Entwicklung und Validierung von ELISA-Verfahren zur ... IgA Stumi Ergebnisse 2012.pdf ·...

Entwicklung und Validierung von ELISA-Verfahren zur Quantifizierung der

Immunglobulin-A-Konzentration in Stutenmilch

Kira Greving, Franziska Bartholdy, Daniel Mörlein und Claus-Peter Czerny

Februar 23, 2013 Verband Deutscher Stutenmilcherzeuger

•  Stutenmilch als Lebensmittel

•  Vermarktung und Anwendungsbereiche


Bedeutung der Stutenmilch

•  „Eure Lebensmittel sollen Eure Heilmittel sein, Eure Heilmittel sollen Eure Lebensmittel sein“- Hippokrates

•  Seit mehreren Jahrhunderten wird Stutenmilch aufgrund ihrer heilenden Wirkung konsumiert

•  1858 erste Kumyss-Heilstätte in Samara

•  Tierarzt Dr. Storch brachte Stutenmilcherzeugung nach Deutschland –  1959 Stutenmilchfarm in Ettenheim

•  Durch die Aktualität von Naturheilverfahren rückt Stutenmilch als Lebensmittel wieder in den Vordergrund


Produktion und Vermarktung

Produktion •  Fohlen bleiben die ganze Laktationsperiode bei der Mutter •  Aktive Laktationsauslösung durch Fohlen (REMBALSKI, 1979) •  Häufig erst ab der 4.-6 Woche in der Produktion (BOYD, 1988) •  3-4 Melkperioden täglich •  Gute Bindung zum Melker von Vorteil (KNY, 1998)

Kennzahlen •  2.500 bis 3.000 l Milch pro Stute/Jahr (CSAPÓ et al.,1995)

•  Ca. 450 l für den Markt abgemolkene Milch pro Stute/Jahr •  Jährlich erzeugte vermarktungsfähige Milch

•  25 BVDS Betriebe: ca.170.000 l •  15 weitere: ca. 75.000 l (lt. SCHUBERT, 2011)


Vermarktung

Produkte: •  Stutenmilch •  Kumyss •  Kosmetika (Körperlotion, Tagespflege etc.) •  Kapseln mit Stutenmilchpulver

Vertrieb: fast ausschließlich tiefgefrorene Vorzugsmilch oder pasteurisiert •  Online Verkauf über hofeigene Seiten •  Direktverkauf „ab-Hof“ •  In wenigen Fällen: Reformhäuser


www.nutri-nature.de

www.esowatch.com

Zusammensetzung der Stutenmilch

Bestandteil Kuhmilch Stutenmilch Frauenmilch

Wassergehalt in % 87,3 88,8 87,1

Gesamteiweiß in % 3,4 2,5 0,9

Kaseine in % 2,8 1,3 0,4

Molkeneiweiß in % 0,6 1,2 0,5

Fettgehalt in % 3,9 1,9 4,0

Milchzucker in % 4,7 6,2 7,1


Quelle: Eigene Darstellung nach KIELWEIN 1994; OFTEDAL ET AL 1993

Gründe für den Stutenmilchkonsum (MALACARNE ET AL. 2002)

•  Durch günstige Eiweißzusammensetzung gut verdaulich

•  Lactoferin und Lysozym antibakteriell und antiviral

•  Zahlreiche verdauungsfördernde Enzyme

•  Laktose als Nährsubstrat für Milchsäure- und Bifidusbakterien

•  Sekretorisches IgA und IgM unterstützen Immunabwehr im Darm


Anwendungsbereiche

•  Substitut: •  „Functional Food“ auf natürlicher Basis •  Muttermilch (in Kombination mit Kuhmilch)

•  Unterstützung des Immunsystems

•  Für Hochleistungssportler zur Unterstützung des Immunsystems

•  Als begleitendes Heilmittel in der Krebstherapie (SEIDL, 2002)


Aktuelle Forschung zur oralen Aufnahme

•  SCHUBERT et al., 2009 •  Verbesserung bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Patienten

•  FOEKEL et al., 2009 •  Linderung des Schweregrads von Neurodermitis

•  ELLINGER et al., 2002 •  Hemmung von Entzündungsreaktionen im Organismus


•  Immunabwehr

•  Immunglobuline


Antigenerkennung und klonale Expansion

Antigen

B Zell Klon

T Zell Klon

APZ


Immunglobuline

•  Y-förmige Glykoproteine aus 4 Polypeptidketten

•  Erkennen und binden Antigene

•  Sind bivalent können zwei Antigene binden

•  Einteilung in 5 Antikörperklassen

•  Immunglobulin D •  Immunglobulin M •  Immunglobulin G •  Immunglobulin E •  Immunglobulin A


Immunglobuline in verschiedenen Körperflüssigkeiten adulter Pferde

Sekret IgG IgM IgA IgE

Serum [mg/dl] 2704 ± 14242 70 ± 401,2 196 ± 732 0.0233

Tränenflüssigkeit

[mg/dl]

11,27 ± 1,494 13 ± 1,14 309 ± 334 k.A.

Kolostrum [mg/dl] 5100 ± 10005 957 ± 10886 122.9 ± 77.36 k.A.

Milch [mg/dl] 147 77 1307 k.A.


Quelle: Eigene Darstellung nach: 1 PERKINS ET AL. 2003, 2 DE CAMARGO ET AL. 2009, 3 WILSON ET AL. 2006, 4 MARTIN ET AL. 1997, 5 VENNER ET AL. 2008,6 KOHN ET AL. 1989 (6 STUNDEN NACH DEM FOHLEN GEMESSEN), 7

MCGUIRE, CRAWFORD 1972

Immunglobuline in verschiedenen Körperflüssigkeiten adulter Pferde

Sekret IgG IgM IgA IgE

Serum [mg/dl] 2704 ± 14242 70 ± 401,2 196 ± 732 0.0233

Tränenflüssigkeit

[mg/dl]

11,27 ± 1,494 13 ± 1,14 309 ± 334 k.A.

Kolostrum [mg/dl] 5100 ± 10005 957 ± 10886 122.9 ± 77.36 k.A.

Milch [mg/dl] 147 77 1307 k.A.


Quelle: Eigene Darstellung nach: 1 PERKINS ET AL. 2003, 2 DE CAMARGO ET AL. 2009, 3 WILSON ET AL. 2006, 4 MARTIN ET AL. 1997, 5 VENNER ET AL. 2008,6 KOHN ET AL. 1989 (6 STUNDEN NACH DEM FOHLEN GEMESSEN), 7

MCGUIRE, CRAWFORD 1972

Immunglobulin A

•  Wichtige Schutzfunktionen auf Schleimhautoberflächen

•  Vorherrschendes Immunglobulin in Tränenflüssigkeit und Milch (VEARMAN et al., 1970)

•  IgA-System vom Pferd analog zu dem des Menschen (VEARMAN et al.,1970)

•  Besonderheit ist die „sekretorische Komponente“ •  „Sekretorische Komponente“ haftet nach Transport durch Endothelzelle am

IgA-Dimer an •  „Sekretorische Komponente“ schützt IgA vor proteolytischer Spaltung


sIgA: Lokale Schleimhautimmunität

Immunglobulin A. Sekretorisches IgA (sIgA) wird regelmäßig als Dimer aus zwei IgA-Proteinen in Körpersekreten angetroffen. Die IgA-Monomere sind durch ein J-Kettenprotein kovalent miteinander verknüpft.


Lokale Immunität und sekretorisches

IgA

sIgA


Februar 23, 2013 Verband Deutscher Stutenmilcherzeuger !Quelle: STRUGNELL, WIJBURG 2010

Synthese von sekretorischem

IgA

•  Eigene Untersuchungen und Projektziel: Entwicklung von ELISAs zum Nachweis von IgA

in Milch

in Blut bzw. Plasma und Serum

im Speichel

in Körperflüssigkeiten und Sekreten

•  Statistische Auswertung


Prinzip eines Capture-ELISAs


IgA-Moleküle werden gefangen


anti-IgA-Antikörper heften sich an


Der Test leuchtet


Material

•  Von 35 Stuten jeweils 2 Proben im Abstand von einer Woche

•  4 Betriebe mit diversen Rassen unterschiedlichen Alters

•  2 Probeentnahmen •  September/ Oktober 2010 •  Juli 2011

•  Proben wurden bei -20°C bis zur Analyse gelagert


Vorversuch kommerzielles Testkit (MyBioSource)

•  Testkit für Serum ausgelegt

•  Verdünnungsreihe mit Stutenmilchproben ergab optimale Verdünnung von 1:10.000

•  Bei der Auswertung muss das Ergebnis um den Verdünnungsfaktor korrigiert werden.

•  Spezifitätsnachweis


Entwicklung und Validierung von ELISA Verfahren: Direkter Sandwich ELISA


Checkerboard direkter Sandwich ELISA

•  Beschichtung: polyklonaler Antikörper Goat-anti-Horse-IgA (α IgAG)

•  Verdünnung: ab 1:100 im log 2

•  IgA-Standard (62,5 ng/ml) des kommerziellen Testkits als Probe

•  Konjugat: poyklonaler Antikörper Goat-anti-Horse-IgA: HRP (α-IgAG- HRP)

•  Verdünnung: ab 1:10.000 im log 2


Auswertung des Checkerboardtesst zum direkten Sandwich ELISA


Optimale Konzentration unter Berücksichtigung der Hintergrundreaktion : •  Beschichtung: α-IgAG 1:400 •  Konjugat: α-IgAG-HRP 1:10.000

Entwicklung und Validierung von ELISA Verfahren: Indirekter Sandwich ELISA


Y Wellboden αIgAG

αIgAM

αMouse-HRP

P P

Horseradish Peroxidase (HRP) P Immunglobulin A

Y Antikörper

Februar 23, 2013

Checkerboard indirekter Sandwich ELISA

•  Beschichtung: polyklonaler Antikörper Goat-anti-Horse-IgA (α IgAG)


•  Standard (62,5 ng/ml) des kommerziellen Testkits als Probe

•  Detektor: monoklonaler Antikörper Mouse-anti-Horse IgA (α IgAM)


•  Konjugat: Goat-anti-Mouse-HRP

•  Verdünnung: 1:2000

Verband Deutscher Stutenmilcherzeuger

Auswertung des Checkerboard-Tests zum indirekten Sandwich ELISA

Optimale Konzentrationen: •  Beschichtung: α-IgAG 1:400

•  Detektor: α-IgAM 1:800

•  Konjugat: α-MG 1:2000

•  Auswertung beider Verfahren am Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm spätestens 20 min nach Zugabe der Stopplösung


Direkter Goat-anti-Horse-IgA Sandwich ELISA mit Stutenmilchproben

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A 0,206 1,512 3,083 2,706 2,775 2,21 0,819 1,293 0,993 0,778

B 0,351 2,216 1,003 3,069 2,721 3,06 2,976 1,434 1,387 1,04

C 0,574 2,383 2,981 3,04 2,275 2,65 3,194 0,765 2,514 0,689

D 1,113 2,88 2,75 2,833 1,465 3,124 3,192 1,141 3,087 1,44

E 2,096 1,83 2,435 2,132 2,483 2,816 2,8

0,947 2,999 0,89

F 2,881 0,853 2,624 1,132 2,923 2,974 3,129 0,833 3,146 1,023

G 3,02 2,262 0,636 2,944 2,612 2,826 2,012

1,126 1,685 1,197

H 0,082 2,666 1,833 3,045 3,166 2,715 1,99 1,03 1,334 1,998


Berechnung der IgA-Konzentrationen anhand der Extinktionswerte


y = -2E-05x2 + 0,0135x + 0,2867 R² = 0,99256

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 100 200 300 400 500 600

Ext

inkt

ions

wer

te

IgA Konzentration [ng/ml] Extinktionswerte der Standdardverdünnungsreihe

Polynomische Trendlinie der Standardverdünnungsreihe R² Bestimmtheitsmaß

Wiederholbarkeit

•  ELISA-Verfahren •  Kommerzieller Testkit •  Direkter Goat-anti-Horse-IgA Sandwich ELISA •  Indirekter Goat-anti-Horse-IgA Sandwich ELISA

•  Korrelation der Ergebnisse: •  Kommerzieller Testkit mit direktem Sandwich ELISA positiv •  Kommerzieller Testkit mit indirektem Sandwich ELISA signifikant positiv •  Direkter Sandwich ELISA mit indirektem Sandwich ELISA hoch signifikant

positiv


Ergebnisse - deskriptive Statistik


Kennzahl N Range Min. Max. Mittelwert SD

Alter in Jahren 35 16 5 21 11,37 4,68

Laktationswoche 28 32 2 34 14,29 8,658

Laktationszahl 31 16 1 17 4,77 3,12

IgA Gehalt 1.

Entnahme [mg/dl] 34 215,52 18,69 223,64 92,49 52,31

IgA Gehalt 2.

Entnahme [mg/dl] 34 327,25 18,14 348,22 104,16 71,51

IgA-Gehalt der 4 Betriebe


104,93 87,06

46,37

114,86

140,11

121,92

63,94

93,56

0

20

40

60

80

100

120

140

160

IgA

Kon

zent

ratio

n [m

g/dl

]

1. Probenentnahme 2. Probenentnahme

Betrieb 1 Betrieb 2 Betrieb 3 Betrieb 4

IgA-Gehalt [mg/dl] in Abhängigkeit der Laktationswoche


112,85

102,57

70,27

113,78

71,72 76,15

0

20

40

60

80

100

120

IgA

Geh

alt [

mg/

dl]


1-9 Woche 11-20 Woche >20 Woche

IgA-Gehalt [mg/dl] in Abhängigkeit der Laktationszahl


86,63 98,28

108,78 120,48

0

20

40

60

80

100

120

140

IgA

Kon

zent

ratio

n [m

g/dl

]


1-4 Laktationen > 4 Laktationen

IgA-Gehalt [mg/dl] in Abhängigkeit der Altersgruppen


84,10

95,39 101,60 104,00

88,89

114,36

90,28

111,67

0

20

40

60

80

100

120

140

IgA

Kon

zent

ratio

n [m

g/dl

]


2-6 Jahre 7-11 Jahre 12-15 Jahre > 16 Jahre

Vergleich der drei ELISAs zum Nachweis von IgA in Stutenmilch


Lage- und Streuungsmaße der IgA-Gehalte der ersten und zweiten Probenentnahme

MyBioSource-IgA-ELISA

Direkter IgA-ELISA

Indirekter IgA-ELISA

Zusammenfassung •  Durchschnittlicher IgA Gehalt

•  1. Probenentnahme: 92,49 – 171,93 mg/dl •  2. Probenentnahme: 104,16 – 167,07 mg/dl

•  Laktationszahl und Alter haben keinen Einfluss auf IgA Gehalt

•  Zu Beginn der Laktation ist der IgA Gehalt höher als am Ende

•  Zukünftig auch Untersuchungen weiterer Matrizes

•  evtl. andere Intervalle zur Probenentnahme


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!


MSc Kira Greving BSc Franziska Bartholdy ------------------------------- Dr. Daniel Mörlein

BVDS

Date post:	13-Feb-2018
Category:	Documents
Upload:	phamkien
View:	214 times
Download:	0 times

Entwicklung und Validierung von ELISA-Verfahren zur ... IgA Stumi Ergebnisse 2012.pdf ·...

Documents