräparationen durch Multiplex- oder STR-Genanalysen.

Das IKDT Labor ist seit 2003 durch das Col-lege of American Pathologists (CAP) nach den stringenten Richtlinien der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für seine kardiale Diagnostik akkreditiert. IKDT ist Mit-glied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB.

IKDT GmbH Innovative Diagnostics Dr. Dirk Laßner Moltkestraße 31 12203 Berlin Tel.: +49-(0)30-8441-5540 Fax: +49-(0)30-8441-5555 [email protected] www.innovative-diagnostics.eu

Mit Enhanced Biobanking stellt die in Hennigsdorf ansässige in.vent Diagnostica GmbH ein ISO-zertifiziertes System zur Ge-winnung neuer Biomarker vor. Die besonde-ren Vorteile liegen in der gezielten Probenge-winnung unter definierten prä-/analytischen Bedingungen und im IT-unterstützten sowie verlinkten Probenmanagement. So lassen sich nicht nur individuelle Protokolle über das Probenhandling anfertigen, auch das Erstellen einer umfassenden, projektorien-tierten Probendokumentation wird möglich. Auf diese Weise können anschließend indi-kations-, parameter- oder matrixbezogene Kollektive genauer betrachtet werden.

Enhanced Biobanking bietet eine völlig neue Qualität in der Bereitstellung huma-ner Proben. Gerade wegen immer neuer Fortschritte auf dem Gebiet der Entdeckung und Entwicklung von Biomarkern steigt der Bedarf an nativen Proben. Mit Enhanced Bio-banking lassen sich die vielfältigsten Ansprü-che an Volumen, Informationen, Matrices, Parameter sowie Behandlung erfüllen. Das Enhanced Biobanking ermöglicht die effizi-

ente Durchführung klinisch-diagnostischer Studien im Bereich der in-vitro-Diagnostik und der personalisierten Medizin durch die ziel- und projektorientierte Bereitstellung humaner Proben. Seit 2009 ist in.vent nach DIN EN ISO 9001:2008 und nach DIN EN ISO 13485:2007 zertifiziert. Es verfügt über ein schlankes Qualitätsmanagementsystem, basierend auf einem prozessorientierten Ansatz. In.vent Diagnostica ist Mitglied im Berlin-brandenburgischen Verband Diag-nostik Net | BB.

in.vent Diagnostica GmbHChristiane EwelTel.: +49-(0)3302 55 199-23Fax: +49-(0)3302 55 [email protected]

Das Odyssey CLx Infrarot-Imaging-System ist die neueste Ergänzung im Sortiment der Bild-bearbeitungssysteme von LI-COR® Biosciences. Das Odyssey CLx verfügt erstmals über die innovative Autoscan-Funktion, die Zeit spart und automatisch sofort das bestmögliche Bild generiert. Die Autoscan-Funktion bietet einen linear-dynamischen Bereich von mehr als sechs logarithmischen Stufen an, eliminiert die Bildsättigung und liefert sofort quantitative Daten. Bisherige Nachweisgrenzen werden so erweitert, und die Forscher erhalten sofort die besten Daten, ohne Einstellungen der Hard- oder Software optimieren zu müssen.

LI-COR

Neues Infrarot-Imaging-System: Odyssey CLx

Das Odyssey CLx nutzt die neueste Version der LI-COR Image Studio Software. Es ist eine leicht zu bedienende Bildbearbeitungssoftware mit einer applikationsorientierten Funktionsleiste. Das System basiert auf LI-CORs bewährter Infrarot-Technologie für die sensitive und quanti-tative Bildgebung. Das flexible Infrarot-Imaging-System unterstützt zahlreiche Anwendungen, einschließlich quantitativer Western-Blots, Zell-basierter Assays, EMSAs, DNA-Färbung, Coo-massie-Gelen, Protein Arrays, Gewebeschnitte, in-vivo-Imaging, Protein- und Nukleinsäure-Nachweis und Mikrotiterplatten-Assays.

Das Odyssey CLx ist mit zwei Nah-Infrarot-(NIR)-Laser/Detektionssystemen für die direkte Fluoreszenzdetektion ausgestattet. Durch den NIR-Wellenlängenbereich werden in Verbindung mit LI-CORs innovativer Detektionstechnologie sowohl Autofluoreszenz als auch Streulicht stark reduziert. Das Ergebnis ist ein exzellentes Signal-Rausch-Verhältnis und eine deutlich höhere Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu anderen Imaging-Systemen. LI-COR ist Mit-glied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB.

LI-COR Biosciences GmbHKristine SchwarzTel.: +49-(0)6172-1717-771Fax: +49-(0)[email protected]/odysseyCLx

in.vent Diagnostica

Ausgereiftes ISO-zertifiziertes System zur Gewinnung neuer Biomarker

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Service Produktwelt

Eine Voraussetzung für die Etablierung der per-sonalisierten Medizin sind geeignete Biomarker. Die Messung von umfangreichen Genomics-, Proteomics- und Metabolit-Datensätzen gehört inzwischen zum Alltag in der biomedizinischen Forschung. Aber erst die integrative Analyse von klinischen und -omics-Daten ermöglicht eine gezielte Biomarkersuche.

Für diese Herausforderung bietet das Pro-fileDB Datenbank-System der MicroDiscovery GmbH (Berlin) eine leistungsfähige Lösung, die sich bereits in einer Vielzahl von biomedizini-schen Projekten bewährt hat. Hauptziel des Systems ist es, dem Anwender aus Medizin und Molekularbiologie einen direkten und intuitiven Zugang zu seinen Daten zu geben.

Dieser wird erreicht durch den Einsatz mo-derner Web-Technologien und leistungsstarker Analyse- und Visualisierungmethoden. Das Anwendungsspektrum reicht von der gezielten Identifikation von Biomarkern über den Vergleich von Gen-, Protein- und Metabolit-Messungen bis zur Analyse von klinischen Parametern im Rah-men von Korrelationsstudien. Leistungsfähige Algorithmen und die Einbindung externer Infor-

mationsquellen ermöglichen die Identifikation der relevanten Pathways und Funktionen auch in komplexen Zusammenhängen. Die Ergebnisse werden in interaktiven Graphiken dargestellt, die es dem Benutzer ermöglichen, gezielt interes-sante Gruppen, Marker und Schlüsselmoleküle für die weiteren Analysen zu selektieren, zu spei-chern oder zu exportieren.

MicroDiscovery GmbHDr. Dieter BeuleMarienburger Straße 110405 BerlinTel.:+49-(0)[email protected]

Microdiscovery

Biomarkersuche für die personalisierte Medizin mit dem ProfileDB Datenbank-System

Seit vielen Jahren stellt Porvair Sciences Mikroplatten mit Gewebekultur für wissen-schaftliche Anwendungen her. Nun hat das Unternehmen eine neue Reihe sorgfältig ausgewählter Gewebekultur-Kunststoffpro-dukte zum Laborgebrauch vorgestellt, die alle einer strengen Qualitätskontrolle unterliegen. Dieses neue Sortiment von Gewebekultur-Kunststoffprodukten entspricht den höchsten internationalen Standards für Materialqualität, optische Oberflächenpolitur, Gewebekultur-verarbeitung, Sterilität und Packungssicher-heit.

Porvair hat den globalen Markt intensiv unter-sucht, so dass nur die besten Kunststoff- und Verbrauchsprodukte für die Epigenetik mit Zubehör für Zell- und Gewebekulturen in die neue Produktreihe aufgenommen wurden. In den Testlabors in Großbritannien wurden um-fangreiche Investitionen getätigt, um sicherzu-stellen, dass die Produkte von gleichbleibend hoher Qualität sind. Die Herstellung der neuen Produktreihe erfolgt in einem Reinraum der Klasse 100.000/ISO-Klasse V, der streng den Fertigungsstandards gemäß ISO 9001:2008 und EN ISO 13485:2003 entspricht. So sind alle Produkte frei von DNA/RNA, DNase/RNase und Pyrogen-Verunreinigungen. Die meisten Produkte sind auch mit Gamma-Strahlen sterilisiert erhältlich. Testberichte, in denen das Zellwachstum in Flaschen, Petrischalen, Platten, Röhrchen und Pipetten aus der neuen Produktpalette von Porvair mit Gewebekultur-Kunststoffprodukten einer führenden Marke verglichen wird, sind auf www.epigeneticsex-press.com zum Download verfügbar.

Porvair Sciences Ltd.Dr. Bill BradburyTel.: +44-(0)[email protected]

Porvair

Hochwertige Gewebekultur-Kunststoffprodukte

Roche

Integrierte Diagnostik für kleine Labore

Durch die kontinuierliche Weiterentwick-lung der 454 Next-Generation Sequencing-Technologie auf Basis der hochparallelen Pyrosequenzierung stehen nun erstmalig Leselängen wie in der Sanger-Sequenzierung zur Verfügung. Verbesserungen der Ge-rätefluidik, Software und Reagenzchemie ermöglichen nun eine modale Leselänge von über 700 bp und durchschnittlich ca. 700 Megabasen pro Lauf. Als kostengünstiges vor Ort-Upgrade für bestehende GS FLX Systeme oder als Neusystem ist das GS FLX+ System

sowohl mit den neuen als auch bisherigen GS FLX Titanium-Kits kompatibel.

Die einzigartige Kombination aus langen Leseweiten, hohem Durchsatz und hoher Einzellesegenauigkeit des GS FLX+ Systems ermöglicht eine genauere und kosten-günstigere Sequenzierungsanalyse für ein breites Anwendungsspektrum: Sowohl de novo-Assemblierungen kleiner, großer und komplexer Genome, Sequence Capture, Transkriptom- und Metagenom-Analysen profitieren von den langen GS FLX+ Reads. Die Auflösung langer Repeat-Regionen erhöht die Assemblierungsqualität und re-sultiert in längeren Scaffolds und Contigs. In Kombination mit 454 Paired End-Reads (3 kb, 8 kb und 20kb) und Short Read-Daten optimieren die neuen langen Leseweiten in Hybrid-Ansätzen die Kosten für de novo- und Re-Sequenzierungsprojekte.

Durch die erhöhte Sensitivität und Spe-zifität bei der taxonomischen Zuordnung können Gene und Organismen in komplexen Metagenomen nun noch einfacher und ge-nauer identifiziert und zugeordnet werden.

Roche Diagnostics Deutschland GmbHDr. Sonja Vogel-RohwerSandhofer Straße 11668305 MannheimTel.: +49-(0)[email protected]

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Service Kalender


November 2011 – März 2012

Veranstaltungskalender

13.–14. Februar 2012, Weihenstephan

Grundlagen der Fermentation

Das Seminar vermittelt die notwendigen Kenntnisse, um für eine vorgegebene Auf-gabenstellung einen geeigneten Fermenter und Zusatzeinrichtungen auszuwählen und unter optimalen Bedingungen zu betreiben. Info: www.baytech-akademie.de

08.–09. Dezember 2011, Dortmund

Synthetische Biologie

Die Biotrends 2011 steht unter dem Motto „Pharmaceutical BioEngineering – New Biotrends to Smarter Drugs“. Sie beschäf-tigt sich mit den Vorteilen und Herausfor-derungen der synthetischen Biologie für die Pharmaforschung. Themenschwerpunkte sind unter anderem die Gentherapie und das Tissue Engineering. Info: www.biotrends.net

15. Mai 2012, München

BioVaria zeigt Innovationen

Zum fünften Mal öffnet die europäische BioVaria in München ihre Pforten. Wissen-schaftler stellen hier rund 70 lizenzierbare Technologien vor. Erneut präsentieren auch Pharmafirmen ihre Lizenzwünsche. Info und Anmeldung: www.biovaria.org

26.09.11Tag der Genomforschung, BerlinInfo: Dr. Silke Argo , Nationales Genom-forschungsnetz - NGFN (E-Mail: [email protected],Web: www.ngfn.de/jubilaeum/)

28.11.11Abschlussveranstaltung Nawaro-Nach-wuchsgruppen, BerlinInfo: FNR/BMELV (E-Mail: [email protected],Web: www.fnr.de/nachwuchsgruppen2011)

29.11.-01.12.1110th Annual World Drug ManufacturingSummit, BerlinInfo: WTG events (Tel.: +44 (0)20 7202 7690,E-Mail: [email protected],Web: www.wdmsummit.com/programme.asp)

29.11.-01.12.11European Antibody Congress 2011, Genf (CH)Info: Sarah Pegden, Terrapinn (E-Mail: [email protected], Web: www.terrapinn.com/2011/european-antibody-congress)

29.11.11Local Heroes and Global Challenges,MünchenInfo: BioM Biotech Cluster Development GmbH(E-Mail: [email protected],Web: http://events.bio-m.org/munich_biomarker_conference)

30.11.11Der Prüfplan in Klinischen Studien; Die Fall-zahlberechnung bei Klinischen Studien, KölnInfo: Biocampus Cologne(Tel.: +49-221-2722-18-0,E-Mail: [email protected],Web: www.biocampuscologne.de)

01.-03.12.11Molecular Insights for Innovative Therapies, HeidelbergInfo: EMBL (E-Mail: [email protected],Web: http://events.embo.org/emm2011)

01.12.115. Kooperationsforum Drug Development, WürzburgInfo: Dr. Borris Haupt, Bayern Innovativ(E-Mail: [email protected],Web: www.bayern-innovativ.de/drugdevelopment2011)

05.12.11The Use of Zink Finger Nucleases for theDevelopment of Next Generation Cell Lines and Animal Models, HeidelbergInfo: EMBL (Web: www.embl.de/training/events/2011/ZFN11-02)

07.-08.12.11Rapid Microbiological Methods Conference, BerlinInfo: CONCEPT Heidelberg GmbH(E-Mail: [email protected],Web: www.rmm-conference.org)

08.-09.12.11Pharmaceutical BioEngineering –New Biotrends to Smarter Drugs,DortmundInfo: Dr. Frank Eiden,BioChemGate & ChemBioTec(Tel.: +49 231 755 7391,E-Mail: [email protected],Web: www.biotrends.net)

24.01.12Synthetische DNA – Schreiben mit denBuchstaben des Lebens, Frankfurt am MainInfo: DECHEMA e.V. (Web: www.dechema.de/dna)

09.02-10.02.12Crossroads in Biology – 4th InternationalSymposium, Köln, Info: Universität Köln(Web: http://crossroads.uni-koeln.de)

16.-18.02.12Omics and Personalised Health, HeidelbergInfo: Bettina Schäfer, EMBL(E-Mail: [email protected], Web: www.embl.de/training/events/2012/PRO12-01/index.html)

16.-18.02.12: Neuroblastoma 2012, TübingenInfo: Universitätsklinik, Tübingen (Web: www.neuroblastoma2012.com)

17.02.12: 5th Berlin Conference on IP in LifeSciences – Antibodies and Beyond, BerlinInfo: Uta Holmer, BIOCOM AG (Web: www.biocom.de/events)

22.-23.02.12: 7th Annual Biomarkers Congress, Manch0ester (UK)Info: Oxford Global Conference(Web: www.biomarkers-congress.com)

11.-14.03.12: Human Genome Meeting,Sydney (AUS)Info: HUGO (E-Mail: [email protected],Web: www.hgm2012.org)

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Ausblick

Inserentenverzeichnis

Analytik Jena AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5Astra Biotech GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13Beckman Coulter GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . 7Berlin Partner GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27BIO .NRW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U3BIOCOM AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11, 31Candor Bioscience GmbH . . . . . . . . . . . . . . . 15Fördergesellschaft IZB mbH . . . . . . . . . . . . . 15Graduate School Life Science . . . . . . . . . . . . 43Hochschule Biberach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43Kimberly Clark Professional . . . . . . . . . . . . . 37Licor Biosciences GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . 25New England Biolabs GmbH . . . . . . . . . . . . U4Norgenta GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Porvair Sciences Ltd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Promocell GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Protagen AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17S4L - Science for Life . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31SOCOREX ISBA S .A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Stammzellentscheidung des EuGH stoppt Forscher von Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT

Um einiges schärfer als erwartet, hat der Europäische Gerichtshof (EuGH) in Luxemburg definiert, was nach der Europäischen Biopatentrichtlinie 98/44 unter einem „menschlichen Embryo“ zu verstehen ist. Eine Definition hatte der deutsche Bundesgerichtshof vor zwei Jahren vom EuGH erbeten, nachdem das Bundespatentgericht 2006 das Patent DE: 197 56 864.5 des Bonner Neuro pathologen Oliver Brüstle nach Klage des Greenpeace e.V. erheblich eingeschränkt und Brüstle dem im Mai 2007 vor dem BGH widersprochen hatte. Brüstles Patent betrifft die Differenzierung neuraler Vorläuferzellen aus pluripotenten humanen em-bryonalen Stammzelllinien zum Zwecke der Behandlung unheilbarer neurologischer Leiden. Das Gericht befand jetzt, dass jede menschliche Eizelle, die natürlich oder künstlich befruchtet sowie durch Parthenogenese entstanden ist, als „menschlicher Embryo“ zu betrachten und alle Verfahren, bei denen ein humaner Embryo zerstört wird, von der Patentierbarkeit nach der Biopatentrichtlinie auszuschließen seien. Darunter fallen sämtliche Verfahren, die totipo-tente menschliche Embryonen als Ausgangsmaterial nutzen. Auch könne eine Verwendung zur wissenschaftlichen Forschung nicht von einer kommerziellen Nutzung unterschieden werden, so der EuGH, und sei damit nicht patentierbar. Vor der eigentlichen Frage, ob aus Blastozysten gewonnene Stammzelllinien die Basis für patentierte Verfahren sein dürfen, drückte sich der EuGH allerdings und spielte den Ball an die nationalen Gerichte zurück. Diese sollen nun entscheiden, ob Blastozysten imstande seien, „die Entwicklung eines Menschen in Gang zu setzen, und folglich unter den Begriff des menschlichen Embryos fallen“.

Ähnlich wie führende deutsche Stammzell-forscher befürchtet Brüstles Anwältin Clara Sattler de Sousa e Brito, dass das Urteil auch Folgen auf die ausdrücklich anwendungsori-entierte EU-Forschungsförderung im Rahmen des 8 . Rahmenprogrammes haben muss . Denn der Verwertungskanal für Stammzell-erfindungen ist seit der Entscheidung in Europa geschlossen . Zwar gelten bereits erteilte Stammzellpatente weiter . Im Falle einer Nichtigkeitsklage sind die Ansprüche jedoch nach dem Referenzurteil des EuGH nicht mehr zu verteidigen . Auch die Beantra-gung neuer Patente ist nicht mehr möglich – ist Europa damit auf dem Weg zu weniger Transparenz in der Stammzellforschung und Heimlichtuerei, damit außereuropäische Konkurrenten die Forschungsergebnisse europäischer Gruppen nicht nutzen? Hier ist

LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint dreimonatlich im Verlag der

BIOCOM AGLützowstraße 33–3610785 Berlin, GermanyTel./Fax: 030/264921-0 / 030/[email protected]

RedaktionDipl.-Biol. Thomas GabrielczykTel.: 030/264921-50

AnzeigenleitungOliver SchnellTel. 030/264921-45, [email protected]

LeserserviceAngelika Werner, Tel. 030/264921-40

Graphik-DesignMichaela Reblin

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BIOCOM AG

Impressum

www.laborwelt.de

ThemenZellbiologie & AktuellesMit dem Start einer umfassenden LA-BORWELT-Online-Plattform, die die Prin-tausgabe ergänzt, wird LABORWELT 2012 noch informativer und moderner . Im ge-druckten Methodenjournal finden sich im neuen Jahr ein Haupt- und zwei aktuelle Themenschwerpunkte, begleitet von Ex-pertenkommentaren und vielem neuen . Das LABORWELT-Hauptthema Zellbiologie beleuchtet neue FACS-Anwendungen und Imagingverfahren sowie die Entdeckung, dass Makrophagen eine Rolle bei der adap-tiven Immunantwort spielen .

Expertenpanel ZellkulturmedienWerbekunden bietet diese Ausgabe eine opti male Plattform für ihre Produkt-und Image anzeigen . Reservieren Sie Ihren Wer-beplatz in der LABORWELT-Themenausgabe bis spätestens zum 02 . März 2012 . Ergänzend zum Thema „Zellbiologie“ lassen wir Ex-perten zu aktuellen Entwicklungen im An-wendungssfeld „Zellkulturmedien“ zu Wort kommen . Informationen zu Ihrer möglichen Teilnahme gibt Oliver Schnell (Tel .: +49-30-264921-45, E-Mail: o .schnell@biocom .de) .

Vorschau Heft 1/2012

ein forschungspolitisches Bekenntnis gefragt . Denn wer Millionen Euro Steuergelder für die anwendungsorienterte Stammzellfor-schung ausschreibt und von Forschern einen Verwertungsplan einfordert, kann nicht den Finger heben und die Kommerzialisierung der Ergebnisse ethisch ächten .

Folgen noch nicht absehbar

Noch sind die Folgen des Urteils nicht abseh-bar . Klar ist jedoch, dass Wissenschaftler sich umorientieren werden wo Hemmschwellen aufgebaut werden, wissenschaftliche Ergeb-nisse zu publizieren und damit öffentlich zu machen . In Deutschland laufen die Förde-rungen jetzt aus, und es kommt erst einmal wenig nach .

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LABORWELT 06/2011

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