Klinische Epidemiologie, Serotypenverteilung und ...

Aus dem Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

Klinische Epidemiologie, Serotypenverteilung und

Antibiotikaresistenz von Gruppe B Streptokokken (GBS)

in der Schwangerschaft

–

Prospektive Kohortenstudie an der Universitäts-

Frauenklinik Freiburg in den Jahren 2009-2010

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

vorgelegt 2011

von Leonie Karstens

geboren in Hamburg

Dekan Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum

1. Gutachter Priv.-Doz. Dr. med. Markus Hufnagel

2. Gutachter Prof. Dr. med. Heinrich Prömpeler

Jahr der Promotion 2012

Inhalt

1 Einleitung ............................................................................................................................. 1

1.1 Charakteristika des Erregers Streptococcus agalactiae .................................................... 1

1.1.1 Geschichtlicher Hintergrund .............................................................................. 1

1.1.2 Mikrobiologische Eigenschaften ....................................................................... 1

1.1.3 Zellwand ............................................................................................................ 2

1.1.4 Serologische Einteilung ..................................................................................... 3

1.1.5 Kapselpolysaccharide ........................................................................................ 4

1.2 Klinische Bedeutung von GBS ........................................................................................ 4

1.2.1 Kolonisation und Infektion ................................................................................ 4

1.2.2 Risikofaktoren für die Neugeborenen-Infektion ................................................ 7

1.2.3 Prophylaxe ......................................................................................................... 8

1.3 Epidemiologie der neonatalen GBS-Infektionen ............................................................. 9

1.4 Antibiotikaresistenzen ................................................................................................... 10

1.4.1 Betalaktam-Antibiotikaresistenz ..................................................................... 10

1.4.2 Makrolid-Resistenzen ...................................................................................... 11

1.5 GBS-Impfstoffentwicklung ........................................................................................... 13

2 Fragestellung und Ziele der Studie .................................................................................. 15

3 Material und Methoden..................................................................................................... 18

3.1 Studiendesign ................................................................................................................. 18

3.2 Material .......................................................................................................................... 18

3.2.1 Klinisch-epidemiologische Datenerfassung .................................................... 18

3.2.2 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................... 20

3.2.3 Geräte ............................................................................................................... 21

3.3 Methoden ....................................................................................................................... 22

3.3.1 Nachweismethoden von GBS .......................................................................... 22

3.3.1.1 Katalase-Test ............................................................................................ 23

3.3.1.2 CAMP-Test ............................................................................................... 24

3.3.1.3 Latex-Agglutinationstest .......................................................................... 25

3.3.2 Antibiotikaresistenz-Testungen ....................................................................... 26

3.3.2.1 Agardiffusionstest (Disc-Test) ................................................................. 26

3.3.2.2 D-Test ....................................................................................................... 27

3.3.2.3 E-Test ........................................................................................................ 28

3.3.3 Serotypisierung .............................................................................................................. 30

3.3.4 Statistische Analyse ....................................................................................................... 30

4 Ergebnisse ........................................................................................................................... 32

4.1 Patientenkollektiv: Gesamt ............................................................................................ 32

4.1.1 Abstrichrate des GBS-Screenings ................................................................... 32

4.2. Patientenkollektiv: GBS-Screening .............................................................................. 32

4.2.1 GBS-Kolonisationsrate .................................................................................... 32

4.2.2 Zeitpunkt des positiven GBS-Nachweises ...................................................... 32

4.2.3 Entnahmeort des Abstrichs bei GBS-Screening .............................................. 33

4.3 Patientenkollektiv: GBS-positive Schwangere .............................................................. 34

4.3.1 Lebensalter ....................................................................................................... 34

4.3.2 Schwangerschafts-Parität ................................................................................. 34

4.3.3 Einlings- vs. Mehrlingsschwangerschaften ..................................................... 34

4.3.4 Schwangerschaftsdauer ................................................................................... 34

4.3.5 Frühgeburtlichkeit ........................................................................................... 34

4.3.6 Geburtsmodus .................................................................................................. 35

4.3.7 Risikofaktoren für eine GBS-Infektion beim Neugeborenen .......................... 35

4.3.8 Intrapartale Antibiotika-Prophylaxe ................................................................ 36

4.4 Epidemiologie der EOD Fälle........................................................................................ 38

4.4.1 Inzidenz der EOD Fälle ................................................................................... 38

4.4.2 Klinik der EOD Fälle ....................................................................................... 38

4.4.3 Vergleich Serotypen kindliches vs. mütterliches Isolat ................................... 39

4.5 Antibiotikaresistenzen ................................................................................................... 39

4.5.1 Antibiotikaresistenz im Agardiffusionstest ..................................................... 39

4.5.2 Antibiotikaresistenz im E-Test ........................................................................ 40

4.6 Serotypisierung .............................................................................................................. 41

4.6.1 Gesamtkollektiv der GBS-Isolate .................................................................... 41

4.6.2 Serotypenverteilung der Erythromycin-resistenten Isolate ............................. 42

5 Diskussion ........................................................................................................................... 44

5.1 Klinische Epidemiologie ................................................................................................ 44

5.1.1 GBS-Kolonisationsrate schwangerer Frauen ................................................... 44

5.1.2 Klinik der GBS-kolonisierten Schwangeren ................................................... 45

5.1.3 IAP ................................................................................................................... 46

5.1.4 Inzidenz der EOD ............................................................................................ 47

5.2 Phänotypische GBS-Eigenschaften ............................................................................... 48

5.2.1 Antibiotikaresistenz ......................................................................................... 48

5.2.2 Serotypenverteilung ......................................................................................... 51

5.2.3 Serotypenverteilung und Makrolid-Resistenz ................................................. 52

5.3 GBS-Impfstoff ............................................................................................................... 53

5.3.1 Entwicklung und Perspektiven ........................................................................ 53

6 Zusammenfassung ............................................................................................................. 57

7 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 58

8 Anhang ................................................................................................................................ 72

8.1 Schwangeren - Fragebogen ............................................................................................ 72

8.2 Neugeborenen - Fragebogen .......................................................................................... 76

9 Erklärung ........................................................................................................................... 82

Danksagung ............................................................................................................................. 83

Abkürzungsverzeichnis

ACOG American College of Obstetricians and Gynecologists

APGAR Atmung, Puls, Muskelgrundtonus, Aussehen, Reflexerregbarkeit

AAP American Academy of Pediatrics

CAMP-Test Christie, Atkins, Munch-Petersen-Test

CDC Centers for Disease Control and Prevention

DGGG Deutsche Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe

DGPI Deutsche Gesellschaft für Pädiatrische Infektiologie

EOD Early-Onset-Disease

ESPED Erhebungseinheit seltener pädiatrischer Erkrankungen in Deutschland

GBS Gruppe B-Streptokokken

IAP Intrapartale Antibiotika-Prophylaxe

LOD Late-Onset-Disease

MHK Minimale Hemmkonzentration

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

PAC Port-a-Cul: Abstrichtupfer

RKI Robert-Koch-Institut

RVA Rektovaginalabstrich

SD Standarddeviation (Standardabweichung)

SSW Schwangerschaftswoche

THB Todd Hewitt Bouillon

UFK Universitäts-Frauenklinik

VBS Vorzeitiger Blasensprung

ZKJ Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin

95%-KI 95%-Konfidenzintervall

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Charakteristika des Erregers Streptococcus agalactiae

1.1.1 Geschichtlicher Hintergrund

Seit den 1970er Jahren ist Streptococcus agalactiae (Gruppe B-Streptokokken, GBS) ein

führender Erreger von invasiven Infektionen bei Neugeborenen und in den industrialisierten

Ländern heute nach wie vor der häufigste Erreger der neonatalen Sepsis (Schuchat A, 1999,

Berner R, 2003). In den dreißiger Jahren des letzten Jahrhunderts war es Rebecca Lancefield

erstmals gelungen eine Klassifizierung von B-Streptokokken basierend auf der

Antigenstruktur an der Zelloberfläche lokalisierter Polysaccharide (C-Substanz)

vorzunehmen, wodurch sich Streptococcus agalactiae von Streptococcus pyogenes (Gruppe

A-Streptokokken) unterscheiden ließ (Lancefield RC, 1933). Im Jahre 1938 beschrieben Fry

et al. zum ersten Mal die humanpathogene Bedeutung von Streptococcus agalactiae im

Zusammenhang mit schweren Formen der Puerperalsepsis (Wochenbettfieber) (Fry RM,

1938). In Studien der sechziger und siebziger Jahre wurden sowohl Escherichia coli als auch

Staphylococcus aureus als Hauptursachen der Sepsis bei Neugeborenen nachgewiesen

(Schuchat A, 2001), bis sie im Verlauf von GBS abgelöst wurden. Trotz einer ständigen

Verbesserung von Diagnostik, Therapie und Prophylaxe von GBS-Infektionen sind sie heute

nach wie vor die häufigsten Erreger der neonatalen Sepsis.

1.1.2 Mikrobiologische Eigenschaften

GBS sind grampositive, Katalase-negative, fakultativ anaerobe, unbewegliche, sporenlose

Kokken, die sich in Paaren oder Ketten anordnen. Meist sind sie von einer Kapsel umgeben.

Auf Blutagar weisen die Kolonien einen Durchmesser von 2-3 mm auf, sind scharf begrenzt,

flach, rund und in ihrer Farbe grau bis perlweiß. Streptokokken im Allgemeinen können

verschiedene Formen der Hämolyse bewirken. Unterschieden wird zwischen alpha-, beta- und

gamma-Hämolyse. Die alpha-Hämolyse entsteht durch einen partiellen Abbau des

Hämoglobins in den Erythrozyten und zeigt eine unscharfe grünlich-bräunliche Zone rund um

die Kolonien. In den meisten Fällen exprimieren GBS ein Hämolysin und verursachen damit

eine beta-Hämolyse, die durch einen vollständigen Zerfall der Erythrozyten gekennzeichnet

Einleitung 2

ist und einen eindeutig abgegrenzten Hämolysehof um die Kolonien zur Folge hat. Entsteht

kein Hämolysehof, spricht man von einer gamma-Hämolyse (Berner R, 2003, Fluegge K,

2005, Hof H, 2005). Bis zu 5% der GBS weisen phänotypisch keine Hämolyse auf (Brimil N,

2006). Neben dem Hämolysin produzieren GBS weitere Substanzen, wie

Desoxyribonukleasen, Hyaluronidasen, Neuraminidasen, Proteasen, pyogenes Exotoxin und

Lipoteichonsäuren, die als potentielle Virulenzfaktoren gelten (Ferrieri P, 1985, Lindahl G,

2005). In der Pathogenese der GBS werden Faktoren unterschieden, die eine Rolle spielen bei

der Adhäsion, der Invasion und der Immunevasion. Bei der Adhäsion und Invasion wirken die

Proteine der Alp-Familie, wie das ScpB, Lmb, Spb1, FbsA, sowie das Rib-like Protein und

die Proteine α und β (Lindahl G, 2005, Areschoug, T, 1999). Weitere Bedeutung kommt dem

Alpha-C-Protein und sog. Pilusstrukturen zu, die eine Interaktion zwischen den Epithelzellen

ermöglichen. Eine wichtige Rolle bei der Immunevasion spielt das ScpB, das durch den

Abbau der C5a-Peptidase einen potentiellen Virulenzfaktor darstellt (Lindahl G, 2005).

Neuraminidase, ein extrazelluläres Produkt von GBS, scheint ebenfalls ein Virulenzfaktor zu

sein (Milligan TW, 1980, Musser JM, 1998). Die Serotypen I und II von GBS produzieren

geringe Mengen an Neuraminidasen, wohingegen beim Serotyp III, der mit einem erhöhten

Risiko für eine invasive GBS-Infektion assoziiert wird, große Mengen nachgewiesen werden

konnten (Milligan TW, 1980). Die Rolle der Oberflächenproteine in der Pathogenese der

Meningitis bei Neugeborenen ist noch nicht ausreichend geklärt, allerdings konnte in den

meisten Fällen ebenfalls der hochvirulente Serotyp III, der die Proteine Rib und Spb1

exprimiert, für invasive GBS-Infektionen verantwortlich gemacht werden (Adderson EE,

2003, Lindahl G, 2005).

1.1.3 Zellwand

Die Struktur der Zellwand von GBS entspricht dem typischen Aufbau eines grampositiven

Bakteriums. Das Grundgerüst der Zellwand besteht aus Peptidoglykan (Murein), das netzartig

die Zelle umgibt und, nur getrennt durch einen periplasmatischen Spalt, der

Zytoplasmamembran aufliegt, sowie das Zytoplasma selbst von der Umgebung trennt.

Weiterhin dient die Zellwand als „Kommunikationsorgan“ im Kontakt mit der „Außenwelt“.

Die Zellwand sorgt für den Nährstofftransport, den Druckausgleich in der Zelle, sie gibt der

Einleitung 3

äußeren Form Stabilität und schützt sie vor anderen Mikroorganismen. Durch die Zellwand

selbst ziehen Lipoteichonsäuren und Proteine.

Die langen Polysaccharidketten (Glykane) sind durch Quervernetzungen mittels kurzer

Aminosäuren verbunden. Je nach Dicke der Zellwand und damit abhängig von der Anzahl der

Peptidoglykanschichten, lassen sich die Bakterien mit der Gram-Färbung in die Gruppe der

gramnegativen Bakterien (wenige Mureinschichten) und in die der grampositiven Bakterien

(bis zu 40 Mureinschichten) einteilen (Hof H, 2005). GBS besitzen eine Kapsel, die aus vielen

Peptidoglykanschichten aufgebaut ist und sind somit grampositiv. Polysaccharid-Antigene in

der Zellwand, auch C-Substanz genannt, spielen eine wichtige Rolle beim Schutz vor

Phagozytose und sind die molekulare Basis der Einteilung der Lancefield-Gruppen (siehe

1.1.4).

1.1.4 Serologische Einteilung

Streptokokken werden aufgrund von Polysaccharid-Antigenen in der Zellwand, C-Substanz

genannt (in Ableitung des englischen Wortes „Capsular“ für Kapsel), in die Lancefield-

Gruppen A-W eingeteilt und in solche, die kein Gruppenantigen besitzen. Lancefield

definierte 1934 zwei Zellwandantigene für GBS: die gruppenspezifische C-Substanz, die für

alle GBS-Stämme spezifisch ist und die typenspezifische S-Substanz, die eine Klassifikation

in damals drei Serotypen erlaubte (I, II und III). Serotyp I wurde später anhand strukturell

unterschiedlicher Polysaccharide in die Untergruppen Ia und Ib unterteilt (Lancefield RC,

1934). Heutzutage werden 10 verschiedene typspezifische Kapselpolysaccharide

unterschieden und klassifiziert: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und IX (Perch B, 1979, Ryc

M, 1988, Ramaswamy SV, 2006, Slotved HC, 2007). In der heutigen Diagnostik können

sowohl die Gruppenspezifität als auch die Typenzugehörigkeit durch verschiedene

Testverfahren wie der Latex-Agglutination mit gruppen- und typenspezifischen Antiseren

oder der PCR untersucht und charakterisiert werden (Hof H, 2005).

Einleitung 4

1.1.5 Kapselpolysaccharide

GBS können anhand ihrer unterschiedlichen Kapselpolysaccharidstruktur in 10 verschiedene

Serotypen unterteilt werden: Ia, Ib und II-IX. Kapselpolysaccharide bestehen aus

Monosacchariden, Rhamnose, Galactose, N-Acetylglucosamin und Glucitolphosphat. Ihre

Zusammensetzung ist für jeden der zehn Serotypen unterschiedlich und charakterisierend. Die

Verteilung der Serotypen variiert geographisch stark (Brimil N, 2006, Lachenauer CS, 1999),

außerdem unterscheidet sich das Verteilungsmuster zwischen mütterlichen

Kolonisationskeimen und kindlichen invasiven Isolaten (Phares CR, 2008, Bürckstümmer

AK, 2004, Hickmann ME, 1999). Der am häufigsten vorkommende invasive Typ in

Deutschland ist Serotyp III, allerdings wurde in den letzten Jahren zunehmend von GBS-

Infektionen durch Isolate des Serotyps V berichtet (Fluegge K, 2005, Brimil N, 2006, Berner

R, 2003, Blumberg HM 1996, Von Both U, 2003). In den USA hatte in den 1990er Jahren der

Serotyp V die Häufigkeit des Serotyps III übertroffen, allerdings nahmen die Serotypen Ia, II

und III in den letzten Jahren wieder deutlich zu (Harrison LH, 1998, Phares CR, 2008). In

Norwegen und Polen dominiert ebenfalls Serotyp III, in Japan die Serotypen VI und VIII

(Kvam AI, 1995, Sadowy E, 2010, Lachenauer CS, 1999).

In den letzten Jahren ist außerdem ein Anstieg von Resistenzen von GBS gegen Makrolide

und Lincosamide zu beobachten. Grund dafür ist laut aktueller Studienlage die Zunahme der

Isolate mit dem Serotyp V (Diekema DJ, 2003, Manning SD, 2003).

1.2 Klinische Bedeutung von GBS

1.2.1 Kolonisation und Infektion

GBS können aufgrund ihrer Adhäsions- und Invasionsfähigkeit an Epithelzellen, intakte

Schleimhäute überwinden und ins Gewebe penetrieren. Bei Erwachsenen scheinen GBS keine

relevanten Infektionen zu verursachen. Erst im höheren Lebensalter erkranken auch

Erwachsene wieder an GBS-Infektionen (Lambertsen L, 2010, Sendi P, 2008).

Symptomatische GBS-Infektionen betreffen hauptsächlich die Haut und Weichteile

(Zellulitis, Phlegmone), sowie Knochen und Gelenke (Osteomyelitis, septische Arthritis);

außerdem treten Bakteriämien, Endo- und Perikarditiden, Pneumonien, Otitis media,

Einleitung 5

Harnwegsinfektionen und Peritonitis auf (Farley MM, 1993). Die Letalität bei Erwachsenen

ist nicht unerheblich. In den USA scheint die GBS-assoziierte Letalität bei älteren Menschen

bei bis zu 50% zu liegen (Edwards MS, 2005). In der Schwangerschaft führt eine Besiedelung

des Harntraktes mit GBS häufig zu einer asymptomatischen Bakteriurie, kann aber auch eine

symptomatische Harnwegsinfektion verursachen. Das Reservoir von GBS beim Menschen ist

der Gastrointestinaltrakt (Baker CJ, 1973). Eine symptomatische GBS-Infektion in der

Schwangerschaft kann neben einem Harnwegsinfekt als Chorioamnionitis, Endometritis,

Beckenvenen-Thrombophlebitis oder (selten) auch als Endokarditis auftreten (CIDCFN,

1992).

Hauptgefahr durch eine Kolonisation bzw. Infektion von Schwangeren mit GBS besteht

jedoch für das Neugeborene. Ein wichtiger Faktor für die potentielle Übertragung auf das

Neugeborene ist die Dichte der Besiedlung, d.h. die Anzahl an GBS-Kolonien, die sich im

Rektovaginalbereich ansiedelt. Etwa 10-35% aller Frauen sind während der Schwangerschaft

im Bereich der Vagina und des Rektums intermittierend, transient oder permanent mit GBS

besiedelt (Berner R, 2003, Milatovic D, 1995). Eine vertikale Übertragung auf das

Neugeborene tritt im Durchschnitt bei jedem zweiten Neugeborenen auf, jedoch entwickelt

nur ein kleiner Teil von etwa 0,2% dieser kolonisierten Kinder eine ernsthafte Neugeborenen-

Infektion (Berner R, 2003, Baker CJ, 2001). Das Risiko einer Neugeborenen-Infektion steigt

bei Frühgeburtlichkeit deutlich an. Bei Neugeborenen können sich die Infektionen in Form

einer Early-Onset-Disease (EOD) oder einer Late-Onset-Disease (LOD) äußern.

1.) EOD

Definitionsgemäß spricht man von einer Early-Onset-Disease (Frühe Form der Erkrankung),

wenn die Infektion in den ersten 7 Lebenstagen des Neugeborenen auftritt. In 80% der Fälle

sind reife Neugeborene betroffen. Das Letalitätsrisiko liegt hier bei ca. 4%. Bei sehr unreifen

Frühgeborenen ist die Letalität deutlich höher. Die drei häufigsten Manifestationen einer

GBS-Infektion sind Sepsis (bis hin zum septischen Schock), Pneumonie und Meningitis.

Seltener sind lokale Infektionen in Form einer Osteomyelitis oder Arthritis (DGGG, 2004).

Die Erreger gelangen ins Gewebe, schädigen dieses und lösen eine ausgeprägte

hyperinflammatorische Immunreaktion aus (Berner R, 2003, Henneke P, 2006). GBS können

Einleitung 6

ohne Infektionszeichen bei der Mutter durch Aspiration von Amnionflüssigkeit oder

Vaginalsekret unter der Geburt auf das Neugeborene übertragen werden. Bei bestehender

mütterlicher Chorioamnionitis mit mütterlichem Fieber oder mütterlichen Infektionszeichen

und Übertragung der Infektion auf das Neugeborene spricht man von einem sogenannten

Amnioninfektionssyndrom. GBS adhärieren nach Aspiration oder Ingestion von infiziertem

Fruchtwasser/Vaginalsekret an der Schleimhaut des fetalen Gastrointestinal- und

Respirationstraktes und können nach Invasion in die Blutbahn des Neugeborenen gelangen.

Initial zeigen ca. 80% der Neugeborenen respiratorische Auffälligkeiten, wie Apnoen,

Tachypnoe, Dyspnoe (z.B. stöhnende Atemgeräusche) oder Zyanose. Im weiteren Verlauf

kann es zu Hypothermie oder Fieber, Blässe, Tachykardie und Ikterus kommen (Baker CJ,

2001). 40-50% der Fälle weisen radiologisch eine Beteiligung der Lunge auf, da die Erreger

vornehmlich über das mütterliche, infizierte Fruchtwasser auf den Feten übertragen werden

(Gibson RL, 1995). 5-10% der Neugeborenen mit einer EOD leiden unter einer Meningitis,

die häufig durch den Serotyp III hervorgerufen wird (Baker, 1977). Tritt eine Meningitis bei

einer EOD auf, geht sie mit einem hohen Risiko für neurologische Langzeitfolgen einher,

besonders bei Frühgeborenen. In über 90% der Fälle ist mit einer Ausheilung einer EOD zu

rechnen, in Deutschland verläuft die Erkrankung in etwa 6% tödlich (Berner R, 2003). Ein

tödlicher Verlauf kann Folge eines septischen Schocks mit Kreislaufversagen, respiratorischer

Insuffizienz oder einer Hirnblutung sein (Schuchat A, 1990). Ein verspäteter Therapiebeginn

nach Auftreten der Symptome erhöht das Risiko an einer neonatalen GBS-Infektion zu

versterben (Schuchat A, 1990).

2.) LOD

Bei einer Infektion ab dem 8. Lebenstag bis zum Ende der 12. Lebenswoche spricht man von

einer Late-Onset-Disease (Späte Form der Erkrankung). Nach bisherigen Literaturangaben

kommt sie in Deutschland seltener vor als die frühe Form (LOD: 10-40%, EOD: 60-90%);

seit Einführung der IAP sank das Verhältnis von LOD/EOD weiter auf 40:60 (DGGG, 2010,

Fluegge K, 2006). Neuere Studienergebnisse zeigen sogar eine Umkehr des Verhältnisses von

LOD/EOD mit 52% zu 48% (Lander F, 2010). Im Gegensatz zur EOD sind bisher spezifische

Risikofaktoren für eine LOD nicht bekannt, auch die Pathogenese ist ebenfalls noch

Einleitung 7

weitgehend unbekannt. Diskutiert werden zwei Übertragungswege von GBS auf den

Säugling: Sowohl durch die Mutter als auch von der Umgebung, zum Beispiel von

Angehörigen, Pflegepersonal und Besuchern. Klinisch äußert sich die Erkrankung meist als

Meningitis, für die in 75-80% der Fälle der Serotyp III verantwortlich ist (Baker CJ, 1973).

Die Letalitätsrate ist geringer, allerdings besteht ein weitaus höheres Risiko für neurologische

Spätfolgen (Franciosi RA, 1973, Jarvis WR, 1996, Phares CR, 2008).

1.2.2 Risikofaktoren für die Neugeborenen-Infektion

Ob ein Neugeborenes durch die Übertragung der Mutter eine EOD entwickelt, ist von vielen

Faktoren abhängig. Folgende maternale Risikofaktoren gehen mit einem erhöhten Risiko für

eine Infektion beim Neugeborenen einher und gelten als Indikation für eine intrapartale

Chemoprophylaxe zur Vermeidung der frühen Form der Neugeborenensepsis durch GBS:

▪ Zustand nach Geburt eines vorherigen Kindes mit GBS-Infektion

▪ GBS-Bakteriurie während der Schwangerschaft

▪ Frühgeburt < 37 vollendete Wochen

▪ Mütterliches Fieber ≥ 38°C unter der Geburt

▪ Dauer des Blasensprunges ≥ 18 Stunden

▪ Positives GBS-Screening 35.-37.Woche

Neben diesen klassischen maternalen Risikofaktoren hängt das Risiko einer

Neugeboreneninfektion auch vom Inokulum (Dosis/Menge an Keimen) und dem Kapseltyp

der GBS ab. Kapselserotyp III scheint die höchste Virulenz zu besitzen, da 35% der EOD-

Fälle, 80% der EOD-Meningitiden und 75% der LOD-Fälle durch diesen Kapselserotyp

verursacht werden (Phares CR, 2008).

Neben dem kindlichen Infektionsrisiko kann eine Infektion durch GBS mit einem niedrigen

Geburtsgewicht (<1500g) assoziiert sein (Stoll BJ, 1996). Neugeborene sind laut Baker und

Kasper besonders gefährdet eine Early- bzw. Late-Onset-Infektion zu entwickeln, wenn ein

niedriger opsonierender Serumantikörpertiter der Mutter gegen die Kapselpolysaccharide der

Typ III B-Streptokokken vorliegt (Baker CJ, 1976). Da diese Antikörper zur Klasse der

Einleitung 8

plazentagängigen IgGs gehören und ca. 60% davon erst in den letzten zehn Wochen der

Schwangerschaft transplazentar übertragen werden, haben unreife Frühgeborene ein höheres

Risiko eine EOD zu entwickeln (Hyvarinen M, 1973). Weitere Faktoren, die mit einem

erhöhten Risiko für eine EOD assoziiert sind, sind afroamerikanische Rasse, Alter der Mutter

unter 20 Jahren, vorangegangene Totgeburt oder Spontanabort und langandauerndes

intrauterines Monitoring (Schuchat A, 1998). Spezielle Risikofaktoren für die LOD sind

bisher nicht bekannt.

1.2.3 Prophylaxe

Folgendes Vorgehen wird zur Prophylaxe von perinatalen GBS-Erkrankungen von CDC

(Centers for Disease Control and Prevention), ACOG (American College of Obstetricians and

Gynecologists) und AAP (American Academy of Pediatrics) in den USA bzw. der DGGG

(Deutsche Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe) und DGPI (Deutsche Gesellschaft

für Pädiatrische Infektiologie) seit 2004 empfohlen:

Bei allen Schwangeren sollte zwischen der 35. und 37. Woche ein vaginal-rektaler (vaginaler

Introitus und Anorektum) Abstrich vorgenommen und eine Kultur auf Selektivmedien

angelegt werden. Bewiesen ist, dass der Rektovaginalabstrich im Vergleich zu einem

einfachen vaginalen Abstrich mit bis zu 40% mehr erkannten positiven Fällen deutlich

sensitiver ist (Jamie WE, 2004, El Aila NA, 2010, Marconi C, 2010). Unter den

Labormethoden ist die Kultur der Goldstandard und wesentlich sensitiver als ein

Antigenschnelltest (Daniels J, 2009). Antigenteste/Schnellteste sind zurzeit nicht empfohlen

(Daniels J, 2009). Sollte dieser dennoch durchgeführt werden, ist ein positives Ergebnis

verwertbar, ein negatives sollte mittels Kultur kontrolliert werden, da falsch negative

Ergebnisse nicht auszuschließen sind.

Bei einem positiven Befund ist eine intrapartale Antibiotika-Prophylaxe (IAP) mit Penicillin

oder Ampicillin empfohlen. Sollte eine Unverträglichkeit gegen Betalaktam-Antibiotika

vorliegen, können Makrolide (z.B. Erythromycin) oder Lincosamide (z.B. Clindamycin)

gegeben werden. Angesichts der zunehmenden Resistenzentwicklung gegen Makrolide und

Lincosamide in den letzten Jahren, wird vor dem Einsatz dieser Antibiotika eine

Resistenztestung empfohlen. Makrolide sollen aufgrund der schlechten fetalen

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22El%20Aila%20NA%22%5BAuthor%5D

Einleitung 9

Gewebegängigkeit nicht eingesetzt werden (Verani JR, 2010). Liegt eine Makrolid- und

Lincosamid-Resistenz vor, empfiehlt sich bei Betalaktam-Antibiotika-Unverträglichkeit die

Gabe von Vancomycin (Schuchat A, 1998).

Bei nicht vorliegendem Abstrichergebnis bzw. wenn kein Abstrich erfolgt war, aber

Risikofaktoren wie drohende Frühgeburt, vorzeitiger Blasensprung oder intrapartales

mütterliches Fieber ≥ 38°C vorliegen, sollte ebenfalls eine intrapartale antibiotische

Prophylaxe gegeben werden. Gleiches gilt für Frauen, die bereits ein vorheriges Kind mit

einer GBS-Infektion geboren haben oder bei der während der Schwangerschaft eine GBS-

Bakteriurie nachgewiesen wurde. Hier kann auf ein präpartales GBS-Screening verzichtet

werden, da in jedem Fall eine antibiotische Prophylaxe unter der Geburt gegeben werden

sollte.

Keine Prophylaxe muss bei einem negativen Kulturergebnis im Zeitraum von 5 Wochen vor

Entbindung, auch nicht bei Anwesenheit von Risikofaktoren (Frühgeburt < 37 Wochen,

Vorzeitiger Blasensprung (VBS) 18h, Fieber ≥ 38°C unter der Geburt), gegeben werden.

Unabhängig vom GBS-Kulturergebnis kann auch bei einer primären Schnittentbindung (ohne

Wehen und ohne Blasensprung) auf eine Chemoprophylaxe verzichtet werden (Schuchat A,

1998).

Bei einer Kolonisation mit GBS in einer vorausgegangenen Schwangerschaft und negativem

GBS-Screening in der aktuellen Schwangerschaft, sowie bei GBS-Positivität zu einem

beliebigen Zeitpunkt vor der 35. Woche in der aktuellen Schwangerschaft wird keine

intrapartale Antibiotika-Prophylaxe empfohlen.

1.3 Epidemiologie der neonatalen GBS-Infektionen

Mit Beginn der 70er Jahre des letzten Jahrhunderts entwickelten sich GBS zum führenden

Erreger invasiver Infektionen bei Neugeborenen. GBS sind derzeit die häufigsten Erreger der

neonatalen Sepsis. Ihre Inzidenz für EOD und LOD beträgt weltweit ca. 0,6 bis 3,7 pro 1000

Lebendgeburten, in Deutschland liegt diese bei 0,47 pro 1000 Geburten (Fluegge K, 2006).

Betrachtet man nur die Inzidenz der EOD weltweit, so liegt diese bei etwa 0,5-0,6 pro 1000

Lebendgeburten (Berner R, 2003, Baker CJ, 1973, Berner R 1998, Baker CJ, 2001, Fluegge

Einleitung 10

K, 2006, Schrag SJ, 2000). Deutschland hat eine EOD-Inzidenz von 0,28 pro 1000 Geburten

(Fluegge K, 2006). In Dänemark wurde von einer ähnlichen Inzidenz von 0,24 pro 1000

Geburten berichtet (Hansen SM, 2004), in der Tschechischen Republik lagen die Werte

hingegen mit 0,7-1 pro 1000 Lebendgeburten höher (Strakova L, 2004). 1996 wurden in den

USA neue Präventionsrichtlinien des CDC eingeführt, die zu einem deutlichen Abfall der

Inzidenzzahlen führten. Von anfänglichen 1,7 pro 1000 Geburten gelang es innerhalb von

wenigen Jahren die Rate auf Werte von 0,6 pro 1000 Geburten zu senken. Der Anteil der

EOD nahm um 65% ab, die Zahlen der LOD blieben allerdings konstant (Schrag SJ, 2000).

Wenige Jahre später zeigten Phares et al. weiter sinkende EOD-Inzidenzen von 27%. Die

Zahlen nahmen von 0,47 pro 1000 Lebendgeburten in den Jahren 1999-2001 auf 0,34 pro

1000 Lebendgeburten in 2003-2005 ab. Dagegen blieb die LOD mit 0,34 pro 1000

Lebendgeburten weiterhin konstant (Phares CR, 2008). Mit Abnahme der Inzidenzen sank

auch die Mortalitätsrate der GBS-Erkrankungen kontinuierlich. In den USA starb in den

1970er Jahren noch jedes zweite Kind mit einer EOD, zehn Jahre später lag die

Mortalitätsrate bei 15%. Durch weitere Verbesserungen in den Bereichen mütterliches

Screening, intrapartale Antibiotika-Prophylaxe, schnelleres Erkennen der Symptome einer

EOD und verbesserte intensivmedizinische Therapiemöglichkeiten gelang es den USA bis

zum Jahr 1999 die Mortalitätsrate auf 5-7% zu senken (Schuchat A, 2001, Phares CR, 2008).

Allerdings kam es - möglicherweise als Folge der GBS-Prophylaxe - insbesondere bei

Frühgeborenen zu einer Zunahme der E. coli-Septikämien (Stoll BJ, 2002, Schrag SJ, 2000,

Alarcon A, 2004).

1.4 Antibiotikaresistenzen

1.4.1 Betalaktam-Antibiotikaresistenz

Betalaktam-Antibiotika gehören zu einer Gruppe von Antibiotika, die in ihrer Strukturformel

einen viergliedrigen Laktam-Ring aufweisen. Sie wirken bakterizid, indem sie die

Mureinbiosynthese der Zellwand stören und damit die bakterielle Zellwandsynthese hemmen

(Hof H, 2005). Während der Anwendung von Betalaktam-Antibiotika entwickeln sich in der

Regel nur selten und sehr langsam Resistenzen. Diese lassen sich durch drei Mechanismen

erklären (Hof H, 2005):

Einleitung 11

1.) Enzymatische Hydrolyse des Laktam-Rings durch eine Betalaktamase

2.) Unempfindliche Penicillin-bindende-Proteine (PBP)

3.) Membranveränderungen

Betalaktam-Antibiotikaresistenzen bei GBS-Isolaten traten bisher nur in sehr seltenen Fällen

auf. Eine Studie aus Japan berichtete von Stämmen mit verminderter Penicillin-

Empfindlichkeit, die durch Veränderungen der Aminosäuren in Penicillin-bindenden-

Proteinen (u.a. pbp2X) verursacht wurde (Kimura K, 2008). In weiteren Studien aus den USA,

Japan und Spanien traten Penicillin-intermediäre beziehungsweise resistente Keime auf

(Dahesh S, 2008, Morikawa Y, 2003, Betriu C, 1994). Da dies bis heute allerdings die

einzigen bekannten Resistenzfälle sind (Resistenzraten somit unter 0,1%) und die klinische

Relevanz der nachgewiesenen Penicillin-MHK-Werte, die nur knapp oberhalb der Grenzwert-

MHKs lagen, nicht bekannt ist, bleiben Betalaktam-Antibiotika weiterhin Mittel der Wahl bei

Therapie und Prophylaxe von GBS-Transmission und -Infektion.

1.4.2 Makrolid-Resistenzen

Für viele Patienten sind bei Betalaktam-Antibiotika-Unverträglichkeit Makrolid-Antibiotika

eine wichtige therapeutische Alternative. In den letzten Jahren ist allerdings ein deutlicher

Anstieg der Makrolid-Resistenzen zu beobachten (Morales WJ, 1999, Betriu C, 2003).

Die Gruppe der Makrolide wird unterteilt in Substanzen mit 14- (Erythromycin,

Clarithromycin und Roxithromycin), 15- (Azithromycin) und 16- (Josamycin und

Spiramycin) gliedrigen Laktonringen. Die bakteriostatische Wirkung der Makrolide beruht

auf der Behinderung der Proteinsynthese an den 50 S-Untereinheiten der bakteriellen 70 S-

Ribosomen. Die Makrolidresistenz bei Streptokokken begründet sich auf zwei Mechanismen

(Jebelean C, 2000):

1.) Eine ribosomale Änderung durch eine Methylase, kodiert durch das erm-Gen, führt zur

MLSB-Resistenz (Makrolid-, Lincosamid- und Streptogramin B-Resistenz).

2.) Über ein Effluxsystem, kodiert durch das mef-Gen, werden die Wirkstoffe aus der

Bakterienzelle ausgeschleust und es entsteht die M-Resistenz (Makrolidresistenz).

Dies betrifft nur die 14- und 15-gliedrigen Makrolide, nicht aber die 16-gliedrigen

Makrolide wie Josamycin.

Einleitung 12

MLSB-Resistenz

Durch Methylierung der Bindungsstellen an den Ribosomen vermindern die RNA-Methylasen

die Bindungsaffinität der Makrolide, Lincosamide und B-Streptogramine. Diese Methylasen

werden durch das erm- (erythromycin ribosome methylation) Gen kodiert. Das erm-Gen

kodiert die Erythromycinresistenz und eine konstitutive oder induzierbare Resistenz gegen

Lincosamide und Streptogramin B. Diese Stämme zeigen sich also entweder immer

(konstitutiv) oder nur unter Einfluss von Erythromycin und anderen 14- und 15-gliedrigen

Makroliden (induzierbar) resistent gegenüber Clindamycin und Streptogramin B (Leclercq R,

1993, Weisblum B, 1995). Im D-Test kann die induzierbare Resistenz von Erythromycin und

Clindamycin nachgewiesen werden (siehe auch Kapitel 3.3.2.2).

M-Resistenz

Zur Resistenz gegen 14- und 15-gliedrige Makrolide (nicht gegen die 16-gliedrigen

Makrolide, Lincosamide und B-Streptogramine) führen Membranproteine, die verantwortlich

sind für einen Makrolidtransport aus der Zelle. Diese Membranproteine werden von den mef-

(macrolide-efflux) Genen kodiert. Für GBS wurde das mefA-Gen, das mefE-Gen und ein

mreA-Gen, das für ein von mef unterschiedliches Efflux-System kodiert, nachgewiesen (Arpin

C, 1999, Clancy J, 1997).

In den letzten Jahren kam es zu einem deutlichen Anstieg der Erythromycin- und

Clindamycin-Resistenzen. In den Vereinigten Staaten stiegen laut Morales et al. die

Erythromycin-Resistenzen in einem Zeitraum von 18 Jahren von 1,2% (1980-1993) auf Werte

von 18% (1997-1998) (Morales WJ, 1999). Gleiches berichtet eine Studie aus Taiwan, wo im

Jahre 1994 eine Rate von 18% zu verzeichnen war, die innerhalb von drei Jahren bis auf 37%

anstieg (Hsueh PR, 2001). In vielen anderen Studien liegen die Resistenzen für Erythromycin

zwischen 16,3% und 20% beziehungsweise für Clindamycin zwischen 8% und 22,2% (Aracil

B, 2002, Betriu C, 2003, De Azavedo JC, 2001, Uh Y, 2001). Es wird deutlich, dass bei

Betalaktam-Antibiotika-Unverträglichkeit die Gabe von Makroliden oder Lincosamiden keine

befriedigende Lösung darstellt.

Einleitung 13

1.5 GBS-Impfstoffentwicklung

Die einzige bisher etablierte präventive Maßnahme bei Risikofaktoren für eine GBS-Infektion

des Neugeborenen ist die Antibiotikaprophylaxe. Mit ihr lassen sich allerdings nur die Rate

von EOD-, nicht jedoch die LOD-Rate senken. Für LOD-Fälle werden andere

Präventivmaßnahmen benötigt.

Schon vor über 30 Jahren wurde das erste Mal ein Zusammenhang zwischen invasiven GBS-

Erkrankungen bei Neugeborenen und einem mütterlichen Antikörpermangel gegen den

auslösenden GBS-Serotyp festgestellt (Baker CJ, 1976). Weitere Studien bestätigten diesen

Zusammenhang (Lin FY, 2001, Davies HD, 2001). Daraus leitete sich die Hypothese ab, dass

ausreichend hohe mütterliche Serotyp-spezifische Antikörper gegen Kapselpolysaccharide

von GBS einen protektiven Effekt gegen invasive Erkrankungen des Neugeborenen haben.

Ziel ist es seitdem, einen geeigneten Impfstoff zu entwickeln, der eine Erkrankung beim Kind

mit GBS schon vor der Geburt verhindern und die Antibiotika-Prophylaxe der Schwangeren

bei GBS-Positivität ersetzen würde. Impfstoffe gegen Kapselpolysaccharide haben den

Nachteil einer verkürzten und schlecht boosterbaren Immunantwort (Stein KE, 1992). Daher

wird seit Beginn der Impfstoffentwicklung an einem Konjugatimpfstoff gegen GBS

gearbeitet. Baker et al. entwickelten einen Impfstoff, der aus dem Kapselpolysaccharid Ia oder

Ib bestand und an Tetanus-Toxoid konjugiert war. Hierdurch konnte ein ausreichendes Maß

an Immunogenität gegen beide GBS Serotypen erzielt werden (Baker CJ, 1999). Gleiches

zeigte auch ein bivalenter Impfstoff für die Serotypen II und III, gekoppelt an Tetanus-Toxoid

(Baker CJ, 2003). Diese Untersuchungen machten Hoffnung auf einen entwickelbaren

multivalenten Impfstoff, der gegen die häufigsten Kapselpolysaccharide Schutz bieten könnte.

Mit den bisher in Entwicklung befindlichen Impfstoffen sind nicht notwendigerweise die

Serotypen berücksichtigt, die in anderen Regionen der Welt dominieren und für dortige

invasive GBS-Infektionen verantwortlich sind. So entwickelte sich das Konzept einer

protektiven Immunantwort unabhängig vom Kapsel-Serotyp.

Der wohl vielversprechendste Ansatz beruht auf Pilus-Antigenen von GBS. Pili spielen eine

wichtige Rolle bei der Adhäsion von GBS an die Epithelzelle (Dramsi S, 2006, Telford JL,

2006). Inzwischen sind drei Pili-Gene bekannt (PI-1, PI-2 und PI-2b), von denen jeweils zwei

Einleitung 14

pro GBS-Stamm zu finden sind (Lauer P, 2005, Dramsi S, 2006, Margarit I, 2009). Pili sind

hochkonservierte Proteine, die bei fast allen untersuchten GBS-Isolaten gefunden wurden

(Lauer P, 2005). Margarit et al. zeigten im Tierversuch, dass Pilus-Impfstoffe in bis zu 96%

gegenüber den untersuchten GBS-Stämmen Protektivität verliehen (Margarit I, 2009). Ein

potentieller Impfstoff müsste also jeweils nur eine Komponente von jedem der 2 bekannten

Pili beinhalten und könnte damit möglicherweise einen Infektionsschutz gegen alle GBS-

Stämme vermitteln.

Auf diesen tierexperimentellen Daten aufbauend setzt das im 7. Rahmenprogramm der EU

geförderte DEVANI-Projekt (Design of a Vaccine Against Neonatal GBS Infections) eines

europäischen Konsortiums große Hoffnungen in die Immunogenität der Pilus-Antigene. Sie

könnten als möglicher Konjugatpartner für Kapselpolysaccharide die Grundlage für einen

neuen Impfstoff gegen GBS darstellen. Parallel zu der hier vorgelegten Studie aus Freiburg

wurden noch in neun weiteren Ländern Europas GBS-Stämme und mütterliche Seren

gesammelt. Diese Daten werden möglicherweise einen genauen Aufschluss über die

Epidemiologie und Serotypenverteilung von GBS in Europa liefern, sodass die Hoffnung

besteht, aufbauend auf diesen Untersuchungen einen Europa- bzw. sogar weltweit

einsetzbaren Impfstoff herstellen zu können.

Fragestellung und Ziele der Studie 15

2 Fragestellung und Ziele der Studie

Die Besiedelung von Schwangeren mit GBS liegt in Deutschland bei rund 20-25%

(Bürckstümmer AK, 2006). In etwa der Hälfte der Fälle werden die Erreger auf das

Neugeborene übertragen; in 0,2% der Fälle kommt es zur Entstehung einer invasiven

Infektion bei den Neugeborenen (Fluegge K, 2006). Zwischen 2001 und 2002 wurde in

Deutschland eine erste Studie zur Inzidenz neonataler GBS-Infektionen über das ESPED-

Erfassungssystem durchgeführt (Fluegge K, 2004, Fluegge K, 2005, Fluegge K, 2006). Die

Ergebnisse zeigten, dass die Inzidenz (0,47/1000 Lebendgeborene) deutlich niedriger lag als

in den USA vor Einführung der intrapartalen Antibiotika-Prophylaxe. In den USA hat die

Implementierung der Screening-basierten IAP zu einer signifikanten Reduktion der Inzidenz

der Early-onset Sepsis durch GBS geführt. Diese Strategie beinhaltet allerdings, dass etwa

25% aller Mütter unter der Geburt mit Antibiotika behandelt werden. Dies übt einen hohen

Selektionsdruck auf die mikrobielle Flora der Mutter und damit des Neugeborenen aus.

Aufgrund des hohen Selektionsdrucks ist es in den USA nach Einführung der IAP zu einem

Anstieg Antibiotika-resistenter E. coli-Septikämien insbesondere bei Frühgeborenen

gekommen (Stoll BJ, 2002, Schrag SJ, 2000, Alarcon A, 2004). Für Deutschland liegen hierzu

keine Daten vor. Entsprechende Daten sind jedoch wichtig, um die initiale Antibiotikatherapie

des Neugeborenen kalkuliert zu gestalten, aber auch um eine Bewertung innovativer

Strategien zur Prävention der neonatalen Sepsis vornehmen zu können. Die IAP wird

international nur als vorübergehende Maßnahme angesehen. Andere Präventionsstrategien,

z.B. Vakzinierungen müssen entwickelt werden (Margarit I, 2009, Moriel DG, 2008, Baker

CJ, 2003).

Da die Immunität gegenüber GBS Serotypen-spezifisch ist, spielt die molekulare

Epidemiologie und deren mögliche Veränderung eine entscheidende Rolle in Vorbereitung

auf in Entwicklung befindliche Immunisierungsstrategien.

Neben der ESPED-Studie aus den Jahren 2001-2002, ist an der Universitätsfrauenklinik

Freiburg im Jahr 2002/2003 eine epidemiologische Studie zur Kolonisierung,

Serotypenverteilung und Antibiotika-Resistenzlage bei schwangeren Frauen durchgeführt


worden (Bürckstümmer AK, 2006, Kunze M, 2011). Es handelte sich hierbei um eine

prospektive Einjahresstudie zur Untersuchung der Häufigkeit der Besiedelung von

Schwangeren und Neugeborenen mit GBS, sowie zur Ermittlung der GBS-Transmissionsrate

von GBS positiv getesteten Schwangeren aufs Kind.

Die vorliegende Arbeit ist Teil einer erneuten deutschlandweiten ESPED-Erfassung von

invasiven GBS- und E. coli-Infektionen bei Neugeborenen (Berner R, 2008), als auch des EU-

Projektes DEVANI zur Erhebung von epidemiologischen Grundlagen für die Entwicklung

eines Impfstoffes gegen neonatale GBS-Infektionen (www.devaniproject.org). Ziel des

DEVANI-Projekts ist die klinisch-epidemiologische und molekulare Charakterisierung von

invasiven neonatalen GBS-Isolaten im Vergleich zu mütterlichen Kolonisationskeimen.

Kliniken und Labore aus 8 verschiedenen europäischen Ländern nehmen an dem Projekt teil.

Koordinierungszentrum für Deutschland ist das Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin

Freiburg (ZKJ).

Hauptziel der vorliegenden Studie war die Erfassung der aktuellen Kolonisationsraten

schwangerer Frauen in Deutschland und die mikrobiologische und molekulare Untersuchung

der GBS-Isolate. Dazu wurde in den Jahren 2009/2010 eine prospektive Surveillance-Kohorte

schwangerer Frauen in Freiburg, die sich einem GBS-Screening unterzogen hatten, untersucht

und dieses Kollektiv mit einem Kollektiv aus den Jahren 2002/2003 (Bürckstümmer AK,

2006, Kunze M, 2011) verglichen. Im Kollektiv aus den Jahren 2002/2003 war mit der

Umsetzung einer IAP an der Universitäts-Frauenklinik Freiburg begonnen worden. Die an der

vorliegenden Studie teilnehmenden Frauen wurden mittels eines standardisierten Fragebogens

klinisch, inkl. Dokumentation einer IAP erfasst und das Outcome von Mutter und

neugeborenem Kind bis zur Entlassung nach der Geburt prospektiv dokumentiert. GBS-

Isolate von allen Müttern und eventuelle invasive Isolate von den Kindern wurden gesammelt

und auf ihren Serotyp und ihre Antibiotikaresistenz hin untersucht.


Gezielt sollten folgende Fragestellungen beantwortet werden:

1. Wie viele Schwangere erhielten an der Universitäts-Frauenklinik ein GBS-Screening und

wie hoch war die Kolonisationsrate im Studienkollektiv?

2. Haben sich die Risikofaktoren für die Entwicklung einer invasiven neonatalen GBS-

Infektion wie Frühgeburtlichkeit, mütterliches Fieber, vorzeitiger Blasensprung, sowie

Bakteriurie seit 2002/2003 verändert?

3. Wie viele Schwangere erhielten unter der Geburt eine leitliniengerechte intrapartale

Antibiotikaprophylaxe?

4. Ist die EOD-Rate durch die Anwendung der IAP gesunken?

5. Hat sich die Serotypenverteilung bei den GBS-Isolaten verändert? Ist insbesondere eine

weitere Zunahme von Serotyp V oder neuen Serotypen (z.B. Typ IX) zu beobachten?

6. Hat sich die Antibiotikaresistenz, insbesondere die Rate der Makrolid- und Lincosamid-

Resistenzen geändert? Falls ja, sind die Resistenzen bestimmten Serotypen zuzuordnen?

Material und Methoden 18

3 Material und Methoden

3.1 Studiendesign

Die vorliegende Studie war als prospektive Surveillancestudie konzipiert. Allen schwangeren

Frauen, die im Rahmen der Schwangerenvorsorge in der Universitäts-Frauenklinik Freiburg

(UFK) vorstellig wurden, wurde die Teilnahme an der Studie angeboten. Die Teilnahme an

der Studie erfolgte freiwillig, ohne finanzielle Kompensation der Probandinnen, nach

Aufklärung durch die ärztlichen Kolleginnen/Kollegen der Universitäts-Frauenklinik und der

Einholung einer schriftlichen Einverständniserklärung. Die Studie war durch die

Ethikkommission des Universitätsklinikums Freiburg positiv beschieden worden. Die

Erfassung von klinisch-epidemiologischen und experimentellen Daten erstreckte sich über

einen Zeitraum von 18 Monaten, vom 01. Januar 2009 bis zum 30. Juni 2010. Die Studie

wurde am Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin (ZKJ) der Universität Freiburg in

Zusammenarbeit mit der Universitäts-Frauenklinik (UFK) Freiburg durchgeführt. Die

klinisch-epidemiologischen Daten wurden anhand eines strukturierten Fragebogens an der

UFK erhoben. Die experimentellen Arbeiten zur Isolierung von GBS aus RVA (der

Schwangeren), Blut- oder Liquorkulturen (von erkrankten Neugeborenen), sowie die

Serotypisierung und die Antibiotikaresistenztestungen wurden im Bakteriologischen Labor

des ZKJ durchgeführt.

3.2 Material

3.2.1 Klinisch-epidemiologische Datenerfassung

Im Rahmen des DEVANI-Projekts wurden mit Hilfe eines standardisierten Fragebogens

(siehe Anhang 8.1) für Schwangere klinische Daten zur Schwangerschaft und Geburt

dokumentiert. Im Rahmen des GBS-Screenings wurde ein Rektovaginalabstrich (RVA),

sowie mütterliches Serum zum Zeitpunkt der Geburt im Rahmen einer Routine-Blutentnahme

entnommen. Alle schwangeren Frauen, die sich in der 35.-37. Schwangerschaftswoche in der

Schwangerenambulanz der UFK vorstellten, wurden in die Studie eingeschlossen, ebenso

Frauen, die im Kreißsaal mit Geburtsbestrebungen erstmalig vorstellig wurden.


Auch bei Schwangeren, die schon einen Abstrich beim niedergelassenen Frauenarzt/ärztin

erhalten hatten, wurde nochmals ein Abstrich entnommen, um ggfs. die Isolate

charakterisieren zu können. Bei drohender Frühgeburtlichkeit wurde der Zeitpunkt der

Abnahme eines RVA auch in Einzelfällen auf einen Zeitpunkt vor der 35. SSW vorgezogen.

Bei positivem GBS-Befund der Mutter erhielt die Patientin eine intrapartale Antibiotika-

Prophylaxe. Diese bestand bei Schwangeren am Endtermin aus Ampicillin intravenös, initial

2 g, ab Geburtsbeginn dann alle 4 Stunden 1 g bis zur Geburt. Bei Schwangeren mit bekannter

Penicillinallergie wurde zunächst das Risiko einer Anaphylaxie abgewogen und bei niedrig

eingestuftem Anaphylaxierisiko (keine Anaphylaxie, keine respiratorischen Symptome)

erhielt die Patientin Cefuroxim 1,5 g alle 8 Stunden bis zur Geburt. Cefuroxim wurde

außerdem als prophylaktisches Antibiotikum der Wahl bei allen Schwangeren mit einem

vorzeitigen Blasensprung (> 12 h) gegeben. Bei hohem Risiko für eine Betalaktam-

Antibiotika-Unverträglichkeit wurde Clindamycin, 900 mg i.v. alle 8 Stunden bis zur Geburt

eingesetzt.

Während des Aufenthaltes von Mutter und Kind in der Universitäts-Frauenklinik wurden mit

Hilfe des Kreißsaaljournals klinische Daten zu Schwangerschaft und Geburt in einem

standardisierten Fragebogen (siehe Anlage 8.1) ermittelt. Neben dem Alter der Mutter und der

Anzahl der Schwangerschaften bzw. Geburten wurden Schwangerschaftsdauer und

Risikofaktoren für eine neonatale GBS-Infektion oder Geburtskomplikationen erfasst.

Folgende infektiologische Risikofaktoren wurden abgefragt: (1) Art der Entbindung, (2)

Zeitpunkt des Blasensprungs vor der Geburt, (3) Fieber unter der Geburt (Temperatur ≥

38,0°C), (4) GBS-Bakteriurie während der Schwangerschaft und (5) vorheriges Kind mit

invasiver GBS-Infektion. Eine etwaige intrapartale Antibiotika-Prophylaxe wurde

dokumentiert (Art, Applikationsweise des Antibiotikums und Anzahl der Dosen präpartal).

Ebenfalls dokumentiert wurde, ob das Neugeborene zum Zeitpunkt der Entlassung Zeichen

einer invasiven GBS-Infektion aufwies.

Die zwei EOD Fälle (siehe Kapitel 4.4.2) wurden aufgrund positiver Blut- oder

Liquorkulturen, bzw. Oberflächenabstriche (bei eindeutigen klinischen Zeichen der


Neugeborenen-Infektion), die im bakteriologischen Labor des Zentrums für Kinder- und

Jugendmedizin (ZKJ) untersucht wurden, in die DEVANI-Studie eingeschlossen, nachdem

die Eltern einer Teilnahme der Neugeborenen an der Studie zugestimmt hatten. Über einen

Neugeborenen-Fragebogen des DEVANI-Projekts (siehe Anhang 8.2) wurden Angaben zu

den klinischen Daten des Kindes, Diagnose, Behandlung und Outcome ermittelt.

3.2.2 Verbrauchsmaterialien

▪ Antibiotikaplättchen (1) BD Sensi-Disc™ für Vancomycin, Erythromycin, Ampicillin,

Clindamycin, Cefotaxim (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland)

▪ Antibiotikaplättchen (2) BD BBL™ Sensi-Disc für Linezolid (BENEX Limited, Shannon

County, Ireland)

▪ Blutagarplatte Columbia Agar (Spezialpepton 23 g, Stärke 1,0 g, NaCl 5,0 g, Agar 14 g

ad 1 l dH2O + 5% Hammelblut) (Biomérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich)

▪ Culture Media Supplements Staph./Strep. Selective Supplement (enthält Colistin 10

µg/ml + Nalidixinsäure 15 µg/ml) (Oxoid Ltd. Basingstoke, Hampshire, England)

▪ E-Test: Etest® für Clindamycin, Benzylpenicillin, Cephalotin, Erythromycin (Biomérieux,

Solna, Schweden)

▪ Glycerin: Glycerin 86%, Ph. Eur., reinst (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland)

▪ Glycerin-Bouillon: 0,5 ml Glycerin + 0,5 ml mit GBS-Kolonie beimpfte Müller-Hinton-

Bouillon (zum Einfrieren der GBS-Stämme)

▪ Katalase: 4,5 ml Aqua bid. ad 0,5 ml Perhydrol H2O2

▪ Kryo-Röhrchen Cryogenic Vials Nalgene® Cryoware™ (Nalgene Nunc International,

Rochester, NY, USA)

▪ Müller-Hinton-Bouillon (Rindfleischinfusion 6 g, Caseinhydrolysat 17,5 g, Stärke 1,5 g,

Agar 11 g auf 1 l Aqua dest.) (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA)


▪ Perhydrol® 30% H2O2 (MERCK, Darmstadt, Deutschland)

▪ Selektive GBS-Bouillon: Selektivmedium Bacto™ Todd Hewitt Bouillon 15 g + 500 ml

Aqua dest. (Sterile Aqua Flasche von Fa. Braun autoklaviert bei 50° C, 1-2 Std. abgekühlt.

1 Fläschchen à 5 ml Culture Media Supplement bei ca. 50° C zur THB-Lösung dazugeben

und gut schütteln).

▪ Selektivmedium Bacto™ Todd Hewitt Broth = THB (Becton, Dickinson and Company,

Sparks, USA)

▪ Streptex: Streptex® für B-Streptokokken und D-Streptokokken (Remel Europe Ltd., Kent,

UK)

▪ Strep-B-Latex 10 × 1, 5 ml type serum on latex + 25 disposable reaction cards (Statens

Serum Institut, Kopenhagen, Dänemark)

▪ STR Agar Strep-Agar (Institut für Mikrobiologie und Hygiene, Freiburg im Breisgau,

Deutschland)

▪ Venturi Transystem®, Port-A-Cul Culture Swab Transport System (COPAN

Innovation®, Brescia, Italien)

3.2.3 Geräte

▪ Autoklav: Tecnomara (Fernwald, Deutschland)

▪ CO2 Brutschrank: Kendro Laboratory Products (Hanau, Deutschland)

▪ Kühlschrank: Liebherr Premium (Liebherr, Deutschland)

▪ Tischzentrifuge: Biofuge primo (Heraeus, Osterode, Deutschland)


3.3 Methoden

3.3.1 Nachweismethoden von GBS

In der Frauenklinik wurde bei allen Schwangeren, die in die Studie einwilligten, ein

Rektovaginalabstrich vom unteren Drittel der Vagina sowie vom Anorektalbereich (gleicher

Abstrichtupfer) entnommen. Es wurden Abstrichtupfer verwendet, die ohne Zusatz von

Nährstoffen in feuchtem Medium transportiert werden konnten (Culture Swab Transport

System bzw. PAC = Port-a-Cul). Täglich wurde das gesamte Untersuchungsmaterial der

Studie aus Schwangerenambulanz und Kreißsaal in das Bakteriologische Labor des ZKJ

transportiert und dort registriert, nummeriert und bearbeitet. Die Abstrichtupfer, die aus der

Schwangerenambulanz der UFK kamen, wurden direkt in einem Röhrchen mit 4 ml GBS-

Selektivmedium geschwenkt und für 18-24 h bei 35-37° C im Brutschrank (ohne CO2)

bebrütet und am nächsten Tag auf einer Selektivmedium-Agarplatte für Streptokokken (STR-

Agar) ausgestrichen. Die Abstriche aus dem Kreißsaal wurden in einem zusätzlichen Schritt,

bevor sie in das Selektivmedium überführt wurden, direkt auf einer ersten Selektivagarplatte

(STR-Agar) ausgestrichen und für 18-24 h bei 35-37° C mit 5% CO2 bebrütet. Dies hatte den

Vorteil, dass das Ergebnis der Abstriche aus dem Kreissaal bereits am nächsten Tag von der

Selektivplatte abgelesen werden konnte und dadurch gewährleistet war, dass das Ergebnis

nach 24 Stunden vorlag.

Am nächsten Tag wurde die bebrütete Bouillon - sowohl aus dem Material aus der

Schwangerenambulanz als auch aus dem Kreissaal - mit einer Öse (10 µl) auf einer ersten

beziehungsweise einer zweiten Selektivagarplatte ausfraktioniert. Die Inkubation der Platten

im Brutschrank erfolgte bei 37° C mit 5% CO2 für 18-24 h. Am darauf folgenden Tag wurden

die Platten auf Wachstum von feinen Kolonien mit (evtl. auch ohne) beta-Hämolyse

kontrolliert und im Grampräparat auf gram-positive Kokken überprüft. Fanden sich auf dem

Selektivmedium auffällige, das heißt kleine, grau-weiße Kolonien mit oder ohne beta-

Hämolyse, so erfolgte zunächst die Überprüfung mittels Katalase-Reaktion (siehe Kapitel

3.3.1.1).


Zum Nachweis von GBS wurden zwei weitere Verfahren, der CAMP-Test beziehungsweise

der Latex-Agglutinationstest mit GBS-spezifischem Antiserum (siehe Kapitel 3.3.1.2 bzw.

3.3.1.3) verwendet. Falls nach 24 h kein Wachstum auf dem Selektivmedium erfolgt war,

wurden nochmals 10 µl des Inokulates im Drei-Ösen-Ausstrich auf Selektivagar aufgetragen.

Wieder erfolgte die Bebrütung bei 35-37° C und 5% CO2 für 24 h. Im Einzelfall war eine

Kontrolle nach 48 h angezeigt.

Zur Konservierung der Bakterien wurde eine einzelne Kolonie vom Selektivagar abgetragen,

in 1-2 ml Müller-Hinton-Bouillon gegeben und für 4-6 h bebrütet. Zum Einfrieren wurden

dann 0,5 ml bebrütete Bouillon + 0,5 ml Glycerin-Bouillon in ein steriles Kryo-Röhrchen

gefüllt und bei - 20° C (als sogenannter „Working Stock“) bzw. - 80° C (als sogenannter

„Back-up Stock“) eingefroren.

Bei positivem GBS-Befund der Mutter wurde umgehend der Kreißsaal beziehungsweise die

Schwangerenambulanz per Fax informiert.

3.3.1.1 Katalase-Test

Der Katalase-Test wird in der mikrobiologischen Diagnostik zur Differenzierung

insbesondere von grampositiven Bakterien eingesetzt. Das eisenporphyrinhaltige Enzym

Katalase versetzt bestimmte Bakterien in die Lage, das beim Stoffwechsel anfallende,

zytotoxische Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff zu spalten. Die Katalase-Reaktion

eignet sich unter anderem dazu, grampositive Kokken zu differenzieren. Staphylokokken sind

Katalase-positiv, wohingegen Streptokokken und Enterokokken eine negative Katalase-

Reaktion aufweisen (www.laborwissen.de).

a) Durchführung:

Es wird ein Tropfen Katalase-Reagenz auf einen Objektträger gegeben und mit einer sterilen

Impföse eine Bakterienkolonie von der Agarplatte abgenommen und im Katalase-Reagenz

verrieben.


b) Auswertung:

Positiv: direktes Sprudeln, Blasenbildung

Negativ: kein, bzw. verzögertes Sprudeln

3.3.1.2 CAMP-Test

Der CAMP-Test wurde nach seinen Erfindern Christie, Atkins und Munch-Petersen benannt

und dient dem Nachweis von GBS und zum Ausschluss anderer Streptokokken bzw.

Enterokokken. Sie sind von der Morphologie her auf Blutagarplatten nicht immer sicher von

GBS zu differenzieren. Das sogenannte CAMP-Phänomen ist eine pfeilförmige Hämolyse-

Verstärkung.

Material: 1 Columbia Blutagar-Platte

1 Staphylococcus aureus-Stamm ATCC 29213

1 B-Streptokokken-Stamm als Positivkontrolle

1 Enterokokken-Stamm als Negativkontrolle

a) Durchführung (Abb. 3.1):

Mit einem Ösenstrich wird eine Blutagarplatte in der Mittellinie mit Staphylococcus aureus-

Stamm ATCC 29213 beimpft (C). An diesen Strich werden im rechten Winkel so nah wie

möglich die Kontrollstämme und die zu testenden Stämme mit einem dünnen Ösenstrich

ausgezogen, ausgehend von Staphylococcus aureus, ohne diesen jedoch zu berühren. Bei 37°

C und 5% CO2 wird die Platte für 18-24 h bebrütet.

b) Auswertung:

Positiv: GBS-Stamm bildet einen pfeilförmigen Hämolysehof zu Staphylococcus aureus hin

(schüsselförmige Hämolyse-Verstärkung) (A)

Negativ: Andere Streptokokken bilden keinen Hämolysehof (B)


Abb. 3.1: CAMP-Test zur Identifikation von Streptococcus agalactiae (Gruppe B). (A) Streptococcus

agalactiae (Gruppe B) zeigt eine positive Reaktion, (B) Streptococcus pyogenes (Gruppe A) zeigt eine

negative Reaktion nach Inokulation auf der Platte, (C) Staphylococcus aureus (Hanson A, 2006)

3.3.1.3 Latex-Agglutinationstest

Der Latex-Agglutinationstest ist ein Verfahren zum Nachweis und Sichtbarmachen von

positiven Antigen-Antikörper-Reaktionen in Form einer Agglutination. Dazu wurde ein Kit

der Firma Remel (Streptex®) verwendet.

a) Durchführung:

Eine einzelne Kolonie wird von der Blutagarplatte abgehoben und in eine Extraktionslösung

eingebracht, in der die Bakterienzellwand ca. 20 min enzymatisch gespalten wird, sodass die

Lancefield-Oberflächenantigene freigesetzt werden. Spezifische Antikörper (vom

Kaninchen), z.B. gegen das Gruppenantigen B und D gerichtet, werden mit der

Extraktionslösung vermischt (Bildung einer milchig-trüben Lösung) und auf eine

Agglutinations- und Farbreaktion hin untersucht.

b) Auswertung:

Positiv: Agglutination/Ausflockung


Negativ: keine Agglutination

3.3.2 Antibiotikaresistenz-Testungen

Die im Rahmen der Studie gesammelten Isolate wurden auf ihre Antibiotika- Empfindlichkeit

getestet. Die Resistenztestung erfolgte sowohl mittels Agardiffusionstest inklusive D-Test als

auch mittels E-Test.

3.3.2.1 Agardiffusionstest (Disc-Test)

a) Prinzip:

Beim Agardiffusionstest wird der zu testende Stamm auf eine Agarplatte aufgetragen und

zusammen mit einem aufgelegten Antibiotika-getränkten Plättchen inkubiert. Nach der

Bebrütung zeigt sich ein kreisförmiger Hemmhof bei trübem Bewuchs der restlichen

Agarplatte. Anhand der vom National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)

festgelegten Hemmhofdurchmesser teilt man die Bakterienstämme in resistente, intermediäre

und sensible Keime (NCCLS, 2006) ein. Folgende Antibiotika wurden getestet (s. Tab. 3.1):

Antibiotika-

klasse

Wirkstoff

(Konz. in µg)

Resistent

[mm]

Intermediär

[mm]

Sensibel

[mm]

Aminopenicillin Ampicillin (10) ≤ 16 ≥ 17

Cephalosporine Cefotaxim (30) ≤ 14 15-22 ≥ 23

Makrolide Erythromycin (15) ≤ 18 19-20 ≥ 21

Lincosamide Clindamycin (2) ≤ 16 ≥ 17

Glycopeptide Vancomycin (30) ≤ 9 10-11 ≥ 12

Oxazolidinone Linezolid (30) ≤ 16 17-18 ≥ 19

Tab. 3.1: Cut-off-Werte der Hemmhofdurchmesser verschiedener Antibiotika für GBS im

Agardiffusionstest laut NCCLS


b) Durchführung:

Der zu testende Stamm wird auf einer Blutagarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37° C

und 5% CO2 bebrütet. Am darauffolgenden Tag wird eine einzelne GBS-Kolonie per Öse von

der Platte abgenommen und in ca. 1-2 ml Müller-Hinton-Bouillon inokuliert. Die Bouillon

wurde 2 h bei 37° C inkubiert, bis die gewünschte Trübung (McFarland: 0,5) erreicht war.

Anschließend wird die Bouillon mit Hilfe eines sterilen Wattetupfers auf eine frische

Blutagarplatte aufgetragen und gleichmäßig dicht ausgestrichen. Die Antibiotikaplättchen

werden mit Hilfe eines Dispensers auf die Platte aufgebracht. Nach einer erneuten 18-24-

stündigen Bebrütung bei 37° C und 5% CO2 wird der Hemmhofdurchmesser ausgemessen

und das Resistenzergebnis als sensibel vs. intermediär vs. resistent ermittelt (Abb. 3.2).

Abb. 3.2: Agardiffusionstest (Foto: L. Karstens)

3.3.2.2 D-Test

Um eine mögliche Induktion einer Clindamycin-(CC)-Resistenz durch Erythromycin (E)

nachzuweisen, werden im Agardiffusionstest die beiden entsprechenden Antibiotikaplättchen

in einem Abstand von 15-20 mm zueinander angeordnet. Nach der Bebrütung über 18-24 h


entstehen je nach Resistenzeigenschaften des Stammes keine oder verschieden große

wachstumsfreie Hemmzonen um die Plättchen (Abb. 3.3).

Auswertung:

Positiv: Der Hemmhof um Clindamycin ist auf der dem Erythromycin zugewandten Seite

abgeflacht und erscheint D-förmig

Negativ: alle anderen Varianten (zwei sich überschneidende kreisförmige Hemmhöfe oder gar

keine Hemmhöfe)

Abb. 3.3: D-Test zum Nachweis einer Erythromycin-induzierten

Clindamycin-Resistenz (www.microblog.me.uk)

3.3.2.3 E-Test

Eine genauere Methode zur Resistenzbestimmung im Vergleich zum Agardiffusionstest ist

der E-Test. Dieser beruht auf dem Prinzip der minimalen Hemmkonzentration (MHK), was

definitionsgemäß die niedrigste Konzentration einer Substanz ist, bei der die Vermehrung von

Mikroorganismen mit bloßem Auge nicht mehr wahrgenommen werden kann. Es ist die

jeweilige geringste Konzentration eines Antibiotikums, die das Wachstum eines

Bakterienstammes gerade noch hemmt.


Durchführung:

Hierfür wird eine Blutagarplatte mit der bebrüteten Bouillon bestrichen und mit zwei

Antibiotika-haltigen E-Teststreifen (Erythromycin/Clindamycin oder Penicillin/Cephalotin)

beladen (Abb. 3.4).

Abb. 3.4: E-Test mit Erythromycin (EM) und Clindamycin (CM)

(Foto: L. Karstens)

Nach Bebrütung über Nacht wird die MHK abgelesen (s. Tab. 3.2).

Wirkstoff Resistent [µg/ml] Intermediär [µg/ml] Sensibel [µg/ml]

Penicillin G > 0,25 ≤ 0,25

Cephalotin > 0,5 ≤ 0,5

Erythromycin > 0,5 0,25 – 0,5 < 0,25

Clindamycin > 0,5 ≤ 0,5

Tab. 3.2: Minimale Hemmkonzentrationen (MHK) für GBS im E-Test laut NCCLS


3.3.3 Serotypisierung

Die Serotypisierung auf dem Boden eines Latex-Agglutinationstests erfolgt nach der

modifizierten „Micro-scale“ Methode des DEVANI-EU-Projekts (www.devani-project.org)

mittels Strep-B-Latex Kit der Firma Statens Serum Institut. Das entsprechende Kit stellt für

den Test alle 10 Antiseren (vom Kaninchen) gegen die 10 Kapseltypen von GBS (Ia, Ib, II,

III, IV, V, VI, VII, VIII, IX) und jeweils 25 Latex-Karten pro Kit zur Durchführung und

Auswertung zur Verfügung.

a) Durchführung:

Analog zur Antibiotikaresistenztestung wird eine Blutagarplatte mit dem zu testenden GBS-

Stamm beimpft und nach 24 h Bebrütung bei 37° C und 5% CO2 eine einzelne Kolonie in ca.

1-2 ml Müller-Hinton-Bouillon gelöst. Anschließend wird die Müller-Hinton-Bouillon bei 37°

C für 24-36 h inkubiert, um eine gewünschte Trübung (McFarland: 3) zu erzielen. Im darauf

folgenden Schritt werden 10-20 µl der bebrüteten Müller-Hinton-Bouillon auf eine Latex-

Karte pipettiert und mit einer 3 µl-Öse eines der 10 Antiseren des Strep-B-Latex Kits

hinzugegeben und vermischt. Die Latex-Karte wird nach Vermischung für 10-15 Sekunden

rotiert. Ein GBS-Isolat wurde mit allen 10 Antiseren getestet.

b) Auswertung:

positiv: Agglutination

negativ: keine Agglutination nach 10-15 Sekunden

Agglutinationen nach > 30 Sekunden sind verdächtig auf falsch-positive Reaktionen und

werden nicht bewertet.

3.3.4 Statistische Analyse

Sowohl die klinisch-epidemiologischen Daten, als auch die experimentellen Daten zu

Antibiotikaresistenzen und Serotypenverteilung wurden mittels univariater Testung im Chi-

Quadrat-Test untersucht. Zur Auswertung wurde das Programm GraphPad Prism, Version 4

(Graphpad Software Inc, La Jolla, USA) angewandt. Ein P-Wert < 0,05 wurde als signifikant

http://www.devani-project.org/


angesehen. Alle anderen angegebenen Werte sind rein deskriptiver Natur und geben

Absolutzahlen mit Prozentangaben wieder.

Ergebnisse 32

4 Ergebnisse

4.1 Patientenkollektiv: Gesamt

Im Zeitraum vom 01. Januar 2009 bis zum 30. Juni 2010 wurde in der Universitäts-

Frauenklinik Freiburg bei 2144 Frauen eine Lebendgeburt (Einling oder Mehrlinge)

registriert. 1651 schwangere Frauen (77%) nahmen am GBS-Screening dieser Studie teil,

von denen 322 (19,5%) ein positives und 1329 (80,5%) ein negatives GBS-Screening-

Ergebnis aufwiesen; 11 positive GBS-Fälle wurden nicht in die Auswertung aufgenommen,

da die Angaben zu Schwangerschaft und Geburt inkomplett waren. Somit standen 311

vollständige klinisch-epidemiologische Datensätze zusammen mit den entsprechenden

GBS-Isolaten für die Auswertung zur Verfügung.

4.1.1 Abstrichrate des GBS-Screenings

Insgesamt erhielten 1651 Frauen einen Abstrich auf GBS. Die Zahl der Lebendgeburten an

der UFK betrug 2144. Somit wurde eine Gesamt-Abstrichrate von 77,0% erreicht. Zieht man

die 55 Abstriche ab, die vor der 35. SSW abgenommen wurden, so liegt die Abstrichrate bei

76,4% (1596/2089). Da in der Frauenklinik 214 Frauen vor der 35. SSW entbunden haben, zu

einem Zeitpunkt also, an dem kein GBS-Screening gefordert ist, ist eine leitliniengerechte

Abstrichrate von 82,7% (1596/1930) erzielt worden.

4.2 Patientenkollektiv: GBS-Screening

4.2.1 GBS-Kolonisationsrate

322 von 1651 Schwangeren hatten im Rektovaginalabstrich (RVA) einen positiven GBS-

Befund. Das entspricht einer Kolonisationsrate von 19,5% (322/1651).

4.2.2 Zeitpunkt des positiven GBS-Nachweises

Der positive GBS-Nachweis fand in 76,9% (239/311) der Fälle bis zur vollendeten 37.

Schwangerschaftswoche statt, in 23,2% (72/311) wurde erst zur Geburt hin (38.-41. SSW)

ein positiver Abstrich gewonnen (siehe Abb. 4.1). Laut GBS-Screening-Empfehlungen der

Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe e.V. sollte ein Rektovaginalabstrich

Ergebnisse 33

in der 35.-37. SSW erfolgen. Bei 55 Schwangeren wurde ein positiver Abstrich vor der 35.

SSW (17,7%, 55/311) gewonnen. Hauptgrund des frühzeitigen GBS-Screenings war eine

drohende Frühgeburt.

Weitere Gründe für ein Screening vor der empfohlenen Screeningperiode wurden in der

Studie nicht erfasst. Der Großteil der GBS-positiven Abstriche wurde somit

leitlinienentsprechend zwischen der 35. und 37. SSW vorgenommen (71,9%, 184/256).

Abb. 4.1: Zeitpunkt in Schwangerschaftswochen (SSW) des GBS-Screenings mit jeweiliger

Anzahl der Abstriche (n=311) und Prozentangabe

4.2.3 Entnahmeort des Abstrichs bei GBS-Screening

Von der Gesamtanzahl von 311 erhielten 310 einen Rektovaginalabstrich (entsprechend

einer Rate von 99,7%). Bei einer Schwangeren wurde der Ort der Materialabnahme nicht

dokumentiert.

Ergebnisse 34

4.3 Patientenkollektiv: GBS-positive Schwangere

4.3.1 Lebensalter

Zum Zeitpunkt der Entbindung betrug das Durchschnittsalter der GBS-positiven

Schwangeren 28,5 ± 8,1 Jahre, die jüngste Patientin war 15 Jahre, die älteste 43 Jahre alt.

4.3.2 Schwangerschafts-Parität

45,0% (143/311) der Frauen waren Erstgebärende, 26,4% (82/311) Zweitgebärende, 14,5%

(45/311) Drittgebärende, 6,8% (21/311) Viertgebärende und zusammengefasst Fünft-, Sechst-

und Achtgebärende mit 6,4% (20/311).

4.3.3 Einlings- vs. Mehrlingsschwangerschaften

In 302 Fällen handelte es sich um Einlingsschwangerschaften (entspricht 97,1% - 302/311),

in 8 Fällen (2,6% - 8/311) um Zwillings- und in einem Fall um eine Drillingsschwangerschaft

(0,3% - 1/311).

4.3.4 Schwangerschaftsdauer

Die mittlere Dauer der Schwangerschaft betrug 38,9 ± 1,6 Wochen, der Median lag bei 39

vollendeten Schwangerschaftswochen. Die größte Gruppe stellten mit 77,2% (240/311) die

Schwangeren dar, die am Endtermin, also zwischen der 37. und vollendeten 40. SSW

entbunden wurden. In 14,8% (46/311) der Schwangerschaften fand eine Entbindung erst in

oder jenseits der 41. SSW statt (Abb. 4.2).

4.3.5 Frühgeburtlichkeit

Eine Frühgeburt (< 37 vollendete Wochen) trat in 8,0% (25/311) der Fälle auf (Abb. 4.2).

Ergebnisse 35

Abb.4.2: Schwangerschaftsdauer in Wochen im GBS-positiven Kollektiv (n= 311)

4.3.6 Geburtsmodus

In 48,2% (150/311) der Geburten kamen die Kinder spontan (vaginal) zur Welt. In 6,4%

(20/311) erfolgte eine operativ-vaginale Entbindung, in insgesamt 45,3% (141/311) fand eine

Schnittentbindung statt, davon betrug der Anteil der primären Sectiones caesareae 19,9%

(62/311), der Anteil der sekundären Sectiones caesareae 25,4% (79/311).

4.3.7 Risikofaktoren für eine GBS-Infektion beim Neugeborenen

Ein vorzeitiger Blasensprung (> 18h) trat in 5,1% (16/311) der Geburten auf, ein

Blasensprung mit > 12h und < 18h war mit 5,5% (17/311) etwa gleich häufig vertreten. In

63,3% (197/311) der Geburten trat der Blasensprung < 12 h auf, bei 19,9% (62/311) fand der

Blasensprung aufgrund einer primären Sectio nicht statt und in 6,1% (19/311) ist der

Zeitpunkt des Blasensprungs unbekannt.

Nur in einem Falle trat Fieber (≥ 38,0° C) unter der Geburt auf.

Ergebnisse 36

Eine Bakteriurie während der Schwangerschaft oder eine Schwangere mit vorherigem Kind

mit invasiver GBS-Infektion kamen im untersuchten Kollektiv nicht vor. Einer der Gründe

dafür war, dass Patientinnen, die stationär wegen einer GBS-Pyelonephritis behandelt wurden,

keinen Screening-Abstrich mehr erhielten und somit in der vorliegenden Studie nicht erfasst

werden konnten. Diese Patienten erhielten leitliniengerecht eine IAP ohne ein GBS-

Screening.

4.3.8 Intrapartale Antibiotika-Prophylaxe

Unter der Geburt erhielten 64,3% (200/311) der GBS positiven Schwangeren eine

intrapartale Antibiotika-Prophylaxe (IAP), in 35,7% (111/311) der Fälle wurde diese nicht

gegeben. Hauptgrund trotz positiven GBS-Screenings – leitliniengerecht – keine IAP zu

geben, war eine primäre Sectio caesareae (19,9% - 62/311). Der zweite Grund für eine nicht

gegebene IAP war das bei Geburt nicht vorliegende Ergebnis des GBS-Screenings (in 25

Fällen). Bei 18 von 30 Schwangeren, die vaginal entbunden haben und trotz positivem GBS-

Nachweis nicht antibiotisch behandelt wurden, war das Testergebnis zum Zeitpunkt der

Geburt nicht bekannt. Somit war in 12 Fällen einer vaginal entbundenen Schwangeren eine

indizierte IAP trotz bekanntem positivem GBS-Status aus unbekannten Gründen nicht

verabreicht worden. Bei den restlichen 19 Schwangeren mit positivem GBS-Screening wurde

eine sekundäre Sectio caesareae ohne IAP durchgeführt. Bei 7/19 war das Screeningergebnis

zum Zeitpunkt der Sectio nicht bekannt und somit hatten 12/19 aus unbekannten Gründen

nicht die eigentlich indizierte IAP bekommen. Zusammengefasst lag die leitliniengerechte

IAP-Rate bei 89,3% (200/224).

Im Mittel (± 1 SD) wurde die IAP 7,7 (± 6,8) Stunden vor der Geburt gegeben und eine

Anzahl von 1,9 (± 1,0) Dosen verabreicht. 55,5% (111/200) erhielten mindestens 2

Antibiotika-Dosen vor der Geburt.

Das am häufigsten verwendete Antibiotikum war parenterales Ampicillin (68,5% - 137/200),

gefolgt von parenteralen Cephalosporinen (Cefuroxim) (29,5% - 59/200). Clindamycin

wurde wie Amoxicillin nur in je 0,5% (1/200) der Fälle verwendet, vergleichbar häufig wie

Erythromycin (in 1% - 2/200 Fälle). Penicillin und Vancomycin kamen in keinem Fall zum

Einsatz (s. Abb. 4.3). Amoxicillin wurde oral verabreicht, bei allen anderen Antibiotika

Ergebnisse 37

erfolgte der Applikationsweg intravenös. Nur bei einem kleinen Teil der 59 Patienten (keine

exakte Dokumentation verfügbar), denen Cephalosporine verabreicht wurden, ließ sich dies

auf eine dokumentierte Penicillinallergie mit erhöhtem Anaphylaxierisiko zurückführen, der

größere Anteil wurde aufgrund eines UFK-internen Standards eingesetzt, der beinhaltet, dass

bei einem Blasensprung > 12 h ein Cephalosporin (Cefuroxim) gegeben werden sollte. Somit

weicht die Antibiotika-Auswahl in nicht unerheblichem Umfang von den in den Leitlinien der

DGGG / DGPI primär empfohlenen Substanzen ab.

Abb. 4.3: Verteilung der Antibiotika nach Anzahl der Verabreichungen (n=200) mit

Prozentangabe

Indikation für die Antibiotikagabe war in der überwiegenden Zahl der Fälle ein positives

GBS-Screening-Ergebnis und damit die IAP in 96% (192/200). Mit sehr großem Abstand

stand an zweiter Stelle eine Sectio-Prophylaxe mit 2% (4/200). In 0,5% (1/200) der Fälle

wurde ein vorzeitiger Blasensprung als Indikation und in 1,5% (3/200) war der Grund der

Antibiotikagabe nicht angegeben.

Ergebnisse 38

4.4 Epidemiologie der EOD Fälle

Im Studienzeitraum traten zwei EOD-Erkrankungsfälle bei Neugeborenen auf, die im

Zusammenhang mit einer nachgewiesenen mütterlichen GBS-Kolonisation standen.

Ein Fall einer Late-onset GBS Sepsis (LOD) trat in der Studienkohorte nicht auf.

4.4.1 Inzidenz der EOD Fälle

Bezogen auf die Gesamtzahl der Geburten innerhalb des Studienzeitraumes ergab sich damit

eine Inzidenz von 2 pro 2144 Lebendgeburten oder 0,93 pro 1000 Lebendgeburten.

4.4.2 Klinik der EOD Fälle

In beiden Fällen erkrankten die Neugeborenen an einer durch GBS verursachten neonatalen

Sepsis (Fall A) beziehungsweise einem septischen Schock (Fall B). GBS ließ sich im Fall B

aus der Blutkultur anzüchten, im Fall A konnten GBS nur aus Oberflächenabstrichen,

Mekonium und Urin des Kindes und der Plazenta nachgewiesen werden. Das klinische Bild

zusammen mit den Laborwerten des Neugeborenen war jedoch mit einer Neugeborenen-

Sepsis vereinbar (s.u.). Beide Neugeborenen waren weiblichen Geschlechts, wurden in der 37.

Schwangerschaftswoche geboren und zeigten einen Apgar-Wert nach 1 Minute von 1 (Fall A)

bzw. von 3 (Fall B). Beide Kinder besserten sich nach postpartaler medizinischer Intervention

(Fall A: Maskenbeatmung über 3 Minuten, Fall B: Intubation in Lebensminute 3) auf einen 5

min-Apgar-Wert von 6. An relevanten Symptomen bei Beginn der Klinik zeigte Fall B

Apnoen und eine Bradykardie sowie zusätzlich im Röntgen-Thorax eine Beteiligung der

Lunge in Form eines Pleuraergusses. Fall A dagegen hatte deutlich ausgeprägtere klinische

Symptome in Form von Apnoen, Dyspnoe, arterielle Hypotension, Bradykardie, Lethargie,

verminderte Nahrungsaufnahme und ein graues Hautkolorit. Erhöhte Leukozytenzahlen (Fall

A: 9300/µl, Fall B: 12.300/µl), ein Anstieg des C-reaktiven Proteins (Fall A: 111 mg/l, Fall B:

367 mg/l) und im Fall A ein deutlich erhöhtes Interleukin-6 (99.588 pg/ml) unterstützten bei

beiden Neugeborenen die klinische Diagnose einer Neugeborenen-Sepsis. Durch eine rasche

Antibiotikatherapie nach Beginn der ersten Symptome (Fall A: 7 Tage Behandlung mit

Piperacillin/Tobramycin, während 7-tägigem Aufenthalt auf der neonatologischen

Intensivstation; Fall B: Start mit Ampicillin/Gentamicin, nach 24 h Umstellung auf

Ergebnisse 39

Piperacillin/Tobramycin, Therapiedauer: 5 Tage Kombinationstherapie, weitere 12 Tage

Piperacillin-Monotherapie; die Behandlung erfolgte während des 17-tägigen Aufenthalts auf

der neonatologischen Intensivstation) konnte in beiden Fällen eine Heilung ohne

Folgeschäden erzielt werden.

Ein mütterliches GBS-Screening war in beiden Fällen in der 35. Schwangerschaftswoche

erfolgt, Fall A war im Screening GBS-positiv, Fall B GBS-negativ. Die Schwangere im Fall B

war mit einem GBS-Antigentest (nicht kulturell) vom niedergelassenen Facharzt als GBS-

negativ gescreent worden. Ein kultureller RVA nach der Geburt bei der Mutter konnte jedoch

GBS nachweisen. Beide Schwangere hatten unter der Geburt (durch eine sekundäre Sectio

ceasareae mit Beginn der Wehen und dem Blasensprung von < 12 h vor der Geburt) keine

IAP erhalten.

4.4.3 Vergleich Serotypen kindliches vs. mütterliches Isolat

Sowohl die zwei kindlichen als auch die zwei mütterlichen Isolate wurden auf ihren

Kapselpolysaccharidserotyp untersucht. Im Fall B hatten sowohl das Kind, als auch die

Mutter den Serotyp Ia, im Fall A besaß das kindliche Isolat den Serotyp Ia, das mütterliche

Isolat allerdings den Serotyp III.

4.5 Antibiotikaresistenzen

Alle 322 GBS-Isolate der Schwangeren standen zur Antibiotikaresistenz-Testung und

Serotypisierung zur Verfügung.

4.5.1 Antibiotikaresistenz im Agardiffusionstest

Gegen Ampicillin und Cefotaxim war keines der 322 Isolate resistent, ebenso wenig gegen

Vancomycin und Linezolid.

Dagegen konnten Resistenzen gegen Erythromycin und Clindamycin nachgewiesen werden.

Gegen Erythromycin waren 78,9% (254/322) der Stämme empfindlich, 2,8% (9/322)

intermediär empfindlich und 18,3% (59/322) resistent. Von den 322 Isolaten waren 10,9%

(35/322) resistent gegen Clindamycin, 85,1% (274/322) waren sensibel. Von den 59

Erythromycin-resistenten Isolaten waren 35 Isolate gleichzeitig auch Clindamycin-resistent.

Ergebnisse 40

Eine induzierbare Resistenz gegen MLSB-Antibiotika zeigte sich in 4,0% (13/322) der

Isolate (alle 13 Isolate wiesen im D-Test ein positives Ergebnis auf) (s. Tab. 4.1).

Antibiotikum Resistent Intermediär Sensibel

Ampicillin

(10 µg)

0

(< 17 mm)

0

322 (100%)

(≥ 17 mm)

Cefotaxim

(30 µg)

0

(< 15 mm)

0

(15-22 mm)

322 (100%)

(≥ 23 mm)

Vancomycin

(30 µg)

0

(< 10 mm)

0

(10-11 mm)

322 (100%)

(≥ 12 mm)

Linezolid

(30 µg)

0

(< 17 mm)

0

(17-18 mm)

322 (100%)

(≥ 19 mm)

Erythromycin

(15 µg)

59 (18,3%)

(< 19 mm)

9 (2,8%)

(19-20 mm)

254 (78,9%)

(≥ 21 mm)

Clindamycin

(2 µg)

Resistent

35 (10,9%)

(< 17 mm)

iMLSB

13 (4,0%)

0

274 (85,1%)

(≥ 17 mm)

Tab. 4.1: Antibiotikaresistenzen im Agardiffusionstest (n=322)

4.5.2 Antibiotikaresistenz im E-Test

Alle 322 Isolate waren im E-Test gegenüber Penicillin G und Cephalotin sensibel.

Insgesamt wurde die Erythromycin- und Clindamycin-Resistenz bei 253/322 Isolaten im E-

Test überprüft, die restlichen 69 Isolate waren bereits im Agardiffusionstest eindeutig

Erythromycin- und Clindamycin-sensibel. Resistenzen gegen Erythromycin lagen in 26,9%

(68/253) der Fälle vor, gegen Clindamycin waren 13,8% (35/253) der Stämme resistent.

Ergebnisse 41

Damit bestätigte der E-Test alle Erythromycin- und Clindamycin-resistenten Isolate aus dem

Agardiffusionstest. Die 9 Erythromycin-intermediären Isolate aus dem Agardiffusionstest

waren im E-Test resistent, womit sich die Zunahme der Erythromycin-resistenten Stämme

von 59 auf 68 im E-Test erklären lässt. Die Verteilung der Antibiotikaresistenzen aufgrund

minimaler Hemmkonzentrationen aller getesteten Antibiotika findet sich in Tabelle 4.2.

Antibiotikum Resistent Intermediär Sensibel

Penicillin G (n=322) 0

(> 0,25 µg/ml)

0

322 (100%)

(≤ 0,25 µg/ml)

Cephalotin (n=322) 0

(> 0,5 µg/ml)

0

322 (100%)

(≤ 0,5 µg/ml)

Erythromycin (n=253) 68 (26,9%)

(> 0,5 µg/ml)

0

(0,25-0,5 µg/ml)

185 (73,1%)

(< 0,25 µg/ml)

Clindamycin (n=253) 35 (13,8%)

(> 0,5 µg/ml)

0

(0,5 µg/ml)

218 (86,2%)

(< 0,5 µg/ml)

Tab. 4.2: Antbiotikaresistenzen nach MHK laut NCCLS (n=322 bzw. n=253)

4.6 Serotypisierung

4.6.1 Gesamtkollektiv der GBS-Isolate

Alle 322 Isolate wurden auf ihren Kapselpolysaccharid-Serotyp mittels Latex-Agglutination

untersucht. Von den 322 untersuchten GBS-Stämmen ließen sich 314 den Serotypen Ia, Ib, II,

III, V, VII und IX zuordnen, acht Isolate (2,5%) waren nicht typisierbar (NT)

beziehungsweise zeigten gegen mehrere serotyp-spezifische Antiseren eine positive Reaktion.

Die Serotypen IV, VI und VIII kamen in keinem Fall vor.

Serotyp III war mit einem Anteil von 49,7% (160/322) der prädominierende Typ. An zweiter

Stelle standen mit fast gleicher Anzahl die Serotypen Ia mit 17,1% (55/322) und Serotyp V

mit 16,8% (54/322). Dahinter folgten die Serotypen Ib mit 5,3% (17/322) und II mit 4,4%

Ergebnisse 42

(14/322) vor Serotyp IX mit 3,1% (10/322). Am seltensten wurde Serotyp VII

nachgewiesen mit nur 1,2% (4/322) (s. Abb. 4.4).

Abb. 4.4: Häufigkeitsverteilung der verschiedenen Kapselserotypen (n=322)

4.6.2 Serotypenverteilung der Erythromycin-resistenten Isolate

Betrachtet man die Serotypenverteilung der 59 Erythromycin-resistenten GBS-Isolate, so

zeigt sich, dass die Serotypen III mit 47,5% (28/59) und V mit 42,4% (25/59) nah

beieinander lagen. Mit sehr viel niedrigerem Anteil folgten die Serotypen II, Ia und zwei

nicht-typisierbare Isolate mit jeweils 3,4% (2/59) (s. Abb. 4.5).

Ergebnisse 43

Abb.4.5.: Häufigkeitsverteilung der Kapselserotypen unter den Erythromycin-resistenten Isolaten

(n=59)

Unter den Serotyp-V-Isolaten ließ sich eine signifikant erhöhte Erythromycin-Resistenz (p <

0,0001, 95%-KI 1,700-4,118) nachweisen: von 54 Isolaten mit dem Serotyp V waren 25

Isolate (46,3%) Erythromycin-resistent. Bei allen anderen lag die Resistenz deutlich niedriger

(Typ III: 17,5% - 28/160, Typ II: 14,3% - 2/14, Typ Ia: 3,6% - 2/55).

Diskussion 44

5 Diskussion

Die Häufigkeit einer GBS-Kolonisation von Schwangeren bzw. einer Infektion des

Neugeborenen, wie auch die Antibiotika-Resistenzen und die Serotypenverteilung von GBS

können geographisch nicht unerheblich variieren. Die Epidemiologie ist zusätzlich zeitlichen

Trends unterworfen, die in der Natur des Erregers, aber auch in der Einflussnahme des

Menschen, z.B. durch die Einführung einer intrapartalen Antibiotikaprophylaxe begründet

liegen. Ziel der vorliegenden Studie war es, Entwicklungen der Epidemiologie von GBS

bezüglich Kolonisation von Schwangeren und Infektion von Neugeborenen zu erfassen. Dazu

wurde in einer Surveillance-Studie eine Kohorte schwangerer Frauen aus der Universitäts-

Frauenklinik in Freiburg in den Jahren 2009/2010 prospektiv verfolgt. Die gewonnenen Daten

wurden mit einer vergleichbaren Kohorte aus den Jahren 2002/2003 verglichen

(Bürckstümmer AK, 2004, Kunze M, 2011). Dabei wurde ein besonderes Augenmerk auf

mögliche Veränderungen der GBS-Kolonisationsrate und EOD-Inzidenz, sowie auf die

Antibiotika-Resistenzlage und Serotypenverteilung seit Empfehlung eines routinemäßigen

GBS-Screenings in der 35.-37. SSW (in 2004) und einer IAP bei GBS-positiven Schwangeren

gelegt.

5.1 Klinische Epidemiologie

5.1.1 GBS-Kolonisationsrate schwangerer Frauen

Die Kolonisationsrate schwangerer Frauen mit GBS im Genital- und/oder Gastrointestinal-

Trakt liegt in Deutschland bei 20-25% (Berner R, 2003, Regan JA, 1991). Die

Kolonisationsrate in der Freiburger Studienkohorte aus den Jahren 2002/2003 lag bei 21,1%

(183/869) (Bürckstümmer AK, 2004). In der vorliegenden Studie zeigte der

Rektovaginalabstrich (RVA) bei 322 von 1651 Schwangeren einen positiven GBS-Befund,

das entspricht einer Kolonisationsrate von 19,5%. Die Prävalenz ist damit um 1,6%

gesunken; dies ergab keinen signifikanten Unterschied zu den Daten von 2002/2003

(p=0,354). Eine weitere Arbeit aus Deutschland von 2006 wies im Raum Aachen und

München eine Kolonisationsrate von 16% nach (Brimil N, 2006).

Diskussion 45

Somit scheinen sich die GBS-Kolonisationsraten in Deutschland in den letzten 10 Jahren

stabil zwischen 16% und 22% zu halten. Allerdings liegen bisher keine Daten aus einer

nationalen Studie vor, die eine Aussage über die GBS-Kolonisationsrate über mehrere Jahre

in ganz Deutschland möglich macht und etwaige zeitliche oder regionale Varianzen der

Kolonisationsrate nachweisen könnte.

Im weltweiten Vergleich divergieren die Kolonisationsraten sehr stark. Zwei Studien aus

Dänemark zeigen, dass die Kolonisationsrate innerhalb von vier Jahren seit Einführung eines

einheitlichen GBS-Screenings und zeitgleich eingeführter IAP um mehr als die Hälfte, also

von <15% auf 33-38%, angestiegen war (Hansen SM, 2004, Feikin DR, 2001). In einer der

beiden Studien wurden die Mütter ein zweites Mal ein Jahr nach der Geburt gescreent und

34% der Frauen wiesen noch immer einen positiven Befund auf (Hansen SM, 2004). In

Studien aus den USA rangiert die Kolonisationsrate nach Einführung des einheitlichen

rektovaginalen GBS-Screenings und einer IAP im Jahr 2002 zwischen 24-29% (Van Dyke

MK, 2009, Faro S, 2010, Yancey MK, 1996). Im Gegensatz dazu liegen die

Kolonisationsraten in Spanien, aber auch in Großbritannien mit 15,4% und 14% sehr viel

niedriger, was daran liegen könnte, dass in diesen Ländern entweder keine einheitliche

Empfehlung für ein GBS-Screening ausgesprochen wurde (wie in Großbritannien), oder diese

nicht einheitlich in die Praxis umgesetzt wird, wie beispielsweise in Spanien (Centelles-

Serrano MJ, 2009, Colbourn T, 2007). Als weiteres Argument gegen ein generelles GBS-

Screening führt Großbritannien die fragliche Kosteneffizienz des GBS-Screenings auf

(RCOG, 2003).

5.1.2 Klinik der GBS-kolonisierten Schwangeren

Vergleicht man die beiden Freiburger Kohorten bezüglich der verschiedenen Geburtsmodi,

so hat sich das Verhältnis von vaginaler Entbindung zu Schnittentbindungen (primäre und

sekundäre Sectiones caesareae) nicht wesentlich geändert. Lagen die Zahlen von 2002/2003

bei 57,9% (vaginale Geburt, 580/1001) und 42,1% (Schnittentbindung, 421/1001), so hat die

Rate der vaginalen Entbindungen in der vorliegenden Studie auf 54,7% abgenommen,

während die Schnittentbindungen eine geringe Zunahme auf 45,3% erfuhren (p=0,307).

Diskussion 46

Der vorzeitige Blasensprung (> 18 h), der ein bedeutender Risikofaktor für die Entwicklung

einer neonatalen Infektion darstellt und eine wichtige Indikation für die Gabe der IAP ist, trat

in der vorliegenden Studie von 2009/2010 in 5,1% (16/311) der Geburten auf. Im Vergleich

dazu hatten in der Untersuchung von 2002/2003 wesentlich mehr Frauen präpartal einen

vorzeitigen Blasensprung (13,9% - 139/1001; p<0,0001, 95%-KI 1,634-4,457). Allerdings

zeigte diese Studie auch, dass die Latenz zwischen Blasensprung und Geburt von über 18

Stunden keinen signifikanten Einfluss auf die GBS-Transmission hatte.

5.1.3 IAP

In der Freiburger Studie von 2002/2003 hatte nur ein Drittel der positiv getesteten

Schwangeren eine IAP erhalten, wie sie damals von ACOG und CDC empfohlen war. Ein

Grund dafür war, dass die Leitlinien aus den USA von 1996 in Deutschland noch nicht in die

Praxis umgesetzt worden waren und häufig kein GBS-Screening und keine konsequente IAP

erfolgten. Die deutschen Fachgesellschaften DGGG und DGPI empfehlen erst seit 2004 ein

generelles GBS-Screening und eine entsprechende IAP (DGGG, 2004). Bis heute gibt es in

Deutschland allerdings keine einheitliche Regelung zur Durchführung und Finanzierung des

GBS-Screenings und der IAP. Viele niedergelassene Frauenärzte/innen bieten ein GBS-

Screening an, allerdings zählt dieses zu den individuellen Gesundheitsleistungen (IGEL-

Leistungen) und somit werden die Kosten nicht von der gesetzlichen Krankenkasse

übernommen, auch wenn die DGGG bereits seit 2004 eine eindeutige Empfehlung für

Screening und Prophylaxe ausgesprochen hat (DGGG, 2004). Auch in anderen europäischen

Ländern sind die Regelungen bezüglich GBS-Screening und IAP sehr uneinheitlich. In

Großbritannien beispielsweise gibt es kein von der Regierung empfohlenes GBS-Screening,

obwohl die invasiven Infektionen von 2003 bis 2008 um etwa 50% angestiegen sind (Group B

Strep Support, 2009). In Belgien, Spanien, Polen, Frankreich und Tschechien sind ein GBS-

Screening und eine IAP empfohlen, allerdings unterscheiden sich die landesspezifischen

Leitlinien bezüglich Screening-Zeitpunkt, Abstrichmaterial und dessen Verarbeitung

erheblich (Council, 2003, SEGO et al., 2003, Kotarski J, 2008). Keine offizielle Empfehlung

für ein GBS-Screening haben die Länder Portugal, Italien und die Schweiz.

Diskussion 47

Im Rahmen dieser Studie konnte den Schwangeren in der Universitätsfrauenklinik Freiburg

ein generelles GBS-Screening und eine IAP angeboten werden. Die Zahlen zur IAP haben

sich im Vergleich zum Jahre 2002/2003 deutlich gebessert. Damals hatten 32,2% (59/183) der

auf GBS-positiv getesteten Schwangeren eine IAP erhalten, in der vorliegenden Studie

konnten 89,3% (200/224) der Frauen mit einer IAP versorgt werden. Dieser Unterschied war

hoch signifikant (p<0,0001, 95%-KI 0,291-0,448).

5.1.4 Inzidenz der EOD

Im Studienzeitraum ereigneten sich zwei Fälle einer EOD. Setzt man diese zwei invasiven

Fälle ins Verhältnis zu allen 2144 Lebendgeborenen an der Universitäts-Frauenklinik

Freiburg, so konnte eine Inzidenz von 0,93 pro 1000 Lebendgeburten berechnet werden.

2002/2003 wurde in Freiburg eine Inzidenz von 4,3 pro 1000 Lebendgeburten ermittelt, wenn

man nur die invasiven EOD-Fälle betrachtet, von 1,7 pro 1000 Lebendgeburten. Mit 1,7 pro

1000 Lebendgeburten entsprach die Inzidenz im damaligen Studienkollektiv den

Inzidenzzahlen der USA vor Einführung der Präventionsrichtlinien 1996 (Schuchat A, 1996).

Mit der aktuellen Studie konnte also eine rückläufige EOD-Inzidenz in Freiburg

dokumentiert werden.

Zwischen 2001 und 2002 wurde in Deutschland eine erste landesweite Studie zur Inzidenz

neonataler GBS-Infektionen über das ESPED-Erfassungssystem an allen deutschen

Kinderkliniken durchgeführt (Fluegge K, 2004, Fluegge K, 2005, Fluegge K, 2006). Die

Ergebnisse zeigten, dass die Inzidenzzahlen (0,47/1.000 Lebendgeborene) deutlich niedriger

lagen als die der Freiburger Daten von 2002/2003. Die aktuelle Freiburger Inzidenz liegt

somit immer noch höher als die deutschlandweite Inzidenz aus den Jahren 2001/2002. Die

deutschlandweiten Daten aus der ESPED-Erhebung 2008-2010 sind noch nicht

abgeschlossen, deuten aber auf einen Rückgang der Inzidenz um ein Drittel im Vergleich zum

Zeitraum 2001/2002 hin (Prof. Reinhard Berner, persönliche Kommunikation).

Die aktuelle EOD-Inzidenz ist somit ähnlich niedrig und rückläufig wie in anderen

europäischen Ländern (0,72 pro 1000 Lebendgeburten in Irland und Großbritannien) (Heath

PT, 2004, Weisner AM, 2004). In den Niederlanden lag die Inzidenz im Jahr 1997/1998

Diskussion 48

allerdings noch deutlich höher, mit 1,9 pro 1000 Lebendgeborene entsprach sie den Daten aus

den USA vor Einführung der Antibiotika-Prophylaxe (Trijbels-Smeulders M, 2002). In den

USA konnte die EOD-Inzidenz im Zeitraum von 15 Jahren von 1,7 pro 1000 Lebendgeburten

(1990) auf 0,34-0,37 pro 1000 Lebendgeburten (2008) gesenkt werden (Verani JR, 2010).

Im Gegensatz zu den in den letzten Jahren rückläufigen EOD-Zahlen wird bei der LOD eine

stabile Inzidenz beobachtet. In Deutschland lagen die Zahlen bei 0,19 pro 1000

Lebendgeborene im Jahr 2001/2002 (Fluegge K, 2006). Studien aus den USA konnten über

einen Beobachtungszeitraum von 15 Jahren eine gleichbleibende Inzidenz der LOD von 0,4

pro 1000 Lebendgeborene vermerken (Verani JR, 2010).

Wichtig ist die Frage nach Präventionsmöglichkeiten einer EOD bzw. LOD. Eine EOD lässt

sich durch das pränatale GBS-Screening und die IAP beeinflussen, die LOD jedoch nicht. Für

diese sind andere Präventionsmaßnahmen zu entwickeln, z.B. in Form einer mütterlichen

Impfung, die mit hoher Wahrscheinlich sowohl eine EOD als auch eine LOD positiv

beeinflussen sollte (Jordan HT, 2008).

5.2 Phänotypische GBS-Eigenschaften

5.2.1 Antibiotikaresistenz

In der vorliegenden Studie wurden 322 GBS-Isolate auf ihre Antibiotika-Empfindlichkeit

geprüft. Keiner der untersuchten Stämme zeigte im Agardiffusionstest eine Resistenz gegen

Ampicillin, Cefotaxim, Vancomycin und Linezolid. Auch im E-Test waren Penicillin G und

Cephalotin zu 100% sensibel. Damit können die Ergebnisse aus den Jahren 2002/2003

bestätigt werden. Auch damals waren alle 180 untersuchten Stämme auf Penicillin G,

Ampicillin und Cefotaxim sensibel gewesen. Es ist bis heute in Europa nur eine einzige

Studie aus Spanien bekannt, die Isolate mit einer intermediären Empfindlichkeit gegen

Penicillin G und Ampicillin beschrieben hat (Betriu C, 1994). In Japan wurde 2008 eine

Studie vorgestellt, die weltweit das erste Mal von einer Penicillin- und Ceftizoxim-Resistenz

(letzteres ein Drittgenerations-Cephalosporin, das in Deutschland nicht erhältlich ist) bei GBS

berichtet. 14 GBS-Isolate aus 12 verschiedenen Kliniken in Japan aus den Jahren 1995-1998

und 2005 wiesen eine Penicillin-Resistenz auf (Kimura K, 2008).

Diskussion 49

Als Grund für die Penicillin-Resistenz konnte der Austausch mehrerer Aminosäuren in einem

Penicillin-bindenden-Protein (pbp2X) nachgewiesen werden, was zu einer verminderten

Affinität des Antibiotikums an die Bakterienzelle führt und die Abnahme der Empfindlichkeit

des Antibiotikums erklärt (Kimura K, 2008). Eine erste Studie aus Japan zeigte bereits 2001

intermediäre Betalaktam-Antibiotika-Resistenzen. Hier wurden 21 von 117 GBS-Isolaten mit

einer intermediären Empfindlichkeit gegen Penicillin beschrieben, ein Isolat zeigte sich

Penicillin-resistent und 51 waren intermediär empfindlich gegenüber Ampicillin (Morikawa

Y, 2003). Für das damalige Auftreten von Betalaktam-Antibiotika-Resistenzen liegen

allerdings keine weiteren Erklärungen vor. Eine neuere Studie aus den USA von Dahesh et al.

stellte bei vier invasiven GBS-Isolaten mit dem Serotyp III eine verminderte Penicillin-

Empfindlichkeit, sowie leicht erhöhte MHK-Werte bei drei weiteren Betalaktam-Antibiotika

(Cefotaxim, Cefoxitin und Cefuroxim) fest, die ebenfalls mit einer pbp2X-Mutation (Q557E)

erklärt werden konnten (Dahesh S, 2008). Inwiefern die beobachteten Resistenzen eine

klinische Relevanz haben, ist unklar. Die publizierten MHK-Werte liegen knapp oberhalb des

als resistent-bezeichneten Grenzwertes. Ob damit ein klinisches Versagen impliziert wird, ist

nicht bekannt.

Da die Richtlinien des CDC eine IAP mit Penicillin G oder Ampicillin empfehlen und sowohl

in Deutschland, als auch in anderen Ländern weltweit keine nennenswerten Resistenzen (bis

auf Japan, Spanien und den USA) gegen Betalaktam-Antibiotika beschrieben sind, bleiben

Penicillin G und Ampicillin Mittel der Wahl zur Prophylaxe und Therapie von GBS-

Transmission bzw. -Infektion.

Anders sieht die Resistenzlage bei der Prophylaxe/Therapie mit Makroliden und

Lincosamiden aus. Von der CDC wird bei Betalaktam-Unverträglichkeit neuerdings nur noch

die Gabe von Clindamycin empfohlen (CDC 2010). Da es in den letzten Jahren aber zu einem

deutlichen Anstieg der Makrolid- und Lincosamid-Resistenzen weltweit kam, ist diese

Empfehlung inzwischen kritisch zu betrachten. Im Freiburger Studienkollektiv von 2002/2003

waren 11,6% der Stämme resistent gegen Erythromycin, 7,7% zeigten eine Resistenz gegen

Clindamycin. Sechs Jahre später konnte in Freiburg ein Anstieg der Rate an Erythromycin-

resistenten Stämmen verzeichnet werden. Die Testung der 322 Studienisolate ergab in

18,3% eine Resistenz gegen Erythromycin, in 10,9% eine Resistenz gegen Clindamycin.

Diskussion 50

Auch im sensitiveren E-Test konnte ein Anstieg der Erythromycin-Resistenz bestätigt werden.

2002/2003 lag die Erythromycin-Resistenz bei 11,6%, in der vorliegenden Studie hatten sich

die Zahlen mit 26,9% Erythromycin-resistenter Stämme signifikant erhöht (p<0,0002, 95%-

KI 0,267-0,698). Der Anteil an Clindamycin-intermediären Isolaten lag dagegen in der Studie

von 2002/2003 mit 16,7% noch deutlich höher als im Jahre 2009/2010 (ohne Clindamycin-

intermediären Fall). Der Unterschied könnte durch technische Gründe, wie z.B. konsequentes

dünneres Ausplattieren der Stämme auf Agarplatte zur Agardiffusionstestung bedingt sein.

Eine dichtere Bakterienaussaat erhöht die Rate an intermediären Resultaten. Die

Erythromycin-intermediären Stämme blieben in beiden Studien bei 2,8% konstant. Auch die

induzierbare Resistenz zeigten in der vorliegenden Studie mit 4% nicht wesentlich viel mehr

Isolate als in der Studie von vor sechs Jahren (3,3%).

Andere Studien bestätigen den Anstieg der Erythromycin-resistenten Stämme. Laut Morales

et al. stiegen in den USA die Erythromycin-Resistenzen in einem Zeitraum von 18 Jahren von

1,2% (1980-1993) auf Werte von 18% (1997-1998) (Morales WJ, 1999) an. Gleiches

berichtet eine Studie aus Taiwan, wo im Jahre 1994 eine Rate von 18% zu verzeichnen war,

die innerhalb von drei Jahren auf 37% anstieg (Hsueh PR, 2001). In weiteren Studien liegen

die Resistenzraten für Erythromycin zwischen 16,3% und 20% beziehungsweise für

Clindamycin zwischen 8% und 22,2% (Aracil B, 2002, Betriu C, 2003, De Azavedo JC, 2001,

Uh Y, 2001). In Kenntnis dieser Daten ist der uneingeschränkte Einsatz von Erythromycin,

wie auch von Clindamycin als Mittel der Wahl bei Betalaktam-Unverträglichkeit zu

hinterfragen. Vor deren Einsatz sollte zwingend eine Resistenztestung erfolgt sein.

Entsprechend sind die aktuellen amerikanischen Leitlinien aus dem Jahr 2010 formuliert

(CDC, 2010). Sicher effektiv sind derzeit Glykopeptid- und Oxazolidinon-Antibiotika. Da

diese jedoch wichtige Reserveantibiotika bei der Therapie lebensgefährlicher Infektionen mit

multiresistenten gram-positiven Erregern sind, sollten sie als Mittel der ersten Wahl bei

Betalaktam-Unverträglichkeit nicht eingesetzt werden, solange eine Resistenztestung gegen

Clindamycin vorliegt. Bei Fehlen einer Clindamycin-Testung muss der Einsatz von

Glykopeptiden oder Oxazolidinone erwogen werden (Schuchat A, 1998, CDC 2010).

Im Falle eines Screenings in der 35.-37. SSW wird das Ergebnis der Resistenztestung – bei

Betalaktam-Allergie der Schwangeren – rechtzeitig vor der Geburt vorhanden sein.

Diskussion 51

Problematisch ist die Resistenztestung bei Schwangeren, die erst zur Geburt gescreent

werden, da dann das Ergebnis möglicherweise nicht rechtzeitig vor Geburt vorliegt.

5.2.2 Serotypenverteilung

Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden alle 322 Isolate auf ihren Kapsel-Serotyp

untersucht. Von den zehn verschiedenen bekannten Serotypen (Ia, Ib und II-IX) kamen die

Serotypen IV, VI und VIII in keinem Falle vor. Es zeigte sich eine deutliche Prädominanz

des Serotyps III, der in 49,7% der Fälle vertreten war. Etwa mit gleichen Anteilen folgten die

Serotypen Ia (17,1%) und V (16,8%), die sich im Vergleich zu der Studie von 2002/2003

nicht wesentlich verändert hatten (Serotyp Ia mit 16% und Serotyp V mit 15%). Der Anteil

des Serotyps III hatte sich dagegen von 2002/2003 (29%) bis 2009/2010 (49,7%) fast

verdoppelt. Dieser Unterschied war hoch signifikant (p<0,0001, 95%-KI 0,446-0,765). Der

Serotyp Ib war von 19,4% im Jahre 2002/2003 bis auf 5,3% abgesunken (p<0,0001, 95%-KI

2,087-6,440), Serotyp II hatte von 14% auf 4,4% abgenommen (p<0,0014, 95%-KI 1,452-

5,473) und Serotyp IV lag 2002/2003 bei 6,5% und kam in der vorliegenden Studie in keinem

Fall vor (p<0,0001).

Wie andere Studien zeigen, unterliegen die Serotypen geographisch und zeitlich

unterschiedlichen Häufigkeitsverteilungen. In Norwegen und Polen dominiert mit 33,8% und

36% ebenfalls Serotyp III (Kvam AI, 1995, Sadowy E, 2010). In den 1970er Jahren waren in

den Vereinigten Staaten die Serotypen Ia, Ib, II und III, sowohl bei den mütterlichen GBS-

positiven Isolaten als auch bei den kindlichen EOD- und LOD-Fällen, führend (Wilkinson

HW, 1978, Baker CJ, 1974). Nur wenige Jahre später wurde der Serotyp III von Serotyp V

überholt (Harrison LH, 1998). In einer aktuellen Studie von Phares et al. konnte eine

Prädominanz des Serotyp V (31%) nur in der Gruppe der nicht-schwangeren Frauen

nachgewiesen werden, während bei den schwangeren Frauen und den kindlichen EOD-

Infektionsfällen Serotyp Ia (30%), Serotyp III (28%) und Serotyp II ( 13%) einen deutlich

höheren Anteil ausmachten. Weiterhin dominierend zeigte sich Serotyp III mit 51% bei den

LOD-Infektionen (Phares CR, 2008).

In anderen Teilen der Welt spielen wiederum ganz andere Serotypen eine dominierende Rolle,

wie beispielsweise in Japan, wo die Serotypen VI und VIII schon seit 1983 vorherrschen und

Diskussion 52

prozentual bis heute immer weiter ansteigen. In einer Studie von Lachenauer et al. wurde der

Serotyp VI mit 24,7% und der Serotyp VIII mit 35,6% vermerkt (Lachenauer CS, 1999). Die

deutliche Prädominanz der Serotypen VI und VIII in Japan zeigt, dass bei der Entwicklung

eines weltweit wirksamen Impfstoffes gegen GBS unbedingt alle bis heute bekannten

dominierenden Serotypen berücksichtigt werden müssen, damit dieser auch global einsetzbar

ist. Die Kenntnis über die Serotypenverteilung und ihre zeitlichen Trends ist essentiell für die

Entwicklung eines Impfstoffes gegen GBS (siehe 5.3).

5.2.3 Serotypenverteilung und Makrolid-Resistenz

Laut aktueller Studienlage ist ein Grund für den Anstieg der Erythromycin-Resistenz die

Zunahme der Isolate mit dem Serotyp V (Diekema DJ, 2003, Manning SD, 2003). Während

in der vorliegenden Studie in der Gruppe der Erythromycin-sensiblen Stämme der Serotyp V

einen Anteil von lediglich 11,4% (29/254) stellte, lag dieser in der Gruppe der Erythromycin-

resistenten bei 46,3% (25/54). Diese unterschiedliche Verteilung des Serotyp V in den

Erythromycin-resistenten und -sensiblen Gruppen war hoch signifikant (p<0,0001, 95%-KI

1,700-4,118). Eine sehr ähnliche Aussage konnte auch in der Studie von 2002/2003 gemacht

werden. Dort lag der Anteil des Serotyp V in der Gruppe der Erythromycin-sensiblen Stämme

bei 11,3%, in der Gruppe der Erythromycin-resistenten Stämme bei 45% (Bürckstümmer AK,

2004). Eine Studie aus Frankreich berichtete von ähnlich hohen Anteilen an Erythromycin-

resistenten GBS-Stämmen mit dem Serotyp V. Mit 35% lag der Anteil des Serotyp V unter

den Erythromycin-resistenten Stämmen deutlich vor den Serotypen Ia (8%), Ib (15%), II (9%)

und III (16%) (Domelier AS, 2008). Auch in anderen Ländern scheinen die Erythromycin-

resistenten Serotyp V Stämme zuzunehmen. In Korea liegt der Anteil bereits bei 43,6% (Uh

Y, 2004), eine Studie aus den USA berichtet von 27% Erythromycin-resistenter Stämmen mit

dem Serotyp V (Croak A, 2003).

Aus dem Vergleich der beiden Studienkollektive in Freiburg scheint somit der prozentuelle

Anteil der Erythromycin-resistenten Serotyp V Isolate stabil zu sein, jedoch hat der Anteil der

Erythromycin-resistenten Isolate innerhalb der Non-Serotyp V Stämme – v.a. der Typ III

Stämme – zugenommen. So lag 2002/2003 der Anteil der Erythromycin-resistenten Serotyp

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Domelier%20AS%22%5BAuthor%5D

Diskussion 53

III Isolate bei 20%, in den Jahren 2009/2010 konnte ein Anstieg auf 47,5% verzeichnet

werden (p<0,0306, 95%-KI 0,169-1,054).

5.3 GBS-Impfstoff

5.3.1 Entwicklung und Perspektiven

Die vorliegende Studie aus Freiburg von 2009/2010 ist Teil des europaweit durchgeführten

DEVANI-Projekts (Design of a Vaccine Against Neonatal GBS Infections), das zum Ziel hat,

epidemiologische Grundlagen für die Entwicklung eines Impfstoffes gegen neonatale GBS-

Infektionen zu schaffen.

Bereits vor über 30 Jahren wurde in einer Studie von Baker et al. ein Zusammenhang

zwischen invasiven GBS-Erkrankungen bei Neugeborenen und einem mütterlichen Mangel

opsonierender Antikörper gegen den auslösenden GBS-Serotyp festgestellt (Baker CJ, 1976).

Weitere Studien belegten, dass das Risiko für das Neugeborene eine EOD zu entwickeln,

abhängig war von der Menge der maternalen opsonierenden Antikörper (Lin FY, 2001,

Davies HD, 2001). Daraus leitete sich die Hypothese ab, dass ausreichend hohe mütterliche

Serotyp-spezifische opsonierende Antikörper einen protektiven Effekt gegen invasive GBS-

Erkrankungen des Neugeborenen haben. Verbunden damit war das Ziel, einen geeigneten

Impfstoff zu entwickeln, der eine Erkrankung beim Kind mit GBS schon vor der Geburt

verhindern und die Antibiotika-Prophylaxe der Schwangeren bei Nachweis von GBS ersetzen

würde. Ein solcher Schutz würde nicht nur EOD-, sondern auch LOD-Fälle umfassen.

Letztere sind durch eine IAP nicht zu verhindern. Da GBS eine große genomische Variabilität

mit unterschiedlicher Ausprägung der Serotypen wie auch der Resistenzgene aufweisen,

stellte sich die Frage, wie ein Impfstoff konzipiert sein muss, damit er dem Neugeborenen

möglichst gegen alle oder zumindest gegen die wichtigsten Serotypen Schutz bieten und

somit eine invasive Erkrankung verhindern könnte. Ein Impfstoff muss ausreichend hohe

mütterliche opsonierende Antikörpertiter induzieren, damit das Neugeborene von einem

„Nestschutz“ profitieren kann. Neben dem ausreichenden Schutz sollte die Immunantwort

idealerweise auch anhaltend, bzw. einfach „boosterfähig“ sein. Dieses Ziel ist mit einem

reinen Kapselpolysaccharidimpfstoff nicht zu erzielen. Deshalb wurde von Anfang an

Diskussion 54

versucht, Konjugatimpfstoffe zu entwickeln. Dabei werden Kapselpolysaccharide an Proteine

gekoppelt. Die Immunantwort gegen Eiweiße ermöglicht eine T-Zell-abhängige

Gedächtnisantwort, die leichter „boosterfähig“ ist. Bereits 1999 präsentierten Baker et al.

(Baker CJ, 1999) einen Konjugat-Impfstoff, der aus den Kapselpolysacchariden Ia und Ib,

gekoppelt an Tetanus-Toxoid, bestand. Nach der Gabe von 15 µg des Impfstoffes ließen sich

auch noch nach einem Jahr erhöhte Antikörperspiegel im Blut weiblicher Testpersonen

nachweisen, die noch so hoch waren, dass man mit einem Schutz des Neugeborenen rechnen

konnte. Neben bekannten Proteinen, wie Tetanus-Toxoid für die Impfstoffherstellung,

kommen auch GBS-spezifische Eiweiße – idealerweise solche Proteine, die Virulenzfaktoren

darstellen – als mögliche Konjugatpartner für GBS-Kapselpolysaccharide in Frage.

Da weltweit sehr große Unterschiede in der Serotypenverteilung und den zugehörigen

Virulenzfaktoren vorliegen, musste man sich in den letzten Jahren die Frage stellen, für

welche Serotypen es Sinn macht, einen Impfstoff zu entwickeln. Seit 1996 wurden für die

häufigsten Serotypen Ia, Ib, II, III und V Konjugat-Impfstoffe getestet, mit der Hoffnung

einen multivalenten GBS-Impfstoff zu erhalten, der möglichst alle invasiven GBS-Infektionen

abdecken würde (Baker CJ, 2003). Allerdings sind damit noch nicht die Serotypen

berücksichtigt, die möglicherweise in anderen Regionen der Welt dominieren und für dortige

invasive GBS-Infektionen verantwortlich sind. Daraus entwickelte sich der Ansatz, eine

protektive Immunantwort unabhängig vom Kapsel-Serotyp für eine Impfstoff-Entwicklung zu

generieren.

Mehrere Arbeitsgruppen untersuchten sowohl verschiedene GBS-Genomsequenzen, als auch

bestimmte Proteine an der Zelloberfläche von GBS auf ihre „Impfstoff-Tauglichkeit“

(Lindahl G, 2005). Zwei Oberflächenproteine (Sip und C5a Peptidase) machten Hoffnung auf

einen neuen Ansatz zur Entwicklung eines Impfstoffes, da diese beiden Proteine in jedem

bisher untersuchten GBS-Stamm nachzuweisen waren, unabhängig von ihrem Serotyp

(Brodeur BR, 2000, Johri AK, 2006).

Ein weiterer Ansatz und vom heutigen Standpunkt aus gesehen wohl der vielversprechendste,

ist die Entdeckung der GBS-Pili, die eine wichtige Rolle spielen bei der Adhäsion der

Bakterien an die Epithelzelle (Dramsi S, 2006, Telford JL, 2006). Initial wurden für GBS

Diskussion 55

zwei verschiedene Pili beschrieben, kodiert durch die Gene PI-1 und PI-2a (Lauer P, 2005).

Kürzlich wurde gezeigt, dass PI-2a noch ein weiteres Allel (PI-2b) mit einer etwas anderen

Gensequenz aufweist (Dramsi S, 2006). In einer Studie von Margarit et al. (Margarit I, 2009)

konnte über eine PCR-Analyse gezeigt werden, dass jeder GBS-Stamm mindestens eines der

drei Gene (PI-1, PI-2a und/oder PI-2b) besitzt. Ein potentieller Impfstoff müsste also jeweils

nur eine Komponente von jedem der 2 bekannten Pili beinhalten und könnte damit

möglicherweise einen Infektionsschutz gegen alle GBS-Stämme vermitteln. Im Tierversuch

waren reine Pili-Impfstoffe in bis zu 96% der untersuchten GBS-Stämme protektiv (Margarit

I, 2009).

Darauf aufbauend setzt das DEVANI-Projekt große Hoffnungen in die Rolle der Pili-

Antigene als möglichen Konjugatpartner für Kapselpolysaccharide, die Grundlage für einen

neuen Impfstoff gegen GBS darstellen könnten. Um die Serotypen- und Pilusgen-Verteilung

von GBS in Europa zu erfassen, wurden parallel zu der vorliegenden Studie, noch in neun

weiteren Ländern Europas nicht nur GBS-Stämme sondern auch mütterliche Seren

gesammelt, um dort nach der Höhe von Antikörpertitern gegen GBS-Pili und GBS-Serotypen

zu suchen. Diese Daten werden – so ist die Hoffnung – einen genauen Aufschluss über die

Epidemiologie, Serotypen- und Pilusverteilung in Europa liefern, sodass die Erwartung

besteht, die Grundlage für einen Europa-, möglicherweise sogar weltweit einsetzbaren

Impfstoff schaffen zu können.

Es wird auf vielen Ebenen weiter an einem Impfstoff gegen neonatale GBS-Infektionen

geforscht. Dabei ist grundsätzlich die Frage zu stellen, wie hoch der Preis für einen Schutz der

Neugeborenen ist. In Deutschland sind 20-25% der Frauen mit GBS besiedelt, in etwa 50%

der Fälle kommt es zu einer Transmission auf das Neugeborene, aber nur etwa 0,2% der

Neugeborenen entwickeln eine invasive Infektion. Macht es Sinn, alle schwangeren Frauen zu

impfen, um diesem kleinen Teil von 0,2% der Neugeborenen Schutz vor einer invasiven

Infektion bieten zu können? Ist der Preis der Entwicklung einer Impfung gerechtfertigt, wenn

ein Screening mit nachfolgender IAP zwar nicht ähnlich effektiv, aber kostengünstiger ist?

Neben der klinischen Effektivität eines zukünftigen GBS-Impfstoffes wird somit auch die

Kosteneffektivität auf dem Prüfstand stehen müssen.

Diskussion 56

Der Vorteil einer Impfung liegt sicher darin, dass mit ihr auch die LOD wahrscheinlich

verhindert werden kann, während die IAP hier versagt. Ein wichtiger Punkt in der

Beantwortung der Frage nach der Notwendigkeit einer Impfung wird sein, wie lange die

Impfung einen Schutz bieten kann. Muss in/vor jeder Schwangerschaft neu geimpft werden,

da die Antikörpertiter maximal ein Jahr hoch genug sind, um dem Neugeborenen ausreichend

Schutz bieten zu können, oder hält der Schutz sogar mehrere Jahre vor? Schützt eine Impfung

während der Reproduktionsphase der Frau vielleicht sogar vor GBS-Infektionen im hohen

Alter? GBS-Infektionen im hohen Alter gelten als ein „emerging“ Problem. Würde die

Impfung nur Schutz für die aktuelle Schwangerschaft bieten, würde der Kosten-Nutzen-Effekt

im Vergleich zur IAP möglicherweise gering ausfallen.

Ein weiterer wichtiger Aspekt in der Frage nach dem Nutzen einer Impfung ist die Frage nach

der künftigen Antibiotikaresistenzlage und der Verfügbarkeit von neuen wirksamen

Antibiotika. Gegenüber Penicillin und Ampicillin zeigen sich bisher noch keine klinisch

relevanten Resistenzen. Ob das langfristig so bleiben wird, kann derzeit nicht beantwortet

werden. Es stellt sich aber bereits jetzt die Frage, was man Schwangeren mit positivem GBS-

Screening anbieten kann, wenn eine Betalaktam-Unverträglichkeit vorliegt und auch

Makrolide und Lincosamide wegen zu hoher Resistenzraten nicht mehr angewendet werden

können. Hier wäre ein GBS-Impfstoff, der möglichst über mehrere Jahre Schutz bietet und

wenige Nebenwirkungen aufweist, eine optimale Lösung.

Zusammenfassung 57

6 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden über anderthalb Jahre in einer prospektiven Surveillance-

Studie an schwangeren Frauen und ihren neugeborenen Kindern die Eigenschaften von

Gruppe B-Streptokokken (GBS) bezüglich klinischer Epidemiologie, Antibiotikaresistenz und

Serotypenverteilung untersucht und mit Daten einer vergleichbaren Studie aus den Jahren

2002/2003, die ebenfalls an der Universitäts-Frauenklinik und dem Zentrum für Kinder- und

Jugendmedizin Freiburg erhoben wurden, verglichen. Von 1651 Frauen, die einen Screening-

Abstrich auf GBS erhalten hatten, wiesen 322 (19,5%) einen positiven GBS-Befund auf, in

der Studie von 2002/2003 lag die Kolonisationsrate mit 21,1% nur unwesentlich höher. Die

Häufigkeit des vorzeitigen Blasensprungs (> 18 h vor Geburt) nahm von 13,9% auf 5,1% ab.

Der Einsatz der intrapartalen antibiotischen Prophylaxe (IAP) nahm im Vergleich zum

Jahre 2002/2003 deutlich zu. Damals hatten 32,2% (59/183) der positiv getesteten

Schwangeren die IAP erhalten, in der vorliegenden Studie waren es 89,3% (200/224). Die

Inzidenz der EOD Fälle lag in der Studienkohorte bei 0,93 pro 1000 Lebendgeburten. LOD

Fälle wurden nicht beobachtet. Die Clindamycin-Resistenzrate stieg von 7,7% in den

Jahren 2002/2003 auf 10,9% in der aktuellen Studie an. Die Erythromycin-Resistenzrate

hingegen nahm nochmal deutlicher zu. Von 322 GBS-Isolaten waren aktuell 26,9% resistent

gegen Erythromycin, ein statistisch signifikanter Anstieg gegenüber 11,6% in der Studie von

2002/2003. Die Untersuchung der Serotypenverteilung zeigte eine Prädominanz des Serotyp

III. Der Anteil des Serotyps III hatte sich von 29% im Zeitraum 2002/2003 auf 49,7% in den

Jahren 2009/2010 fast verdoppelt. In der Gruppe der Erythromycin-resistenten Stämme lag

der Anteil des Serotyp V bei 46,3% (25/54). Auch die Studie von 2002/2003 beschrieb mit

45% eine vergleichbare positive Korrelation zwischen dem Auftreten einer Erythromycin-

Resistenz und dem Serotyp V. Eine Zunahme der Erythromycin-Resistenz betrifft in erster

Linie Serotyp III Isolate, 2002/2003 lag diese bei 20%, 2009/2010 war sie auf 47,5%

angestiegen. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten sind Teil eines EU-geförderten

Projekts über epidemiologische Grundlagen von GBS in Europa mit dem langfristigen Ziel

der Entwicklung eines Impfstoffes gegen neonatale GBS-Infektionen (DEVANI – Design of a

Vaccine Against Neonatal GBS Infections).

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Anhang 72

8 Anhang

8.1 Schwangeren - Fragebogen

DEVANI Projekt - DEsign of a Vaccine Against Neonatal GBS Infections

SCHWANGEREN – FRAGEBOGEN (CASE REPORT FORM)

Name (Initialen d. Familien- und d. Vornamens): _____________________Krankenakten-Nr.: ___________

Name d. Krankenhauses: ________________________________

Pränatales / intrapartales GBS Screening

1. Wurde mütterliche GBS-Kolonisation i.d. Schwangerschaft gescreent? ja, durchgeführt, in __ __. Schwangerschaftswoche

nein unbekannt

! Falls ja, bitte angeben Material Vaginalabstrich

Rektovaginalabstrich unbekannt

verwendetes Kulturmedium (bitte angeben, was zutrifft)

selektive Anreicherungsmedium (Lim, eg) unbekannt

(modifizierte) Granada Agar Blut CNA

StrepB ID Agar (bioMérieux) StrepB Select Agar (BioRad)

und Ergebnis d. Kultur GBS positiv negativ unbekannt

! Falls positiv, bitte anderes Testverfahren angeben PCR Antigen-Test sonstiges

2. Wurde mütterliche GBS-Kolonisation zur Geburt gescreent? ja nein unbekannt

! Falls ja, bitte angeben Material Vaginalabstrich


und Ergebnis d. Kultur GBS positiv negativ unbekannt

! Falls positiv, bitte anderes Testverfahren angeben PCR Antigen-Test sonstiges

Anhang 73

Pränatale und Schwangerschaftsanamnese

3. Mütterliches Alter bei Geburt: __ __ Jahre 4. Anzahl Schwangerschaften: __ __

5. Anzahl Geburten: __ __

6. Zeitpunkt d. Blasensprungs vor Geburt <12h >12h und <18h >18h unbekannt

7. Geburtsmodus: vaginal vaginal + Zange vaginal + Vakuum

primäre Sectio sekundäre Sectio unbekannt

Falls Geburt durch Sectio: Beginn der Wehen vor der Sectio? ja nein unbekannt

Blasensprung vor der Sectio? ja nein unbekannt

8. Fieber unter der Geburt (T° > 38.0° C): ja nein unbekannt

9. GBS Bakteriurie während der Schwangerschaft? ja nein unbekannt

10. Vorheriges Kind mit invasiver GBS-Infektion? ja nein unbekannt

11. GBS-Testergebnisse bekannt zum Zeitpunkt der Geburt? ja nein unbekannt

Intrapartale Antibiotika

12. Wurden unter d. Geburt Antibiotika an Mutter gegeben? ja nein unbekannt

! Fall ja, bitte angeben: - Erste Dosis gegeben __ __ __ Stunden vor d. Geburt und Anzahl __ __ Dosen gegeben

vor Geburt.

- Folgende(s) Antibiotikum(a) wurde(n) gegeben:

Penicillin Ampicillin Cephalosporin

Clindamycin Erythromycin Vancomycin sonstige,

angeben …………………

- Applikationsweg IV IM PO

13. Was war der Grund für die mütterliche Antibiotikagabe intrapartal?

GBS Prophylaxe Sectio Prophylaxe V.a. (Chorio-) amnionitis

sonstiger, angeben ……………………. unbekannt

Anhang 74

Neugeborenen Outcome am 6. Lebenstag oder zum Zeitpunkt der Entlassung aus dem Krankenhaus (falls

vor 6. Lebenstag)

14. Zeichen einer invasiven GBS-Infektion? nein ja unbekannt

Serum der Schwangeren

15. Wurde Serum abgenommen? ja nein, bitte angeben warum:

……………………….……………………………………

GRUPPE B STREPTOKOKKEN

Erhaltenes Isolat

S. agalactiae Nachweis bestätigt kein S. agalactiae, sondern identifiziert als

……………………………….

nicht überlebt, nicht anzüchtbar kontaminierte Kultur

Kapsel-Serotyp

Ia Ib II III IV V IV VII VIII

nicht typisierbar

Pili Gene

MLST Typ

PFGE Muster

PCR-basierte Typisierung

Anhang 75

SEROLOGISCHE STUDIEN

ELISA

Opsonophagocytose Assay

Sonstiges

DEVANI-Projekt

Universitätsklinikum Freiburg

Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin bzw. Klinik für Geburtshilfe und Perinatologie

Mathildenstr. 1 bzw. Hugstetter Str. 55

79106 Freiburg

Anhang 76

8.2 Neugeborenen- Fragebogen

DEVANI Projekt - DEsign of a Vaccine Against Neontal GBS Infections

GRUPPE B STREPTOKOKKEN PERINATALE INFEKTION – FRAGEBOGEN (CASE REPORT FORM)

Name d. Kindes (Initialen d. Familien- und d. Vornamens): ________________ Krankenakten-Nummer d. Kindes:

_____________

Name d. Mutter (Initialen d. Familien- und d. Vornamens): ________________ Krankenakten-Nummer d. Mutter:

_____________

Name d. Krankenhauses: ________________________________

INFORMATIONEN ZUM KIND

1. Geburtsdatum: __ __ / __ __ / __ __ __ __ 2. Geburt außerhalb der Klinik?

ja nein unbekannt

FALLS JA, bitte angeben:

3. Zum Zeitpunkt der ersten Symptome, war das Hausgeburt Geburtshaus auf d. Weg i. Krankenhaus

Kind seit der Geburt hospitalisiert worden? unbekannt

ja nein 4. War das Kind von einem anderen Krankenhaus verlegt

ja nein

5. Datum d. ersten positiven GBS-Kultur vom Kind (Datum der Probenabnahme): __ __ /__ __ /__ __ __ __

6. Hat das Kind Muttermilch vor Infektionsbeginn bekommen? ja nein unbekannt

Geburtsanamnese

7. Schwangerschaftsalter i. vollendete Wochen: __ __ (nicht aufrunden) 8. Geburtsgewicht: __ . __ __ __ kg

9. Geschlecht: männlich weiblich

10. Apgar: nach 1 min __ __ nach 5 min __ __

11. Geburt bei Zwillingen: ja nein Falls JA, Geburtsreihenfolge: 1st 2

nd

Anhang 77

Klinische Zeichen der schweren Infektion und Diagnosen

12. Beginn d. Symptome: bei Geburt ja oder nach__ __ Stunden oder nach __ __ __ Tagen

13. Relevante Symptome bei Beginn der Klinik (bitte ankreuzen, was zutrifft):

Hypothermie Apnoen verminderter Refill Lethargie abdominelle Distension

Fieber Stöhnen Hypotension Irritabilität Diarrhoe

vermind. Nahrungsaufnahme Tachypnoe Tachykardie Krampfanfälle Erbrechen

graues Hautkolorit Zyanose Bradykardie Affektkrämpfe

Hepatosplenomegalie marmorierte Extremitäten Dyspnoe Schock vorgewölbte Fontanelle

Ikterus Oligurie (<1ml/kg/h)

14. Art d. Infektion verursacht durch GBS (bitte ankreuzen, was zutrifft):

Bakteriämie ohne Fokus Meningitis Multiorganversagen

Sepsis (Bakteriämie + klinische Zeichen d. Sepsis) Pneumonie Weichteilinfektion

Septischer Schock (Sepsis + Vasopressoren-Therapie) Osteomyelitis oder Arthritis

sonstige (angeben) ………………

Paraklinische Parameter der Infektion

Bakteriologie Blutbild bei Symptombeginn

16. Blutkultur(en), positiv für GBS: ja nein nicht abgenommen 19. Leukozytenzahl: _ _ , _ _ _ /mm³

nicht abgenommen unbekannt

17. Liquorkultur für GBS: positiv negativ nicht abgenommen 20. Neutrophilenzahl: _ _ , _ _ _ /mm³


18. Andere Stelle(n) von d. GBS isoliert wurden (bitte ankreuzen, was zutrifft): 21. Plättchenzahl: _ _ _ , _ _ _ /mm³


Pleuraflüssigkeit Magensaft

Trachealsekret (falls intubiert oder Lungeninfiltrate) 22. C-reaktives Protein

mukokutane Abstriche, angeben Anzahl: __ __ nicht abgenommen unbekannt

sonstige (angeben): …………………………………. bei Beginn: ________ mg/L

maximal: ________ mg/L Maximum an

Tag …… nach Beginn

Anhang 78

Röntgen - Thorax

23. pathologisch normal nicht durchgeführt Falls pathologisch, bitte ankreuzen, was zutrifft:

fokal Pleuraergüsse interstitielle Zeichnungsvermehrung Atemnotsyndrom Grad....º

sonstige (angeben): ………………………………….

Therapie und Outcome

24. Welche Art der medizinischen Betreuung war notwendig?

Neugeborenen-Intensivstation Neugeborenen-Station

25. Wurden Antibiotika gegeben?

ja, bei Geburt, prophylaktisch (< 72 h) ja, bei Geburt, therapeutisch (> 72 h) ja, bei Beginn d. Klinik

ja, an Tag ___ nach Beginn d. Klinik nein unbekannt

26. Outcome: Heilung Tod überlebt, mit neurologischen Schäden unbekannt

MÜTTERLICHE INFORMATIONEN

Schwangerschafts- und Geburtsanamnese

27. mütterliches Alter bei Geburt: __ __ Jahre 28. Anzahl Schwangerschaften: __ __

29. Anzahl Geburten: __ __

30. Wurde mütterliche GBS-Kolonisation i.d. Schwangerschaft gescreent? ja, durchgeführt in__ __.

Schwangerschaftswoche nein unbekannt

! Falls ja, bitte Material und Kulturergebnis angeben Vaginalabstrich


GBS positiv GBS negativ unbekannt

! Falls positiv, bitte anderes Testverfahren angeben PCR Antigen-Nachweis sonstiges

31. Wurde mütterliche GBS-Kolonisation zur Geburt gescreent? ja nein unbekannt

! Falls ja, bitte angeben GBS positiv GBS negativ unbekannt

32. Zeitpunkt d. Blasensprungs vor Geburt <12h >12h und <18h >18h

unbekannt

Anhang 79

33. Geburtsmodus: vaginal vaginal+ Zange Vaginal + Vakuum

primäre Sectio sekundäre Sectio unbekannt

Falls Geburt durch Sectio: Beginn der Wehen vor der Sectio? ja nein unbekannt

Blasensprung vor der Sectio? ja nein unbekannt

34. Fieber unter der Geburt (T° > 38.0° C): ja nein unbekannt

35. GBS Bakteriurie während der Schwangerschaft? ja nein unbekannt

36. Vorheriges Kind mit invasiver GBS-Infektion? ja nein unbekannt

37. GBS-Testergebnisse bekannt zum Zeitpunkt der Geburt? ja nein unbekannt

Intrapartale Antibiotika

38. Wurden unter d. Geburt Antibiotika an Mutter gegeben? ja nein unbekannt

! Falls ja, bitte angeben: - Erste Dosis gegeben __ __ __ Stunden vor d. Geburt und Anzahl __ __ Dosen

gegeben vor Geburt.

- Folgende(s) Antibiotikum(a) wurde(n) gegeben:

Penicillin Ampicillin Cephalosporin

Clindamycin Erythromycin Vancomycin

sonstige, angeben …………………

- Applikationsweg IV IM PO

39. Was war der Grund für die mütterliche Antibiotikagabe intrapartal?

GBS Prophylaxe Sectio Prophylaxe V.a. (Chorio-) amnionitis

sonstiger, angeben ……………………. unbekannt

Mütterliches Serum

40. Wurde mütterliches Serum abgenommen? ja nein, bitte angeben warum:

……………………….…………………………………

Anhang 80

GRUPPE B STREPTOKOKKEN

Erhaltenes Isolat

S. agalactiae Nachweis bestätigt kein S. agalactiae, sondern identifiziert als ……………………….

nicht überlebt, nicht anzüchtbar kontaminierte Kultur

Kapsel-Serotyp

Ia Ib II III IV V IV VII VIII

nicht typisierbar

Pili Gene

MLST Typ

PFGE Muster

PCR-basierte Typisierung

SEROLOGISCHE STUDIEN

ELISA

Anhang 81

Opsonophagocytose Assay

Sonstiges

DEVANI-Projekt

Universitätsklinikum Freiburg

Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin bzw. Klinik für Geburtshilfe und Perinatologie

Mathildenstr. 1 bzw. Hugstetter Str. 55

79106 Freiburg

Erklärung 82

9 Erklärung

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne

Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen

direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle

gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs-

bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen.

Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten,

die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Leonie Karstens

Freiburg, den 28. Juni 2011

Danksagung 83

Danksagung

Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen bedanken, die zur Entstehung und dem Gelingen

dieser Arbeit beigetragen haben.

Priv.-Doz. Dr. med. Markus Hufnagel danke ich herzlichst für die Betreuung der

vorliegenden Dissertation. Seine stete Unterstützung, Förderung und Gesprächsbereitschaft

waren essentiell für die Entstehung dieser Arbeit. Danke für die tolle Arbeitsatmosphäre.

Prof. Dr. med. Reinhard Berner danke ich für die Vergabe des Dissertationsthemas und

dafür, dass er mir damit einen Teil des DEVANI-Projekts anvertraute.

Prof. Dr. med. Heinrich Prömpeler danke ich herzlichst für die Erstellung des

Zweitgutachtens.

Dr. med. Mirjam Kunze danke ich für ihre Unterstützung und Betreuung in der

Universitätsfrauenklinik, sowie für die vielen lebhaften Gespräche, Diskussionen und

Anregungen.

Ursula Schmidt, Käthe Brell, Susanne Fukala und Rainer Schwab danke ich von Herzen

für die Einarbeitung im Bakteriologischen Labor und dafür, dass sie mir immer mit Rat und

Tat zur Seite standen.

Anita Imm und Anna Büchele danke ich für ihre stete Hilfe und die Durchführung der

Serotypisierung. Auf sie war einfach in jeder Situation Verlass.

Florentin und meiner Familie danke ich für ihre liebevolle Unterstützung und dafür, dass sie

mich durch alle Höhen und Tiefen der Promotion begleitet haben.

Date post:	18-Dec-2021
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Klinische Epidemiologie, Serotypenverteilung und ...

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