Date post: | 06-Apr-2015 |
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Nicht-invasive pränatale RHD-Bestimmung
RHD-Genotypisierung zellfreier fetaler DNA
32. Informationsgespräch der Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
GliederungNicht-invasive fetale RHD-Genotypisierung
Hintergrund Prävention der Anti-D Bildung in der Schwangerschaft,Management von Antikörperträgerinnen in der
Schwangerschaft
Standard-Prozedere und fetale Genotypisierung im Vergleich
Grundlagen der nicht-invasiven fetalen Gen-Diagnostik
Zuverlässigkeit der Methode: Sensitivität und Spezifität
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Bei RhD-negativen Schwangeren:Prävention der Anti-D-Immunisierung
Kein Immunisierungsrisiko bei RHD-negativen Feten
Nutzen fetaler RHD-BestimmungWann interessiert der kindliche RhD-Faktor?
Bei Antikörperträgerinnen:Nachweis des fetalen RHD-Genotyps
HDFN-Risiko nur bei RHD-positiven Feten
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Prävention der Anti-D-ImmunisierungStandards bei Schwangerschaften RhD-negativer Frauen1
- 28. SSW: Anti-D Immunglobulin
- Bei RhD-positiven Neugeborenen: Anti-D Immunglobulin < 72 h p. partum
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1 KAV-Richtlinien
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Anti-D-immunisierte SchwangereVoraussage für die Entwicklung einer HDFN
nicht invasive Diagnostik (Mutter):
Anti-D-TiterbestimmungUltraschallfetales RHD-Screening (RHD-NIPD)
Invasive fetale Diagnostik: Diagnostik beim Kindesvater (?)
Amniozentese RhD undChoriozentese RHD-ZygotiebestimmungCordozentese (PCR)
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung
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Prof. J. DeutingerUniversitätsklinik für FrauenheilkundeMedizinische Universität Wien
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung
Prof. J. DeutingerUniversitätsklinik für FrauenheilkundeMedizinische Universität Wien
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Hydrops fetalis, 11. – 14. SSWHydrops fetalis, 11. – 14. SSW
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A. cerebri media flow (MCA-PSV)
Flow velocity waveform in the fetal middle cerebral artery in a severely anemic fetus at 22 weeks (left) and in a normal fetus (right). In fetal anemia, blood velocity is increased
Doppler Ultraschalldiagnostik
Bei einer schweren fetalen Anämie (Hb <6g/dl) ist die Flussgeschwindigkeit in der A. cerebri media signifikant erhöht.Scheier M, Prediction of severe fetal anemia in red blood cell alloimmunization after previous intrauterine transfusions. Am J Obstet Gynecol. 2006 Dec;195(6):1550-6. Epub 2006 Jun 21
Collins CY, Evaluating suspected fetal anemia with Doppler ultrasound. J Reprod Med. 2005 Jun;50(6):379-82
Anti-D-immunisierte SchwangereVoraussage für die Entwicklung einer HDFN
Nicht-invasive Diagnostik (Mutter):
Anti-D-TiterbestimmungUltraschallfetales RHD-Screening (RHD-NIPD)
Invasive fetale Diagnostik: Diagnostik beim Kindesvater (?)
Amniozentese RhD und ggf.Choriozentese RHD-ZygotiebestimmungCordozentese (PCR)
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Prävention der Anti-D-Immunisierung bei Schwangerschaft RhD-negativer Frauen
Nutzen fetaler RHD-Bestimmung(Wann) ist die Genotypisierung sinnvoll?
Bei Antikörperträgerinnen:Nachweis des fetalen RHD-Genotyps
Vermeidung von: passiver
Immunprophylaxe(humanes
Plasmapräparat)
Unabhängigkeit von der Verfügbar-keit von humanem Anti-D
Kosteneffizienz?
Frühzeitige Klarheit
Vermeidung von: invasiver Diagnostik und
assoziierter Risiken
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Entwicklung der RHD-NIPDInternationale Arbeitsgruppen
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SAFE NoE - GruppeSpecial Non-Invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network of ExcellenceSixth EC Framework Program
Gemeinsame ProtokolleMultizentrische EvaluierungStandardisierung der Prozesse
Grundlage der GenotypisierungRHD- und RHCE-Gen
Daniels G. Human Blood GroupsDaniels G. Human Blood Groups3
RHD negativRHD negativ RHD positiv (heterozygot)RHD positiv (heterozygot) RHD positiv (homozygot)RHD positiv (homozygot)
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
LO, Y.M.D. et al. 1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 350: 485–487.
FINDINGS: Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal plasma samples, [...] None of the 13 women bearing female fetuses, and none of the ten non-pregnant control women, had positive results for plasma, serum or nucleated blood cells.
INTERPRETATION: Our finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have implications for non-invasive prenatal diagnosis, and for improving our understanding of the fetomaternal relationship.
Fetale Genotypisierung aus maternalem PlasmaLo et al. weisen DNA männlicher Feten in maternalem Plasma nach
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Zellfreie fetale DNAZellfreie fetale DNASynzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNASynzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNA
Kumpel et al. Transfusion 2008
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Anteil fetaler DNA an der zellfreien mütterlichen DNA
Die cffDNA-Menge ist abhängigvom Gestationsalter des Feten
Die DNA-Menge liegt zum Zeitpunkt der Untersuchungteilweise nahe dem stochastischen Bereich der rqPCR.
DNA-Qualität: die cffDNA ist stark fragmentiert
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C. Ellen van der Schoot
Konzentration der cffDNAKonzentrationsunterschiede bei gleichem Gestationsalter
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Studien zur RHD-NIPDReview
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
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Studien zur RHD NIPDErgebnisse von Sanquin, NL
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Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNABeispiele
Y-chromosomale Marker
Genetische Polymorphismen
Epigenetik
Lo et al. 1998 SYRChin and Lo 2003 SYRRijnders et al. 2004 SYRAvent and Chitty 2006 SYR
Lee et al. 2002 HLA-DQLegler et al. 2002 RHCE, C, E, cVan der Schoot et al. 2003 insertion/deletionBrojer et al. 2005 insertion/deletion
Chan et al. 2006 RAASF1A4
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Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNASensitivität der Methoden
Zuverlässigkeit der Methode ist abhängig von:
- geeignete Amplifikationskontrollen für fetale DNA
- geeignetes Entscheidungsschema
Das Verfahren muss ausreichend sensitiv sein, jeden RHD-positiven Feten richtig zu typisieren.
Falls zu wenig fetale DNA vorhanden ist, muss das erkannt werden.
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Amplifikation fetaler DNASpezifität der Methoden
Falsch positive Ergebnisse sind nicht kritisch:
Bei vermeintlich RHD-positiven Feten würde der Schwangeren eine nicht indizierte Anti-D-Prophylaxe verabreicht werden.
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K.C. Allen Chan et al. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal DiagnosisClinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218
BstU I methylation-sensitive restriction enzyme CG’CG, GC’GC
Fetale DNA-MethylierungUniversaler fetaler DNA-Marker für nicht-invasive Diagnostik
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
EukaryontenEpigenetik - GenexpressionHypermethylierung führt zur Suppression der
GenExp.
ProkaryontenSchutz vor DNA anderer Organismen Methylierung blockiert Enzym-Schnittstelle
eigener DNA- fremde (Bakteriophagen-) DNA wird zerstört
DNA-Methylierungin vivo-Bedeutung der DNA-Methylierung
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Enzymatische Verdauung der mütterlichen Plasma-DNA
fetale Methylierung blockiert die Restriktionsschnittstelle
die methylierte fetale Gensequenz bleibt erhalten
die maternale Sequenz wird zerstört
Die Menge der fetalen DNA kann gemessen werden
DNA-Methylierungin vitro-Bedeutung für die fetale Diagnostik
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Amplifikationskontrolle für fetale DNAmethyliertes fetales RAASF1A
Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNAAbb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
RHD-NIPD SAFE-Protokoll
Abb.3: RHD negativer männlicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Abb.5: RHD positiver weiblicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus
RHD-NIPD SAFE-Protokoll
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Amplifikationskontrolle für fetale DNAmethyliertes fetales RAASF1A
Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNAAbb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA
Entscheidungsbaum bei Verwendung von RASSF1A und ACTB für das Prä-natale RHD-Screening nach Chan et al.Clinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218
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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Frühzeitiger Ausschluss RHD-negativer Feten
Vermeidung invasiver Diagnostik
ZusammenfassungNicht-ivasive pränatale RHD-Diagnostik bei Antikörperträgerinnen
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
ZusammenfassungNIPD: Kriterium zur Indikationsstellung der Anti-D-Prophylaxe
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Hohe Sicherheit gegenüber falsch positiven Ergebnissen
Vermeidung unnötiger Anwendung von humanem Anti-D
Unabhängigkeit von der Verfügbarkeit von Anti-D
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
Elisabeth Schwartz-Jungl1
Dieter Schwartz1
Claudia Hobel2
Christof Jungbauer2
W. R. Mayr1,2
RHD-NIPD Arbeitsgruppe
Josef Deutinger3
Peter W. Husslein3
1 Universitätsklinik für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin, Medizinische Universität Wien2 Österreichisches Rotes Kreuz, Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland3 Universitätsklinik für Frauenheilkunde, Medizinische Universität Wien
Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland
www.blut.at www.roteskreuz.at
www.blut.at www.roteskreuz.at
Österreichisches Rotes KreuzBlutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland