CHRISTIAN HAUPT1, DIETMAR RUDOLF THAL2, UWE HORN3, MARCUS FÄNDRICH1
1INSTITUT FÜR PHARMAZEUTISCHE BIOTECHNOLOGIE, UNIVERSITÄT ULM2INSTITUT FÜR PATHOLOGIE, SEKTION NEUROPATHOLOGIE,
UNIVERSITÄTSKLINIKUM ULM3LEIBNIZ-INSTITUT FÜR NATURSTOFF-FORSCHUNG UND INFEKTIONSBIOLOGIE,
HANS-KNÖLL-INSTITUT (HKI), JENA
Conformational diseases, such as Alzheimer’s or Parkinson’s, are charac-terized by the misfolding of endogenous polypeptide chains into abnormalamyloid fibril conformations. To better analyze this process and its biolog-ical consequences and to generate tools for targeted interference in vitroand in vivo, we have biotechnologically generated a set of antibody frag-ments that are able to discriminate by binding between different amyloidassembly states.
Amyloidfibrillen und Amyloid-Krankheitenó Die Ablagerung von Amyloidfibrillen istein zentrales pathologisches Charakteristi-
kum von Amyloid-Krankheiten wie Alzhei-mer und Parkinson [1]. Diese aus Polypep-tidketten bestehenden Aggregate zeichnensich durch ein Strukturmotiv aus (cross-β),
welches allen Amyloidfibrillen gemeinsamist. Dieses Motiv besteht aus einem inter -molekularen β-Faltblatt, welches das struk-turelle Rückgrat der Fibrille bildet und dessenβ-Stränge senkrecht zur Fibrillen-Hauptach-se ausgerichtet sind. Neben den oben genann-ten neurodegenerativen Erkrankungen kom-men pathologische Amyloidfibrillen aber auchaußerhalb des Gehirns vor, insbesonderebei den systemischen Amyloidosen [2]. Amy -loidfibrillen sind Produkte eines komplexenSelbstassemblierungsprozesses, in dem sichPeptide aneinanderlagern und über ver-schiedene Zwischenzustände schließlich denEndzustand der Amyloidfibrille erreichen(Abb. 1). Allerdings ist es von Krankheit zuKrankheit verschieden, welche dieser Amy-loidstrukturen für den beobachteten Patho-mechanismus verantwortlich ist. Währendman bei den neurodegenerativen Amyloid-Erkrankungen von einem zelltoxischen Effektvon Fibrillierungszwischenstufen ausgeht,entstehen systemische Amyloidosen wohleher durch die von großen Fibrillenablage-rungen hervorgerufenen physikalisch-me -chanischen Schädigungen des betroffenenGewebes.
Biotechnologische Gewinnung vonkonformationsspezifischenAntikörperfragmentenUm den Prozess der Selbstassemblierungbesser zu verstehen, einzelne Assemblie-rungsstufen gezielt zu charakterisieren undum neue Möglichkeiten zu schaffen, mit derWirkung bestimmter Zustände zu interferie-ren, wurde in den vergangenen Jahren eineReihe von Molekülen und Proteinen ent -wickelt, die einzelne Assemblierungsstadienselektiv erkennen und so für weitere Studienzugänglich machen konnten. BesonderesAugenmerk galt dabei der Herstellung vonkonformationellen Antikörpern. Diese er -kennen nicht primär eine bestimmteSequenz, sondern eine (etwa durch ein dis-kontinuierliches Epitop) definierte Kon -formation [3]. Antikörper sind aufgrund ihrernatürlichen Funktion darauf optimiert, eine
˚ Abb. 1: Schema des Selbstassemblierungsprozesses zu einer Amyloidfibrille und Bindung spe-zifischer Zustände mittels konformationsspezifischer Antikörperfragmente. Während das Antikör-perfragment B10 die Assemblierungsreaktion auf der Stufe von Protofibrillen inhibiert, greift KW1auf der Stufe von Oligomeren in die Reaktion ein.
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große Zahl unterschiedlicher Antigenstruk-turen verlässlich zu erkennen, und poly -klonale Antikörper können außerdem durchVakzinierung von Labortieren relativ leichtgewonnen werden. Dennoch ist es vor allemin der Grundlagenforschung immer wiederwünschenswert, mit monoklonalen Bindernzu arbeiten, die eindeutige Spezifitäten be -sitzen, biophysikalisch gut charakterisiertund molekularbiologisch zugänglich sind.Daher haben wir eine Methode etabliert, ummaßgeschneiderte Antikörperfragmentemittels eines biotechnologischen Verfahrensgezielt herzustellen. Dieses beruht auf derPhagen-Display-Technologie und dem Ausle-sen von Bindern gewünschter Selektivitätaus einer selbst hergestellten, vollsyntheti-schen Bibliothek von Antikörperfragmentenaus Kamelen. Diese besitzen nämlich einenbesonderen Antikörpertypus, der nur auszwei schweren Ketten besteht und dem folg-lich leichte Ketten fehlen (Abb. 2A). Eine kleine, autonom faltende Domäne (VHH) vonca. 120 Aminosäuren Länge bewerkstelligtin diesen Antikörpern die Antigenbindung.Der sich damit verbindende offensichtlicheVorteil besteht darin, dass es für eine funk-tionelle Bindung nicht mehr notwendig ist,mehrere Ketten miteinander zu kombinie-ren, wodurch ein Phagen-Display leichterdurchzuführen ist.
Kernstück unserer Selektion war die Schaf-fung einer kompetitiven Situation zwischenzwei Antigenen (Abb. 2B). Ein Ziel-Antigen,gegen welches das Antikörperfragmentgerichtet sein soll, wird immobilisiert. Einzweites Antigen, für welches wir die Kreuz-reaktivität minimieren möchten, wird alsKompetitor löslich in den Überstand gegeben.Antikörperfragmente mit hoher Affinität fürden Kompetitor können so zusammen mitallen ungebundenen Antikörperfragmentenleicht entfernt werden. Zur Gewinnungvon Antikörperfragmenten, die spezifischeAssemblierungsstadien des Alzheimer-Amy-loid-β(Aβ)-Peptids erkennen, wurden unter-schiedliche Konformere dieses Peptids alsZiel-Antigen und Kompetitor verwendet. Fürdie Gewinnung des fibrillenspezifischen Bin-ders B10 nutzen wir beispielsweise Aβ-Amy-loidfibrillen als Ziel-Antigen und disaggre-giertes („monomeres“) Aβ-Peptid als Kompe-titor [4].
Mögliche Anwendungen inGrundlagenforschung und MedizinMit den dabei generierten Antikörperfrag-menten konnten grundlegende Erkenntnisse
darüber gewonnen werden, welche Oberflä-cheneigenschaften die ligandengestützteUnterscheidung von verschiedenen Assem-blierungsstufen ermöglichen. Im Falle vonB10 (Abb. 3A), welches Amyloidfibrillen, aberkeine oligomeren Intermediate oder disag-gregiertes Aβ-Peptid bindet (Abb. 3B), erfolgtdiese Erkennung über ein saures Oberflä-chenmotiv der Fibrillen und elektrostatischeWechselwirkungen. Eine Mutagenese derAntigen-Bindestelle von B10, chemische Modi-fikation von sauren Gruppen der Fibrille undRöntgenkristallografie konnten dies konsis-tent belegen [5]. Dagegen bindet das KW1-Antikörperfragment (Abb. 3A) spezifisch anoligomere Intermediate, nicht aber an Fibril-len oder disaggregiertes Aβ-Peptid (Abb. 3B).Es erkennt diese Oligomere aufgrund einerspeziellen Oberflächenstruktur, die sich durchhydrophobe/aromatische Seitenketten aus-zeichnet [6].
Konformationelle Antikörperfragmente bil-den die Grundlage für neue Entwicklungenin Grundlagenforschung, Diagnostik und Inhi-bition. Konformationelle Binder können inBlots, ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay), Affinitätspräzipitation oder Mikro-
skopie zum Nachweis bestimmter Aggregat-stadien eingesetzt werden. Darüber hinauskönnten sie die Etablierung neuer in vivo-Bildgebungsverfahren ermöglichen, um dieVerteilung von Amyloidablagerungen im Kör-per oder einzelnen Organen nachzuweisen.Diese Option ist insbesondere durch denNachweis von B10- oder KW1-positiven Spe-zies in histologischen Schnitten, Körperflüs-sigkeiten, Gewebs- und Zellextrakten unter-stützt [4, 6–8]. Mithilfe von B10 können Pla-ques in verschiedenen Mausmodellen diffe-renziert und somit strukturelle Unterschiededetektiert werden (Abb. 3C). Derart verbes-serte Nachweismöglichkeiten von Amyloid imlebenden Organismus wären insbesonderefür die Beurteilung der therapeutischen Effizienz anti-amyloider Maßnahmen sehrwichtig.
Konformationelle Binder können aber auchdirekt als Ausgangspunkt für neue thera-peutische Strategien genutzt werden. Dabeisind mehrere Wirkmechanismen denkbar.Erstens können vollständige Antikörpernatürlich generell Fremdstrukturen erken-nen und ihre Eliminierung durch das humo-rale Immunsystem einleiten. Zweitens kön-
BIOspektrum | 01.14 | 20. Jahrgang
˚ Abb. 2: Strukturelle Organisation und biotechnologische Anwendung von Kamel-Antikörpern.A, struktureller Vergleich eines konventionellen Antikörpers mit Schwere-Ketten-Antikörpern vonKamelen. VH, VL: variable Domäne der schweren bzw. leichten Kette; VHH: variable Domäne derSchwere-Ketten-Antikörper. B, Schema der Selektion von konformationsspezifischen Antikörper-fragmenten mittels kompetitiven Phagen-Display.
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nen Antikörper durch Bindung toxischerAggregate ihre zellschädigende Wirkung anta-gonistisch unterbinden. Diese Wirkweisekonnte im Falle von KW1 in vitro gezeigt wer-den, welches die neuronenschädigende Wir-kung von Aβ-Oligomeren auf kultivierte pri-märe Neuronen und Gehirnschnitte blockiert(Abb. 3D, [6]). Drittens können Antikörper-fragmente mit dem Assemblierungsmecha-nismus interferieren und diesen damit ineiner gewünschten Weise verändern – etwa
indem toxische Strukturen in ihrer Bildungunterbunden oder destabilisiert werden. Die-se Wirkweise konnte sowohl für B10 als auchfür KW1 belegt werden. Beide Antikörper-fragmente greifen in den Assemblierungs-mechanismus ein, allerdings KW1 in einemfrühen und B10 in einem späteren Schritt derAssemblierungsreaktion (Abb. 1). Inwieweitsich daraus eine therapeutische Strategieableiten lässt, ist Gegenstand aktueller Arbei-ten unseres Labors.
DanksagungDiese Arbeiten wurden gefördert von BMBF(BioFuture), DFG (SFB 610), Exzellenznetz-werk Biowissenschaften Land Sachsen-Anhaltund Alzheimer Forschung Initiative e.V. ó
Literatur[1] Westermark P, Benson MD, Buxbaum JN et al. (2007) Aprimer of amyloid nomenclature. Amyloid 14:179–183[2] Röcken C, Ernst J, Hund E et al. (2006) Interdisciplinaryguidelines on diagnosis and treatment for extracerebral amy-loidoses – published by the German Society of AmyloidDiseases (www.amyloid.de). Dtsch Med Wochenschr 131:45–66[3] Benjamin DC, Berzofsky JA, East IJ et al. (1984) The anti-genic structure of proteins: a reappraisal. Annu Rev Immunol 2:67–101[4] Habicht G, Haupt C, Friedrich RP et al. (2007) Directedselection of a conformational antibody domain that preventsmature amyloid fibril formation by stabilizing Aβ protofibrils.Proc Natl Acad Sci USA 104:19232–19237[5] Haupt C, Morgado I, Kumar ST et al. (2011) Amyloid fibrilrecognition with the conformational B10 antibody fragmentdepends on electrostatic interactions. J Mol Biol 405:341–348[6] Morgado I, Wieligmann K, Bereza M et al. (2012)Molecular basis of β-amyloid oligomer recognition with a con-formational antibody fragment. Proc Natl Acad Sci USA 109:12503–12508[7] Kieninger B, Gioeva Z, Krüger S et al. (2011) PTAA andB10: new approaches to amyloid detection in tissue-evaluationof amyloid detection in tissue with a conjugated polyelectroly-te and a fibril-specific antibody fragment. Amyloid 18:47–52[8] Haupt C, Bereza M, Kumar ST et al. (2011) Pattern recog-nition with a fibril-specific antibody fragment reveals the sur-face variability of natural amyloid fibrils. J Mol Biol 408:529–540.
Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Marcus FändrichInstitut für Pharmazeutische BiotechnologieUniversität UlmHelmholtzstraße 8/1D-89081 UlmTel.: [email protected]
˚ Abb. 3: Die Antikörperfragmente KW1 und B10 greifen im Assemblierungsmechanismus vonAmyloidfibrillen ein. A, Röntgenkristallstruktur der Antikörperfragmente KW1 und B10. CDR:hypervariable Region. B, konformationelle Spezifität von KW1 und B10. C, B10 detektiert spezi-fisch Fibrillen in Aβ-Ablagerungen im Gehirn eines Alzheimer-Mausmodells (APP23). Dagegen tre-ten in einem alternativen Mausmodell (APP51/61) keine Fibrillen in den Aβ-Ablagerungen auf. D,KW1 blockiert eine durch Oligomere hervorgerufene Störung von synaptischen Übertragungen.
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AUTORENChristian Haupt1999–2006 Biologiestudium an der Universität Jena, dort2006–2011 Promotion in Biochemie. 2011–2012 Postdocam Hans-Knöll-Institut in Jena. Seit 2012 Postdoc am Institutfür Pharmazeutische Biotechnologie der Universität Ulm.
Uwe Horn1984–1989 Biologiestudium an den Universitäten Greifs-wald und Halle-Wittenberg. 1989–1994 Assistent am Institutfür Allgemeine Mikrobiologie der Universität Halle-Witten-berg. 1994 Promotion. 1994–1996 Postdoc bei Prof. Dr. A.Plückthun am Biochemischen Institut der Universität Zürich,Schweiz. Seit 1996 wissenschaftlicher Mitarbeiter am Leib-niz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie(HKI), Jena. Seit 2005 Leiter des Biotechnikums.
Dietmar Rudolf Thal1986–1992 Humanmedizinstudium an der UniversitätFrankfurt a. M., dort 1993 Promotion in Humanmedizin.1994–2007 Assistenzarzt in Offenbach, Leipzig, Frankfurta. M. und Bonn. 2005 Habilitation für das Fachgebiet Neu-ropathologie. Seit 2007 Professor für Neuropathologie amInstitut für Pathologie der Universität Ulm.
Marcus Fändrich1993–1998 Biologiestudium an der Universität Heidel-berg, 1998–2002 Promotion in Physical Science/Inorga-nic Chemistry an der Universität Oxford, UK. 2002–2007Postdoc und BioFuture-Gruppenleiter am Leibniz-Institutfür Altersforschung in Jena. 2008–2012 Gruppenleiter ander Max-Planck-Forschungsstelle für „Enzymologie derProteinfaltung“ in Halle/Saale. Seit 2012 Professor fürPharmazeutische Biotechnologie an der Universität Ulm.
