�Biowissenschaften�

Einzelmolekülmethoden zur Genomsequenzierung

Michael Groß

Die gegenwärtig genutzten Genomsequenzierer der zweiten Generation sind nur ein Übergang. Es ist

heute bereits möglich, einzelne DNA-Moleküle zu sequenzieren.

� Die Sequenzierung des mensch-lichen Genoms war zwar in vieler Hinsicht ein Meilenstein, aber ganz sicher nicht in Sachen Sequenzie-rungstechnik. Absolviert wurde dieses internationale Milliardenpro-jekt nämlich mit einer Urform der DNA-Sequenzierung, der Sanger-Methode (nach Frederick Sanger, der für seine Methoden zur Sequen-zierung von Proteinen und Nukle-insäuren je einen Nobelpreis er-hielt), auch Kettenabbruch-Metho-de genannt.

Nach Sanger kopiert man die zu sequenzierende DNA in Anwesen-heit eines defekten Bausteins, der nach einer bestimmten Base zum Kettenabbruch führt. In der moder-nen, automatisierbaren Version funktioniert das so, dass die Ketten-abbrecher mit vier verschiedenfar-bigen Fluoreszenzfarbstoffen mar-kiert sind. Die verschieden langen Fragmente sortiert dann eine Kapil-larelektrophorese.

Ein fundamentales Problem der Sanger-Methode liegt darin, dass man für jede einzelne auszulesende Position eine Population von DNA-Strängen synthetisieren muss, die an dieser Stelle abbrechen. Unterm Strich addierten sich so die Kosten zu den astronomischen Summen des Humangenom-Projekts. Warum können wir es nicht wie die Zelle machen, die Erbinformation immer nur von einem DNA-Doppelstrang abliest?

Die zweite Generation

� Ein erster Schritt in die Richtung, die Erbinformation immer nur von einem DNA-Doppelstrang abzule-sen, war der Abschied von Sangers Prinzip, dass jede Position in der Se-quenz von einem entsprechend lan-gen DNA-Strang repräsentiert wird.

Beim Solexa-Verfahren, das der heute marktbeherrschende Sequen-zierer Genome Analyser 2 von Illu-mina verwendet, ist diese Änderung über einen reversiblen Ketten-abbruch eingebaut. Sobald die neu eingebaute Base (immer noch über das Fluoreszenzsignal) ausgelesen ist, wird der Fluoreszenzmarker ab-getrennt und das Strangende für die

nächste Kupplungsreaktion freige-geben.

Das Ganze findet in einer Durch-flusszelle statt, auf deren innerer Glasoberfläche jeweils etwa 1000 identische Exemplare eines DNA-Strangs immobilisiert sind. Hunder-te von Millionen solcher Cluster ver-arbeitet eine Zelle gleichzeitig. Die Sequenzierung eines menschlichen Genoms nach diesem Verfahren kos-tete im Herbst 2009 knapp unter 50 000 US-Dollar, Tendenz fallend.

Das Pyrosequencing-Verfahren von 454 Life Sciences ist ebenfalls synthesegestützt und kann im Laufe der Synthese eine Base nach der an-deren auslesen, kommt also mit der Größenordnung von Tausenden

Abb. 1. Gensequenzierer am Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Oxford. (Foto: Groß)

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Molekülen aus. Der Unterschied liegt in der Auslesetechnik. Beim Py-rosequencing gibt man jeweils nur eine der vier Basen unmarkiert zu und detektiert die Freisetzung des Pyrophosphats, wenn der nächste Baustein angeknüpft ist. Dieses Ver-fahren entschlüsselte das Genom von DNA-Pionier James Watson, und auch das Max-Planck-Institut für Evolutionäre Anthropologie in Leipzig sequenzierte damit das Ne-andertaler-Genom.

Die dritte Variante der zweiten Ge-neration, das Solid-Verfahren von Ap-plied Biosystems, fügt die Basen nicht einzeln an, sondern setzt die DNA aus Oligo-Nucleotiden zusammen. Diesen Vorgang, der Ligieren heißt, katalysiert eine Ligase. Es müssen alle möglichen Buchstabenkombinatio-nen einer bestimmten Länge her-gestellt und markiert werden, so dass dann ihr Einbau in den wachsenden DNA-Strang registriert werden kann.

Im Herbst 2009 arbeiteten von diesen Geräten der zweiten Genera-tion mehr als 1000 Exemplare in Forschungszentren rund um den Globus. Ein Viertel der weltweiten Kapazität steht allerdings im Sanger-Centre in Hinxton bei Cambridge. Diese Geräte spucken etwa zehn Bil-lionen Basen pro Woche aus, das entspricht mehr als 400 Mal dem In-formationsgehalt des menschlichen Genoms pro Tag. Um ein persönli-ches Genom zu erstellen, müsste man allerdings dessen Gesamtlänge einige Dutzend Male sequenzieren. Also können die Geräte nicht 400, sondern nur 10 bis 20 Kunden pro Tag abfertigen.

Das hört sich beeindruckend an, doch wenn wir überlegen, wie viel DNA unsere Körperzellen tagaus tagein replizieren und transkribie-ren, dann ist unser technischer Rückstand gegenüber der Natur im-mer noch peinlich. Wo bleibt also die DNA-Ablesung am Einzelmole-kül, im Nanometermaßstab?

Die dritte Generation

� Mehrere Start-ups entwickeln derzeit Verfahren zur Sequenzierung von Einzelmolekülen. Das erste Un-ternehmen, das ein Gerät auf den Markt gebracht und ein mensch-liches Genom komplett sequenziert hat, war Helicos Biosciences in Cam-bridge, Massachusetts. Im August 2009 machte ein Genom-Paper mit nur drei Autoren Schlagzeilen: Heli-cos-Gründer Stephen Quake hatte

mit dem Doktoranden Dmitry Pushkarev und der Laborassistentin Norma Neff sein eigenes Genom se-quenziert.1) Es war das erste menschliche Genom, das mit einem Einzelmolekül-Verfahren vollstän-dig entschlüsselt wurde.

Die zugrunde liegende Methode funktioniert im Prinzip ähnlich wie das Solexa-Verfahren: Die einzelnen DNA-Stränge werden auf einer Oberfläche (die offenbar speziell für diese Anwendung entwickelt wur-de) immobilisiert und schrittweise mit den Reagenzien in Kontakt ge-bracht. Es wird jeweils nur eine Base angeboten, und nach dem Kupp-lungsschritt wird die Fläche mit ei-nem speziellen DNA-Mikroskop fo-tografiert, wobei Lichtflecken anzei-gen, an welchen der Tausenden von gleichzeitig (aber eben individuell) analysierten Molekülen eine neue Base angekuppelt ist.

Der Nachteil dieser Methode ist das Detektionsverfahren, das auf Fluoreszenzmikroskopie basiert. Um es auf Einzelmoleküle anzuwen-den, benötigt man extrem leistungs-fähige und teure Optik, einen er-schütterungsfreien Raum und dann noch einen schweren Granitblock, auf dem die ganze Apparatur auf-gebaut wird. Insgesamt wird das ge-samte Instrument so groß wie ein lu-xuriöser Kühlschrank und teurer als die handelsüblichen Instrumente der zweiten Generation. Diese Nach-teile erklären auch, warum Helicos erst wenige Geräte verkauft hat, trotz des Ruhms, als erstes Unter-nehmen den Schritt zum Einzel-molekül geschafft zu haben.

Die Zukunft?

� Weitere Einzelmolekülverfahren werden nicht lange auf sich warten lassen. Sowohl Pacific Biosciences (PB) in Menlo Park, Kalifornien, als auch Oxford Nanopore Technologies (ONT) haben Verfahren im fort-geschrittenen Entwicklungsstadium, die noch in diesem Jahr auf den Markt kommen könnten.

Wie Helicos detektiert PB mit Fluoreszenz und sequenziert synthe-segestützt. Dieser Hersteller hat dem

Abb. 2. Nanopore-Verfahren: Eine DNA-Base wandert durch eine Nanopore, durch die ein Strom

fließt. Der Verlauf der Stromstärke ist charakteristisch für jede Base. (Quelle: Oxford Nanopore)

� QUERGELESEN

�� Heute gängige Verfahren zur Genomsequen -

zierung sind nach wie vor synthesegestützt, sie

erfordern aber nicht mehr, dass jede Position in

der Sequenz von einem entsprechenden DNA-

Strang repräsentiert wird.

�� Das erste Verfahren, das Einzelmoleküle sequen-

ziert, arbeitet mit Fluoreszenzmikroskopie und

erfordert eine extrem leistungsfähige Optik.

�� Voraussichtlich werden in diesem Jahr noch klei-

nere und preisgünstigere Geräte auf den Markt

kommen. Inzwischen gibt es auch einen Ansatz

ohne Synthese und ohne optische Detektion.

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Verfahren aber einige Verbesserun-gen abgerungen, so dass es vermut-lich ohne den massiven instrumen-tellen Aufwand des Helicos-Verfah-rens auskommt.

Nach der von PB entwickelten SMRT(Single Molecule Real Time)-Technik wird jeder einzelne Strang in je einer Mulde synthetisiert. Die Mulden mit Durchmessern im zwei-stelligen Nanometer-Bereich sind so klein, dass sichtbares Licht nicht hindurchscheinen und nur 20 bis 30 nm tief in den Hohlraum eindrin-gen kann. Der dem Licht zugäng-liche Reaktionsraum umfasst nur 20 Zeptoliter (10–21 L). Wenn in die-sem Volumen nun ein Molekül des Enzyms DNA-Polymerase sitzt und einen einzelnen DNA-Strang repli-ziert, ist nicht mehr viel Platz für an-dere Moleküle, die Störsignale ver-ursachen könnten. Wenn also aus diesem winzigen Volumen Fluores-zenzlicht zurückkommt, handelt es sich garantiert um die gerade an der Kupplungsreaktion teilnehmende Base. Damit die wachsende DNA-Kette kein störendes Fluoreszenzsig-nal beisteuert, ist beim SMRT-Ver-fahren der Fluoreszenzmarker nicht wie bisher üblich an der Base selbst, sondern an einer der abzutrennen-den Phosphatgruppen befestigt.

Grundsätzlich andere Wege be-schreitet Oxford Nanopore. Das Spin-off aus dem Labor von Hagan Bayley an der Universität Oxford be-nutzt künstlich veränderte Versio-nen von biologischen Membranpo-ren (Nanoporen) als elektronisches Zählgerät, um abgetrennte Basen zu identifizieren. Sie hat also sowohl vom synthesegestützten Sequenzie-ren als auch von der optischen De-tektion Abschied genommen.

In einem Artikel, der im Februar 2009 in Nature Nanotechnology on-line erschien,2) zeigten Mitarbeiter von ONT, dass ihre Nanoporen nicht nur alle vier Basen zuverlässig von-einander unterscheiden, sondern auch methylierte Cytosine erkennen. Dies ist entscheidend für die Analyse der regulatorischen Markierung von Genen, also der Epigenetik.

Bei den Nanoporen handelt es sich um das Membranprotein Hämo-

lysin des Bakteriums Staphylococcus aureus, dessen Innenraum durch ko-valenten Einbau eines Cyclodextrin-Derivats verengt wurde. Baut man eine einzelne Nanopore dieser Art in eine Membran ein, die zwei Flüssig-keitsbehälter voneinander trennt und legt eine geringe Spannung an, so fließt ein konstanter Strom durch die Pore. Wandert eine DNA-Base durch die Pore, so wird der Strom-fluss für etwa eine Zwanzigstel Se-kunde blockiert, wobei der Verlauf der Stromkurve charakteristisch für eine Base ist (Abbildung 2).

Der zweite, noch zu optimierende Teil der Nanoporen-Technik ist die Anbringung eines DNA-verdauen-den Enzyms (einer Exonuclease), das die Basen von einem Ende des Strangs her trennt und einzeln der Pore zuführt.

Die Nanopore-Technik, für die ONT einen Vermarktungsvertrag mit dem Marktführer Illumina abge-schlossen hat, wird vermutlich in die-sem Jahr auf den Markt kommen. Die Geräte, wenn sie denn marktreif sind, werden kleiner und preisgünstiger ausfallen als alles, was gegenwärtig verfügbar ist, sagen die Entwickler bei ONT. Selbst die oft zitierte Schwelle von 1000 US-Dollar für die Sequenzierung eines menschlichen Genoms könnte unterboten werden.

Der promovierte Biochemiker Michael Groß

lebt als freier Wissenschaftsautor in Oxford,

England. www.michaelgross.co.uk

1) D. Pushkarev, N. F. Neff, S. R. Quake, Nat.

Biotechnol. 2009, 27, 847–850.

2) J. Clarke, H.-C. Wu, L. Jayasinghe, A. Patel,

S. Reid, H. Bayley, Nat. Nanotechnol.

2009, 4, 265–270.

Kurz notiert

Geld für Lipidforschung

� Die Deutsche Forschungs-gemeinschaft (DFG) fördert den Sonderforschungsbereich (SFB) Transregio „Molekulare Architek-tur und zelluläre Funktionen von Lipid/Protein-Komplexen“. Der Ge -meinschafts-SFB mit Teilnehmern aus Heidelberg, Dresden und Bonn erhält insgesamt 8,7 Mio. Euro von der DFG. Er soll klären, was Mem-branlipide zur Struktur und Funk-tion biologischer Membranen bei-tragen.

Zuverlässige Proteinfaltung

� Falsch gefaltete Proteine können Krankheiten wie Alzheimer aus-lösen. Isomerasen spielen für die Faltung eine wichtige Rolle. Wissenschaftler des Max-Planck-Instituts in Halle fanden heraus, dass Prolylisomerasen mit einer Chaperon-Untereinheit Proteine zuverlässig falten, und zwar un -abhängig von der Aminosäurese-quenz.

Kathrin Dörr, Frankfurt

Erkenntnisse für Krebstherapie

� Wachstumsfaktoren, beispiels-weise der epidermale Wachstums-faktor EGF und deren Rezeptoren, sind wichtig für die Zellteilung. Des-halb spielen sie auch in der Tumor- und Krebsentstehung eine große Rolle. Wissenschafter der Goethe-Universität Frankfurt, aus Dresden, Odense in Dänemark und Toronto, Kanada, haben durch computer-unterstützte Screenings nach Protei-nen geforscht, die an den EGF-Re-zeptor binden. Sie stießen dabei auf das Enzym HDAC6, das Acetylgrup-pen an den alpha-Tubuli entfernt. Durch diesen Mechanismus kann sich der Rezeptor in einem Vesikel verschnürt fortbewegen und an ei-ner anderen Membran für Wachs-tum oder Transport von Krebszellen sorgen. Die Forscher wollen auf-grund dieser Erkenntnisse das En-zym HDAC6 und EGF-Rezeptoren kombiniert hemmen. Sie verspre-chen sich davon, das Wachstum von Tumoren des Kopfes und des Halses zu verlangsamen sowie andere Krebsarten zu therapieren.

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