Post on 24-Aug-2019
transcript
Aus der Klinik für kleine Haustiere
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Untersuchungen zur Pharmakokinetik, gerinnungsphysiologischen
Wirkung und Immunogenität von rekombinantem humanen
Faktor VIIa bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N
Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Bernd Dörsch
aus Wuppertal
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. R. Mischke 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2004
Gewidmet
Anke, meiner Verlobten
und
Erika, meiner Mutter
Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 7
1 Einleitung 9
2 Literaturübersicht 10
2.1 Theorie der Blutgerinnung und Rolle des Faktors VII 10
2.2 Hereditärer Faktor VII-Mangel (einschließlich Therapie) 12
2.2.1 Mensch 12
2.2.2 Hund 15
2.3 Rekombinanter humaner Faktor VIIa 17
2.3.1 Chemische Struktur 17
2.3.2 Pharmakokinetik 17
2.3.2.1 Mensch 17
2.3.2.2 Hund 18
2.3.3 Klinische Anwendung 19
2.3.3.1 Mensch 19
2.3.3.1.1 Indikationen außer Faktor VII-Mangel 19
2.3.3.1.2 Faktor VII-Mangel 23
2.3.3.1.3 Laborkontrolle der Anwendung beim Menschen 25
2.3.3.2 Hund 28
3 Eigene Untersuchungen 31
3.1 Material, Tiere und Methoden 31
3.1.1 Material 31
3.1.1.1 Geräte und Bezugsquellen 31
3.1.1.2 Reagenzien und Bezugsquellen 31
3.1.1.3 Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen 33
3.1.2 Tiere 33
3.1.3 Methoden 35
3.1.3.1 Versuchsaufbau 36
3.1.3.2 Vorbereitung der Patienten 36
3.1.3.3 Blutentnahme und Probenbehandlung 36
3.1.3.4 Labormethoden 37
3.1.3.4.1 Hämatokrit und Thrombozytenzahl 36
3.1.3.4.2 Poolplasma 37
3.1.3.4.3 Prothrombinzeit 37
3.1.3.4.4 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit 39
3.1.3.4.5 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII-Aktivität 39
3.1.3.4.6 Bestimmung der humanen Faktor VIIa-Antigen-Konzentration 40
3.1.3.4.7 Nachweis der kaninen Antikörperbildung gegen rekombinanten
humanen Faktor VIIa 44
3.1.4 Pharmakokinetische Berechnungen 48
3.1.5 Statistische Auswertung 48
4 Ergebnisse 50
4.1 Klinische Verträglichkeit 50
4.2 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII-Aktivität 50
4.3 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor
VII:C-Aktivität 51
4.4 Konzentration des humanen Faktor VIIa-Antigens 52
4.5 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor
VIIa-Antigen-Konzentration 54
4.6 Prothrombinzeit 56
4.7 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit 58
4.8 Thrombozytenzahl 59
4.9 Hämatokrit 60
4.10 Kanine Antikörperbildung gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa 61
5 Diskussion 62
6 Zusammenfassung 69
7 Summary 72
8 Literaturverzeichnis 74
Tabellarischer Anhang 96
Abkürzungsverzeichnis:
α = initiale Verteilungsgeschwindigkeitskonstante
a = aktiviert (bei Gerinnungsfaktorennamen)
Abb. = Abbildung
Ak = Antikörper
aPTT = Aktivierte Partielle Thromboplastinzeit
Aqua bidest. = Aqua bidestillata
AUC = Area under the curve
β = Eliminationskonstante
C0-ber = berechnete Anfangskonzentration
C0-gem = gemessene Anfangskonzentration
Ca2+-Ionen = Kalzium-Ionen
Cltot = totale Clearance
DBA-Puffer = Diäthylbarbiturat-Acetat-Puffer
DIG = Disseminierte intravasale Gerinnung
DNA = Desoxyribonukleinsäure
DTI = Dauertropfinfusion
∆% = korrigierte Aktivität (nach Subtraktion des Nullwertes)
e = Eulersche Zahl
EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA = Enzymelinked Immunosorbent Assay
F = Faktor (Gerinnungsfaktor)
FVII:C = Faktor VII (koagulometrisch gemessen)
FVII:Ag = Faktor VII-Antigen
FVIIa:Ag = Faktor VII-aktiviert-Antigen
x g = Vielfaches der Erdbeschleunigung
g = Gramm
h = Stunde
IE = Internationale Einheiten
IgG = Immunglobulin G
IgM = Immunglobulin M
iv = intravenös
kDa = Kilodalton
KM = Körpermasse
ln (2) = natürlicher Logarithmus
MC = Mikrochip-Nummer
min = Minute
mmol = Millimol
µg = Mikrogramm
µl = Mikroliter
n = Anzahl
N = Normalität
ng = Nanogramm
nm = Nanometer
PAP = Plättchenarmes Plasma
pt = p-Wert des paarigen t-Tests
PT = Prothrombinzeit
PTMT = Prothrombinzeit (modifizierter Test)
PTST = Prothrombinzeit (Standardtest)
rhFVIIa = rekombinanter humaner Faktor VIIa
Rt = Raumtemperatur
s = Standardabweichung
sec = Sekunden
t50 = Halbwertszeit
Tab. = Tabelle
TMB = 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin
% v/v = Volumenprozent
Vdβ = Verteilungsvolumen auf der Basis der Eliminantionskonstante β
VWF = von Willebrand-Faktor
= arithmetischer Mittelwert
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1 Einleitung
Rekombinanter Humaner Faktor VIIa (rhFVIIa, NovoSeven, Novodisk, Dänemark) wird
beim Menschen als Therapeutikum bei Blutungskrisen infolge Hämophilie A und B
(insbesondere Hemmkörperhämophilien), Faktor VII-Defizienz sowie anderen hereditären
Gerinnungsfaktormängeln, disseminierter intravasaler Gerinnung (DIG), Thrombozytopenien
und -pathien sowie schweren lebensbedrohlichen Blutungen anderer Ursache eingesetzt
(LINDLEY et al. 1994, BECH et al. 1995, WHITE et al. 1999a, HEDNER 2000,
MOSCARDO et al. 2001). Er birgt für die Anwendung beim Menschen den Vorteil, daß er
aus einem virusfreien Vermehrungsmedium gewonnen wird, und beinhaltet somit nicht die
Risiken die bei konventionell aus Plasma gewonnenen Faktorkonzentraten bestehen,
insbesondere die häufig vorkommenden Virusinfektionen. Rekombinanter Faktor VIIa wurde
beim Menschen in zahlreichen klinischen Studien in den verschiedenen
Anwendungsbereichen auf seine Wirksamkeit und Sicherheit überprüft (LINDLEY et al.
1994, HEDNER 2000), jedoch sind nach wie vor verschiedene Fragen, wie z.B. die Sicherheit
bei DIG und der Wirkmechanismus bei Thrombozytopenie, ungeklärt (CHUANSUMRIT et
al. 2000, POON et al. 2000, MOSCARDO et al. 2001, KRISTENSEN et al. 2003).
Der Hund stellt für verschiedene Fragestellungen ein gutes Tiermodell für die
Grundlagenforschung der Hämostase sowie klinische Hämostaseforschung beim Menschen
dar (HOVIG et al. 1967, SPURLING et al. 1974, MISCHKE und NOLTE 1999). Es liegt eine
orientierende Studie beim Hund vor, in der rhFVIIa bei einzelnen Patienten mit Hämophilie
A, Hämophilie B und der von Willebrand-Erkrankung mit ersten tendenziell positiven
Ergebnissen zur Anwendung gelangte (BRINKHOUS et al. 1989). Allerdings liegen bislang
keinerlei systematische Untersuchungen zur Pharmakokinetik und -dynamik vor. Vor diesem
Hintergrund soll das vorliegende Projekt die Pharmakokinetik und Einflüsse auf das
Gerinnungssystem von rhFVIIa bei gerinnungsphysiologisch gesunden und Faktor VII-
defizienten Hunden erarbeiten und dadurch die Grundlagen für tierexperimentelle
Untersuchungen liefern. Obgleich der hohe Preis zur Zeit die Möglichkeiten eines klinischen
Einsatzes limitiert, werden damit gleichzeitig die Grundlagen für die klinische Anwendung
beim Hund geschaffen.
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2 Literaturübersicht
2.1 Theorie der Blutgerinnung und Rolle des Faktors VII
Der Prozeß der Blutgerinnung beinhaltet eine Anzahl von vernetzten biochemischen
Reaktionen, deren Faktoren neben ihren Eigennamen gewöhnlich mit römischen Zahlen in der
Reihenfolge ihrer Entdeckung bezeichnet werden. Die Blutgerinnung kann nach der
klassischen Lehre auf zwei Wegen initiiert werden: dem endogenen Weg (endogenes System,
Intrinsic System) oder dem exogenen Weg (exogenes System, Extrinsic System), beide
münden in der Aktivierung des Faktors X zu Faktor Xa (a= aktiviert) im gemeinsamen Weg
(EDER 1987, TROY 1988, DODDS 1997).
Das endogene System wird aktiviert, wenn Blut mit Fremdoberflächen (körperfremdes
Material, subendotheliales Gewebe, pathologisch verändertes Gefäßendothel, Zellfragmente)
in Kontakt kommt. Dadurch werden der Kontaktfaktor Faktor XII und Präkallikrein zu Faktor
XIIa bzw. Kallikrein aktiviert, und dadurch mit Hilfe des Kofaktors hochmolekulares
Kininogen der Faktor XI zu Faktor XIa aktiviert (MISCHKE und NOLTE 1999). Dieser
Kontaktaktivierung kommt nach aktuellen Vorstellungen bei der In-vivo-Gerinnung keine
wesentliche Bedeutung zu (ALLEN et al. 2002). Faktor XIa bewirkt die Aktivierung von
Faktor IX zu Faktor IXa, der dann mit dem durch Thrombin aktivierten Faktor VIIIa und
Kalzium-Ionen (Ca2+) auf der Phospholipidschicht der Thrombozytenmembran einen
Komplex bildet, der auch als Tenase-Komplex bezeichnet wird (BOUDREAUX 1996,
DODDS 1997). Dieser Komplex aktiviert dann Faktor X zu Faktor Xa.
Das exogene System startet, wenn Blutzellen oder geschädigte Gewebe
Gewebsthromboplastin freisetzen. Hierbei handelt es sich um einen Protein-Phospholipid-
Komplex, der zur Aktivierung von Faktor VII zu Faktor VIIa führt. Gewebsthromboplastin
bildet mit Faktor VIIa und Kalzium-Ionen (Ca2+-Ionen) einen Komplex, der dann zur
Aktivierung von Faktor X (TROY 1988, DODDS 1997, MISCHKE und NOLTE 1999) führt.
Die Faktor X-Bildung erhöht ihrerseits die Faktor VII-Aktivierung um das 900fache über eine
positive Rückkopplungsschleife (DODDS 1997).
Der gemeinsame Weg wird zunächst durch das exogene System initiiert (INGERSLEV et al.
2000, ALLEN et al. 2002). In dem gemeinsamen Weg aktiviert der Faktor Xa den Faktor V
und bildet mit diesem unter Beteiligung von Ca2+-Ionen einen sogenannten
11
Prothrombinaktivator-Komplex (EDER 1987), der Prothrombin zu Thrombin aktiviert.
Thrombin spaltet vom Fibrinogen kleine Peptide (Fibrinopeptide A und B) ab, so daß lösliche
Fibrinmonomere entstehen, die dann durch den ebenfalls durch Thrombin aktivierten Faktor
XIII in Gegenwart von Kalzium-Ionen zu vernetztem Fibrin verbunden werden, das den
Plättchentrombus stabilisiert (EDER 1987, DODDS 1997). Thrombin führt auch über eine
Aktivierung der Faktoren V, VIII und XI zu einer positiven Rückkopplung (McCONNELL
2000).
Das klassische Modell stellt diese Reaktionen als hintereinander ablaufende Kaskade dar
(EDER 1987, MISCHKE 1999, ALLEN 2002). Dieses Modell ist auch gut geeignet, um die
Ergebnisse der Prothrombinzeit und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit zu
interpretieren (MISCHKE 1999, ALLEN 2002). Neben dem oben angegebenen vereinfachten
Schema kommt es aber in vivo zu zahlreichen Nebenreaktionen und 2
Rückkopplungsschleifen. So können z.B. aktivierte Thrombozyten bei Anwesenheit von
Kallikrein die Kontaktaktivierung von Faktor XII umgehen und direkt den Faktor XI zu
Faktor XIa aktivieren. Ebenso wird Faktor IX auch von Faktor VIIa über die sogenannte
Josso-Schleife bzw. „Josso Pathway“ (JENSEN et al. 1976, XI et al. 1989, MISCHKE und
NOLTE 1999) oder „Alternate Pathway“ (WEISSBACH, 1991a) aktiviert. Dies verdeutlicht
die wesentliche Bedeutung von Faktor VII für die physiologische Blutgerinnung.
Diese Vernetzungen der Reaktionen des endogenen und exogenen Weges des klassischen
Modells, und nicht zuletzt die neuen Aspekte, die sich durch die Anwendbarkeit von rhFVIIa
bei thrombozytären Blutstillungsstörungen ergaben, haben neuerdings in der
humanmedizinischen Literatur zu einem zellbasierten Modell der Gerinnung geführt (POON
et al. 2000, HOFFMAN und MONROE 2001, MARTINOWITZ et al. 2001, ALLEN et al.
2002, MARTINOWITZ et al. 2002). Dieses Modell wurde in der veterinärmedizinischen
Literatur erstmals von KRISTENSEN et al. (2003), im Zusammenhang mit dem möglichen
Einsatz von rhFVIIa, erwähnt. Bei diesem Modell wird auch die Bedeutung der
Gewebsthromboplastin-enthaltenden Zellen und Thrombozyten als Plattform für die
biochemische Reaktionen der bisher sogenannten „plasmatischen Gerinnung“ betont (Abb. 1).
Die Reaktionsschritte der Blutgerinnung werden in Initiation, Amplifikation und Propagation
unterteilt (ALLEN et al. 2002). Nach diesem Modell kommt dem Faktor VIIa-
Gewebsthromboplastin-Komplex bei der Initiation der Hämostase die entscheidende
12
Bedeutung zu (HOFFMAN und MONROE 2001, ALLEN et al. 2002). Der in geringen
Mengen auch ohne Aktivierung der Gerinnung kursierende Faktor VIIa bildet bei einer
Blutung einen Komplex mit Gewebsthromboplastin, das auf der Oberfläche von geschädigten
Zellen des Blutes oder verletzten Gewebes vorhanden ist (HOFFMAN und MONROE 2001,
MARTINOWITZ et al. 2002). Hierdurch werden kleine Mengen Thrombin über die auf der
Zelloberfläche ablaufenden weiteren Aktivierungsreaktionen der Faktoren X, V und II
gebildet und ins Plasma abgegeben. Parallel dazu wird ebenfalls auf der
Gewebsthromboplastin-enthaltenden Zelle über die oben beschriebene Josso-Schleife Faktor
IX aktiviert und ins Plasma abgegeben. Bei der Amplifikation trennt und aktiviert das
gebildete Thrombin den an von Willebrand-Faktor gebundenen Faktor VIII, aktiviert Faktor
XI und führt zu einer Aktivierung der Thrombozyten mit Formänderung und anschließender
Ausschleusung und Aktivierung des Faktors V. Diese aktivierten Faktoren befinden sich dann
auf der Oberfläche der aktivierten Thrombozyten (HOFFMAN und MONROE 2001, ALLEN
et al. 2002). Bei der Propagation wird der in der Initiation und lokal durch
thrombozytenständigen Faktor XIa gebildete Faktor IXa in den Tenase-Komplex eingebunden
und über den Prothrombinkomplex in großen Mengen Thrombin gebildet (ALLEN et al.
2002).
2.2 Hereditärer Faktor VII-Mangel (einschließlich Therapie)
2.2.1.1 Mensch
Beim hereditären Faktor VII-Mangel handelt es sich beim Menschen um einen autosomal-
rezessiv vererbten Defekt (ROBERTS und HOFMANN 1995, ROBERTS und BINGHAM
1998, MADLENER und PÖTZSCH 1999). Ursache ist eine Mutation der kodierenden
Gensequenz auf Chromosom 13. Es sind über 20 Mutationen innerhalb des Faktor VII-Gens
bekannt (MADLENER und PÖTZSCH 1999). Basierend auf Unterschieden in
Radioimmunoassays, Neutralisationstests und der In-vitro-Aktivität von Faktor VII nach
Abb. 1 (S. 13): Darstellung des verschiedenen Phasen der Gerinnung bis zur massiven
Vermehrung des Thrombins nach dem zellbasierten Model der Gerinnung modifiziert nach
ALLEN et al. (2002).
13
Initiation: Amplifikation: Propagation:
F= Faktor; a (bei Faktorennamen)= aktiviert; vWF= von Willebrand-Faktor
Zelle mit Gewebsthromboplastin
FVIIa
FXa
FXa FVa
FX FIIFIIa
FVIIa
FIX FIXa
aktivierter Thrombozyt
FXIa Tenase-Komplex
FVIIIa
FIX
Prothrombin-Komplex
FX
FII
FIIa
FIIa
FIIa
FVIII/vWF FVIIIa
vWF
FIIa Thrombozyt aktivierter
Thrombozyt
FXIa
FXIa
FVIIIa FVa
FVa
14
Aktivierung mit verschiedenen Gewebsthromboplastinen sind mehrere Varianten beschrieben
worden (ROBERTS und HOFMANN 1995, ROBERTS und BINGHAM 1998).
MADLENER und PÖTZSCH (1999) geben auch zwei Typen an: Einen Typ I-Mangel, bei
dem eine Verminderung der koagulometrisch gemessenen Faktor VII(FVII:C)-Aktivität und
Faktor VII-Antigen(FVII:Ag)-Konzentration vorhanden ist, wogegen sich der Typ II-Mangel
durch eine verminderte FVII:C-Aktivität bei nur leicht reduzierter Plasmakonzentration von
FVI:Ag auszeichnet. Weltweit sind bisher bei sechs Fällen natürliche Autoantikörper
festgestellt worden (KAMIKUBO et al. 2000, ROBERTS und WHITE 2001). Sehr selten
treten auch als erworbene Form Alloantikörper nach Gabe von Faktor VII-Präparaten auf
(ROBERTS und WHITE 2001).
Der angeborene Faktor VII-Mangel ist beim Menschen selten, als geschätzte Inzidenz wird
von ROBERTS und HOFMANN (1995) sowie MADLENER und PÖTZSCH (1999)
1:500000 angegeben, während WEISSBACH eine Erkrankungshäufigkeit von 1:2 Millionen
beschreibt (1991b). BECH et al. (1995) geben die geschätzte absolute Zahl der Patienten mit
schwerer Blutungssymptomatik weltweit mit 100 bis 250 an. Männer und Frauen sind
gleichermaßen betroffen (ROBERTS und HOFMANN 1995).
Heterozygote Individuen sind klinisch asymptomatisch oder haben nur eine milde
Blutungssymptomatik. Homozygote Individuen mit 1-10% FVII:C-Aktivität haben meist nur
milde Symptome, bei weniger als 1% Aktivität können aber Blutungsepisoden wie bei
schwerer Hämophilie A oder B auftreten. Diese äußern sich in Form von rezidivierenden
Gelenkblutungen, chronischen Arthropathien, Hämatomen, Epistaxis, Menorrhagie,
Hämaturie, Blutungen in den Magen-Darm-Trakt und Zahnfleischblutungen (RAGNI et al.
1981, ROBERTS und BINGHAM 1998, HANDIN 2001). Die Schwere der Blutungsneigung
korreliert beim Menschen nicht immer mit der FVII:C-Aktivität, sondern ist auch von der Art
des genetischen Defektes abhängig (HERRMANN und WULF 1998, ROBERTS und
BINGHAM 1998, HANDIN 2001).
Bei Routine-Labortests fallen eine verlängerte Prothrombinzeit (PT) bei normaler aktivierter
partieller Thromboplastinzeit (aPTT), normaler Thrombinzeit und normalem Russels Viper
Venom Test (Screening-Test zur Bestimmung der Prothrombin-Aktivität) auf (WEISSBACH
1991, ROBERTS und HOFMANN 1995, MADLENER und PÖTZSCH 1999). Der Faktor
VII-Mangel ist die einzige erbliche Erkrankung mit dieser Kombination von Gerinnungstest-
15
Ergebnissen (WEISSBACH 1991, ROBERTS und HOFMANN 1995). Die
Einzelfaktoranalyse zeigt eine isoliert verminderte FVII:C-Aktivität auf (WEISSBACH
1991, ROBERTS und HOFMANN 1995).
Therapeutisch werden beim Menschen bei schweren Blutungsepisoden Frischplasma-
Präparate, Prothrombinkomplex-Präparate und rekombinante Faktor VII- und Faktor-VIIa-
Präparate eingesetzt (ROBERTS und HOFMANN 1995, ROBERTS und BINGHAM 1998,
HANDIN 2001).
2.1.2 Hund
Der spontane hereditäre Faktor VII-Mangel ist außer beim Menschen nur beim Hund
beschrieben worden (DODDS 1997). Bei Mäusen konnte dieser hereditäre Defekt
experimentell durch Deletion der kompletten kodierenden Gensequenz für diesen Faktor
erzeugt werden (ROSEN et al. 1997). Beim Hund ist diese Erkrankung v. a. bei Beagles in
verschiedenen Teilen der Welt gefunden worden (MUSTARD et al. 1962, SPURLING 1980,
SPURLING 1988, DODDS 1997). Beim Beagle ist einerseits ein autosomal-rezessiver
Erbgang beschrieben worden (SPURLING et al. 1974, SPURLING 1988, DODDS 1997,
McPHERSON et al. 1999), während andererseits GREEN und THOMAS (1995) und
LITTLEWOOD (2000) für dieselbe Spezies einen autosomal-dominanten Erbgang mit
inkompletter Dominanz angeben. Es wurde eine inkomplette Deletion der Faktor VII-
Synthese gezeigt (SPURLING 1986). WILHELM et al. (2001) konnten den Gendefekt bei
Faktor VII-defizienten Beagles charakterisieren. Es handelt sich um eine Punktmutation an
Nukleotid 443 mit einer Substitution von Guanin durch Adenin, was einen Austausch der
Aminosäure Glycin gegen Glutaminsäure im Faktor VII-Protein an Stelle 96 bewirkt. Diese
defekten Faktor VII-Moleküle werden zwar normal sezerniert, haben aber eine reduzierte
Gerinnungsaktivität. Damit übereinstimmend hat SPURLING (1988) beschrieben, daß beim
Faktor VII-defizienten Beagle die Werte für die FVII:C-Aktivität niedriger als die FVII:Ag-
Konzentration sind Neben dem Beagle ist der Faktor VII-Mangel vereinzelt auch bei
Bulldoggen, einem Wurf Alaskan Malamutes und einem Mischlingshund beschrieben worden
(SPURLING 1980, DODDS 1997, McPHERSON 1999). Der Vererbungsmodus ist bei diesen
Rassen noch nicht belegt.
16
Beim Hund sind bei heterozygoten Faktor VII-Mangel-Tieren keine und bei homozygoten
meist keine oder nur milde Symptome beschrieben worden, wie kleine Hämatome nach
Kämpfen (GREEN und THOMAS 1995, HOVIG et al. 1967, SPURLING 1974b). So werden
Faktor VII-defiziente Hunde teilweise nur per Zufall entdeckt (SPURLING et al. 1974b).
Auch Operationen können meist ohne abnorme Blutungen durchgeführt werden (SPURLING
et al. 1974b, WHEELER et al. 1984). Erst bei FVII:C-Aktivitäten < 5% treten teilweise auch
stärkere Symptome auf, wie Hämatome, starke Blutungen bei Operationen, steifer Gang
infolge Hämarthrose, exzessive Blutung nach Abort, anhaltende vaginale und uterine
Blutungen und exzessive Blutung nach Leberruptur (SPURLING 1974b, WHEELER et al.
1984, McPHERSON et al. 1999). Beim Hund ist auch eine Prädisposition für die
generalisierte Demodikose beschrieben worden (DODDS 1997). Auf der anderen Seite
konnten bei Hunden mit hereditärem Faktor VII-Mangel Anzeichen für eine verringerte
Empfindlichkeit für einen Endotoxin-Schock gefunden werden (GARNER und EVENSEN
1974).
Die Laborergebnisse entsprechen denen des Menschen (SPURLING 1986, MISCHKE et al.
2003). Homozygote Hunde haben meist eine FVII:C-Aktivität von 1-5 %, teilweise bis 15 %,
während heterozygote eine FVII:C-Aktivität von 15-65 % aufweisen (POLLER et al. 1971,
SPURLING 1980, DODDS 1997). Auch bei schweren Fällen sind bei Hunden immer geringe
Aktivitäten an FVII:C im Plasma nachweisbar (SPURLING, 1986).
Bei blutenden Hunden mit hereditärem Faktor VII-Mangel wurden, wenn nötig, lokale
blutstillende Maßnahmen wie Kauterisation sowie eine Substitutionsbehandlung mit
Transfusionen von Vollblut oder gefrorenem Frischplasma eingesetzt (SPURLING et al.
1974b, WHEELER et al. 1984, DODDS 1997). WHEELER et al. (1984) berichteten über die
viermalige Transfusion von 500 ml Vollblut im Abstand von 12 – 24 Stunden (h) bei einer
13,2 kg schweren Hündin mit vaginaler Blutung. Aber erst eine Operation mit Kauterisation
des kleinen Defekts erzielte einen langfristigen Effekt. SPURLING et al. (1974b) berichteten
über eine Beagle-Hündin, deren Gewicht nicht angegeben wurde, die bei anhaltenden
Blutungen nach der Geburt eine zweimalige Transfusion von jeweils 100 ml Vollblut im
Abstand von 24 h erhielt. Nach der zweiten Transfusion war der Effekt zufriedenstellend.
Auch humane Faktor VIIa-Konzentrate sind beim Faktor VII-defizienten Hund grundsätzlich
einsetzbar (CHABBAT et al. 1988), ihre Verwendung bei Faktor VII-defizienten Hunden ist
17
bisher aber noch nicht beschrieben worden. Weitere Therapien der Faktor VII-Defizienz beim
Hund sind in der zugänglichen Literatur nicht beschrieben worden.
2.3 Rekombinanter humaner Faktor VIIa
2.3.1 Chemische Struktur
Beim humanen Faktor VIIa handelt es sich um ein Glykoprotein-Enzym, das zu den Serin-
Proteasen gehört (THIM et al. 1988, WILDGOOSE et al. 1999). Er hat ein Molekulargewicht
von 50 Kilodalton und er gehört elektrophoretisch zu den β-Globulinen (EDER 1987,
WILDGOOSE et al. 1999). In der Leber wird das weniger aktive Zymogen Faktor VII als
einsträngiges Molekül Vitamin K-abhängig gebildet, um dann im Blut hydrolytisch in zwei
Ketten, eine leichte Kette mit 152 Aminosäuren und eine schwere Kette mit 254
Aminosäuren, gespalten zu werden, die durch Disulfid-Brücken verbunden sind (THIM et al.
1988, WILDGOOSE et al. 1999). Diese Spaltung erfolgt ohne Peptidverlust (WEISSBACH
1991a). Das N-terminale Ende ist, wie die anderen Vitamin K-abhängigen
Gerinnungsfaktoren, durch eine Glutaminsäure-Region gekennzeichnet, was für die γ-
Carboxylierung wichtig ist (THIM et al. 1988, WILDGOOSE et al. 1999).
Rekombinanter humaner Faktor VIIa wird aus dem Zellüberstand von kultivierten Baby-
Hamster-Nierenzellen, die mit der codierenden humanen DNA transfiziert wurden,
gewonnen. Er hat sich bei Aminosäure-Sequenzierung, chromatographisch und bezüglich der
biologischen Aktivität als weitgehend übereinstimmend mit dem humanen Faktor VIIa
erwiesen (THIM et al. 1988).
2.3.2 Pharmakokinetik
2.3.2.1 Mensch
Zur Pharmakokinetik von rhFVIIa liegt für den Menschen nur eine Studie vor (LINDLEY et
al. 1994) (Tab. 1). In dieser Studie wurden nach intravenöser (iv) Gabe von 17,5, 35 und 70
µg/kg Körpermasse (KM) als Bolus Clearance, mittlere Verweilzeit, Verteilungsvolumen im
Steady-State-Zustand, Halbwertszeit und Wiederfindungsrate untersucht. Diese Studie wurde
an Patienten mit Hämophilie A und B, mit und ohne Hemmkörpern sowie mit und ohne
Blutungsepisoden durchgeführt, während der zugänglichen Literatur keine
18
pharmakokinetischen Daten für gesunde Menschen entnommen werden können. Das in dieser
Studie ermittelte Verteilungsvolumen entsprach bei blutenden Patienten im Mittel 103,2
ml/kg KM und bei Patienten ohne Blutung 106,5 ml/kg KM. Die mittlere Halbwertszeit lag in
Abhängigkeit davon, ob Blutungen vorlagen oder nicht, bei 2,41 bzw. 2,89 h und bei
getrennter Auswertung der Dosierung bei 2,59 h (17,5 µg/kg KM), 2,57 h (35,0 µg/kg KM)
und 2,81 h (17,5 µg/kg KM). Die Wiederfindungsrate war bei Patienten ohne Blutung 43,5
und bei Patienten mit Blutungen 45,6 %.
Tab. 1: Mittelwerte der pharmakokinetischen Daten für die intravenöse Injektion von
rekombinantem humanen Faktor VIIa beim Menschen (nach LINDLEY et al. 1994).
KM= Körpermasse; ml= Milliliter; kg= Kilogramm; h= Stunden
2.3.2.2 Hund
Bei den Versuchen zur Anwendung von rhFVIIa beim Hund sind pharmakokinetische
Parameter an jeweils zwei Hunden mit Hämophilie A und mit Hämophilie B bei
unterschiedlichen Dosierungsregimen untersucht worden (BRINKHOUS et al. 1989). Bei
dieser Studie wurden verschiedene Dosierungen bei variabler Anzahl von Injektionen in
unterschiedlichen Zeitintervallen gegeben (siehe Kapitel 2.3.3.2, Tab. 4). Hierbei zeigte sich
bei den zwei Hunden mit Hämophilie A bei drei- bzw. viermaligen Injektionen von
Dosierungen zwischen 49 bis 219 µg/kg Körpermasse (KM) eine mittlere Wiederfindungsrate
von 34 % und eine Halbwertzeit für die FVII:Ag-Konzentration von 2,8 ± 0,5 h für die
Status der Patienten bzw. Dosierungen
ohne Blutungen
mit Blutungen
17,5 µg/kg KM
35 µg/kg KM
70 µg/kg KM
Verteilungsvolumen im Steady-State Zustand [ml/kg] 106,5 103,2 97,8 112,9 107,8
Mittlere Verweilzeit [h] 3,44 2,70 3,30 3,27 3,31
Clearance [ml kg-1h-1] 31 32,6 27,8 31,1 32,2
Mittlere Halbwertzeit [h] 2,89 2,41 2,59 2,57 2,81
Wiederfindungsrate im Plasma [%]
45,6 43,5 47,76 46,13 38,55
Maximale Konzentration (Einheiten/ml)
9,3 7,8 4,5 9,8 17,95
19
FVII:C-Aktivität 2,1 ± 0,6 h, die annähernd den Verhältnissen beim Menschen entsprachen.
Bei zwei Hunden mit Hämophilie B ergaben Injektionen mit Dosierungen zwischen 57-199
µg/kg KM eine mittlere Wiederfindungsrate von 44 %.
2.3.3 Klinische Anwendung
2.3.3.1 Menschen
2.3.3.1.1 Indikationen außer Faktor VII-Mangel
Rekombinanter Faktor VIIa wurde als Medikament für unstillbare Blutungen bei an
Hämophilie A und B erkrankten Menschen, speziell mit Hemmkörper-Hämophilie, entwickelt
(HEDNER et al. 1988, HEDNER 1999). Aufgrund seiner hervorragenden blutstillenden
Eigenschaften wird dieses Medikament seitdem aber auch immer häufiger als universelles
Hämostyptikum in anderen Anwendungsbereichen eingesetzt (HEDNER 2000). Die
Einsatzmöglichkeiten beim Menschen werden in Tabelle 2 summarisch dargestellt. Es zeigte
sich, daß bei Hämophilie A und B bei der Mehrheit der Studien eine Dosierung von 70 bis 90
µg/kg KM alle 2 h als Bolus effektiver als niedrigere Dosierungen war, und eine
Weiterführung mit 30 bis 35 µg/kg KM als Dauertropfinfusion (DTI ) in den meisten Fällen
ausreichend war (HEDNER 1996, LUSHER 1998, SHAPIRO et al 1998, ARKIN et al. 2000).
Ähnliche Dosierungsregimes wurden bei schwereren Funktionsstörungen der primären
Hämostase wie Thrombozytopenie (GEROTZIAFAS et al. 2002), von Willebrand-
Erkrankung (FRIEDRICH et al. 2002), Glanzmann-Thrombasthenie (KIM et al. 1999) und
Bernard-Soulier-Syndrom (PETERS und HEIBOER 1998) eingesetzt. Bei Faktor XI-Mangel
mit Inhibitor oder prophylaktischer Anwendung vor Operationen mit hohem Blutungsrisiko
waren bei zufriedenstellendem Erfolg nur Dosierungen von ca. 30 µg/kg KM als Bolus
eingesetzt worden (AL DOURI et al. 2000, BILLON et al. 2001). Bei der disseminierten
intravasalen Gerinnung wurden 40 bis 180 µg/kg KM als Bolus und 16,5 bis 33 µg/kg KM als
DTI erfolgreich angewendet (CHUANSUMRIT et al. 2000). Bei schweren Blutungen und
schweren Blutungen durch Leberinsuffizienz waren zwischen 20 und 90 µg/kg KM rhFVIIa,
z.T. wiederholt als Bolus, effektiv (BERNSTEIN et al. 1997, ZIETKIEWITZ et al. 2002).
20
Tab. 2: Anwendungsbereiche für rekombinanten humanen Faktor VIIa beim Menschen (ohne
hereditären Faktor VII-Mangel) mit Berücksichtigung von Dosierung für intravenöse
Applikation, Dosierungsintervall, Art der Applikation und klinischem Effekt
Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route, Anzahl der Fälle (n)
klinischer Effekt Literaturstellen
35 bzw. 70 µg/kg KM als Bolus in Intervallen von 2-3 Stunden (n= 84)
Klinischer Effekt bei Hemmkörper-Hämophilien bei beiden Dosierungen ähnlich, ohne Hemmkörper besser bei 70µg/kg
LUSHER et al. 1998
2 Gruppen mit 35 (n= 15) bzw. 90 µg/kg KM (n= 14) als Bolus alle 2 Stunden für 2 Tage, dann alle 2-6 Stunden für weitere 3 Tage
Ausreichende intraoperative Hämostase bei 28 von 29 Patienten; bessere Ergebnisse bei 90 µg/kg KM
SHAPIRO et al. 1998
90-110 µg/kg KM alle 2 Stunden in den ersten 24 Stunden (n= 23)
Sistieren von 82 % der Muskel- und 89 % der Gelenkblutungen
ARKIN et al. 2000
90-110 µg/kg KM alle 2 Stunden in den ersten 24 Stunden, dann 70-90 µg/kg alle 2 Stunden (n= 9)
Effektive Beherrschung der Blutungen
BRACKMANN et al. 2000
Protokoll I: Initialdosis 90 µg/kg KM als Bolus, dann 15-16 µg/kg KM als DTI über 12 Stunden (n= 6) Protokoll II: Initialdosis 160-180 µg/kg KM als Bolus, dann 30 µg/kg als DTI über 6 Stunden (n= 2)
Klinischer Effekt nahezu gleich (71% bzw. 75% klinischer Erfolg), aber die Blutung stoppte bei Protokoll II schneller (0 von 58 bzw. 27 von 36 Blutungsepisoden innerhalb der ersten 6 Stunden)
KENET et al. 2000
Hämophilie A und B, mit und ohne Hemmkörper
Bei 5 von 6 Patienten zuerst 90-200 µg/kg KM als Bolus, bei allen 12-49 µg/kg/h als DTI (n= 6)
Bei 4 Patienten Reduktion von Blutungen, zweimal Therapieversagen
MCPHERSON et al. 2000
21
Fortsetzung Tab. 2 Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route,
Anzahl der Fälle (n) klinischer Effekt Literaturstellen
erworbener Faktor X-Mangel bei Amyloidose
90 µg/kg KM alle 3 Stunden als Bolus (n= 1)
Keine Komlikationen bei der Splenektomie
BOGGIO und GREEN 2001
Faktor XI-Mangel mit Inhibitor
30 µg/kg KM 2mal im Abstand von 4 Stunden als Bolus (n= 1)
Stoppen der Blutung BILLON et al. 2001
In 52 % von 105 Applikationen bei nicht blutenden Patienten erfolgte eine dosisunab-hängige Verkürzung der Blutungszeit; bei 8 blutenden Patienten erfolgte eine Reduktion (n=2) oder ein Sistieren der Blutung (n=6)
KRISTENSEN et al. 1996
50 oder 100 µg/kg KM als Bolus
Stoppen der Blutungen (n=1)
VIDARSSON et al. 2000
Blutung stoppte (n=1)
MEIJER et al. 1998
Sisitieren der Blutung (n=1)
REVESZ et al. 1998
Thrombozytopenie oder Thrombozytopathie unbekannter Genese
90 µg/kg KM als Bolus
Blutungen stoppten (n=2)
GEROTZIAFAS et al. 2002
90 µg/kg KM als Bolus initial, dann 17,5 µg/kg/h KM als DTI (n= 1)
Blutungen gestoppt FRIEDRICH et al. 2001
80-82 µg/kg KM als Bolus alle 2-3 h (n= 1)
Blutungen sistierten MEIJER et al. 2001
von Willebrand-Erkrankung
200 µg/kg KM als Bolus dann 90 µg/kg KM (n= 1)
Stoppen der Blutungen
TARANTINO und ABERLE 2001
22
Fortsetzung Tab. 2
Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route, Anzahl der Fälle (n)
klinischer Effekt Literaturstellen
110 µg/kg KM als Bolus alle 1,5-3 Stunden (n= 1)
Sistieren des Nasenblutens
TENGBORN und PETRUSON 1996
90, 180 und 270 µg/kg KM als Bolus bei 3 Episoden im Abstand von Monaten (n= 1)
Kein Effekt bei 90 µg/kg; keine Normalisierung der Blutungszeit, aber klinischer Effekt nach 180 µg/kg; optimaler Effekt in beiden Kategorien nach 270 µg/kg
CHUANSUMRIT et al. 1999
90µg/kg KM als Bolus alle 2 Stunden
Gute Kontrolle der Blutung (n= 1)
KIM et al. 1999
Glanzmann-Thrombasthenie
Stoppen der Blutung (n=1) Stoppen der Blutung (n=1)
MATHEW et al. 2000
Bernard-Soulier-Syndrom
77 µg/kg KM alle 4 Stunden über 1 Tag als Bolus (n= 1)
Sistieren des Nasenblutens
PETERS und HEIBOER 1998
40-180 µg/kg KM als Bolus, dann 16,5-33 µg/kg/h als DTI (n= 1)
Sistieren der Blutungen
CHUANSUMRIT et al. 2000
Disseminierte intravasale Gerinnung
90 µg/kg KM als Bolus alle 3 Stunden (n= 1)
Sistieren der Blutungen
MOSCARDO 2001
5, 20 und 80 µg/kg KM als Bolus im Abstand von 7 Tagen (n= 13)
Bei 13 Patienten Normalisierung der PT
BERNSTEIN et al. 1997
Leberzirrhose und Lebertransplantation
80 µg/kg KM als Bolus einmalig (n= 6)
Geringerer intra-operativer Blutverlust bei 6 Patienten
HENDRICKS et al. 2001
schweres Trauma 120 ± 89 µg/kg KM als Bolus, 1-3malig (n= 19)
Sistierende Blutung bei 15 von 19 (79%) Schwerst-verwundeten
KENET et al. 1999, MARTINOWITZ et al. 2001, MARTINOWITZ et al. 2002
23
Fortsetzung Tab. 2
DTI= Dauertropfinfusion; KM= Körpermasse; µg= Mikrogramm; PT= Prothrombinzeit;
2.3.3.1.2 Faktor VII-Mangel
Über den klinischen Einsatz von rhFVIIa bei Blutungen bei Menschen mit hereditärem Faktor
VII-Mangel gibt es einzelne Berichte. BECH et al. (1995), BAUER et al. (1996) und
MARIANI et al. (1998) untersuchten die Anwendung bei Patienten mit spontanen Blutungen.
BECH et al. (1995) geben die Ergebnisse von insgesamt 21 Anwendungen bei 10 Faktor VII-
defizienten Patienten mit 15-30 µg/kg KM alle 4-6 Stunden als Bolus iv an. Die Effizienz
Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route, Anzahl der Fälle (n)
klinischer Effekt Literaturstellen
Blutungen bei Überdosierung von Antikoagulantien vom Cumarintyp
Experimentell bei freiwilligen Probanden verschiedene Dosierungen von 5-320 µg/kg KM als Bolus; therapeutisch: 80 µg/kg KM als Bolus (n= 12)
Experimentell: außer bei 5 µg/kg KM, eine Besserung der International Normalized Ratio (INR), ab 120 µg/kg KM Normalisierung der INR für 12 Stunden; therapeutisch: Blutungen stoppten
BERNTORP et al. 2000
90 µg/kg KM als Bolus, Wiederholung nach 2 Stunden (n=2)
Sofortiges Stoppen der Blutungen
WHITE et al. 1999b
60 µg/kg KM als Bolus, 2mal im Abstand von 12 Stunden (n= 1)
Nach der 1. Injektion Reduktion, nach der 2. Injektion: Stoppen der Blutung
KAMPHUISEN et al. 2002
Schwere, mit anderen Maßnahmen nicht kontrollierbare Blutungen
20 bzw. 30 µg/kg KM als Bolus 2 mal im Abstand von 4 Stunden (n= 1)
Nach der 1. Injektion Reduktion, nach der 2. Aufhören der Blutung
ZIETKIEWICZ et al. 2002
Schwere, mit anderen Maßnahmen nicht kontrollierbare Blutungen
90 µg/kg KM als Bolus, Wiederholung nach 2 Stunden (n=2)
Sofortiges Stoppen der Blutungen
WHITE et al. 1999b
24
wird mit 95% angegeben. Antikörperbildung trat nur bei einem Säugling mit angeborenem
Faktor VII-Mangel nach Gabe einer akzidentell hohen Dosis von 800 µg/kg KM auf.
BAUER (1996) berichtet über die Gabe von rhFVIIa an 2 Faktor VII-Mangelpatienten in
einer Dosierung von 10 µg/kg KM einmalig als Bolus intravenös (iv) und ermitteltete die
Veränderungen der Prothrombinzeit (PT), FVII:C-Aktivität und FVII:Ag-Konzentration in
bestimmten Zeitintervallen. Hierbei zeigte sich eine Erhöhung der FVII:C-Aktivität von <1
auf 168 % (Patient 1) bzw. von 3 auf 128 % (Patient 2) und eine Steigerung der FVII:Ag-
Konzentration von 0,2 auf 15,2 % bzw. von 17,5 auf 36,0 %. Bei einer weiteren Gabe
mehrere Wochen später von 20 µg/kg KM einmalig als Bolus iv ergab sich ein Anstieg der
FVII:C-Aktivität von < 1 auf 200 % bzw. von 3 auf 180 % und eine Erhöhung der FVII-:Ag-
Konzentration von 0,2 auf 29,1 % (Patient 1) und von 17,5 auf 42,2 % (Patient 2).
In einer weiteren Studie von MARIANI et al. (1998) betrug die Einzeldosierung bei Faktor
VII-Mangel-Patienten 9 bis 71 µg/kg KM, im Mittel 20 µg/kg KM, bei 2- bis 112maliger
Anwendung. Bei 14 von 15 Hämarthrose-Blutungen war das Ergebnis gut bis sehr gut, bei der
niedrigsten Dosierung jedoch nur teilweise effektiv. Bei 5 von 6 anderen Blutungs-Episoden
war das Ergebnis gut, bei einem Patienten mit einer hohen Dosierung entwickelten sich
schnell Antikörper.
INGERSLEV et al. (1997) wandten das Medikament bei zwei Patienten mit schwerem Faktor
VII-Mangel prophylaktisch bei Operationen in einer Dosierung von 17,6-18,5 µg/kg KM als
Bolus alle 6 h an. Es traten keine Blutungskomplikationen während insgesamt sieben
Operationen auf. Das Medikament wurde gut vertragen und postoperativ waren keine
Symptome für ein thrombotisches Geschehen sichtbar. Die Werte der PT normalisierten sich
nach 10 min und waren auch 6 h später noch deutlich unter dem Ausgangswert. Ebenso lag
auch die nach 10 min deutlich angestiegene Faktor VII-Aktivität noch nach 6 h über dem
Ausgangswert.
WHITE et al. (1999a) beschrieben den Verlauf einer rhFVIIa-Therapie eines Leukämie-
Patienten mit erworbenem Faktor VII-Mangel und Lungenblutungen sekundär zu einer
Aspergillus-Pneumonie. Die anderen Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren waren
unverändert und es konnten auch keine Hemmkörper gefunden werden. Es wurden zweimal
90µg/kg KM als Bolus im Abstand von zwei Stunden iv gegeben mit sofortiger Verringerung
25
der Blutung. Die gleiche Dosis wurde einen Tag später erneut gegeben, worauf keine weiteren
Lungenblutungen mehr auftraten.
Die in der Literatur beschriebenen Anwendungen von rhFVIIa bei Menschen mit Faktor VII-
Defizienz sind summarisch in Tabelle 3 dargestellt.
Tab. 3: Literaturübersicht zur Anwendung von rekombinantem humanen Faktor VIIa bei
hereditärem Faktor VII-Mangel des Menschen mit Berücksichtigung der Dosierung für die
intravenöse Applikation (jeweils als Bolus), Dosierungsintervall und klinischem Effekt.
Dosierung, Intervalle klinischer Effekt Literaturzitat 95 %iger Erfolg der Blutstillung bei 21 Blutungsepisoden von 10 Patienten
BECH et al. 1995,
15-30 µg/kg KM alle 4-6 Stunden
Normalisierung der Gerinnungsparameter bei 2 Patienten ohne Blutungen
BAUER 1996
17,6-18,5 µg/kg KM alle 6 Stunden
keine Komplikationen bei Operationen
INGERSLEV et al. 1997
9 bis 71 µg/kg KM gute klinische Wirkung bei 26 von 27 Blutungsepisoden, einmal Therapieversagen
MARIANI et al. 1998
90 µg/kg KM im Abstand von 2 Stunden
Stoppen des blutigen Hustens bei einem Patienten
WHITE et al. 1999a*
* erworbener Faktor VII Mangel bei Leukämie 2.3.3.1.3 Laborkontrolle der Anwendung beim Menschen
Zur Überwachung der rhFVIIa-Gabe beim Menschen wurden verschiedene Parameter
benutzt, teilweise abhängig von der Indikation. Allerdings wurden nur von wenigen Autoren
konkrete Angaben zu genauen Messwerten, dazugehörigen Dosierungen und Zeitdauer des
Effektes gemacht. Ebenso erlauben Arbeiten, in denen sowohl Bolusinjektionen als auch DTI
gegeben wurden, keine Aussage über den zeitabhängigen Effekt einer Bolusinjektion allein.
Am häufigsten fand zum Monitoring des rhFVIIa-Effektes die PT Anwendung. Hierbei lieβ
sich – naturgemäβ – beim hereditären Faktor-VII-Mangel ein besonders deutlicher Effekt
erzielen, wo sich nach Dosierungen von 10-20 µg/kg KM rhFVIIa die initial deutlich
verlängerten Werte von 24-42 sec auf 7-11 sec verkürzten (BAUER 1996 (siehe Tab. 4, Seite
29), INGERSLEV et al. 1997). Der Therapieerfolg war auch bei 10 Patienten mit
Leberzirrhose an einer auffälligen Reduktion der PT von initial im Mittel 20 sec auf 12 bzw.
26
10 sec nach der vor Gabe von 20 bzw. 80µg/kg (BERNSTEIN et al. 1997). Auch bei einem
blutenden Menschen mit DIG bewirkte die Injektion von 90 µg/kg KM rhFVIIa eine
darstische Reduktion der PT von 27 sec auf 12 sec bei einer Dosierung, die durch
Folgeinjektionen im Abstand von 3 h auf diesem Niveau gehalten werden konnte
(MOSCARDO et al. 2001). MARTINOWITZ et al. (2001) fanden bei 7 Trauma-Patienten
nach Bolusinjektionen von 40 bis 120 µg/kg ebenfalls eine signifikante Verkürzung der PT
von im Mittel 24 sec auf 10 sec. Bei blutenden hämophilen Menschen verkürzte sich die
initial normale PT hingegen nach Dosierungen von 17,5-70 µg/kg in wesentlich geringerem
Umfang von im Mittel 11,2 auf 8,9 sec (LINDLEY et al. 1994). Bei einer Blutung bei einem
Urämie-Patienten konnte nach Gabe von 90 µg/kg KM rhFVIIa trotz sofortigen Sistierens der
Blutung keine Veränderung der PT verzeichnet werden (REVESZ et al. 1998).
BAUER (1996) stellte bei zwei Patienten mit hereditärem Faktor VII-Mangel bei Applikation
von 10 und 20µg/kg KM rhFVIIa nach 15 min eine Verkürzung der PT um 60 bis 75 % fest
(siehe Tab. 4, Seite 29). INGERSLEV et al. (1997) beschrieben eine Verkürzung bei zwei
Patienten mit hereditärem Faktor VII-Mangel nach Bolusinjektion von 20 µg/kg KM rhFVIIa
von ursprünglich 29 sec auf 8 sec (Patient 1) bzw. von initial 28 sec auf 10sec (Patient 2).
Daneben wird zum Monitoring der rhFVIIa-Therapie die Messung der FVII:C-Aktivität
empfohlen (INGERSLEV et al. 2000), die dosisabhängig ansteigt (LINDLEY et al. 1994,
BERNSTEIN et al. 1997, INGERSLEV et al. 1997, HENDRICKS et al. 2001). Auch die
niedrigeren, in Verbindung mit hereditärem Faktor-VII-Mangel eingesetzten Dosierungen
führen hierbei nach der Therapie zu einer VII:C-Aktivität, die deutlich über den normalen
Verhältnissen liegt. So fanden INGERSLEV et al. (1997) nach Bolusinjektion mit 20 µg/kg
KM rhFVIIa bei einem Patienten eine Erhöhung der FVII:C-Aktivität von initial 0,01
Internatitonale Einheiten (IE)/ml (1 IE/ml entspricht 100 % FVII:C-Aktivität in der
konventionellen Einheit) auf 5,5 IE/ml nach 10 min und 0,45 IE/ml nach 6 h. Bei dem
zweiten von diesen Autoren beschriebenen Patienten war nach Gabe von 20 µg/kg KM
rhFVIIa eine Veränderung von 0,01 IE/ml auf 7,7 IE/ml nach 10 min und 0,64 IE/ml
festgestellt worden. Auch BAUER (1996) bestimmte bei 2 Patienten mit hereditärem Faktor
VII-Mangel die FVII:C-Aktivität und fand eine Steigerung von <3 % der Norm auf Werte
über 100 % der Norm 15 min nach Gabe von 10 bzw. 20 µg/kg KM (siehe Tab. 4, S. 29).
27
Bei anderen Dosierungen werden noch drastischere Erhöhungen der physiologischen FVII:C-
Aktivität erzielt. BERNSTEIN et al. (1997) fanden bei Patienten mit Leberzirrhose 10 min
nach rhFVIIa-Gabe in verschiedenen Dosierungen eine FVII:C-Aktivitätssteigerung von 0
IE/ml auf 2 (5µg/kg KM), 6 (20 µg/kg KM) bzw. 30 IE/ml (80 µg/kg KM). Von 6 Patienten
mit schweren Lebererkrankungen wurde 30 min nach rhFVIIa-Bolusinjektion mit 60µg/kg
KM ein Anstieg der FVII:C-Aktivität von initial <0,5 IE/ml auf 20-27 IE/ml festgestellt
(HENDRICKS et al. 2001). Analoge Werte werden bei den hämophilen Menschen erzielt, wo
LINDLEY et al. (1994) 5 min nach Gabe von 17,5 µg/kg KM rhFVIIa gemittelt über alle
Patienten nach 17,5 µg/kg rhFVIIa eine Steigerung der FVII:C-Aktivität um 5 IE/ml, nach 35
µg/kg um 10 IE/ml und nach 70 µg/kg um 19 IE/ml feststellten.
Auch die Änderung der Faktor VII/VIIa-Antigen-Konzentration wurde von BAUER (1996)
bei diesen 2 Patienten anhand von 2 verschiedenen Dosierungen (10 und 20µg/kg KM) von
rhFVIIa untersucht (siehe Tab. 4).
Zur Dokumentation (oder Kontrolle) der rhFVIIa-Wirkung wurde weiterhin die aktivierte
partielle Thromboplastinzeit (aPTT) eingesetzt, z.B. von BERNSTEIN et al. (1997) bei
Patienten mit Leberzirrhose. Die Autoren fanden eine Reduktion der aPTT 10 min nach Gabe
von 80 µg/kg von 43 % auf 35 %, und von 40 % auf 38% nach Gabe von 20 µg/kg rhFVIIa.
MARTINOWITZ et al. (2002) fanden nach rhFVIIa-Gaben in Dosierungen von 40 bis 120
µg/kg KM bei Trauma-Patienten eine signifikante aPTT-Verkürzung von 71 ± 38,9 sec auf
42,2 ± 24 sec. Bei einem hämophilen Patienten fanden LUSHER et al. (1998) eine
Verkürzung der aPTT nach Gabe von 70 µg/kg von 70 auf 31sec. Die Thrombozytenzahl
wurde vor allem bei Thombozytopenie (VIDARSSON et al. 2000, GEROTZIAFAS et al.
2002) gemessen. GEROTZIAFAS et al. (2002) konnten nach Injektion von 90 µg/kg KM
rhFVIIa eine moderate Steigerung am Tag nach der Injektion feststellen. VIDARSSON et al.
(2000) konnten zwar durch mehrmalige rFVIIa-Injektionen von 100 µg/kg bei einem
Leukämie-Patienten die Blutungen stoppen, aber über einen Zeitraum von 81 Tagen bis zum
Tode der Patientin keine Besserung der Thrombozytopenie erreichen.
Der Hämatokrit wurde von einigen Autoren bestimmt, aber genaue Daten wurden nur von
BERNTORP et al. (2000) und ohne Angabe der dazugehörigen Dosierung angeben. Die
Autoren stellten bei Warfarin-behandelten Probanden eine geringgradige Reduktion des
28
Hämatokrits von im Mittel 36 % vor Gabe von rhFVIIa auf 35 % nach 10 min und 33 % nach
30 min fest.
Tab. 4: Prothrombinzeit (PT, in Sekunden), koagulometrisch gemessene Faktor VII-Aktivität
(FVII:C, in % der Norm) und Faktor VII/VIIa-Antigen-Konzentration (in % der Norm) bei
zwei Menschen mit hereditärem Faktor VII-Mangel vor und nach intravenöser Gabe zweier
verschiedener Dosierungen (10 bzw. 20 Mikrogramm pro Kilogramm (µg/kg) Körpermasse)
von rekombinantem humanen Faktor VIIa zu den jeweiligen Probenentnahmezeitpunkten (in
Stunden, h) nach BAUER (1996).
Patient 1 Patient 2
10µg/kg rhFVIIa 20µg/kg rhFVIIa 10µg/kg rhFVIIa 20µg/kg rhFVIIa
Zeitp
unkt
(h)
PT sec
FVII:Ag (%)
FVII:C (%)
PT (sec)
FVII:Ag(%)
FVII:C(%)
PT sec
FVII:Ag(%)
FVII:C(%)
PT sec
FVII:Ag (%)
FVII:C(%)
0 38,4 0,2 <1 41,5 0,2 <1 23,8 17,5 3 23,7 17,5 3
0,25 9,1 15,2 168 10,5 29,1 200 9,1 36,0 128 9,2 42,2 180
0,5 9,1 13,2 140 9,1 25,3 136 9,3 31,2 100 9,4 40,8 136
1 10,2 13,1 54 9,2 23,2 100 9,8 31,1 57 9,1 36,7 98
2 11,9 9,9 29 10,6 16,9 45 11,0 30,3 26 9,7 36,0 74
4 15,2 7,3 11 12,5 15,5 18 13,2 23,5 13 10,8 - 40
6 17,3 5,2 4 15,0 7,0 7 14,5 22,0 8 12,4 31,6 12
12 19,9 2,9 2 14,0 3,1 2,5 19,9 17,7 4 17,5 20,7 4
24 38,6 0,5 <1 35,7 0,6 1,7 24,6 18,1 3,5 23,7 17,8 2,5
2.3.3.2 Hund
Für Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel läßt sich der zugänglichen Literatur bislang
keine Anwendung von rhFVIIa entnehmen. BRINKHOUS et al. (1989) setzten rhFVIIa bei 5
Tieren mit Hämophilie A oder B oder von Willebrand-Erkrankung ein. Bei zwei Hunden mit
Hämophilie A wurde rhFVIIa in Dosierungen von 49, 60 und 219 µg/kg KM (Hund 1) bzw.
51, 64 und 193 µg/kg KM (Hund 2) als Bolus in Intervallen von ein bis drei Tagen angewandt
(Tab. 5). Ebenso wurden bei zwei Hunden mit Hämophilie B rhFVIIa in Dosierungen von 67,
196 und 199 µg/kg KM (Hund 3) bzw. 153 µg/kg KM (Hund 4) als Bolus in Intervallen von 1
29
bis 3 Tagen (Hund 3) bzw. einmalig (Hund 4) eingesetzt. Ein Hund mit von Willebrand-
Erkrankung bekam 257 und 550 µg/kg KM als Bolus an zwei aufeinanderfolgenden Tagen.
Die FVII:C-Aktivität wurde mit Plasma gesunder Hunde als Standard bestimmt. Ein Enzyme
linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Bestimmung der FVIIa-Antigenkonzentration,
mittels zweier gegen verschiedene Epitope des Faktor VII-Moleküls gerichteter monoklonaler
Antikörper, wurde von den Autoren selbst hergestellt. Auf eine ELISA-Platte wurde ein
Antikörper gebunden, dann das Probenplasma des Patienten hinzugefügt, und mittels eines
zweiten Maus-Anti-Faktor VII-Antikörpers und eines peroxidasekonjugierten Anti-Maus-
Antikörper die Konzentration bestimmt. Auch zur Bestimmung der Bildung von Antikörpern
gegen rhFVIIa bei den Hunden wurde von den Autoren ein ELISA entwickelt. Hierzu wurde
rhFVIIa an eine ELISA-Platte gebunden, Probenserum hinzugefügt, und vorhandene
Antikörper gegen rhFVIIa mittels peroxidasekonjugiertem Kaninchen-Anti-Hunde-
Antikörper bestimmt, wobei Plasma unbehandelter Hunde als Negativkontrolle diente.
Genauere Angaben über die Durchführung der beiden ELISA-Testsysteme wurden nicht
gemacht.
Vier Tiere zeigten nach einmaliger (Hund 4) oder wiederholter (Hund 2, 3 und 5) Applikation
vorübergehende Urtikaria, ansonsten wurde das Medikament gut vertragen. Die FVII:C-
Aktivität und FVII:Ag-Konzentration stiegen bei allen 5 Hunden deutlich an und die
Blutungszeit und aPTT verkürzten sich deutlich. Alle Tiere hatten ein bis zwei Wochen nach
Applikation Antikörper gegen den rhFVIIa. Ein Tier (Hund 2) hatte einen Antikörpertiter von
1:100, die anderen vier von maximal 1:1000. Die Antikörper persistierten bei Hund 1 29
Wochen, Hund 2 2 Wochen, Hund 3 und 4 je 10 Wochen und Hund 5 22 Wochen nach
Applikation.
30
Tab. 5: Zusammenfassung der Ergebnisse der Versuche von BRINKHOUS et al. (1989) an 5
Hunden mit Hämophilie A, B oder von Willebrand-Erkrankung mit der an den
entsprechenden Tagen applizierten Dosis an rekombinantem humanen Faktor VIIa,
koagulometrisch gemessener Faktor VII:C (FVII:C)-Aktivität, erwarteter und tatsächlich
gemessener Faktor VII-Antigen (FVII:Ag)-Konzentration sowie aktivierter partieller
Trombolastinzeit (aPTT) vor und nach Applikation.
Nr.= Nummer des Hundes im Versuch; µg=Mikrogramm, kg=Kilogramm; KM=Körpermasse; ng=Nanogramm; ml=Milliliter; sec=Sekunden
FVII:Ag-Konzentration (ng/ml)
aPTT (sec) Nr. Erkrankung Tag und Dosis (µg/kg KM) erwartete tatsächliche
FVII:C-Aktivität (Einheiten/ml) vorher nachher
Tag 0: 60 1206 512 7,3 52 43 Tag 1: 60 1206 473 7,9 54 44 Tag 2: 49 993 450 7,2 55 42
1 Hämophilie A
Tag 5: 219 4397 1210 9,4 52 46 Tag 0: 64 1277 228 3,7 64 48 Tag 1: 51 3016 545 8,1 58 30
2 Hämophilie A
Tag 2: 193 3859 1867 11,2 59 35 Tag 0: 67 1344 468 8,3 78 46 Tag 1: 196 3925 1810 14,0 49 34
3 Hämophilie B
Tag 2: 199 3978 1813 30,7 69 36 4 Hämophilie B Tag 0: 153 3067 1490 22,9 60 37
Tag 0: 257 5147 2855 42,5 33 30 5 von Willebrand- Erkrankung
Tag 1: 550 11029 4925 64,0 33 25
31
3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material, Tiere und Methoden
3.1.1 Material
3.1.1.1 Geräte und Bezugsquellen
1. Halbautomatisches Zell-Zählgerät F 820, Firma Sysmex Deutschland GmbH,
Norderstedt
2. IKA-Mikrotiterplattenschüttler MTS 4, Firma IKA Labortechnik, Janke und Kunkel
GmbH & Co. KG, Staufen
3. Koagulometer nach Schnitger und Gross, Firma Trinity Biotech, Lemgo (früher Firma
Amelung GmbH, Lemgo)
4. Kühlzentrifuge, Typ GPKR, Firma Beckmann Instuments GmbH, München
5. Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader, Dynex 500, Firma Dynatech,
Denkendorf
6. Mikrotiterplatten-Wasch-Absauggerät, Dynatech MRW, Firma Dynatech, Denkendorf
7. Pipetten, einstellbar 10-100 µl, Firma Eppendorf, Hamburg
8. Pipetten, einstellbar 100-1000 µl, Firma Eppendorf, Hamburg
9. Rolling Mixer RM 810, Firma Sysmex Medical Electronics GmbH, Norderstedt
10. Umkehrosmoseanlage Typ RO 50/14 SMB, Firma SG, Barsbüttel
3.1.1.2 Reagenzien und Bezugsquellen
1. Aqua bidestillata, hergestellt in der hauseigenen Umkehrosmoseanlage
2. Diethylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (DBA-Puffer, pH 7,6), Firma Dade Behring
Diagnostics GmbH, Marburg
3. Dimethylsulfoxid (DMSO), Nr. 7157, Firma Merck, Darmstadt
4. di-Natriumhydrogenphosphat-monohydrat (Na2HPO4 x H2O), Nr. 6577, Firma Merck,
Darmstadt
5. di-Natriumhydrogenphosphat-heptahydrat, (Na2HPO4 x 7 H2O), Nr. 6579, Firma Merck,
Darmstadt
6. Humanes Fibrinogen, plasminogenfrei, Firma Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen
7. Isotone Natriumchlorid-Lösung (NaCl) 0,9 %, 500 ml, Firma Baxter, Unterschleißheim
32
8. Kalziumchlorid-Lösung (CaCl2-Lösung) 25 mmol, Firma Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim
9. Monoklonaler Maus-Anti-humaner Faktor VIIa (MabHFVIIa-5), Firma Haemochrom
Diagnostica GmbH, Essen
10. Natriumcarbonat-monohydrat (Na2CO3 x H2O), Nr. 6392, Firma Merck, Darmstadt
11. Natriumchlorid (NaCl), Nr. 9265.2, Firma Carl Roth, Karlsruhe
12. Natriumcitrat-Probenröhrchen (0,11 mol/l), 5ml, 57 x 16 mm, Firma Sarstedt, Nümbrecht
13. Natrium-di-hydrogenphosphat-monohydrat (NaH2PO4 x H2O), Nr. 6346, Firma Merck,
Darmstadt
14. Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), Nr. 342 K2136829, Firma Carl Roth, Karlsruhe
15. Natriumhydroxid (NaOH), wasserfrei, Nr. S-5881, Firma Sigma, Deisenhofen
16. NovoSeven®, eptacog alfa (aktiviert), rhFVIIa, 600 µg/ml, Firma Novo Nordisk,
Bagsvaerd, Dänemark
17. Pathromtin®, Reagenz zur Messung der aPTT, Firma Dade Behring Diagnostics
GmbH, Marburg
18. Peroxidasemarkierter monklonaler Ziegen-Anti-Hund-IgG-Antikörper (H+L), Firma
Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, USA
19. Peroxidasemarkiertes polyklonales Schaf-Anti-humaner Faktor VII-IgG (SAFVII-HRP),
Firma Haemochrom Diagnostica, Essen
20. Salzsäure (HCl), konzentriert (37%), Nr. 6081, Firma J. T. Baker, Groß-Gerau
21. STA Factor VII-Mangelplasma, Firma Stago-Haemodiagnostica, Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim
22. 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin (TMB), Nr. t-2885, Firma Sigma, Deisenhofen
23. Thromborel® S, Reagenz zur Messung der PT, Firma Dade Behring Diagnostics
GmbH, Marburg
24. Tween 20 (Polyoxyethylensorbitan-monolaurat), Nr. P 1379, Firma Sigma, Deisenhofen
25. Wasserstoffperoxid 3%ig (H2O2), Firma Sigma-Aldrich, Steinheim
26. Zitronensäure-monohydrat (C6H8O7 x H2O), Nr. 200.14, Firma Sigma, Deisenhofen
33
3.1.1.3 Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen
1. Braunüle Vasofix 18 G, 1 ¼ (1,3 x 33 mm), Firma Braun, Melsungen
2. Einmal-Injektionskanülen, Neolus, 18 G 1,2 x 40 mm, Firma Terumo, Braunschweig
3. Einmalspritzen BD Discardit II, 5, 10 und 20 ml, Firma Becton Dickinson, Braunschweig
4. F96-Maxisorb-ELISA-Platten, Nunc GmbH und Co KG, Wiesbaden
5. Kunststoffprobengefäß, 1,5 ml, Firma Eppendorf, Hamburg
6. Probengefäße mit Kalium-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 1,6 mg/ml), 1,3 ml,
Firma Sarstedt, Nümbrecht
7. Probengefäße mit Natrium-Citrat (0,11 mol/ml), 1,3 ml, Firma Sarstedt, Nümbrecht
8. Pipettenspitzen 2-100 µl, gelb, Firma Brand Plastibrand GmbH und Co, Wertheim
9. Pipettenspitzen 50-1000 µl, blau, Firma Brand Plastibrand GmbH und Co, Wertheim
10. Probengefäß zur Serum-Gewinnung, 10 ml, 95 x 16,8 mm, Firma Sarstedt, Nümbrecht
11. Teströhrchen für Koagulationsmessungen, 3,5 ml, 55 x 12 mm, Nr. 55484, Firma Sarstedt,
Nümbrecht
3.1.2 Tiere
Die für die Versuche verwendeten Beagles (n=22) stammten aus der Klinik für kleine
Haustiere (n=21) bzw. aus dem Institut für Reproduktionsmedizin (n=1) der Tierärztlichen
Hochschule Hannover (Tab. 6). Es handelte sich um 12 klinisch und gerinnungsphysiologisch
gesunde Hunde und 10 Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel.
34
Tab. 6: Laufende Nummer im Versuch, Gruppenzugehörigkeit, Tätowier- bzw. Mikrochip-
Nr. (MC, angegeben sind die letzten sieben Ziffern, denen in allen Fällen die Ziffern
27609810 vorangehen), Geschlecht, Alter, Körpermasse (KM), Prothrombinzeit-modifizierter
Test (PTMT) und Faktor VII-Aktivität (FVII:C) der verwendeten Beagle-Hunde bei Eintritt in
die Studie. Der Hund Nr. 13 stammt aus dem Institut für Reproduktionsmedizin.
* Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
Hund-Nr.
Gruppe* Tätowier-/bzw. Mikrochip-Nr.
Geschlecht
Alter KM [kg]
PTMT [%]
FVII:C [%]
1 I 9104 weiblich 10 Jahre 12,3 77 85 2 I 9103 männlich-kastriert 10 Jahre 13,9 90 80 3 II 909 weiblich 11 Jahre 14,5 20 10 4 I 904 weiblich 11 Jahre 15,1 66 75 5 I 902 weiblich-kastriert 11 Jahre 13,7 75 106 6 II 15893 männlich-kastriert 12 Jahre 14,8 25 13 7 II 15894 männlich-kastriert 12 Jahre 19,3 20 18 8 II 906/6 männlich-kastriert 11 Jahre 13,8 20 11 9 III 15895 männlich-kastriert 13 Jahre 15,0 66 115 10 III 9011 weiblich-kastriert 12 Jahre 16,3 72 98 11 III (MC)...1356821 männlich-kastriert 2 Jahre 21,6 75 115 12 III (MC)...0253540 weiblich 2 Jahre 16,4 74 104 13 IV FH1 163 männlich 9 Jahre 21,5 37 5 14 II (MC)...1459622 weiblich-kastriert 9 Monate 10,6 39 8 15 IV (MC)...0251451 männlich-kastriert 1 Jahr 17,5 34 5 16 II (MC)...1042155 männlich-kastriert 1 Jahr 11,8 30 5 17 IV (MC)...1458253 männlich 9 Monate 10,8 25 5 18 I (MC)...1459122 männlich 11 Monate 15,0 58 83 19 I (MC)...1357604 männlich 9 Monate 14,2 64 64 20 III (MC)...1456190 männlich 11 Monate 15,3 74 70 21 IV (MC)...1462350 männlich 11 Monate 15,5 38 28 22 III (MC)...1042014 männlich-kastriert 14 Monate 15,7 60 73
35
3.1.3 Methoden
3.1.3.1 Versuchsaufbau
Die Beagles wurden für den Versuch, abhängig davon, ob sie Faktor VII-defizient waren oder
nicht und ob sie mit 100 oder 500 µg/kg KM rhFVIIa behandelt wurden, in vier Gruppen
eingeteilt (siehe Tab. 6). Die Gruppen I bis III bestanden aus jeweils sechs Tieren, während
die Gruppe IV vier Tiere umfasste.
Die Blutentnahmen wurden zu folgenden Zeitpunkten durchgeführt: vor der rhFVIIa-Gabe
(= Zeitpunkt 0), sowie 2, 5, 10, 15, 30 min, 1, 1,5 , 2, 3, 4, 6, 8, 12 und 24 h danach. Bei
jedem Blutentnahmezeitpunkt wurde Blut in mit Citrat bzw. EDTA beschichtete
Probengefäße entnommen zur Messung folgender Meßgrößen: Hämatokrit,
Thrombozytenzahl, Prothrombinzeit-Standardtest (PTST) und Prothrombinzeit-modifizierter
Test (PTMT), aPTT, FVII:C-Aktivität und Faktor VIIa:Ag-Konzentration. Blut zur
Bestimmung der Antikörperbildung gegen rhFVIIa wurde vor der rhFVIIa-Gabe sowie 2, 4
und 12 Wochen danach in Probengefäße zur Serumgewinnung entnommen.
3.1.3.2 Vorbereitung der Patienten
Für diesen Versuch wurden die Hunde am Tag des Versuchs isoliert gehalten. Die Tiere
wurden beginnend 12 h vor der Applikation nüchtern gehalten und erst 12 h nach der
Applikation des Medikaments gefüttert, Trinkwasser stand ad libitum zur Verfügung.
Über den Punktionsstellen der Vena cephalica antebrachii und Vena saphena lateralis wurde
das Fell geschoren. Danach wurde eine Venenverweilkanüle plaziert, über die zur
Überprüfung des korrekten Sitzes zunächst 5 ml isotone Natriumchlorid-Lösung und dann
rhFVIIa über 1 min injiziert wurden. Anschließend wurden 1 ml Blut aspiriert und reinjiziert
und 5 ml isotone Natriumchlorid-Lösung nachgegeben, um sicherzustellen, daß das
Medikament vollständig in den Tierkörper gelangte. Die angegebenen Proben-
entnahmezeitpunkte beziehen sich auf die Mitte des Injektionszeitraumes. Die Tiere wurden
nach der Injektion innerhalb der ersten 3 h halbstündlich und danach zu den
Probenentnahmezeitpunkten einer kurzen allgemeinen klinischen Untersuchung unterzogen.
36
3.1.3.3 Blutentnahme und Probenbehandlung
Die Punktionsstelle wurde mit Alkohol desinfiziert. Der erste ml frei fließendes Blut nach
Punktion der Vene wurde in Kalium-EDTA enthaltende Probengefäße, die folgenden 5 ml in
mit Natriumcitrat beschickte Probengefäße aufgefangen und die Gefäße unverzüglich
geschwenkt, um eine Durchmischung von Blut und Antikoagulanz zu gewährleisten. Zur
Serumgewinnung zu ausgewählten Zeitpunkten wurden 2 ml Blut in Probengefäße zur
Serumgewinnung entnommen.
Die Citratblut-Proben wurden innerhalb von 10 min in die Kühlzentrifuge gebracht und bei
2000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand abpipettiert, in ein
Kunststoffprobengefäß verbracht und erneut in gleicher Weise zentrifugiert. Der Überstand
nach der zweiten Zentrifugation wurde als plättchenarmes Plasma (PAP) abpippetiert und bis
zur Bearbeitung bei -28 °C eingefroren. Für die Messungen wurde das PAP kurz in einem
Wasserbad mit 37 °C aufgetaut und sofort untersucht.
Das Blut im mit Kalium-EDTA beschichteten Probengefäß wurde bis zur Untersuchung von
Thrombozytenzahl und Hämatokrit auf einen Rollenmischer gelegt und innerhalb von 30 min
nach Probenentnahme untersucht.
Serum-Proben für die Autoantikörpermessung wurden 30 min bei Raumtemperatur
erschütterungsfrei stehen gelassen, um eine vollständige Gerinnung zu gewährleisten und bei
2000 x g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Der nach Zentrifugation aus dem
Kunststoffprobengefäß abpippettierte Überstand wurde bei -28 °C eingefroren. Zur Messung
wurde das Serum ebenfalls kurz in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und dann
untersucht.
3.1.3.4 Labormethoden
3.1.3.4.1 Hämatokrit und Thrombozytenzahl
Zur Messung des Hämatokrits und der Thrombozytenzahl wurden die Proben nach
Herstelleranweisung mit dem halbautomatischen Zell-Zählgerät untersucht. Es mißt nach
dem Widerstandsänderungsprinzip. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen Mittelwerten
aus Doppelmessungen. Die Eichung der Hämatokritmessung wurde mit Hundeblutproben
vorgenommen, deren Hämatokrit mit dem Mikrohämatokrit-Verfahren gemessen wurde. Die
37
Thrombozytenzahl wurde wie die anderen Meßgrößen des Gerätes mit einem kommerziellen
Kontrollblut des Herstellers in regelmäßigen Abständen kontrolliert. Messungen erfolgten nur
dann, wenn die Werte in den angegebenen Vertrauensbereichen lagen.
3.1.3.4.2 Poolplasma
Zur Herstellung eines Poolplasmas für die Anfertigung der Referenzkurven für die PTMT und
die FVII:C-Aktivität wurde 20 gesunden Hunden verschiedener Rassen 5 ml Blut in mit
Natriumcitrat beschickte Probengefäße entnommen und wie oben für Plasma-Proben
beschrieben, zentrifugiert und portioniert eingefroren. Zur Herstellung des Poolplasmas
wurde jeweils eine Portion des Plasmas dieser Hunde im Wasserbad bei 37 °C kurz aufgetaut
und dann in einem Probengefäß gemischt.
3.1.3.4.3 Prothrombinzeit
Prinzip:
Bei der PT wird zum PAP Gewebsthromboplastin hinzugefügt, was zur Aktivierung des
exogenen Gerinnungssystems und damit letztendlich zur Fibrinbildung führt. Im
Koagulometer wird die Zeit bis zur Fibrinbildung gemessen. Die Prothrombinzeit erfaßt die
Aktivität der Faktoren VII, X und Prothrombin, weniger sensitiv des Faktors V und die
Fibrinogenkonzentration. Da bei dem PTMT humane Fibrinogenlösung zugegeben wird, erfaßt
dieser Test nicht die Fibrinogenkonzentration.
Durchführung:
Neben dem Test nach Herstelleranleitung (PTST) wurde auch ein modifizierter Test nach
MISCHKE und NOLTE (1997) durchgeführt, da der PTST beim Hund nur eine geringe
Einzelfaktorempfindlichkeit besitzt. Bei dem PTMT wurde das Ergebnis mit einer
Referenzkurve verglichen, die mit Poolplasma erstellt wurde.
Die Tests wurden im Koagulometer nach Schnitger und Gross als Doppelbestimmung
durchgeführt. PT-Reagenz wurde nach Herstellerangaben aufgelöst und vor der Messung 15
min bei 37 °C erwärmt.
38
a) Prothrombinzeit-Standardtest:
Das Teströhrchen im Koagulometer wurde mit 100 µl Probenplasma befüllt und eine Minute
bei 37 °C inkubiert. Zum Starten der Reaktion wurden 200 µl PT-Reagenz hinzugegeben und
gleichzeitig die Stoppuhr im Koagulometer gestartet. Nach kurzem Schwenken des
Testansatzes wurde der Elektrodenhalter in das Gerät eingesetzt und die Zeit bis zur
Fibrinbildung automatisch gemessen (BARTHELS et al. 1987).
b) Prothrombinzeit-modifizierter Test:
Humanes Fibrinogen wurde in steriler isotone Natriumchlorid-Lösung gelöst (2 g/l) und bis
zur Verwendung im PTMT portioniert eingefroren. Zur Vorbereitung des PTMT wurde das PAP
in einem Kunststoffprobengefäß 1:20 mit DBA-Puffer verdünnt (50 µl PAP + 950 µl DBA-
Puffer). In das im Koagulometer befindliche Teströhrchen wurden 100 µl Probenverdünnung
mit 100 µl humaner Fibrinogen-Lösung (2 g/l) 2 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde
durch Zugabe von 100 µl PT-Reagenz in Gang gesetzt und zeitgleich die Stoppuhr des
Koagulometers gestartet. Nach kurzem Schwenken des Testansatzes wurde der
Elektrodenhalter in das Gerät eingesetzt und die Gerinnungszeit automatisch gemessen
(MISCHKE und NOLTE 1997).
Zur Erstellung der Referenzkurve, die eine Umrechnung der Sekundenwerte in Prozent
Aktivität ermöglichte, wurde Poolplasma in mehreren Verdünnungsstufen in DBA-Puffer
verdünnt. Der Anteil an Poolplasma in den Verdünnungsstufen entsprach 5, 10, 15, 20, 25,
33, 50, 75, 100, 125, 150 und 200 % des PAP im Testansatz. Dann wurde für jede
Verdünnungsstufe die PTMT ermittelt und die Ergebnisse wurden grafisch in einer Kurve
dargestellt. Bei Sekundenwerten, die unter der 200 % entsprechenden Zeit lagen, wurde der
Test mit einer höheren PAP-Verdünnung wiederholt so daß das Sekunden-Ergebnis über
diesem Grenzwert lag. Der zusätzliche Verdünnungsfaktor wurde dann bei der Ermittlung der
Gerinnungsaktivität berücksichtigt.
39
3.1.3.4.4 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
Prinzip:
Durch Zugabe einer Reagenzlösung mit Oberflächenaktivatoren (hier Kaolin) und partiellen
Thromboplastinen in Form von gerinnungsaktiven Phospholipiden zu PAP wird eine
Kontaktaktivierung der Faktoren XII und XI des intrinsischen Systems hervorgerufen. Die
Substitution von Kalzium-Ionen (Ca2+-Ionen) startet die weitere Gerinnung bis zur
Fibrinbildung. Gemessen wird die Zeit von der Zugabe des Kalziums bis zur Fibrinbildung
(PROCTOR und RAPAPORT 1961). Dieser Test erfaßt vor allem die Aktivität der Faktoren
XII, XI, IX und VIII, und auch der Faktoren X, V, weniger von Prothrombin und Fibrinogen.
Durchführung:
Die Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) wurde im Koagulometer
nach Schnitger und Gross als Doppelbestimmung durchgeführt. In die in das Koagulometer
eingesetzten Teströhrchen wurden 100 µl PAP mit 100 µl aPTT-Reagenz exakt 2 min lang
inkubiert. Als Startreagenz wurden 100 µl einer CaCl2-Lösung (25 mmol) zugegeben,
zeitgleich die in das Gerät eingebaute Stoppuhr gestartet, der Testansatz durch Schwenken
kurz durchmischt und der Elektrodenhalter in den Testansatz eingesetzt sowie die Zeit bis zur
Fibrinbildung gemessen.
3.1.3.4.5 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII-Aktivität
Prinzip:
Da der Faktor VII zum exogenen System gehört, wird ein Test auf der Basis des PT-
Testsystems verwandt. Dem verdünnten Probenplasma wird humanes Faktor VII-
Mangelplasma zugefügt, so daß der Faktor VII-Gehalt der Probe der bestimmende Faktor ist.
Wie bei der PT-Messung wird durch Zugabe von Gewebsthromboplastin und Ca2+-Ionen das
exogene System aktiviert und die Zeit bis zur Fibrinbildung gemessen (MISCHKE 1994b,
MISCHKE 2001).
Durchführung:
Auch die FVII:C-Aktivität wurde mit dem Koagulometer nach Schnitger und Gross ermittelt.
Die Plasmaprobe wurde zuvor 1:40 mit DBA-Puffer verdünnt (25 µl Probe + 975 µl DBA-
40
Puffer). Von dieser Probenverdünnung wurden 50 µl in ein Kunststoffprobengefäß gegeben
und mit 50 µl humanem Faktor VII-Mangelplasma versetzt und dann 2 min inkubiert. Durch
Zugabe von 200 µl PT-Reagenz wurde die Reaktion zur Fibrinbildung gestartet und – wie
oben beschrieben – die Gerinnungszeit automatisch gemessen.
Auch hier wurde – analog zu der Beschreibung bei der PTMT-Bestimmung – eine
Referenzkurve mit Poolplasma erstellt, um anhand des gemessenen Sekundenwertes die
Aktivität in Prozent der Norm angeben zu können. Lag der Sekundenwert unterhalb der
Grenzzeit des 200 %-Aktivitätswertes, so erfolgten Wiederholungsmessungen bei höheren
Verdünnungen und Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors für die Ergebnisermittlung.
3.1.3.4.6 Bestimmung der humanen Faktor VIIa-Antigen-Konzentration
Prinzip:
Der ELISA zur Messung der Faktor VIIa-Antigen-Konzentration (FVIIa:Ag) folgt dem
Prinzip eines sogenannten Sandwich-ELISAs. Er ist asymmetrisch, denn Fänger- und
Detektionsantikörper sind voneinander verschieden. Eine ELISA-Platte wird mit einer Lösung
mit Fänger-Antikörpern (hier monoklonale anti-humaner Faktor VIIa-Antikörper) beschichtet.
In einer längeren Inkubation binden die Antikörper an die Platte bei 4°C. Dann wird die
Lösung mit nichtgebundenen Antikörpern durch mehrere Waschschritte entfernt.
Anschließend wird das zu untersuchende Plasma hinzugegeben und die Platte für eine
bestimmte Zeit inkubiert. In dieser Zeit kann vorhandenes Antigen (hier humaner Faktor
VIIa) an die plattengebundenen Antikörper binden. Nach abermaligen mehrmaligen
Waschschritten wird eine Lösung mit enzymgekoppelten Detektionsantikörpern (hier
polyklonale anti-humaner Faktor VII-Antikörper) hinzugegeben und der Testansatz für eine
weitere Periode inkubiert. Danach wird eine Lösung mit einem Substrat hinzugegeben, das
spezifisch vom Enzym des Detektionsantikörpers umgesetzt wird. Die Umsetzung des
Substrates ist gekoppelt mit einer Veränderung des pH-Wertes. Ein Farbindikator zeigt diese
pH-Wert-Änderung durch Farbveränderung an, die proportional zum vorhandenen Antigen ist
und photometrisch gemessen wird. Anhand von auf der gleichen Platte mitgetesteten
Referenzverdünnungen mit verschiedenen Konzentrationen von rhFVIIa wird das Ergebnis
quantifiziert.
41
Durchführung:
Die Bestimmung der FVII:Ag-Konzentration mittels des ELISA-Tests wurde im Labor der
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
Zunächst wurden die Pufferlösungen vorbereitet.
Für den „A-Puffer“ wurden 0,795 g Na2CO3 x H2O (15 mmol/l) zusammen mit 1,470 g
NaHCO3 (35 mmol/l) in 500 ml Aqua bidestillata gelöst. Die Lösung wurden – falls
notwendig – mittels konzentrierter Salzsäure (37 %) oder 3 N Natronlauge auf einen pH-Wert
von 9,6 eingestellt.
Der „B-Puffer“ bestand aus 1,725 g NaH2PO4 x H2O (2,5 mmol/l), 5,325 g Na2HPO4 x 7 H2O
(7,5 mmol/l), 42,369 g NaCl (145 mmol/l) in 5 l Aqua bidestillata gelöst und dann mit 5 ml
Tween 20 (0,1% v/v) versetzt. Die Lösung wurde wie oben beschrieben auf einen pH-Wert
von 7,2 eingestellt.
Der „C-Puffer“ wurde durch Lösung von 3,199 g C6H8O7 x H2O (33 mmol/l) und 4,733g
Na2HPO4 x 2 H2O (66,7 mmol/l) in 500 ml Aqua bidestillata hergestellt und der pH-Wert wie
oben dargestellt auf 5,0 eingestellt.
Zuerst wurde in einem Vorversuch untersucht, welche Vorverdünnungen des rhFVIIa in „B-
Puffer“ bzw. in Hunde-Poolplasma mit diesem ELISA adäquate Resultate lieferten. Dabei
wurden Verdünnungsstufen des rhFVIIa ausgeschlossen, deren Testergebnisse am oberen
oder unteren meßtechnischen Limit lagen, da die Resultate keine genaue Zuordnung zu
bestimmten Konzentrationen erlaubten. So wurden jeweils drei Konzentrationen für rhFVIIa
in „B-Puffer“ bzw. das Plasma der mit rhFVIIa behandelten Hunde zu den entsprechenden
Probenentnahmezeitpunkten ermittelt (Daten des Vorversuchs: siehe Tab. TA1, tabellarischer
Anhang).
Um festzustellen, ob der Antikörper auch kaninen Faktor VIIa erkennt, wurde ein weiterer
Vorversuch durchgeführt. Dazu wurde mit dem ELISA-Testsystem Hunde-Poolplasma mit
verschiedenen Konzentrationen von rhFVIIa und einem Leerwert verglichen. Hierbei zeigte
das Hunde-Poolplasma ein Signal in der gleichen Größenordnung wie der Leerwert, während
die rhFVIIa-Verdünnungen sehr hohe Werte ergaben. Dies zeigte, daß der ELISA den Faktor
VIIa des Hundes nicht detektiert (Ergebnisse des Vorversuchs: Siehe Tab. TA1).
Zum Beschicken der Platten für den Hauptversuch wurde in jede Vertiefung einer F96
Maxisorb ELISA-Platte 75 µl einer Lösung des monoklonalen Maus-anti-humaner Faktor
42
VIIa-Antikörpers in „A-Puffer“ mit einer Endkonzentration von 2,5 µg/ml gegeben. Dann
wurde die Platte 12 h bei 4 °C stehen gelassen. Die überstehende Lösung wurde dann durch
5 Wasch-Schritte mit „B-Puffer“ entfernt. Die PAP-Proben der Hunde der verschiedenen
Probenentnahmen-Zeitpunkte wurden auf 1:100, 1:1000, 1:10000 mit „B-Puffer“ verdünnt,
dann wurden die Verdünnungen auf die Platte verbracht. Neben den PAP-Proben wurden als
Standard Verdünnungen von rhFVIIa in „B-Puffer“ 1:100000, 1:300000, 1:1000000
aufgebracht. Alle Verdünnungen wurden als Doppelansatz aufgetragen. Anschließend wurde
1 h auf dem Rüttler inkubiert. Erneut wurden weitere fünf Waschschritte mit „B-Puffer“
angeschlossen. Danach wurde eine Lösung mit Peroxidase-konjugiertem polyklonalen Schaf-
anti-humaner Faktor VII-Antikörper in „B-Puffer“ (Endkonzentration 2 µg/ml) zugegeben
und 60 min auf dem Rüttler inkubiert. Der Überstand mit ungebundenen Antikörpern wurde
durch 5 Waschschritte mit „B-Puffer“ entfernt und jede Vertiefung mit 75 µl einer
organischen Wasserstoffperoxid-Lösung (1 ml TMB, 1,5 mg/ml Dimethylsulfoxid + 10 ml
„C-Puffer“ + 40 µl 3%ige Wasserstoffperoxid-Lösung) beschickt, sowie für 10 min im
Dunkeln stehen gelassen. Danach wurde die Reaktion mit 50 µl 1N H2SO4 pro Vertiefung
gestoppt und im ELISA-Lesegerät Dynex 500 bei 450 nm als Testfilter und 630 nm als
Referenzfilter wurden die optischen Dichten photometrisch gemessen. Die Belegung der
ELISA-Platten wird schematisch in Tabelle 7, die Durchführung in Tabelle 8 dargestellt.
43
Tab. 7: Schematische Darstellung der Mikrotiterplattenbelegung zur Durchführung des
ELISAs zum Nachweis der humaner Faktor VIIa-Antigen-Konzentration mit den verdünnten
Citratplasmaproben eines Hundes, dem rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa)
injiziert wurde. Angegeben sind die Reihen A bis H und die Spalten 1 bis 12 und die
Probenbelegung mit den entsprechenden Verdünnungen der plättchenarmen Plasmen der
entsprechenden Probenentnahmezeitpunkte. Die Standardverdünnungen von rhFVIIa als
Referenz sind grau unterlegt.
Probe 1-15 = Blutprobenentnahmen zu den Zeitpunkten vor und 2, 5, 10,15, 30 min, 1, 1,5 , 2, 3, 4, 6, 8 ,12 und 24 h nach Injektion von rhFVIIa
Tab. 8: Schematische Darstellung der Durchführung des ELISAs zum Nachweis der
Konzentration des Faktor VIIa-Antigens (FVIIa:Ag) im Hundeplasma.
Schritt Zugegebenes Reagenz (siehe Text)
Volumen pro Vertiefung
Inkubationsdauer und -temperatur
1. Beschichtung Maus-Anti-humaner Faktor VIIa-Antikörper in „A-Puffer“
75 µl 12 h bei 4 °C
2. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 3. Probenzugabe Patientenplasma 75 µl 60 min bei Rt 4. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 5. Detektionsantikörper Schaf-Anti-humaner
FVII-Antikörper in „B-Puffer“
75 µl 60 min bei Rt
6. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 7. Detektionssubstrat 3 % H2O2 + TMB in „C-
Puffer“ 75 µl 10 min im Dunkeln
bei Rt
A-B C-D E-F G-H 1 1: 100000 1: 100 1: 100 1: 100 2 1: 300000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 3
rhFVIIa
1:1000000
Probe 4
1:10000
Probe 8
1:10000
Probe 12
1:10000 4 1: 100 1: 100 1: 100 1: 100 5 1: 1000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 6
Probe 1
1:10000
Probe 5
1:10000
Probe 9
1:10000
Probe 13
1:10000 7 1: 100 1: 100 1: 100 1: 100 8 1: 1000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 9
Probe 2
1:10000
Probe 6
1:10000
Probe 10
1:10000
Probe 14
1:10000 10 1: 100 1: 100 1: 100 1: 100 11 1: 1000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 12
Probe 3
1:10000
Probe 7
1:10000
Probe 11
1:10000
Probe 15
1:10000
44
Fortsetzung Tab. 8 Schritt Zugegebenes Reagenz
(siehe Text) Volumen pro Vertiefung
Inkubationsdauer und -temperatur
8. Reaktionsstop 1 N H2SO4 50 µl sofort 9. Photometrische Messung der optischen Dichte bei 450 gegen 630 nm Rt = Raumtemperatur; TMB= 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin; sec = Sekunden
Die Konzentrationen an Faktor VIIa in den Plasmaproben wurden anhand von
Standardkurven bestimmt, die durch die optischen Dichtewerte der verschiedenen
Verdünnungsstufen der Faktor VIIa Lösung (600 µg/ml) generiert wurden.
Für die Berechnung der FVIIa:Ag-Konzentrationen aus den gewonnen Daten zur optischen
Dichte wurden zunächst für das Referenzserum dessen logarithmierte Verdünnungen (X-
Achse) gegen die logarithmierten optischen Dichten (Y-Achse) aufgetragen und im linearen
Bereich der Dosis-Wirkungskurve die Steigung sowie der Schnittpunkt mit der X-Achse
(Verdünnung) bestimmt. Steigung („slope“) sowie Schnittpunkt der Kurve („intercept“)
gingen anhand folgender Formel in die Computer-gestützte Berechnung der Gehalte (mg/ml)
in den Testproben ein:
rumReferenzse
rumReferenzseProbe
ProberumReferenzseProbe
slope10 intercept)log(OD
Verdünnung x mg/ml = ng/ml−
3.1.3.4.7 Nachweis von kaninen Antikörpern gegen rekombinanten humanen Faktor
VIIa
Zum Nachweis von Antikörpern gegen den rhFVIIa im Hundeserum wurde ein ELISA-
Testsystem mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Hunde-IgG angewandt (BRINKHOUS et al.
1989). Die von BRINKHOUS et al. (1989) angegebene Methode wurde dahingehend
modifiziert, daß Ziegen- statt Kaninchen-Anti-Hunde-IgG verwendet wurde.
Prinzip:
Zur Messung von Antikörpern wird eine Trägerplatte mit dem Antigen überschichtet und
längere Zeit zum Binden des Antigens (hier rhFVIIa) an die Platte bei 4 °C gelagert. Nach
mehreren Waschschritten wird das Patientenserum hinzugegeben und der Testansatz einige
Zeit inkubiert, um eventuell darin befindlichen antigenspezifischen Antikörpern Gelegenheit
45
zur Bindung zu geben. Nach weiteren Waschschritten zur Entfernung des Überstandes werden
enzymkonjugierte Detektionsantikörper hinzugegeben, die spezifisch an eventuell vorhandene
Antikörper aus dem Patientenserum binden. Danach wird ein Substrat zugegeben, das vom
Enzym des Detektionsantikörpers umgesetzt wird und eine Änderung des pH-Wertes
herbeiführt. Die Änderung des pH-Wertes wird mittels eines Farbindikators photometrisch
messbar gemacht und ist proportional zum umgesetzten Substrat und damit zur Menge der
rhFVIIa-spezifischen Antikörper im Patientenserum.
Durchführung:
Die Bestimmung der kaninen Antikörper gegen rhFVIIa mittels des ELISA-Tests wurde im
Labor der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
Es wurden die gleichen Lösungen von „A-Puffer“, „B-Puffer“ und „C-Puffer“, wie unter
3.1.3.4.6 beschrieben, verwendet. Zur Ermittlung jeweils einer Konzentration für den rhFVIIa
in „A-Puffer“ und den Peroxidase-konjugierten Ziege-Anti-Hund-Antikörper in „B-Puffer“
wurden verschiedene Konzentrationen dieser beiden Lösungen in einem Vorversuch
verglichen. Jeweils vier Verdünnungen der Positivkontrolle (Serum von Patient 10, 2 Wochen
nach rhFVIIa-Gabe), einer Negativkontrolle (Serum von Patient 3 vor rhFVIIa-Gabe), und
einem Leerwert wurden mittels dieses ELISA-Testsystems verglichen. Es wurde für den
Hauptversuch die Kombination von rhFVIIa-Verdünnung und Detektions-Antikörper-
Verdünnung verwendet, bei denen die Ergebnisse proportional zu den jeweiligen Serum-
Verdünnungen waren (Ergebnisse des Vorversuchs: Siehe Tab. TA2)
Für den Hauptversuch wurde jede Vertiefung einer F96 Maxisorb ELISA-Platte mit 75 µl
einer Lösung von rhFVIIa in „A-Puffer“ mit einer Endkonzentration von 4 µg rhFVIIa/ml
beschichtet. Dann wurde die Platte 12 h bei 4 °C stehen gelassen. Danach wurde die Lösung
mit ungebundenen Antikörpern durch 5 Wasch-Schritte mit „B-Puffer“ entfernt. Neben den
Patienten-Seren wurden nun Vergleichs-Seren von gesunden unbehandelten Hunden und
Patient 3 (vor rhFVIIa-Gabe) als Negativkontrollen und Serum von Patient 10 (2 Wochen
nach Behandlung) als Positivkontrolle verwendet. Die Seren der Patienten vor der
Behandlung und die Negativ-Kontrollen wurden auf 1: 4000, 1: 8000, 1: 16000 und 1:32000
mit „B-Puffer“ verdünnt. Nach Ergebnissen des Vorversuchs wurden die Seren, die den
Patienten 2, 4 und 12 Wochen nach rhFVIIa-Gabe abgenommen wurden und die
46
Positivkontrolle (Serum des Patienten 10, 2 Wochen nach rhFVIIa-Gabe) in höheren
Verdünnungen von 1: 40000, 1: 80000, 1: 160000 und 1:320000 in „B-Puffer“ eingesetzt.
Von den verdünnten Seren wurden 75 µl pro Vertiefung auf die Platte verbracht und 1 h auf
dem Rüttler inkubiert. Nach weiteren 5 Waschschritten mit „B-Puffer“ zur Entfernung des
Überstandes von ungebundenen Antikörpern wurde eine Lösung mit Peroxidase-konjugierten
Ziege-Anti-Hund-Antikörpern in „B-Puffer“ (6 µl Antikörper-Lösung auf 15 ml Puffer)
zugegeben und 45 min auf dem Rüttler inkubiert. Erneut wurde der Überstand mit
ungebundener Antikörper-Lösung durch 5 Waschschritte mit „B-Puffer“ entfernt und
anschließend mit 75 µl pro Vertiefung einer TMB-Lösung in „C-Puffer“ mit 3 % H2O2 (siehe
1.3.4.5.) für 10 min im Dunkeln stehen gelassen. Die Reaktion wurde zuletzt mit 50 µl 1N
H2SO4 pro Vertiefung gestoppt und im ELISA-Lesegerät bei 450 nm als Testfilter gegen 630
nm als Referenzfilter photometrisch gemessen. Die Belegung der ELISA-Platten wird
schematisch in Tabelle 9, die Durchführung in Tabelle 10 dargestellt. Für die Berechnung des
Antikörpergehaltes einer Probe wurde ein Serum, welches 2 Wochen nach Faktor VIIa
Applikation gewonnen wurde (Patient 10, 2 Wochen), als Referenzserum definiert und dessen
Gehalt an Antikörpern gegen Faktor VIIa mit 100 ELISA-Units definiert. Dieses Serum
wurde auf allen Mikrotiterplatten in mehreren Verdünnungen eingesetzt, um aus der Steigung
der Kurve („slope“) und dem errechneten Schnittpunkt mit der X-Achse (Kurve:
log(Verdünnung) vs. log(OD)) die Gehalte der anderen zu prüfenden Seren nach der
folgenden Formel zu errechnen.
rumReferenzse
rumReferenzseProbe
ProbeProbe
slope10 intercept)log(OD
Verdünnung x 100 = Units−
47
Tab. 9: Anordnung der Proben auf der F96 Maxisorb-ELISA-Platte zur Messung von kaninen
Antikörpern gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa). Angegeben sind die
Reihen A bis H und die Spalten 1 bis 12, die Probenbelegung der Bereiche in den
entsprechenden Verdünnungen jeweils als Doppelmessung. Alle Kontrollproben-
verdünnungen sind grau unterlegt, die übrigen Probenverdünnungen sind vom jeweils zu
untersuchenden Patienten vor und 2, 4 und 12 Wochen nach rhFVIIa-Gabe.
Negativkontrollen: Patient 3 (0-Wert), 4 gesunde Hunde 1-4 Positivkontrolle: Patient 10 (2 min-Wert)
Tab. 10: Schematische Darstellung der Arbeitsschritte zur Durchführung des ELISAs zum
Nachweis von kaninen Anikörpern gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa).
Schritt zugegebene Reagenz (siehe Text)
Volumen pro Vertiefung
Inkubationsdauer und -temperatur
1. Beschichtung rhFVIIa 4µg/ml in „A-Puffer“ 75 µl 12 h bei 4 °C 2. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 3. Probenzugabe Patientenserum 75 µl 60 min bei Rt 4. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 5. Detektionsantikörper Ziegen-Anti-Hunde IgG
Antikörper in „B-Puffer“ 75 µl 45 min bei Rt
6. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 7. Detektionssubstrat 3 % H2O2 + TMB in „C-
Puffer“ 75 µl 10 min im
Dunkeln bei Rt 8. Reaktionsstop 1 N H2SO4 50 µl sofort 9. Photometrische Messung bei 450 gegen 630 nm Rt = Raumtemperatur; TMB= 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin; sec = Sekunden
1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 Patient 3:
0-Wert Patient 10: 2 Wochen
Referenz- Hund 1
Referenz- Hund 2
Referenz- Hund 3
Referenz- Hund 4
A 1: 4.000 1: 40.000 1: 4.000 1: 4.000 1: 4.000 1: 4.000 B 1: 8.000 1: 80.000 1: 8.000 1: 8.000 1: 8.000 1: 8.000 C 1: 16.000 1:160.000 1: 16.000 1: 16.000 1: 16.000 1: 16.000 D 1: 32.000 1:320.000 1: 32.000 1: 32.000 1: 32.000 1: 32.000 Patient
0-Wert Patient 2 Wochen
Patient 4 Wochen
Patient 12 Wochen
Leerwert Leerwert
E 1: 4.000 1: 40.000 1: 40.000 1: 40.000 0 0 F 1: 8.000 1: 80.000 1: 80.000 1: 80.000 0 0 G 1: 16.000 1:160.000 1:160.000 1:160.000 0 0 H 1: 32.000 1:320.000 1:320.000 1:320.000 0 0
48
3.1.4 Pharmakokinetische Berechnungen
Die pharmakokinetischen Berechnungen wurden im Institut für Pharmakologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Mit einem Software-Programm (Top FIT
2,0, Springer-Verlag, Berlin) wurden basierend auf den FVII:C-Aktivitäten und den humanen
FVIIa:Ag-Konzentrationen Daten zur Pharmakokinetik ermittelt. Die Berechnungen wurden
gemäß den Angaben von KOCH und RITSCHEL (1986) durchgeführt. Bei den Berechnungen
basierend auf der FVII:C-Aktivität wurde von jedem Aktivitätswert der Plasmaproben nach
Injektion der Ausgangswert abgezogen, um isoliert den exogen zugeführten humanen FVIIa
zu erfassen. Bei den Berechnungen auf der Basis der FVII:C-Aktivitäten wurden Werte unter
20 %, bei Berechnungen basierend auf der FVIIa:Ag-Konzentration Werte unter 2 ng/ml
ausgeschlossen, um testimmanente unspezifische Reaktionen zu minimieren. Bei den
Berechnungen basierend auf der rhFVIIa:Ag-Konzentration wurde das Einkompartment-
Modell verwendet und die Berechnungen basierend auf der FVII:C wurden mit dem
Zweikompartment-Modell durchgeführt.
Die Plasmakonzentration von rhFVIIa gehorcht im Einkompartment-Modell der Formel:
teAC ×−×= α (A ist ein Koeffizient)
Die Plasmakonzentration von rhFVIIa gehorcht im Zweikompartment-Modell der Formel:
tt eBeAC ×−×− ×+×= βα (A und B sind Koeffizienten)
Die terminale Halbwertszeit (t50) wurde berechnet mit der Formel:
t50 =β
)2ln( =β693,0
Die Berechnung der Fläche unter der Kurve (Area under the curve, AUC) erfolgte mit der
Formel:
AUCβ
txtx
C=∞→
Das Verteilungsvolumen auf der Basis der Eliminationskonstante β (Vdβ) wurde mit folgender
Formel berechnet:
Vdβ=β×AUC
Dosis
49
3.1.5 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Meßergebnisse wurde mit dem GFA-Statistik-
Programmpaket von BUSCHER, ENGELS und KRAUTH durchgeführt. Für die annähernd
standardnormalverteilten Meßergebnisse jeder Gruppe wurde zu jedem Meßzeitpunkt der
Mittelwert ( ) und die Standardabweichung (s) berechnet. Die Meßergebnisse innerhalb der
Gruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit Meßwiederholung auf
Unterschiede zwischen verschiedenen Zeitpunkten geprüft. Zudem wurden die Ergebnisse
nach der Injektion mittels des paarigen t-Tests gruppenintern mit dem Initialwert verglichen.
Ergänzend wurde für die Gruppen mit den gesunden Hunden (Gruppe I und III) eine
zweifaktorielle Varianzanalyse berechnet. Da sich die Gruppen mit den Faktor VII-
defizienten Hunden (Gruppe II und IV) in der Anzahl der Tiere unterschieden und kein
entsprechendes Auswertungsprogramm zur Verfügung stand, wurde hier auf eine
zweifaktorielle sowie insgesamt auf eine dreifaktorielle Auswertung verzichtet. Die
pharmakokinetischen Daten der einzelnen Gruppen wurden mit t-Test verglichen. Eine
Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 wurde als signifikant angesehen.
50
4 Ergebnisse
4.1 Klinische Verträglichkeit
Das Medikament wurde von allen Tieren gut vertragen, lediglich ein gesunder Hund (Hund
Nr. 5), der 100 µg/kg rhFVIIa erhielt, zeigte 2 h nach Injektion inguinal eine leichte
Quaddelbildung ohne Zeichen von Pruritus, die ohne medikamentelle Intervention nach 30
min verschwunden war.
4.2 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII:C-Aktivität
Mit der zweifaktoriellen Varianzanalyse war für die FVII:C-Aktivität ein deutlicher
dosisabängiger Unterschied zwischen den Gruppen mit den gesunden Hunden (Gruppe I und
III) festzustellen (p<0,0001). Auch zwischen den Zeitpunkten war ein deutlicher Unterschied
erkennbar (Faktor B, p<0,0001) und zwischen diesen beiden Faktoren war eine deutliche
Wechselwirkung zu demonstrieren (Faktor AB, p<0,0001). Bei allen 4 Untersuchungsgruppen
waren mit der einfaktoriellen Varianzanalyse deutliche Unterschiede zwischen den
Probenentnahmezeitpunkten feststellbar (p<0,0001). Die Aktivitäten des FVII:C stiegen 2
min nach rhFVIIa-Injektion bei allen Tieren deutlich an (Tab. 11, Einzelwerte: Siehe Tab
TA3, tabellarischer Anhang) (p-Wert t-Test, pt<0,05). Das Maximum des Gruppenmittels
wurde in den ersten drei Gruppen nach 5 min (Gruppe I: 451 ± 24,9 %, Gruppe II: 465 ± 27,5
%, Gruppe III: 2196 ± 138 %) und in Gruppe IV bereits nach 2 min erreicht (1912 ± 127 %).
Abgesehen von Gruppe IV wurde das Ausgangsniveau nach 24 h wieder erreicht (p<0,05).
51
Tab. 11: Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII:C-Aktivität in Prozent, Mittelwerte
( ) und Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen
rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten
Hunden.
Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
86 446* 451* 424* 412* 368* 326* 302* 272* 206* 169* 134* 118* 98* 86I s 9,8 25,0 24,9 14,9 28,4 33,1 20,7 19,9 15,1 24,4 21,1 22,7 21,2 12,9 15,5 13 441* 465* 447* 422* 388* 323* 275* 221* 156* 105* 74* 43* 25* 14II
s 4,8 27,2 27,5 30,3 22,8 14,4 20,7 19,9 17,4 14,9 11,5 11,3 17,1 12,6 2,8 92 2143* 2196* 2189* 1864* 1612* 1413* 976* 514* 415* 331* 240* 163* 109* 98III
s 15,7 204 138 167 187 111 161 93,8 43,8 47,6 54,7 37,8 27,5 8,1 11,9 15 1912* 1816* 1740* 1584* 1382* 1237* 1001* 661* 433* 337* 271* 122* 54* 17*IV
s 12,3 127 29,1 35,0 46,5 64,3 111 57,7 146 74,5 67,3 63,1 20,1 18,1 11,9 * = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden 4.3 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor VII:C-Aktivität Die Mittelwerte der aus der FVII:C-Aktivität errechneten relativen Ausgangskonzentrationen
(C0-ber) lagen bei 430 ∆% (Gruppe I) und 509 ∆% (Gruppe II), und bei den Gruppen mit der
höheren Dosierung bei 2345 ∆% (Grupppe III) und 2047 ∆% (Gruppe IV) (Tab. 12,
Einzelwerte: Siehe Tab TA4, tabellarischer Anhang). Die gemessene Ausgangskonzentration
(C0-gem) lag im Mittel nur geringgradig unter der C0-ber. Die t50 lag im Mittel mit 98,3 (Gruppe
I), 98,7 min (Gruppen II) und 96,7 min (Gruppe IV) deutlich höher als in der Gruppe mit den
gesunden Hunden und der höheren Dosierung (Gruppe III: 66,3 min). Die Mittelwerte der
AUC lagen in den Gruppen I und II bei 52083 bzw. 65783 ∆% x min, während sie in den
Gruppen mit der höheren rhFVIIa-Dosierung 205667 ∆% x min (Gruppe III) und 242750 ∆%
x min (Gruppe IV) betrugen. Die Cltot lag bei den niedrigdosierten Gruppen auffällig unter
den höher dosierten, ohne deutliche Beeinflussung durch den Faktor-VII-Status. Das
Verteilungsvolumen (Vdβ) lag im Mittel in den Gruppen I, III und IV mit 0,234 l (Gruppe I)
52
0,215 l (Gruppen III) und 0,241 l (Gruppe IV) etwas höher als in Gruppe II: (0,199 l)
(p<0,05). Die Eliminationskonstante β war gleich in den Guppen I, II und IV (0,0070/min),
und mit 0,0105/min höher in der Gruppe III mit gesunden Tieren, denen 500µg/kg KM
rhFVIIa verabreicht wurden.
Tab. 12: Mit einem pharmakokinetischen Programm anhand der koagulometrisch bestimmten
Faktor VII-Aktivität errechneten Mittelwerte und Standardabweichungen der Ergebnisse der
Gruppen von gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden nach Injektion von verschiedenen
Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa, siehe Legende). Dargestellt
sind die berechnete Anfangskonzentration (C0-ber), gemessenen Anfangskonzentration (C0-gem)
(∆%: korrigierte Aktivität (Substraktion des Nullwertes ≙ endogenen Faktor VII-Aktvität) in
%), Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC),
Verteilungsvolumen (Vdβ) und Eliminationskonstante (β) nach Injektion von rhFVIIa sowie
Ergebnisse des statistischen Gruppenvergleiches.
Rechenwert C0-ber C0-gem t50 Cltot AUC Vdβ β Einheit (∆%/ml) (∆%/ml) (min) (ml/min) (∆% x min) (l) (1/min)
430 413 98,3 0,0019 52083 0,234 0,0070 Gruppe I s 36 31 1,22 0,0001 4192 0,020 0,0000 509 495 98,7 0,0015 65783 0,199 0,0070 Gruppe II s 53 43 0,46 0,0001 3705 0,022 0,0000 2345 2245 66,3 0,0244 205667 0,215 0,0105 Gruppe III s 310 202 3,10 0,0016 12628 0,024 0,0005 2048 2003 96,7 0,0207 242750 0,241 0,0070 Gruppe IV s 99 77 4,55 0,0007 9179 0,014 0,0000
Statistischer Gruppenvergleich (p-Werte, t-Test) Gruppe I/II 0,0933 0,0017 0,7799 0,0001 0,0007 0,0080 0,7995 Gruppe I/III <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0776 <0,0001Gruppe I/IV <0,0001 <0,0001 0,7862 <0,0001 <0,0001 0,2811 0,0536 Gruppe II/III <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,1281 <0,0001Gruppe II/IV <0,0001 <0,0001 0,8497 <0,0001 <0,0001 0,0051 0,9638 Gruppe III/IV 0,05269 0,02698 0,2137 0,0005 0,0005 0,0409 0,0459 = Mittelwert; s= Standardabweichung Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
53
4.4 Konzentration des humanen Faktor VIIa-Antigens
Zwischen den beiden Gruppen (I und III) mit gesunden Tieren zeigte die zweifaktorielle
Varianzanalyse für die FVIIa:Ag-Konzentration einen deutlichen Unterschied zwischen den
zwei Dosierungsgruppen (Faktor A, p<0,0001). Es war ebenfalls ein deutlicher Unterschied
zwischen den Zeitpunkten (Faktor B, p<0,0001) sowie eine deutliche zeitpunktabhängige
Wirkung zwischen den beiden Faktoren (AB, p<0,0001) festzustellen. Das Ergebnis der
einfaktoriellen Varianzanalyse zeigte auffällige Unterschiede der FVIIa:Ag-Konzentration
zwischen den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten in allen Gruppen (Gruppe I-III:
p<0,0001, Gruppe IV: p=0,0002). Die Werte der FVIIa:Ag-Konzentration stiegen 2 min nach
rhFVIIa-Gabe in allen Gruppen deutlich an (pt<0,05) und erreichten im Maximum Werte von
29,0 (Gruppe 1), 35,7 (Gruppe 2), 145 (Gruppe 3) und 142 ng/ml (Gruppe 3) (Tab. 13,
Einzelwerte: Siehe Tab. TA5, tabellarischer Anhang).
Tab. 13: Bestimmung der Faktor VII-Antigen-Konzentration, Mittelwerte ( ) und
Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten
humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.
Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
0,5 26,9* 29,0* 21,9* 17,1* 12,2* 9,0* 7,9* 4,8* 2,9* 2,4* 1,9* 1,4* 0,9 0,7*I s 0,3 3,1 3,4 1,1 2,1 2,0 2,0 2,3 2,1 1,3 1,2 1,6 1,2 0,7 0,4 0,5 32,9* 35,7* 27,2* 20,2* 15,5* 11,8* 9,0* 7,3* 4,5* 3,6* 1,9* 1,2* 0,9* 0,8*II
s 0,3 3,5 4,5 3,8 5,8 4,4 3,6 3,4 3,4 1,6 1,4 1,3 0,9 0,6 0,5 0,7 145* 145* 134* 114* 82,4* 50,9* 48,1* 34,1* 27,1* 21,9* 6,9* 3,3* 1,6* 0,8 III
s 0,2 12,0 7,7 8,7 10,2 14,4 7,2 7,6 5,6 3,9 2,8 4,6 1,7 1,1 0,5 0,6 142* 141* 120* 76,6* 52,2* 33,7* 22,3* 19,0* 14,1* 10,1* 4,6* 3,1* 2,2* 0,9*IV
s 0,0 7,6 4,0 12,9 2,4 3,5 6,5 3,0 2,1 1,3 4,1 1,2 1,0 1,1 0,3 * = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
54
4.5 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor VIIa-Antigen-
Konzentration
Die berechnete Ausgangskonzentration (C0-ber) lag bei 34,9 ± 4,4 ng/ml (Grupppe I) und 48,6
± 10,2 ng/ml (Gruppe II), und nach Gabe der höheren Dosierung bei 163 ± 11,8 ng/ml
(Grupppe II) und 167 ± 17,6 ng/ml (Gruppe IV) (Tab. 14, S. 55, Originalwerte: Siehe Tab.
TA6, tabellarischer Anhang). Die gemessene Ausgangskonzentration (C0-gem) lag im Mittel
nur geringgradig unter der C0-ber. Die t50 lag in allen Gruppen im Mittel zwischen 80 und 90
min ohne wesentliche Unterschiede zwischen den Dosierungen und der Frage ob es sich um
gesunde oder Faktor-VII-defiziente Hunde handelte. Die Mittelwerte der AUC lag in den
Gruppen I und II bei 1982 ± 497 bzw. 2558 ± 774 ng/ml x min, während sie in den Gruppen mit
der höheren rhFVIIa-Dosierung 13038 ± 1661 ng/ml x min (Gruppe III) und 8513 ± 1459 ng/ml
x min (Gruppe IV) betrugen. Der t-Test zeigte deutliche Unterschiede zwischen den
verschiedenen Dosierungsgruppen beim Vergleich der Gruppe I mit III, I mit IV, II mit III
sowie II mit IV (in allen Fällen pt=0,0000). Die Mittelwerte der Vdβ betrugen in allen
Gruppen zwischen 2,13 und 3,02 l, wobei die höheren Dosierungen mit einem höheren Vdβ als bei mit 100 µg/kg behandelten FVII-Mangel-Hunden (Gruppe II), nicht aber den gesunden
Hunden (Gruppe I) verbunden waren. Beim Vergleich mit dem t-Test zeigte sich nur ein
deutlicher Unterschied zwischen der Gruppe II und den beiden Gruppen mit der höheren
Dosierung (p<0,01). Die Mittelwerte des Koeffizienten β lagen bei 0,0082 ± 0,0013/min in
Gruppe I, 0,0113 ± 0,0096/min in Gruppe IV, und 0,0082 ± 0,0019/min bzw. 0,0085 ±
0,0037/min in den Gruppen II und III.
55
Tab. 14: Mit einem pharmakokinetischen Programm anhand der Faktor VII-Antigen-
Konzentration errechnete Mittelwerte und Standardabweichungen der Ergebnisse der
Gruppen von gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden nach Injektion von verschiedenen
Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) (siehe Legende). Dargestellt
sind die berechnete Anfangskonzentration (C0-ber), gemessene Anfangskonzentration (C0-gem),
Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC), Verteilungsvolumen
(Vdβ) und Eliminationskonstante (β) nach Injektion von rhFVIIa sowie Ergebnisse des
statistischen Gruppenvergleichs.
= Mittelwert; s= Standardabweichung Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
Rechenwert C0-ber C0-gem t50 AUC Cltot Vdβ β Einheit (ng/ml) (ng/ml) (min) (ng/ml x min) (ml/min) (l) (1/min)
34,9 33,8 86,6 1982 53,1 2,9 0,0082Gruppe I s 4,34 3,97 13,8 497 12,7 3,0 0,0013 48,6 46,0 88,1 2558 42,3 2,13 0,0082Gruppe II s 10,2 8,5 17,4 774 13,6 0,41 0,0019 163 160 89,6 13038 37,9 3,02 0,0085Gruppe III s 11,8 10,9 22,8 1661 6,18 0,29 0,0037 167 163 81,0 8513 63,6 3,00 0,0113Gruppe IV s 17,6 15,2 35,4 1459 15,3 0,32 0,0097
Statistischer Gruppenvergleich (p-Werte, t-Test) Gruppe I/II 0,0063 0,0046 0,4360 0,0779 0,9076 0,9960 0,8266Gruppe I/III <0,0001 <0,0001 0,3955 <0,0001 0,9876 0,2903 0,8200Gruppe I/IV <0,0001 <0,0001 0,6818 <0,0001 0,0534 0,3472 0,7006Gruppe II/III <0,0001 <0,0001 0,4514 <0,0001 0,7542 0,0008 0,4299Gruppe II/IV <0,0001 <0,0001 0,7029 <0,0001 0,0099 0,0038 0,1801Gruppe III/IV 0,2919 0,3765 0,7128 0,9997 0,0010 0,5355 0,2165
56
4.6 Prothrombinzeit
a) Prothrombinzeit-Standardtest
Das Ergebnis der zweifaktoriellen Varianzanalyse für die PTST-Werte der Gruppen I und III
mit gesunden Tieren zeigte weder deutliche Unterschiede zwischen den beiden Dosierungen
(Faktor A, p=0,9384), noch einen zeitpunktabhängigen Effekt (Wechselwirkung AB,
p=0,0592). Es war nur ein deutlicher Unterschied zwischen den Zeitpunkten (Faktor B,
p=0,0000) erkennbar. Die einfaktorielle Varianzanalyse der PTST zeigte in allen Gruppen
deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten auf (Gruppe
I: p=0,0002, Gruppe II: p<0,0001, Gruppe III: p=0,0001, Gruppe IV: p=0,0002). (Tab. 15).
Lokale Vergleiche mittels t-Test zeigten, daß die PTST-Werte in allen Gruppen 2 min nach
rhFVIIa-Gabe sich deutlich verkürzten (pt<0,001) und den Ausgangswert bis zum Ende des
Versuchs (24 h) nicht mehr erreichten (pt<0,05) (Einzelwerte und Original pt-Werte: Siehe
Tab. TA7, tabellarischer Anhang).
Tab. 15: Prothrombinzeit-Standardtest in Sekunden, Mittelwerte ( ) und Standardabweichung
(s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa
(rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.
* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
6,75 3,93* 3,98* 4,11* 4,03* 4,13* 4,33* 4,25* 4,43* 4,53* 4,81* 4,83* 5,05* 5,16* 5,40* I s 1,01 0,10 0,16 0,23 0,3 0,39 0,48 0,36 0,36 0,56 0,62 0,66 0,31 0,52 0,94 16,50 3,98* 3,98* 4,06* 3,93* 4,02* 4,12* 4,10* 4,43* 4,50* 4,98* 5,68* 6,18* 8,37* 14,70*II
s 1,20 0,18 0,12 0,22 0,21 0,24 0,16 0,20 0,31 0,31 0,25 0,18 0,38 0,78 1,53* 7,01 4,10* 4,17* 4,15* 4,15* 4,15* 4,18* 4,20* 4,21* 4,30* 4,53* 4,57* 4,81* 5,25* 6,18 III
s 0,73 0,25 0,34 0,29 0,29 0,20 0,26 0,28 0,31 0,19 0,12 0,15 0,31 0,61 0,95 14,68 4,03* 4,03* 3,95* 3,95* 4,02* 4,18* 4,10* 4,22* 4,45* 4,55* 4,67* 5,40* 6,58* 10,95*IV
s 1,57 0,13 0,17 0,17 0,26 0,13 0,15 0,14 0,31 0,33 0,44 0,69 0,70 0,80 1,38
57
b) Prothrombinzeit-modifizierter Test
Die zweifaktorielle Varianzanalyse zwischen den beiden Gruppen mit gesunden Tieren (I und
III) ergab für den PTMT einen deutlichen Unterschied zwischen den zwei Dosierungsgruppen
(Faktor A, p=0,0035). Es war ebenfalls ein deutlicher Unterschied zwischen den Zeitpunkten
(Faktor B, p<0,0001) sowie eine deutliche zeitpunktabhängige Wirkung zwischen den beiden
Faktoren (AB, p<0,0001) festzustellen. Das Ergebnis der einfaktoriellen Varianzanalyse von
der PTMT zeigte auffällige Unterschiede zwischen den verschiedenen
Probenentnahmezeitpunkten in allen Gruppen (Gruppe I: p<0,0001, Gruppe II: p=0,0001,
Gruppe III: p=0,0005, Gruppe IV: p=0,0147). Die PTMT-Werte stiegen 2 min nach rhFVIIa-
Gabe in allen Gruppen deutlich an (Tab. 16) (pt<0,05) und erreichten im Maximum Werte
von 155 % (Gruppe I), 144 % (Gruppe II), 249 % (Gruppe III) und 209 % (Gruppe IV).
Abhängig von Dosis und dem Vorhandensein eines Faktor-VII-Mangels wurde das
Ausgangsniveau nach 12-24 h wieder erreicht (pt>0,05). (Einzelwerte und Original pt-Werte:
Siehe Tab. TA8, tabellarischer Anhang).
Tab. 16: Prothrombinzeit-modifizierter Test in Prozent der Norm, Mittelwerte ( ) und
Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten
humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.
Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
71.7 155* 145* 143* 143* 135* 129* 123* 117* 116* 110* 105* 88,2* 80,0 73,8I s 11,4 21,8 20.9 15,2 10,9 11,1 15,2 12,4 14,1 12,2 15,7 26,3 12,2 10,8 9,1 25,7 144* 144* 146* 143* 140* 134* 123* 117* 96,0* 78,7* 67,5* 54,0* 40,3* 26,7II
s 7,7 15,5 15,4 14,6 19,0 16,4 17,0 7,8 13,2 8,7 20,0 19,1 11,5 5,2 8,3 73,5 227* 235* 249* 182* 195* 179* 168* 163* 153 142 131* 113* 95,2* 74,7III
s 2,16 10,3 31,3 32,8 40,5 36,7 21,6 27,7 29,8 24,6 21,1 23,7 19,9 10,0 8,0 33,5 193* 205* 209* 206* 199* 180* 169* 165* 150* 122* 111* 89,8* 66,5* 44,3IV
s 5,9 102,7 49,7 42,2 45,5 21,0 12,1 20,8 24,4 32,6 37,8 30,8 20,3 15,3 18,4 * = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
58
4.7 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
Die zweifaktorielle Varianzanalyse zwischen den Gruppen mit gesunden Tieren ergab für die
aPTT einen deutlichen Unterschied zwischen den zwei Dosierungen (Faktor A, p=0,0015).
Der Unterschied war auch deutlich zwischen den Zeitpunkten (Faktor B, p<0,0001) sowie
deutlich zeitpunktabhängig zwischen den beiden Faktoren (AB, p<0,0002). Mit der
einfaktoriellen Varianzanalyse ließen sich für die aPTT bis auf Gruppe III keine deutlichen
Unterschiede zwischen den einzelnen Probenentnahmezeitpunkten nachweisen (Gruppe I:
p=0,4245, Gruppe II: p=0,1833, Gruppe IV: p=0,3128) (Tab. 17). Das Resultat der
Varianzanalyse brachte eine deutliche Verkürzung der aPTT bei den gesunden Hunden, die
500 µg/kg rhFVIIa (Gruppe III: p=0,0098) erhalten hatten, zum Ausdruck. Dies hielt
mindestens 1,5 h an (p<0,01). Lokale Vergleiche mit t-Test zeigten während der ersten 30
min nach rhFVIIa-Injektion auch in den übrigen Gruppen partiell eine Verkürzung an
(Einzelwerte und Original p-Werte des t-Tests: Siehe Tab. TA9, tabellarischer Anhang).
Tab. 17: Aktivierte partielle Thromboplastinzeit in Sekunden, Mittelwerte ( ) und
Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten
humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.
Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
16,90 15,90* 16,38* 16,13 16,17 16,13 16,02* 16,82 16,22* 16,08 16,52 16,55 16,33* 16,40 16,41 I s 1,44 1,04 1,46 1,11 1,08 1,12 0,86 2,26 1,24 1,52 1,41 1,30 1,19 0,97 0,74
15,30 15,07 14,73* 14,87* 14,96 15,13 14,26 14,71 14,53 14,63 15,78 15,25 15,40 15,87* 16,35*II
s 0,54 0,79 0,46 0,46 0,78 0,93 1,32 2,03 1,30 1,53 1,83 0,88 1,16 0,92 1,11
14,68 12,97* 13,20* 13,03* 13,28* 13,37* 13,78* 13,98* 14,30 14,25 15,05 14,70 15,08 14,81 14,90 III s 0,27 0,35 0,41 0,42 0,41 0,53 0,56 0,53 0,84 0,88 1,34 1,23 1,28 1,07 0,98
15,22 14,28 14,28 14,18 14,20* 14,32* 14,60 14,55 14,70 14,78 14,88 14,78 14,83 14,75 14,83 IV s 1,28 1,97 1,61 1,91 1,92 1,75 1,69 1,74 1,98 1,52 1,30 1,36 1,34 1,34 1,14
* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
59
4.8 Thrombozytenzahl
Die zweifaktorielle Varianzanalyse der Thrombozytenzahl der Gruppen I und III (gesunde
Tiere) zeigte keine deutlichen Unterschiede zwischen den beiden Dosierungen (Faktor A,
p=0,2831), sowie keine zeitpunktabhängigen Unerschiede zwischen den beiden Faktoren
(AB, p=0,0910). Ein deutlicher Unterschied war zwischen den Zeitpunkten (Faktor B,
p<0,0001) sichtbar. Die einfaktorielle Varianzanalyse zeigte keine deutlichen Unterschiede
bei der Thrombozytenzahl in den Gruppen I, II und IV (Gruppe I: p=0,1898, Gruppe II:
p=0,5050, Gruppe IV: p=0,1351). Entsprechend dem Ergebnis der einfaktoriellen
Varianzanalyse (p=0,0225) lag die mittlere Thrombozytenzahl beim überwiegenden Teil der
Meßzeitpunkte in Gruppe III hingegen deutlich unter dem Ausgangswert (p<0,05, t-Test).
Eine mit dem t-Test nachweisbare Verminderung der Thrombozytenzahl gegenüber dem
Ausgangswert (p<0,05, t-Test) war in Gruppe I auf die Zeitpunkte 2 und 5 min sowie 6 und
12 h nach rhFVIIa-Injektion begrenzt und trat in den übrigen Gruppen (II und IV) nur
sporadisch auf (Tab. 18) (Einzelwerte und Original p-Werte des t-Tests: Siehe Tab. TA10
tabellarischer Anhang).
Tab. 18: Thrombozytenzahlen in Tausend/µl, Mittelwerte ( ) und Standardabweichung (s)
nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa
(rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.
* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
304 272* 276* 277 263 278 278 279 284 297 284 251* 252* 247* 294 I s 29 26 13 25 35 24 21 36 25 31 30 45 58 47 24 362 343 341 350 346 326* 347 341 339 340 324 329 334 330 347 II
s 60 90 60 62 76 51 64 77 66 57 53 64 82 76 65 332 278* 293* 319 307* 320 312* 305 296* 300* 294 272* 260* 273* 256*III
s 45 67 42 42 30 44 46 48 45 44 35 27 37 54 48 360 319 367 334 401* 404 374 406 344 341 342 313 309 330 340 IV
s 134 141 109 107 128 153 135 173 89 102 81 91 95 75 96
60
4.9 Hämatokrit
Die zweifaktorielle Varianzanalyse der Hämatokrit-Werte der beiden Gruppen mit gesunden
Tieren (I und III) ergab keinen deutlichen Unterschied zwischen den zwei Dosierungen
(Faktor A, p=0,6512). Es war aber ein deutlicher Unterschied zwischen den Zeitpunkten
(Faktor B, p<0,0001) sowie ein deutlicher zeitpunktabhängiger Unterschied zwischen den
beiden Faktoren (Wechselwirkung AB, p<0,0001) zu erkennen (Tab.19). Die einfaktorielle
Varianzanalyse des Hämatokrits der Hunde zeigte während des Versuchs in den meisten
Gruppen nur geringe Schwankungen (Gruppe I: p=0,2136, Gruppe II: p=0,3882, Gruppe IV:
p=0,4092). In der einfaktoriellen Varianzanalyse ließ sich lediglich in Gruppe III (gesunde
Hunde, 500µg/kg rhFVIIa) ein Unterschied zwischen einzelnen Zeitpunkten nachweisen
(Gruppe III: p=0,0441). Dies brachte zum Ausdruck, daß in dieser Gruppe zwischen 1,5 und 8
h nach rhFVIIa-Injektion auffällig niedrigere Hämatokritwerte als initial vorlagen (p<0,05, t-
Test) (Einzelwerte und Original p-Werte des t-Tests: Siehe Tab. TA11 tabellarischer
Anhang).
Tab. 19: Hämatokritwerte in Prozent, Mittelwerte ( ) und Standardabweichung (s) nach
Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa)
bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.
* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
41,1 39,9 42,1 40,4 40,3 41,0 42,2 44,5* 42,5 43,2 41,5 41,8 41,5 41,6 43,0 I s 2,2 1,7 3,0 2,0 1,4 1,4 3,6 4,5 5,0 3,3 3,2 1,7 1,5 2,1 4,0
39,3 38,0 38,1 38,1 38,1 37,9 40,5 38,9 38,7 39,2 38,1 40,6 39,4 39,9 40,7 II s 5,0 3,7 3,9 3,8 2,1 3,8 2,7 3,3 3,2 5,2 5,8 5,9 4,9 3,1 6,5 45,5 43,2 43,4 43,4 43,0 43,4 42,9* 41,6* 40,8* 41,9* 40,2* 40,8* 41,9* 44,0 39,7* III
s 3,0 4,3 4,6 4,0 4,8 3,6 1,4 2,2 2,4 1,7 3,1 3,2 3,1 2,8 2,1 40,7 37,2 40,3 38,3 39,8 38,1 39,3 38,7 40,2 40,1 40,6 40,7 40,2 40,6 39,4 IV
s 7,5 4,0 5,1 5,2 6,0 5,3 5,7 5,6 5,0 4,2 4,7 3,8 4,2 4,6 4,0
61
4.10 Kanine Antikörperbildung gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa
Es ließen sich bei allen Hunden Antikörper gegen rhFVIIa feststellen, jedoch mit individuell
sehr starker Schwankungsbreite. (Tab. 20, Einzelwerte: siehe Tab. TA11, tabellarischer
Anhang). Hunde denen 500µg/kg KM rhFVIIa injiziert (Gruppen III und IV) wurde, zeigten
generell einen höheren Antikörpertiter als Tiere denen 100µg/kg KM injiziert wurde (Gruppe
I und II). Die meisten Hunde wiesen nach 2 Wochen die höchsten Antikörperspiegel auf, was
sich auch am Verlauf des Medians widerspiegelte.
Tab. 20: Verlauf der Antikörperbildung (IgG) gegen rekombinantem humanen Faktor VIIa
(rhFVIIa) (in relativen ELISA-Einheiten) bei vier Gruppen von Hunden (s.u.) zu
verscheidenen Zeitpunkten nach rhFVIIa-Injektion. (Die Nullwerte lagen jeweils < 0,25)
2 Wochen 4 Wochen 12 Wochen t Gr. Median Min. Max. Median Min. Max. Median Min. Max. I 16 4 400 15 7 227 4,5 1 22II 9 1 353 5 0 11 0 0 6III 158 12 304 103 22 264 7,5 0 128IV 93 42 168 49 9 138 28 1 124 Gr.= Gruppe, t= Probenentnahmezeitpunkt Min.= Minimum; Max.= Maximum;
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden
62
5 Diskussion
Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, pharmakokinetische Daten für rhFVIIa und den
Einfluß auf das Blutstillungssystem sowie die Verträglichkeit bei gesunden Hunden und
Hunden mit hereditärem Faktor-VII-Mangel zu überprüfen. Der Hund stellt für viele
hämostaseologische Fragestellungen ein hervorragendes Tiermodell dar (SPURLING 1980,
TINLIN et al. 1993, MISCHKE 2001). Auch zur Anwendung von rhFVIIa liegen erste Daten
für die Anwendung beim Hund vor (BRINKHOUS et al. 1989). Der Hund wäre daher gut
geeignet, um die noch offenen Fragen u.a. zur Sicherheit bei DIG und zum
Wirkungsmechanismus bei Thrombozytopenie näher zu untersuchen. Unabhängig davon
lassen sich generell der Literatur auch für den Menschen bislang nur spärliche Informationen
zur Pharmakokinetik von rhFVIIa entnehmen, so daß alleine schon die Erarbeitung
pharmakokinetischer Daten von Nutzen für den Menschen erscheint.
Neben der Dosierung von 100 µg/kg, die der beim Menschen für viele Indikationen geltenden
Standarddosierung von 90-110 µg/kg KM entspricht (SHAPIRO 1998, ARKIN et al. 2000,
HEDNER 2000), kam in der vorliegenden Studie auch eine wesentlich höhere Dosierung zur
Anwendung (500 µg/kg). Die Grundlage für diese hohe Dosierung lieferte einerseits die
Überlegung, daß auch bei ausgewählten Indikationen beim Menschen (z.B. Glanzmann-
Thrombasthenie, Blutung nach Überdosierung von Antikoagulanzien vom Cumarintyp) sehr
hohe Dosierungen im Bereich von zumindest 300 µg/kg verabreicht werden
(CHUANSUMRIT et al. 1999; BERNTORP et al. 2000). Faktor VIIa ist in physiologischen
Konzentrationen nach dem zell-basierten Modell der Hämostase primär für die Initiation und
Faktor VIIIa und IXa für die Propagation, also der massierten Produktion von Thrombin,
zuständig (POON et al. 2000, HOFFMAN und MONROE 2001, ALLEN et al. 2002,
MARTINOWITZ et al. 2002). Die Gabe von rhFVIIa in Dosen, die deutlich über den
physiologischen Konzentrationen von Faktor VII und VIIa liegen, ist auch unabhängig von
Gewebsthromboplastin in der Lage, Faktor X zu aktivieren und diese massierte Thrombin-
Produktion hervorzurufen, ohne eine DIG auszulösen (TELGT et al. 1989, RAO und
RAPOPORT 1990, HOFFMAN et al. 1994).
Ein zweiter Grund für die Untersuchungen mit dieser hohen Dosierung war die Tatsache, daß
beim homozygoten Hund mit von Willebrand-Erkrankung Typ III wie auch beim hämophilen
63
Hund offensichtlich eine wesentlich höhere Dosierung von Faktor VIIa erforderlich ist, um
klinisch effektiv zu wirken (BRINKHOUS 1989, eigene unveröffentlichte Daten).
Vergleicht man die C0-FVII:C-Werte, die sich mit einer definierten rhFVIIa-Dosis bei Hund
und Mensch erzielen lassen, so wird eine Diskrepanz deutlich. Beim Menschen führen
Injektionen von 60-80 µg/kg rhFVIIa zu einem 20 bis 30fachen Anstieg der physiologischen
FVII:C-Aktivität (LINDLEY et al. 1994, BERNSTEIN et al. 1997, HENDRICKS et al.
2001). Die eigenen Daten zeigen hingegen nach 100 µg/kg einen nur etwa 4fachen und nach
500 µg/kg einen 20fachen Anstieg derselben beim Hund. Der Unterschied ist leicht zu
erklären, beziehen sich die beim Hund gemessenen Aktivitäten auf eine Kalibration gegen
einen Hundepool, der etwa die vierfache Faktor VII-Aktivität im Vergleich zum normalen
Humanplasma besitzt (MISCHKE 2001).
Bei den rhFVIIa:Ag-Werten fällt auf, daß die Werte 2 min nach der Injektion deutlich unter
den im Plasma bei einem Hämatokrit von etwa 40 % maximal zu erwartenden
Konzentrationen von 1,67 µg/ml bei Gabe von 100µg/kg rhFVIIa bzw. 8,33µg/ml bei Gabe
von 500µg/kg lagen. Dies kann einerseits dadurch erklärt werden, daß es zu einer Anlagerung
der rhFVIIa-Moleküle an Gefäß-Endothelzellen oder Blutbestandteile kommt, was die
Konzentration im Plasma verringert. Andererseits kann es in vivo teilweise zu einer
Transformation des Moleküls kommen, die die Bindung an einen monoklonalen Antikörper
verhindert, und damit ein mit einem monoklonalen Antikörper arbeitendes Testsystem
beeinflußt. So berichtet MORISSEY (1999) auch von einer deutlichen Differenz zwischen
koagulometrisch ermittelten und mittels ELISA bestimmten absoluten Konzentrationen von
Faktor VIIa beim Menschen. Der Autor erklärt dies mit einer möglichen C-terminalen
Transformation des FVIIa-Moleküls in vivo, die die Antikörperbindung verhindert, die
Gerinnungsaktivität jedoch nicht verändert.
BRINKHOUS et al. (1989) gaben basierend auf ihren Untersuchungen an einzelnen Hunden
mit Hämophilie für Dosierungen von 50-220 µg/kg eine Halbwertzeit für das FVII:Ag-
Konzentration von 2,8 ± 0,5 h und für die FVII:C-Aktivität von 2,1 ± 0,6 h an. Diese Daten
liegen deutlich über den selbst für die anhand der FVIIa:Ag-Konzentration und der FVII:C-
Aktivität errechneten Werten. Möglicherweise ist der von BRINKHOUS et al (1989)
eingesetzte unspezifischere ELISA, der im Gegensatz zu der vorliegenden Studie auch nicht
aktivierten Faktor VII detektierte, eine Ursache für die Diskrepanz. Da die Ausgangswerte für
64
FVII:Ag vor rhFVIIa-Gabe bei den von BRINKHOUS et al. (1989) beschriebenen Hunden
deutlich über „Null“ lagen, ist zudem davon auszugehen, daß dieser Test auch FVII- und/oder
FVIIa:Ag des Hundes miterfaßte. Hingegen wurde die Spezifität des eigenen Testsystems in
Vorversuchen detailliert untersucht. Weitere Vergleichsdaten für pharmakokinetische
Berechnungen basierend auf der FVII:Ag (bzw. FVIIa:Ag)-Konzentration, die eine
Relativierung erlaubten, lassen sich der zugänglichen Literatur auch für den Menschen nicht
entnehmen. Hier findet sich nur das Zitat von LINDLEY et al. (1994), die ebenfalls auf der
Basis der FVII:C-Aktivität bei Dosierungen von 17,5, 35 und 70 µg/kg rhFVIIa bei
hämophilen Menschen mittlere Halbwertszeiten von 2,57 bis 2,81 h finden.
Interessant ist die in der vorliegenden Studie die für die FVII:C-Aktivität erarbeitete kürzere
Halbwertszeit der höheren Dosierung bei gesunden Hunden. Eine plausible Erklärung wäre
eine schnelle Elimination des aktivierten Faktors aus der Zirkulation durch Bindung an
Zelloberflächen (v.a. Thrombozyten), die in diesen hohen Dosierungen zum Tragen kommt.
Dies könnte auch eine Aktivierung der Thrombozyten erklären, was sich anhand der deutlich
verminderten Thrombozytenzahl nach der Injektion von 500µg/kg KM rhFVIIa in gesunde
Hunde andeutete. So berichteten in der humanmedizinischen Literatur mehrere Autoren
(CHUANSUMRIT et al. 1999, VIDARSSON et al. 2000, GEROTZIAFAS et al. 2002), daß
hochdosierte rhFVIIa-Gaben zu einer erhöhten Aktivität der Thrombozyten führt, was
therapeutisch bei Thrombozytopenien und Störungen der Plättchenfunktion ausgenutzt wird.
Die Faktor VIIa-Injektion führte bereits in der Dosierung von 500µg/kg KM bei allen Hunden
zu einer deutlichen Verkürzung der PT bei Messung mit dem PTST. Die hierbei erreichten
Werte im Bereich von 4 sec stellen die Grenze des Meßbereiches dar, bedingt durch das
Mischen des Testansatzes und Einsetzen des Elektrodenhalters. Sie sind überwiegend als
artifiziell anzusehen und zeigen die Grenzen des konventionellen, für den Menschen
optimierten Tests bei der Messung von Hundeplasma auf. Bedingt durch die deutlich höhere
Faktor V- und Faktor VII-Aktivität des Hundes liegt bereits die PT (PTST) des gesunden
Hundes mit 6-8 sec sehr nahe dieser methodischen Grenze (MISCHKE und NOLTE 1997).
Beim Menschen ist hingegen mit dem PTST auch bei zuvor unverändertem Wert (z.B.
hämophiler Patient) der rhFVIIa-Effekt kontrollierbar (LINDLEY et al. 1994).
Differenziertere Aussagen waren mit dem PTMT möglich, der für den Hund optimiert wurde
(MISCHKE 1999, MISCHKE und NOLTE 1997) und auch für die Überwachung der
65
rhFVIIa-Therapie besser geeignet erscheint. Beim Faktor-VII-defizienten Menschen führen in
der Regel bereits sehr viel niedrigere Dosierungen (10-20 µg/kg rhFVIIa) als in die in der
vorliegenden Arbeit verwendeten zu einem an der PT ablesbaren Effekt. Aufgrund der
deutlich höheren Faktor VII-Aktivität des gesunden Hundes können diese Verhältnisse nicht
unkritisch auf den Hund Übertragen werden. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten PT-
Effekte zeigten jedoch wie die korrespondierenden FVII:C-Resultate, daß für eine klinische
Anwendung beim FVII-Mangel-Hundes eine wesentlich geringere Dosierung als 100 µg/kg
rhFVIIa effektiv sein müßte.
Die aPTT zeigte in Gruppe III (gesunde Hunde, die 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert
bekamen) eine deutliche Verkürzung innerhalb der ersten 1,5 h nach rhFVIIa-Injektion. Auch
in den anderen Gruppen war eine partielle Verkürzungen der aPTT innerhalb der ersten 15
min nach rhFVIIa-Injektion nachweisbar. Beim Menschen sind Verkürzungen der aPTT
schon bei Dosierungen von 20 µg/kg (BERNSTEIN et al. 2001) und ab 40 µg/kg KM
(MARTINOWITZ et al. 2002) festgestellt worden. Auch LINDLEY et al. (1994) sowie
TELGT et al. (1989) beschrieben eine signifikante Verkürzung der aPTT in allen Plasma-
Proben exklusive bei Faktor X und V-defizientem Plasma. Sie führten dies auf eine
Gewebsthromboplastin-unabhängige direkte Aktivierung von Faktor X bei hohen
Konzentrationen von rhFVIIa zurück. Dieses Phänomen wird durch die Aktivierung des
Faktors IX durch Faktor VIIa über die sogenannte Josso-Schleife erklärt (JENSEN et al.
1976, XI et al. 1989, TELGT et al. 1989, LINDLEY et al. 1994). Da die aPTT von
Konzentrationen des Faktors VII und Faktors VIIa unabhängig ist, eignet sie sich andererseits
kaum zum Monitoring der rhFVIIa-Therapie (TELGT et al. 1989, HEDNER 1996,
INGERSLEV et al. 2000).
Das – im Gegensatz zu den anderen Gruppen – deutliche Absinken der Thrombozytenzahl bei
den gesunden Hunden, die 500 µg/kg KM rhFVIIa bekommen hatten, könnte eventuell durch
einen Verbrauch eines Teils der Thrombozyten durch Aktivierung mit anschließender
Verklumpung im Gefäßsystem durch die hohe Dosis rhFVIIa erklärbar sein. Dies könnte ggf.
auch zu einem erhöhten Verbrauch von Erythrozyten führen und den leichten
Hämatokritabfall in dieser Gruppe erklären. Zwar ließ sich ein analoger Effekt für die Faktor-
VII-Mangel-Tiere nicht sichern, was aber zumindest teilweise mit der geringen Tierzahl (n=4)
dieser Gruppe zu erklären sein könnte.
66
Hohe Dosen von rhFVIIa sind in der Lage, die Thrombozyten über einen Thrombin-
abhängigen Weg zu aktivieren (POON et al. 2000, WILBOURN et al. 2003). Dies wird im
zell-basierten Modell der Koagulation berücksichtigt (POON et al. 2000, HOFFMAN und
MONROE 2001, MARTINOWITZ et al. 2001, ALLEN et al. 2002, MARTINOWITZ et al.
2002). Therapeutisch wird dieser Effekt – wie bereits oben erwähnt – bei der Behandlung von
Thrombozytopenien und -pathien genutzt (KRISTENSEN 1996, POON et al. 2000, POON et
al. 2001). Untersuchungen über Hämatokritveränderung nach rhFVIIa-Applikation bei
Menschen ohne Blutung wurden bei größeren Studien beim Menschen z. B. bei LINDLEY et
al. (1994), nicht gemacht. Nach Literaturhinweisen konnte jedoch bei blutenden Menschen
durch rhFVIIa, allerdings in der deutlich geringeren Standarddosierung für den Menschen, der
Hämatokrit stabil gehalten und die Anzahl der notwendigen Blutkonserven reduziert werden
(MARTINOWITZ et al. 2001, KAMPHUISEN et a. 2002, MARTINOWITZ et al. 2002).
BERNTORP et al. (2000) geben bei Warfarin-behandelten Patienten ein geringfügiges
Absinken des Hämatokrits von 36 auf 35 % 5 min nach der rhFVIIa-Injektion an, ohne aber
die zugehörige Dosierung zu nennen.
Rekombinanter humaner Faktor VIIa ist von KRISTENSEN et al. (2003) zum Einsatz bei
Hunden mit Trauma, massiven Blutungen, DIG, Thrombozytopenie, Vergiftungen mit
Antikoagulantien vom Cumarin-Typ, Leber-Erkrankungen, gastrointestinalen Blutungen,
chirurgischen Eingriffen und hereditären Gerinnungsfaktormängeln propagiert worden.
Allerdings limitiert derzeit der Preis (über 2500 € für eine Behandlung eines 20 kg schweren
Hundes mit 100 µg/kg KM rhFVIIa) den klinischen Einsatz in der Veterinärmedizin. Von
größerer Bedeutung erscheint derzeit der Einsatz des Hundes als Tiermodell z.B. zur
Untersuchung des nach wie vor nicht vollständig geklärten Wirkungsmechanismus bei
plättchen-induzierten Blutungen. Mögliche „Hundemodelle“ sind weiterhin die Hämophilie A
und B mit und ohne Inhibitoren sowie der auch in der vorliegenden Arbeit untersuchte Faktor
VII-Mangel (BRINKHOUS et al. 1989, MERTENS et al. 1990, TINLIN et al. 1993).
Sowohl im Hinblick auf einen klinischen Einsatz in der Zukunft als auch im Hinblick auf
mögliche Tiermodelle ist bedeutsam, daß die selbst untersuchten Hunde das Medikament gut
vertrugen. Nur bei einem von 22 Tieren war vorübergehend lokalisierte Quaddelbildung zu
sehen, die aber unbehandelt nach kurzer Zeit verschwand. Die geringe Inzidenz von adversen
Reaktionen bei der Anwendung von rhFVIIa beim Hund widerspricht den Erfahrungen von
67
BRINKHOUS et al. (1989). Von den 5 von BRINKHOUS et al. (1989) mit rhFVIIa
behandelten Hunden entwickelten 4 (davon einer nach wiederholter Injektion) Symptome
einer Typ-I-Überempfindlichkeit in Form von Quaddelbildung. Schwerere adverse
Reaktionen traten allerdings auch in dieser Studie nicht auf. Da es sich bei BRINKHOUS et
al. (1989) um Hunde mit Hämophilie A oder B bzw. von Willebrand-Erkrankung handelte,
die eine deutliche Blutungsneigung aufwiesen und unter experimentellen Bedingungen
gehalten wurden, liegt eine Immunisierung durch Vorbehandlung mit homologen oder
heterologen Plasmaprodukten nahe. Die aufwendige Präparation mit chromatographischen
Techniken und Immunabsorption läßt hingegen das Verbleiben von potenziell immunogenen
Kontaminationen aus der Zellkultur gering erscheinen. Hinweise auf andere immunogene
Zusätze zur Faktor VIIa Lösung (z.B. Stabilisatoren wie Humanalbumin) lassen sich den
methodischen Angaben von BRINKHOUS et al. (1989) nicht entnehmen. Da die Dosierung
von rhFVIIa in der vorliegenden Arbeit und in der Studie bei BRINKHOUS et al. (1989; 49-
550 µg/kg) in der gleichen Größenordnung lagen, können Dosierungsunterschiede hingegen
nicht als Erklärung herangezogen werden.
Die eigenen Beobachtungen passen in den Zusammenhang von Untersuchungsergebnissen
zur Anwendung von konventionell hergestelltem humanem Faktor VIIa-Konzentraten beim
Hund. CHABBAT et al. (1988) wandten dieses bei vier gesunden Hunden und vier Hunden
mit Hämophilie A in vier verschiedenen Dosierungen an aufeinanderfolgenden Tagen an,
ohne daß unerwünschte Wirkungen auftraten. MERTENS et al. (1990) berichten über die
einmalige Verabreichung einer sehr niedrigen Dosierung (0,5µg/kg) eines hochgereinigten
konventionell hergestellten FVII-Kozentrates an gesunde Hunde und Hunde mit Hämophilie
A ohne klinische Auffälligkeiten. Auch bei Hunden die mit rekombinantem humanen Faktor
IX behandelt wurden, war die Verträglichkeit gut (KEITH et al. 1994).
Alle selbst untersuchten Hunde zeigten eine Antikörperbildung 14 Tage nach der Injektion.
Auch BRINKHOUS et al. (1989) fanden eine Antikörperbildung bei allen mit rhFVIIa
behandelten Hunden ein bis zwei Wochen nach der Verabreichung. Es zeigte sich eine
Abhängigkeit von der Dosierung: Die höhere Dosierung verursachte auch höhere
Antikörpertiter. Bei BRINKHOUS et al. (1989) waren die Titerhöhen und die Persistenz der
Antikörper unterschiedlich und ohne erkennbaren Bezug zu Erkrankung, Dosierung oder
Anzahl der Applikationen. Inwiefern die Antikörperbildung die Einsetzbarkeit für
68
mehrmalige therapeutische Anwendungen dieses Medikaments beim Hund beeinflußt, bedarf
noch weiterer Untersuchung. Es traten bei Injektion von konventionellem humanen Faktor
VII-Konzentrat in Hunde an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen keine Komplikationen auf
(CHABBAT et al. 1988). Beim Menschen ist die Antikörperbildung gegen rhFVIIa eine
seltene Komplikation (NICOLAISEN 1996). Bei einem Kleinkind waren nach akzidenteller
Überdosierung Antikörper nachweisbar (MARIANI et al. 1998). Auch 3 von 4 gesunden
Beagles, die mit rekombinantem humanen Faktor IX über 28 Tage (n=4) sowie 3 von 4
gesunden Beagles, die einem konventionellen humanen Faktor IX-Konzentrat über 14 Tage
(n=4) behandelt wurden, bildeten Antikörper gegen die Präparate, die die Halbwertszeit der
Präparate deutlich verminderten (KEITH et al. 1994).
Die vorliegende Studie liefert grundlegende Daten zur Pharmakokinetik und –dynamik von
rhFVIIa beim gesunden und Faktor-VII-defizienten Hund, die für den Menschen einerseits im
Hinblick auf einen direkten vergleichenden Aspekt und auch im Hinblick auf mögliche
tierexperimentelle Ansätze von Interesse sein dürften. Interessant ist in diesem
Zusammenhang, daß in jüngster Zeit wurden noch aktivere Varianten des rhFVIIa gefunden
(PERSSON et al. 2001, LISMAN et al. 2003). Erste In-vitro-Tests mit Plasma von Patienten
mit Hämophilie lassen eine höhere Aktivität als der herkömmliche rhFVIIa erkennen
(LISMAN et al. 2003). Bei höherer Wirksamkeit könnte die Dosis mit diesen Varianten
niedriger gewählt werden, was eventuell den Preis senken und die Bildung von Antikörpern
reduzieren könnte. Ebenso dürften – wie oben ausgeführt – in Abhängigkeit von der
Indikation (insbesondere hereditärer Faktor VII-Mangel) durchaus schon geringere
Dosierungen des derzeit kommerziell erhältlichen rhFVIIa effektiv sein.
69
6 Zusammenfassung
Bernd Dörsch
Untersuchungen zur Pharmakokinetik, gerinnungsphysiologischen Wirkung und
Immunogenität von rekombinantem humanen Faktor VIIa bei gesunden und Faktor
VII-defizienten Hunden
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war, die Pharmakokinetik und Einflüsse auf das
Gerinnungssystem von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) bei
gerinnungsphysiologisch gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden zu erarbeiten und
dadurch die Grundlagen für tierexperimentelle Untersuchungen zu liefern.
Die Untersuchungstiere wurden auf die folgenden Untersuchungsgruppen verteilt:
Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden,
Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa
injiziert wurden,
Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden und
Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa
injiziert wurden.
Blutentnahmen erfolgten vor der rhFVIIa-Gabe sowie 2, 5, 10, 15, 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8,
12 und 24 h danach. Zu allen Zeitpunkten wurden koagulometrisch gemessene Faktor
VII(FVII:C)-Aktivität, Faktor VIIa-Antigen(FVIIa:Ag)-Konzentration, Prothrombinzeit–
Standardtest (PTST), Prothrombinzeit-modifizierter Test (PTMT), aktivierte partielle
Thromboplastinzeit (aPTT), Hämatokrit und Thrombozytenzahl gemessen. Darüber hinaus
erfolgten Blutprobenentnahmen vor sowie 2, 4 und 12 Wochen nach der rhFVIIa-Gabe zum
Nachweis kaniner Antikörper gegen rhFVIIa.
Die wesentlichsten Ergebnisse waren wie folgt:
Bis auf eine leichte temporäre Hautreaktion bei einem gesunden Hund zeigte keines der Tiere
Anzeichen einer Unverträglichkeit. Die FVII:C-Aktivität stieg in allen Gruppen 2 min nach
der Injektion signifikant von im Mittel 86 auf 446 % (in Gruppe I), von 13 auf 441 % (in
Gruppe II), von 92 auf 2143 % (in Gruppe III) und von 15 auf 1912 % (in Gruppe IV) und
erreichte nach 24 h jeweils wieder den Ausgangswert (p>0,05). Die FVIIa:Ag-Konzentration
70
betrug 2 min nach rhFVIIa-Gabe 26,9 ± 3,12 ng/ml (Mittelwert und Standardabweichung,
Gruppe I), 32,9 ± 3,54 ng/ml (Gruppe II), 144,7 ± 11,95 ng/ml (Gruppe III) und 142,0 ± 7,55
ng/ml (Gruppe IV).
Die aus den FVII:C-Werten errechneten Halbwertszeiten stimmten in den Gruppen I, II und
IV sehr gut überein (Gruppe I: 98,3 min, Gruppe II: 99,0 min, Gruppe IV: 96,3 min), lagen
interessanterweise bei der Gruppe mit gesunden Hunden und hoher Dosierung niedriger
(Gruppe III: 66,3 min). Für die Halbwertszeit der FVIIa:Ag-Konzentration bestand mit
Mittelwerten von 81 bis 90 min kein deutlicher Unterschied zwischen den Gruppen.
Korrespondierend zeigte sich für die FVII:C-Aktivität eine um ein Vielfaches höhere totale
Clearance für die höhere Dosierung (Gruppe III: 0,0244 ml/min; IV: 0,0207 ml/min) im
Vergleich zur niedrigeren Dosierung (Gruppe I: 0,0019 ml/min; Gruppe II: 0,0015 ml/min),
während die Unterschiede für die FVII:Ag-Konzenatration hier weniger deutlich ausfielen
(Gruppenmittel: 38-64 ml/min).
Die rFVIIa-Behandlung bewirkte eine auffällige Verkürzung der PTST, die von Werten um 7
sec bei den gesunden Hunden (Gruppe I und III) und Werten um 15 sec bei den Faktor VII-
defizienten Hunden in allen Gruppen auf Werte um 4 sec (als methodenspezifischer unterer
Meßbereich) sank und in keiner der Gruppen nach 24 h den Ausgangswert erreichte.
Hingegen stieg die mit dem PTMT gemessene PT-Aktivität in Abhängigkeit von der Dosis bei
gesunden Hunden von im Mittel 72 auf 155 % (Gruppe I) bzw. 74 auf 227 % (Gruppe III) und
bei Faktor VII-defizienten Hunden von im Mittel 26 auf 144 % (Gruppe II) bzw. von 34 auf
193 % (Gruppe IV) an. Eine auffällige Verkürzung der aPTT war vor allem auf die Gabe von
500 µg/kg KM bei gesunden Hunden beschränkt.
Interessant war, daß nach Verabreichung von 500 µg/kg rhFVIIa bei den gesunden Hunden
ein signifikanter Abfall der Thrombozytenzahl und des Hämatokritwertes auftrat. Bei allen
Hunden konnte 2 Wochen nach einmaliger Behandlung mit rhFVIIa die Bildung von
Antikörper gegen rhFVIIa nachgewiesen werden Die Höhe der Antikörpertiter war
dosisabhängig und variierte interindividuell sehr stark.
Die Ergebnisse dieser Studie liefern die Grundlagen für den Einsatz des Hundes als
Tiermodell für die Therapie mit rhFVIIa. Obgleich derzeit wegen der immensen Kosten nicht
praktikabel, zeigt sich die prinzipielle Effizienz der rhFVIIa-Behandlung beim Faktor VII
defizienten Hund anhand der deutlichen PT-Verkürzung (Anstieg der PTMT-Aktivität) und
71
Anstieg der FVII:C-Aktivität. Da hierbei weit über den physiologischen Verhältnissen
liegende FVII:C-Aktivitäten erzielt wurden, sind für die Behandlung des Faktor-VII-Mangel
Hundes deutlich unter 100 µg/kg liegende rhFVIIa-Dosierungen ausreichend.
72
7 Summary
Bernd Dörsch
Investigations on pharmacokinetics, coagulatory effects and immunogenity of
recombinant human factor VIIa in healthy and factor VII deficient dogs
The aim of this study was to determine pharmacokinetic data and the influence on the
coagulation system of recombinant human factor VIIa (rhFVIIa) in dogs with inherited factor
VII-deficiency and dogs without coagulation disorders. This work should establish
preliminary data for further investigation in animal models.
The animals of this study were put into following groups:
Group I = healthy animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body mass
Group II = factor VII-deficient animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body
mass
Group III = healthy animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body mass
Group IV = factor VII-deficient animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body
mass
Blood was taken before and 2, 5, 10, 15, 30 min, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12 and 24 hours after
application of rhFVIIa. At all times the coagulometric-measured factor VII(FVII:C)-activity,
the factor VII-antigen(FVIIa:Ag)-concentration, the prothrombin time-standard test (PTST),
the prothrombin time-modified test (PTMT), the activated partial thromboplastin time (aPTT),
the haematocrit, and the platelet count were examined. Furthermore, blood was drawn before
and 2, 4 and 12 weeks after application of rhFVIIa to determine if these animals produced
antibodies against rhFVIIa.
The most important results are: Apart from a temporary skin reaction in one healthy dog none
of the dogs showed adverse reactions. The FVII:C activity rised significantly 2 min after
injection of rhFVIIa in all groups from mean values of 86 to 446 % (in group I), from 13 to
441 % (in group II), from 92 to 2143 % (in group III), and from 15 to 1912 % (in group IV).
24 h later the values were not significantly different from initial values (p>0,05). The
73
FVIIa:Ag concentration values 2 min after the rhFVIIa injection were 26.9 ± 3.12 ng/ml
(mean value + standard deviation, group I), 32.9 ± 3.54 ng/ml (group II), 144.7 ± 11.95 ng/ml
(group III) and 142.0 ± 7.55 ng/ml (group IV).
Whereas mean half-life calculated from FVII:C values was longer in groups I, II and IV
(group I: 98,3 min; group II: 99,0 min, group IV: 96,7 min) compared to the group with
healthy animals and higher dosage (group III: 66,3 min), half-lifes calculated based on
FVII:Ag concentrations did not show remarkable group differences (mean values: 81 to 90
min). Correspondingly, based on factor VII:C activity higher dosages were associated with a
manyfold higher total clearance (group III: 0,0244 ml/min; group IV: 0,0207 ml/min) when
compared to the lower dosage (group I: 0,0019 ml/min; group II: 0,0015 ml/min). Less
distinct group differences of the total clearance were found when calculated based on
FVIIa:Ag values (mean values of groups: 38-64 ml/min).
The rhFVIIa-treatment caused a significant shortening of the PTST from initial values of
approx. 7 sec in healthy dogs (groups I and III) or 15 sec in factor VII deficient dogs,
respectively, to values around 4 sec (corresponding to the method specific lower measurement
range) in all groups. The initial values were not reached after 24 h in any of the groups. The
coagulation activity measured with the PTMT increased dose-dependent in healthy dogs from
mean values of 72 to 155 % (group I) and from 74 to 227 % (group III). In factor VII-
deficient dogs mean values increased from 26 to 144 % (group II) or from 34 to 193 % (group
IV). A significant shortening of the aPTT was mainly restricted to the healthy dogs receiving
the high dose of 500 µg/kg KM.
Interestingly, the injection of 500 µg/kg rhFVIIa in healthy dogs induced a significant
decrease in platelet count and haematocrit. Two weeks after rhFVIIa treatment, all the dogs
developed antibodies against rhFVIIa. The amount of antibodies was dose-dependent and
varied remarkably between individual dogs.
The results of the present study deliver the basis of the use of dogs as an animal model for
rhFVIIa treatment. Efficacy of rhFVIIa treatment in factor VII deficient dogs was
demonstrated by significant shortening of PTST (increase of PTMT activity), although high
costs limit its use under clinical conditions at present. Due to the fact that factor VII:C
activities were achieved which were significantly above the physiological situation, dosages
below 100 µg/kg are adequate for the treatment of dogs with inherited factor VII-deficiency.
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Tabellarischer Anhang:
Tab. TA1: Ergebnisse aus dem Vorversuch zum ELISA zur Bestimmung der Faktor
humanen VIIa-Antigen-Konzentration – Verdünnungsfaktor in A-Puffer und Mittelwerte von
Doppelmessungen der optischen Dichte bei einem Testfilter von 450 nm gegen einen
Referenzfilter von 630 nm.
Probe Rekombinanter humaner Faktor VIIa
Verdünnungsfaktor 1: 8 1:32 1:64 1:103 1:104 1:105 1: 3x105 1:106
Optische Dichte 2162 1999 2008 1980 1998 1435 752 329
Probe Kanines Poolplasma
Verdünnungsfaktor 1: 20 1: 40 1: 80 1: 160
Optische Dichte 0,16 0,20 0,18 0,17
Tab. TA2: Ergebnisse aus den Vorversuchen zur Antikörperbildung gegen rekombinanten
humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) - Verdünnungsfaktor in A-Puffer und Mittelwerte von
Doppelmessungen der optischen Dichte bei einem Testfilter von 450 nm gegen einen
Referenzfilter von 630 nm.
Probe Serum von Patient 3 vor rhFVIIa-Gabe
Verdünnungsfaktor 1: 200 1:600 1:800 1:1000 1:3200 1:6400
Optische Dichte 2296 2175 1945 2061 1553 553
Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000
Optische Dichte 650 415 296 181
Probe Serum von Referenzhund 1, unbehandelt
Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000
Optische Dichte 441 267 172 117 Probe Serum von Referenzhund 2, unbehandelt Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000 Optische Dichte 326 185 116 84 Probe Serum von Referenzhund 3, unbehandelt Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000 Optische Dichte 451 285 185 116
97
Fortsetzung Tab. TA2 Probe Serum von Referenzhund 4, unbehandelt Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000 Optische Dichte 348 205 152 94 Probe Serum von Patient 10, 2 Wochen nach rhFVIIa-Gabe
Verdünnungsfaktor 1: 8000 1: 32000 1:40000 1:80000 1:320000 1:640000
Optische Dichte 2065 1998 1847 1434 956 561
98
Tab. TA3: Verlauf der Faktor VII-Aktivität (FVII:C) (% der Norm) nach Injektion von
rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte,
arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den statistischen
Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor
VII-Mangel.
Nr Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)
1 85 432 444 429 420 412 342 305 268 218 178 110 105 102 752 85 460 452 434 412 362 320 300 290 178 142 119 103 96 894 80 488 492 443 452 397 340 328 282 233 201 170 146 96 935 104 444 452 416 419 371 342 315 281 225 170 149 115 120 113
18 85 435 450 419 402 341 321 292 257 205 174 136 141 88 7219 75 417 414 401 365 324 289 270 252 175 150 118 95 83 76
86 446 451 424 412 368 326 302 272 206 169 134 118 98 86s 9,8 25,0 24,9 14,9 28,4 33,1 20,7 19,9 15,1 24,4 21,1 22,7 21,2 12,9 15,5
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0017 0,0098 0,0017 0,4403
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 14 476 500 484 448 412 356 288 236 158 103 73 43 19 136 16 395 416 401 386 372 314 250 203 145 93 67 55 22 187 19 452 476 443 440 390 310 273 228 178 103 92 62 50 178 15 443 464 476 431 396 340 307 243 143 104 77 52 20 15
14 11 429 465 432 408 382 302 268 213 144 100 58 16 17 1116 5 450 470 444 417 378 315 265 202 170 127 76 31 19 12
13 441 465 447 422 388 323 275 221 156 105 74 43 25 14s 4,8 27,2 27,5 30,3 22,8 14,4 20,7 19,9 17,4 14,9 11,5 11,3 17,1 12,6 2,8
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0016 0,0226 0,2409
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 100 2002 2182 2304 1776 1560 1476 936 552 450 345 282 171 103 100
10 95 2364 2400 2340 1824 1776 1548 1020 512 458 411 276 176 102 9511 110 2184 2280 2364 2124 1668 1476 1104 484 390 322 240 185 107 11212 103 2136 2184 2040 1740 1668 1548 936 449 385 290 210 185 118 10820 73 1829 1987 1980 1657 1507 1160 834 569 347 255 184 144 121 7822 73 2340 2141 2104 2064 1490 1269 1024 516 461 360 248 116 105 96
92 2143 2196 2189 1864 1612 1413 976 514 415 331 240 163 109 98s 15,7 204 138 167 187 111 161 93,8 43,8 47,6 54,7 37,8 27,5 8,1 11,9
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0001 0,0000 0,0424 0,0808
99
Fortsetzung Tab. TA3
Tab. TA4: Auf der Basis der Faktor VII-Aktivität (FVII:C) (% der Norm) errechnete
pharmakokinetische Daten des rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) beim Hund
nach intravenöser Injektion verschiedener Dosierungen in gesunde Hunden bzw. Hunden mit
hereditärem Faktor VII-Mangel: Berechnete (C0-ber) und gemessene Anfangskonzentration
(C0-gem), Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC)
Verteilungsvolumen (Vdβ) und Eliminationskonstante (β).
Rechenwert C0-ber C0-gem t50 Cltot AUC Vdβ β Einheit (∆%) (∆%) (min) (ml/min) (∆% x min) (l) (1/min)
Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 1 383 381 98,80 0,0018 54400 0,261 0,0070 2 444 423 99,00 0,0019 52300 0,225 0,0070 4 484 465 99,00 0,0017 58800 0,206 0,0070 5 400 386 99,00 0,0020 49900 0,250 0,0070
18 447 422 98,20 0,0019 50500 0,224 0,0071 19 423 399 95,90 0,0021 46600 0,237 0,0072
430 413 98,32 0,0019 52083 0,234 0,0070 s 36 31 1,22 0,0001 4192 0,020 0,0000
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 518 511 99,00 0,0014 70700 0,193 0,0070 6 421 419 98,90 0,0017 60000 0,238 0,0070 7 525 507 98,90 0,0015 65600 0,190 0,0070 8 478 476 98,80 0,0015 68100 0,209 0,0070
14 573 540 97,80 0,0016 63600 0,174 0,0071 16 536 517 99,00 0,0015 66700 0,187 0,0070
509 495 98,73 0,0015 65783 0,199 0,0070 s 53 43 0,46 0,0001 3705 0,022 0,0000
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 16 1980 1824 1776 1644 1356 1200 920 600 494 356 295 109 34 1815 7 1750 1778 1699 1596 1428 1332 1056 584 481 424 345 106 57 1017 5 1877 1848 1723 1554 1440 1320 1006 580 330 288 247 150 47 621 32 2040 1814 1760 1541 1303 1096 1020 880 428 280 198 121 77 33
15 1912 1816 1740 1584 1382 1237 1001 661 433 337 271 122 54 17s 12,3 127 29,1 35,0 46,5 64,3 111 57,7 146 74,5 67,3 63,1 20,1 18,1 11,9
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0000 0,0012 0,0000 0,0016 0,0029 0,0019 0,0061 0,0177
100
Fortsetzung Tab. TA4
Rechenwert C0-ber C0-gem t50 Cltot AUC Vdβ β Einheit (∆%) (∆%) (min) (ml/min) (∆% x min) (l) (1/min)
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 2310 2280 71,20 0,0238 210000 0,217 0,0097
10 2320 2130 66,30 0,0225 222000 0,215 0,0104 11 2340 2330 61,40 0,0241 207000 0,213 0,0113 12 2110 2100 66,20 0,0248 201000 0,237 0,0105 20 2060 2040 66,50 0,0272 184000 0,234 0,0104 22 2930 2590 66,30 0,0238 210000 0,171 0,0104
2345 2245 66,32 0,0244 205667 0,215 0,0105 s 310 202 3,10 0,0016 12628 0,024 0,0005
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 1980 1970 99,00 0,0207 241000 0,252 0,0070 15 1980 1930 99,00 0,0196 256000 0,253 0,0070 17 2190 2110 89,90 0,0213 235000 0,229 0,0077 21 2040 2000 99,00 0,0210 239000 0,229 0,0077
2048 2003 96,73 0,0207 242750 0,241 0,0070 s 99 77 4,55 0,0007 9179 0,014 0,0000
101
Tab. TA5: Verlauf der humanen Faktor VIIa-Antigen-Konzentration (ng/ml) nach Injektion
von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen –
Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den
statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit
hereditärem Faktor VII-Mangel.
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)
1 0,5 25,8 28,4 22,4 17,2 12,5 10,2 10,1 8,0 3,9 3,8 3,3 2,3 1,2 1,02 0,3 27,3 29,9 21,2 16,7 12,2 8,6 8,4 3,7 2,7 1,9 1,6 1,3 0,9 0,54 0,3 29,5 32,0 22,2 18,4 12,8 8,6 7,9 3,1 1,9 1,3 0,4 0,4 0,3 0,45 0,3 28,7 31,1 22,0 17,0 12,6 8,2 7,2 3,5 1,8 1,2 0,1 0,2 0,2 0,2
18 0,9 29,1 30,1 23,3 19,8 14,5 12,1 10,0 7,0 5,0 4,0 4,2 3,4 2,0 1,319 0,6 21,2 22,5 20,1 13,5 8,5 6,2 3,7 3,3 2,2 2,4 1,7 0,9 0,6 0,6
0,5 26,9 29,0 21,9 17,1 12,2 9,0 7,9 4,8 2,9 2,4 1,9 1,4 0,9 0,7s 0,26 3,14 3,42 1,13 2,10 2,00 1,99 2,33 2,14 1,29 1,20 1,61 1,21 0,68 0,40
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,0016 0,0014 0,0023 0,0292 0,0342 0,0511 0,0363
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 0,2 33,4 36,7 28,0 22,3 16,7 13,7 9,6 6,4 3,7 3,0 1,1 0,6 0,5 0,66 0,2 31,8 35,0 30,0 23,7 17,8 13,9 7,1 6,2 3,1 2,0 0,2 0,3 0,2 0,27 0,8 35,6 37,9 32,5 26,7 21,0 16,8 14,4 13,0 7,0 5,7 2,3 0,9 0,8 0,98 0,6 34,8 39,0 25,2 21,6 14,3 9,9 10,8 8,8 4,1 3,0 1,7 1,5 1,3 1,0
14 0,8 35,5 38,5 21,8 16,6 15,1 9,4 7,7 6,8 5,9 5,0 4,0 2,7 1,9 1,616 0,4 26,3 27,1 25,9 10,5 7,9 7,1 4,4 2,6 3,3 2,9 2,2 1,4 0,9 0,7
0,5 32,9 35,7 27,2 20,2 15,5 11,8 9,0 7,3 4,5 3,6 1,9 1,2 0,9 0,8s 0,26 3,54 4,45 3,78 5,81 4,38 3,59 3,45 3,44 1,59 1,42 1,27 0,87 0,60 0,48
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0002 0,0002 0,0003 0,0008 0,0020 0,0004 0,0007 0,0109 0,0363 0,0222 0,0214
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 0,6 146,6 143,5 122,2 96,6 82,4 50,7 55,8 33,3 33,5 26,4 4,7 2,8 1,9 0,6
10 0,4 150,6 147,1 132,0 110,5 55,6 39,6 37,0 25,2 21,7 17,9 3,1 1,3 0,8 0,211 0,6 155,0 153,2 142,2 117,9 81,0 57,9 53,1 39,1 28,6 22,1 4,1 2,5 1,2 0,912 1,1 155,4 151,5 146,1 127,4 88,7 46,5 40,8 30,3 24,6 22,0 13,6 5,9 3,8 1,020 0,9 135,2 140,0 131,8 117,7 88,9 51,9 48,4 37,1 27,0 20,6 12,1 4,7 0,9 1,622 0,7 125,6 132,6 130,5 115,2 97,9 58,9 53,3 39,3 27,3 22,6 4,2 2,4 1,2 0,7
0,7 144,7 144,7 133,9 114,2 82,4 50,9 48,1 34,1 27,1 21,9 6,9 3,3 1,6 0,8s 0,23 11,95 7,67 8,72 10,23 14,44 7,22 7,60 5,58 3,95 2,76 4,62 1,72 1,14 0,48
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0092 0,0047 0,0405 0,2773
102
Fortsetzung Tab. TA5
Tab. TA6: Auf der Basis der Faktor VIIa-Antigen-Konzentration (FVIIa:Ag) (ng/ml)
errechnete pharmakokinetische Daten zur berechneten (C0-ber) und der gemessenen
Anfangskonzentration des rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) (C0-gem),
Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC), Verteilungsvolumen
(Vdβ ) und Eliminationskonstante (β) nach intravenöser Injektion des rhFVIIa in Gruppen mit
verschiedenen Dosierungen und gesunden Hunden bzw. Hunden mit hereditärem Faktor VII-
Mangel.
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 0,6 138,1 137,1 129,3 77,6 56,8 31,4 24,1 21,1 14,0 6,8 4,1 2,4 1,6 1,315 0,6 143,5 145,9 113,8 78,2 52,3 37,8 23,2 19,5 15,7 15,0 5,8 4,2 2,3 0,717 0,7 151,8 142,3 104,7 73,0 51,4 39,8 24,2 19,1 14,4 12,1 5,4 3,8 3,7 0,821 0,6 134,4 138,5 131,8 77,5 48,3 25,6 17,8 16,1 12,6 6,6 3,2 2,2 1,2 1,1
0,6 142,0 141,0 119,9 76,6 52,2 33,7 22,3 19,0 14,1 10,1 4,6 3,1 2,2 0,9s 0,05 7,55 3,96 12,89 2,41 3,52 6,45 3,04 2,09 1,28 4,12 1,20 0,98 1,10 0,26
pt 0,0000 0,0000 0,0002 0,0000 0,0000 0,0010 0,0004 0,0002 0,0001 0,0096 0,0033 0,0071 0,0306 0,0343
Rechenwert C0-ber C0-gem t50 AUC Cltot Vdβ β Einheit (ng/ml) (ng/ml) (min) (ng/ml x min) (ml/min) (l) (1/min)
Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 1 36,7 35,2 99 2460 40,7 2,73 0,0070 2 40,4 38,4 70,2 1770 56,6 2,47 0,0099 4 34,2 33,4 73,9 1790 55,8 2,92 0,0094 5 33,2 32,5 78,6 1770 56,5 3,01 0,0088
18 37 36,3 99,0 2710 37,0 2,66 0,0070 19 27,6 26,9 99,0 1390 72,1 3,62 0,0070
34,9 33,8 86,6 1982 53,1 2,90 0,0082 s 4,34 3,97 13,8 497 12,7 2,98 0,0013
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 47,4 45,4 73,6 2490 40,1 2,11 0,0094 6 41,7 40,6 59,3 2230 44,8 2,4 0,0117 7 45,5 44,2 98,9 3870 25,9 2,2 0,0070 8 53,4 50,5 99,0 2710 36,9 1,87 0,0070
14 66,1 60,1 99,0 2560 39,0 1,51 0,0070 16 37,2 35,7 98,9 1490 67,0 2,69 0,0070
48,6 46,1 88,1 2558 42,3 2,13 0,0082 10,18 8,46 17,4 774 13,64 0,41 0,0020
103
Fortsetzung Tab. TA6
Rechenwert C0-ber C0-gem t50 AUC Cltot Vdβ β Einheit (ng/ml) (ng/ml) (min) (ng/ml x min) (ml/min) (l) (1/min)
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 171 167 99 13700 36,5 2,92 0,0070
10 168 166 98,5 12500 33,7 2,61 0,0069 11 178 175 99 14200 35,3 2,81 0,0070 12 160 159 43 9930 50,3 3,12 0,0161 20 156 154 99 13500 37 3,2 0,0070 22 145 144 99 14400 34,7 3,45 0,0070
163 160 89,6 13038 37,9 3,02 0,0085 s 11,8 10,9 22,8 1661 6,18 0,29 0,0037
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 146 144 99 5500 90,9 3,43 0,0265 15 165 161 26,1 8620 58 3,03 0,0070 17 188 180 99 8450 59,2 2,66 0,0076 21 174 169 91,6 6960 71,8 2,88 0,0070
167 163 81,1 8513 63,6 3,00 0,0113 s 17,6 15,2 35,4 1459 15,3 0,32 0,0097
104
Tab. TA7: Verlauf der Standard-Prothrombinzeit (PTST) (sec) nach Injektion von
rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte,
arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p-Wert für den statistischen
Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor
VII-Mangel.
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)
1 5,6 4,0 4,1 4,5 4,6 4,9 5,3 4,9 5,1 5,3 5,7 5,5 5,5 5,7 7,12 6,8 3,8 3,8 3,8 3,8 4,1 4,1 4,1 4,3 4,2 4,3 4,5 4,7 5,0 6,34 6,3 4,0 4,2 4,0 3,9 3,8 4,3 4,2 4,4 4,2 4,7 4,3 4,9 4,3 5,95 6,0 4,0 3,8 4,2 3,8 4,0 4,1 3,9 4,1 4,0 4,1 4,0 4,8 5,0 6,0
18 7,5 4,0 4,0 4,1 4,0 4,0 4,1 4,0 4,2 5,2 5,4 5,6 5,3 5,4 7,019 8,3 3,8 4,0 4,1 4,1 4,0 4,1 4,4 4,5 4,3 4,7 5,1 5,1 5,6 8,1
6,75 3,93 3,98 4,11 4,03 4,13 4,33 4,25 4,43 4,53 4,81 4,83 5,05 5,16 5,40s 1,01 0,10 0,16 0,23 0,3 0,39 0,48 0,36 0,36 0,56 0,62 0,66 0,31 0,52 0,94
pt 0,0007 0,0011 0,0006 0,0009 0,0018 0,0036 0,0015 0,0023 0,0030 0,0057 0,0028 0,0054 0,0056 0,0394
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 17,5 4,0 4,1 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,2 4,4 5,1 5,9 6,5 8,7 16,36 17,0 3,8 3,8 4,5 3,6 3,7 4,1 4,0 4,9 5,1 4,8 5,7 5,6 8,0 16,87 15,3 4,0 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,4 5,1 5,5 6,0 7,4 14,28 17,5 4,0 4,0 4,0 3,8 4,0 4,0 3,9 4,5 4,5 5,0 5,5 6,0 7,7 14
14 14,7 4,3 4,1 4,0 4,0 4,1 4,2 4,4 4,5 4,2 5,3 5,9 6,6 9,1 14,116 17,0 3,8 3,9 4,1 4,2 4,4 4,4 4,3 4,5 4,4 4,6 5,6 6,4 9,3 12,8
16,50 3,98 3,98 4,06 3,93 4,02 4,12 4,10 4,43 4,50 4,98 5,68 6,18 8,37 14,70s 1,20 0,18 0,12 0,22 0,21 0,24 0,16 0,20 0,31 0,31 0,25 0,18 0,38 0,78 1,53
pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0218
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 6,8 4,0 4,0 4,0 4,1 4,0 3,8 4,0 4,0 4,2 4,6 4,5 4,5 5,0 5,5
10 6,1 3,8 3,8 3,8 3,8 4,0 4,1 4,0 4,0 4,0 4,6 4,4 5,0 5,0 5,711 6,6 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,3 4,3 4,5 4,5 4,7 5,512 6,8 4,5 4,6 4,5 4,5 4,2 4,5 4,5 4,5 4,5 4,6 4,8 4,8 5,0 5,820 7,8 4,0 4,0 4,1 4,0 4,2 4,3 4,1 4,0 4,3 4,5 4,5 4,8 5,4 6,722 8,0 4,3 4,6 4,5 4,5 4,5 4,4 4,6 4,7 4,5 4,6 4,7 5,3 6,4 7,9
7,01 4,10 4,17 4,15 4,15 4,15 4,18 4,20 4,21 4,30 4,53 4,57 4,81 5,25 6,18s 0,73 0,25 0,34 0,29 0,29 0,20 0,26 0,28 0,31 0,19 0,12 0,15 0,31 0,61 0,95
pt 0,0001 0,0001 0,0000 0,0001 0,0000 0,0001 0,0001 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0218
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 14,5 3,9 3,8 3,7 3,6 4,0 4,1 4,0 3,8 4,0 4,0 4,2 5,8 6,9 11,915 16,8 4,0 4,0 4,1 4,2 4,2 4,4 4,3 4,5 4,5 4,6 4,5 5,2 6,8 12,317 14,4 4,0 4,2 4,0 3,9 3,9 4,1 4,0 4,4 4,8 5,0 5,7 6,1 7,2 10,22 13 4,2 4,1 4,0 4,1 4,0 4,1 4,1 4,2 4,5 4,4 4,3 4,5 5,4 9,4
14,68 4,03 4,03 3,95 3,95 4,02 4,18 4,10 4,22 4,45 4,55 4,67 5,40 6,58 10,95s 1,57 0,13 0,17 0,17 0,26 0,13 0,15 0,14 0,31 0,33 0,44 0,69 0,70 0,80 1,38
pt 0,0005 0,0005 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0007 0,0006 0,0005 0,0015 0,0005
105
Tab. TA8: Verlauf der Prothrombinzeit-modifizierter Test (PTMT) (Prozent der Norm) nach
Injektion von rekombinantem humanen Faktor VIIa in verschiedenen Dosierungen –
Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den
statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit
hereditärem Faktor VII-Mangel.
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)
1 77 121 153 129 138 129 123 119 119 105 98 78 72 66 682 90 174 144 153 153 140 124 129 104 105 106 88 84 83 794 66 140 149 149 134 134 134 120 112 120 108 106 84 85 795 75 153 150 153 155 147 150 144 144 136 140 154 109 95 82
18 58 178 167 155 129 116 105 113 110 108 97 100 88 69 5819 64 165 105 119 150 142 136 110 113 121 110 102 92 82 77
71.67 155,17 144,67 143,00 143,17 134,67 128,67 122,50 117,00 115,83 109,83 104,67 88,17 80,00 73,83
s 11,43 21,79 20.92 15,18 10,91 11,09 15,17 12,41 14,09 12,22 15,70 26,28 12,21 10,77 9,11pt 0,0003 0,0003 0,0001 0,0000 0,0000 0,0002 0,0001 0,0008 0,0010 0,0017 0,0217 0,0364 0,1003 0,3188
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 20 130 130 145 155 160 140 112 140 90 73 57 49 35 206 25 201 169 174 163 159 160 120 112 88 48 44 41 40 287 20 150 150 146 155 140 140 124 124 97 82 64 55 38 208 20 129 132 140 143 125 110 133 105 92 73 60 46 38 20
14 39 153 151 137 113 124 129 129 109 97 87 96 60 41 4016 30 150 132 133 128 130 124 117 109 112 109 84 73 50 32
25,67 144,00 144,00 145,83 142,83 139,67 133,83 122,50 116,50 96,00 78,67 67,50 54,00 40,33 26,67
s 7,65 15,45 15,43 14,63 19,04 16,38 17,02 7,76 13,21 8,65 20,02 19,05 11,45 5,16 8,26pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0004 0,0003 0,0004 0,0013 0,0553
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 76 207 194 197 150 165 163 140 140 140 120 113 113 97 78
10 72 240 220 235 161 174 153 153 128 124 128 113 84 80 7211 75 236 251 257 186 204 178 182 174 167 166 159 129 104 8012 74 213 203 220 144 163 172 163 174 170 156 154 134 107 8420 74 232 311 325 253 260 211 216 211 186 160 144 124 95 6122 70 235 228 262 197 204 197 151 151 132 121 105 95 88 73
73,5 227,3 234,5 249,3 181,8 195,0 179,00 167,50 163,00 153,17 141,83 131,33 113,17 95,17 74,67
s 2,16 10,25 31,31 32,76 40,47 36,74 21,58 27,65 29,81 24,60 21,05 23,69 19,91 10,03 8,04pt 0,0000 0,0003 0,0002 0,0007 0,0002 0,0000 0,0002 0,0003 0,0002 0,0002 0,0008 0,0017 0,0009 0,3634
106
Fortsetzung Tab. TA8
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 37 186 202 225 235 218 194 160 144 128 107 96 77 64 5115 34 193 205 190 194 205 184 200 200 184 146 136 100 52 3217 25 176 186 186 172 169 165 154 154 116 76 74 69 62 2721 38 218 228 234 224 204 178 163 163 170 159 136 113 88 67
33,5 193,3 205,3 208,8 206,3 199 180,25 169,25 165,25 149,50 122,00 110,50 89,75 66,50 44,25s 5,91 102,65 49,71 42,22 45,48 20,99 12,12 20,83 24,43 32,63 37,79 30,78 20,32 15,26 18,35
pt 0,0129 0,0012 0,0010 0,0013 0,0001 0,0000 0,0005 0,0009 0,0022 0,0066 0,0053 0,0035 0,0086 0,1103
107
Tab. TA9: Verlauf der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) (sec) nach Injektion
von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen –
Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den
statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit
hereditärem Faktor VII-Mangel.
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)
1 15,3 15,2 14,9 15,6 15,2 15,0 15,3 16,0 15,8 15,0 15,7 16,2 15,5 15,8 16,12 18,3 16,7 17,8 17,8 14,5 16,4 15,9 15,3 15,9 15,1 17,3 17,2 17,6 17,3 17,54 18,6 16,8 17,8 16,5 16,8 17,0 16,8 18,7 18,3 18,7 18,7 18,8 17,9 17,0 16,85 17,5 17,0 17,5 16,8 17,5 17,8 17,3 20,5 17,0 17,0 17,0 16,2 16,3 17,4 16,6
18 16,3 15,0 15,4 15,3 15,1 15,4 15,7 15,6 15,4 15,9 15,5 15,8 15,8 15,9 16,219 15,4 14,7 14,9 14,8 15,0 15,2 15,1 14,8 14,9 14,8 14,9 15,1 14,9 15,0 15,3
16,90 15,90 16,38 16,13 16,17 16,13 16,02 16,82 16,22 16,08 16,52 16,55 16,33 16,40 16,41s 1,44 1,04 1,46 1,11 1,08 1,12 0,86 2,26 1,24 1,52 1,41 1,30 1,19 0,97 0,74
pt 0,0073 0,0053 0,0301 0,0487 0,0539 0,0392 0,4607 0,0709 0,0771 0,0697 0,1716 0,0142 0,0764 0,1201
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 16,3 14,8 14,8 15,0 15,1 14,9 15,0 16,5 14,1 15,5 16,6 16,5 17,1 17,0 17,36 16,0 15,5 14,5 15,3 14,4 14,0 14,1 14,3 15,4 15,0 14,6 14,6 15,1 16,2 16,37 15,1 14,4 14,5 14,4 14,6 15,4 15,0 16,0 15,3 15,5 19,0 15,5 16,1 15,8 17,08 15,1 16,0 14,5 15,0 16,0 16,5 11,8 11,0 12,3 11,7 14,3 14,5 14,1 15,5 16,6
14 15,8 15,7 15,8 15,3 15,7 15,7 15,5 16,0 15,9 15,8 15,9 16,0 15,8 16,4 16,716 14,5 14,0 14,3 14,2 14,0 14,3 14,2 14,5 14,2 14,3 14,3 14,4 14,2 14,3 14,2
15,30 15,07 14,73 14,87 14,96 15,13 14,26 14,71 14,53 14,63 15,78 15,25 15,40 15,87 16,35s 0,54 0,79 0,46 0,46 0,78 0,93 1,32 2,03 1,30 1,53 1,83 0,88 1,16 0,92 1,11
pt 0,1819 0,0217 0,0036 0,1789 0,3633 0,0539 0,2532 0,0770 0,1516 0,2808 0,4479 0,4165 0,0413 0,0191
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 15,1 13,5 13,6 13,7 13,8 14,2 14,3 14,5 15,1 15,3 16,0 15,7 16,1 15,8 15,8
10 14,8 13,2 13,0 13,2 13,5 13,4 14,1 14,3 15,0 14,9 16,8 16,0 16,6 16,3 16,011 14,4 12,7 13,0 12,4 12,8 12,7 13,8 14,1 14,5 14,5 15,5 15,5 15,5 14,9 15,512 14,8 12,9 13,8 12,9 13,5 13,0 14,3 14,3 14,7 14,4 15,0 14,5 15,2 14,5 14,320 14,4 12,5 13,1 13,0 12,8 13,7 13,2 13,6 13,2 13,0 13,5 13,2 13,5 13,7 13,822 14,6 13,0 12,7 13,0 13,3 13,2 13,0 13,1 13,3 13,4 13,5 13,3 13,6 13,7 14,0
14,68 12,97 13,20 13,03 13,28 13,37 13,78 13,98 14,30 14,25 15,05 14,70 15,08 14,81 14,90s 0,27 0,35 0,41 0,42 0,41 0,53 0,56 0,53 0,84 0,88 1,34 1,23 1,28 1,07 0,98
pt 0,0000 0,0001 0,0000 0,0000 0,0004 0,0017 0,0050 0,1128 0,0966 0,2450 0,4861 0,2140 0,3691 0,2853
108
Fortsetzung Tab. TA9
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 14,1 12,5 13,1 12,5 12,8 12,9 13,5 13,5 13,8 14,3 15,0 14,4 15,0 14,3 14,915 15,3 15,5 15,4 15,4 15,2 15,3 15,5 15,6 15,8 15,5 15,6 15,3 15,3 15,4 15,517 17,0 16,4 15,9 16,2 16,4 16,3 16,5 16,4 16,8 16,4 15,9 16,3 16,0 16,2 15,721 14,5 12,7 12,7 12,6 12,4 12,8 12,9 12,7 12,4 12,9 13,0 13,1 12,9 13,1 13,2
15,22 14,28 14,28 14,18 14,20 14,32 14,60 14,55 14,70 14,78 14,88 14,78 14,83 14,75 14,83s 1,28 1,97 1,61 1,91 1,92 1,75 1,69 1,74 1,98 1,52 1,30 1,36 1,34 1,34 1,14
pt 0,0667 0,047 0,0505 0,0498 0.0446 0,0951 0,1076 0,2067 0,1848 0,2907 0,1606 0,2485 0,1508 0,3289
109
Tab. TA10: Verlauf der Thrombozytenzahl (x 103/µl) nach Injektion von rekombinantem
humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte, arithmetischer
Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p-Wert für den statistischen Vergleich mit dem 0-
Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel.
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)
1 305 245 252 310 274 266 291 285 265 279 285 267 274 169 3092 275 276 277 305 309 314 298 322 323 355 337 279 149 245 3274 304 246 283 258 235 248 238 214 260 274 252 231 226 229 2575 313 285 274 272 294 296 288 279 278 274 258 269 267 252 292
18 272 269 275 246 218 262 277 274 270 291 290 289 274 274 28119 352 313 292 273 247 282 278 301 306 309 283 271 320 311 298
304 272 276 277 263 278 278 279 284 297 284 251 252 247 294s 29,2 25,6 13,3 25,4 35,4 24,2 21,3 36,4 25,2 31,4 30,2 44,7 58,5 47,5 24,0
pt 0,0168 0,0263 0,0798 0,0846 0,0851 0,129 0,1228 0,3764 0,3764 0,1963 0,0420 0,0180 0,0157 0,2910
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 337 231 245 263 270 284 275 268 263 271 236 243 229 220 2736 414 406 390 375 379 313 418 459 422 421 370 421 442 426 4627 382 373 362 387 373 360 367 357 338 337 323 341 313 308 3118 267 281 295 304 277 278 313 271 282 302 288 286 277 288 333
14 339 292 351 336 306 307 291 294 316 318 362 310 327 356 32616 431 473 400 434 469 412 420 398 414 392 363 374 418 381 375
362 343 341 350 346 326 347 341 339 340 324 329 334 330 347s 60,1 90,3 59,6 61,5 76,3 51,3 63,6 77,3 66,4 56,5 53,1 63,6 81,8 76,3 65,5
pt 0,2048 0,1338 0,2449 0,1697 0,0340 0,2016 0,1327 0,0784 0,1069 0,0611 0,0571 0,1242 0,1161 0,2822
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 381 353 359 392 326 391 386 374 378 380 338 313 308 368 333
10 386 343 279 349 352 348 352 297 314 322 311 275 297 293 26711 295 205 320 275 315 312 278 284 276 283 318 232 236 243 20312 318 256 258 272 292 267 280 246 275 276 260 269 270 232 23820 338 203 298 341 287 304 300 351 261 258 246 256 224 221 21422 275 308 244 282 271 297 273 279 270 280 292 286 227 279 279
332 278 293 319 307 320 312 305 296 300 294 272 260 273 256s 45,1 66,6 42,3 42,3 29,6 43,6 45,7 48,0 44,5 44,3 35,4 27,4 36,7 54,3 47,9
pt 0,0338 0,0396 0,1131 0,0431 0,1951 0,0222 0,0908 0,0207 0,0368 0,0547 0,0076 0,0005 0,0141 0,0058
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 281 167 304 243 312 301 283 296 294 268 259 230 254 275 26215 469 363 434 403 487 429 399 413 389 417 391 344 349 354 38117 478 494 480 449 534 611 555 648 444 438 429 427 422 426 45721 211 250 248 242 272 274 259 267 249 239 288 249 210 266 260
360 319 367 334 401 404 374 406 344 341 342 313 309 330 340s 134 141 108 107 128 153 135 173 88,6 101 81,2 91,2 95,2 75,1 96,4
pt 0,1892 0,6522 0,1501 0,0135 0,1568 0,3434 0,2001 0,2944 0,1786 0,3150 0,1257 0,0702 0,2360 0,2655
110
Tab. TA11: Verlauf der Hämatokritwerte (%) nach Injektion von rekombinantem humanen
Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert
( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-
Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel.
Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)
1 42,9 40,7 46,8 42,1 39,2 42,2 47,2 47,6 39,9 42,8 40,5 40,1 43,2 41,6 43,72 42,5 42,8 43,2 43,2 42,7 42,3 45,2 51,2 51,7 49,3 46,8 41,6 41,8 39,8 49,44 42,8 40,2 43,5 40,7 39,7 39,5 40,5 45,7 43,2 43,2 41,7 42,7 39,8 43,5 43,55 41,5 38,3 38,9 39,7 39,2 39,1 42,5 42,8 41,2 42,3 41,7 44,6 40,0 40,6 37,7
18 39,2 38,3 40,5 37,9 41,2 41,9 37,4 39,8 42,1 41,9 41,5 41,3 43,3 44,5 43,819 37,7 39,2 39,7 38,8 40,0 40,7 40,5 39,9 37,1 39,5 36,8 40,3 41,0 39,4 40,1
41,10 39,92 42,10 40,40 40,33 40,95 42,22 44,50 42,53 43,16 41,50 41,77 41,52 41,57 43,03s 2,16 1,72 2,96 2,01 1,37 1,41 3,55 4,52 4,96 3,27 3,20 1,68 1,52 2,05 3,97
pt 0,0862 0,1509 0,1256 0,2530 0,4462 0,1764 0,0186 0,2232 0,0508 0,3543 0,2559 0,3640 0,3513 0,1272
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 45,5 41,6 43,4 42,4 39,6 43,9 42,6 39,9 37,6 41,8 40,9 45,1 39,6 42,6 49,36 31,9 31,5 32,8 31,1 34,6 32,2 40,0 38,5 37,5 35,5 33,6 35,0 36,9 38,0 35,17 41,9 38,4 36,0 39,6 39,0 38,4 40,8 40,9 39,9 42,4 39,5 42,3 41,5 42,5 42,68 42,7 40,7 42,0 40,1 40,2 38,5 44,1 43,6 44,7 46,9 47,6 49,4 48,0 42,9 46,5
14 36,8 39,2 37,3 37,5 36,6 38,2 36,8 36,0 35,6 33,9 34,0 35,4 34,7 36,9 33,016 36,9 36,4 37,3 38,1 38,6 36,0 38,6 34,5 37,1 34,8 32,7 36,5 35,6 36,3 37,4
39,28 37,97 38,13 38,13 38,10 37,87 40,48 38,90 38,73 39,22 38,05 40,62 39,38 39,87 40,65s 4,97 3,65 3,92 3,84 2,11 3,82 2,65 3,32 3,23 5,24 5,77 5,93 4,92 3,12 6,52
pt 0,1128 0,1614 0,0897 0,2035 0,0843 0,2360 0,4131 0,3885 0,4817 0,2283 0,1660 0,4786 0,3258 0,1529
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 41,7 35,7 36,0 36,2 34,0 37,6 40,5 37,7 36,3 40,2 36,6 34,8 36,2 40,1 39,2
10 49,5 48,4 48,8 44,0 42,9 44,1 43,0 41,1 40,7 44,1 39,9 41,5 41,2 43,6 41,011 44,8 45,2 47,7 47,2 48,5 48,8 44,4 43,5 42,2 40,5 41,6 40,8 43,5 44,4 42,012 47,8 42,5 41,8 42,0 44,0 42,0 44,1 41,6 42,0 43,7 43,1 44,0 45,0 46,7 41,120 46,4 42,2 42,9 44,5 43,7 44,2 42,7 41,7 40,6 40,9 36,5 41,3 41,9 41,9 36,122 42,9 44,9 43,0 46,5 45,0 43,8 42,8 43,7 42,8 41,9 43,5 42,4 43,5 47,4 39,0
45,52 43,15 43,37 43,40 43,02 43,41 42,91 41,55 40,77 41,88 40,20 40,80 41,88 44,02 39,73s 2,96 4,28 4,59 3,99 4,83 3,63 1,38 2,17 2,35 1,67 3,10 3,15 3,09 2,79 2,13
pt 0,0683 0,0974 0,1376 0,1197 0,1205 0,0250 0,0163 0,0059 0,0029 0,0111 0,0036 0,0187 0,1787 0,0035
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 39,2 34,6 39,3 40,0 40,5 38,4 42,2 41,0 40,0 42,3 44,7 42,0 42,3 43,1 43,015 51,0 41,5 47,5 43,5 47,1 44,2 42,1 41,8 43,4 39,7 42,3 43,9 42,0 41,1 40,917 32,9 33,1 35,7 31,1 32,4 31,2 30,7 30,3 33,2 34,5 33,7 35,2 33,9 34,0 33,721 39,5 39,6 38,7 38,7 39,0 38,7 42,1 41,6 44,0 44,0 41,5 41,6 42,7 44,1 39,8
40,65 37,20 40,30 38,33 39,75 38,13 39,28 38,68 40,15 40,13 40,55 40,68 40,23 40,58 39,35s 7,54 3,99 5,05 5,23 6,03 5,33 5,72 5,59 4,96 4,15 4,76 3,79 4,23 4,56 3,99
pt 0,1158 0,4025 0,1442 0,2341 0,0890 0,3270 0,2541 0,4284 0,4472 0,4879 0,4961 0,4464 0,4918 0,3486
111
Tab. TA12: Antikörperbildung (in ELISA-Einheiten) vor sowie 2, 4 und 12 Wochen nach
Injektion von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen
in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel.
nach Injektion Hund vor Injektion 2 Wochen 4 Wochen 12 Wochen
Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 1 0,27 4 16 3 2 0,42 8 14 22 4 0,22 8 7 1 5 0,41 23 30 4
18 0,09 62 12 5 19 0,02 400 227 11
Median (Min-Max.)
0,25 (0,02-0,42)
16 (4-400)
15 (7-227)
4,5 (1-22)
Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 0,01 353 5 0 6 1,09 25 11 2 7 nicht auswertbar 8 0,00 7 0 0
14 0,00 1 0 0 16 0,43 9 8 6
Median (Min-Max.)
0,01 (0,00-1,09)
9 (1-353)
5 (0-11)
0 (0-6)
Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 0,00 12 41 14
10 0,00 193 83 0 11 0,02 153 122 128 12 0,06 163 264 10 20 0,13 304 141 5 22 0,00 78 22 0
Median (Min-Max.)
0,01 (0-0,13)
158 (12-304)
103 (22-264)
7,5 (0-128)
Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 0,00 168 138 124 15 0,02 42 36 55 17 0,00 75 9 1 21 0,00 111 61 1
Median (Min-Max.)
0,00 (0,00-0,02)
93 (42-168)
49 (9-138)
28 (1-124)
112
Danksagung Ein besondere Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Mischke für die Überlassung des interessanten
Themas und den unermüdlichen Ansporn zur Anfertigung der Arbeit.
Ein ganz besonderer Dank gilt Meike Diedrich, die mit mir lange Zeit eine Leidensgenossin
war, und mir dankenswerterweise einen Teil ihres Themas überließ.
Ein weiterer Dank geht an Prof. Dr. H. J. Schuberth, der mir bei der Durchführung der
ELISA-Tests jederzeit aufmunternde Hilfestellung gab.
Auch bei Prof. Dr. M. Kietzmann möchte ich mit bedanken für die sehr freundliche
Unterstützung bei den pharmakokinetischen Berechnungen und die anregenden Gespräche.
Bedanken möchte ich mich auch bei Prof. Dr. A. Günzel-Apel für die Möglichkeit einen der
Beagles ihres Institus für die Studie verwenden zu dürfen.
Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei Ruth Höinghaus und Jens Rohwer für die
Unterstützung in normalen und extremen Krisenzeiten.
Ein herzlicher Dank geht auch an die Mitarbeiter der Klinik für kleine Haustiere, die mit bei
den Probenentnahmen und auch sonst tatkräftig zur Seite gestanden haben.
Besonderen Dank schulde ich auch Brigitte Schäffner, Dirk Menzel, Ingrid Luther-Thomas
und Detlef Kemmesies für die fachliche und moralische Unterstützung bei den Arbeiten im
Labor.
Ferner möchte ich mich bei Prof. Dr. W. Leibold und seinen Assistenten Julia Heselhaus,
Katrin Langner, Anja Wege, Dimitrij Bessonov, Alexeij Dronov, Rimantas Stakauskas und
Giedrus Guzys, sowie bei Silke Schöneberg und Udo Rabe für ihre fachliche Hilfe und die
sehr freundliche Aufnahme in ihrer Runde und die hochinteressanten Gespräche während des
Wartens auf den ELISA bedanken.