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Analyse von MakromolekAnalyse von Makromolekülen mit der ülen mit der
MALDI-TOF-MassenspektrometrieMALDI-TOF-Massenspektrometrie
in der Molekularen Medizinin der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
DNA ProteinRNAGenomics ProteomicsTranscriptomics
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Molekulare MedizinMolekulare Medizin
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Diagnostik Therapie
Krankheit
Prävention
Bioanalytik Bioinformatik
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MALDI-TOF MassenspektrometrieMALDI-TOF Massenspektrometrie
+++
Matrix
Assisted
Laser
Desorption
Ionization
Time
Of
Flight
Laser
Laser
Optik
Feldfreie Driftstrecke
Detektor
Beschleunigungsstrecke
Target
+ + +
Beschleunigungselektrode
Matrix-Biomolekül-Kokristalle
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Matrizes für die MALDI-TOF-MSMatrizes für die MALDI-TOF-MS
OH
HC CCN
COOH
OH
COOH
HO
COOH
N
COOH
NOH
-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CCA):
- Peptide bis ca. 5 kDa
Trans-3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure, SA):
- Peptide ab ca. 3 kDa
- Proteine
2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB):
- Proteine
- Glykoproteine
- Kohlenhydrate
Pikolinsäure (PA):
- DNA
- RNA
OH
HC CH
COOH
CH3H3C OO3-Hydroxypikolinsäure (3-HPA):
- DNA
- RNA
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Fulleren-Analyse mit MALDI-TOF-MSFulleren-Analyse mit MALDI-TOF-MSR
el.I
nt.
Re
l.In
t.
m/z1200 16001400
1356
.315
1800
Fulleren
monoisotopische Massen Isotopenauflösung
natürliche Isotopenverteilung: 12C 98,890 % 13C 1,110 %
14N 99,634 % 15N 0,366 %
16O 99,762 % 17O 0,038 % 18O 0,200 %
1H 99,985 % 2H 0,015 %
„Molekularer Fußball“:
Definiertes Regio-Isomer
C93H48O12 mit C60-Kern
monoisotopische Masse:
1356,3149 DaIsotopen-Signal
Theoretische
Verteilung [%]
Experimentelle
Signal-Höhen [%]
Experimentelle
Signal-Integrale [%]
0 94,99 92,81 93,75
1 100,00 100,00 100,00
2 54,41 55,23 53,12
3 20,34 21,25 20,47
4 5,86 6,94 6,78
0 12 3 4
m/z
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Quantifizierung mit MALDI-TOF-MSQuantifizierung mit MALDI-TOF-MSGenerelle Aspekte:
- Kein direkter Vergleich zwischen einzelnen Signalen aus verschiedenen Spektren
- aber: Intraspektraler Vergleich relativer Signal-Höhen- bzw Signal-Integral-Verhältnisse
mit internen Standards (direkt aus biologischer Probe oder nach Zugabe)
- potentielle Probleme:
• Heterogene Verteilung der Biomoleküle im Kristall (“sweet-spots”)
• Verunreinigung der Probe (Adduktbildung z.B. mit Na+ oder K+)
• Inhomogene Desorptions- und Ionisations-Eigenschaften der Biomoleküle
• Definition des Hintergrunds und der Signale
- Lösungsansätze:
• Summation vieler Laserschüssen an unterschiedliche Positionen zur Mittelung
• standardisierte Probenvorbereitung und Präparation des Ko-Kristalls
• Mehrfachansätze jeder Einzelprobe (z.B. Triplikate) und statistische Analyse
• automatisierte Messung und Auswertung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Analyse mit MALDI-TOF-MSAnalyse mit MALDI-TOF-MSAnwendungen:
- DNA Level (Genomics): • SNP-Analytik
• Mikrosatelliten-Instabilität (MSI)
• Verlust der Heterozygotie (LOH)
• DNA-Methylierung
- RNA Level (Transcriptomics): • Expressions-Analytik
- Protein Level (Proteomics): • Protein-Identifizierung
• Protein-Modifizierung
• Protein-Quantifizierung
- Lipid Level (Lipidomics): • Lipid-Komposition
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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- Genomics- Genomics - -
MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der DNA-Analytikin der DNA-Analytik
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Der Mensch ?Der Mensch ?
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Die Menschen !Die Menschen !
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Ausprägung der IndividualitätAusprägung der Individualität
IndividualitätGene Umwelt
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Risiko ManagementRisiko Management
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Risiko ManagementRisiko Management
Risiko
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA
CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA
Risiko ManagementRisiko Management
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA
CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA
Risiko ManagementRisiko Management
Risiko
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Genetische HeterogenitätGenetische Heterogenität
chromosomale Veränderungen
Insertionen von Nukleotiden
Deletionen von Nukleotiden
Substitutionen von Nukleotiden (single nucleotide polymorphisms)
ACGTCGCTGAC
TGCAGCGACTG
ACGTCGCTGAC
TGCAGCGACTG
ACGTCGCTGAC
TGCAGCGACTG
ACGTCAGCTGAC
TGCAGTCGACTG
ACGTCCTGAC
TGCAGGACTG
ACGTCACTGAC
TGCAGTGACTG
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Single nucleotide polymorphismsSingle nucleotide polymorphisms
SNP Definition: - SNPs sind Einzelbasensubstitution mit einer Häufigkeit von mindestens 1 % in der betrachteten Population.
bei weniger als 1 % Häufigkeit: Punktmutation
SNP-Frequenzen: - 90% der genetischen Heterogenität bedingt durch SNPs- ca. 1 / 1000- über 2 Millionen SNPs identifiziert
SNPs in den Genen: - SNPs in regulativen Regionen- ca. 60.000 SNPs in kodierenden Gen-Regionen- kodierende SNPs können zum Aminosäureaustausch führen
SNP Identifizierung: - bioanalytisch: direkte Sequenzierung ...- bioinformatisch: Algorithmen & Datenbanken („Data Mining“)
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Single nucleotide polymorphismsSingle nucleotide polymorphisms
Positionsmarker
Kartierung neuer Genorte
Identitätsmarker
Vaterschaft Forensik Täter
Diagnostik
Risikoallele Krankheitsallele Pharmakogenomik
SNPs
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Methoden zur GenotypisierungMethoden zur Genotypisierung
- Messung von sekundären Moleküleigenschaften:
z.B. elektrophoretische Mobilität, chromatographisches Verhalten, Hybridisierung:
- klassische und Kapillar-Sequenzierung
- denaturierende HPLC
- Chips
- Messung einer absoluten, intrinsischen Moleküleigenschaft:
Bestimmung der molekularen Masse mit MALDI-TOF Massenspektrometrie
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Molekulare Massen der DNA-BausteineMolekulare Massen der DNA-Bausteine
O
O
O -
O PO
H
H
HH
H
N
N N
N
NH2
O
O
O -
O PO
H
H
HH
H
N
NH
O
O
H3C
O
O
O -
O PO
H
H
HH
H
N
N
O
NH2
Desoxyadenosin: 313 Da
Desoxythymidin: 304 Da
Desoxyguanosin: 329 Da
Desoxycytosin: 289 Da
16 Da
15 Da
40 D
a
9 D
a
2
5 D
a
24 Da
O
O
O -
O PO
H
H
HH
H
N N
NH
O
NH2
N
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Das Risiko wiegen !Das Risiko wiegen !
Gen-Waage
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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MALDI-TOF MassenspektrometrieMALDI-TOF Massenspektrometrie
+++
Matrix
Assisted
Laser
Desorption
Ionization
Time
Of
Flight
Laser
Laser
Optik
Feldfreie Driftstrecke
Detektor
Beschleunigungsstrecke
Target
+ + +
Beschleunigungselektrode
Matrix-Biomolekül-Kokristalle
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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MALDI-TOF-MS: Probenpräparation MALDI-TOF-MS: Probenpräparation 7618 7848
7600 7800 m/z7700 7900
Magnetische Partikel
Reversed-PhaseChromatographie
Amorphe Silikate
Re
l. In
t.
Initiale Probleme bei der MALDI-TOF-MS Analytik :
- Komplexbildung der DNA mit Ionen (Natrium, Kalium ...)
- Abnehmende Sensitivität bei größeren Oligonukleotiden
- Fragmentierung der DNA
Lösungsansätze für die MALDI-TOF-MS Analytik :
- Optimierte Reinigung und Probenpräparation
- Optimiertes molekulares Design der Testsysteme
- Verwendung geeigneter Matrices und Probenträger
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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BlutgerinnungskaskadeBlutgerinnungskaskadeEndogenes
SystemExogones System
Faktor IXa Faktor VIIa
Faktor X Faktor Xa Faktor X
Faktor Va
Prothrombin Thrombin
Fibrinogen Fibrin
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Faktor V Leiden-AllelFaktor V Leiden-Allel
CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA
CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA
Normal-Allel Leiden-Allel
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Faktor V Leiden-AllelFaktor V Leiden-AllelNormal-Allel Leiden-Allel
Faktor V Faktor V
Thrombin
Faktor Va inaktiv Faktor Va inaktiv
Protein C
Faktor Va Faktor Va
X
Stopp der Blutgerinnung
Stopp der Blutgerinnung
X
AKTIVIERUNG„Gas“
INAKTIVIERUNG„Bremse“
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Evolution beim Faktor V SNPEvolution beim Faktor V SNP Ethnie-Abhängigkeit: höchste Rate in Europa: G/A ca. 5 %
A/A ca. 1: 5000 selten bei Afrikanern und Asiaten
Auftreten ca. vor 20 000 - 30 000 Jahren nach der Trennung der Kaukasier von Afrikanern und Asiaten Überlebensvorteil in prä-moderner Zeit: Reduzierte Mortalität bei Geburt und Verletzungen durch erhöhte Blutgerinnung balancierter Polymorphismus
Und in heutiger Zeit ? Thromboserisiko !
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Faktor V Leiden und ThromboserisikoFaktor V Leiden und Thromboserisiko
Klinische Ausprägung des Thromboserisikos beeinflußt durch
A.) Anzahl der Faktor V Leiden-Allele:- Heterozygotie (G/A): 5 bis 10 -fach erhöhtes Thromboserisiko- Homozygotie (A/A): 80 bis 100 -fach erhöhtes Thromboserisiko
B.) Anwesenheit von weiteren genetischen Heterogenitäten:- weitere Risikoerhöhung durch SNP G20210A im Prothrombin-Gen (Faktor II), ca. 3 % Prävalenz in Europa
C.) weitere Risikofaktoren: - Alter, Operationen, anhaltende Immobilisierung, Rauchen, orale Kontrazeptiva, Schwangerschaft ...
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Faktor V Wildtyp5´-AGAGCAGATCCCTGGACAGGAGAGGAATACAGA-3´3´-TCTCGTCTAGGGACCTGTCCTCTCCTTATGTCT-3´
Faktor V Leiden5´-AGAGCAGATCCCTGGACAGGAAAGGAATACAGA-3´3´-TCTCGTCTAGGGACCTGTCCTTTCCTTATGTCT-3´
Extensionsprimer: CAGATCCCTGGACAGGA 5181 Da
Reaktion mit dGTP und ddATP:
Extensionsprodukt Faktor V Wildtyp CAGATCCCTGGACAGGAGA 5807 Da
Extensionsprodukt Faktor V Leiden CAGATCCCTGGACAGGAA 5478 Da
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Faktor V Leiden GenotypisierungFaktor V Leiden Genotypisierung
m/z
Probe A
Probe B
5400 580056005200
Primer5181
A-Allel5478
G-Allel5807
Re
l.In
t.
Probe A + 10 % Probe B
Probe C
Wasserkontolle
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Etablierte SNP Etablierte SNP TestsystemenTestsystemen
FV: 1 SNP TLR4: 1 SNP FII: 1 SNP TLR2: 1 SNP GLRA1: 16 SNPs ADRB1: 7 SNP PR: 3 SNPs GRIN2B: 2 SNP ACHE: 2 SNPs MYOC: 1 SNP PPP2R3L: 7 SNPs CYP2D6: 1 SNP HFE: 2 SNPs MDR1: 1 SNP MTHFR: 1 SNP TGFBRII: 1 SNP PRNP: 4 SNPs Prnp: 10 SNP APC: 2 SNPs APC: 4 Deletionen HBB: 10 SNPs HBB: 2 Deletionen + 1 Insertion … …
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Genomics und AutomatisierungGenomics und Automatisierung
Map II Pure
Genopure
+
Puredisk
PrPrä-Analytikä-Analytik
Anker-Targets
Autoflex
AnalytikAnalytik
Genotools
Post-AnalytikPost-Analytik
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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DNA-Reinigung mit magnetischen BeadsDNA-Reinigung mit magnetischen Beads “Sass-to-Pure” Map II Pure Puredisk
“Mechanik” Zwei-Hand + Multipette 8-Nadel 96-Nadel
Probendurchsatz variabel: 1-96 rel. variabel: 32-96 fest: 96
Reinigungsleistung sehr gut sehr gut sehr gut
Zeitbedarf ca. 90 Minuten ca. 80 Minuten ca. 60 Minuten
Zuverlässigkeit prinzipiell hoch hoch hoch
Verbrauch-Limitierung Nerven, Sehnen, Muskeln Spitzen Binde- und Waschpuffer
Kosten Personal Anschaffung Anschaffung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Anker-TargetsAnker-TargetsVorteile gegenüber herkömmlichen Targets:
Hydrophobe Oberfläche mit hydrophilen Ankern
- definierte Positionen für automatische Messung
- Mikropräparation mit Makropipetten bzw. Robotik
- reduzierte Sweet-Spots
- homogenere Präparation
- 384 Probenpositionen
- erhöhte Sensitivität für Bioanalyte
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Automatische AuswertungAutomatische Auswertung
Verlässlichkeit
grün hoch
gelb mittel
rot niedrig
grau n.d.
Genotypen
dunkelblau A / A
hellblau A / G
rot G / G
grau n.d.
Abnehmende Stringenz der Parameter der automatischen Auswertung
sehr hoch hoch mittel geringStringenz
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Detektion somatischer MutationenDetektion somatischer MutationenMikrosatelliten-Instabilität:
• Verlust oder Einfügen repetitiver Einheiten in Mikrosatelliten
• Verursacht durch DNA-Polymerase Slippage und Defekte im MMR-System
• Schlüsselrolle in Genese und Progression von Tumoren
• Assoziation mit heriditärem nicht polypösem Kolonkarzinom (HNPCC) und in ca. 15 % aller sporadischen Tumore detektiert
• Detektion bisher über Gel-basierte Methoden (Bandenverschiebung)
• Bioinformatische Identifizierung von kodierenden Mikrosatelliten (> 17000/Genom)
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Interne QuantifizierungInterne Quantifizierung
Molare Verhältnisse (-1 Deletion / Wt)
Sig
nal
-Int
egra
l Ver
häl
tnis
se (
-1 D
elet
ion
/ W
t)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,00,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Bestimmung der intern Signal-Integral Verhältnisse mit MALDI-TOF-MS
1.) Messung verschiedener molarer Verhältnisse zweier synthetischer Oligonukleotide:
2.) Bestimmung der Signal-Integral-Verhältnisse
Beispiel: Mikrosatellit im GART-Gen (Phosphoribosylglycinamid Formyltransferase-Gen)
Extensionsprodukte:
Mikrosatellit GART: Wt = 10 TAGCCACTCTGGCCTTTTTTTTTTC
Mikrosatellit GART: -1 Deletion = 9 TAGCCACTCTGGCCTTTTTTTTTC
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Mikrosatelliten-Instabilität: GARTMikrosatelliten-Instabilität: GARTGART Wildtyp5´-TTTGAAAAAAAAAAGGCCAGAGTGGCTGTCTTA-3´3´-AAACTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGACAGAAT-3´
Extensionsprimer: TTTTTTTCCGGTCTCACCGA 6026 Da
Reaktion mit dTTP und ddCTP:
Extensionsprodukt GART Wildtyp CTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA 7211 Da
Extensionsprodukt GART -1 Deletion CTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA 6907 Da
Extensionsprodukt GART +1 Insertion CTTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA 7515 Da
Kontrolle
Zell-LinieKM12
Primer6026
-1 Del6907
Wt7211
m/z
Re
l.In
t.
6300 6800 7300
Patient 184Kontrollgewebe
Patient 184Tumorgewebe
Patient 218Kontrollgewebe
Patient 218Tumorgewebe
+1 Ins7515
!
!
!
! = MSI
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Etablierte MSI TestsystemeEtablierte MSI Testsysteme
GART: A10 – Mikrosatellit Chromosom 21q22.1
AC1: T10 - Mikrosatellit Chromosom 4p16
TGFBRII: A10 - Mikrosatellit Chromosom 3p22
MSH3: A8 - Mikrosatellit Chromosom 5q11-q12
MSH6: C8 - Mikrosatellit Chromosom 2p16
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Verlust der HeterozygotieVerlust der HeterozygotieZwei-Hit Modell der Tumorigenese:
1.) Keimbahn-Mutataion Heterozygotie
2.) Somatische Mutation Verlust der Heterozygotie (loss of heterozygosity, LOH) wichtig für Tumorsuppressor-Gene Verlust der Funktion (loss of function)
Detektion von LOH mit MALDI-TOF-MS:
- DNA Extraktion und PCR- Primerextensionsreaktion und MALDI-TOF-MS- relative Signalverhältnisse Vergleich von relativen Signalverhältnissen: Tumor- versus Kontrollgewebe
TS-Gen (functional)
TS-Gen (dysfunctional)
1. Hit
2. Hit
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Verlust der HeterozygotieVerlust der HeterozygotieLOH-Analyse mit MALDI-TOF-MSPotentielles Tumorsuppressor-Gen PPP2R3B:
T/C SNP an Nukleotidposition 40678
Verlust des T-Allels bei Brustkrebs
Patient Gewebe Signal Integral
Verhältnis (T/C)
Signal Höhen
Verhältnis (T/C)
A Kontrolle 1.01 1.03
A Tumor 0.28 0.26
B Kontrolle 0.98 0.96
B Tumor 0.15 0.14
C Kontrolle 0.95 0.93
C Tumor 0.92 0.91
Rel
.Int.
6100 650063005900
5855 6128 6456
C-Allel T-AllelPrimer
m/z
Patient A: Kontrollgewebe
Patient A: Tumorgewebe
Patient B: Kontrollgewebe
Patient B: Tumorgewebe!
! = LOH
!
Patient C: Kontrollgewebe
Patient C: Tumorgewebe
Extension: dTTP, ddATP und ddCTP
Primer TGAAGCGCTGCAAGCTGGC 5855 Da
C-Allel TGAAGCGCTGCAAGCTGGCC 6128 Da
T-Allel TGAAGCGCTGCAAGCTGGCTA 6456 Da
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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Verlust der HeterozygotieVerlust der Heterozygotie
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Kontrolgewebe
Tumorgeweben=4
A B C D Patient
PPP2R3B:
SNP 40678 T/C
Sig
nal V
erhä
ltnis
(T
/C
)
kein LOHLOH !
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DNA-MethylierungDNA-MethylierungBedeutung der DNA-Methylierung:
Prokaryonten: • Abwehrreaktion gegen Bakteriophagen in Kombination mit Restriktionsendonukleasen
• Timing der DNA-Replikation und DNA-Reparatur
• Regulation der Gen-Expression
Eukaryonten:
• Repression der Gen-Expression:
• Entwicklungskontrolle, genomisches Imprinting, X-chromosomale Inaktivierung
Herkömmliche Techniken zur Analyse der in vitro-DNA-Methylierung:
• Einsatz radioaktiver Methylierungsreagenzien
• Protektion der Restriktionsendonuklease-Reaktion
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DNA-MethylierungDNA-Methylierung
6000 7000 m/z
5793 5807
5750 5850 m/z
5793 7672
0 Min
1 Min
2 Min
5 Min
10 Min
20 Min
40 Min
60 Min
DNA-Methylierung erfolgt durch die Methyltransferasen (MTasen).
S-Adenosylmethionin (SAM) als Donor von aktivierten Methylgruppen.
Beispiel:
E. coli dam MTase erkennt Palindrom GATC:
5´-GCCCGGGGATCCGGCCGCG–3´ 5793 Da3´-CGGGCCCCTAGGCCGGCGC-(T)6-Biotin 7672 Da
CH3
Methylierung führt zu einem definierten Anstieg der molekularen Masse des Oligonukleotids von 14 Da.
Analyse mit MALDI-TOF-MS
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DNA-MethylierungGenomische DNA-Methylierung geht bei PCR verloren.
keine direkte Analyse mit MALDI-TOF-MS möglich!
Chemische Reaktion mit Natrium-Bisulfit:
• unmethyliertes Cytosin Uracil (hydrolytische Deaminierung)
• methyliertes Cytosin resistent gegen Modifikation
Nach Bisulfit-Behandlung und PCR:
• PCR-Fragmente mit T statt unmethyliertes C
• PCR-Fragmente mit C statt methyliertes C
Virtueller C/T-SNP, der den positionsspezifischen Methylierungsstaus wiederspiegelt
Primerextension und MALDI-TOF-MS
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- Transcriptomics -- Transcriptomics -
MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der RNA-Analytikin der RNA-Analytik
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Expressions-AnalyseExpressions-AnalyseA B C D
m/z
PrimerZiel-Gen
PrimerHaushaltsGen
ProductProduktZiel-Gen Haushalts
Gen
Re
l.In
t.
Extension Extension
SteigendeMengenderZiel-GenmRNA
Ziel-Gen Haushalts-Gen
Quantifizierung
RNA Präparation
Gewebepräparation
RT-PCR
Ko-Reinigung
Primerextension
Ko-Reinigung
MALDI-TOF-MS
Signal-Verhältnisse
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Expressions-AnalyseExpressions-AnalyseZiel-Gene
• Glycin Rezeptor -Untereinheit (glrb)
• GABA-A Rezeptor 2-Untereinheit (2)
• GABA-A Rezeptor -Untereinheit ()
Haushalts-Gene
• -Aktin
• Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl Transferase (HPRT)
Analyse-Level
• murines Modell (Gewebe)
• klonierte Fragmente (Plasmide)
• synthetische Templat-Oligonukleotide
Kontrollansätze
• TaqMan
• Light Cycler
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Re
l.In
t.
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Expressions-AnalyseExpressions-AnalyseglrbGACTATAGAGTTAACATTTTCTTGAGACAGAAATGGAATGACCCCAGACTCAAGCTACCTAGTGACTTCAGAGGCTCAGATGCACTGACAGTTGACCCCACCATGTATAAGTGCTTGTGGAAACCTGACTTATTCTTTGCAAATGAAAAAAGTGCCAATTTTCATGATGTGACCCAAGAAAATATCCTGTTGTTTATCTTTCGGGATGGAGACGTCCTTGTGAGC
Extension: ddGTPPrimer: ACAGTTGACCCCACCAT 5100 Da AProdukt ACAGTTGACCCCACCATG 5413 Da B
-AktinTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACAGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGCTATGCTCTCCCTCACGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCC
Extension: ddGTPPrimer: TCCCTGTATGCCTCTGGTC 5723 Da CProdukt: TCCCTGTATGCCTCTGGTCG 6036 Da D
A B C D
m/z
5100 5723 6036
5200 5400 5600
5413
5800 6000
C57/BL6+/+
C3H/HeJ+/+
C57/BL6s/s
B6/C3Hs/s
Cortex von unterschiedlichen
Mäusen
(B/A) / (D/C) = relative Mengen des Ziel-GenTranskritps
(D/C) = Verhältnis des -Aktin-Produkts (haushalts-Gen)
(B/A) = Verhältnis des glrb-Produkts (Ziel-Gen)
(B/A) (D/C)
7.0
5.4
0.7
2.1
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- Proteomics- Proteomics - -
MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der Protein-Analytikin der Protein-Analytik
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Die Bausteine der ProteineDie Bausteine der ProteineMonoisotopische molekulare Massen von Aminosäuren (-H20) [Da] :
Gly (G) 57,0215 Asp (D) 115,0269
Ala (A) 71,0371 Gln (Q) 128,0586
Ser (S) 87,0320 Lys (K) 128,0950
Pro (P) 97,0528 Glu (E) 129,0426
Val (V) 99,0684 Met (M) 131,0405
Thr (T) 101,0477 His (H) 137,0589
Cys (C) 103.0092 Phe (P) 147,0684
Leu (L) 114,0841 Arg (R) 156,1011
Ile (I) 114,0841 Tyr (Y) 163,0633
Asn (N) 115,0269 Trp (W) 186,0793
isobar
m = 0,0364
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Modifizierungen der ProteineModifizierungen der ProteineVeränderungen der monoisotopische molekularen Massen [Da]:
Met Homoserin (CNBr-Abbau) - 29,9928 Glykosylierung (N-Acextylglucosamin) + 203,0794
Gln Pyroglutaminsäure - 17,0265 Liponsäure ( NH-Lys) + 188,0330
Bildung von Disulfidbrücken - 2,0157 Farnesylierung + 204,1878
C-terminale Amidbildung - 0,9840 Myristoylierung + 210,1984
Methylester + 14,0157 Biotinylierung + 226,0776
Hydroxylierung / Met-Oxidation + 15,9959 Addition Pyridoxalphosphat + 231,0297
Formylierung + 27,9949 Palmitoylierung + 238,2297
Acetylierung + 42,0106 Steaorylierung + 266,2610
Carboxylierung + 43,9898 Geranylgeranylierung + 272,2504
Phosphorylierung + 79,9663 Addition N-Acetylneuraminsäure + 291,0954
Sulfatierung + 79,9568 Addition Glutathion + 305,0682
Glykosylierung (Pentose) + 132,0423 Adenosylierung + 329,0525
Glykosylierung (Hexosamin) + 161,0688 Addition Phosphopantethein + 339,0780
Glykosylierung (Hexose) + 162,0528 ADP-Ribosylierung + 541,0611
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ProteinProtein Leitersequenzierung LeitersequenzierungSpaltungen mit Carboxypeptidasen
Detektion verkürzter Peptide mit MALDI-TOF-MS
Massendifferenzen liefern Seqeunzinformation
- Vorteile: - C-terminale Sequenzinformation
- repetitive Sequenzen analysierbar
- Detektion von Modifizierungen
- Nachteile : - relativ kurze “sequence tags”
- Leucine und Isoleucin: isobar
Beispiel:Amyloid Peptide
1100 1500 m/z1900
G Y E V H H Q K L/I V
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Post Source Decay (PSD)Post Source Decay (PSD)Fragmentierung metastabiler Analyten in feldfreier Driftstrecke nach der Beschleunigung:
Pm+ F+ + Fn
Fragmentierung metastabiler Peptide meistens im Proteinrückgrat:
N-term. Ladung: a-, b-, c- Serien C-term. Ladung: x-, y-, z- Serien
Example:Adrenocorticotrope Hormone (ACTH)
adapted from “Bioanaltyik”, F.Lottspeich and H. Zorbas Spektrum Verlag (1998)
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Massen-Finger-PrintsMassen-Finger-Prints
2D-Gel-Elektrophorese
In-Gel-Verdaueinzelner Spots
MALDI-TOF-MS Datenbanksuche mitMassen-Finger-Prints -Actin
no match
CyclophillinA
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NR2B im neonatalen HerzNR2B im neonatalen Herz
E xtraze llu lä r
In traze llu lä r
N R 1N R 2X
A nkerp ro te in
C x H erz
E14kD
116
adultP21
P12P5P0
E18P12
205
NMDA-Rezeptor:
- Excitatorischer Neurotransmitter-Rezeptor
Ligand: Glutamat
Ionenkanal Permeabilität für Na+ und Ca2+
- Hetero-Tetramer aus einer oligatorischer NR1- und
variablen NR2 a-d -Untereinheiten
- klassische Lokalisation: Nervensystem
NR2B: RT-PCR-Analyse im neonatalen Rattenherz:
NR2B: Westernblot-Analyse im neonatalen Rattenherz:
Cx Herz
E18
NR2B
HO2ad
ultP21P12P5
P0P12
-Aktin
M
Primer
Primer
1380
635
517
1125
1380
6351125
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NR2B: Molekularer InteraktionspartnerNR2B: Molekularer Interaktionspartner
BSA-Kontrolle
180 kD-Protein
10004000
30002000>205 kD-Protein
m/z
97,4
kD
205
116
Sol IP
205
kD Ryanodin-Rezeptor
A
IP-Rezeptor3
205
Sol IPkD
B
molekularer Interaktionspartner der NR2B-Untereinheitim neonatalen Rattenherz Ryanodin-Rezeptor
Konfokale Laserscan-Mikroskopie:
Immunpräzipitation und Westernblot-Analyse:Immunpräzipitation vonMembranfraktionen mitAnti-NR2B-Antikörper SDS-PAGE Proteinfärbung
?NR2B ?
In-Gel-Verdau MALDI-TOF-MS Massenfingerprints
Datenbank-suche
BSA
NR2B
RyanodinRezeptor
NR2B Ryanodin-R. Überlagerung
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Modifikationen vonModifikationen von--TThymosinhymosinenen
m/z
Re
l.In
t.
ohne Modifikation
einfache Modifikation
doppelte Modifikation
5000 6000
- Peptid Mapping: nur Glutamine 23 und 36 modifiziert (Reaktivität, Vergänglichkeit)
- Detektion intramolekulare Isopeptidbindungen zwischen spezifischen Lysinen und Gluatminen in vitro und in vivo
ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES
- Substrate für Transglutaminasen
Reaction mit Aminogruppen
- 3 Glutaminreste (Q) an Positionen 23, 36 und 39:
- -Thymosine: Familile von 5 kDa Peptiden
- Funktion:
intrazellulär: Sequestrierung von G-Aktin
Regulation des Cytoskeletts
extrazellulär: Blutgerinnung und Wundheilung
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Glykierung von ProteinenGlykierung von ProteinenBei der nicht-enzymatischen Glykierung werden im Unterschied zur enzymatischen Glykosylierung die Aminosäureseitenketten von Lysin und Arginin modifiziert !
1.) Reaktion von reduzierenden Zuckern (z. B. Glucose) mit Aminogruppen eines Proteins unter Ausbildung von Schiff‘schen Basen (reversibel)
2.) Amadori-Umlagerung (reversibel)
3.) Nachgeschaltete Abbaureaktionen führen zu „Advanced Glycation Endproducts“
(irreversibel)
Bedeutung: - Medizin: Diabetes mellitus mit diversen Folgeschäden z.B. Retinopathie, renale Dysfunktion
- Lebensmittelchemie: Bräunungsreaktionen (Maillard-Reaktion)
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Advanced Glycation EndproductsAdvanced Glycation Endproducts
m 58 Da
m 72 Da
m 144 Da
m 54 Da
Carboxymethyl-Lysin (CML)
Carboxyethyl-Lysin (CEL)
Imidazolon A
Methylimidazolon
Lysin spezifische Produkte Arginin spezifische Produkte
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Glykierung intakter ProteineGlykierung intakter Proteine
13000 15000 17000 m/z
natives Lysozym
CML-Lysozym
CEL-Lysozym
3-Desoxyglucoson-Lysozym
Methylglyoxal-Lysozym
glykiertes Lysozym
Re
l.In
t.14313
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Glykierung und PeptideGlykierung und Peptide
Glukose Glu-C-Spaltung
MALDI-TOF-MS
Lysozym AGE-Lysozym
838 896 1000
m/z m/z
1202 1346
NH2
K V FG R C E
838
N H
K V FG R C E
CH2O
CH2
O H
OH
OH
OH
H
H
H
1000
NH
K V FG R C E
CH2
O OH
896V Q A W I R G C R L
N H
N N H
O C4 O3H9
V Q A W I R G C R L
N H
NH N H2
1202 1346
Amadori CML Imidazolon
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Quantifizierung der GlykierungQuantifizierung der Glykierung
m/z850 900 950 1000
838 1000896 CML Amadori
Re
l.In
t.
ohne Glukose
1 Woche Glukose
4 Woche Glukose
8 Woche Glukose
16 Woche Glukose
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Inkubationsdauer [Wochen]
% d
es
tota
len
In
teg
rals
unmodifiziert
CML
Amadori
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Re
l.In
t.
m/z2000 60004000 10000
Poly-L-Lysin
8000
Molekulare Heterogenität: Poly-L-LysinMolekulare Heterogenität: Poly-L-Lysin
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Zusammenfassung ProteinanalytikZusammenfassung ProteinanalytikBiologisches Material
2D-Gel- Elektrophorese Protein-Reinigung
Crosslink
In-Gel-Verdau Protein-Verdau Exoproteasen
MALDI - TOF Massenspektrometrie
Massen-Finger-Print
Datenbanken
Peptid-Leiter
Masse desintakten Proteins
Sequenz-Information(1o-Struktur)
Identifizierungbekannter Proteine
Detektionunbekannter
Proteine
Analyse von Protein-
Modifizierungen
Analyse von3o- und 4o-Strukturen
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Protein Separation & Clinical ProteomicsProtein Separation & Clinical Proteomics
Chemische Oberflächen – Protein Expressions Profiling:
Hydrophob Anionisch IMAC Normael PhaseKationisch
aktivierte Oberflächen AK-AG Rezeptor - Ligand DNA - Protein
Biologische Oberflächen – Protein Interaktions Assays:
SELDI-TOF-MS
(adapted from Ciphergen)
MALDI-TOF-MS
Magnetische BeadsProteinChips
(adapted from Villanueva et al. 2004)
Bead Suspension Bindung: Waschen:
Beads
Serum
Waschen und Sammeln: Elution: MALDI-Probenpräparation:
Puffer Matrix
Eluat
MALDITarget
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ProteinChips und SELDI-TOF-MSProteinChips und SELDI-TOF-MS
…ISEVXXDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA…
1 - 40 peptide
1 - 42 peptide
Analysis von Amyloid Varianten:
NTA4 mAb
1 - 17 peptide
0
20
40
2000 3000 4000 5000
4514.41 - 42 Peptid
Biomarker Profiling: 1.) ProteinChip: Ionenaustausch Chromatographie
2 biologische Proben (A und B): pH 10, 8, 6 und 4
2.) SELDI-TOF-MS Analyse:
pH Probe
10 A
10 B
8 A
8 B
6 A
6 B
4 A
4 B
7000 7250 7500
7000 7250 7500
7000 7250 7500
7000 7250 7500
7000 7250 7500
7000 7250 7500
7000 7250 7500
7000 7250 7500
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
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ProteinChips und SELDI-TOF-MSProteinChips und SELDI-TOF-MS
Flad et al. 2002
DermcidinAnalyse von Schweiss
ProteinChips und SELDI-TOF-MS
Insulin
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MALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsMALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsVergleich von chromatografischen Beads- Mischung von 7 Peptiden (1 kDa - 3 kDa)
- Chromatographie auf magn. Beads (HIC, IMAC, WAX, WCX)
- MALDI-TOF-MS Analyse (linearer Modus), Matrix HCCA
m/z
WCX
WAX
HIC
IMAC
1400 2400
An
gio
ten
sin
II
AC
TH
(1-
17)
So
mat
ost
atin
28
Re
l.In
t.
3400
An
gio
ten
sin
IS
ub
stan
ce P
Bo
mb
esin
AC
TH
(18
-39)
Vergleich von chromatografischen Beads- menschliches Serum
- Chromatographie auf magn. Beads (HIC, IMAC, WAX, WCX)
- MALDI-TOF-MS Analyse (linearer Modus), Matrix HCCA
Re
l.In
t.
m/z2000 4000 6000 8000
WCX
WAX
HIC
IMAC
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Zellkulturüberstand
m/z
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
24h BBTx
24h BBTx
24h BBTx
2000 4000 6000 8000
Re
l.In
t.
Zellkulturüberstand- Gift einer Taiwanesischen Giftschlange
(banded krait Bungarus multicinctus):
Beta-Bungarotoxin (BBTx)
- BBTx induziert neuronale Apoptose (hippocampale Kulturen):
- Bindung an spannungsabhängige K+ Kanäle
- Internalisierung
- Anstieg von intrazellulärem Ca2+
- Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)
- Modifizierung von Proteinen und Lipiden
- Apoptose
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MALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsMALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsZellkulturüberstand
m/z
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
24h BBTx
24h BBTx
24h BBTx
2000 2500 3000
Re
l.In
t.
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- Lipidomics- Lipidomics - -
MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der Lipid-Analytikin der Lipid-Analytik
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Lipid-Analyse mit MALDI-TOF-MSLipid-Analyse mit MALDI-TOF-MS
770 810790750 m/z
Phosphatidyl-cholin
Re
l.In
t.
m/z760
Re
l.In
t.
m/z810
Re
l.In
t.
m/z790
Re
l.In
t.
780
A B C Signalbereiche A
B
C
1 2 3 4
12345 6789
34 5 6
1 PC 16:0 / 18:2 oder
PC 16:1 / 18:1 oderPC 16:2 / 18:0
3 PC 16:0 / 18:1 oderPC 16:1 / 18:0
5 PC 16:0 / 18:0
1 PC 16:0 / 22:6 oder ...3-6Na+ -Shifts von B6-B9 ?3 PC 18:1 / 20:4 oder ...5 PC 18:0 / 20:4 oder ...
1-5Na+ -Shifts von A1-A5 ?3 PC 16:0 / 20:46 PC 18:0 / 18:2 oder ...
PC 18:1 / 18:18 PC 18:0 / 18:1
5
1 2
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MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS
MALDITOFMS
Auflösung
Sensitivität
Genauigkeit Quantifizierung Geschwindigkeit
Automatisierung
Hochdurchsatz
Reproduzierbarkeit Poolen & Multiplex Kosteneffizienz
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
DanksagungDanksagungInstitut für Biochemie (Universität Erlangen-Nürnberg)
Cord-Michael Becker Kristina Becker Katrin SchiebelSilke Seeber Daniela Gockenhammer Andre Reuland Thomas Bonk Julia Brill Nadine BalbusClaudia Sass Thomas Kislinger
Klinik für Frauenheilkunde (Universität Erlangen-Nürnberg)
Mattias Beckmann Reiner Strick Pamela StrisselLudwig Wildt Alexander Berkholz Michael Bauer
Insitut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (Universität Erlangen-Nürnberg)
Monika Pischetsrieder Carlo Peich Jasmin Meltretter
Molekulare Diagnostik (Universität Heidelberg)
Magnus von Knebel-Döberitz Johannes Gebbert Christian Sutter
Bruker Daltonik GmbH (Bremen und Leipzig)
Jochen Franzen Uwe Rapp Markus Kostrzewa
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin