Das Verhalten und der Einfluss von Thrombozyten und CCR4 ... · Aus der Klinik und Poliklinik für...

Aus der Klinik und Poliklinik für Chirurgie

(Direktor: Univ.- Prof. Dr. med. Claus-Dieter Heidecke)

der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Das Verhalten und der Einfluss von Thrombozyten und CCR4 in der

polymikrobiellen Sepsis

Inaugural – Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der

Medizinischen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2010

vorgelegt von:

Appelt, Manja

geb. am: 08.12.1986

in: Schwedt/Oder

Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar

1. Gutachter: Prof. Dr. med. Stefan Maier

2. Gutachter: Prof. Dr. med. A. Greinacher

3. Gutachter: Prof. Dr. Bröker

4. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. med. Nico Schäfer

5. Gutachter: Priv.-Doz. Kollmar

Ort, Raum: Seminarraum der Klinik für Thoraxchirurgie

Tag der Disputation: 28.10.2013

Für meine Eltern

IV

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis .................................................................................. VII

1 Einleitung ................................................................................................... 1

1.1 Thrombozyten................................................................................................ 2

1.1.1 Aufbau des Thrombozyten ...................................................................... 2

1.1.2 Aktivierung des Thrombozyten ................................................................ 5

1.1.3 Funktion des Thrombozyten.................................................................... 7

1.1.4 Thrombozyten in der Sepsis ................................................................... 8

1.2 Pathogenese der Sepsis ............................................................................... 9

1.3 Sepsismodelle ............................................................................................. 12

1.3.1 Exogene Verabreichung von Toxinen und Bakterien ............................ 12

1.3.2 Cecal Ligation and Puncture (CLP) ....................................................... 13

1.3.3 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) ........................................... 13

2 Fragestellung der Arbeit ........................................................................... 15

3 Material und Methoden ............................................................................. 16

3.1 Material ........................................................................................................ 16

3.1.1 Reagenzien und Chemikalien ............................................................... 16

3.1.2 Kits ........................................................................................................ 18

3.1.3 Primer ................................................................................................... 18

3.1.4 Antikörper.............................................................................................. 18

3.1.5 Puffer und Lösungen ............................................................................. 19

3.1.6 Laborgeräte ........................................................................................... 20

3.1.7 Verbrauchsmaterialien .......................................................................... 21

3.2 Methodik in vivo ........................................................................................... 22

3.2.1 Genehmigung der Tierversuche ............................................................ 22

3.2.2 Tiere und Tierhaltung ............................................................................ 22

3.2.3 Tiermodelle ........................................................................................... 23

V

3.2.3.1 Anästhesie ...................................................................................... 23

3.2.3.2 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) .................................... 23

3.2.3.3 Schmerztherapie ............................................................................ 25

3.2.4 Organentnahme .................................................................................... 25

3.3 Zellbiologische Methoden mit humanen Zellen ........................................... 26

3.3.1 Abnahme und Präparation der Blutproben ............................................ 26

3.3.2 Stimulation von Vollblut ......................................................................... 26

3.3.3 Stimulation von plättchenreichem Plasma (PRP) .................................. 26

3.4 Zellbiologische Methoden mit murinen Zellen ............................................. 27

3.4.1 Isolation muriner Thrombozyten ............................................................ 27

3.4.2 Aufarbeitung muriner Lymphozyten ...................................................... 27

3.4.2.1 Isolation von PBMCs aus dem peripheren Blut .............................. 27

3.4.2.2 Isolation von CD4+-Zellen aus der Milz........................................... 28

3.5 Molekularbiologische Methoden .................................................................. 29

3.5.1 RNA-Isolation ........................................................................................ 29

3.5.2 Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion .......................... 31

3.6 Proteinbiochemische Methoden .................................................................. 32

3.6.1 Durchflusszytometrie humaner Zellen ................................................... 32

3.6.1.1 Vollblutfärbung für die Durchflusszytometrie .................................. 33

3.6.1.2 Färbung des PRP ........................................................................... 34

3.6.2 Durchflusszytometrie muriner Zellen ..................................................... 34

3.6.3 Fibrinogen-ELISA .................................................................................. 35

3.6.4 Immunhistologie .................................................................................... 35

3.6.4.1 Anfertigen von histologischen Präparaten ...................................... 35

3.6.4.2 Färbungen ...................................................................................... 35

3.7 Statistische Auswertung .............................................................................. 38

4 Ergebnisse ............................................................................................... 39

4.1 In vitro Versuche mit humanen Zellen ......................................................... 39

VI

4.1.1 Stimulation von plättchenreichem Plasma ............................................ 39

4.1.1.1 Stimulation mit TRAP-6 .................................................................. 40

4.1.1.2 Stimulation mit TRAP-6 und LPS ................................................... 41

4.1.2 Stimulation von Vollblut ......................................................................... 44

4.1.2.1 Granulozyten .................................................................................. 46

4.1.2.2 Monozyten ...................................................................................... 49

4.2 Versuche mit murinen Thrombozyten .......................................................... 52

4.2.1 Thrombozytenzahl nach CASP ............................................................. 52

4.2.2 Immunhistologischer Vergleich septischer und unbehandelter Organe 52

4.2.2.1 Ergebnisse von Lunge und Milz in CCR4-/- und C57BL/6 ............... 53

4.2.2.2 Ergebnisse von Leber..................................................................... 56

4.2.2.3 Ergebnisse der Leber mit CD42c , CD62P und Gr-1 ...................... 57

4.2.3 Fibrinogen-ELISA .................................................................................. 60

4.3 CCR4-Regulation nach CASP ..................................................................... 62

4.3.1 RT-qPCR muriner PBMCs .................................................................... 62

4.3.2 RT-qPCR muriner CD4+-Zellen ............................................................ 65

5 Diskussion ................................................................................................ 67

5.1 In vitro Versuche mit humanen Zellen ......................................................... 67

5.2 In vivo Versuche nach CASP ...................................................................... 70

5.3 CCR4-Regulation nach CASP ..................................................................... 74

6 Zusammenfassung ................................................................................... 77

Literaturverzeichnis ........................................................................................ 79

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen .................................................... 86

Eidesstattliche Erklärung ................................................................................ 88

Lebenslauf ..................................................................................................... 89

Danksagung ................................................................................................... 91

VII

Abkürzungsverzeichnis

ACDA Acid Citrate Dextrose solution A

AK Antikörper

BSA Bovines Serumalbumin

CARS compensatory anti-inflammatory

response syndrome

CASP Colon Ascendens Stent Peritonitis

CCL17 Thymus- and activation-regulated

chemokine

CCL22 Macrophage-derived chemokine

CCR4 Chemokinrezeptor 4

C57BL/6 C57 Black 6 – Maus

CLP Cecal ligation and puncture

DAMP Damage associated molecular

pattern molecules

DIC Disseminierte intravasale Gerinnung

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FACS Fluorescence-activated-cell-sorter

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FCS Fetales Kälberserum

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-

Dehydrogenase

GP Glykoprotein

GPIb/V/IX Rezeptor für vWF auf Thrombozyten

GPIIb/IIIa Fibrinogenrezeptor auf Thrombozyten

16G 16 Gauge

HMGB1 High-Mobility-Group-Protein B1

IL Interleukin

IFN Interferon

i.p. intraperitoneal

LPS Lipopolysaccharid

MDC Macrophage - derived chemokine

VIII

MODS Multi organ dysfunction syndrome

NETs Neutrophil extracellular traps

NFκB nuclear factor of activated B-cells

OCS open canalicular system

PAC-1 Antikörper gegen aktiviertes GPIIb/IIIa

PAMP Pathogen - associated molecular

patterns

PAR 1-6 Protease-activated Rezeptor 1-6

PCR Polymerasekettenreaktion

PBS Phosphate buffered Saline

PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell

PDGF Platelet derived growth factor

PE Phycoerythrin

PF-4 Platelet factor 4

POD Peroxidase

PRP Plättchenreiches Plasma

PRR Pattern recognition receptor

PSGL-1 P-Selektin Glykoprotein Ligand-1

RGDS Arg-Gly-Asp-Ser

RT Raumtemperatur

TARC Thymus- and activation-regulated

chemokine

TF Tissue Factor

TGF Transforming growth factor

TLR Toll-like Rezeptor

TNF Tumornekrosefaktor

TRAP-6 Thrombin receptor agonist peptide-6

vWF Von-Willebrand-Faktor

WT Wildtyp

Kapitel 1: Einleitung

1

1 Einleitung

Trotz intensiver Forschung und zahlreichen therapeutischen Möglichkeiten

stellt das Krankheitsbild der Sepsis noch immer ein großes Problem auf

intensivmedizinischen und chirurgischen Stationen dar. Die Mortalität ist sehr

hoch und die weltweite Inzidenz steigend [1-3]. Allein in Deutschland

erkranken jährlich 76.000 Patienten an Sepsis und septischem Schock, damit

liegt die Prävalenz auf deutschen Intensivstationen bei 12,4% für Sepsis und

11% für schwere Sepsis [3, 4]. Die Letalität der schweren Sepsis beträgt trotz

stationärer Behandlung und Medikation 55,2%. Es sterben pro Jahr etwa

60.000 Patienten an einer Sepsis. Damit ist sie hinter der koronaren

Herzkrankheit und dem Myokardinfarkt die dritthäufigste Todesursache [4].

Auch wenn in den letzten 20 Jahren das Verständnis pathophysiologischer

Zusammenhänge auf dem Gebiet der Sepsis stark erweitert wurde, stehen

Kliniker noch immer vor den Problemen der rechtzeitigen Diagnose und

entsprechenden Behandlung der Sepsis. Besonders bei den frühen Stadien

der Sepsis ist es wichtig entsprechend einzugreifen, doch gerade diese

werden diagnostisch häufig zu spät erkannt [5].

Definitionsgemäß wird die Sepsis heute vereinfacht als generalisierte

hyperinflammatorische Reaktion auf eine Infektion bezeichnet, die mit SIRS

(systemic inflammatory response syndrome) abgekürzt wird [6]. Dabei sind

Bakterien neben Viren und Pilzen die Hauptauslöser der Infektion und führen

zur Aktivierung von Rezeptoren der angeborenen Immunität. Durch Verlust

von Kontrollmechanismen führt die ausgedehnte Immunantwort schließlich zur

Schädigung des eigenen Organismus. Allerdings überwiegt nur initial diese

proinflammatorische Phase, zusätzlich kommt es in den späten Stadien der

Sepsis gegenregulatorisch zur Antiinflammation, die man als CARS

(compensatory anti-inflammatory response syndrome) bezeichnet, bis hin zur

Immunparalyse. Diese gegensätzlichen Erscheinungen während der Sepsis

und das teilweise Überlappen der beiden Phasen erschweren die Medikation

[7]. Neben dem Ungleichgewicht des Immunsystems gerät auch die

Hämostase außer Kontrolle. Auf der einen Seite kommt es zur massiven

Aktivierung der Gerinnung, die bis hin zum Vollbild der disseminierten

intravasalen Gerinnung (DIC) führen kann. Auf der anderen Seite kommt es


2

zur Aktivierung von Thrombozyten und zur Thrombozytopenie [8]. Sowohl die

gestörte Hämostase, als auch der Abfall von Thrombozyten werden deshalb

unter anderem als diagnostische Marker für die schwere Sepsis verwendet.

Bedeutend sind diese oft vernachlässigten Aspekte, weil eine schwere DIC mit

erhöhter Thrombenbildung und Verbrauchskoagulopathie zur eingeschränkten

Mikrozirkulation der Organe und damit zu deren Versagen führen kann. Die

Thrombozytopenie und der Verbrauch von Gerinnungsfaktoren führen

außerdem zur Hypokoagulabilität und so zur Blutungsgefahr für den Patienten.

Da der Thrombozyt im Krankheitsbild Sepsis selten in Betracht gezogen wird,

obwohl seit langem bekannt ist, dass er mit dem Immunsystem interagiert, soll

seine Funktion in dieser Arbeit näher betrachtet werden.

1.1 Thrombozyten

1.1.1 Aufbau des Thrombozyten

Thrombozyten sind mit einem Durchmesser von 2-5 µm und einem Volumen

von 6-10 fl die kleinsten Zellen im menschlichen Organismus. Die Größe wird

aber mit der immensen Plättchenanzahl von 150000 bis 300000 pro Mirkoliter

Blut ausgeglichen. Diese Menge zirkulierender Thrombozyten entspricht etwa

dem 50fachen an Leukozyten.

Sie haben eine Lebensdauer von etwa 7-10 Tagen im Blut und werden dann

von der Leber oder Milz abgebaut. Sie gelangen in die Zirkulation als kernlose,

diskoide Abkömmlinge der Megakaryozyten, mehrkernigen Riesenzellen im

Knochenmark. Thrombozyten besitzen zwar keinen Zellkern, aber sonst

beinhalten sie durch die Abschnürung vom Megakaryozyt alle

überlebenswichtigen Organellen, sowie zahlreiche Rezeptoren und residuelle

mRNA mit allen notwendigen Mechanismen zur Neusynthese von Proteinen

[9-12].

Der Aufbau der diskoiden Zelle ist sehr homogen, aber dennoch recht

komplex. Die Plasmamembran weist viele Fältelungen auf zur

Oberflächenvergrößerung und dringt in das Innere des Thrombozyts ein zur

Bildung seines einzigartigen kanalikulären Systems (OCS, open canalicular

system). Dieses OCS zieht sich schwammartig durch die Zelle und dient zur

zusätzlichen Speicherung von Proteinen der Glykokalix. Außerdem ist es

beteiligt an Endozytosevorgängen und bei der Sekretion von Proteinen aus


3

den Granula. Neben dem offenen kanalikulären System, findet man in den

kleinen Zellen auch ein geschlossenes kanalikuläres System, das vom rauen

endoplasmatischen Retikulum des Megakaryozyts abstammt. Es beinhaltet

Calcium und zahlreiche Enzyme und übernimmt damit die Kontrolle über

Aktivierungsvorgänge des Thrombozyts und verschiedene metabolische

Funktionen wie die Thromboxansynthese [13]. Weiterhin enthält der

Thrombozyt Speichergranula, die α-, δ- und λ-Granula, die verschiedene

Aktivierungsmarker und Botenstoffe enthalten und nach Aktivierung über

Exozytose freigesetzt werden [14]. Während die λ-Granula Lysosomen

darstellen, enthalten die dichten δ-Granula vor allem niedermolekulare

Substanzen wie Calcium, Nukleotide und Serotonin. Die α-Granula speichern

vorwiegend Proteine wie Plättchen-Faktor 4 (PF4), P-Selektin (CD62P),

Matrixproteine wie Fibrinogen und Fibronektin sowie Wachstumsfaktoren wie

PDGF (platelet derived growth factor) und TGF-β (transforming growth factor).

Inhalte der Granula diffundieren nach Exozytose entweder in den

Extrazellulärraum oder werden als Rezeptoren auf der

Thrombozytenoberfläche exprimiert.

Abb. 1: Schematische Darstellung eines Thrombozyts mit all seinen Organellen


4

Zu sehen sind neben dem Membransystem, einmal dem offenen kanalikulären System (OCS)

und dem geschlossenen kanalikulären System (DTS), die Mitochondrien und die drei

spezifischen Granula (Bildquelle: Rendu et. al) [13].

Die δ-Granula sind kleiner und dichter als die stärker granulierten, irregulären

α-Granula. Die Lysosomen (λ-Granula) weisen eine mittlere Größe und

komplette dichte Füllung auf [13, 15].

Neben dem generellen Aufbau ist vor allem die Expression zahlreicher

Oberflächenmoleküle für die Funktion und Interaktion des Thrombozyten von

Bedeutung. Zu finden sind konstitutiv exprimierte, aber auch induzierbare

Rezeptoren. In den letzten Jahren zeigte sich, dass Thrombozyten nicht nur

funktionelle Rezeptoren für ihre Rolle in der Hämostase aufweisen, sondern

auch viele Oberflächenproteine, die für eine Funktion im Immunsystem

sprechen.

In der Hämostase sind vor allem die Adhäsionsmoleküle von Bedeutung,

spezifische adhäsive Glykoproteine (GP). Die wichtigsten sind hier der

Rezeptor GPIb, der durch Multimere des von Willebrand Faktor (vWF) zum

GPIb/V/IX-Komplex konformiert und so den vWF unter hoher Schubspannung

binden kann. Dieser Vorgang ist wichtig für die initiale Adhäsion der

Thrombozyten an die subendotheliale Matrix, die bei Gefäßschäden freiliegt.

Der vWF, der unter anderem von Endothelzellen der Gefäßintima gebildet

wird, dient dabei als Bindeglied zwischen Thrombozyten und dem bei

Gefäßschäden freiliegendem Kollagen. Bedeutend für die Interaktion zwischen

Thrombozyten ist der Rezeptor für Fibrinogen. Dieser Rezeptor mit der

Bezeichnung GPIIb/IIIa (αIIbβ3) kann erst nach Plättchenaktivierung und

folgender Strukturänderung Fibrinogen binden und ist dann zuständig für die

Thrombusbildung. Pac-1, ein spezifischer Antikörper, der nur an die aktivierte

Form des GPIIb/IIIa-Rezeptors bindet, wird als spezifischer

Aktivierungsmarker bei Thrombozyten genutzt.

Neben den Glykoproteinen besitzen Thrombozyten weitere Rezeptoren, die

eine Rolle im Immunsystem nahe legen. Sie exprimieren pattern recognition

receptors (PRR) wie toll-like Rezeptoren [16, 17] und exozytieren bei

Aktivierung durch mikrobielle Strukturen Mediatoren wie Chemokine und

Zytokine. Als wichtigste Beispiele sollten hier Chemokine wie RANTES

(regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted), MIP-1α


5

(macrophage inflammatory protein 1α) , PF4 und das Zytokin Il1-β genannt

werden. Neben der Ausschüttung von Botenstoffen werden nach Aktivierung

Oberflächenproteine exprimiert, die eine Interaktion mit anderen Immunzellen

vermitteln. Eines der wichtigsten ist hier Adhäsionsmolekül und

Aktivierungsmarker P-Selektin, das nach Plättchenaktivierung aus den

α-Granula entlassen und auf die Membranoberfläche transportiert wird. An

P-Selektin adhärieren Leukozyten über PSGL-1 (P-Selektin Glykoprotein

Ligand-1) und können so auf Plättchenthromben entlang rollen. Der

Aktivierungsmarker wird nach Stimulation mit Thrombin vermehrt

ausgeschüttet. Diese Tatsache wird genutzt um die Funktion von

Thrombozyten zu überprüfen. Verwendet wird dazu auch das synthetische

Thrombinanalogon TRAP-6 (Thrombin receptor agonist peptide-6), das wie

Thrombin über den protease-activated receptor 1 (PAR-1) in sehr geringen

und über PAR-4 in höheren Konzentrationen stark aktivierend wirkt [18].

Ein weiteres Bindungsmolekül für Leukozyten ist CD40L, das auch aus den

α-Granula freigesetzt wird nach Stimulation der Plättchen mit typischen

Thrombozytenagonisten wie Thrombin, Kollagen oder ADP [19].

1.1.2 Aktivierung des Thrombozyten

Thrombozyten lassen sich über verschiedene Wege aktivieren.

Klassischerweise ist die Adhäsion zur subendothelialen Matrix der initiale

Schritt zur Plättchenaktivierung. Bei Beschädigung der Gefäßinnenwand wird

das darunterliegende Subendothel mit seinen Struktur- und

Adhäsionsproteinen wie Kollagen und von-Willebrand-Faktor (vWF) frei. Der

Thrombozyt adhäriert mit den entsprechenden oben genannten spezifischen

Oberflächenproteinen und wird dadurch aktiviert. Zusätzlich kann auch die

Bindung von spezifischen Agonisten wie Thrombin, Kollagen oder ADP an

thrombozytäre Rezeptoren zur starken Aktivierung führen, wobei Thrombin der

stärkste Thrombozytenaktivator überhaupt ist [20]. Nach der Aktivierung

kommt es zu einer Formänderung („shape change“) der Thrombozyten (Abb.

2), die elektronenmikroskopisch sichtbar wird in einer immensen

Oberflächenvergrößerung und Ausbildung von Pseudopodien. Außerdem

fusionieren die Granula mit der Plasmamembran und sezernieren ihren Inhalt

(Degranulation). Es kommt zur Ausschüttung von Sekretionsprodukten wie


6

ADP, Thrombin oder Serotonin und zur Expression von Aktivierungsmarkern

wie P-Selektin. Die Aktivierung ist assoziiert mit einer Bindung von Fibrinogen

an den aktivierten GPIIb/IIIa, die eine Brückenbildung zwischen den

Thrombozyten vermittelt und letztendlich zur Aggregation führt.

Diese Thrombusbildung durch Thrombozyten nennt man auch primäre

Hämostase, während die anschließende Initiation der Gerinnungskaskade als

sekundäre Hämostase bezeichnet wird. Sie wird getriggert durch die

Degranulation und Ausschüttung von Thrombin aus den Thrombozyten. Die

Gerinnung endet in der Synthese von Fibrin und führt zu festen Fibrin-

Plättchen-Thromben. Die granulären Inhaltsstoffe lösen nicht nur die

Gerinnungskaskade aus, sondern führen auch zur Rekrutierung weiterer

Thrombozyten und deren Aktivierung, so dass es zur Amplifikation der

Prozesse kommt.

Abb. 2: Änderung der Thrombozytenform nach Aktivierung

Ruhende Plättchen weisen eine diskoide, homogene Form auf (A). Nach Aktivierung kommt

es zur Kontraktion und Umordnung des Zytoskeletts, resultierend in einer Ausbildung von

Pseudopodien und einer Formänderung (Bildquelle: Mony M. Frojmovic, John G. Milton [21]).

Die sekundäre Hämostase, die über die Gerinnungsfaktoren vermittelt wird,

wird neben Thrombozyten durch den tissue factor (TF) generiert. TF wird

normalerweise konstitutiv von subendothelialen Zellen exprimiert, die keinen

Kontakt zum Blut und damit zu den Gerinnungsfaktoren haben. Bei Verletzung

der Gefäßwand kommt der TF in Kontakt mit dem Blut und es kommt zur

Bindung von Faktor VII und damit zum Anstoß der Gerinnungskaskade. Außer

von den subendothelialen Zellen kann TF von im Blut zirkulierenden

Monozyten und Makrophagen nach deren Stimulation generiert werden.


7

Stimulanzien, die dazu in der Lage sind, sind sowohl Zytokine wie IL-1 oder

TNF, als auch Lipopolysaccharid (LPS) nach Langzeitstimulation. Da dies eine

TF-abhängige Gerinnung ohne Gefäßverletzung bedeuten würde, spielt dieser

Prozess für Hämostasestörungen in der Sepsis eine besondere Rolle.

Thrombozyten tragen durch direkte adhäsive Interaktionen zu der

monozytären TF-Aktivität bei [22, 23].

Die kaskadenartige Aktivierung der Gerinnungsfaktoren endet in der Synthese

von Thrombin, was letztendlich von Fibrinogen Fibrin abspaltet. Fibrinogen ist

ein in der Leber gebildetes Protein, das neben seiner Funktion in der

Hämostase auch als Akute-Phase-Protein fungiert. Da es als Protein einfach

per ELISA im Plasma zu messen ist, wird es als Marker für verschiedene

Erkrankungen genutzt. Ein Absinken würde entweder für eine

Leberfunktionsstörung oder für einen sehr starken Verbrauch von Fibrinogen

sprechen, während ein Anstieg des Akute-Phase-Proteins bei

Entzündungsprozessen und nach operativen Traumen zu verzeichnen wäre.

Zu einem Verbrauch käme es beispielsweise bei starker Aktivierung der

Gerinnungskaskade, wie es bei disseminierter intravasaler Gerinnung der Fall

wäre. Aus diesem Grund zählt ein verminderter Fibrinogengehalt im Plasma

(<100 mg/dl) neben einer verringerten Thrombozytenzahl, einer Verlängerung

der Prothombinzeit und einer Erhöhung von Fibrinmarkern laut der

Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase (ISTH) zu den

Nachweisparametern einer DIC [24].

1.1.3 Funktion des Thrombozyten

Wie aus der Struktur des Thrombozyten bereits hervorgeht, besteht seine

Hauptfunktion in der Aufrechterhaltung der Hämostase, also der Stillung von

Blutungen. Durch seine einzigartige Struktur ist er bestens dafür geeignet

kleine Gefäßverletzungen abzudichten, indem er über Fibrinogen

Querbrücken und Bindungen untereinander ausbildet. Die primäre

Defektheilung durch den Thrombozyt wird unterstützt durch die Aktivierung

des Gerinnungssystem und der Stabilisierung des Thrombus durch Fibrin. Es

kommt zur komplexen Verdichtung durch die Interaktion mit dem

Gerinnungssystem.


8

Neben seine Rolle in der Hämostase wird seit einigen Jahren auch seine

Mitwirkung im Immunsystem diskutiert. Über entsprechende Rezeptoren

interagiert er sowohl mit den bakteriellen Pathogenen als auch mit den

rekrutierten Immunzellen. Thrombozyten werden im Entzündungsgeschehen

aktiviert und kommunizieren über Rezeptoren und die Ausschüttung von oben

genannten Mediatoren mit dem Immunsystem.

1.1.4 Thrombozyten in der Sepsis

Da Thrombozyten beteiligt sind an inflammatorischen Prozessen, ist es nahe

liegend, dass sie auch in der Sepsis einen Einfluss haben. Bekannte

Phänomene für das schwere Krankheitsbild sind die Thrombozytopenie und

die disseminierte intravasale Gerinnung (DIC).

Als Thrombozytopenie bezeichnet man einen Abfall der Blutplättchen auf

weniger als 150 x 109 Plättchen pro Liter Blut. Von diesem Thrombozytenabfall

sind etwa 35-44% der septischen Patienten betroffen. 12-15% weisen sogar

ein Absinken auf nur noch 50 x 109/l Zellen auf. Die septischen Patienten

erfahren diesen Zellrückgang innerhalb der ersten vier Tage auf der

Intensivstation. Das Ausmaß der Thrombozytopenie korreliert direkt mit der

Schwere der Sepsis [25]. Die Ursache für dieses Phänomen in der Sepsis ist

noch nicht vollständig geklärt.

Die systemische Inflammation führt außerdem zur Aktivierung der

plasmatischen Gerinnung und zur Hemmung der Fibrinolyse [26]. Durch die

Bildung von Fibrinablagerungen können eindringende Mikroorganismen und

die inflammatorische Antwort eingedämmt werden [27]. Eine überschießende

Gerinnung kann dagegen mikrovaskuläre Thromben und Organdysfunktion

nach sich ziehen, ein Krankheitsbild, das man dann als disseminierte

intravasale Gerinnung bezeichnet. Hauptaktivator der Gerinnung in der Sepsis

ist der in Makrophagen induzierbare Gewebefaktor, der sogenannte tissue

factor (TF). In der Sepsis anflutende bakterielle Strukturen wie LPS, aber auch

Zytokine wie TNF-α oder P-Selektin von aktivierten Thrombozyten führen zur

Generierung von TF.

Die folgende Verminderung von Gerinnungsfaktoren bei septischen Patienten

bezeichnet man auch als Verbrauchskoagulopathie und führt zu einer

verstärkten Blutungsneigung. Neben dem erhöhten Verbrauch kommt es auch


9

durch verminderte Synthese und Verlust zum Absinken der

Gerinnungsfaktoren [28].

1.2 Pathogenese der Sepsis

Der klassische Begriff der Sepsis wurde bereits 1914 von Hugo Schottmüller

als hämatogene Generalisation einer Lokalinfektion geprägt. Ursache sind

hierbei vor allem die eindringenden Mikroorganismen. Erst Jahrzehnte später

führte eine Theorie von Lewis Thomas zum Weiterdenken im

pathophysiologischen Konzept der Sepsis. Sie besagte, dass nicht nur die

eindringenden Mikroorganismen an sich, sondern vor allem die

Abwehrreaktionen des Organismus für die Schädigung im Rahmen einer

Sepsis verantwortlich seien. Seine Theorie wurde schließlich bestätigt durch

eine Reihe von Studien und mündete in der Definition des systemic

inflammatory response syndrome (SIRS) durch Roger Bone [7, 29]. Am

Anfang dieser hyperaktiven, unkontrollierten Immunreaktion steht vor allem

das angeborene Immunsystem. Es reagiert auf exogene Schädigungen, die

neben Viren und Pilzen vor allem durch Bakterien verursacht werden. Das

Keimspektrum der Sepsis ist abhängig vom Ausgangspunkt der Infektion und

von verschiedenen Wirtsfaktoren wie beispielsweise einer bestehenden

Immunschwäche des Patienten. Trotzdem findet man generell bestimmte

Keime häufiger als andere. Die wichtigsten Vertreter sind die gram-negativen

natürlichen Darmbakterien wie E.coli, Klebsiellen und Enterokokken, sowie

gram-positive Staphylokokken und Streptokokken. Zellen des angeborenen

Immunsystems, wie Makrophagen, neutrophile Granulozyten und dendritische

Zellen können typische molekulare Muster auf diesen Mikroben erkennen,

binden und präsentieren. Diese konservierten Muster, die man auf den

Pathogenen findet, werden als PAMPs (Pathogen-associated molecular

pattern) bezeichnet. Außerdem werden bei Gewebsschäden vom Organismus

sogenannte Alarmine ausgeschüttet, deren bekanntester Vertreter wohl das

HMGB1 (High-Mobility-Group-Protein B1) ist. Alarmine werden nur von

nekrotischen Zellen und Immunzellen freigesetzt. PAMPs und Alarmine fasst

man unter dem Begriff DAMPs (Damage associated molecular pattern

molecules) zusammen. Sowohl die körperfremden Muster als auch die

eigenen Alarmstoffe werden von den Zellen über PRRs wie den toll-like


10

Rezeptoren (TLRs) erkannt und gebunden. Bereits durch Antikörper oder

Komplementfaktoren markierte Bakterien werden durch Fc-Rezeptoren auf

Makrophagen und neutrophilen Granulozyten gebunden, phagozytiert und

durch Fusion mit Lysosomen beseitigt. Die TLR-ausgelöste Signalkaskade

resultiert in der Dislokation des Transkriptionsfaktors NFκB in den Zellkern und

führt zur Aktivierung hunderter verschiedener Gene, die für Proteine

proinflammatorischer Reaktionen kodieren. Neben NFκB werden auch noch

zahlreiche weitere Transkriptionsfaktoren zeitabhängig aktiviert [7].

Es kommt zur Synthese von Zytokinen und Chemokinen. In gesunden

Menschen werden nur sehr geringe Plasmakonzentrationen (pg/ml) detektiert,

während es in der Sepsis zum exzessiven Anstieg der Menge kommt.

Zytokinrezeptoren werden von fast allen Zellen exprimiert und finden sich

zusätzlich in löslicher Form im Plasma. Die wichtigsten Zytokine, die in der

Anfangsphase der Immunreaktion von Makrophagen ausgeschüttet werden,

sind TNF-α und IL-1. Die beiden Zytokine induzieren Leukozyten,

Endothelzellen und weitere organspezifische Zellen zur Produktion weiterer

Mediatoren wie Eikosanoiden, Chemokinen, reaktiven Sauerstoffspezies und

Zytokinen. Hauptsächlich zu nennen sind hier TNF-α, IL-1, IFN-γ, IL-6, IL-8,

IL-12 und IL-17. Eine Untergruppe der Zytokine bilden die Chemokine.

Chemokine sind sehr kleine Signalproteine, die man durch die Anordnung von

Cysteinresten im Molekül in verschiedene Klassen einteilen kann. Man

unterscheidet vier Familien, die CC-, die CXC-, die CX3C -und die C-Familie.

Die Funktion der Chemokine kann unterteilt werden in eine

proinflammatorische, induzierbare und eine homöostatische, konstitutive

Wirkung. Im Entzündungsgeschehen dienen sie vor allem der Aktivierung und

Chemotaxis und damit Migration von Leukozyten. Durch ihre Funktion sind

Chemokine bedeutend in der Immunabwehr gegen Infektionen, aber auch in

der Entwicklung von chronischen entzündungsbedingten Krankheiten, wie

Allergien und Autoimmunkrankheiten.

Näher eingegangen werden soll hier nur auf die CC-Chemokine MDC

(macrophage-derived chemokine, CCL22) und TARC (thymus- and activation-

regulated chemokine, CCL17) und ihren Rezeptor CCR4. Sie gehören zu den

Chemokinen, die sowohl proinflammatorisch als auch homöostatisch wirksam

sind, da sie sowohl beteiligt sind an der T-Zell-Entwicklung als auch an der


11

Rekrutierung von Entzündungszellen durch Chemotaxis. CCR4 wird exprimiert

von dendritischen Zellen, Makrophagen, Basophilen, NK-Zellen und

Thrombozyten, ist aber in erster Linie bekannt durch sein vorwiegendes

Vorkommen auf T-Zellen, vor allem auf dem TH2-Subtyp. Das vermehrte

Vorkommen von CCR4 ist mit vielen Krankheitsbildern verknüpft wie

Lungenfibrose, granulomatöse Lungenerkrankungen und Diabetes. Seine

Rolle in der Sepsis wurde vor allem durch CCR4-/--Mäuse bestätigt. Sie

zeigten ein besseres Überleben nach Induktion einer Sepsis durch operative

polymikrobielle Sepsismodelle oder LPS-Injektion im Vergleich zu septischen

C57BL/6-Mäusen. [30-32].

Die gebildeten Entzündungsmediatoren haben unter anderem Einfluss auf

Blutgefäße und Endothelzellen. Es kommt zur Bildung von Stickstoffmonoxid

und damit zur Vasodilatation und verringertem Blutfluss [33]. Endothelzellen

exprimieren außerdem vermehrt Oberflächenrezeptoren, die eine Adhäsion

der durch die Vasodilatation verlangsamten Leukozyten ermöglichen und

damit die Diapedese zum Entzündungsort vermitteln. Der systemische

Überschuss der Zytokine führt zusätzlich zur Ausprägung klinischer

Symptome. Die Gefäßerweiterung bewirkt einen Blutdruckabfall, außerdem

kommt es zu Fieber, Hyper- oder Hypothermie, Tachykardie, Tachypnoe und

anfangs zu einer Leukozytose. Neben diesen Effekten induzieren Phagozyten

über Präsentation von pathogenen Strukturen die adaptive Immunantwort, die

vermittelt wird von T- und B-Zellen. Zytokine haben hierbei eine zusätzliche

Rolle in der Festlegung der Art der adaptiven Immunantwort. Beispielsweise

differenzieren naive CD4+ T-Helfer-Zellen durch IFN-γ und IL-12 in TH1- und

durch IL-4 in TH2-Zellen. Während TH1-Zellen eine zelluläre Immunantwort über

erhöhte Proliferation zytotoxischer CD8+ T-Zellen auslösen, stimulieren TH2-

Zellen eine humorale Immunantwort über Erhöhung der B-Zell-Proliferation

und Klassenwechsel der gebildeten Antikörper.

Neben der Zytokinproduktion werden durch die eindringenden Mikroben auch

Kaskaden im Plasma aktiviert. Neben dem bereits beschriebenen

Gerinnungssytem wird unter anderem das Komplementsystem aktiviert. Es

führt auf der einen Seite zur direkten Abtötung der Mikroorganismen über die

Bildung eines Membran-Attack-Komplexes, einer Pore in der


12

Bakterienmembran, oder hilft auf der anderen Seite bei der Beseitigung der

Keime durch Opsonierung.

Diese Überreaktion des Immunsystems kann im Extremfall zu einem

hyperdynamen, septischen Schock bis hin zum multiplen Organversagen

führen. Dann spricht man auch vom MODS (multi organ dysfunction

syndrome).

Über einen langen Zeitraum wurde angenommen, dass die unkontrollierte

Hyperinflammation auf die eindringenden Organismen Ursache für die hohe

Mortalität in der Sepsis sei. Die daraufhin durchgeführten Studien mit dem Ziel

zur Unterdrückung der überschießenden Inflammation schlugen allerdings

fehl. Sowohl TNF-Antagonisten, Il-Antagonisten, als auch Antiendotoxin-

Antikörper zeigten nicht die gewünschten Erfolge. Viele starben trotz

Behandlung, vor allem an Sekundärinfektionen. Der Grund hierfür ist die

zweite Phase der Immunantwort. Nach dem Zytokinsturm kommt es zur

kompensatorischen Gegenregulation. Antiinflammatorische Zytokine wie IL-10

sind diesmal die Hauptakteure. Es kommt zur Apoptose peripherer

Immunzellen, zur Anergie der T-Zellen und zu einem Wechsel der T-Helfer-

Zellen zum TH2-Typ. Dies kann im Extremfall zur Immunparalyse führen und

damit zur starken Anfälligkeit für Sekundärinfektionen [34].

1.3 Sepsismodelle

Da die Sepsis ein sehr komplexes Krankheitsbild darstellt, ist es nicht einfach

die zu Grunde liegenden Mechanismen aufzuklären.

Hierbei dienen Tierexperimente als unverzichtbares Modell zur Untersuchung

der Pathomechanismen im Gesamtorganismus und Bindeglied zwischen

molekular- und zellbiologischen Experimenten und klinischen Studien.

Zur Induktion einer Sepsis wurden im Laufe der Jahre viele Modelle entwickelt

von der Injektion von bakteriellen Bestandteilen bis hin zum operativen

Sepsismodell. Im Folgenden sollen die wichtigsten Vorgehensweisen kurz

erläutert werden.

1.3.1 Exogene Verabreichung von Toxinen und Bakterien

Bakterien und vor allem deren Zellwandbestandteil LPS sind oft Ursache für

die Entstehung einer Sepsis. Als Modell wurde deshalb die Injektion von LPS


13

entwickelt. Die Applikation erfolgt intravenös, intraperitoneal oder für einen

längeren Zeitraum als Bolus. Neben in vivo-Gabe ist die Stimulation mit LPS

auch in vitro Gang und Gebe um die Effekte auf einzelne Zellpopulationen

beurteilen zu können. Nach Injektion von LPS in die Tiere kommt es zur

Ausbildung der typischen Symptome eines septischen Schocks.

Um zusätzlich die Expansion der Bakterien und deren Elimination durch den

Wirt, was im LPS-Modell nicht betrachtet werden kann, zu berücksichtigen,

können auch lebendige Bakterien injiziert werden. Klarer Vorteil beider

Modelle ist die einfache Durchführung und die kontrollierbare Menge

eindringender Mikroben. Die Ausprägung der Symptome ist kaum durch

experimentelle unbeeinflussbare Variationen zu ändern. Die Übertragbarkeit

beider Modelle auf den Verlauf des septischen Schocks beim Menschen

konnte bis jetzt allerdings noch nicht gezeigt werden. Um dem wirklichen

Krankheitsverlauf in der Sepsis näher zu kommen, wurden operative Modelle

entwickelt, die von einer Peritonitis ausgehen. Die beiden wichtigsten

Methoden sollen folgend kurz erläutert werden.

1.3.2 Cecal Ligation and Puncture (CLP)

CLP ist das wohl am häufigsten verwendete operative Sepsismodell. Dieses

Modell wurde erstmals 1980 beschrieben [35].

Bei dem CLP-Modell wird das Zökum unterhalb der Ileozökalklappe ligiert und

mit einer Nadel punktiert. Die aus dem künstlich erschaffenen Leck

austretenden Darmkeime erzeugen eine Peritonitis. Die Entwicklung der

Symptome von Peritonitis und Sepsis nach Darmperforation benötigt längere

Zeit und ähnelt deswegen stärker einem klinischen Verlauf als nach LPS-

Injektion.

1.3.3 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP)

Das CLP-Modell wurde in den letzten Jahren weiterentwickelt und führte zu

einem weiteren operativen Modell, der CASP. Erstmals wurde es 1998 von

Zantl et. al. bei der Anwendung an Mäusen beschrieben [36]. Das neue Modell

sollte der generalisierten Peritonitis beim chirurgischen Patienten möglichst

nahe kommen um die immunologische Pathophysiologie einer Sepsis

realitätsnah untersuchen zu können.


14

Der Maus wird bei der CASP ein Stent in den aufsteigenden Dickdarmteil

implantiert. Dadurch wird eine Verbindung zwischen Darmlumen und

Peritoneum hergestellt und ein stetiger Ausfluss von Darminhalt in den

Bauchraum gewährleistet. Die heraustretenden Bakterien führen zur

Ausbildung einer diffusen Peritonitis und schließlich zur polymikrobiellen

Sepsis.

Die CASP wurde von Niko Zantl im Rahmen einer chirurgisch-

mikrobiologischen Kooperation erarbeitet und 1997 erstmals publiziert. Ziel

der Studien war es, ein Tiermodell in der Maus für die postoperative

abdominelle Sepsis zu entwickeln, um damit die immunologische

Pathophysiologie während des Verlaufs einer Sepsis analysieren zu können.

Durch Variation des Durchmessers von 14G bis 18G bei den verwendeten

Stents kann die Mortalität der CASP beeinflusst werden. Das genaue

operative Verfahren der CASP ist unter 3.2.3 beschrieben.

Kapitel 2: Fragestellung der Arbeit

15

2 Fragestellung der Arbeit

Die Bedeutung der Thrombozyten wuchs in den letzten Jahren mehr und mehr

über ihre alleinige Funktion in der Hämostase hinaus. Ziel der vorliegenden

Arbeit ist es, die erweiterte Rolle dieser kernlosen Zellen in der Sepsis zu

untersuchen. Septische Patienten leiden oft unter Thrombozytopenie und

disseminierter intravasaler Gerinnung, die die Prognose der Krankheit

zusätzlich verschlechtern. Die Verhaltensweisen der Thrombozyten in der

Sepsis sollen sowohl in vitro als auch in vivo in einigen Punkten untersucht

werden. Schwerpunkt ist dabei in vitro die Reaktion auf Stimulation mit

Bakterienbestandteilen und in vivo die Verteilung der Thrombozyten im

septischen Mausmodell. Induziert wird das komplexe Krankheitsbild der

Sepsis dabei über die Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP), die eine

Möglichkeit bietet die Situation einer polymikrobiellen Sepsis realistisch

nachzubilden.

Neben den Thrombozyten als ein Akteur in der Sepsis und möglicher

Angriffspunkt für neue therapeutische Strategien, soll auch der

Chemokinrezeptor CCR4 untersucht werden. Da neben Immunzellen auch

Blutplättchen CCR4 exprimieren und CCR4-/--Mäuse ein besseres Überleben

nach CASP zeigen, wird hier ein möglicher Zusammenhang vermutet und am

Mausmodell untersucht [30].

Kapitel 3: Material und Methoden

16

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Reagenzien und Chemikalien

Aceton Merck, Darmstadt

Ammoniumchlorid (NH4Cl) Merck, Darmstadt

Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) Sigma-Aldrich Chemie,

Steinheim

Bovines Serumalbumin ICN Biomedicals, Aurora, USA

Bovine Albumin 22% Ortho-Clinical Diagnostics Inc.

Neckargmünd

Biotin Blocking System, ready-to-use Dako, Glostrup

Cellfix BD Biosciences

Chloroform Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

Complete Roche, Mannheim

DABCO Merck, Darmstadt

Destilliertes Wasser GIBCO, InvitrogenTM

- DNase/RNase frei

Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

DNAse Qiagen, Hilden

dNTPs MBI Fermentas, St. Leon – Rot

EDTA Merck, Darmstadt

Einbettmedium Tissue - Tek® Sakura Finetek Europe B.V.,

Zoeterwoude, Niederlande

Ethanol unvergällt Carl Roth, Karlsruhe

FACS - Puffer Becton Dickinson, Heidelberg

Fötales Kälberserum, inaktiviert Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi Biotec

Hepes Puffer Sigma-Aldrich Chemie,

Steinheim


17

Histopaque -1083 Sigma-Aldrich Chemie,

Steinheim

Isotonische Natriumchlorid-Lösung Delta Select, Pfullingen

Korsolex Bode Chemie GmbH & Co. KG,

Hamburg

Lipopolysaccharid (LPS), E.Coli O127:B8 Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

Lyse-Puffer BD Biosciences

Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

N - Acetyl - L - alanyl - L - Glutamin Biochrom AG, Berlin

Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt

PBS Dulbecco w/o Ca2+, Mg2+ Biochrom AG, Berlin

PBS, steril Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

PBS Dulbecco (1x) w Ca2+, w Mg2+ Biochrom AG, Berlin

Pefa - Bloc Roche, Mannheim

Peroxidase Blocking Reagent (Dako) Dako

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

2-Propanol Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

Random Primers Invitrogen, Karlsruhe,

SuperArrays

RNase ZAP® Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

RNAsin Ribonuclease Inhibitor Promega, Mannheim

Superscript II RNAse H

Reverse Transcriptase Invitrogen, Karlsruhe

TaqMan® Universal PCR Mastermix Applied Biosystems,

Branchburg

TaqMan Assay Reagents

- für Real – Time PCR Applied Biosystems,

Branchburg


18

Tergitol Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

TRAP-6, PAR-1 (1-6) (human) BACHEM, Bubendorf, Schweiz

Triton X 114 Sigma- Aldrich Chemie,

Steinheim

TRI Reagent Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

Türck`s Lösung Merck, Darmstadt

Tween 20 Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

3.1.2 Kits

CD4+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec GmbH

RNeasy® Mini Kit Qiagen, Hilden

TSATM Biotin System, für 200-600 Proben PerkinElmer, Wartham , USA

3.1.3 Primer

murine GAPDH probe (Farbstoff: VIC) Applied Biosystems,

Branchburg

CCR4 TaqMan assay (Mm99999052_s1) Applied Biosystems,

Branchburg

3.1.4 Antikörper

Rat polyclonal IgG, PE-labeled (P190-2) emfret analytics Eibelstadt

Rat polyclonal IgG, FITC-labeled (P190-1) emfret analytics Eibelstadt

rat monoclonal anti-mouse GPIbβ (CD42c)

FITC labeled (M050-1)

emfret analytics Eibelstadt

donkey polyclonal anti-goat IgG

PE-labeled (705-708-125)

Rockland, Gilbertsville

Purified rat anti-mouse CD62P (550289) BD PharmingenTM

Purified Rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6c

(553123)

BD PharmingenTM


19

FITC labeled monoclonal anti-mouse CD4

(130-091-608)

Miltenyi Biotec

PE conjugated anti-mouse CD45RB

(120455)

eBioscience

rat monoclonal anti-mouse CD34

PE-labeled (12-0341)

eBioscience

PE-CyTM5 Mouse Anti-Human CD62P

(551142)

BD PharmingenTM

FITC PAC-1 (340507) BD PharmingenTM

CD42a-PE (558819) BD PharmingenTM

IgG1-PE-Cy5 (555750) BD PharmingenTM

PE-Cy5 monoclonal anti-human CD41,

Klon P2 (6607116)

Beckman Coulter GmbH

Isotyp Tricolor V, PNIM 1672 Beckman Coulter GmbH

POD conjugated F(ab’)2 Fragment mouse

anti-ratIgG (H+L), (212-036-168)

Jackson

Immuno Research

Farbstoffe

Alexa 488 (A-11090) Molecular Probes

Streptavidin TRITC (016-030-084) Dianova

3.1.5 Puffer und Lösungen

Erythrozyten - Lysepuffer: Aqua bidest

155 mM NH4Cl

10 mM KHCO3

0,1 mM EDTA

Sucrose-Lösung 15 ml HEPES-Waschpuffer

6 % Sucrose

0,06 % Triton X114

Lösung A 80 g NaCl


20

2 g KCl

10 g NaHCO3

0,5 g NaH2PO4×H2O

500 ml Aqua bidest

Tyrode Ansatz 2 ml Glucose 10% in A. bidest

5 ml Lösung A

1 ml HEPES 0,5M pH 7,3

40 mg Adenosin

18 mg Theophyllin

92 ml A. bidest

3.1.6 Laborgeräte

ABI Prism® 7000 Sequence Detection

System

Applied Biosystems, Foster

City

Durchflusszytometer Beckman Coulter,

FC 0

Beckman Coulter, Krefeld

Digitalkamera Power Shot S50 Canon Deutschland GmbH,

Krefeld

Digitalwaage BL 150 S Sartorius AG, Göttingen

Eismaschine IceLine KF85

Fluoreszenzmikroskop Leica DM IL

Migel

Leica Microsystems, Wetzlar

Halbmikroküvetten Brand, Wertheim

Magnetrührer (MR 3001 K)

Magnetständer MACS® MultiStand

Heidolph, Schwabach

Miltenyi Biotec,

Bergisch Gladbach

Mikrotom - Kryostat Cryo - Star,

HM 560

Microm, Walldorf

NanoDrop 2000/2000c

pH-Meter inoLab

Peqlab Biotechnologie GmbH,

WtW, Weilheim

Pipetten Eppendorf, Hamburg

Reagenzglasschüttler Vortex Merck Eurolab N.V., Leuven,

Belgien

Spectrophotometer NanoDrop 2000,

peqLab

Biotechnologie GmbH,

Erlangen


21

Sterilwerkbank Microflow Nunc GmbH & Co. KG,

Wiesbaden

Sterilwerkbank Herasafe Heraeus, Hanau

Thermocycler Biometra, Göttingen

Ultraschallbad Sonorex TK 52 Bandelin, Berlin

Zellzählung Sysmex KX-21N Sysmex Digitana AG Horgen

Zentrifugen:

Centrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg

Megafuge 1.0 R Heraeus, Hanau

Cytospin 4 Shandon

Chirurgisches Besteck:

Pinzette Asanus, Neuhausen ob Eck

Nadelhalter, Mikronadelhalter Asanus, Neuhausen ob Eck

Schere, Mikroschere Asanus, Neuhausen ob Eck

3.1.7 Verbrauchsmaterialien

Chirurgisches Nahtmaterial:

Mariderm schwarz 7/0 USP Catgut GmbH, Markneukirchen

Polyester weiß 4/0 USP Catgut GmbH, Markneukirchen

96-Well Optical Raction Plate

Deckgläser

Applied Biosytems, Foster City, USA

Superior, Marienfeld

Einbettschälchen Cryomold® Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude,

Niederlande

Einmalskalpelle Ansell Medical, Cergy Pontoise, Frankreich

Einmalspritzen 1ml Dispomed, Gelnhausen

Einmalspritzen Omnican® F 1 ml Braun, Melsungen

Einmalspritze 5 ml Injekt Braun, Melsungen

Halbmikroküvetten Brand, Wertheim

Hämatokritkapillaren Brand, Wertheim

Kryoröhrchen Nunc, Roskilde, Dänemark

MicroAmpTM,

Optical Adhesive Film

Applied Biosystems, Branchburg, USA


22

Objektträger Superfrost® Plus Menzel Gläser, Braunschweig

Optische Platten

(Real – Time PCR)

Applied Biosystems, Branchburg, USA

PCR Softtubes 0,2ml

Pipettenspitzen

Biozym Scientific GmbH, Oldendorf

Eppendorf, Hamburg

Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg

Röhrchen für FACS - Analyse Becton Dickinson, Heidelberg

Safe Seal-Tips® professional

Spritzenvorsatzfilter

0,2µm, 0,45µm

Biozym

Merck, Bruchsal

Venenverweilkanülen 16G BD Vialon Biomaterial, Heidelberg

Wattestäbchen care&serve

Zellsiebe 70 µm BD Pharmingen, Heidelberg

Zentrifugenröhrchen:

Spitzboden 15 ml und 50 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen

Rundboden 12 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen

3.2 Methodik in vivo

3.2.1 Genehmigung der Tierversuche

Gemäß dem deutschen Tierschutzgesetz wurden die Tierversuche vor der

Durchführung von der zuständigen Behörde, dem Landesveterinäramt und

dem Lebensmitteluntersuchungsamt Mecklenburg-Vorpommern genehmigt,

gemäß Aktenzeichen LALLF M-V/TSD/7221.3-11-025/08.

3.2.2 Tiere und Tierhaltung

Als Versuchstiere wurden sowohl C57BL/6 Mäuse als auch CCR4-/- Mäuse

verwendet. Beide Gruppen waren weiblich und bei Versuchsdurchführung

8-12 Wochen alt mit einem Gewicht von 20-25g. Die C57BL/6 Mäuse wurden

von Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany

GmbH in Sulzfeld Frankreich bezogen und die knock-out Mäuse stammen aus

eigener Zucht. Gehalten wurden die Tiere in Makrolonkäfigen (Ehret GmbH

Emmendingen,Deutschland) mit Gruppengrößen von fünf bis zehn Tieren. Der

Käfig war ausgestattet mit 200g Einstreu (Lignocel®, Naturholzfasern), Wasser


23

ad libitum und Alleinfutter in pellettierter Form (M-Z Extrudient, ssniff

Spezialdiäten GmbH). Die Tiere wurden im Biotechnikum in der Walther-

Rathenau-Straße, Greifswald, gehalten, das durch die Ernst-Moritz-Arndt-

Universität Greifswald angemietet wird. Zur Gewährleistung gleicher

Versuchsbedingungen wurden die Tiere eine Woche vor Durchführung der

Experimente unter gleichen Bedingungen im Tierstall eingewöhnt. Alle

Tierversuche wurden unter Einhaltung des deutschen Tierschutzgesetzes

durchgeführt.

3.2.3 Tiermodelle

Zur Sepsisinduktion wurde das Modell der Colon Ascendens Stent Peritonitis

(CASP) angewendet.

3.2.3.1 Anästhesie

Zur Narkotisierung der Versuchstiere wurde eine Injektionlösung aus

2% Rompun, 25 mg/ml Ketanest und 0,9% NaCl frisch hergestellt und 10 µl

pro Gramm Körpergewicht intraperitoneal injiziert. Ungefähr 5 Min nach der

Injektion wurde die Tiefe der Narkose durch Setzen eines Schmerzreizes an

den Hinter- und Vorderpfoten überprüft und gegebenenfalls 0,1 ml

nachgespritzt. Im narkotisierten Zustand wurde die Maus rücklings für die

Operation auf einer Styroporplatte an Vorder- und Hinterläufen fixiert.

3.2.3.2 Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP)

Bei der CASP wird durch einen kontinuierlichen Austritt von Bakterien der

natürlichen Darmflora in die Bauchhöhle eine disseminierte Peritonitis und

Sepsis hervorgerufen. Der Übertritt der Pathogene wird durch Einbau eines

Stents in das Colon Ascendens der Maus ermöglicht. Der Stent verbindet

Darmlumen und Bauchhöhle und sorgt für einen Übertritt von Fäzes in den

Bauchraum. Je nach Größe des eingesetzten Stents (14G, 16G, 18G) variiert

die Schwere der Sepsis und damit die Letalität. In dieser Arbeit wurden

ausschließlich Stents mit einem Durchmesser von 16 Gauge zur

Sepsisinduktion verwendet.


24

Folgende Instrumente wurden verwendet:

- Mikrochirurgisches Besteck: Mikronadelhalter, Pinzette, Mikroschere

- Nadelhalter

- Schere

- Wattestäbchen, Tupfer, Pflaster

- Venenverweilkatheter: 16G VenflonTM, 1,7x45 mm; 180 ml/Min

(Becton Dickinson, Heidelberg)

- Faden: 4/0 Polyester (Catgut GmbH, Marktneukirchen)

7/0 Mariderm schwarz (Catgut GmbH, Marktneukirchen)

Durchführung der Operation

Vor der Operation wird das Versuchstier wie in 3.2.3.1 beschrieben

anästhesiert. Zur Vorbereitung wird der 16G Venenverweilkatheter etwa 2 mm

nach Beginn der Kunststoffummantelung mit einer Schere zirkulär eingeritzt.

Die entstandene Inzision im späteren Dickdarmstent dient dann als Widerlager

für den Faden.

Nachdem die Maus ausreichend narkotisiert wurde, wird sie in Rückenlage auf

einer Styroporplatte mit Pflasterstreifen an den Rück- und Vorderläufen fixiert.

Das Bauchfell wird desinfiziert mit 70%igem Ethanol und mit einem Tupfer

glatt gestrichen um zu vermeiden, dass Haare in die Bauchhöhle gelangen.

Die desinfizierte Bauchhaut wird mit einer Pinzette leicht angehoben um die

folgende Inzision der Haut zu erleichtern. Die Haut und analog die darunter

liegende Muskelfaszie werden ab der Symphyse unter Vermeidung von

Blutung ca. 15 mm nach kranial inzidiert.

Mittels zweier Wattestäbchen wird der Zökalpol aufgesucht um anschließend

Zökum, Colon ascendens und terminales Ileum vorsichtig nach außen zu

luxieren. Das Colon ascendens wird ca. 15 mm nach der Mündung des

terminalen Ileums mit Mariderm 7/0 durchstochen und ein Knoten wird

vorgelegt. Nun erfolgt die Punktion der antimesenterialen Seite des Colon

ascendens mit dem vorbereiteten Venenverweilkatheter unmittelbar aboral

des vorgelegten Knotens. Der Katheter wird anschließend vorsichtig vorwärts

geschoben, bis sich die Kerbe des Plastikmantels auf Höhe der Serosa

befindet. Der Stent wird nun mit den freien Enden des Fixierungsfadens

mittels chirurgischen Knoten in der Inzision befestigt und so am Hinausgleiten


25

gehindert. Eine weitere Fixationsnaht erfolgt von hier aus nach aboral durch

einen Stich durch die Darmwand. Zuletzt wird die Nadel vorsichtig

herausgezogen und der Stent auf ca. 1 mm über der Serosa gekürzt.

Vor der Rückverlagerung der Darmteile in die Bauchhöhle, wird der Stent

durch leichten Druck mit zwei Wattestäbchen auf das Zökum mit Fäzes gefüllt.

Sind Zökum, Colon ascendens und terminales Ileum reponiert, werden ca.

0,5 ml 0,9%iger Kochsalzlösung in die Bauchhöhle injiziert um den

Flüssigkeitsverlust während der OP auszugleichen. Die Wunde wird

fortlaufend mit 4/0 Polyesterfaden vernäht, sodass sowohl Peritoneum als

auch Muskulatur und Haut gut verschlossen sind.

3.2.3.3 Schmerztherapie

Alle Mäuse erhielten postoperativ eine Schmerztherapie mit Buprenorphin

0,1 mg/kg pro Tag i.m..

3.2.4 Organentnahme

Vor Entnahme der einzelnen Organe wurden die Tiere wie unter 3.2.3.1

beschrieben narkotisiert. Begonnen wurde mit der Punktion des

Retroorbitalplexus des Auges um Blut zu gewinnen. Eine mit EDTA

beschichtete Mikro-Hämatokrit-Kapillare wurde genutzt zur Unterbindung der

Blutgerinnung. Etwa 1 ml Blut wurde aufgefangen und durch bereits im Gefäß

vorgelegtes Antikoagulanz (170 µl ACDA und 5 µl Hirudin) antikoaguliert. Das

Blut wurde bis zur Weiterverarbeitung ruhig und bei RT gelagert. Zur weiteren

Organentnahme wurde das Tier in Rücklage fixiert und nach Desinfektion der

Haut an der Operationsnaht bzw. Linea alba mithilfe einer Mikroschere

vollständig eröffnet. Milzen zur CD4+-Zellisolation wurden vorsichtig

freipräpariert, entnommen und in PBS auf Eis gelagert. Organe für die

histologische Aufarbeitung wurden in Tissue-Tek® gebettet und in flüssigem

Stickstoff schockgefroren. Entnommen wurden linker Leberlappen, Milz, linke

Niere und die Lunge. Bei der Entnahme der Lunge wurde vorher die Trachea

durchtrennt um über diese Öffnung beide Lungenlappen mit Tissue-Tek® zu

füllen. Dadurch wurde der Erhalt der feinen Alveolenstruktur trotz des

Schockgefrierens gewährleistet. Bis zum Schneiden der Organe wurden sie

bei -80°C gelagert.


26

3.3 Zellbiologische Methoden mit humanen Zellen

3.3.1 Abnahme und Präparation der Blutproben

Die Blutproben zur Durchführung der Stimulationsexperimente wurden von

gesunden, freiwilligen Spendern des Instituts für Immunologie und

Transfusionsmedizin Greifswald, denen im Rahmen einer Blutspende Vollblut

abgenommen wurde, gewonnen. Das kubital, venös entnommene Blut wurde

mit Citrat antikoaguliert und ruhig gelagert um eine Aktivierung von

Thrombozyten zu vermeiden. Anschließend folgte die Stimulation der Zellen.

Folgende Stimulanzien wurden sowohl für Vollblut als auch für

plättchenreiches Plasma verwendet:

- Lipopolysaccharid (LPS) aus E.Coli O127:B8, Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen

- TRAP-6, PAR-1 (1-6) (human) (thrombin receptor agonist peptide-6),

Bachem

3.3.2 Stimulation von Vollblut

Humanes Citratvollblut wurde vor dem Versuch mit dem Sysmex Cellcounter

gezählt. Pro FACS-Röhrchen wurden 100 µl Vollblut vorgelegt und entweder

mit 1-10 µg/ml LPS (E.coli O127:B8), 50 µmol/l TRAP-6 oder beidem

stimuliert. Die Negativkontrolle wurde mit 1 µl PBS (+Ca/+Mg) versetzt.

Anschließend wurden die Proben 4 h bei 37°C inkubiert. Daran schloss sich

die Messung der Oberflächenexpression der Aktivierungsmarker mittels

Durchflusszytometrie.

3.3.3 Stimulation von plättchenreichem Plasma (PRP)

Das Citratvollblut wurde 20 Min. bei 860 rpm, ohne Bremse zentrifugiert zur

Gewinnung des thrombozytenreichen Plasmas. Das Plasma wurde vorsichtig

in ein neues FACS-Röhrchen überführt und die Anzahl der Thrombozyten

wurde mit dem Sysmex Cellcounter bestimmt. Die Probe wurde mit PBS

(+Ca2+, +Mg2+) auf eine Zellkonzentration von 1x108/ml eingestellt. Im


27

Testansatz wurden pro Röhrchen dann 50 µl PRP überführt, was einer Anzahl

von 5x106 Plättchen entsprach. Zur Stimulation wurden jeweils LPS

(10 µg/ml), TRAP-6 (50 µmol/l), beides oder als Negativkontolle PBS

hinzugesetzt und die Proben für 2-4 h bei 37°C inkubiert. Anschließend

erfolgte die Messung der Aktivierung mittels Markierung durch spezifische

Antikörper in der Durchflusszytometrie.

3.4 Zellbiologische Methoden mit murinen Zellen

3.4.1 Isolation muriner Thrombozyten

Bevor mit der eigentlichen Isolation begonnen wurde, wurde zum Tyrode

Ansatz sowohl Hirudin (1000 U/ml, 4 µl auf 10 ml Tyrode Ansatz) als auch

BSA (10%ig) hinzugefügt. Die Lösung wurde auf 37°C erwärmt und mit

25%iger HCl auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.

Dem antikoagulierten murinen Blut wurde 1 ml des angesetzten Tyrode-

Ansatzes hinzugefügt. Schütteln oder vortexen des Eppendorfgefäßes wurden

unterlassen um eine Aktivierung der Thrombozyten zu vermeiden. Die

Mischung wurde bei 200xg 5 Min. ohne Bremse bei RT zentrifugiert. Das nun

als obere Schicht vorliegende PRP wurde vorsichtig in ein neues

Eppendorfgefäß überführt und nochmal mit 1 µl ProstaglandinE1/ml

antikoaguliert. Bei 169xg ohne Bremse wurden für 5 Min. die Erythrozyten

abzentrifugiert. Das PRP wurde wieder in ein neues Eppendorfgefäß überführt

und mit 111 µl ACDA/ml versetzt. 100 µl des PRP wurden zur Zellzählung

verwendet, der Rest wurde zur weiteren Verwendung bei 1400xg 5 Min. bei

RT pelletiert.

3.4.2 Aufarbeitung muriner Lymphozyten

3.4.2.1 Isolation von PBMCs aus dem peripheren Blut

Die Isolation der Lymphozyten und Monozyten aus dem peripheren murinen

Blut erfolgte mittels Zentrifugation über einen Dichtegradienten. Hilfsmittel war

hierbei HISTOPAQUE 1083, eine Lösung aus Polysaccharose und

Natriumdiatrizoat mit einer Dichte von 1.083 g/ml.

Das Blut wurde mit PBS 1:2 verdünnt. Histopaque (3 ml) wurde vorgelegt und

dann vorsichtig mit 3 ml des vorverdünnten Blutes überschichtet.

Anschließend wurde 30 Min. bei RT und 400xg ohne Bremse zentrifugiert.


28

Durch die Zentrifugation werden die Blutzellen separiert. Die Erythrozyten

aggregieren mit der Polysaccharose des Histopaques und befinden sich dann

zusammen mit den Granulozyten aufgrund ihrer hohen Dichte in der untersten

Schicht. Die mononukleären Zellen liegen als Zellring auf der Histopaque-

Phase. Die darüber befindliche Plasmaschicht wurde bis ca. 5 mm über den

PBMCs abgenommen und verworfen. Die PBMCs wurden überführt und mit

PBS verdünnt. Es folgten Waschschritte zur Elimination überschüssiger

Thrombozyten und zur vollständigen Entfernung des Histopaques. Zuerst

wurden die Zellen zentrifugiert bei 250xg für 10 Min. Der entstehende

Überstand wurde abgegossen und das Röhrchen wurde wieder mit 5 ml PBS

aufgefüllt, vermischt und bei 250xg 10 Min. zentrifugiert. Dieser Waschritt

wurde wiederholt und anschließend wurde das Zellpellet in 500 µl PBS

aufgenommen und mit dem Sysmex Zellcounter gezählt. Zur RNA-Isolierung

wurden die Zellen 10 Min. bei 250xg pelletiert und bei -80°C gelagert.

3.4.2.2 Isolation von CD4+-Zellen aus der Milz

Die Isolation der T-Helfer-Zellen aus der Milz erfolgte über ein indirektes

magnetisches Markierungssystem, bei dem alle Nicht-CD4+-Zellen depletiert

werden. Alle unerwünschten Milzzellen werden mithilfe eines Cocktails aus

Biotin-konjugierten Antikörper markiert und bleiben später auf einer

magnetischen Säule hängen, so dass im Eluat die gewollten CD4+-Zellen sind.

Zuvor muss die Milz zu einer Einzelzellsuspension aufgearbeitet werden.

Während des gesamten Isolationsprozesses wurden die Milzen gekühlt und

die Waschschritte erfolgten bei 4°C für 10 Min. bei 300xg in der Zentrifuge.

Während des gesamten Vorgangs wurden alle Puffer gekühlt verwendet. Die

Inkubationen wurden bei 4°C durchgeführt um unspezifische Zellmarkierungen

zu vermeiden. Die Milz wurde durch ein 70 µm Zellsieb gedrückt und dabei mit

PBS/2%FCS (fötales Kälberserum) gespült. Danach wurden die Zellen

gewaschen und das Zellpellet wurde in PBS resuspendiert. Anschließend

wurden die Erythrozyten lysiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von

PBS/2%FCS abgestoppt. Nach einem weiteren Waschschritt wurde das Pellet

in 1 ml PBS/2%FCS aufgenommen und am Sysmex Cellcounter wurden die

Zellen gezählt. Die Zellen wurden nun nochmal bei 470xg 5 Min. zentrifugiert,

um mit dem magnetischen Labeling zu beginnen. Das Pellet wurde in MACS-


29

Puffer resuspendiert (40 µl pro 1x107 Zellen) und mit dem Biotin-Antikörper-

Cocktail für 10 Min. bei 4°C versetzt (10 µl pro 1x107 Zellen),. Der Cocktail

enthält Antikörper gegen CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220),

CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-class II, und Ter-119 und markiert damit

CD8+-T-Zellen, B-Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen, NK-Zellen und

Granulozyten. Nach weiterer Zugabe von MACS-Puffer (40 µl pro 1x107

Zellen) wurden die Anti-Biotin MicroBeads dazu pipettiert und 15 Min.

inkubiert. Alle Zellen, die durch einen Antikörper markiert werden, binden

zusätzlich die magnetischen Microbeads und verbleiben dadurch später an

der Säule. Die Zellen wurden mit 1 ml MACS-Puffer gewaschen und

zentrifugiert für 10 Min. bei 300xg und dann in 500 µl Puffer aufgenommen.

Für die Separation wurden die MACS Separation Colums in dem Magneten in

Position gebracht und mit einem Pre-Separation-Filter versehen um eine

Verklumpung durch zu große Zellreste in der Säule zu vermeiden. Bevor die

Probe aufgetragen wurde, wurden beide Systeme mit 500 µl Puffer gespült.

Nach dem Durchlauf der Probe wurde dreimal mit 500 µl Puffer nachgespült.

Vor jedem Schritt wurde darauf geachtet, dass die Flüssigkeit vorher komplett

die Säule passiert hat. Die isolierten Zellen wurden gezählt und zur

Überprüfung der Reinheit mit einem CD4+-FITC und einem CD45-PE

markierten Antikörper durchflusszytometrisch gemessen. Für die RNA-

Isolation wurden die Zellen bei 300xg 10 Min. zentrifugiert.

3.5 Molekularbiologische Methoden

3.5.1 RNA-Isolation

Die RNA-Isolation erfolgte sowohl mit TRI Reagent als auch mit dem RNeasy

Mini Kit. Vor der Isolation wurde der Arbeitsplatz mit RNase ZAP® von RNasen

befreit. Zur Isolation wurden ausschließlich Pipetten mit Filter Tips verwendet.

RNA-Isolation mit TRI Reagent

Die Gesamt-RNA aus den PBMCs wurde mit der TRIZOL-Methode gewonnen,

modifiziert nach Chomczynski und Sacchi. Nachdem 5-6x106 Zellen isoliert

und pelletiert wurden, wurde 1 ml Trizol dazu gegeben und resuspendiert bis

sich die Zellen gelöst hatten. Durch diese Mischung aus Phenol und

Guanidinisothiozyanat werden Zellbestandteile gelöst und zerstört, während


30

die Integrität der RNA gewährt wird. Nach 5 Min. Inkubation bei RT wurden

200 µl Chloroform dazugegeben und 15 s geschüttelt. Die Probe wurde 7 Min.

inkubiert und 15 Min. bei 12000xg zentrifugiert, wodurch es zur Aufteilung der

Probe in drei Phasen kommt. In der oberen wässrigen Phase befindet sich die

RNA während die untere Protein enthält. Die DNA verteilt sich auf die untere

und mittlere Phase.

Nach Abnahme der oberen Phase, wurde mit 500 µl Isopropanol die RNA

präzipitiert und nach 10 Min. Inkubation bei 12000xg 10 Min. zentrifugiert. Je

nach RNA-Gehalt bildet sich ein gelartiges Pellet. Die RNA wurde noch einmal

mit 75%igen Ethanol gewaschen und anschließend bei RT getrocknet. Zuletzt

wurde die RNA in 20 µl RNase freiem Wasser gelöst und bei -80°C gelagert.

Zur Überprüfung der RNA-Qualität wurden 2 µl der RNA auf den NanoDrop

2000/2000c gegeben.

RNA-Isolation mit dem RNeasy Mini Kit (Quiagen)

Die RNA-Isolation muriner CD4+ Milzzellen erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit.

Die Milzzellen wurden nach der Isolation pelletiert und aus maximal 1x107

Zellen wurde entsprechend der Herstellerangaben die RNA isoliert. Zwischen

den einzelnen Schritten wurde ein DNA-Verdau eingefügt. Es wurden 10 µl

DNase und 70 µl des zugehörigen RDD-Puffers auf die mit der Probe

benetzten Säule aufgetragen und 15 Min. bei RT inkubiert. Anschließend

wurde mit dem RW1-Puffer wie angegeben fortgefahren. Zum Schluss wurde

die RNA mit 40 µl RNase-freiem Wasser nach 5 Min. Inkubation von der Säule

bei 15700xg gelöst und bis zur Weiterverarbeitung bei -80°C gelagert.

RNA-Kontrolle mit dem NanoDrop 2000/2000c

Nach RNA-Isolation wurden 2 µl der Probe auf den NanoDrop gegeben und

photometrisch untersucht. Über die Absorption bei 260 nm wurde die

Konzentration der RNA bestimmt. Mit dem Quotienten 260 nm/280 nm wurde

die Proteinverunreinigung ermittelt, da Protein Licht einer Wellenlänge von

280 nm absorbiert. Es wurde nur RNA weiterverwendet, deren Quotient

zwischen 1,7-2,1 lag und somit eine geringe Verunreinigung aufwies.


31

3.5.2 Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion

Zur Quantifizierung der CCR4-mRNA und damit der Transkriptionsrate der

Zellen wurde eine quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt. Hierbei werden die

gewonnenen Nukleinsäuren nach der Polymerasekettenreaktion vervielfältigt

und gleichzeitig eine Quantifizierung mittels Fluoreszenzfarbstoffen

ermöglicht. In dieser Arbeit wurde mit TaqMan Sonden gearbeitet, die am 3‘-

Ende mit einem Quencher-Farbstoff und an 5‘-Ende mit dem Reporter-

Fluoreszenzfarbstoff FAM markiert werden.

Reverse Transkription

Vor der PCR muss die isolierte RNA in cDNA umgewandelt werden. Hierzu

wurde ein Mastermix aus allen benötigten Reagenzien vorbereitet.

Für 1 µg RNA wurde benötigt:

- 2 µl Random Primer

- 8 µl 1st strand buffer

- 4 µl 0,1 M DTT

- 4 µl 10 mM dNTP

- 1 µl RNAsin

- 2 µl Superscript

- 3 µl RNase-freies Wasser

Es wurde mit Handschuhen und auf Eis gearbeitet. Außerdem wurden Filter

Tips als Pipettenspitzen verwendet um Kontamination mit RNase und DNase

möglichst auszuschließen. Nachdem 40 µl Probe bestehend aus Mastermix

und RNA in die PCR Softtubes gegeben wurde, wurde mit dem Thermocycler

cDNA synthetisiert.

Folgendes Programm wurde verwendet:

- 10 Min. 25°C

- 60 Min. 37°C

- 5 Min. 95°C

- 5 Min. 4°C

Eine Probe bestehend aus Mastermix und Wasser statt RNA dient später als

Negativkontrolle.


32

Quantitative Echtzeit PCR

Für die PCR wurde ein PCR-Mastermix hergestellt bestehend aus Mastermix

und Nukleotidsonden.

Der PCR-Mastermix wurde wie folgt hergestellt:

- 12,5 µl TaqMan Mastermix

- 1,25 µl CCR4-FAM (Nukleotidsonde) oder GAPDH-VIC (endogene

Kontrolle)

- 6,25 µl RNase-freies Wasser

20 µl des PCR-Mastermixes wurden pro Well der 96-Well-Platte vorgelegt. Pro

Well wurden jeweils 5 µl cDNA dazugeben. Jede Probe wurde als

Dreifachbestimmung aufgetragen. Die Negativkontrolle wurde einfach

aufgetragen. Die Platte wurde mit einer Klebefolie verschlossen und bei

2800 rpm 3 Min. zentrifugiert. Anschließend wurde sie in den Thermocycler

(Sequence Detection System) überführt und dem Standardprogramm

unterzogen.

Folgendes Programm wurde verwendet:

- 2 Min. 50°C

- 10 Min. 95°C

- 15 s 95°C

- 1 Min. 60°C

Die Auswertung erfolgte mit ABIPrism nach der ΔΔCt-Methode. Der Ct-Wert

gibt den Zyklus der PCR an, an dem das Fluoreszenzsignal des markierten

Primers das erste Mal die Hintergrundfluoreszenz überschreitet. Je niedriger

der Ct-Wert, desto stärker wird das Zielgen also exprimiert.

3.6 Proteinbiochemische Methoden

3.6.1 Durchflusszytometrie humaner Zellen

Zur Untersuchung der Expression von Oberflächenmolekülen auf bestimmten

Zellen in humanem Vollblut oder plättchenreichem Plasma wurde die Methode

der Durchflusszytometrie verwendet. Hierbei werden die Zellen mittels einer


33

Kapillare angesaugt und passieren im Gerät einzeln einen Laserstrahl.

Anhand ihrer Emission von optischen Signalen nachdem sie den Laser

passiert haben, können die Zellen sortiert werden. Neben Größe und

Granularität kann die Expression von Oberflächenmolekülen mithilfe von

gebundenen Fluoreszensfarbstoffen nachgewiesen werden. Im Folgenden

wird die Durchführung der Vollblut- und Plasmaversuche dargestellt. Humanes

Vollblut bzw. PRP wurde mit TRAP-6, einem synthetischen Thrombin-

Analoga, und LPS versehen und die Änderung von Aktivierungsmarkern

PAC-1 und P-Selektin sowie die Aggregatbildung von Thrombozyten mit

Leukozyten wurde untersucht.

3.6.1.1 Vollblutfärbung für die Durchflusszytometrie

Die Blutproben wurden wie unter 3.3.2 beschrieben behandelt. Nach 4 h

Inkubation der Stimulanzien bei 37°C wurden pro 100 µl Probe je 5 µl

Antikörper hinein gegeben. Die Proben wurden anschließend für weitere 15

Min. inkubiert.

Folgende Antikörper wurden unverdünnt verwendet:

- Isotype Tricolor V, Beckman Coulter GmbH

- PE-Cy5 monoclonal anti-Human CD41, Beckman Coulter GmbH

- PE conjugated anti-mouse CD45RB, eBioscience

- PE-CyTM5 Mouse Anti-Human CD62P, BD PharmingenTM

Anschließend wurde pro Röhrchen 3 ml Lysereagenz (BD, 1:10 verdünnt in

Aqua bidest) dazugegeben und mit Hilfe eines Vortexers vermischt. Die Lyse

wurde 7 Min. im Dunkeln inkubiert. Nach 7 Min. Zentrifugation bei 1300 rpm

wurde mit 3 ml PBS/BSA 0,2% gewaschen. Die Messung erfolgte innerhalb

von 4 h am FC500 der Firma Beckmann-Coulter unter Verwendung eines

geeigneten FACS-Messprotokolls.


34

3.6.1.2 Färbung des PRP

Das PRP wurde wie unter 3.3 beschrieben gewonnen und stimuliert. Als

alternative „Isotyp-Kontrolle“ für den PAC-1 Antikörper wurden zuerst 5 µl

RGDS (10 mg/ml) dazupipettiert und die Proben jeweils für 10 Min. bei RT

inkubiert. Das Tetrapeptid Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) bindet einen Teil des

aktivierten Fibrinogenrezeptor GPIIb/IIIa auf Thrombozyten und blockiert dort

spezifisch die Bindungsstelle für PAC-1 [37]. Es wird in den Herstellerangaben

des Antikörpers als Isotypkontrolle angegeben. Danach wurden 5 µl der

angegebenen Antikörper hinzu pipettiert und die Proben nochmals für 10 Min.

bei RT inkubiert.


- PE Mouse Anti-Human CD42a, BD PharmingenTM

- FITC PAC-1, BD PharmingenTM

- PE-CyTM5 Mouse Anti-Human CD62P, BD PharmingenTM

- Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS), Sigma

- PE-Cy™5 Mouse IgG1 κ Isotype Control, BD PharmingenTM

Anschließend wurde jede Probe mit 70 µl Cellfix (BD Biosciences) für 10 Min.

bei RT fixiert und danach mit 1 ml DPBS (mit Ca2+, Mg2+, 0,2% BSA)

verdünnt. Die Messung erfolgte innerhalb von 4 h am Durchflusszytometer

FC500 der Firma Beckmann-Coulter unter Verwendung eines geeigneten

FACS-Messprotokolls.

3.6.2 Durchflusszytometrie muriner Zellen

Die Überprüfung der Reinheit der isolierten CD4+-Zellpopulationen aus der

Milz erfolgte mit dem Durchflusszytometer.


- PE conjugated anti-mouse CD45RB (120455), eBioscience

- FITC conjugated monoclonal anti-mouse CD4 (130-091-608),

Miltenyi Biotec


35

Nach der magnetischen Separation wurden 1x106 Zellen in 100 µl FACS-

Puffer aufgenommen und mit 3 µl Fc-Block 10 Min. inkubiert. Pro Probe

wurden je 1 µl CD45RB- und 3 µl CD4-Antikörper dazugegeben und 20 Min.

inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit 2 ml FACS-Puffer (versetzt mit 2%

FCS) und 10 Min. Zentrifugation bei 500xg wurden die gefärbten Zellen in

250 µl FACS-Puffer aufgenommen und durchflusszytometrisch analysiert.

3.6.3 Fibrinogen-ELISA

Der Fibrinogen-ELISA funktioniert nach dem Prinzip eines Sandwich-ELISAs.

Das Fibrinogen im murinen Plasma bindet an die mit anti-Fibrinogen

beschichtete Oberfläche der 96-Well-Mikrotiterplatte. Plasmaproben wurden

vorher aus antikoaguliertem Mausblut mittels 10 Min. Zentrifugation bei

13000xg gewonnen und vor Auftragen 1:30000 mit Diluent-Konzentrat

verdünnt. Anschließend wurde der ELISA entsprechend der

Herstellerangaben durchgeführt. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen.

Mithilfe einer Standardkurve konnte die absolute Fibrinogen-Konzentration im

Plasma bestimmt werden.

3.6.4 Immunhistologie

3.6.4.1 Anfertigen von histologischen Präparaten

Die Anfertigung der Kryoschnitte erfolgte im Mikrotom-Kryostat bei -20°C

Kammertemperatur. Jeweils zwei 5 µm dicke Schnitte wurden auf Superfrost

Objektträger gebracht und ü.N. bei RT luftgetrocknet. Zur Fixation wurden die

Schnitte für 10 Min. in eiskaltes Aceton getaucht und anschließend eine

Stunde an der Luft getrocknet. Bis zur Färbung wurden sie bei -80°C gelagert.

3.6.4.2 Färbungen

Von Leber, Lunge, Milz und Niere wurden immunhistochemische Färbungen

angefertigt. Die Analyse der gefärbten Präparate erfolgte mit Hilfe des Leica

DM IL Mikroskops (Leica Microsystems, Wetzlar). Fotografiert wurden die

Schnitte mit einer Kamera von Visitron System GmbH und der zugehörigen

Software Spot Advanced (Diagnostic Instruments Inc.) und eingefärbt mit

MetaMorph Offline. Ausgewertet wurden die Bilder anschließend mit der

Software ImageJ.


36

Immunhistochemische Färbungen

Zur immunhistochemischen Färbung der Organe wurden spezifische

monoklonale Antikörper verwendet, die an die nachzuweisenden

Oberflächenepitope binden. Zur Sichtbarmachung der Bindung wurden mit

einem Fluoreszensfarbstoff gekoppelte Antikörper, die Peroxidase-

Antiperoxidasemethode, sowie die Avidin-Biotin-Methode verwendet.

Folgende Primärantikörper wurden verwendet:

- FITC-labeled rat monoclonal anti-mouse GPIbβ (CD42c) (M050-1), emfret

analytics Eibelstadt

- Purified Rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6c (553123), BD PharmingenTM,

Heidelberg

- Purified rat anti-mouse CD62P (550289), BD PharmingenTM, Heidelberg

Folgende Sekundär- und Tertiärantikörper wurden verwendet:

- POD conjugated F(ab’)2 Fragment mouse anti-ratIgG (H+L), (212-036-

168), Jackson Immuno Research

- Alexa 488 (A-11090), Molecular Probes

- Streptavidin TRITC (016-030-084), Dianova

- TSATM Biotin System, für 200-600 Proben (NEL700001KT), PerkinElmer

Die Färbungen wurden wie folgt durchgeführt:

Kombinationsfärbung von Thrombozyten mit P-Selektin oder GR-1

Der gesamte Färbevorgang fand in einer feuchten Kammer statt um die

Austrocknung der Präparate zu verhindern. Waschschritte erfolgten jeweils für

4 Min. in PBS. Zuerst wurden die Organe mit 20 µl 20%igem fetalem

Kälberserum in PBS 10 Min. inkubiert um unspezifische Fc-Bindungsstellen zu

blocken. Anschließend wurden mittels Peroxidase-Blocking-Reagenz (10 Min.,

Ready-to-use, Dako, Carpinteria, USA) die endogenen Peroxidasen inaktiviert

um eine unerwünschte Aktivierung der später zugegebenen chromogenen


37

Substanzen zu verhindern. Nach zweimaligem Waschen erfolgte die Zugabe

eines Tropfens Biotin-Blocking-Lösung 1 (Avidin Solution, Dako X0590) für 10

Min. um eine Bindung des enzymmarkierten (TRITC) Streptavidins an

endogenem Biotin zu verhindern. Damit werden falsch-positive Ergebnisse

vermieden. Es wurde einmal gewaschen um dann Biotin-Bindungsstellen

mittels einem Tropfen Biotin-Blocking-Lösung 2 (Biotin Solution, 10 Min.) zu

blockieren. Nach nochmaligem Waschen erfolgte die Zugabe von 100 µl des

primären Antikörpergemisches (CD62P, 1:50 verdünnt in 20% FCS/PBS und

CD 42c FITC 1:20 verdünnt in 20% FCS/PBS bzw. CD 42c FITC 1:20

verdünnt in 20% FCS/PBS und Gr-1 1:50 in PBS/ 20% FCS) bzw. von 100 µl

20% FCS/PBS auf die Negativkontrolle. Die Schnitte wurden ü.N. bei 4°C

inkubiert. Darauf wurde dreimal gewaschen und schließlich der Peroxidase

gekoppelte Sekundärantiköper zugegeben (anti rat IgG POD 1:100 in PBS

/20% FCS) und 60 Min. bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte

dreimal gewaschen, mit 50 µl Biotinyltyramid (1:200 verdünnt in

Amplifikationsdiluent) versehen und 4 Min. inkubiert. Nach zweimaligen

Waschen wurden 50 µl des dritten Antikörpergemisches (Streptavidin TRITC

1:100 verdünnt in PBS/20%FCS, aFITC-Alexa 488 1:100 verdünnt in

PBS/20%FCS) dazugegeben und 60 Min. bei RT inkubiert. Nach zweimaligem

Waschen wurden die Schnitte mit Fluoprep eingedeckelt.

Einfachfärbung von Thrombozyten

Die Färbung erfolgte analog wie oben beschrieben. Im Unterschied zur

kombinierten Färbung wurde nach Auftragen von 75 µl des Primärantikörpers

(CD 42c FITC 1:20 verdünnt in 20% FCS/PBS, Inkubation über Nacht bei 4°C)

auf die Positivkontrolle nur zweimal gewaschen, bevor der zweite Antikörper

zur Verstärkung des Signals dazugegeben wurde. Nachdem 50 µl des

Verstärkungsantikörpers Alexa 488 (1:100 verdünnt in PBS/20%FCS)

dazugegeben wurden, wurden die Schnitte zweimal gewaschen und mit

Fluoprep eingedeckelt.


38

3.7 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Ergebnisse und die Darstellung der Graphen

erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism für Windows (GraphPad

Software, San Diego, CA).

Jedes Ereignis entspricht einer Probe bzw. einem Tier. Dargestellt ist der

arithmetische Mittelwert. Die Daten wurden mittels des Mann-Whitney-Test auf

Signifikanz überprüft, da eine Normalverteilung der Daten nicht gewährleistet

werden kann. Als Signifikanzniveau wurde p = 0,05 festgelegt und in den

Graphen mit * verdeutlicht. Zwei ** stehen für ein Signifikanzniveau von

p< 0,01 und drei *** für p< 0,001.

Die Auswertung der FACS Analysen erfolgte mit FlowJo. Die Gates wurden

entsprechend der Größe (Vorwärtsscatter) und Granularität (Seitwärtsscatter)

der Zellen gesetzt um anschließend die populationsspezifische Analyse der

Bindung der Farbstoff-gekoppelten Antikörper durchzuführen. Histogramme

und Dotplots wurden mit Hilfe von FlowJo dargestellt und ausgewertet.

Kapitel 4: Ergebnisse

39

4 Ergebnisse

4.1 In vitro Versuche mit humanen Zellen

Um die Rolle der Thrombozyten in der polymikrobiellen Sepsis zu

untersuchen, wurden in vitro Versuche mit humanen Zellen durchgeführt. Als

vereinfachtes Sepsismodell diente hierbei die Stimulation von Zellen mit LPS

(E.coli O127:B8). Überprüft wurde, ob Thrombozyten durch diesen

Bakterienbestandteil aktiviert werden und welche Bedingungen dafür nötig

sind.

4.1.1 Stimulation von plättchenreichem Plasma

Es wurden sowohl Versuche mit LPS als auch Kostimulationsversuche mit

LPS und TRAP-6, einem synthetischen Thrombinanalogon, durchgeführt um

zu untersuchen, ob LPS selbst Thrombozyten aktiviert oder eine Verstärkung

der Aktivierung durch TRAP-6 auslöst.

Thrombozyten weisen in der Durchflusszytometrie eine charakteristische

Population auf, die sich bei Maximalaktivierung in ihrer Form ändert. Die

Änderung der Thrombozytenwolke ist bedingt durch den „shape change“ des

Thrombozyts nach Aktivierung mit Thrombin bzw. TRAP-6 [38].

Abb. 3: Typische Thrombozytenpopulation in der Durchflusszytometrie

Dargestellt ist eine charakteristische Thrombozytenwolke im Vorwärts-Seitwärtsscatter des

Durchflusszytometers. Der Übergang der diskoiden, nicht-aktivierten Thrombozyten (links) zu

sphärischen Partikeln nach Maximalaktivierung mit 200 µmol/l TRAP-6 (rechts) wird auch

durchflusszytometrisch sichtbar.


40

Da die Formänderung der Thrombozytenpopulation nur bei sehr starker

Aktivierung beobachtet werden kann, wurden zusätzlich farbstoffmarkierte

Aktivierungsmarker verwendet um kleinere Unterschiede in der Aktivierung

festzustellen.

Als Fluoreszenzmarker wurden die Antikörper der Aktivierungsmarker

P-Selektin (CD62P) und PAC-1 verwendet und deren Bindung

durchflusszytometrisch untersucht. P-Selektin wird nach Aktivierung der

Thrombozyten aus den α-Granula freigesetzt und als Membranprotein auf der

Oberfläche exprimiert. PAC-1 bindet an den aktivierten Fibrinogenrezeptor,

der nach entsprechender Stimulation durch Formkonversion des

Oberflächenepitops GPIIb/IIIa zu einem funktionellen Rezeptor für Fibrinogen

entsteht. Besonders PAC-1 ist ein sehr sensitiver Aktivierungsmarker, der

schon bei leichter Stimulation der Plättchen exprimiert wird.

4.1.1.1 Stimulation mit TRAP-6

Vor Beginn der Versuche wurde ein Titrationsversuch mit TRAP-6

durchgeführt um die optimale Konzentration für eine Kombination mit LPS zu

finden.

Abb. 4: CD62P-Expression nach Stimulation von PRP mit unterschiedlichen TRAP-6

Konzentrationen


41

5x106 Thrombozyten wurden mit 200 µmol/l, 50 µmol/l, 12,5 µmol/l TRAP-6 und als Kontrolle

mit PBS stimuliert und anschließend die P-Selektin-Expression durchflusszytometrisch

bestimmt. 200 µmol/l TRAP-6 aktivierte beinah alle Thrombozyten (dunkelrot links, hellgrau

rechts), während mit 12,5 µmol/l TRAP-6 (rosa) kein Unterschied zur Kontrollgruppe

(dunkelgrau) zu erkennen war. Durch Zugabe von 50 µmol/l TRAP-6 kam es zu einer mäßigen

Aktivierung der Thrombozyten (rot).

In Abb. 4 ist sowohl im Histogramm als auch im Dotplot ersichtlich, dass es

nach Zugabe von 200 µmol/ TRAP-6 zu einer maximalen Degranulation der

α-Granula und Expression von CD62P und damit zu einer starken Aktivierung

kam. Bei zusätzlicher Behandlung mit LPS wäre eine Steigerung der

Aktivierung kaum noch möglich, da gespeichertes P-Selektin in den α-Granula

bereits verbraucht wurde. Im Gegensatz dazu war nach Stimulation mit

12,5 µmol/l TRAP-6 kein Unterschied zur PBS-behandelten Kontrollgruppe zu

erkennen. Die Zellen, die mit 50 µmol/l TRAP-6 stimuliert wurden, zeigten eine

mäßige Steigerung der P-Selektin-Expression. Dies ist zu erkennen an der im

Histogramm dargestellten mittleren Fluoreszenz und an der Anzahl CD62P-

positiver Ereignisse im Dotplot. Da hier eine optimale Beobachtung der

Änderung einer Expressionsrate und Aktivierung möglich ist, wurde diese

Konzentration zur Kostimulation mit LPS verwendet.

4.1.1.2 Stimulation mit TRAP-6 und LPS

Blutproben wurden von freiwilligen, gesunden Spendern gewonnen und mit

Citrat antikoaguliert. Jeweils 5x106 Zellen des hergestellten PRP wurden pro

Röhrchen überführt und mit LPS und TRAP-6 stimuliert (siehe Tabelle 1).

Pro Gruppe wurden Proben von sieben Spendern untersucht. Der

Versuchsaufbau ist in Tabelle 1 dargestellt.


42

Tabelle 1: Versuchsaufbau der Stimulation von PRP

Nach Inkubation der Stimulanzien wurden die Aktivierungsmarker CD62P und

PAC-1 dazugegeben und deren Expression durchflusszytometrisch bestimmt.

Sample TRAP-6

(50 µmol/l)

LPS

O127:B8

(10 µg/ml)

RGDS

10 mg/ml

(je 5 µl)

PAC-1

FITC

Unv.

(je 5 µl)

CD62P

PE-Cy5

Unv.

(je 5 µl)

IgG1

PE-Cy5

Unv.

(je 5 µl)

1 + - - + + -

2 + - + + - +

3 + + - + + -

4 + + + + - +

5 - - - + + -

6 - - + + - +

7 - + - + + -

8 - + + + - +


43

Abb. 5: Histogramme der CD62P- und PAC-1-Fluoreszenz nach Stimulation mit TRAP-6

und LPS

Gezeigt ist die Fluoreszenzintensität der Aktivierungsmarker CD62P und PAC-1. In den

Histogrammen links erfolgte die Zugabe von PBS als Kontrolle (grau) und die zusätzliche

Stimulation mit 10 µg/ml LPS (rot). Die rechten Graphen zeigen die Fluoreszenz der

Aktivierungsmarker einmal nach Zugabe von 50 µmol/l TRAP-6 als Kontrolle (grau) und

zusätzlicher Stimulation mit LPS (10 µg/ml) (rot). Die Fluoreszenz nach LPS-Zugabe steigt bei

beiden Gruppen nur minimal an.

Wie in Abb. 5 zu erkennen ist, steigt die Fluoreszenz der Aktivierungsmarker

nach LPS-Zugabe nur minimal, es erfolgt also keine merkliche Stimulation

durch LPS. Auch eine signifikante Steigerung der Aktivierung von TRAP-6

durch LPS konnte nicht beobachtet werden.


44

TRAP-6 TRAP-6+LPS Ko LPS0

500

1000

1500

2000

PAC-1

CD62PG

eom

etr

ic M

ean

Abb. 6: Mittlere Fluoreszenz von PAC-1 und P-Selektin nach Stimulation

Dargestellt ist der Mittelwert der Fluoreszenz von PAC-1 (grau) und P-Selektin (rot). PRP

wurde entweder mit 50 µmol/l TRAP-6 behandelt oder als Kontrolle (Ko) mit PBS. Zusätzlich

wurde jeweils mit 10 µg/ml LPS (E.coli) stimuliert. Die Expression von P-Selektin ist nach

TRAP-6-Stimulation signifikant höher, als in der Kontroll- und LPS-Gruppe (p<0,05). Durch

LPS-Stimulation erhöht sich die mittlere Fluoreszenz nur geringfügig (n=7 pro Gruppe).

Thrombozyten im plättchenreichen Plasma zeigen nach Stimulation mit LPS

keine signifikante Erhöhung der Expression vom Fibrinogen-Rezeptor (p=0,65)

und P-Selektin (p=0,41) im Vergleich zur PBS behandelten Kontrollgruppe,

werden also nicht aktiviert. Auch eine signifikante Steigerung der Aktivierung

durch LPS nach Kostimulation mit TRAP-6 konnte sowohl bei Pac-1 (p=0,58)

als auch bei P-Selektin (p=0,59) nicht beobachtet werden, die Aktivierung von

TRAP-6 konnte also durch LPS nicht verstärkt werden. Zu sehen sind nur

geringe Anstiege in der Fluoreszenz der Aktivierungsmarker (Abb. 6).

Thrombozyten werden also im PRP nicht durch LPS aktiviert.

4.1.2 Stimulation von Vollblut

Um zu überprüfen ob Thrombozyten im Vollblut, also in Kombination mit

anderen Blutzellen, durch LPS aktiviert werden, wurden jeweils 100 µl Vollblut

von freiwilligen Spendern mit LPS, TRAP-6 oder beidem stimuliert. Als

Kontrolle wurde PBS hinzugegeben. Nach zwei Stunden Inkubation wurden

ein Antikörper zur Messung der Thrombozytenaktivierung (CD62P) und ein

thrombozytenspezifischer Antikörper (CD41) zur Bestimmung der Aggregate

mit anderen Blutzellen hinzugegeben.

Der Versuchsaufbau ist in Tabelle 2 dargestellt.


45

Tabelle 2: Versuchsaufbau der Stimulation von Vollblut

Sample TRAP-6

50µmol/l

PBS

(+Ca/+Mg)

LPS O127:B8

10µg/ml

Antikörper

(je 5µl)

1 - + - Isotyp Tricolor

2 - + - CD45 FITC,

CD41 PC5

3 - + - CD45 FITC,

CD62P PERCP

4 - + + Isotyp Tricolor

5 - + + CD45 FITC,

CD41 PC5

6 - + + CD45 FITC,

CD62P PERCP

7 + - - Isotyp Tricolor

8 + - - CD45 FITC,

CD41 PC5

9 + - - CD45 FITC,

CD62P PERCP

10 + - + Isotyp Tricolor

11 + - + CD45 FITC,

CD41 PC5

12 + - + CD45 FITC,

CD62P PERCP

P-Selektin diente als Aktivierungsmarker, da es nur auf aktivierten

Thrombozyten und Endothelzellen exprimiert wird [39]. Als spezifischer Marker

für Thrombozyten wurde CD41, Teil des Rezeptors GPIIb/IIIa, verwendet. Die

verschiedenen Populationen im Vollblut wurden über den Vorwärts-Seitwärts-

Scatter differenziert (Abb. 7)


46

Abb. 7: Durchflusszytometrische Darstellung der Zellen im Vollblut

Die Gates wurden entsprechend der zellspezifischen Morphologie Größe und Granularität

gesetzt. Die festgelegten Zellpopulationen Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten

wurden anschließend entsprechend ihrer Gates näher analysiert. Ein Punkt entspricht einem

Ereignis im FACS.

4.1.2.1 Granulozyten

Zuerst wurden die Aggregate der Thrombozyten und Granulozyten untersucht,

also die CD41-positiven Zellen in der vorher morphologisch bestimmten

Granulozytenpopulation. Alle untersuchten Granulozyten waren CD45R

positiv.

Abb. 8: Zunahme der Thrombozyten-Granulozyten-Aggregate


47

CD

41

In der unbehandelten Probe waren kaum CD41-positive Granulozyten zu sehen. Nach LPS-

Stimulation stieg das CD41-Signal deutlich an. Der Anteil an Aggregaten lag in der

unbehandelten Gruppe bei 17,2% und stieg durch LPS Stimulation auf 39,49%. 100 µl Vollblut

wurden mit LPS stimuliert (E.coli, 10 µg/ml) und 2 h inkubiert. Durchflusszytometrische Daten

wurden mit FlowJo ausgewertet. Die Gates wurden mithilfe einer Isotypkontrolle festgelegt.

Nach LPS-Stimulation steigt das Fluoreszenzsignal von CD41 in der

Granulozytenpopulation deutlich an. Es kommt also zur Erhöhung der

Thrombozyten-Granulozyten-Aggregate. Eine Erhöhung der Zell-Zell-

Aggregate ließ sich auch durch TRAP-6-Zugabe erzeugen. Durch

Kostimulation von TRAP-6 mit LPS konnte ein zusätzlicher Anstieg der CD41-

positiven Zellen beobachtet werden (Abb. 9).

PBSLPS

TRAP-6

TRAP-6 + LPS

0

20

40

60

80

100**

**

CD

41 in

%

Abb. 9: Unterschiedliche Expression des Thrombozytenmarkers CD41 in der

Granulozytenpopulation nach Stimulation mit LPS und TRAP-6

Nach Simulation von Vollblut mit LPS war die CD41-Expression auf den Granulozyten

signifikant höher als in der Kontrollgruppe (PBS) (p<0,01). Durch Zugabe des

Thrombozytenaktivators TRAP-6 stieg die CD41-Fluoreszenz im Vergleich zur PBS-Gruppe

auch signifikant an (p<0,01). Die Kostimulation von TRAP-6 mit LPS erhöht zusätzlich die

Aggregatbildung zwischen Granulozyten und Thrombozyten (p=0.0503).

Neben der Aggregatbildung wurde auch die Aktivierung der Thrombozyten, die

sich in diesen Aggregaten befanden, untersucht. Hierzu wurde die Expression

von P-Selektin mithilfe eines anti-CD62P-Antkörpers untersucht.


48

Abb. 10: CD62P -Expression der Thrombozyten in der Granulozytenpopulation

Die LPS-behandelte Gruppe (rot) zeigt im Vergleich zur PBS-behandelten Kontrollgruppe

(grau) eine deutliche Zunahme der Fluoreszenz von CD62P (links). Die rechte Graphik zeigt,

dass LPS als Kostimulanz mit TRAP-6 (rot) zusätzlich die Fluoreszenz des

Aktivierungsmarkers CD62P auf den Thrombozyten in der Granulozytenpopulation erhöht im

Vergleich zur TRAP-6 behandelten Kontrollgruppe (grau). Die Isotypkontrolle ist in den

Histogrammen gestrichelt dargestellt. 100 µl Vollblut wurden mit LPS (10 µg/ml) bzw. TRAP-6

(50 µmol/l) oder beidem stimuliert.

Die Expression von P-Selektin steigt nach Zugabe von LPS in jeder Gruppe

signifikant an. (Abb. 11)

PBSLPS

TRAP-6

TRAP-6 + LPS

0

10

20

30

40

50

60

70 *** *

**

CD

62P

in %

Abb. 11: Unterschiedliche Aktivierung der Thrombozyten in der

Granulozytenpopulation


49

Aktivierung wurde durch P-Selektin-Expression der Thrombozyten bestimmt. Nach LPS-

Stimulation stieg die Aktivierung der Thrombozyten signifikant an im Vergleich zur PBS-

behandelten Kontrollgruppe (p<0,001). Auch durch Kostimulation war ein signifikanter Anstieg

der P-Selektin-Fluoreszenz zu beobachten im Vergleich zur TRAP-6 behandelten Gruppe

(p<0,05). 100µl Vollblut wurden mit LPS (10µg/ml) bzw. TRAP-6 (50µmol/l) stimuliert und 4 h

inkubiert (n=9 pro Gruppe).

4.1.2.2 Monozyten

Zusätzlich zur Population der Granulozyten wurde die Monozytenpopulation

näher betrachtet und auf dieselben Parameter wie bei den Granulozyten

analysiert.

Abb. 12: Zunahme der Thrombozyten-Monozyten-Aggregate nach LPS-Stimulation

Vollblut wurde mit LPS (10 µg/ml) stimuliert und 4 h inkubiert. CD41-Expression wurde

durchflusszytometrisch bestimmt. Zu sehen war eine deutliche Erhöhung der CD41-

Fluoreszenz in der Monozytenpopulation von 50,94% in der unbehandelten auf 68,93% in der

stimulierten Gruppe. Daten wurden ausgewertet mit FlowJo. Zur Festlegung der Gates diente

die Isotypkontrolle.

Die CD41-Expression der Monozyten nahm nach LPS-Zugabe signifikant zu

(p<0.01). Durch LPS banden Thrombozyten vermehrt an die Monozyten im

Vollblut. Durch TRAP-6 wurde ein ähnlicher Effekt, wie durch LPS ausgelöst.

Nach zusätzlicher Stimulation von LPS in Kombination mit TRAP-6 stieg die

CD41-Fluoreszenz nur noch geringfügig an. (Abb. 13)


50

PBSLPS

TRAP-6

TRAP-6 + LPS

0

20

40

60

80

100**

**

CD

41+

in %

Abb. 13: CD41-Expression in der Monozyten-Population nach LPS und TRAP-6 Zugabe

CD41-Fluoreszenz wurde durchflusszytometrisch im Vollblut gemessen zur Bestimmung der

Monozyten-Thrombozyten-Aggregate. In der Monozytenpopulation stieg der Anteil an CD41-

positiven Zellen signifikant an nach LPS- und TRAP-6-Stimulation (p<0.01). Eine Kombination

von LPS mit TRAP-6 zeigte keine Erhöhung der CD41-Expression im Vergleich zur einfachen

TRAP-6-Behandlung. 100 µl Vollblut wurden mit LPS (10 µg/ml) bzw. TRAP-6 (50 µmol/l)

stimuliert und 4 h inkubiert (n=8-10 pro Gruppe).

Wie für die Granulozyten gezeigt, nimmt auch bei den Monozyten die CD62P-

Expression zu. Thrombozyten, die an die Monozyten gebunden haben, zeigen

nach Stimulation mit LPS eine stärkere Aktivierung. Die Zunahme der

Fluoreszenzintensität von CD62P ist in den Histogrammen zu erkennen. (Abb.

14)

Abb. 14: CD62P-Expression der Thrombozyten in der Monozytenpopulation


51

Nach alleiniger Zugabe von LPS (rot) zum Vollblut oder als Kostimulanz mit TRAP-6 erhöhte

sich die Fluoreszenz des Aktivierungsmarkers CD62P auf den Thrombozyten in der

Monozytenpopulation im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe (grau). Betrachtet wurde die

gesamte Monozytenpopulation. Die Isotypkontrolle ist gestrichelt dargestellt.

Bei Betrachtung aller Gruppen fällt eine starke Aktivierung der Thrombozyten

nach LPS-Zugabe auf, sowohl im Vergleich zur PBS-behandelten

Kontrollgruppe als auch zur TRAP-6-behandelten Gruppe. Die Stimulation mit

LPS zeigt tendenziell sogar einen stärkeren Anstieg von CD62P als die

alleinige Stimulation mit TRAP-6. Die Unterschiede zwischen den einzelnen

Gruppen weisen Signifikanzen auf (Abb. 15).

PBS

LPS

TRAP-6

TRAP-6

+ L

PS

0

20

40

60

80 *** ****

CD

62P

in %

Abb. 15: Unterschiedliche Aktivierung der Thrombozyten in der Monozytenpopulation

Die Aktivierung wurde durchflusszytometrisch bestimmt mittels der P-Selektin-Expression der

Thrombozyten. Nach LPS-Stimulation stieg die Fluoreszenz von P-Selektin auf den

Thrombozyten signifikant an im Vergleich zur PBS-behandelten Kontrollgruppe (p<0,001).

Auch durch Kostimulation von TRAP-6 und LPS ist ein signifikanter Anstieg der P-Selektin-

Fluoreszenz zu beobachten im Vergleich zur TRAP-6 behandelten Gruppe (p<0,05).

Im Vollblut kam es also zu einer Aktivierung von Thrombozyten durch LPS.

Die Aktivierung äußerte sich über eine Zunahme der P-Selektin-Expression

und über eine vermehrte Bildung von Zell-Zell-Aggregaten zwischen

Thrombozyten und Granulozyten bzw. Monozyten.


52

4.2 Versuche mit murinen Thrombozyten

Um das Verhalten von Thrombozyten während einer Sepsis in vivo zu

untersuchen, wurden murine Zellen von unbehandelten und CASP-operierten

Tieren verglichen. Die Versuche fanden jeweils 20 Stunden nach der

Operation statt.

4.2.1 Thrombozytenzahl nach CASP

Ein bekanntes Phänomen bei septischen Patienten ist die Thrombozytopenie.

Um die Übertragbarkeit auf das Tiermodell der CASP zu überprüfen, wurden

die Thrombozytenzahlen von unbehandelten und septischen Tieren verglichen

(Abb. 16).

WT CASP0

50

100

150

200

250

**

Thrm

obozyt

enza

hl x10

6/m

l

Abb. 16: Änderung der Thrombozytenzahl nach CASP

20 h nach CASP kam es zu einem signifikanten Abfall der Thrombozyten im Vollblut im

Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren (p<0.01). Das Blut wurde retroorbital entnommen.

Anschließend wurden die Plättchen isoliert und gezählt.

Die Thrombozytenzahl unbehandelter Tiere betrug nach Isolation der Zellen

im Mittel 161x106/ml. Nach CASP kam es zu einem signifikanten Abfall

(p<0.01) der Thrombozyten auf durchschnittlich 107x106/ml Zellen. Untersucht

wurden jeweils zehn Tiere.

CASP löste 20 h nach Operation bei den Tieren eine Thrombozytopenie aus.

4.2.2 Immunhistologischer Vergleich septischer und unbehandelter Organe

Um die Verteilung der Thrombozyten nach der CASP zu untersuchen und das

Verschwinden der Plättchen nachzuvollziehen, wurden immunhistologische


53

Färbungen von Leber, Lunge, Milz und Niere angefertigt. Die Blutplättchen

wurden mit dem spezifischen Marker CD42c auf den Organschnitten

angefärbt. CD42c wird auch bezeichnet als GpIbβ und ist Teil des Komplexes

GpIa-d, der als Bindungsstelle für den von Willebrand-Faktor (vWF) und

Thrombin dient. Erhöht sich die mittlere Fluoreszenz von CD42c, lässt sich

daraus eine Erhöhung der Thrombozytenzahl in dem gefärbten Organ

herleiten. Verglichen wurden unbehandelte CCR4-/- und C57BL/6 Tiere mit

septischen 20 h nach CASP.

4.2.2.1 Ergebnisse von Lunge und Milz in CCR4-/- und C57BL/6

In Lunge und Milz zeigte sich kein Unterschied in der Anzahl angefärbter

Thrombozyten, sowohl zwischen den unbehandelten Tieren der C57BL/6 und

CCR4-/- Maus, als auch zwischen der CASP-Gruppe und der unbehandelten

Kontrollgruppe (Abb. 17).


54

Abb. 17: Immunhistologische Färbungen von Lunge und Milz

Die Organe wurden unbehandelt oder 20 h nach CASP von C57BL/6 oder CCR4-/-

-Tieren

entnommen und mit einem FITC-markierten CD42c-Antikörper angefärbt um die

Thrombozyten sichtbar zu machen. Die Bilder zeigen die Fluoreszenz der gebundenen

Antikörper bei 100facher Vergrößerung.

20 h nach CASP kam es zu keiner Einwanderung von Thrombozyten in die

Lunge und die Milz. Die Organe konnten also nicht mit der Thrombozytopenie

in Zusammenhang gebracht werden (Abb. 18, Abb. 19).


55

WT C

57Bl6

CASP C57Bl6 -/-

WT C

CR4-/-

CASP CCR4

0

1

2

3

4

Thro

mbozyte

nfläche in %

Abb. 18: Änderung der Thrombozytenzahl in der Lunge

CASP führte zu keiner Änderung der Thrombozytenzahlen in der Lunge, weder in C57BL/6

noch in CCR4-/-

Mäusen. Pro Gruppe erhielten 4 Mäuse CASP, 5 dienten als unbehandelte

Kontrolle. 20 h nach CASP wurden die Organe entnommen und mit dem Thrombozyten-

spezifischen Marker CD42c gefärbt. Die fotografierten Färbungen wurden mit ImageJ

ausgewertet.

WT C57Bl6

CASP C57Bl6 -/-

WT CCR4

-/-

CASP CCR4

20

30

40

50

Thro

mbozyte

nfläche in %

Abb. 19: Änderung der Thrombozytenzahl in der Milz

Nach CASP kam es zu keiner Änderung der Thrombozytenzahlen in der Milz, weder in

C57BL/6 noch in CCR4-/-

Mäusen. Pro Gruppe erhielten vier Mäuse CASP, fünf dienten als

unbehandelte Kontrolle. 20 h nach CASP wurden die Organe entnommen und mit dem

Thrombozyten-spezifischen Marker CD42c gefärbt. Die fotografierten Färbungen wurden mit

ImageJ ausgewertet.


56

4.2.2.2 Ergebnisse von Leber

In der Leber konnte 20 h nach CASP-Induktion ein Anstieg der CD42c-

Fluoreszenz in den immunhistologischen Färbungen beobachtet werden. Es

kam also zu einer signifikanten Erhöhung der Thrombozytenzahl in der Leber

der septischen Tiere. Dieser Anstieg war sowohl in den CASP-behandelten

C57BL/6 (p<0,0001) als auch in den CCR4-/--Tieren (p=0,0159) zu sehen. Als

zweiter Zeitpunkt wurde der 48 h nach CASP Zeitpunkt für die Entnahme der

Lebern gewählt. Die Thrombozytenzahl in der Leber der C57BL/6-Tiere waren

zu diesem Zeitpunkt immer noch signifikant höher als in der Kontrollgruppe

(p=0,029) (Abb. 20, Abb. 21)

Abb. 20: Immunhistologische Färbungen der Leber


57

Die Leber wurde 20 h nach CASP mit dem thrombozytenspezifischen Antikörper CD42c

gefärbt. Untersucht wurden jeweils CCR4-/-

- und C57BL/6 Tiere. Unbehandelte Tiere dienten

als Kontrolle. Die septischen Tiere zeigten eine Zunahme der Fluoreszenz im Vergleich zu

den Kontrolltieren (WT). Die Aufnahmen sind dargestellt in 100facher bzw. 200facher

Vergrößerung.

Abb. 21: Änderung der Thrombozytenzahl in der Leber

Die Leber wurde 20 h und 48 h nach CASP entnommen und mit dem Thrombozytenmarker

CD42c angefärbt. Verglichen wurden jeweils septische CCR4-/-

und C57BL/6 Tiere mit

unbehandelten Kontrollgruppen. Bei beiden Gruppen ist 20 h nach CASP ein signifikanter

Anstieg der Thrombozyten in den CASP-Tieren zu sehen (p<0.001 bei C57BL/6, links, p<0.05

bei CCR4-/-

, rechts). 48 h nach CASP nimmt die Anzahl der Thrombozyten in den C57BL/6-

Mäusen ab, ist aber noch signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0.01). Die

Bilder wurden ausgewertet mit ImageJ. Die Abbildung links fasst die Daten von fünf

unabhängigen Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen zusammen.

In den septischen Tieren kam es zu einer Sequestration von Thrombozyten in

der Leber, was somit als eine mögliche Ursache für die Thrombozytopenie

gesehen werden kann.

4.2.2.3 Ergebnisse der Leber mit CD42c , CD62P und Gr-1

Da die Anzahl der Thrombozyten nach CASP in der Leber zunahm, wurden

weitere Färbungen zur Untersuchung der Aktivierung und Aggregatbildung der

Thrombozyten mit Granulozyten in dem Organ angestellt. Dazu wurden

Kombinationsfärbung mit dem thrombozytenspezifischen Antikörper CD42c

und CD62P (P-Selektin) bzw. Gr-1 angefertigt. Gr-1 ist ein Oberflächenprotein

WT CASP 20h CASP 48h0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 *****

Thro

mbozy

tenfläche in %

WT CASP 20h0

2

4

6

8

10 *

Thro

mbozyt

enflä

che in

%


58

auf myeloiden Vorläuferzellen. Die Expression nimmt mit Reifung der

Granulozyten zu und wird als granulozytenspezifischer Marker genutzt.

Da die CCR4-/--Tiere keinen Unterschied zu den C57BL/6-Tieren zeigten,

wurde nur die Leber von Letzteren untersucht, jeweils 20 h nach CASP.

Die P-Selektin-Expression der Leber nahm 20 h nach CASP signifikant zu

(p<0.001) (Abb. 23). Durch Übereinanderlegen der P-Selektin- und CD42c-

Färbung konnte man sehen, dass die Fluoreszenzen kongruent waren.

P-Selektin wurde also ausschließlich von Thrombozyten exprimiert (Abb. 22).

Abb. 22: Immunhistochemische Anfärbung von P-Selektin und CD42c auf Leber

P-Selektin ist rot dargestellt, CD42c leuchtet grün. Überlagern sich beide Fluoreszenzen,

erscheint dies als gelb. Aufnahmen erfolgten bei 200facher Vergrößerung. Lebern wurden

20 h nach CASP entnommen und gefärbt. Organe unbehandelter Tiere (WT) dienten als

Kontrolle.

WT CASP 0

1

2

3

4

5**

Flä

che v

on P

-Sele

ktin

in %

Abb. 23: Zunahme der P-Selektin-Expression in der Leber nach CASP


59

Lebern von C57BL/6 Tieren wurden 20 h nach CASP entnommen und mit CD42c und CD62P

angefärbt. Bei den septischen Tieren kam es im Vergleich zu den unbehandelten Tieren zu

einem signifikanten Anstieg der P-Selektin-Expression (p<0.01). Bilder wurden ausgewertet

mit ImageJ.

Mit Zunahme der Thrombozyten, nahm auch die CD62P-Expression der

septischen Tiere signifikant zu. In die Leber eingewanderte Thrombozyten

waren also aktiviert.

Bei der Färbung von CD42c und Gr-1 kam es 20 h nach CASP zu einer

deutlichen Zunahme beider Fluoreszenzen im Vergleich zur unbehandelten

Kontrollgruppe. Da es zu einer Überlagerung beider Fluoreszenzen kam,

lagen die Zellen offensichtlich als Aggregate vor. Die Infiltration der Leber mit

beiden Zelltypen war im septischen Tier signifikant höher als in der

unbehandelten Kontrollgruppe (p<0.01). Dargestellt in Abb. 25 ist nur die

Erhöhung der Granulozyten.

Abb. 24: Immunhistochemische Anfärbung von CD42c und Gr-1 in der Leber

20 h nach CASP war eine deutliche Zunahme beider Fluoreszenzen in der Leber zu erkennen.

Der Granulozytenmarker Gr-1 ist hier rot und CD42c als Thrombozytenmarker grün

dargestellt. Überlagerung beider Signale erscheint gelb. Die Aufnahmen wurden bei 200facher

Vergrößerung gemacht.


60

WT CASP0

2

4

6

8**

Gra

nulo

zyt

enflä

che in

%

Abb. 25: Zunahme der Granulozyten in der Leber 20 h nach CASP

20 h nach CASP wurde die Leber entnommen und immunhistochemisch mit dem

Granulozytenmarker Gr-1 und dem Thrombozytenmarker CD42c gefärbt. Im Vergleich zu

unbehandelten Kontrolltieren stieg die Granulozytenzahl signifikant an (p<0.01). Bilder wurden

ausgewertet mit ImageJ.

Auch in vivo kam es nach CASP zu einer Zunahme von Thrombozyten-

Granulozyten-Aggregaten in Leber.

4.2.3 Fibrinogen-ELISA

Eine andere Ursache für das Verschwinden der Thrombozyten in der Sepsis

ist die disseminierte intravasale Gerinnung (DIC). Da es dabei neben der

Aggregation von Thrombozyten auch zu einer starken Aktivierung der

Gerinnungskaskade kommt, kann man einen Abfall von Fibrinogen im Plasma

beobachten. Bei der Gerinnung entsteht Thrombin, das zur Bildung von Fibrin

aus Fibrinogen führt. Es entstehen Thromben und Thrombozytenaggregate,

die sich in Gefäßen und Sinusoiden der Organe ablagern und zum

Organversagen führen können. Fibrinogen ist neben einem Marker für

schwere DIC auch ein akute-Phase-Protein und ist damit nach Traumen und

bei Entzündung erhöht.

Um zu untersuchen, ob es zu einem Abfall von Fibrinogen nach CASP kommt,

wurde ein Fibrinogen-ELISA durchgeführt. 20 h nach CASP wurde Plasma

von septischen Tieren (C57BL/6 und CCR4-/-, n=7-8 pro Gruppe) gewonnen

und 1:30000 verdünnt aufgetragen. Plasma von unbehandelten Kontrolltieren

(n=8-9) wurden parallel in der gleichen Verdünnung aufgetragen. Die


61

Absorption wurde bei 450 nm gemessen und mittels einer Standardkurve

(Abb. 26) wurde die absolute Fibrinogenkonzentration im Plasma bestimmt.

0 200 400 600 800 10000

1

2

3

4

ng / ml

O.D

. 450 n

m

Abb. 26: Standardreihe für den Fibrinogen-ELISA

Angefertigte Standardreihe mit löslichem Fibrinogen. 800 ng/ml Fibrinogen entsprechen einer

Absorption von 3,2 nm. Erstellt mit GraphPadPrism.

Bei den septischen C57BL/6-Tieren kam es im Vergleich zur Kontrollgruppe

zu einem signifikanten Anstieg der absoluten Fibrinogenkonzentration im

Plasma von im Durchschnitt 1,94 mg/ml auf 5,17 mg/ml (p<0.001). Eine

Erhöhung des Fibrinogengehalts war auch bei den CCR4-/--Tieren zu sehen.

Hier stieg das Fibrinogen von im Mittel 1,97 mg/ml bei den Kontrolltieren auf

5,86 mg/ml bei den CASP-Tieren (p<0.001) (Abb. 27).

WT C

57BL/6

CASP C57BL/6

-/-

WT C

CR4-/-

CASP CCR4

0

5

10

15 ******

Fib

rinogen in m

g/m

l

Abb. 27: Zunahme von Fibrinogen im Plasma 20h nach CASP


62

20 h nach CASP wurde Plasma gewonnen sowohl von C57BL/6 als auch von CCR4-/-

Mäusen. Der Fibrinogengehalt wurde mittels Sandwich-ELISA bestimmt. Im Vergleich zu den

unbehandelten Kontrolltieren kam es in beiden Gruppen zu einem signifikanten Anstieg von

Fibrinogen (p<0.001).

Trotz Vermutung kam es 20 h nach CASP nicht zu einem Abfall von

Fibrinogen im Plasma. DIC konnte nicht nachgewiesen werden.

4.3 CCR4-Regulation nach CASP

Da die CCR4-/--Mäuse bisher keinen Unterschied zu C57BL/6-Tieren

aufwiesen, nach CASP aber ein besseres Überleben zeigen [30], wurde die

Regulation von CCR4 auch in PBMCs und CD4+-Zellen untersucht. In einem

Parallelprojekt unserer Arbeitsgruppe konnte bereits gezeigt werden, dass

CCR4 auf mRNA-Ebene in Thrombozyten 20 h nach Sepsisinduktion

hochreguliert wird.

Die Transkriptionsrate von CCR4 und damit die Menge der CCR4-mRNA

wurde mittels relativer Echtzeit-PCR bestimmt. Als endogene Kontrolle diente

GAPDH. Verglichen wurde die RNA von CASP-Tieren mit der von

unbehandelten Kontrolltieren nach der ΔΔCt-Methode. Jeweils 20 h nach

CASP wurde Blut für die Isolation der PBMCs bzw. Milz für die Isolation von

CD4+-Zellen entnommen.

4.3.1 RT-qPCR muriner PBMCs

Murine PBMCs wurden 20 h nach CASP isoliert. Bei Zählung der Leukozyten

im Vollblut fiel auf, dass die Zahl der weißen Blutkörperchen insgesamt und

auch die der Lymphozyten signifikant abnahm im Vergleich zum

unbehandelten Kontrolltier. Leukozyten fielen von im Mittel 2,97 x109/ml auf

1,96 x109/ml. Der Anteil der Lymphozyten davon sank von 2,52 x109/ml auf

1,67 x 109/ml (Abb. 28).


63

WT W

BZ

CAS

P W

BZ

WT L

YM

CAS

P L

YM

0

1

2

3

4

5* *

Zellz

ahl x

10

9/m

l

Abb. 28: Abnahme der Leukozyten 20 h nach CASP

Die Zahl der Leukozyten (WBZ) im Vollblut nahm 20 h nach CASP signifikant ab (p<0.01). Bei

Betrachtung der Lymphozytenpopulation (LYM) sinkt deren Zellzahl auch signifikant im

Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren (p<0.05). Vollblut wurde retrobulbär abgenommen

und die Zellzahl mit dem Sysmex Cellcounter bestimmt (n=6-7 pro Gruppe).

Die RNA wurde mit der Trizol-Methode isoliert und anschließend mit dem

NanoDrop auf ihre Qualität untersucht. Es wurde ausschließlich qualitativ

hochwertige RNA ohne Verunreinigung verwendet. Nach cDNA-Synthese

wurde die CCR4-Expression auf mRNA Ebene mit quantitativer Echtzeit-PCR

untersucht. Das house-keeping Gen GAPDH diente hierbei als endogene

Kontrolle. Verglichen wurde zunächst die Größe des Fluoreszenzsignals der

einzelnen farbstoffgekoppelten Primer (Abb. 29).


64

Abb. 29: Signal des CCR4-Primers in qRT-PCR bei CASP- und Kontrollgruppe

In der CASP-Gruppe steigt die Fluoreszenz des Reportersignals (Delta RN) erst zu einem

späteren Zyklus an als in der unbehandelten Kontrollgruppe (WT). Das Signal des GAPDH-

Primers bleibt für beide Gruppen konstant. Aufgetragen ist die mittlere Fluoreszenz ∆ RN

gegen den Zyklus. Gezeigt sind die Ergebnisse isolierter RNA aus PBMCs gewonnen 20 h

nach CASP im Vergleich zu PBMCs unbehandelter Kontrolltiere.

Schon bei Betrachten der bloßen ∆RN-Werte (Abb. 29) liegt augenscheinlich

weniger CCR4-mRNA in den PBMCs der CASP-Tiere vor, als in den

gesunden Tieren. Nach zusätzlicher Einbeziehung der endogenen Kontrolle

GAPDH und Auswertung wird der Abfall von CCR4 noch deutlicher (p<0.001)

(Abb. 30, n = 9-10 pro Gruppe).

WT CASP0.0

0.5

1.0

1.5***

ct

Abb. 30: Abnahme der CCR4-Expression in qRT-PCR nach CASP


65

20 h nach CASP kommt es zu einem signifikanten Abfall der CCR4-Expression auf mRNA-

Ebene (p<0.001). Untersucht wurde die RNA von PBMCs aus unbehandelten und septischen

(20 h CASP) C57BL/6-Mäusen. Die qRT-PCR wurde mit der ΔΔCt-Methode ausgewertet.

4.3.2 RT-qPCR muriner CD4+-Zellen

T-Helfer-Zellen (CD4+) wurden mit dem MACS-Kit aus der Milz isoliert. Die

Reinheit der CD4-Population betrug etwa 90%. Die RNA wurde mithilfe des

Quiagen-Mini Kit isoliert und anschließend mit dem NanoDrop untersucht. Für

die qRT-PCR wurde nur hochqualitative RNA verwendet, die keine

Verunreinigung mit Protein aufwiesen.

Vor Durchführung der qRT-PCR wurde die RNA in cDNA umgewandelt.

Verglichen wurde die cDNA und deren Gehalt an CCR4-mRNA von CASP-

Tieren (n = 14) mit der unbehandelten Kontrollgruppe (n = 12).

Die Fluoreszenzsignale des FAM-gekoppelten CCR4-Primers zeigen starke

Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. In der CASP-Gruppe steigt

die Fluoreszenz erst zu einem viel späteren Zyklus (Abb. 31).


In der CASP-Gruppe steigt die Fluoreszenz des Reportersignals (Delta RN) erst zu einem

späteren Zyklus an als in der unbehandelten Kontrollgruppe. GAPDH wird als house-keeping

Gen in beiden Gruppen gleich exprimiert. Aufgetragen ist die mittlere Fluoreszenz ∆ RN gegen

den Zyklus.


66

Nach Auswertung der PCR zeigt sich ein deutlicher Abfall der CCR4-mRNA in

den CASP-behandelten Tieren. T-Helfer-Zellen der septischen Tiere haben

eine signifikant geringere Expression von CCR4-mRNA im Zellkern (p<0.001)

(Abb. 32)

WT CASP0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 ***

ct

Abb. 32: Abnahme der CCR4-Expression CD4+-Milzzellen in qRT-PCR nach CASP

20 h nach CASP kommt es zu einem signifikanten Abfall der CCR4-Expression auf mRNA-

Ebene (p<0.001). Untersucht wurde die RNA von CD4+-Milzzellen aus unbehandelten und

septischen C57BL/6-Mäusen. Die qRT-PCR wurde mit der ΔΔCt-Methode ausgewertet.

Sowohl PBMCs als auch CD4+-Zellen zeigen als Reaktion auf die CASP eine

verringerte Expression von CCR4 auf RNA-Ebene. Im Gegensatz dazu steht

die Hochregulation des Chemokinrezeptors in Thrombozyten nach CASP-

Induktion.

Kapitel 5: Diskussion

67

5 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit sollten die unterschiedlichen Funktionen von

Thrombozyten in der polymikrobiellen Sepsis untersucht werden. Zu diesem

Zweck wurden Versuche sowohl mit humanen als auch murinen Zellen

durchgeführt. Als anerkanntes Modell für die murine polymikrobielle Sepsis

wurde die Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) sowohl bei C57BL/6 als

auch bei CCR4-/--Tieren angewandt. Humane Zellen wurden in vitro stimuliert.

5.1 In vitro Versuche mit humanen Zellen

In den letzten Jahren wurde durch viele Veröffentlichungen bekannt, dass die

Funktion der Thrombozyten über ihre Rolle in der Hämostase hinausreicht.

Gezeigt wurde, dass sie zusätzlich vor allem im angeborenen Immunsystem

von Bedeutung sind. Auf ihrer Oberfläche exprimieren sie die Toll-like-

Rezeptoren TLR 2, TLR 4 und TLR 9 [16, 40] und sind damit in der Lage,

Lipopolysaccharid (LPS) und andere bakterielle Strukturen zu binden. Eine

weitere Brücke der kernlosen Zellen zum Immunsystem ist ihre Expression

von P-Selektin. Das als Aktivierungsmarker genutzte Oberflächenprotein

befindet sich in den α-Granula der Thrombozyten und den Weibel-Palade-

Körperchen der Endothelzellen [41, 42]. Funktionell bedeutend ist P-Selektin

für das Rollen der Leukozyten auf dem Endothel der Gefäße vor der

Diapedese und damit das Einwandern der Immunzellen zum

Entzündungsgeschehen [43, 44]. Aktivierte Thrombozyten binden außerdem

Leukozyten über den Rezeptor P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1)

und vermitteln darüber den Durchtritt durch Hochendothelvenolen (HEVs) in

Lymphknoten und durch Mikrothromben an kleinen Gefäßschäden. Patienten,

die an einer Sepsis leiden und überflutet werden mit Pathogenen, zeigen

auch einen Anstieg der P-Selektin-Expression auf Thrombozyten [45, 46]. Wie

der Anstieg des Aktivierungsmarkers im Entzündungsprozess vermittelt wird,

ist in der Literatur widersprüchlich. Darum wurde um zu untersuchen, wie es

zu dem Anstieg des Aktivierungsmarkers durch den Entzündungsprozess

kommt, plättchenreiches Plasma (PRP) mit LPS und Lipoteichonsäure (LTA)

stimuliert. Es konnte sowohl nach LPS- als auch nach LTA-Stimulation kein

signifikanter Anstieg von P-Selektin auf den Thrombozyten beobachtet werden


68

(Daten nur gezeigt für LPS). Sogar der sehr empfindliche Aktivierungsmarker

Pac-1, der den konvertierten funktionellen Fibrinogenrezeptor GPIIb/IIIa

spezifisch bindet, zeigte keine erhöhte Expression nach Stimulation. Auch

nach Vorinkubation mit dem Thrombozytenaktivator TRAP-6 konnte durch

LPS-Zugabe nur ein leichter Anstieg beider Aktivierungsmarker beobachtet

werden. Nach Ward et. al. ist LPS weder in der Lage via TLR-4 einen Anstieg

der P-Selektin-Expression auf Thrombozyten auszulösen noch Aggregation

und zytosolischen Calcium-Anstieg hervorzurufen [47]. TLR-4 und TLR-2

werden hier als funktionslose Überbleibsel der Megakaryozyten bezeichnet.

Andere Autoren sahen durch LPS-Stimulation von PRP zwar auch keinen

Anstieg in P-Selektin, wiesen dem TLR4 auf Thrombozyten dennoch stärkere

Bedeutung zu, da TLR4-/--Mäuse im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen nach LPS-

Gabe keine Thrombozytopenie aufwiesen [40]. Erstaunlicherweise wurde in

einer Quelle angegeben, dass LPS sogar zu einer Verminderung der

Thrombozytenaggregation führt, also die Expression des Fibrinogenrezeptors

und damit die Aktivierung verringert [48]. Im Kontrast dazu zeigen andere

Autoren, dass Thrombozyten neben TLR4 auch MyD88, MD2 und CD14 als

weitere beteiligte Proteine in der zugehörigen Signalkaskade exprimieren. Hier

wurde sowohl eine P-Selektin-Expression, als auch eine zusätzliche Erhöhung

des Aktivierungsmarkers nach Vorinkubation mit Thrombozytenstimulatoren

durch LPS-Gabe gesehen [49, 50]. Der Aktivierungs-Effekt durch LPS wurde

durch einen blockierenden TLR-4-Antikörper unterbunden, sodass ein

Signalweg über andere thrombozytäre Rezeptoren ausgeschlossen wurde.

Auch ein Interaktionseffekt mit anderen Zellen im Blut wurde durch die

Stimulation isolierter, gewaschener Thrombozyten unterbunden.

Die Widersprüchlichkeit der Literatur zeigt, wie empfindlich die Reaktion der

Thrombozyten auf äußere Faktoren ist. Es war zu überlegen, ob eine

Wiederholung mit größeren Gruppenzahlen die Aktivierung der Thrombozyten

im PRP durch LPS-Stimulation besser darstellen kann. Die durchgeführten

Experimente ließen jedoch darauf schließen, dass der Effekt sehr klein sein

würde und damit keine weiteren Versuche rechtfertigt. Außerdem wäre die

Relevanz in Anbetracht der diskutierten kontroversen Aussagen fraglich. Die

Bedeutung von TLR4 auf Thrombozyten wird vor allem im Zusammenspiel mit

anderen Zellen wichtig, wie es die nun zu diskutierenden Vollblutergebnisse


69

zeigen werden. Hier führt LPS-Stimulation indirekt über andere Blutzellen zur

Aktivierung von Thrombozyten und zur Ausschüttung von Chemokinen wie

RANTES, PF4 und MIP-1α und damit zusätzlich zu einer Botschaft für andere

Immunzellen [19, 51, 52].

Im Gegensatz zum PRP, zeigte die Stimulation von Vollblut mit LPS einen

starken Anstieg von Thrombozyt-Leukozyt-Aggregaten und eine erhöhte P-

Selektin Expression der Thrombozyten. Beides sind Zeichen einer Aktivierung

und Degranulation der Plättchen. Die vermehrte Formation von Aggregaten ist

bereits von vielen Krankheitsbildern bekannt, wie Herzinfarkt, Diabetes oder

durch vaskuläre chirurgische Eingriffe [53-55]. Von besonderer Bedeutung ist

die Interaktion von Thrombozyten mit Granulozyten und Monozyten bei

Entzündung und Sepsis, da Thrombozyten ähnlich dem Endothel eine

Vermittlerrolle zwischen Leukozyten und Entzündungsherd einnehmen [56].

Die gefundene Erhöhung der Aggregate zwischen Thrombozyten und

Monozyten sowie Granulozyten nach LPS Stimulation wurde auch in der

Literatur beschrieben [56]. Sowohl die stärkere Bindung der Thrombozyten an

die Monozyten im Vergleich zu den Granulozyten, als auch eine nochmalige

Steigerung der Aggregatbildung nach Vorstimulation mit einem

Thrombozytenaktivator wurde von Autoren beschrieben [56]. Vermittelt wird

die Bindung über verschiedene Rezeptoren. Zuerst soll hier das ebenfalls

untersuchte P-Selektin genannt werden. P-Selektin aktivierter Thrombozyten

bindet den konstitutiv exprimierten PSGL-1-Rezeptor auf Granulozyten und

Monozyten [57]. Im Vergleich zum PRP war im Vollblut nach LPS-

Administration ein signifikanter Anstieg der P-Selektin-Expression zu sehen,

die Thrombozyten in den Aggregaten wurden also aktiviert. Dies lässt darauf

schließen, dass die Aktivierung der Plättchen nicht durch LPS direkt, sondern

durch einen indirekten Effekt mithilfe anderer Blutzellen vermittelt wurde. Eine

mögliche Hypothese wäre, dass die Bindung von LPS an Monozyten zur

Ausschüttung von Tissue Factor führt (TF) [58, 59] und TF die

Gerinnungskaskade auslöst, die in der Bildung von Thrombin endet. Thrombin

ist einer der stärksten Thrombozytenaktivatoren und aktiviert weitere

Thrombozyten im Vollblut über den protease-activated receptor (PAR) auf

ihrer Oberfläche [60].


70

Da zwischen dem Anstieg der Aggregate (CD41-Expression) und der P-

Selektin-Expression eine relativ hohe Korrelation zu erkennen war (r= 0,817,

Daten nicht gezeigt), ist P-Selektin ein wesentlicher Rezeptor der

Thrombozyten, der die Interaktion mit PSGL-positiven Zellen vermittelt.

Allerdings lassen die Abweichungen und weniger korrelierenden Daten

vermuten, dass auch andere Rezeptoren bei der Vermittlung von Leukozyten

und Thrombozyten von Bedeutung sind. Diese Annahme lässt sich bestätigen

durch in der Literatur beschriebene Bindung zwischen Mac-1 auf Monozyten

und Granulozyten mit GPIbα, Bindungsstelle für den von Willebrand Faktor

(VWF) auf Thrombozyten [61, 62]. Im Gegensatz zur mäßigen Interaktion

zwischen P-Selektin und PSGL-1 ist die Bindung zwischen dem β2-Integrin

Mac-1 und GPIbα sehr stark und die beteiligten Rezeptoren werden erst nach

vorheriger Aktivierung der Leukozyten exprimiert [44, 61]. Die Aktivierung der

Immunzellen und damit die Expression von β2-Integrinen wird durch die oben

beschriebene Chemokin- und Zytokinausschüttung der Thrombozyten nach

LPS Stimulation hervorgerufen [51, 63]. Da Mac-1 zusätzlich Fibrinogen

bindet, kann darüber neben der direkten Bindung an Thrombozyten auch eine

indirekte Bindung zwischen Mac-1 und dem Fibrinogenrezeptor GpIIbIIIa

vermittelt werden [56]. Die LPS-Aktivierung löst also im Vollblut eine komplexe

Kaskade an Zell-Zell-Interaktionen aus, die von Diacovo et al. in folgendem

übersichtlichen Schema zusammengefasst wurden. Thrombozyten binden

Neutrophile in einem mehrstufigen Prozess und ermöglichen ähnlich dem

Endothel dadurch eine Passage zum Entzündungsherd. Im ersten Schritt des

Schemas kommt es zu einer schwachen, durch thrombozytäres P-Selektin

vermittelten Bindung und dadurch zum Rollen der Neutrophilen auf den

Plättchen. Im zweiten Schritt werden die Neutrophilen über Zytokine,

Chemokine oder Rezeptoren der Thrombozyten aktiviert. Dies führt im dritten

Schritt zu einer festen Bindung zwischen den beiden Zellen über das

induzierte Mac-1. Chemokin-vermittelt kommt es dann zuletzt zur Diapedese

durch die Thrombozytenschicht an den Entzündungsherd [44].

5.2 In vivo Versuche nach CASP

Nicht nur die Aktivierung von Thrombozyten, sondern auch die Abnahme der

Blutplättchenzahlen ist ein bekanntes pathologisches Phänomen bei


71

septischen Patienten. 35-59% der erkrankten Patienten entwickeln eine

Thrombozytopenie [64, 65]. Auch im Tiermodell konnte nach CASP ein

signifikanter Abfall der Blutplättchen beobachtet werden, wie er auch schon für

die CLP-induzierte Sepsis beschrieben wurde [66]. Mögliche Ursachen für das

Sinken der Zellzahl können eine verringerte Produktion im Knochenmark, eine

erhöhte Destruktion und vermehrte Sequestration in kleinen Gefäßen sein

[67]. Die Immunhistochemie zur Ortung der Thrombozyten in den

verschiedenen Organen ergab vor allem die Ansammlung der Plättchen in der

Leber 20 Stunden nach CASP. Keine signifikanten Erhöhungen der

Thrombozyten wurden in Lunge, Milz und Niere (Daten für Niere nicht gezeigt)

beobachtet. Angaben in der Literatur, die ebenfalls Plättchenakkumulationen

in der Leber nachweisen konnten, stimmen mit diesen Ergebnissen überein

[68, 69]. Neben der Zunahme der Thrombozyten in der Leber, konnte auch

eine Erhöhung der Neutrophilen immunhistochemisch nachgewiesen werden.

Interessanterweise überlagerten sich beide Zellen optisch, waren also in

unmittelbarer Nähe zueinander. Dafür spricht, dass Leukozyten, vor allem

Neutrophile, nach CLP in die Leber einwandern und aktiviert werden [70, 71].

Singer et. al beschrieb die Adhäsion von Thrombozyten an das

Kapillarendothel der Leber in Abhängigkeit von der vorherigen Neutrophilen-

Einwanderung [70]. Von anderen Autoren wurde beschrieben, dass es durch

die LPS-Aktivierung von Thrombozyten via TLR-4 zur Bindung an die

Neutrophilen und zu deren Aktivierung kommt. Interaktionen der beiden

Zelltypen lösen die Bildung von Neutrophil Extracellular Traps (NETs), Netzen

aus fibrillärer Matrix und Chromatin, die das Einfangen von Bakterien

erleichtern, aus [52, 72]. Für diesen indirekten Weg über die Thrombozyten

spricht, dass Neutrophile allein nicht durch LPS zur NET-Bildung angeregt

werden konnten. Als Folge dieser Anreicherung von Thrombozyten und

Granulozyten in der Mikrozirkulation der Leber kommt es zu einer

verminderten Durchblutung des Organs und damit zur Nekrose [52, 71]. Dies

könnte eine Ursache für das Leberversagen während einer Sepsis sein.

Die leberspezifische Ansammlung von Thrombozyten nach CASP könnte

durch einen Rezeptor, der auf Hepatozyten exprimiert wird, verursacht

werden. Thrombozyten werden nach bakterieller Infektion durch die bakterielle

Neuraminidase in ihrer Oberflächenstruktur verändert. Deshalb können sie


72

durch den sogenannten Ashwell-Rezeptor auf Hepatozyten erkannt werden,

reichern sich spezifisch in der Leber an und verschwinden aus der Zirkulation

Diese Beobachtungen können zusätzlich als Erklärung für die

Thrombozytopenie herangezogen werden [73].

Zwischen der CCR4-/-- und der C57BL/6-Maus wurde kein Unterschied in der

organspezifischen Thrombozytenanreicherung nach CASP gesehen. Auch die

Tiere, denen der CCR4-Rezeptor fehlte, zeigten 20 Stunden nach CASP eine

Thrombozytenanreicherung in der Leber und keine Veränderung der

Plättchenzahlen in Lunge und Milz im Vergleich zu unbehandelten knock-out-

Tieren. Der Chemokinrezeptor ist also vermutlich nicht an der Verteilung der

Thrombozyten in der Sepsis beteiligt, auch wenn Thrombozyten diesen

exprimieren [74]. Der in dieser Hinsicht fehlende Einfluss von CCR4 lässt sich

darauf zurückführen, dass weder Neutrophile noch Thrombozyten die

Liganden von CCR4, MDC und TARC, ausschütten oder produzieren.

Trotzdem beide Chemokine Thrombozytenaggregation und Calciumanstieg

auslösen, sind sie als Botenstoff eher für die Einwanderung von T-und B-

Zellen zum Entzündungsherd als für die Verteilung von Thrombozyten in der

Sepsis verantwortlich [31, 75, 76].

Im Vergleich zur Leber konnte in Milz und Lunge 20 h nach CASP keine

Akkumulation der Thrombozyten beobachtet werden. Im Gegensatz dazu

wurde von anderen Autoren allerdings nach LPS-Injektion eine Anhäufung der

Plättchen in der Lunge gefunden [40, 68, 69]. Als Erklärung für diesen

Widerspruch kann der Zeitpunkt der Organuntersuchung der Tiere

herangezogen werden. Während in dieser Arbeit alle Organe 20 Stunden nach

Sepsisinduktion untersucht wurden, wurde die Lunge in den anderen Quellen

nur wenige Minuten nach LPS-Injektion untersucht. Für zeitliche Abhängigkeit

spricht ein Schema von Ohtaki et. al., der die Verteilung der Thrombozyten

nach LPS-Gabe analysiert hat. Nur wenige Minuten nach LPS-Administration

häufen sich die Thrombozyten in der Lunge an und kehren anschließend in die

Zirkulation zurück. Nach etwa zehn Minuten akkumulieren sie in der Milz und

erst nach Stunden reichern sie sich in der Leber an. Diese Reihenfolge wurde

besonders nach i.v.-Injektion von hohen LPS-Dosen beobachtet. Injizierte man

geringe Dosen i.v. oder i.p., wurde nur die Einwanderung der Thrombozyten in

die Leber induziert [69, 77]. Diese Theorie bestätigt die beobachteten


73

Ergebnisse der fehlenden Thrombozytenakkumulation in Lunge und Milz und

passt zu dem Anstieg in der Leber 20 Stunden nach CASP.

Zusätzlich zur Untersuchung nach 20 Stunden, wurde die Thrombozytenzahl

in der Leber auch 48 Stunden nach CASP überprüft. Hier zeigte sich immer

noch eine signifikante Erhöhung der Plättchen im Vergleich zu unbehandelten

Tieren, allerdings nahm ihre Anzahl im Vergleich zum früheren Zeitpunkt nach

20 Stunden in dem Organ deutlich ab.

Die Abnahme der Thrombozyten in der Leber nach 48 Stunden könnte drei

mögliche Ursachen haben. Zum einen könnte es zu einer erneuten

Umverteilung der Thrombozyten gekommen sein, wie es schon für die Lunge

beschrieben wurde. Die Thrombozyten gelangen also wieder in die Zirkulation

und wandern möglicherweise in ein anderes Organ. Als weitere Möglichkeit

könnte es nach 48 Stunden bereits zu einem Abbau der eingewanderten

Thrombozyten gekommen sein. Plausibler scheint jedoch die Annahme, dass

die Tiere, die 48 Stunden nach CASP überleben, schon 20 Stunden nach

Induktion der Sepsis eine geringere Thrombozytenanreicherung in der Leber

aufgewiesen haben. Die geringere Anzahl der Plättchen in der Mikrozirkulation

der Leber verhindert möglicherweise ein ischämisches Organversagen und

führt damit zum besseren Überleben dieser Tiere im Vergleich zu denen, die

20 Stunden nach CASP eine stärkere Thrombozytensequestration in der

Leber aufwiesen.

Als weitere Ursache der verminderten Thrombozytenzahl nach CASP wurde

die disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) in Betracht gezogen. Dafür

wurde der Fibrinogengehalt im Plasma bestimmt. Wider erwarten kam es zu

einem signifikanten Anstieg des Fibrinogenplasmalevels 20 Stunden nach

CASP sowohl in der C57BL/6 als auch in der CCR4-/--Maus. Zur Ermittlung

einer DIC beim Patienten wird der sogenannte DIC-Score verwendet, erstellt

von der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase (ISTH).

Der Score beinhaltet die Thrombozytenzahl, den Fibrinogengehalt im Plasma,

Fibrinmarker (z.B. Fibrinspaltprodukte / D-Dimere, Fibrinmonomere) und die

Verlängerung der Prothrombinzeit in Sekunden (International normalized Ratio

= INR). Für die septischen Tiere wurde hier das Fibrinogen als Marker

ausgewählt und ein Absinken des Plasmagehalts durch die DIC erwartet.

Ursache für den unerwarteten Anstieg von Fibrinogen ist vor allem die


74

gleichzeitige Funktion von Fibrinogen als Akute-Phase-Protein. Durch das

Trauma und die Entzündung nach CASP steigt Fibrinogen als Akute-Phase-

Protein an und verfälscht dessen Funktion als Marker für DIC. Weiterhin

bleiben die Plasmawerte trotz vorhandener gesteigerter Gerinnung von

Fibrinogen sehr lange konstant und erst bei sehr starker intravasaler

Koagulation kommt es zu einem Abfall [78, 79]. Auch in einer klinischen Studie

mit 40 septischen Patienten fand man nur einen Fall mit einem

Fibrinogengehalt, der unter der von der ISTH angegebenen Grenze lag [80].

Der Anstieg von Fibrinogen im Plasma ist kein Widerspruch, sondern nur

Zeichen der Entzündung nach CASP und hier kein gut gewählter Marker für

DIC.

5.3 CCR4-Regulation nach CASP

Chemokine und deren Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle im

Zusammenspiel des Immunsystems. Der Chemokinrezeptor CCR4 und seine

Liganden CCL17 (TARC) und CCL22 (MDC) sind vor allem im

Zusammenhang mit Autoimmunkrankheiten wie atopische Dermatitis

untersucht worden. Ursache für die einseitige Forschung ist seine

vornehmliche Expression auf TH2- Zellen. Trotzdem ist CCR4 auch in andere

pathologische Mechanismen involviert. Die Abwesenheit des CCR4-Rezeptors

bringt sowohl nach LPS-Gabe als auch nach CLP oder CASP ein

Überlebensvorteil für die Tiere im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen [30, 32, 81,

82].

Die CD4+-Milzzellen und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die

in dieser Arbeit untersucht wurden, zeigten eine drastische Abnahme der

Expression von CCR4 auf mRNA-Ebene 20 Stunden nach CASP im Vergleich

zur unbehandelten Kontrollgruppe. Dabei verhalten sie sich konträr zu

Blutplättchen, die überraschenderweise als einzige bekannte Zellen CCR4 in

der Sepsis hoch regulieren. Dies konnte in einem Parallelprojekt unserer

Arbeitsgruppe gezeigt werden.

In der Literatur wurden ähnliche Regulationsmechanismen wie bei den CD4+-

Zellen und PBMCs für Leber, Milz, Thymus und mesenteriale Lymphknoten,

die 20 Stunden nach CASP untersucht wurden, beschrieben. Im Gegensatz

dazu war die Expression von CCR4 drei Stunden nach CASP in den


75

jeweiligen Organen noch identisch zu den Werten der Kontrolltiere [30].

Interessanterweise zeigen PBMCs während der akuten Phase einer

allergischen Reaktion auf ein Medikament genau die entgegengesetzte

Regulation. CCR4 wird hier hoch reguliert [83]. Die Expression der beiden

Hauptliganden von CCR4, MDC und TARC, ist sowohl bei allergischen

Exanthemen der Haut als auch in septischer Milz 20 Stunden nach CASP auf

mRNA-Ebene erhöht [30, 83]. Die Regulation der beiden Chemokine ist

unabhängig von CCR4 und dessen Regulation, da die erhöhte Expression

auch in CCR4-/--Tieren nach CASP beobachtet wird [30].

Die Hochregulation der Chemokine CCL17 (TARC) und CCL22 (MDC) ist

einfach über die Bindung der bakteriellen Pathogen-assoziierten molekularen

Muster (PAMPs) an die pattern recognition receptors (PRR) zu erklären. LPS

als klassisches PAMP bindet beispielsweise an TLR4 und induziert damit die

Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB und die daraus resultierende

gesteigerte Transkription von Chemokinen und Zytokinen [32]. Die Regulation

von CCR4 lässt sich ungleich schwieriger erklären. Eine mögliche Hypothese

wäre die Hypoinflammation (CARS) als gegenregulatorische Maßnahme des

Körpers auf die systemische Hyperinflammation (SIRS). Beide Phasen kann

man während des Verlaufs einer Sepsis beobachten [84]. Die Ausschüttung

proinflammatorischer Zytokine, wie TNF bewirkt die reflektorische Sekretion

antiinflammatorische Zytokine, wie Il-10. Über negative Rückkopplung wird

außerdem eine weitere TNF-Sekretion verhindert. In einem analogen

Mechanismus könnte zusätzlich die Expression des Chemokinrezeptors CCR4

auf mRNA-Ebene verringert werden, so dass die Immunparalyse verstärkt

wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Thrombozyten bei der Sepsis eine

wesentliche Rolle spielen. Thrombozytopenie, disseminierte intravasale

Gerinnung und Thrombozytenaktivierung erschweren das Krankheitsbild

septischer Patienten und könnten Angriffspunkte therapeutischer

Interventionen sein. Trotzdem Thrombozyten kernlos und mit einem

Durchmesser von 1,5-3 µm sehr klein sind, nehmen sie über Interaktion und

Kommunikation mit anderen Immunzellen maßgeblich Einfluss auf das

Krankheitsgeschehen. Sowohl in vitro, als auch in vivo konnte die Beteiligung

von Thrombozyten im inflammatorischen Geschehen gezeigt werden. In vitro


76

interagierten Blutplättchen nach LPS-Stimulation mit Leukozyten, was die

Expression von Oberflächenmolekülen mit immunologischer Funktion

nachweist. Mithilfe des CASP-Modells wurde die Rolle der Thrombozyten in

der polymikrobiellen Sepsis am Mausmodell gezeigt. Die Einwanderung der

Thrombozyten vor allem in die Leber könnte hier eine mögliche Ursache für

ein Organversagen darstellen, da die Thromben und Thrombozyten-

Granulozyten-Aggregate die Mikrozirkulation beeinflussen und zur Nekrose

führen. Da das Organversagen einhergeht mit einer gesteigerten Letalität,

wäre die Verhinderung der Thrombozyteneinwanderung ein möglicher

therapeutischer Angriffspunkt.

Warum Thrombozyten viele Eigenschaften von Immunzellen aufweisen, lässt

sich anhand der Evolution erklären. Säugetiere sind die einzigen Lebewesen,

die polyploide Megakaryozyten mit kernlosen diskoiden Abkömmlingen als

Blutzellen aufweisen. Andere Wirbeltiere wie Vögel oder Fische besitzen

kernhaltige Thrombozyten, die als deren Hauptvertreter der weißen Blutzellen,

als Leukozyten fungieren. In wirbellosen Tieren findet man sogar nur eine

Blutzelle, den Amöbozyten, der trotz der 400 Millionen Jahre Evolution noch

erstaunliche Ähnlichkeit mit unseren Thrombozyten zeigt. Beide haben

beispielsweise eine diskoide Form, enthalten Granula und entwickeln

Pseudopodien nach Aktivierung [19, 85]. Diese Entwicklung erklärt die heute

noch vorhandene Funktion des Thrombozyts als Immunzelle und sollte

aufgrund der Menge an Plättchen sicherlich nicht unterschätzt werden.

Plättchen exprimieren und sezernieren eine große Anzahl an Zytokinen,

Mediatoren und Rezeptoren. Der Chemokinrezeptor CCR4 scheint dabei für

die Thrombozyten in der Sepsis von untergeordneter Bedeutung zu sein. Der

Überlebensvorteil, den CCR4-/--Mäuse in der Sepsis zeigen, ist wohl eher

durch das Fehlen des Rezeptors auf Leukozyten als auf Thrombozyten

bedingt.

Auch wenn immer neue Studien die vielseitige Funktion von Thrombozyten,

sowie deren Anpassungsfähigkeit aufzeigen, werden sie in ihrer Bedeutung

häufig noch unterschätzt. Daher sind dringend weitere Studien erforderlich um

die Komplexität dieser kleinen, kernlosen Zellen zu lernen und zu verstehen.

Kapitel 6: Zusammenfassung

77

6 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro und in vivo die Rolle der

Thrombozyten in der Sepsis untersucht. In vitro wurde sowohl humanes

plättchenreiches Plasma (PRP) als auch Vollblut mit LPS und TRAP-6, einem

Thrombinanalogon, stimuliert und eine mögliche Aktivierung der

Thrombozyten durchflusszytometrisch überprüft. Im PRP kam es zu einem

leichten Anstieg von P-Selektin, einem Aktivierungsmarker und

Adhäsionsmolekül auf Thrombozyten, nach Kostimulation von TRAP-6 und

LPS im Vergleich zur TRAP-6 behandelten Gruppe. Im Vollblut zeigte sich

nach LPS-Zugabe dagegen ein signifikanter Anstieg von Leukozyt-

Thrombozyt-Aggregaten und eine Zunahme der P-Selektin-Expression auf

den aggregatbildenden Thrombozyten.

In vivo wurde als etabliertes Sepsismodell die Colon Ascendens Stent

Peritonitis (CASP) durchgeführt. Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden einer 16

G CASP unterzogen und nach 20 h untersucht. Unbehandelte Tiere dienten

als Kontrollgruppe. Es wurde ein signifikanter Abfall der Thrombozytenzahl im

peripheren Blut septischer Tiere beobachtet. Um die Ursache für diese

verminderte Plättchenanzahl zu finden, wurden zuerst immunhistochemische

Färbungen von Leber, Lunge, Niere und Milz angefertigt um dort mögliche

Thrombozytenanreicherungen zu entdecken. In diesen zeigte sich allerdings

nur in der Leber eine deutliche Zunahme von Thrombozyten nach CASP. In

Lunge, Niere und Milz war kein signifikanter Anstieg zu verzeichnen.

Als zweiter möglicher Grund für die Thrombozytopenie wurde die

disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) als bekanntes Phänomen der

Sepsis in Betracht gezogen. Zur Überprüfung wurde der Fibrinogengehalt im

Plasma per ELISA bestimmt, da bei starker Gerinnung dessen Gehalt sinkt.

Dabei zeigte sich allerdings eine Zunahme von Fibrinogen im Plasma bei den

septischen Tieren im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Fibrinogen

sank also nicht im Sinne einer Verbrauchskoagulopathie, wie es zu erwarten

wäre, sondern stieg im Sinne eines Akute-Phase-Proteins.

Weiterhin wurde der Einfluss des Chemokinrezeptors CCR4 in der Sepsis

untersucht, da CCR4-/--Mäuse im Vergleich zu C57BL/6-Tieren nach CASP

einen Überlebensvorteil haben. Zuerst wurde die Expression von CCR4 auf

Kapitel 6: Zusammenfassung

78

mRNA-Ebene in mononukleären Zellen des peripheren Blutes und CD4+-

Zellen der Milz 20 h nach CASP gemessen. In beiden Zellpopulationen zeigte

sich im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe eine signifikant

verringerte Transkription von CCR4. Da auch Thrombozyten CCR4

exprimieren, wurde sowohl die Immunhistochemie, als auch der ELISA bei

CCR4-/--Tieren nach CASP durchgeführt um mögliche Unterschiede zur

Wildtyp-Maus festzustellen. In beidem war allerdings kein Unterschied

zwischen C57BL/6- und CCR4-/--Tieren zu sehen.

Da Thrombozyten in vitro durch LPS aktiviert wurden, vor allem im

Zusammenspiel mit anderen Blutzellen und septische Tiere sowohl eine

Thrombozytopenie als auch eine Plättchenakkumulation in der Leber zeigten,

sind die Plättchen im Krankheitsverlauf der Sepsis von Bedeutung. Der

Chemokinrezeptor CCR4 scheint im Zusammenhang mit Thrombozyten in der

Sepsis von untergeordneter Bedeutung zu sein. In anderen Immunzellen, vor

allem T-Helfer-Zellen, wird dessen Expression im Zellkern im Verlauf der

Sepsis reguliert und könnte damit Einfluss auf den Krankheitsverlauf haben.

79

Literaturverzeichnis

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86

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen

Abbildungen

Abb. 1: Schematische Darstellung eines Thrombozyts mit all seinen ................

……….Organellen ............................................................................................ 3

Abb. 2: Änderung der Thrombozytenform nach Aktivierung ............................. 6

Abb. 3: Typische Thrombozytenpopulation in der Durchflusszytometrie ........ 39

Abb. 4: CD62P-Expression nach Stimulation von PRP mit unterschiedlichen

. TRAP-6 Konzentrationen ................................................................... 40

Abb. 5: Histogramme der CD62P- und PAC-1-Fluoreszenz nach Stimulation .

. mit TRAP-6 und LPS .......................................................................... 43

Abb. 6: Mittlere Fluoreszenz von PAC-1 und P-Selektin nach Stimulation ..... 44

Abb. 7: Durchflusszytometrische Darstellung der Zellen im Vollblut .............. 46

Abb. 8: Zunahme der Thrombozyten-Granulozyten-Aggregate ..................... 46

Abb. 9: Unterschiedliche Expression des Thrombozytenmarkers CD41 in der

. Granulozytenpopulation nach Stimulation mit LPS und TRAP-6 ........ 47

Abb. 10: CD62P -Expression der Thrombozyten in der Granulozytenpopulation

....................................................................................................................... 48

Abb. 11: Unterschiedliche Aktivierung der Thrombozyten in der .

. Granulozytenpopulation ................................................................... 48

Abb. 12: Zunahme der Thrombozyten-Monozyten-Aggregate nach LPS-.

…………Stimulation ....................................................................................... 49

Abb. 13: CD41-Expression in der Monozyten-Population nach LPS und

. TRAP-6 Zugabe ............................................................................... 50

Abb. 14: CD62P-Expression der Thrombozyten in der Monozytenpopulation 50

Abb. 15: Unterschiedliche Aktivierung der Thrombozyten in der .

…………Monozytenpopulation ....................................................................... 51

Abb. 16: Änderung der Thrombozytenzahl nach CASP ................................. 52

Abb. 17: Immunhistologische Färbungen von Lunge und Milz ....................... 54

Abb. 18: Änderung der Thrombozytenzahl in der Lunge ................................ 55

Abb. 19: Änderung der Thrombozytenzahl in der Milz ................................... 55

Abb. 20: Immunhistologische Färbungen der Leber ...................................... 56

87

Abb. 21: Änderung der Thrombozytenzahl in der Leber ................................. 57

Abb. 22: Immunhistochemische Anfärbung von P-Selektin und CD42c auf

………... Leber ............................................................................................... 58

Abb. 23: Zunahme der P-Selektin-Expression in der Leber nach CASP ........ 58

Abb. 24: Immunhistochemische Anfärbung von CD42c und Gr-1 in der Leber

....................................................................................................................... 59

Abb. 25: Zunahme der Granulozyten in der Leber 20 h nach CASP .............. 60

Abb. 26: Standardreihe für den Fibrinogen-ELISA ......................................... 61

Abb. 27: Zunahme von Fibrinogen im Plasma 20h nach CASP ..................... 61

Abb. 28: Abnahme der Leukozyten 20 h nach CASP..................................... 63


....................................................................................................................... 64

Abb. 30: Abnahme der CCR4-Expression in qRT-PCR nach CASP .............. 64


....................................................................................................................... 65

Abb. 32: Abnahme der CCR4-Expression CD4+-Milzzellen in qRT-PCR nach

………...CASP ............................................................................................... 66

Tabellen

Tabelle 1: Versuchsaufbau der Stimulation von PRP..................................... 42

Tabelle 2: Versuchsaufbau der Stimulation von Vollblut ................................ 45

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst

und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe

und dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht

vorliegt.

Datum Unterschrift

Lebenslauf

Persönliche Daten

Schulbildung

08/93-07/99

08/99-06/06

Studium

10/06

04/09-04/10

04/09-04/11

09/09/09-13/09/09

08/03/10-13/03/10

Manja Appelt

Roald-Amundsen Str. 12

17493 Greifswald

[email protected]

Geb. am 08.12.1986 in Schwedt

Grundschule 6 Schwedt

Carl-Friedrich-Gauss-Gymnasium

Schwedt

Abiturnote: 1,2

Aufnahme des Studiums der

Humanmedizin an der Ernst-Moritz-

Arndt Universität Greifswald

Physikumsnote: 1,5

Laborjahr im Rahmen meiner

Doktorarbeit in der Chirurgie

Mitglied im Graduiertenkolleg 840

Projekt E1 „The effect of CCR4 on

immuno-competent cells in

inflammation”

Aktive Kongressteilnahme

Weimar Sepsis Update 2009

Aktive Kongressteilnahme

ab 11/10

Berufstätigkeit

03/07-04/07

08/07-10/07

04/08-07/08

10/08-07/11

07/10-08/10

08/10-09/10

09/10-10/10

Auslandsaufenthalte

01/03-06/03

„Trauma, shock, inflammation and

sepsis – TSIS 2010“

Weiterführung des Medizinstudiums

Pflegepraktikum in der

Gastroenterologie Greifswald

Pflegepraktikum in der plastischen

Chirurgie

des Vivantes Klinikum Berlin

Anstellung an der EMAU als

Chemietutorin

Anstellung an der EMAU als

Biochemietutorin

Famulatur im Franziskus

Krankenhaus Berlin

-Innere Abteilung-

Famulatur im Asklepios Klinikum

Uckermark

-Abteilung für

Orthopädie/Unfallchirurgie-

Famulatur im Asklepios Klinikum

Uckermark

-Abteilung für Neurologie-

Highschoolyear in den USA, Missouri

http://www.tsis2010.org/

http://www.tsis2010.org/

Danksagung

Diese Arbeit hätte ohne die Hilfe und tatkräftige Unterstützung von vielen

Seiten nicht verwirklicht werden können.

Zu allererst gilt ein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. med. Claus-Dieter-

Heidecke und Prof. Dr. med. Stefan Maier, die mich in ihre Arbeitsgruppe

aufgenommen haben und die ausgiebige Arbeit an diesem interessanten

Thema ermöglicht haben. Weiterhin danken möchte ich auch den Mitarbeitern

der Arbeitsgruppe Frau Dr. med. Alexandra Busemann, Frau Dr. med. Pia

Körner, Frau Dr. med. Katharina Cziupka, Herrn Dr. med. Tobias Traeger und

Herrn Dr. med. Wolfram Keßler, die für Anregungen, Diskussionen und

Verbesserungsvorschläge in den Laborbesprechungen gesorgt haben. Ein

besonderer Dank gilt hier Stephan Diedrich, der sich im Labor viel Zeit für

Gespräche genommen hat und mich in die operativen Techniken eingeführt

hat.

Außerdem danke ich ganz besonders Frau Antje Janetzko und Frau Doreen

Biedenweg für ihre große Unterstützung und ihre Geduld in der Durchführung

vieler Experimente. Auch Frau Birgitt Fürll aus der Abteilung für

Transfusionsmedizin, die mir mit Ideen und technischem Wissen sehr

geholfen hat, möchte ich herzlich danken.

Danken möchte ich auch meinen lieben Mitdoktoranden Laura Klene, Michael

Nielson und Christian Klöcker für eine sehr angenehme Arbeitsatmosphäre

und die gegenseitige Unterstützung. Ohne sie wäre das Jahr im Labor sicher

um viele schöne Momente ärmer gewesen.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft gilt mein Dank für ein Stipendium

und wissenschaftliche Beihilfe im Rahmen des Graduiertenkollegs 840 Host-

pathogen interactions in generalized bacterial infections. Unter der Leitung von

Prof. Dr. med. Barbara Bröker wurden mir dort das wissenschaftliche Arbeiten,

der wissenschaftliche Austausch und die Teilnahme an Kongressen näher

gebracht und ermöglicht.

Ein riesiges Dankeschön möchte ich auch an meine Eltern aussprechen, die

mich in jeder Hinsicht im Studium und in meiner Doktorarbeit unterstützt

haben. Neben meinen Eltern gilt auch meinem Freund Torben ein besonderer

Dank für seine geduldige, liebevolle Unterstützung und den ermutigenden

Beistand in jeder Situation.

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Das Verhalten und der Einfluss von Thrombozyten und CCR4 ... · Aus der Klinik und Poliklinik für...

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