Dr. Yvonne Pfeifer
Extended-Spectrum Beta-Lactamasen (ESBL) und Carbapenemasen
Antibiotikaresistenz- Mechanismen der Entstehung, Ausprägung und Ausbreitung
06./07.04.2009
Bad Honnef-Symposium 2009
Gramnegative, nosokomiale Erreger als Beta-Lactamase-Bildner
Escherichia coli
Enterobacter ssp.Citrobacter ssp.
Providencia ssp.Pseudomonas aeruginosa
Klebsiella ssp.Harnwegsinfektionen, UrosepsisWundinfektionen, Bakteriämie, Sepsis
Infektion der Atemwege/Nosokomiale Pneumonie
●
●
●
Resistenzen:Beta-Lactam-Antibiotika
Chinolone (Ciprofloxacin, Ofloxacin)
Aminobenzylpenicilline (Ampicillin)Cephalosporine (Cefoxitin, Ceftriaxon, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefepim)
Carbapeneme (Ertapenem, Imipenem, Meropenem)Monobactame (Aztreonam)
Sulfomamide (Sulfamethoxazol/Trimethoprim)Aminoglycoside (Amikacin, Gentamicin,)
Acinetobacter baumannii
Morganella ssp.
●
●
●
●
6-Aminopenicilliansäure
Einteilung der β-Lactamasen nach Ambler (DNA-Sequenz basiert)
Serine-β-lactamases Metallo-β-lactamases
Ambler classes A C D BGeneral designation ESBL AmpC OXA Metallo-β-lactamases
Important examples
•TEM-1, TEM-2 SHV-1 •TEM-type ESBL•SHV-type ESBLCTX-M
•KPC•GES•SME
AmpC enzymes:•CMY•MOX•ACC•DHA
•OXA-type ESBL
•OXA-typecarbapenemases
carbapenemases•VIM
•IMP
Preferential occurrence Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae,
A. baumanniiA. baumanniiP. aeruginosa
Important phenotypical resistance traits
penicillins,cefotaxime,ceftazidime,cefpodoxime,
penicillinscephalosporins,imipenem,meropenem,ertapenem
penicillinscefoxitincefotaximeceftazidimecefpodoxime
oxacillin, cefotaxime,ceftazidime,cefpodoxime
penicillins,cephalosporinsimipenem,meropenem,ertapenem
penicillins,several cephalosporins,imipenem,meropenem,ertapenem
Diagnostik: Phänotypische Resistenzbestimmung ESBL
Mikrobouillonverdünnungstest für den ESBL-Nachweis•
Fähigkeit zur Hydrolyse von 3. Generation CephalosporinenHemmbarkeit durch ß-Lactamase Inhibitoren (z.B. Sulbactam)
ESBL
CTX CAZ CPD CTX/SUL CAZ/SUL CPD/SUL(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
(G)
(H) 0,510,510,510,510,510,51
0,2520,2520,2520,2520,2520,252
0,12540,12540,12540,12540,12540,1254
0,06380,06380,06380,06380,06380,0638
0,032160,032160,032160,032160,032160,03216
0,016320,016320,016320,016320,016320,01632
0,008640,008640,008640,008640,008640,00864
WK128WK128WK128WK128WK128WK128
0,510,510,510,510,510,51
0,2520,2520,2520,2520,2520,252
0,12540,12540,12540,12540,12540,1254
0,06380,06380,06380,06380,06380,0638
0,032160,032160,032160,032160,032160,03216
0,016320,016320,016320,016320,016320,01632
0,008640,008640,008640,008640,008640,00864
WK128WK128WK128WK128WK128WK128ESBL-positiv:
MHKCeftazidim o. Cefotaxim ≥ 2 μg/ml
MHKCefpodoxim ≥ 8 μg/ml
Quotient aus MHKCephalosporinund MHKCephalosporin. + Inhibitor ≥ 8
Bestätigungstests
Beta-Lactamase-Typ und Phänotypische Resistenz
Veränderung des Phänotyps durch Kombination von verschiedenenBeta-Lactamasen und weiteren Resistenzmechanismen
Molekulare Diagnostik (Resistenz-Genotyp) erforderlich
AP, Ampicillin; CPD, Cefpodoxim; CTX, Cefotaxim; CAZ, Ceftazidim; FOX, Cefoxitin; SUL, Sulbactam; CLV, Clavulansäure; ETP, Ertapenem; R, Resistent; V, variabel; S, sensitiv
Antibiotika Hemmbarkeitβ-Lactamase AP CPD CTX CAZ FOX ETP
SSS
S
SR
SUL, CLV, EDTATEM ESBL R R V R S SUL, CLVSHV ESBL R R V R S SUL, CLVCTX-M-ESBL R R R V S SUL, CLVK1 (K. oxytoca) R R V S S -
AmpC R R R R R -MBL R R R R R EDTA
Verbreitung der Resistenz gegen Cephalosporine und gegen Carbapeneme
Horizontaler Gentransfer - Übertragung von konjugativen Plasmideninnerhalb der Spezies oder in andere Spezies
●
Ausbreitung von Resistenz-Plasmiden zwischen verschiedenen Isolaten
BA
A DonorB Rezipient
Mobilisierung chromosomaler „Vorläufer-Gene“ (z.B. CTX-M) über, Integrons, Transposons und Integration in Resistenzplasmide
●
„Akkumulation“ von verschiedenen Resistenzgenen auf mehreren MGEs (Transposons) hintereinander möglich:
●
multi-drug resistance regions (MDR) Multiresistente Erreger (MRE)
● Klonale Ausbreitung resistenter Stämme
Molekulare Nachweismethoden
PCR-Amplifikation und Sequenzierung der bla-Gene
ESBL-Multiplex-PCRM 1 2 3 4 5 MP
blaSHV
blaTEM
Oligonukleotid-Microarray zur Beta-Lactamase Identifikation
Universalprimer erfassen nahezu alle Genvarianten eines Beta-Lactamase TypesGesamt-Gen Sequenzierung nötig für epidemiologische Untersuchungen
CTX-M-Multiplex-PCR
CTX-M-1-typeCTX-M-2-typeCTX-M-9-typeCTX-M-14 spez.
M 1 2 4
spezifisch
schnellsensitiv
●
●
●
teuer!●
●
●
MP3
blaCTX-M
2 3 41 5 MPM
AmpC-Multiplex-PCR
CMY C.f.DHA M.m.ACC H.a.EBC E.cl.MOX A.h.
S241: agc Ser
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
S163 S163.2 S180 S182 S194 S194.2 S202 S216 S235 S235.2 S236 S236.2 S237 S241 S241.2 S258 S261 S264 S271 S272 S276
rel.
inte
nsity
(RI)
A
G
C
T
Die Frage nach der Verwandtschaft:
Molekulare Epidemiologie
Makrorestriktionsanalyse (PFGE)Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST)
●
Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
CTX-M-15CTX-M-15
CTX-M-1; CTX-M-15
CTX-M-1; CTX-M-1;
CTX-M-65; CTX-M-15;
CTX-M-15; CTX-M-15
TEM-1TEM-1
TEM-1
TEM-1TEM-1TEM-1
ESBL
●
FIIFII
FII
FII
FIII1
Inc-group
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
tnpAblaCTX-M hypBhypAΔmrxΔmph(A) ΔORF2
IS26ΔISEcp1
IR-R IR-RIR-R IR-L
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
tnpAblaCTX-M hypBhypAΔmrxΔmph(A) ΔORF2
IS26ΔISEcp1
IR-R IR-RIR-R IR-L
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
tnpAblaCTX-M hypBhypAΔmrxΔmph(A) ΔORF2
IS26ΔISEcp1
IR-R IR-RIR-R IR-L
PCR-Nachweis der Plasmid-Inkompatiblitätsgruppen und Analyse der„genetic environment“:
●
Resistenz-Übertragbarkeit
Konjugationsexperiment: Übertragung der Resistenzplasmide in einen sensitiven Rezipienten
BAA Donor: Resistenz
B Rezipient: ResistenzblaESBL
gegen Ampicillin
gegen Natriumazid
S 1 2 3 4 5 6 S 7 8 9 10 11 S12
3 E. coli 335/07 CTX-M-14 + TEM-110 + SHV-12 4 E. coli K 335/07 CTX-M-14
7200 bp
53000 bp
2100 bp
6000 bp
3000 bp
3900 bp
5550 bp5100 bp
2700 bp
Plasmidisolation
Southern Hybridisierung
7200 bp
53000 bp90000 bp
2100 bp
6000 bp
3000 bp3900 bp
5550 bp5100 bp
2700 bp
1 2 M 1 2 M
1 K. pneumoniae CTX-M-9, CMY-4, VIM-12 E. coli K CMY-4, VIM-1
EARSS - European Antimicrobial Resistance Surveillance System
Verbreitung der Cephalosporin-Resistenz bei Enterobakterien
No data*
< 1%
1 - 5%
5 - 10%
10 - 25%
25 - 50%
> 50
Proportion of invasive isolates of Escherichia coli with resistance to third generationcephalosporins in 2006 (http://www.rivm.nl/earss/ on 28th Feb 2009)*These countries did not report any data or reported less than 10 isolates
E. coli und K. pneumoniae mit ESBL
0
2
4
6
8
10
12
14
E. coli K. pneumoniae
ESBL
Rat
e in
%200120042007
-PhänotypResistenzstudie der PEG (Paul-Ehrlich-Gesellschaft e.V.)
Antibiotika-Resistenz-Surveillance in Deutschland
ARS-ESBL-Projekt 2008
Molekulare Untersuchung von ESBL Isolaten aus mehr als 100 beteiligten Kliniken in ganz Deutschland:
Escherichia coliKlebsiella pneumoniaeKlebsiella oxytoca
(Proteus mirabilis)
n = 1n = 1n = 1n = 1
Erkennen von „Resistenz-Trends“ (Frühwarnfunktion)
Molekulare Diagnostik und deren Weiterentwicklung
Untersuchung zu Vorkommen und Verbreitung von ESBL-Typennosokomialer Enterobacteriaceae in Deutschland
Cephalosporin- und Carbapenemresistenz in Enterobacteriaceae
Isolate mit ESBL-Phänotyp aus Blutkultur, Wundabstrichen, Trachealsekret
2004 2008no. of strains n = 49 no. of strains n = 154no. of hospitals n = 29 no. of hospitals n = 150TEM type n = 7 TEM type n = 6SHV type n = 2 SHV type n = 3CTX-M type n = 40 (81 %) CTX-M type n = 143 (93 %)CTX-M-1 n = 10 CTX-M-1 n = 50CTX-M-2 n = 2 CTX-M-2 n = 4CTX-M-3 n = 7 CTX-M-3 n = 1 CTX-M-9 n = 7 CTX-M-9 n = 2CTX-M-14 n = 2 CTX-M-14 n = 10CTX-M-15 n = 11 (27,5%) CTX-M-15 n = 76 (53 %)
Deutschland: ESBL in nosokomialen E. coli
Antibiotikaresistenz-Surveillance (ARS): ESBL-Projekt 2008
ca. 70-80% aller ESBL Isolate resistent gegen Sulfonamide und Fluorchinolone
Untersuchung von “Ausbruchs- Isolaten”
23 E. coli aus der Neonatologie/ Neointensivstation mit ESBL-Verdacht
RKI-Nr. Herkunft bla-Gen (ESBL-MP-PCR)
165/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
166/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
167/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
168/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
169/07 Kind CTX-M-2
170/07 Kind CTX-M-2
171/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
172/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
173/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
174/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
175/07 Kind CTX-M-15
176/07 Kind CTX-M-15
177/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
178/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
179/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
180/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
181/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
182/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
183/07 Mutter TEM-1 + CTX-M-1
184/07 Personal TEM-1 + CTX-M-15
20/08 (1) Mutter TEM-1 + CTX-M-15
20/08 (2) Mutter TEM-1 + CTX-M-15
21/08 Personal TEM-1 + CTX-M-15
●
Klonale Verbreitung innerhalb der StationCTX-M-15 als häufigste ESBL-Variante●
●
KLUC-1
CTX-M-10
CTX-M-3
CTX-M-28CTX-M-15CTX-M-22
CTX-M-23CTX-M-1
CTX-M-21CTX-M-17CTX-M-24
CTX-M-14
CTX-M-9CTX-M-16
CTX-M-7
CTX-M-4
CTX-M-20
KLUA-Enzyme
KLUG-1CTX-M-8
CTX-M-25CTX-M-26
CTX-M-6
CTX-M-2
CTX-M-1 Gruppe> 97 % Sequenz-Identität
CTX-M-9 Gruppe> 98 % Sequenz-Identität
CTX-M-2 Gruppe> 94 % Sequenz-Identität
CTX-M-8 Gruppe> 98 % Sequenz-Identität
CTX-M-25 Gruppe> 98 % Sequenz-Identität
KLUC-1 Gruppe[AAK08976]
[AAF65843]
[BAB40925]
[AJ549244]
[AAL02127]
[AAL86924]
[AAL99990][P28565]
[CAD08929]
[AAM33515]
[AAN38836]
[AAF72530]
[AAF05311]
[AAK32961]
[CAA06312]
[CAA74573]
[CAC95175]
[AAF04388]
[AAM70498]
[AY157676]
[CAA06311]
[P74841]
[CAB59824]
[AF501233]
Plasmid-Transfer zwischen verschieden Spezies
ESBL-Screening von Patienten einer Klinik:
Gleichzeitige Besiedlung mit E. coli und Klebsiella pneumoniae
●
Spezies Beta-Lactamase Spezies Beta-LactamaseE. coli TEM-1 + CTX-M-3 K. p. SHV-11 + CTX-M-3E. coli TEM-1 + CTX-M-15 K. p. TEM-1 + SHV-32 + CTX-M-15E. coli TEM-1 + CTX-M-1 K. p. TEM-1+ CTX-M-1
Konj. TEM-1
Konj. CTX-M-1
E. c. TEM-1 + CTX-M-1
M = Plasmidstandard V517 E. coli
K.p. TEM-1 + CTX-M-153000 bp
E.c. Konj. M K.p. Konj.Konjugation, Plasmidisolation:
ESBL in Salmonella spp.
●
1 = 6/07 CTX-M-1 + TEM-1 2 = 7/07 CTX-M-1 + TEM-13 = 8/07 CTX-M-1 + TEM-14 = 9/07 CTX-M-1 + TEM-15 = 10/07 CTX-M-1 + TEM-16 = 11/07 CTX-M-1 + TEM-17 = 12/07 CTX-M-1 + TEM-1
BayernBayernNiedersachsenThüringenThüringenSachsen-AnhaltBayern
16 humane Isolate Salmonella entericaserovar Typhimurium, Lysotyp DT193aus fünf Bundesländern
● Gastroenteritis,Harnwegsinfektion
1 2 3 S 4 5 7 S6SXba-I-Makrorestriktionsanalyse (PFGE)
Salmonella ein mögliches ESBL-“Reservoir“?● Leichte Übertragbarkeit der
Resistenzplasmide
● Nachweis des Stammes in Isolaten aus Schweinekot
S = S. enterica Braenderup universal marker
● Erstmaliger Nachweis von „importiertem“ Salmonella Typhi mit CTX-M-15 ESBL und übertragbarer Chinolonresistenz (Qnr-Determinanten)
Ambler-Klasse C: AmpC-β-Lactamasen
Plasmid-kodierteAmpC-β-Lactamasen
Konstitutive o. induzierbare high-level Expression des Wildtyp ampC Gens in E. cloacae, Citrobacter freundii
●
Chromosomal-kodierteAmpC-β-Lactamasen
High-level Expression durch Mutationen im E. coli ampCPromoter
●
Klonale Verbreitung, Konvergente Evolution
CMYACC ACT
FOX LAT MOX
● High-level Expression z.B. in E. coli ; K. pneumoniae
6 Gen-Familien abgeleitet von verschiedenen Ursprungsspezies
●
Verbreitung durch horizontalen Gentransfer
„Cefoxitin-Markerresistenz“Cephalosporinresistenz
„Cefoxitin-Markerresistenz“Cephalosporinresistenz
Cephalosporin-Resistenz in E. coli
WT AmpC* TATGGCGGGCCGTTTTGTATGGAAACCAGACCCTATGTTCAAAACGACGCTCTGCGCCTTATTAAT
WT AmpC* TCCTGACAGTTGTCACGCTGATTGGTGTCGTTACAATCTAACGCATCGCCAATGTAAATCCGGCCCGCC-42 -35box -18 -10box -1
+58
108/04 --T-----------------------A----------------T-------------------------
108/04 --------------------------------T---------------------------------
67/04 ------------A---A----------------T-----------------------------------
67/04 ---------D----------------------T----------------------A----------
99/04 -------------------------I---------------------------------------T---
99/04 --------------------------------------------T---------------------
High-Level Expression der Spezies-eigenen AmpC-β-Lactamasedurch Mutationen der chromosomalen ampC Promoter Region
•
Plasmid-kodierte AmpC-β-Lactamasen: CMY-type Enzyme am häufigsten → Resistenz gegen Cefoxitin + 3.Gen Cephalosporine, nicht hemmbar
•
ESBL-Bildung: TEM, SHV, CTX-M (Kombination TEM-1 + CTX-M häufig) → Resistenz gegen 3. Gen Cephalosporine, hemmbar durch Inhibitoren
•
Y. Pfeifer, Epidem. Bull. 28/2007
EARSS-Report http://www.rivm.nl/earss/ on 28th Feb 2009
Carbapenemresistenz und Carbapenemasen
Das noch sehr seltene Auftreten (in Deutschland unter 1% der Isolate) muss sehr ernst genommen werden; die Erreger sind resistent gegen fast alle verfügbaren Antibiotika; die damit verbundenen Infektionen enden oft tödlich !
Beispiel:Klasse A Carbapenemasen
weltweite Ausbreitung des Gens für die Carbapenemase KPC-2
KPC-2 in K. pneumoniae1998 USA2004 China2005 Kolumbien2005 Frankreich 2005 Israel2008 Griechenland2008 Deutschland
C. Wendt, Epidem. Bull. 22/2008
Multiresistente Acinetobacter baumannii und Enterobacteriaceae
Ausbrüche in einer Klinik 2007: Carbapenemase-bildende A. baumannii mit schwerem Infektionsverlauf
PCR-Nachweis der Gene blaOXA-23 und blaOXA-58
●
TGTACAGAGISAbal
AAGTCTTATGAACATT….7 bases blaOXA-51-like
Turton et al., FEMS Microbiol. Lett. 2006; 258: 72-77
Ambler Klasse D: OXA-β-Lactamasen und Carbapenemresistenz
Überexpression der chromosomalenOXA-51-like Beta-Lactamase:
A. baumannii Einzelisolate von oft zuvor im Ausland hospitalisierten Patienten:●
Übertragbare Carbapenemresistenz: OXA-23; OXA-24; OXA-48; OXA-58
Klonale Verbreitung:
Ambler Klasse B: Metallo-β-Lactamasen
Mobilisierung der Gene blaVIM und blaIMP aus Acinetobacter baumannii und Pseudomonas aeruginosa und Transfer in Enterobacteriaceae
Carbapenemresistenz und Multiresistenz in Enterobacteriaceae durch Kombination der Beta-Lactamase-Bildung mit anderen Resistenzmechanismen:
●
●
1, 2bp-Deletion → STOP in ompK-352, 384 bp-Deletion in ompK-363, 600 bp-Deletion in ompK-36
Carbapenem-Resistenz und Porin-Verlust
OMP – outer mebrane protein (OmpA-Trimer)
Antibiotika K.p. 5 K.p. 54 K.p. 149Imipenem 16 2 2Imipenem/EDTA ≤ 1 1 1Meropenem 32 4 2blaTEM - - -blaSHV 1 5 1blaCTX-M - - 15blaampC - - -blaVIM 1 - -qnr-Gen - qnr-B -Porin OmpK35 -1 + +Porin OmpK36 + -2 -3
Auftreten multiresistenter K. pneumoniae (n = 4) in zwei Kliniken mit Resistenzen gegenüber allenverfügbaren Antibiotika außer Colistin und Tigecyclin
Beta-Lactamase Gen (bla)K.p. 62 K.o. 57
blaTEM - -
blaSHV 1 -
blaCTX-M 9 -
blaampC CMY-4 -
blaVIM 1 1qnr-Gen - qnr-BPorin OmpK35 - a - b
Porin OmpK36 + - b
a, IS1-Transposase in ompK-35; b, bp-DeletionenY. Pfeifer, Epidemiol. Bull. 14/2008
blaCMY-4 und blaVIM-1 auf einem Plasmid lokalisiertund übertragbar → multiresistenteTranskonjuganten
Auftreten multiresistenter K. oxytoca (n = 5) in zweiKliniken mit blaVIM-1 und übertragbarerChinolonresistenz
Metallo-β-Lactamasen und Multiresistenz
12832Meropenem
≤ 1≤ 1Imipenem+EDTA
6464Imipenem
0,50,5Colistin
> 128> 128SXT
> 512> 512Sulfameracin
64> 64Ciprofloxacin
> 32> 32Chloramphenicol
> 8> 8Oxytetrazyclin
> 32> 32Nalidixinsäure
> 64> 64Streptomycin
≤ 2> 32Amikacin
> 32> 32Kanamycin
2> 8Gentamicin
> 32> 32Cefoxitin
> 32> 32Ceftazidim
> 16> 16Cefotaxim
> 8> 8Cefotiam
> 32> 32MSU
> 32> 32Mezlocillin
> 16> 16Ampicillin
K.o. 57K.p. 62Antibiotika ●
●
●
Zusammenfassung
Cephalosporinresistenz in Enterobacteriaceae:
ESBL (CTX-M)AmpC ÜberexpressionAmpC Plasmid-vermittelt (CMY)
Carbapenemresistenz in Enterobacteriaceae und Nonfermentern:KPC
OXA Plasmid-vermittelt
Metallo-β-Lactamasen(VIM, IMP)
OXA ÜberexpressionE. coli, Klebsiella spp. Enterobacter spp., A. baumannii, P. aeruginosa
Enterobacteriaceae
Enterobacter spp., E. coliE. coli, Klebsiella spp., Salmonella spp.
E. coli, Klebsiella spp.
E. coli, Klebsiella spp., A. baumannii, P. aeruginosaA. baumannii
Auftreten multiresistenter Enterobacteriaceae, insbesondere Klebsiella spp., wobei die therapeutischen Möglichkeiten nahezu erschöpft sind
Risiko Horizontaler Gentransfer: Übertragung von Multiresistenz-Plasmiden innerhalb der Spezies und in andere Spezies
Prof. Dr. Wolfgang Witte
Dr. Rita Prager
Sibylle M.-Bertling
Dr. Anne-Marie Fahr
Angela Danschke
Dr. W. Rabsch
Danke
Dr. Birgit StrommengerDr. Guido Werner
Herzlichen Dank an alle Einsender!
