Polymerase Chain Reaction
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Inhaltsverzeichnis
1 Theoretischer Hintergrund - 2 -
1.1 Die Komponenten der PCR - 2 -
1.2 Das Verfahren der PCR - 3 -
1.3 Die Gelelektrophorese - 5 -
2 Material und Methoden - 6 -
3 Ergebnisse - 7 -
3.1 Ergebnisse durch das Internet - 7 -
3.2 Ergebnis der Gelelektrophorese - 8 -
4 Diskussion - 8 -
5 Literaturverzeichnis - 8 -
Polymerase Chain Reaction
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1 Theoretischer Hintergrund
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine der gebräuchlichen Methoden, viele Kopien eines bestimmten DNA- Fragments herzustellen. Diese Amplifizierungsmethode wurde 1985 von Kary Mullis entwickelt und ist viel schneller als die Klonierung mithilfe eines Plasmids oder eines Phagen und wird ausschließlich in vitro durchgeführt. Durch die anschließende Gelelektrophorese werden die vervielfältigten Fragmente sichtbar gemacht und können mit anderen Fragmenten verglichen werden. Diese Methoden finden Anwendung in der Kriminalistik (s. Abb. 2), in der Medizin zur Diagnostik von Erbkrankheiten und zum Nachweis von Virus- oder Bakterieninfektionen (z.B. bei HIV), in der Gerichtsmedizin und bei vielen Verfahren der Molekular- und Mikrobiologie (Isolierung und Amplifizierung gesuchter DNA-Sequenzen aus genomischer DNA oder cDNA-Genbibliotheken).
1.1 Die Komponenten der PCR
Um DNA mit Hilfe einer PCR vervielfältigen zu können, benötigt man zum Reaktionsstart Oligonukleotide (=Primer), an deren Ende die Synthese des neuen Strangs beginnt. Da bei der PCR beide Stränge vermehrt werden sollen, benötigt man für jeden Strang einen Primer, der zu einem Sequenzbereich auf dem jeweiligen Strang komplementär ist. Man wählt die Primer so, dass die DNA-Synthese an beiden Strängen gegenläufig erfolgt und genau der DNA-Bereich amplifiziert wird, der zwischen den beiden Primern liegt. Die DNA Polymerasen müssen nur einmal (zu Reaktionsbeginn) zugesetzt werden, da sie thermostabil sind. Diese sind durch unterschiedliche Eigenschaften charakterisiert:
� Taq-Polymerase: die in unserem Versuch verwendete Taq-Polymerase (Enzym aus Thermus aquaticus) zeichnet sich durch seine hohe Effektivität aus (DNA-Synthese mit einer Geschwindigkeit von 35 – 100 Nukleotiden pro Sekunde).
� Vent-Polymerase: die Vent-Polymerase zeichnet sich durch eine 3`zu 5 ` - Exonucleaseaktivität aus, die für eine größere Kopiergenauigkeit (als z.B. bei derTaq-Polymerase) sorgt.
Die Taq- und die Vent- Polymerase sind nur zwei Beispiele für hitzestabile DNA Polymerasen, die bei der PCR verwendet werden.
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Die Polymerasen bilden aus einzelnen Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs), die extra zugegeben werden müssen, lange Polynukleotidketten; mit ihnen wird ein zum Matrizenstrang komplementärer Strang synthetisiert. Diese Synthese erfolgt immer von 5`zu 3`-Richtung. Neben der DNA bzw. den Primern, den freien Nukleotiden und der DNA-Polymerase muss der PCR-Ansatz noch Puffer und eine für das Enzym geeignete Mg2+-
Konzentration enthalten.
1.2 Das Verfahren der PCR Die PCR besteht aus drei sich mehrfach zyklisch wiederholenden Reaktionsschritten, der Denaturierung, der Primeranlagerung (annealing) und der DNA-Synthese (s. Abb. 1). Die drei Reaktionsschritte eines PCR-Zyklus:
� Denaturierung (1): Um die beiden DNA-Stränge trennen zu können, wird der Reaktionsansatz mit der DNA kurzzeitig auf 95°C erhitzt und dann abgekühlt.
� Anlagerung der Primer (2) (annealing): Die im Überschuss vorhandenen Primer binden über Wasserstoffbrücken mit den komplementären Bereichen der zu vervielfältigenden DNA. Die für diesen Prozess geeignete Temperatur variiert in weiten Bereichen und ist stark von der Basenzusammensetzung der Hybridisierungsbereiche abhängig. Die Hybridisierungstemperatur sollte möglichst hoch sein (ca. 65°C), da es bei niedrigeren Temperaturen vermehrt zu Hybridisierungen der Stränge untereinander kommt. Außerdem paaren sich die Primer bei höheren Temperaturen spezifischer.
� DNA-Synthese (3): Ausgehend vom 3`-OH-Ende der Primer synthetisiert die Polymerase den neuen DNA Strang, indem sie den längeren Strang als Vorlage benutzt. Die Temperatur bei diesem Reaktionsschritt entspricht der optimalen Temperatur der Polymerase und liegt im Falle der Taq-Polymerase bei etwa 72°C. Die Dauer eines PCR-Zyklus richtet sich nach der Länge der zu vervielfältigenden DNA Sequenz.
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Abbildung 1: Ablauf der PCR [aus: Biologie, N. Campbell, 2000; S. 412]
Da die Zahl der DNA-Moleküle in jedem Zyklus verdoppelt wird und die neusynthetisierten Stränge im darauf folgenden Zyklus ebenfalls als Vorlage dienen, findet eine exponentielle Vervielfältigung der DNA statt. Ein PCR-Zyklus wird in der Regel 38 – 40-mal wiederholt. Nach diesem Zeitraum nimmt die Aktivität des Enzyms ab, da es durch die ständige Hitzezufuhr anfängt, zu denaturieren. Außerdem potenzieren sich mit der Zeit die selten auftretenden Mutationen der Replikation und Gift- oder Hemmstoffe die dadurch abgelesen werden, können sich ebenfalls potenzieren.
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1.3 Die Gelelektrophorese Bei der Elektrophorese erfolgt die Auftrennung der DNA durch die Wanderung der negativgeladenen DNA-Moleküle in einem elektrischen Feld das an eine Gelmatrix (z.B. Agarosegel) angelegt wurde. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist dabei abhängig von der Form und Größe der jeweiligen DNA-Moleküle: kleine Fragmente bewegen sich schneller durch das Gel als große. Das bedeutet, dass gleich große Fragmente gleich schnell wandern, sie sich nach Beenden der Elektrophorese auf derselben Höhe befinden und eine Bande bilden. Das Bandenmuster gibt Aufschluss über die Anzahl und die Länge der DNA-Fragmente. Wenn die Größe der unbekannten DNA-Fragmente ermittelt werden soll, muss außerdem noch ein Gemisch aus DNA-Fragmenten bekannter Größen als Marker aufgetragen werden. Damit die einzelnen Banden unter UV-Licht deutlich erkennbar sind, wird die DNA mit Ethidiumbromid, das im UV-Licht fluoresziert, angefärbt. EtBr lagert sich in die aromatischen Ringsysteme der Basen von Nukleinsäuren ein und leuchtet beim Bestrahlen mit UV- Licht.
Abbildung 2: Gelelektrophorese aus der Praxis[aus: Biologie, N. Campbell, 2000; S. 422]
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2 Material und Methoden Da man in diesem Versuch mit sehr geringen Mengen arbeitet, wurde zunächst für jede eingesetzte „Oligoart“ (mitochondriale, chloroplastidäre und nukleäre) ein Master- Mix hergestellt. Die Bestandteile und ihre Mischungsverhältnisse kann man anhand Tabelle 1 erkennen. Nun wurden zuerst 49µl von diesem Master- Mix (der unterschiedlichen Oligoarten) in Eppendorfgefäße pipettiert und dann zu jeder der drei Proben 1µl der jeweiligen DNA- Proben (einer DNA- Art) hinzu gegeben. Als Negativkontrolle dienten 50µl Master- Mix. Dann wurden alle Proben auf Eis gestellt. Die PCR- Maschine wurde wie folgt programmiert: - Einmaliger Denaturierungsschritt: 5min 95ºC - Widerholungsprogramm: 45sec Denaturierung 95ºC 35sec Hybridisierung 50ºC 35sec Synthese 72ºC - Synthese nochmals 3min bei 72ºC. Tabelle 1: Zusammensetzung der Master- Mixe [µl] cox 18S P
H2O 150,8 126,8 190,2 Puffer 20 20 30 dNTP 8 8 12 Primer 1 8 20 30 Primer 2 8 20 30 taq 1,2 1,2 1,8 Während des PCR- Vorganges wurde das Agarosegel für die Gelelektrophorese vorbereitet. Hierzu wurden 1,8g Agarosepulver eingewogen und in einen Erlenmeyerkolben mit Rührfisch gegeben. Zu diesem Pulver wurden dann 150ml TBE- Puffer gegeben und das Ganze in der Mikrowelle erhitzt. Hierbei muss man darauf achten, dass das Gemisch nicht über den Gefäßrand steigt. Deshalb wird das Erhitzen mehrere Male unterbrochen. Es wird solange erhitzt, bis sich das Pulver vollständig gelöst hat. Danach wird die Agarose- TAE- Lösung unter kaltem Wasser und ständigem schütteln abgekühlt, bis es handwarm ist. Nun wurden 6µl Ethidiumbromid (EtBr) hinzugefügt.
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EtBr lagert sich in die aromatischen Ringsysteme der Basen von Nukleinsäuren ein und leuchtet beim Bestrahlen mit UV- Licht. Diese Lösung wurde nun in einen Gelschlitten, der zwei Kämme enthielt, gegossen. Nach Beendigung des PCR- Vorgangs wurden aus jedem Eppendorfgefäß 10µl DNA- Proben entnommen und mit 6µl Ladepuffer vermischt. Diese Lösung wurde dann in die einzelnen Geltaschen bei der Kathode aufgetragen, die durch die Kämme entstanden. Zur Bestimmung der Länge, der später durch UV- Licht sichtbar gewordenen DNA, wird in eine Geltasche ein Marker mit bekannter Länge aufgetragen. Dabei wurde die Gelelektrophorese der zwei Gruppen auf einer Gelmatrix aufgetragen. Unser Teil befindet sich im oberen Abschnitt. Die Gelelektrophorese wurde bei 130V für etwa eine Stunde durchgeführt.
3 Ergebnisse
3.1 Ergebnisse durch das Internet Gibt man die Primer-Sequenzen im Internet auf der Seite National Centers for Biotechnology Information ein und die Art des Organismus, welchem die DNA gehört, liefert das Programm für unsere DNA-Fragmente folgende Ergebnisse: Mitochondriale DNA: 424 Basenpaare Chloroplastidiäre DNA: 595 Basenpaare Nukleäre DNA: 485 Basenpaare
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3.2 Ergebnis der Gelelektrophorese Die DNA-Fragmente wurden von einander durch die Gelelektrophorese abgetrennt. Unser Bild im Anhang war das Ergebnis, welches man unter UV-Licht sichtbar machen konnte. Im oberen Teil kann man erkennen, dass links eine Bande ein bisschen unterhalb der Referenz-Bande (die sehr helle Bande rechts) liegt. Diese Bande ist für die 500 Basenpaar DNA-Fragmente spezifisch. Bei allen drei DNA- Proben kann man ganz am Ende der Laufbahn noch eine verschwommene, breite Bande erkennen, welcher keine spezifische Referenz-Bande mehr zugeordnet werden kann, das sind so genannte „Primerwolken“. Weitere Banden sind nicht zu erkennen.
4 Diskussion Die linke Bande, die etwas unterhalb der 500 Basenpaare-Bande liegt, gehört zu der mitochondrialen DNA, welche laut Genbank bei einem Wert von 424 Basenpaaren liegen sollte. Dies können wir mit unserem Ergebnis ebenfalls behaupten, da die Fragmente um 76Bp kleiner sind als die Fragmente der 500Bp-Referenz-Bande, und deshalb auch etwas weiter in Richtung Anode laufen können. Die restlichen drei Banden, die sich bei jeder DNA-Probe ganz am Ende des Gels befinden, sind Überreste von Primern, Nukleotiden (die nicht verbraucht wurden) und andere Stoffe die zu klein waren um im Gel aufgehalten zu werden. Gründe dafür, dass man keine weiteren Banden außer dieser vier erkennen kann, könnte zum einen ungenaues Pipettieren sein, zum anderen, dass die Proben durch das Eis nicht gut genug gekühlt wurden, oder vorher zu langsam gearbeitet wurde, so dass sich die Proben zu stark erwärmten. Da die Lösungen für die Nukleotide nicht für jeden Versuch erneuert werden, könnte es auch der Fall sein, dass schon einige Nukleotide inaktiv bzw. zerstört wurden.
5 Literaturverzeichnis
N. Campbell; Biologie; 2000 Schopfer, Brennicke; Pflanzenphysiologie; 1999 Biochemie; Karlson; 1994 Skript zum Grundpraktikum SS 2005
