ODA STOEVESANDT1, RONNY SCHMIDT1, CHRISTIAN HEISE2, UWE SCHEDLER2
1CAMBRIDGE PROTEIN ARRAYS LTD., CAMBRIDGE, UK2POLYAN GMBH, BERLIN
The DNA-array to protein-array technology (DAPA) allows the direct transcription and translation of a coded DNA-array to a protein array inthe presence of a cell free expression system. The coupling efficiency ofDNA and of the corresponding immobilized proteins is enhanced by using3-dimensional epoxy surfaces. The production time of protein arrays isconsiderably reduced and the DNA template array can be reused for pro-ducing further protein arrays.
ó Proteinarrays enthalten eine Vielzahl ver-schiedener Proteine, die ortsaufgelöst ineinem definierten Muster auf planaren Trä-gern immobilisiert werden. Als Trägermate-rialien werden oft Gläser oder Kunststoffe imSlideformat verwendet, die chemisch so modi-fiziert werden, dass sie sich für die kovalen-te Immobilisierung biochemischer Spezieseignen. Mit der zielgerichteten Bindung sindhohe Ansprüche an die Oberflächen verbun-den. Die Oberflächen sollten eine hohe Bin-dungskapazität und -spezifität bei gleichzei-tig geringen unspezifischen Wechselwirkun-gen aufweisen. Weiterhin ist die Homogenitätder Funktionsschicht Voraussetzung für einegute Morphologie und Topografie der spots.
Dreidimensionale Oberflächen (3D-Ober-flächen) für Mikroarrays zeichnen sich gegen-über herkömmlichen, silanisierten 2D-Ober-flächen durch eine verbesserte Oberflächen-homogenität, geringere unspezifische Wech-selwirkungen infolge der integrierten Anti-fouling-Funktionen sowie durch eine deutlichhöhere Beladungskapazität aus.
OberflächenchemieBei den hier untersuchten 3D-Schichten han-delt es sich um tentakuläre Nanostrukturen,in denen eine Polyethylenglykol-basierte Anti-fouling-Matrix als Ko-Polymer zur Unterdrü-ckung unspezifischer Wechselwirkungen inte-griert wurde (Abb. 1). In 3D-Epoxyschichten
kann durch die Kombination von hoher Bela-dungskapazität und Antifouling-Matrix dasSignal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR-Wert) deut-lich erhöht werden (Abb. 2). Während die ver-gleichend untersuchten 2D-EpoxyoberflächenSchichtdicken von nur ein bis zwei Nanome-ter und Beladungsdichten von lediglich zehnFemtomol pro Quadratmillimeter aufweisen,zeichnen sich die 3D-Epoxyschichten durchhomogene Schichtdicken von zehn bis 20Nanometer und deutlich höhere Beladungs-dichten von ca. zehn Pikomol pro Quadrat-millimeter aus.
Proteinarray durch DNA-Transkriptionund TranslationDer typische Herstellungsweg für Proteinar-rays ist die separate Expression und Aufrei-nigung aller benötigten Proteine, mit nach-folgender Immobilisierung auf der Oberflä-che. So lassen sich mit minimalem Bedarf anProben und Reagenzien hoch parallelisiertminiaturisierte Interaktionsassays durch-führen und auswerten. Je nach Fragestellungkann es sich dabei um Protein-Protein-, Pro-tein-DNA-, Protein-Lipid- oder Protein-small-molecule-Interaktionen handeln [1]. Eine wei-tere prominente Anwendung von Proteinar-rays liegt in der Evaluierung von Antikör-pern. Zielsetzung ist dabei entweder die Cha-rakterisierung der Antikörperspezifität und-kreuzreaktivität [2] oder – beim Screeningvon Seren von Patienten mit Autoimmuner-
Trägermaterialien
3D-Epoxyoberflächen für DNA-codierteProteinarrays
˚ Abb. 1: Molecular Surface Engineering zur Herstellung von 3D-Oberflächen für DNA-codierte Proteinarrays unter Verwendung einer Polyethylengly-kol-basierten Antifouling-Matrix (PolyAn GmbH) als Ko-Polymer.
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krankungen – die Aufklärung der Autoim-munantigene [3]. Arrays menschlicher Pro-teine erreichen gegenwärtig 17.000 ver-schiedene Proteine und decken damit bereitseinen signifikanten Anteil des Humanpro -teoms ab ([2, 3], www.cambridgeproteinarrays.com).
Um die zeit- und kostenaufwendige sepa-rate Herstellung von Proteinen zur nachfol-genden Immobilisierung auf Proteinarrays zuumgehen, wurden mehrere Ansätze zur Her-stellung von Proteinarrays durch zellfreie Pro-teinexpression auf dem Array miteinanderverglichen [1]. Von getesteten Verfahren hatsich die DAPA(DNA-Array zu Proteinarray)-Methode bewährt, weil der als Expressions-template fungierende DNA-Array wiederver-
wendet werden kann [4, 5]. Der DNA-Arrayenthält immobilisierte lineare DNA mit denProtein-codierenden Sequenzen. Auf diesenArray wird mit einem Abstand von 50 Mikro-metern Höhe ein zweiter Slide mit einer Pro-tein-bindenden Oberflächenmodifikation auf-gelegt. Der Spalt zwischen den beiden Slideswird mit einem homogenen zellfreien Expres-sionssystem gefüllt. Exprimierte Proteineerreichen durch Diffusion die Oberfläche deszweiten Slides, auf dem durch ihre Immobi-lisierung der dem DNA-Array entsprechendeProteinarray entsteht (Abb. 3, links). In Abbil-dung 3 ist außerdem der Vergleich zwischenden verwendeten Oberflächen und derenquantitative DAPA-Proteinexpression darge-stellt [6].
Material und MethodenFür die Herstellung der Mikroarrays fanden3D-Epoxy- und 2D-Epoxy-Glasträger (PolyAnGmbH) Verwendung. Synthetisierte Protein-codierende PCR-Templates wurden miteinem Nanospotter (NP2.1, GeSiM) auf 2D-und 3D-Oberflächen immobilisiert. Vor derAnwendung der DAPA-Technik wurden dieDNA-Arrays gewaschen und geblockt [6]. DieDAPA-Technik wurde in dem zellfreien Sys-tem RTS 100 E. coli HY (RiNA GmbH) ange-wendet [5]. Der Nachweis der Proteine aufdem DAPA-Proteinarray erfolgte durch einenenthaltenen Myc-Tag, der mit einem fluoro-phormarkierten Anti-Myc-Antikörper für dieDetektion im Mikroarray-Scanner angefärbtwurde.
A B
˚ Abb. 2: Vergleich der Bindungskapazitäten zwischen 2D-Epoxy- und 3D-Epoxy-Slides über die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität auf einer Flä-che von 300 mm2, gemessen im GenePix Personal 4100A-Scanner (Molecular Devices) (ex/em: 532/575 nm, PMT: 700) (A) nach sequenzieller Umset-zung mit 1,4-Diaminobutan und Fluoreszeinisothiocyanat (B).
˚ Abb. 3: Abhängigkeit der Effizienz des DAPA-Prozesses (links) von 2D- und 3D-Epoxy-Oberflächenmodifikationen für DNA- und Protein array. Rechtssind die resultierenden Proteinarrays gezeigt, visualisiert durch Immunfluo res zenz färbung gegen Myc-Epitop-Tags (Falschfarbendarstellung: blau =schwächstes, rot = stärkstes Signal. Maßstab = 1,0 mm).
Literatur[1] Stoevesandt O, Taussig MJ, He M (2009) Protein microar-rays: high throughput tools for proteomics. Expert Rev Proteomics 6:145–157[2] Jeong JS, Jiang L, Albino E et al. (2012) Rapid identifica-tion of monospecific monoclonal antibodies using a humanproteome microarray. Mol Cell Proteomics 11:O111.016253[3] Hu CJ, Song G, Huang W et al. (2012) Identification ofnew autoantigens for primary biliary cirrhosis using humanproteome microarrays. Mol Cell Proteomics 11:669–680
[4] He M, , et al. (2008) Printing protein arrays from DNAarrays. Nat Methods 5:175–177[5] Stoevesandt O (2012) Protein arraying by cell-free expres-sion and diffusion across a fluid-filled gap. N Biotechnol 29:586–588[6] Schmidt R, , et al. (2013) Optimised ‘on demand’ proteinarraying from DNA by cell free expression with the ‘DNA toProtein Array’ (DAPA) technology. J Proteomics 88:141–148
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Ergebnis und BewertungEs wurden 18 verschiedene Protein-codie-rende DNA-Konstrukte als Triplikat auf 2D-und 3D-Epoxyoberflächen immobilisiert. Dieso erzeugten DNA-Arrays wurden parallelzueinander mittels DAPA-Technik in Protein -arrays transkribiert und translatiert, wobeiwiederum 2D- und 3D-Epoxyoberflächen fürdie Proteinimmobilisierung gewählt wurden.Alle verwendeten Proteinkonstrukte enthiel-ten einen Myc-Tag, der durch Immunfluores -zenzfärbung auf dem Array detektiert wur-de. Die untersuchten Oberflächenkombina-tionen für die DNA- und Proteinarrays waren2D/2D, 2D/3D 3D/3D (Abb. 3). Mit sukzes-siver Einführung der 3D-Oberflächen in dasDAPA-System war eine deutliche Zunahmeder auf dem Proteinarray detektierbaren Pro-teine zu beobachten. Der Grad der Zunahmevariierte dabei von Protein zu Protein. DieseBeobachtung lässt sich schlüssig durch dieauf 3D-Oberflächen gegenüber 2D-Ober -flächen erhöhte Bindungskapazität erklären,die sowohl auf der DNA- als auch auf der Pro-teinseite der DAPA-Anordnung zum Tragenkommt. ó
Oda Stoevesandt, Ronny Schmidt, Christian Heise und Uwe Schedler (v. l. n. r.)
