Post on 28-Feb-2021
transcript
Untersuchungsmethoden / Analysenverfahren
Chemische Untersuchungsmethoden- Titrimetrische
Verfahren- Gravimetrische Verfahren- Elektrische Verfahren
Physikalische Untersuchungsmethoden- Spektrometrische
Verfahren- chromatographische Verfahren
Biologische Untersuchungsmethoden- Bioteste mit Lebewesen- Enzymimmunoassays
Mikrobiologische Untersuchungsmethoden- Kolonienzahl- Bakterien-
und Pilzwachstum
Spektrometrische Analysenverfahren und zugehörige umweltrelevante Analysenparameter
UV/VIS-Spektrometrie
AnionenKationenFärbungOrganische VerbindungenDetektoren für die HPLC
Kohlenwasserstoffe, TensideDetektor für die GC (HPLC)Detektor für TOC-
und DOC-Messungen
Infrarot-Spektrometrie
Fluoreszenz-Spektrometrie
KationenOrganische VerbindungenDetektor für die HPLC
Emission-Spektrometrie
Flamme, Funken, BogenICPICP/MS
Metalle undNichtmetalle (S;P)
Atomabsorptions-Spektrometrie
FlammeGraphitrohrofenQuecksilber-Hydrid-SystemZeeman-AAS
Metalle undNichtmetalle
Bereiche des elektromagnetischen Spektrums
1021
1019 1017 1015
1013
1011
109
107
Frequenz v, Hz
10-11
10-9 10-7 10-5
10-3
10-1
101
103
1011
109
107
105
103
101
10-1 10-3
Wellenlänge ,cm
Wellenzahl v,cm-1
γ
-
Strahlen
Röntgenstrahlen
Ultraviolett
Sichtbar
Infrarot
Mikrowellen
Radiowellen
Funktionsprinzip der Spektrometrie
StrahlungTemperatur Messzelle Detektion
AuswertungDokumentationAnalysenprobe
Aufbau des Massenspektrometers
Probe
Beschleunigungs-platten
Einlaßsystem
Ionenquelle
Magnet
Trennsystem
Verstärkung/Registrierung
Massenspektrum
Massenspektrometrie
Messprinzip:- Analyt
wird in sich schnell bewegende ionisierende Gase überführt, an Handdes Masse-Ladungsverhältnisses detektiert
Geräte:- Vakuum Kollision der Ionen verhindern (bis 10-8
Pa)- verschiedene Ionisierungsarten (Elektronen, Hochspannung, Atome,
thermisches Plasma, Sekundärionenanregung)-
Einlasssystem, Ionenquelle, Trenn-
und Analysatorsystem, Detektor,Auswertesystem
Anwendung:- Strukturaufklärung von organischen Molekülen und Molmassenbestimmung- qualitative und quantitative Analyse anorganischer und organischer Bestandteile- Ermittlung von Isotopenverhältnissen- Struktur und Zusammensetzung von Oberflächen
Massenspektrometrie
ICP-MS
Funktionsprinzip:das Plasma ist ein im Hochfrequenzfeld ionisiertes Gas (Argon) und dientals Anregungsmedium für die eingesprühte flüssige oder gelöste Probe
System:Massenspektrometer(Quadrupol, Auflösung bis 0,5 Masseeinheiten)Interface(Ionenoptik, zwei Metallkegel mit Bohrungen 1 mm damit Ionen gebündelt das Massenspektrometer
erreichen)Plasma(Hochfrequenzgenerator)
Querschnitt durch den ICP-Brenner
6000 –
8000 K
Induktionsspule
Quarzrohr
PlasmaArgon
Aerosol Probe
Atomabsorptionsspektrometrie (AAS)
- gebräuchliches Verfahren zum quantitativen Nachweis von Metallen und Halbmetallen bis hin zum Ultraspurenbereich
- Prinzip:Atome können nur Licht ganz spezifischer Wellenlänge absorbieren bzw. emittieren
- mögliche Atomisierungsarten:Flamme, Graphitrohrofen, Hydridkaltdampftechnik
- Flamme z.B
Luft-Acetylen-Flamme (2145-2400 °C)Lachgas-Acetylen-Flamme (2650-2800°C)
- Graphitrohrtechnik:bis 3000°C im Argongasstrom, Verbesserung der NG um ca. 2 Größenordnungen, Analysenlösung 5-100µl
-
Hybridbildung durch NaBH4
(z.B. Sb, As, Se, Te, Bi, Sn, Pb, Ge, P)
Flammen-AAS
FlammeAbsorption
Monochromator
Photodetektorund Anzeige
ElektrodenloseEntladungslampe(EDL)Hohlkathoden-lampe
(HKL)Emission
Zerstäubung von Proben-und Kalibrierlösungen in der Flamme
Atomabsorptions-Spektroskopie
Chromatographie
Durchführung einer DC-Trennung
Gaschromatographie
Prinzip:
- Trennverfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Stoffgemischen
- Verteilung von Substanzen zwischen zwei nicht mischbaren Phasen(Konz. stationäre Phase/Konz. in Gasphase = K)
- Trägergase:Helium, Argon, Methan, Wasserstoff, Stickstoff
- Trennsäulen:in Umweltanalytik meist Dünnfilm-Trennkapillaren aus Quarzglas,polyamidummantelt, Länge 10-200 m, Durchmesser innen 0,1-0,5 mm,Oberfläche mit stationärer Flüssigkeit benetzt
- unterschiedliche Detektorsysteme-
Anwendung: z.B. Deponiegasbestimmung
Gaschromatographie in der Umweltanalytik
Proben-Dosierung
Manuell
Probenautomat
Adsorptionemittel
Edelstahlröhrchen
Trennsäule
DetektorWLD
FID
PND
ECD
PID
FPD
Hall-D
MS
Auswertung
GC-Detektoren und ihre Einsatzbereiche
Detektion
Kurz-
Substanzen
Empfind-form
lichkeit
Wärmeleitfähigkeits-
WLD ∗
Bodenluft
mittel-Detektor
∗
Deponiegase
mäßig∗
Biogase
Flammenionisations-
FID
∗
Kohlenwasserstoffe
gutDetektor
∗
Lösemittel∗
Benzol, Toluol, Xylol,ethylenbenzol
Phosphor-Stickstoff-
PND
∗
PflanzenbehandlungsmittelDetektor
∗
Nitrilotrieessigsäure
Elektroneneinfang-
ECD
∗
Leichtflüchtige halogenierte
sehrDetektor
Kohlenwasserstoffe
gut∗
Pflanzenbehandlungsmittel∗
Phenole
nach Derivatisierung∗
Schwerflüchtige halogenierteKohlenwasserstofe
∗
Polychlorierte Kohlenwasser-Stoffe
Photoionisations
PID
∗
aromatische Kohlenwasser-Detektor
Stoffe
Kombination von Gas-
FTIR
∗
KohlenwasserstoffeChromatographie mit FTIR
Kombination von Gas-
MS
∗
Dioxine, Furane
gutChromatographie mit
∗
Pflanzenbehandlungsmittel….-Spektrometer
∗
Polychlorierte Biphenyle, usw.
Kapillarelektrophorese
- neueste Technik elektrophoretischer
Verfahren (1979)- verknüpft Vorteile der elektrophoretischen
Trennmethoden mit den Möglichkeiten der einfachen direkten Quantifizierung und Automatisierung
- ermöglicht Auftrennung von Komponentengemischen über weitenMolekulargewichtsbereich (anorganischen Ionen bis hin zuBiopolymeren)
-
Ersatz oder Ergänzung der Ionenchromatographie (ideales Referenzverfahren)
- Nutzung in Kopplungstechniken (Massenspektrometrie)- Detektoren (Fluoreszenz, Leitfähigkeit, UV, MS)
Aufbau eines Kapillarelektrophoresesystems - Apparatur -
Zugabe
Kapillarelektrophorese Trennung von aromatischen Carbonsäuren
UV/VIS-Spektrometrie
- beruht auf spezifischer Absorption elektromagnetischer Strahlungin den Wellenlängenbereichen:
∗ λ = 200 –
400 nm (ultravioletter Bereich, UV)∗ λ = 400 –
800 nm (sichtbarer Bereich, VIS)
- Strahlungsenergien 650 330 kJ/mol bzw. 330 –
160 kJ/mol
- Anregung von energiereichen Valenzelektronen (π
–
Elektronen vonDoppelbindungen, freie Elektronenpaare von Heteroatomen)
- Plank`scher
Gleichung eigentlich Linienspektrum, in der Praxis aber breite Banden, da sich durch Aufspaltung von Grund-
und Anregungs-niveaus
durch sich ändernde Rotation und Schwingung der Molekülenahe beieinander liegende Übergänge
UV/VIS-Spektrometrie
A
Bandenspektrum
-
charakteristische Daten(Amax.
= Absorption im Maximun, λmax.
= Wellenlänge des Maximums)
-
-kann zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der zugehörenden Substanzen herangezogen werden
λmax. λ
UV/VIS-Spektrometrie
Photometrische Kalibrierfunktion
A = Absorptionc = Konzentration A
Ax
cx
c (%)
UV/VIS-Spektrometer (schematischer Aufbau)
UV/VIS-Spektrometrie
A
Spalt SpaltPolychrom.Strahlung
Mono-chromator
Lichtquelle(D2 und/oder
Wolframlampe)
Meßküvette(Probe) Detektoren
Vergleichsküvette(Blindlösung)
Strahlungsteiler(50:50)
Anzeige-instrument
Registrierung- Schreiber- Plotter- Drucker- PC
MonochromatischeStrahlung
λmax. λ
UV/VIS-Spektrometrie
Einsatzbereiche in der Umweltanalytik
-Bestimmung von:AnionenKationenFärbungorganische Verbindungenenzymatische
Reaktionen
- Spektrometer
eignen sich auch als Detektoren für HPLC- hohe Bedienfreundlichkeit, niedrige Investitionskosten
Laserspektroskopische Methoden
∙
Während die herkömmliche UV-Vis-Spektroskopie
unter derVoraussetzung der Gültigkeit des Lambert-Beer`schen
Gesetzes die Absorption als Differenz aus austretendem zu eintretendemLichtstrahl bestimmt, nutzt die Laserspektroskopie direkteMethoden um die Absorption zu bestimmen.
∙
Das erhaltene Signal ist proportional zur eingestrahlten Lichtenergie,deshalb ist stets der Bezug zu dieser herzustellen.
-
Photoakustische Spektroskopie (LIPAS)-
Fluoreszenzspektroskopie (TRLFS)-
Thermal Lensing
Spektroskopie (TLS)-
(Multi Photon Absorption Spektroskopie)
Laserinduzierte Fluoreszenzspektroskopie
-„Absorbiertes Licht wird als Licht wieder ausgestrahlt.“-
Anregung der zu untersuchenden Uranverbindung mit einem Laserpuls
-
Detektion
des ausgesendeten Fluoreszenzlichtes unter einem Winkel von 90 °
zur Einstrahlungsrichtung.-
Zerlegung des Fluoreszenzlichtes in einem Monochromator, Detektion mit einem Diodenarray bzw. CCD-Kamera-
Für eine zeitaufgelöste Spektroskopie ist die Belichtungsdauer und der Zeitpunkt der Belichtung des Diodenarrays relativ zum Laserpuls einstellbar.(gatebarer
Bildverstärker –
Prinzip des Kameraverschlusses)
- Flureszenzspektren
können einer zeitaufgelösten Peakentfaltungunterzogen werden.
-unterschiedliche Spezies weisen neben unterschiedlichen Spektren
auchunterschiedliche Lebensdauern auf
Bestimmung mehrerer Spezies nebeneinander in einer Probe
Schema Laserspektroskopie Zeitaufgelöste Fluoreszenz/Photoakustik
Time-Resolved Laser-Induced Fluorescence Spectrum Mining Water Königstein
Verfahrensanwendung
- durch Anwendung von fluoreszierenden Organika
ist die indirekte Bestimmung von Metallionen möglich (Al, Li, Sn z.B.)niedrige Nachweisgrenzen pg/L, Störionen
sind zu berücksichtigen
- Pestizide, Aminosäuren, Nukleinsäuren haben oftmals selbst ausgeprägte Phosphoreszenz, die zur Bestimmung ausgenutzt wird
-
Messung erfolgt mit SEV (Sekundärelektronenvervielfacher)
Photoakustische Spektroskopie
-
"Absorbiertes Licht wird als Schallwelle wieder abgegeben."•
Aufnahme der Schallwelle durch ein an der Küvetteangebrachtes "Mikrofon" (piezokeram. Detektor) undUmwandlung in ein elektrisches Signal.
•
Da es sich bei der Schallwelle um eine auf den Laserpulsfolgende, gedämpfte Schwingung handelt, wird durch ein"Boxcar„-System
ein zeitliches Tor zur Messung nur derersten (intensivsten) Schwingungsamplitude gesetzt.
-
Durch Abstimmen des OPO-Lasersystems
über deninteressierenden Wellenlängenbereich lassen sich imPunktverfahren Absorptionsspektren aufnehmen,
-
Die maximal mögliche Wellenlängenauflösung desSpektrums wird dabei im wesentlichen durch die Bandbreitedes Laserpulses und die Abstimmgenauigkeit bestimmt.
Photoakustische Spektroskopie – Cell Design
Lichtquellen für PA/TLS-Spektroskopie
∙
Farbstofflaser (Dye)-
Nutzung organischer Farbstoffe als abstimmbares Medium-
in der Regel kanzerogen und mutagen-
methanolische
Lösungen-
begrenzte Haltbarkeit = speziell zu entsorgende Abfälle-
enger Abstimmbereich (~ 30…400 nm)-
tiefste erreichbare Wellenlänge 410 nm (mit Nd-YAG)
∙
Solid State Laser (OPO)-
Festkörperkristalle als abstimmbares Medium-
keine Abfallmengen-
theoretisch unbegrenzt nutzbar-
großer Abstimmbereich (~250 nm)
Jablonski-Termschema
Absorption Fluoreszenz Phosphoreszenz
interneKonversion
IntersystemCrossing
3210
S2
S0V=3V=2V=1V=0
S1 0
21
210
T2
0123 T1
Interne undexterneKonversion
Elektronenspins für den Singulett-und Triplettzustand
Singulett-Grundzustand
angeregterSingulett-zustand
angeregterTriplett-zustand
Fluoreszenz Phosphoreszenz
Röntgenabsorptionsspektroskopie
SE
PE
FS
AE
h·γ
M
L
K
Folgeprozesse der Absorptionvon Röntgenstrahlung (hγ):
PE: PhotoelektronFS: FluoreszenzstrahlungAE: AugerelektronenSE: SekundärelektronenK, L, M -
Schale
Synchrotron
- Elektronen-Synchrotron- Protonen-Synchrotron
- Teilchen laufen auf Kreisbahnen, sind vom Impuls unabhängig,Umlauffrequenz ändert sich ständig
- Elektronen-Beschleuniger∗
Geschwindigkeit praktisch Lichtgeschwindigkeit∗
erste Phase der Elektronenbeschleuniger ist ein vorgeschalteter
Beschleuniger(z.B. Betatron)
∗
weitere Beschleunigung erfolgt durch ein hochfrequentes
elektrisches Feld(Erhöhung der magnetischen Feldstärke bei konstanter Frequenz)
- Speicherringe:in diesen laufen die Teilchen im Magnetfeld um , bei Elektronen Energiezufuhr durchHochfrequenz-Beschleunigungssystem
Synchrotronstrahlung
(elektromagnetische Strahlung relativisitischer
Elektronen, die sich in einem Magnetfeld bewegen)
Eigenschaften:
-
sehr intensive, laserähnlich gebündelte Strahlung, die sich über den gesamten Spektralbereich von Infrarotbereich bis zum Röntgenstrahlungsbereich erstreckt
-
typische Energie der Elektronen im Speicherring: ca. 100 MeV
-
lineare Polarisation der Strahlung
-
gepulste Strahlung (Lichtblitze ca. 100 ps)
-
hohe Stabilität der Lichtquelle
Röntgenabsorptionsspektroskopie mittels Synchrotronstrahlung
Spektrum (allg.) Detektion
Röntgenabsorptionsmethoden
- Absorption von Röntgenstrahlung durch Atome ist energieanhängig
- bei bestimmten Energien treten Sprünge (Absorptionskanten) auf, die durch die Photoionisation innerer Elektronen bedingt sind
- bei genauer Untersuchung des kantennahen Bereiches ist charakteristischeStrukturierung zu erkennenXANES (X-ray Absorption Near Edge Structure)∗
Informationen zu:
BindungsernergienValenzzustände
- Strukturierung oberhalb der Kante (Bereich 50 eV
–
200 eV
oberhalb derPhotoionisationsschwelle), Rückstreuung der ElektronenEXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure)∗
Informationen zu:
NahordnungBindungsabständeKoordination
EXAFS-Strukturparameter der Uranylkomplexe Aliphatische Carbonsäuren und Huminsäuren
Modellkomplex von
Koordination
U-O äq
U-XUO22+ mit
von –COOH pH
R (Å) N Atom
R (Å)
Maleinsäure
mono
4,2 2,37 6 Malonsäure
mono/oxo
3,9 2,36 5
U 3,96Bernsteinsäure
bi
4,9 2,48 5 C 4,37Huminsäure mono 4,0 2,38 6
Identische
Strukturparameter
für
U-O axial: N=2, R=1,78 Å
As K-Kante XANES Spektren von Referenzproben
Röntgenabsorptionsspektroskopie (XANES, EXAFS)
-
monochromatische Röntgenstrahlung wird beim Durchgang durch Materie geschwächt
-
der lineare Absorptionskoeffizient nimmt mit zunehmender Energie ab, bis zu der Energie,
die ausreicht, um ein Elektron aus einer inneren Schale freizusetzen
-
starker Anstieg des Absorptionskoeffizienten, danach wieder Abfall
-
befinden sich Nachbaratome in der Umgebung des Absorberatoms sind feine Oszillationen
oberhalb der Kante sichtbar = Feinstruktur
-
Oszillationen hängen von Abstand, der Zahl und der Art der benachbarten Atome ab
Forderungen an moderne Speziationsmethoden
- Probe nicht verändern, in-situ
Bestimmung, vor-Ort-Bestimmung∗
sorgfältige Probennahme und Probenvorbereitung
- Messung bei sehr geringen Konzentrationen∗
10-5
bis 1010
mol/L
- Hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit∗
Senkung der Matrixeffekte
- Automatisierung und on-line
Datenauswertung∗
schnelle Bearbeitung von großen Probenzahlen
Kopplungstechniken zur Elementspeziesanalytik - Definition -
- Kopplungstechniken sind aus mehreren hintereinander geschaltetenanalytischen Methoden bestehende Systeme
- Methoden können auch unabhängig voneinander eingesetzt werden
- Synergieeffekt der Kopplung(Information größer als bei getrennter Methodenanwendung)
➙
System bestehend aus Trenn-
und Detektionsmodulen, die über ein Interface verbunden sind und die Analyte
in einem meist automatisierten, geschlossenen System bestimmen
Vorteile der Kopplungstechniken
∗
Verkürzung des Zeitbedarfs pro Bestimmung
∗
Verringerung des Arbeitsaufwandes
∗
Automatisierbarkeit
∗
Weitgehende Vermeidung von Kontaminationen durch Abschirmung dergetrennten Bestandteile von der Umgebungsluft und Gefäßoberflächen
∗
Vermeidung von Analytverlusten
durch Verwendung eines quasi-geschlossenen
Systems
∗
Reproduzierbarkeit durch identische Analysenbedingungen
∗
Vermeidung einer Zwischenlagerung nach Fraktionierung
∗
Änderung der Spezies oder der Bindungspartner durch oxidativen
oder mikrobiellen
Einfluss wird verringert
Häufige Trennmodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse -
Methoden
Trennprinzip/Besonderheiten
Flüssigkeitschromatographie –
LC
GelpermeationschromatographieIonenaustauschchromatographieReversed-phase-ChromatographieIonenpaarchromatographie
Gaschromatographie –
GC
Säulen niedriger PolaritätSäulen hoher Polarität
Kapillarzonenelektrophorese
–CZE
QuarzkapillarenBeschichtete KapillarenGelgefüllte
Kapillaren
Anodic
Stripping
Voltammetry
–
ASV
Differential Pulse
Interfacemodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse -
Methoden
Technik
Flammen-Atomabsorptionsspektroskopie –
F-AAS
Pneumatischer Zerstäuber(Flammen-Atomfluoreszenzspektrometrie
–
F-AFS)
Hydraulische Hochdruckzerstäuber (HHPN)Kaltdampf-Atomabsorptionsspektrometrie
–
CV-AAS)
Fließinjektion (FIA)(Kaltdampf-Atomfluoreszenzspektrometrie
–
CV-AFS)elektrothermale Atomabsorptionsspektrometrie
On-stream
(Probengeber)-ET-AAS
Off-stream
(Fraktionssammler)Plasma-Atomemissionsspektrometrie
–
Plasma-AES
Pneumatischer ZerstäuberUltraschallzertäuberDirektinjektion (DIN)Hydraulische Hochdruckzerstäubung (HHPN)
Chemischer Reaktionsdetektor –
CRD
Continuous-flow
(CFA)Fließinjektion (FIA)
Organische Massenspektrometrie
–
MS
Particle-beamThermosprayElektrosüray
Fourier-Transformation-Infrarot
–
FT-IR
Flusszelle(Fourier-Raman-FT-Raman)Nuklearmagnetische Resonanzspektroskopie –
NMR
Flusszelle
Detektormodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse -
Methoden
Technik / Besonderheiten
Atomabsorptionsspektrometrie
–
AAS
Flamme (F)Hydrid (HD)Kaltdampf (CV)Elektrothermal (ET)
Atomfluoreszenzspektrometrie
–
AFS
Flamme (F)Hydrid (HD)
Plasma-Atomemissionsspektrometrie-
Induktiv gekoppeltes Plasma (ICP)Plasma-AES
Mikrowellenplasma (MIP, CPM)Gleichstromplasma (DCP)Wechselstromplasma (ACP)
Quadrupol-Massenspektrometrie
Induktivgekoppeltes Plasma (ICP)Quadrupol-MS
Mikrowelleninduziertes Plasma (MIP)Sektorfeld-Massenspektrometrie
Induktiv gekoppeltes Plasma (ICP)Chemischer Reaktionsdetektor –
CRD
Continuos-flow
(CFA)Fließinjektion (FIA)
Elementselektiv:
Kopplung der HPLC mit plasmaspektrometrischen Multielementverfahren zur Elementspeziesanalyse
Spurenanalytische Bestimmung von sechs Arsenspezies mittels HPLC/Q-ICP-MS
1
2
3
4 5
6
0 4 8 min
1 –
Arsenocholin, 2 –
Arsenobetain, 3 –
As(III), 4 –
Dimethylarsinsäure
(DMAA),5 –
Monomethylarsonsäure
(MMAA), 6 –
As(V); je 5 g/laus Demesmay
et al. [4.65]
Biologische, mikrobiologische und biochemische Methoden
Biologische Verfahren:
- Bioteste mit LebewesenFischtest, Bakterientest, Algentest
Mikrobiologische Verfahren:
- Bestimmung der Kolonienzahl- Bestimmung coliformer
Keime- Bestimmung ausgewählter Bakterienstämme (Escheria
coli,Fäkalstreptokokken z.B.)
Biochemische Verfahren:
-
Immunochemische
Verfahren
Ökotoxikologische Tests
Organismus Methode, Messgröße Zeit, Parameter
Akute ToxizitätBakterien
Leuchtbakterientest, Stoffwechselaktivität
15-60 min, EC50
1Algen
Wachstumshemmtest
72 h, EC50Daphnien
Immobilisierung, Mortalität
24 h, LC50Fische
akute Toxizität, Mortalität
96 h, LC50
Chronische ToxizitätBakterien
Wachstumshemmung
Stunden, NOEC2
Algen
Wachstumshemmung
72 h, NOECDaphnien
Reproduktion
21 d, NOECFische
verlängerter Fischtest, Mortalität
14 d, 21 d, NOEC
Toxizitätsprüfung an Fischen
Algentest mit Fluoreszenzmessung
Grundlage:Eigenschaft des Chlorophylls grüner Pflanzen nach einer Anregungim sichtbaren Teil des Spektrums (rotes oder blaues Licht) eineFluoreszenzstrahlung (rot) bei 685 nm auszusenden
Verfahren zur Bestimmung von toxischen Effekten chemischer Verbindungen auf das Wachstum planktonischer
Süßwasseralgen
- zur Beurteilung der Photosyntheseaktivität- zum Nachweis von Photosyntheseblockern wie z.B. Herbiziden
Biolumineszenz
-
Strahlungsemission wird oft im biologischen System beobachtet (Leuchtkäfer, Glühwürmchen) Intensität der Lichtemission bei enzymkatalysierten Reaktionen messen:z.B. Luciferase
(aus Leuchtkäfern) katalysiert die Oxidation des
Luciferinsin einer ATP verbrauchten Reaktion (Bestimmung von ATP):
Luciferin + (ATP) + O2 —Luciferase →
Oxyluciferin + (AMP + Ppi) + CO2 + h·v
AMP = Adenosis-5-monophosphatATP = Adenosin-5-triphosphatPpi
= anorg. Diphosphat
Leuchtbakterientest
- gram-negative fakultativ-anaerobe Meeresbakterien aus der Familie der Vibronaceae(Verwandt mit terrestrischen Bakterien die in Böden und Gewässern
leben)- Leuchtvorgang (Biolumineszenz) Teil des Bakterienstoffwechsels-
Leuchten: Oxidation der Leuchtstoffe (Luciferine) unter katalytischer Wirkung des Enzyms Luciferase-
wird Stoffwechsel durch Anwesenheit toxischer Stoffe gestört, verringert sich die Leuchtkraft- Prinzip:
Abnahme der Biolumineszenz
während der 30minütigen Testzeit im Vergleich zu unbehandelten Bakterienproben(Bakterien-Lagerung bei -20°C)
Schematischer Ablauf des LUMISmini - Test
Reaktivieren und Vorbereiten
Start bei 0
Minuten4,5 ml Reaktivierungslösungzur Bakterienkonserve geben
1Je 0,5 ml Kontrolllösung(2%) NaCl) in MessküvettenReihe A geben
2
AB
Probe aufsalzen
und je 0,5 mlin Messküvetten
Reihe Bgeben
Ende nach15
Minuten
3
AB
Je 0,5 ml Bakterien zuMessküvetten
in Reihe A und B geben
Testen
15 Minuten warten
Messen:Kontrolle ProbeErgebnisKontrolle ProbeErgebnisusw.
Leuchtbakterientest
Beispiele:
- Toxizität von Schwermetallen- Toxizität von Kohlenwasserstoffen, Pestiziden, org. Lösungsmitteln
Test von:- Wässern- Klärschlämmen- Gewässersedimenten- Böden (Altlasten)
- Leuchtbakterien sind bisher nie als Krankheitserreger aufgetreten ! -
Immunologie
- beschäftigt sich mit Mechanismen der Immunantworten, mit der sich derlebende Organismus gegen eine Infektion durch Fremdkörper zur Wehr
setzt
- zwei grundsätzliche Immunantworten* humorale
Abwehr (durch Antikörper vermittelt)* zellständige Abwehr
- Prozessdringt Antigen oder artfremde Verbindung in Organismus ein, so
kommt es zur Teilung und Differenzierung von Lymphozytenbei humoraler
Abwehr kommt es zur Reifung von Plasmazellen, die ihrerseits
spezifische Antikörpermoleküle generieren, diese verbinden sich mit demAntigen und bewirken seine Ausfällung, seine Neutralisation oder seinen
Tod, abhängig ob Antigen ein Makromolekül, ein Toxin oder ein Mikroorganismus ist
kaum kovalente
Bindungen, sterische
Effekte –
Schlüssel/Schloss/Prinzip –Antikörper sind Mitglieder der Familie der Immunoglobuline(4 Polypeptidketten)
Immunologie (Fortsetzung 2)
- Herstellung von Antikörpern:Injektion einer Lösung oder Suspension des Antigens (z.B. Klasse der
Protoine,Polysaccharide, hohe MG) in ein Kaninchen, nach erforderlicher Zeit werden5-50 mL Blut vom immunisierten Tier abgenommnen, Blutgerinnung, Serumetwa 2-25 mL durch Zentrifugation
abgetrennt, bei ca. 56°C inkubiert,portioniert und bei -20°C eingefroren
- Radioimmunoassayklinische Praxis, biochemische Forschungz.B. quantitative Analyse von Hormonen, Steroiden, MedikamentenVerbund von Spezifität
der Immunreaktion mit der Empfindlichkeit derRadioaktivitätsmessung*Bestimmung: unmarkiertes Antigen (unbekannte Menge) und radioaktivmarkiertes Antigen (bekannte Menge) konkurrieren um die begrenzte Anzahlvon Antikörperbindungsstellen in einer vorgegebenen Menge Antiserum,bei Steigerung des unmarkierten Antigens (Menge radioaktiv markiertenAntigen bleibt gleich) wird die Menge an Radioaktivität im gebundenen Antikörper-Antigenkomplex abnehmen, aus Eichkurve ist die zu
bestimmendeAntigenmenge ermittelbar
Bioimmunoassay
-
Prinzip ist dem Immunsystem von Mensch und Tier abgeschaut, körperfremde Stoffe nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip
zu erkennen und durch spezifische Antikörper zu binden- bisher insbesondere Drogen und Hormone analysiert- Fortschritte in der Antikörpertechnologie ermöglichen auch die Analyse von
nichtimmunogenen, d.h. niedermolekularen Stoffen –
die Haptene
–
durchEntwicklung dafür spezifischer Antikörper
ELISA-Verfahren: (enzyme
linked
immunoabsorbent
assay)-
Antikörper an festen Phase sorbiert, aber auch durch kovalente
Bindung nach Reaktion z.B. mit Cyanogenbromid
(Cellulose, quervernetzte Dextrane,Polystyrol, Propylen u.a.) Festphase nur einmal einsetzbar
Anwendung:-
Klinische Biochemie: Globuline
im Blut, Insulin, verschiedene Viren, usw.
-
Umweltanalytik:
Atrazin, Huminsäuren, TNT, Pyrene, Sulfonylharnstoffherbizide, PAH z.B.
Immunochemische Verfahren
Motivation:Immunochemische
Reaktionsprinzipien auch zum Nachweisumweltrelevanter Stoffe (z.B. Pflanzenschutzmittel, Sprengstoffe
usw.)zu nutzenEntwicklung von relativ unkomplizierten Testbestecken vor allem zurvor-Ort-Analytik
Grundlagen:Sind immunochemischer
Reaktionen:Antigen (AG) provoziert die Bildung von Antikörpern (AK), Antigen undAntikörper bilden einen Komplex AGAK, ist ein Bestandteil AG oder AKin irgend einer Form markiert, dann ist Komplex quantifizierbar(radioaktiv –
RIA, Fluoreszenz –
FIA)
Immunochemische Methoden