Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen - dgm.org · Neue Methoden der Genetik 7. DGM Fach-...

Neue Methoden der Genetik

7. DGM Fach- und Informationstag für Muskelkranke 2014

1. Juni 2014 – Dr. Sabine Uhrig

Diagnostik bei

neuromuskulären

Erkrankungen

2

Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik

AGENDA

Menschliche Muskulatur

3

Bild: www.freynutrition.de

656 Muskeln

30-50% der Gesamtkörpermasse

Arten von Muskulatur

glatt (Organe)

quergestreift (Herz, Skelettmusk.)

Funktion der

Skelettmuskulatur

Bewegung und Stabilität

Wärmehaushalt


Menschliche Muskulatur

4

Bild: www.fitness-uebung.de


Signalübertragung

5

unteres Motoneuron

Bild: www.natural-bb.de



Chromosomen

46, XX 46, XY

22 Autosomenpaare, 2 Geschlechtschromosomen

6


Chromosomen

Bild: http://www.genome.gov/Images/EdKit/bio2c_large.gif

7

Autosomal rezessiver Erbgang

8

Hintergrund

Charakteristik

Beide Eltern gesund aber heterozygote Anlageträger

25% der Kinder betroffen


Autosomal dominanter Erbgang

9

Hintergrund

Charakteristik

Ein verändertes Allel führt direkt zur Erkrankung

Ein betroffener Elternteil, 50% der Kinder krank


X-chromosomal rezessiver Erbgang

10

Hintergrund

Charakteristik

Weibliche Familienmitglieder meist gesund aber Trägerin

(Fast) nur männliche Familienmitglieder betroffen


Y X X X

X X X X X Y Y X

11


AGENDA

Muskelbeteiligung bei

Muskeldystrophien

12 Grundlagen | Neuromuskuläre Erkrankungen | Diagnostik

Bild: http://www.stemrx.in/mosdis.html

Vorstellung ausgewählter

Krankheitsbilder

13

Muskeldystrophien Duchenne´sche Muskeldystropie (DMD)

Gliedergürtel-Muskeldystrophien (LGMD)

Atrophie Spinale Muskelatrophie (SMA)

Myotonie Myotone Dystrophie Typ 1

(Morbus Cruschmann-Steinert)


Duchenne´sche Muskeldystropie

(DMD) 1/3

14

Bilder: www.thieme.de und http://drugster.info/ail/pathography/462/


Krankheitsbeginn: Frühe Kindheit

Symptome:

Progressiver Muskelschwund

Leichte intellektuelle Beeinträchtigung

(~ 30 %)

Gelenkkontrakturen

Charakteristische Haltung

Pseudohypertrophie der Waden

Gowers Zeichen

Verlust

Gehfähigkeit: oft vor dem 13. Lebensjahr


(DMD) 2/3


Statistik: ~1 : 3.500 (Jungen)

Vererbung: X-chromosomal-rezessiv

de-novo Mutationen

15

Genetik:

Genort DMD-Gen: Xp21.2

großes Gen mit 79 Exons

> 1.000 Mutationen beschrieben

60 % Deletionen

5-10 % Duplikationen

30-35 % Punktmutationen


(DMD) 3/3


Bild: nach Torella et al, JMD 2010

Gliedergürtel-Muskeldystrophien

(LGMD) 1/3

17

Bild: A. Ferbert&W. Kress; medgen 2009, 21:332-336


Krankheitsbeginn: variabel meist 15 – 30 Jahre

Symptome:

proximal betonte Paresen

Schwierigkeiten beim Aufstehen

Progredienz der Paresen über

2 Jahrzehnte

Verlust

Gehfähigkeit: variabel; oft langsamer Verlauf mit

Verlust der Gehfähigkeit



(LGMD) 2/3

Statistik: 1:14 500 – 1:123 000

Vererbung: autosomal-dominant

autosomal-rezessiv

Genetik:

Heterogen

24 Gene bekannt

zusätzlich mehr als 25 Genorte

LGMD1 – autosomal-

dominant

LGMD2 – autosomal-

rezessiv

In der Regel Punktmutationen

bzw. kleinere Deletionen die

durch Sequenzanalyse detektiert

werden können


(LGMD) 3/3


autosomal-dominant

autosomal-rezessiv

Spinale Muskelatrophie (SMA) 1/3

20

Bild: S. Rudnik-Schöneborn & K. Zerres; medgen 2009 21:349-357


Krankheitsbeginn: ab 1. Monat (Typ I)

bis > 30 Jahre (Typ IV)

Symptome:

Typ I – Sitzen nicht möglich,

Muskelhypotonie

gutes Kontaktverhalten,

differenzierte Fein-Motorik,

fehlende Reflexe, respiratorische

Insuffizienz, Skoliose

Typ II – Sitzen möglich, kein freies

Laufen

Typ III – Freies Laufen möglich

Typ IV – variable Progredienz

Verlust

Gehfähigkeit: keine Gehfähigkeit erlernt (Typ I)

bis zu normaler Gehfähigkeit (Typ IV)



Statistik:

1 : 6.000 – 1 : 10.000

Heterozygoten-

frequenz 1 : 50

Vererbung: autosomal-rezessiv

Genetik:

Genort SMN1-Gen: 5q13.3

95 % Deletionen von

Exon 7 und 8 des SMN1-

Gens

3-4 % Punktmutationen

im SMN1-Gen



Myotone Dystrophie Typ 1

(Morbus Cruschmann-Steinert) 1/2

23

Bild: http://medgen.genetics.utah.edu/


Krankheitsbeginn: variabel , vorgeburtlich (congenital) –

spätes Alter, klassische Form 30 – 40 LJ

Symptome:

Muskelschwäche

Myotonie (= Muskelsteifigkeit)

Facies myopathica

Stirnglatze

Katarakt

Herzbeteiligung

Endokrine Störungen

Intelligenzminderung

Wesensänderungen

Verlust

Gehfähigkeit: variabel


Myotone Dystrophie Typ 1

(Morbus Cruschmann-Steinert) 2/2

Statistik: 1 : 10.000 – 1 : 20.000

Vererbung: autosomal-dominant

* 5 – 34 Kopien gesunde Normalpersonen; 35 – 49 Kopien gesunde Personen, aber instabil (Keimbahn!);

50 – 150 Kopien sorgen für milde Zeichen der MD; 100 – 1.000 Kopien zeigen klassische Form der MD;

über 2.000 Kopien kongenitale MD

Genetik:

Genort DMPK-Gen:

19q13.2-q13.3

CTG-Trinukleotid-Repeat*

Antizipation

Erhöhung der Kopienzahl

in der Keimbahn bei

maternaler Übertragung,

d.h. früheres Auftreten der

Erkrankung in

Folgegenerationen

Warum ist der Nachweis der Mutation

so wichtig?


Sicherung der Diagnose beim Betroffenen:

Möglichkeit genauere Prognose zu erstellen

Möglichkeit auch andere Organe (Herz / Auge etc.) in

Vorsorgeuntersuchungen einzubeziehen

Art der Mutation kann für gentherapeutische Ansätze wichtig sein

Aussage über Wiederholungsrisiko bei Kinderwunsch des Betroffenen

1

Familienabklärung dadurch möglich :

Möglichkeit auf Testung hinsichtlich Anlageträgerschaft (auch

prädiktive Testung - d.h. Testung bevor Krankheitszeichen auftreten)

Vorsorgeuntersuchungen von Familienangehörigen (z.B. entwickeln bei

DMD ~ 20% Konduktorinnen Herzrhythmusstörungen/ Kardiomyopathien)

je nach Erbgang Aussage über Wiederholungsrisiko bei weiterem

Kinderwunsch

bei aut-rez Erbgang Testung des Partners bei Kinderwunsch möglich

2

26


AGENDA

Die aktuelle Diagnostik verzichtet

größtenteils auf die Genetik

27

Symptome

Ursache

Diagnose

Therapie


Diagnostik bei Muskeldystrophien

28

5. Genetik

3. Elektromyografie (EMG)

2. Labor (CK)

1. Anamnese

4. Muskelbiopsie (Immunhistochemie)


Bild: http://www.baur-institut.de/uploads/pics/muskelhisto_muskeldystrophie_01.jpg

Unsere Vision

29

Jeder Patient wird zu Beginn

der Diagnostik

genetisch untersucht


Die genetische Diagnose kann eine

verbesserte Therapie ermöglichen

30

Symptome

Ursache

umfassende

Diagnose

gezielte

Therapie


Die Fragestellung bestimmt das

passende Werkzeug der Diagnostik

31

Panel-Diagnostik

[NGS]

• Paralleles

Sequenzieren aller

Genen die mit

einer Krankheit

assoziiert sind

• Hohe Qualität

• Zeit- und Kosten-

effizient

• Hohe Wahrschein-

lichkeit die

ursächliche

Variante zu finden

• Häufige Updates

Einzelgen-Diagnostik

[Sanger]

• Etablierte

Methode

• Nur für einzelne

Gene möglich


intensiv

• Geringe Chance

die genetische

Variante zu finden


32

Bild: aus Shendure and Ji (2008) Nat Biotech 26:1135-1145

Sanger Sequenzierung


Grenzen der Einzelgendiagnostik

33

Vorteile am Beispiel

des NMD-Panels

– 229 Gene

Diagnostik-

Panel

NMD

Einzelgen-

diagnostik

(Theorie)

Einzelgen-

diagnostik

(Praxis)

Untersuchte Gene 229 Gene

(parallel)

229 Gene

(nacheinander) 2-3 Gene

Erfolgsrate ~ 30%

~ 30%

< 10%

Kosten 3.500 € 350.000 € 4.500 €

Bearbeitungszeit 2 - 4 Monate 15 – 20 Jahre 2 - 4 Monate


Die Fragestellung bestimmt das

passende Werkzeug der Diagnostik

34

Panel-Diagnostik

[NGS]

• Paralleles

Sequenzieren aller

Genen die mit

einer Krankheit

assoziiert sind

• Hohe Qualität


effizient

• Hohe Wahrschein-

lichkeit die

ursächliche

Variante zu finden

• Häufige Updates

Einzelgen-Diagnostik

[Sanger]

• Etablierte

Methode

• Nur für einzelne

Gene möglich


intensiv

• Geringe Chance

die genetische

Variante zu finden


Diagnostische Routine:

Arbeitsablauf einer Panel-Analyse

35

Diagnostik

Befundung

Schritt 5

Labor

Validierung

von

Varianten

Schritt 4

Diagnostik

Auswahl der

wahrsch.

ursächlichen

Varianten

Schritt 3

Bioinformatik

De-Multiplexing

Mapping,

Variant calling,

Annotation

Schritt 2

Labor

Probenvorb. und

Sequenzierung

aller

relevanten Gene

Schritt 1


Schritt 1: Aktuellste Sequenziertechnik

im Hochdurchsatz-Labor

36

Sequenzierung der Patienten-DNA in

hochspezialisiertem, zunehmend

automatisiertem Labor

Arbeitsinhalte

Routine:

DNA-Isolierung

Anreicherung der gesuchten Gene

Sequenzierung

Forschung & Entwicklung:

Protokoll-Weiterentwicklung

Inputmengen optimieren

optimale Anreicherung


Schritt 2: Bioinformatische Auswertung

37

Bioinformatische Auswertung der

Sequenzierdaten in einem

vollautomatisierten Prozess

De-Multiplexing

Mapping

Variant Calling

Annotation

Variantenliste für Diagnostik

Feedback an das Labor (Qualität)

Erhebung statistischer Daten

Interpretation der Daten (R&D)


Arbeitsinhalte

38

Interpretation der Variantenlisten durch

ein Expertenteam

Auswertung der genetischen Varianten

Beurteilung im medizinischen Kontext

Auftrag zur Validierung an Sanger-Labor

ggf. Anforderung von

Segregationen

Schritt 3: Biologisch-medizinische

Interpretation der Daten


Arbeitsinhalte

39

Validierung von pathogenen Varianten

durch ein unabhängiges Verfahren

(Sanger-Sequenzierung)

Design von variantenspezifischen Primern

Sanger-Sequenzierung

Auswertung / Abgleich mit NGS-Daten

ggf. Anfordern einer weiteren

möglichen pathogenen Variante

Schritt 4: Bestätigung von Varianten

durch zweite biotechn. Methode

? !


Arbeitsinhalte

40

Abschließende Interpretation der

validierten Varianten und Erstellung

eines medizinischen Befundes

Arbeitsinhalte

• Auswertung der bestätigten Varianten

• Erstellung eines med. Befundes

• 8-Augen-Prinzip

• verständlicher Befund an Arzt (2-3 Seiten)

Research & Development:

• Panel-Design

• Panel-Updates

• Veröffentlichungen

Schritt 5: Erstellung eines

medizinischen Befundes

!


CeGaT bietet derzeit Panel-Diagnostik

für 9 NMD-Krankheitsbilder an

41

Panels N

eurom

uskuläre Erkrankungen

NMD01: Spinale Muskelatrophie (21 Gene)

NMD02: Charcot-Marie-Tooth und sensorische

Neuropathien (71 Gene)

NMD03: Kongenitale und distale Myopathien (55 Gene)

NMD04: Gliedergürtel-Muskeldystrophien (26 Gene)

NMD05: Muskeldystrophien (31 Gene)

NMD06: Kongenitale myasthene Syndrome und

Arthrogryposis (29 Gene)

NMD07: Myotonien (11 Gene)

NMD08: Metabolische Myopathien (27 Gene)

NMD10: Walker-Warburg-Syndrom (13 Gene)


Statistik NMD Panels

(einzelne Subpanels)

42

23%

16% 61%

NMD-02 (Charcot-Marie-Tooth und

sensorische Neuropathien)

positiv unklar negativ

Gesamt: 111

26%

21%

53%

NMD-03 (kongenitale und distale

Myopathien)


Gesamt: 53

40%

21%

39%

NMD-04 (Gliedergürtel-

Muskeldystrophien)


Gesamt: 38

50%

14%

36%

NMD-05 (Muskeldystrophie)


Gesamt: 14


Statistik NMD-Panels (gesamt)

43

28%

20%

52%

NMD (alle)


positiv 91 28%

unklar 66 20%

negativ 173 52%

gesamt 330


CeGaT GmbH

Paul-Ehrlich-Str. 17

D-72076 Tübingen

Tel: +49 7071 / 56 54 400

Fax: +49 7071 / 56 54 422

www.cegat.de

[email protected]

http://www.cegat.de/

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