Analyse von Gehirnaktivität II:Lernabhängige Plastizität in Bienenneuronen.

Die Analyse intrazellulär abgeleiteter Signale von Neuronen des Bienengehirns

dr. bernd grünewald

www.ionenkanal.de

Verschiedene Neuronen im Gehirn bilden unterschiedliche Aktionspotentialmuster

Fragen der Neurophysiologen:

Wie beschreiben wir die Spikeaktivität einzelner Neurone quantitativ?

Welche Parameter lassen sich extrahieren?

Wie vergleichen wir die Reaktionen verschiedener Neurone auf einen gegebenen Reiz?

Wie vergleichen wir die Antworten eines Neurons auf verschiedene Reize oder Reizwiederholungen?

S

abin

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zik

Morphologie des PE1 Neurons

Brandt, Rybak, Menzel, 2002

Morphologie des PE1 Neurons

Brandt, Rybak, Menzel, 2002

Morphologie des PE1 Neurons

Mauelshagen (1993) J Neurophysiol 69:609

o.k.

aber wie funktioniert die intrazelluläre Ableitung von Aktionspotentialen?

Intrazelluläre Ableitungen aus dem Bienengehirn

intrazelluläre Ableitung mit anschließender Färbung des Neurons

Grünewald, 1999

komplexe Reaktion eines Neurons auf einen Duftstimulus

Duftantwort des PE1 Neurons

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

untitled16M14M23

4

2

0

-2

-4

mv

stim

mul

2

0.3

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

mv

sing

nal

1

4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7s

Sp

an

nu

ng

(m

V*1

0)

Zeit (s)

Spannungssignal aus dem Verstärker

Beginn, Dauer und Ende des Reizes

"Event-Kanal" = Aktionspotentiale

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

Reaktionen des PE1 Neurons auf Duftstimuli

4 Ableitungen vom PE1 Neuron an 4 Bienen

Duftreiz = Gewürznelke

Auswertung von elektrophysiologischen Signalen

Signalverstärkung

Filter

Digitalisieren

Validierung

primäre Datenanalyse

sekundäre Datenanalyse

Auswertung von elektrophysiologischen Signalen

1. Digitalisierung der analogen Spannungssignale

Filterfrequenz:z.B. 1 kHz Tiefpassfilter ("entfernt" hohe Frequenzen)

(lässt alle Frequenzen unterhalb 1 kHz durch)z.B. 100 Hz Hochpassfilter ("entfernt" tiefe Frequenzen)

(lässt alle Frequenzen oberhalb 100 Hz durch)z.B. Bandpassfilter (Kombination aus Tiefpass und Hochpass)

Samplefrequenz (z.B. 2 kHz = 1 sample/500µs)

Genauigkeit der Frequenzdarstellung vs. Speicherkapazität

Berücksichtigung des Nyquist Theorems

Nyquist Theorem

Samplefrequenz muss mindestens 2x maximale Signalfrequenz sein!

fnyq = 2fmax

fmax - höchste Frequenzkomponente des Signals,fnyq – minimale Samplingfrequenz, um Signal

ohne Verzerrung (aliasing) abzubilden

Auswertung von elektrophysiologischen Signalen

2. Validierung der Daten und Abschätzung der Ableitqualität

Stabilität des MembranpotentialsKonstante Hintergrundfrequenz?Geringe Schwankungen der Aktionspotentialamplitude?Signal-Rauschverhältnis konstant?

untitled16

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

-0.25

-0.50

-0.75

-1.00

-1.25

-1.50

Vo

lts

mu

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1

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18s

Sp

an

nu

ng

(m

V*1

0)

Zeit (s)

Auswertung von elektrophysiologischen Signalen

3. primäre Datenanalyse - 1. Datenreduktion: einzelne Ableitung (z.B. eine Duftantwort des PE1 Neurons):

Aktionspotentiale:Dauer, Amplitude, Frequenzen (spontan, Reaktion), Adaptation,

Membranpotential:EPSPs, Depolarisationen, Plateaupotentiale

4. sekundäre Datenanalyse – 2. Datenreduktion: Vergleich mehrerer Ableitungen (lernabhängige Veränderungen der Duftantworten:

Variabilität der Antwort (Wiederholung eines Reizes während einer Ableitung)Individuelle Unterschiede der TiereVeränderungen der Aktionspotentialsmusters (Lernen)Statistik

Duftantwort des PE1 Neurons

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

untitled16M14M23

4

2

0

-2

-4

mv

stim

mul

2

0.3

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

mv

sing

nal

1

4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7s

Membranpotential

Spikeamplitude, -Spikedauer

Spikefrequenz

Antwortlatenz

spontane Spikefrequenz

Reaktionsdauer

Analyse der Duftantworten des PE1 Neurons

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

bin size: 100ms

200

100

0

Hz

untit

led

4a

10

5

0

Eve

nts

untit

led

4

5.0

2.5

0.0

-2.5

-5.0

Vol

tsun

title

d

2

0.0

-0.2

-0.4

Vol

tsun

titel

d

1

4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8s

Peristimulus Zeithistogramme (PSTH)

kumulative Spikefrequenzen (1/t)

Peristimulus Zeithistogramme (PSTH)

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

2.00

1.75

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

Sw

eep

Ras

ter

1a

35

30

25

20

15

10

5

0

Cou

ntM

11

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0secondsTime

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

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0.6

Sw

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Cou

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11

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8secondsTime

2.00

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Sw

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Ras

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0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0secondsTime

untitled16M14

0.30

0.25

0.20

0.15

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1

4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0s

bin size: 10ms bin size: 500ms

bin size: 100ms

35/500ms = 70Hz

3/10ms = 300Hz

10/100ms = 100Hz

Duftantwort des PE1 Neurons – DC Komponente

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

untitled16M14M23

4

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2

0.3

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sing

nal

1

4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7s

relatives DC-Potential: Abweichung des Membranpotentials vom Ruhepotential

Sp

an

nu

ng

(m

V*1

0)

Zeit (s)

Duftantwort des PE1 Neurons – DC Potential und Aktionspotential

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

je höher DC-Potential, desto geringer Spikeintegral

Das DC-Potential entspricht in etwa dem synaptischen Eingang des Neurons.

Frage: In welchem Zusammenhang stehen synaptisches Potential und Spikefrequenz /Spikeamplitude?

M14

4

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mul

2

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-0.2

-0.3

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nal

1

4.46 4.48 4.50 4.52 4.54 4.56 4.58 4.60 4.62 4.64 4.66 4.68 4.70 4.72s

je höher DC-Potential, desto höher Spikefrequenz

Sp

an

nu

ng

(m

V*1

0)

Zeit (s)

Duftantwort des PE1 Neurons – DC Potential und Aktionspotential

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

M14

4

2

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-2

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mv

stim

mul

2

0.3

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

mv

sing

nal

1

4.46 4.48 4.50 4.52 4.54 4.56 4.58 4.60 4.62 4.64 4.66 4.68 4.70 4.72s

alle Spikes,geringe Korrelation

Spikes während 3. Intervall: hohe Korrelation

höhere Depolarisation nötig während später Burstphase

Das Pe1 Neuron bildet spontane Aktionspotentiale, denn Membrandepolarisation ("EPSPs") und Spikes korrelieren nicht 100%ig.

Auswertung von elektrophysiologischen Signalen

3. primäre Datenanalyse - 1. Datenreduktion: einzelne Ableitung (z.B. eine Duftantwort des PE1 Neurons):

Aktionspotentiale:Dauer, Amplitude, Frequenzen (spontan, Reaktion), Adaptation,

Membranpotential:EPSPs, Depolarisationen, Plateaupotentiale

4. sekundäre Datenanalyse – 2. Datenreduktion: Vergleich mehrerer Ableitungen (lernabhängige Veränderungen der Duftantworten):

Variabilität der Antwort (Wiederholung eines Reizes während einer Ableitung)Individuelle Unterschiede der Tiere (Duftantworten Veränderungen der Aktionspotentialsmusters (Lernen)Statistik

Duftantworten können sehr variabel sein

Grünewald (1999) J Comp Physiol 185:565

carnation

orange

citra l

a ir

geranio l

10 m V

1 s

neuron A neuron B neuron C

Intrazelluläre Ableitungen von Rückkopplungsneuronen aus dem Pilzkörper des Bienengehirns

Duftantworten - Quantifizierung

Mauelshagen (1991) Dissertation, FU-Berlin

11 22

200

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Hz

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4

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-0.2

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1

3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1s

11 22

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Hz

spik

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-0.2

-0.4

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1

5.40 5.45 5.50 5.55 5.60 5.65 5.70 5.75 5.80 5.85 5.90 5.95 6.00 6.05s

bin size: 100ms

600ms

Differentielle Konditionierung

Mauelshagen (1993) J Neurophysiol 69:609

Differentielle Konditionierung Vergleich zwischen relativer Aktionspotentialfrequenz und relativem DC-Potential

Ähnliche Effekte während Lernakt 2 und 5. Bedeutet: Die lernabhängigen Antwortänderungen sind im wesentlichen präsynaptisch. Aber: Änderungen im DC-Potential geringer als von Spikefrequenz erwartet. Bedeutet: Das PE1 Neuron besitzt selber plastische Eigenschaften.

Mauelshagen (1993) J Neurophysiol 69:609

relative Spikefrequenz relatives DC-Potential

Auswertung von intrazellulären Ableitungen - Zusammenfassung

- Vor dem Experiment: Was will ich auswerten? Wahl der Filterfrequenzen und Samplefrequenzen. Hierzu Pilotexperimente.

- Nach dem Experiment: Abschätzen der Ableitqualität und Signalgüte: Kann ich das analysieren, was ich wollte?

- Datenauswertung: zunächst Quantifizierung der einzelnen Messungen: Welche Auswertungsmethode ist adäquat?

- Eventuell dann: automatisierte Vorabauswertung (Programme, Macros)

- Dann: sekundäre Datenanalyse: Wie variabel / konstant ist mein Signal? Wie sieht eine mittlere Reaktion aus?

- Schließlich: Vergleich experimenteller Gruppen. Gibt es Effekte der Behandlung?

- Abschließend: Kontrolle der Primärdaten: Ist mein berechneter Effekt in den Primärdaten erkennbar?

© G

ary

Lars

on