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transcript
Tierärztliche Hochschule Hannover
Zentrum für Infektionsmedizin, Institut für Mikrobiologie und Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin/Ambulatorische Klinik
Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer Streptococcus suis- Ganzzell- und einer Subunitvakzine
INGUAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Katharina Bennecke aus Braunschweig
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Prof. Dr. K. H. Waldmann
1. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Prof. Dr. K. H. Waldmann
2. Gutachter: PD Dr. E. große Beilage
Tag der mündlichen Prüfung: 15. Mai 2008
Meinen Eltern
Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert bzw. eingereicht:
BEINEKE,A., BENNECKE,K., NEIS,C., SCHRÖDER,C., WALDMANN,K.H.,
BAUMGÄRTNER,W., VALENTIN-WEIGAND,P., BAUMS,C.G. (2007)
Comparative evaluation of virulence and pathology of Streptococcus suis serotype 2
and 9 in experimentally infected growers
Vet Microbiol. in press (Available online 4. November 2007).
BENNECKE, K., SCHRÖDER, C., WALDMAN, K.H., BEINEKE, A., GOETHE, R.
VALENTIN-WEIGAND, P. , BAUMS, C.G.
„Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer S. suis -Ganzzell- und
einer Subunitvakzine“ auf dem 27. DVG-Kongress „Tierseuchenbekämpfung im
Spannungsfeld zwischen Wissenschaft und öffentlichen Interresse“ am 12.4.-
14.4.2007 in Berlin, Poster.
Inhalt
1 Einleitung........................................................................................11
2 Literatur...........................................................................................13
2.1 S. suis............................................................................................................ 13
2.2 Klinik von S. suis- Infektionen........................................................................ 13
2.3 Pathologie von S. suis- Infektionen ............................................................... 14
2.4 Diagnostischer Nachweis von S. suis............................................................ 15
2.5 Epidemiologie von S. suis ............................................................................. 18
2.6 Pathogenese von S. suis- Infektionen ........................................................... 18
2.7 Virulenzfaktoren von S. suis .......................................................................... 19
2.8 Therapie und Prophylaxe von S. suis- Infektionen ........................................ 21
2.9 Immunisierungen zum Schutz gegen S. suis- Infektionen ............................. 21
2.10 Subunitvakzinen ............................................................................................ 23
2.10.1 Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien ................................................. 24
3 Material und Methoden ..................................................................26
3.1 S. suis-Stämme ............................................................................................. 26
3.2 Kultivierung der Bakterien ............................................................................. 26
3.3 Gewinnung und Einstellung der Belastungskultur ......................................... 27
3.4 Durchführung der Infektionsversuche (Allgemeine Ausführungen) ............... 27
3.4.1 Tierversuchsgenehmigungen.................................................................. 27
3.4.2 Herkunftsbestand.................................................................................... 28
3.4.3 Klinische Untersuchung .......................................................................... 28
3.4.4 Entnahme von Blutproben für die Erstellung eines Blutbildes und
Gewinnung von Serum ........................................................................... 29
3.4.5 Anästhesie der Versuchstiere ................................................................. 30
3.4.6 Ablauf der Sektion zur Untersuchung auf eine S. suis-Infektion ............. 30
3.4.7 Pathohistologische Untersuchung .......................................................... 31
3.5 Etablierung des Tiermodells für S. suis-Serotyp 9......................................... 32
3.5.1 Intranasale Infektion................................................................................ 32
3.5.2 Intravenöse Infektion............................................................................... 32
3.6 Herstellung der Vakzinen .............................................................................. 33
3.6.1 Ganzzellvakzine...................................................................................... 33
3.6.2 Subunitvakzine ....................................................................................... 33
3.7 Immunisierungsversuche............................................................................... 34
3.7.1 Immunisierungsversuche mit homologer Belastungsinfektion ................ 35
3.7.2 Immunisierungsversuch mit heterologer Belastungsinfektion ................. 35
3.8 Kulturelle Untersuchung auf S. suis .............................................................. 36
3.9 Genotypische Differenzen von S. suis........................................................... 37
3.9.1 Präparation chromosomaler Streptokokken-DNA ................................... 37
3.9.2 Multiplex-PCR......................................................................................... 39
3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ............................................. 40
3.11 Herstellung eines rekombinanten EF-Fragmentes (rEFfrag) als ELISA-
Antigen .......................................................................................................... 43
3.11.1 Herstellung eines Anti-rEF Antiserums ................................................... 44
3.11.2 Bestimmung der Proteinkonzentration .................................................... 44
3.11.3 SDS-PAGE ............................................................................................. 44
3.11.4 Comassieblau-Färbung........................................................................... 45
3.11.5 Western Blot (BURNETT 1981) .............................................................. 46
3.12 Statistische Auswertung der Ergebnisse ....................................................... 46
4 Ergebnisse......................................................................................47
4.1 Etablierung eines S. suis-Serotyp-9-Tiermodells........................................... 47
4.1.1 Vergleichende experimentelle Infektion mit S. suis-Serotyp 2 und
Serotyp-9-Stamm A3286/94 ................................................................... 47
4.1.2 Pathologische und pathohistologische Befunde nach
experimentellen Infektionen mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-
Stamm A3286/94 .................................................................................... 48
4.1.3 Reisolierung der Belastungsstämme (A3286/94 und Stamm 10) ........... 52
4.2 Protektive Wirkungen einer Ganzzell- und Subunitvakzine gegenüber
homologen und heterologen Belastungsinfektionen mit S. suis-Serotyp 2
bzw. 9 Stämmen............................................................................................ 53
4.2.1 Protektive Wirkung einer S. suis-Ganzzellvakzine.................................. 54
4.2.2 Untersuchung der protektiven Wirkung einer S. suis-Subunitvakzine
aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) .............................................. 59
4.3 Antikörperantworten von Schweinen nach experimenteller Infektion mit
S. suis- Serotyp-2-Stamm 10 und Serotyp-9-Stamm A3286/94 .................... 70
4.3.1 Experimentelle Infektion zur Etablierung des S. suis-Serotyp-9-
Stamm A3286/94 Modells....................................................................... 70
4.3.2 Immunisierungs- und Belastungsversuche ............................................. 72
4.3.3 Abschätzung der Bedeutung von MRP- und MAP-spezifischen
Antikörpertitern (Gesamt IgG) als prognostische Indikatoren ................. 77
5 Diskussion ......................................................................................79
6 Zusammenfassung ........................................................................85
7 Summary.........................................................................................88
8 Literaturverzeichnis .......................................................................90
9 Anhang..........................................................................................105
9.1 Abbildungsverzeichnis..................................................................................116
9.2 Tabellenverzeichnis......................................................................................118
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
A. bidest. Aqua bidestilla (zweifach destilliertes Wasser)
AFLP engl.: amplified fragment-length polymorphism
AH Aluminiumhydroxid
AK Antikörper
Appl. Applikationsart
APS Ammonium Persulfate
bzw. beziehungsweise
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
cps engl.: capsular polysaccharides
Da Dalton
dATP 2’-Desoxy-Adenosin-5’-Triphosphat
dCTP 2’-Desoxy-Cytosin-5’-Triphosphat
dGTP 2’-Desoxy-Guanosin-5’-Triphosphat
d.h. das heißt
DIVA engl.: differentiating infected from vaccinated animals
DNA engl.: desoxyribonucleic acid
dNTP 2’-Desoxy-Nukleotid-5’-Triphosphat
dpi engl.: days post infectionem
dTTP 2’-Desoxy-Thymidin-5’-Triphosphat
EDTA engl.: ethylendiamine-tetraaceticacid
EF Extrazellulär Faktor
ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assey
et al. et ali
evtl. eventuell
FIA engl. : Freund’s incomplete adjuvans
fbl. engl.: final bleeding
gdh Glutamatdehydrogenase
ggf. gegebenenfalls
ggr. geringgradig
GZV Ganzzellvakzine
hgr. hochgradig
i.m. Intramuskulär
i.n. intranasal
insb. insbesondere
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
i.v. intravenös
LB Luria-Bertani
K Kontrollgruppe
KBE Kolonie bildende Einheit
kg Kilogramm
M Molar
MAP Murein-assoziierte Proteine
min. Minuten
mg Milligramm
mgr. mittelgradig
ml Milliliter
MLST engl.: multi locus sequence typing
mM millimolar
MP-PCR Multiplex PCR
MRP engl.: muramidase-released protein
MW Mittelwert
NaCl Natrium-Chlorid
OD Optische Dichte
ÖW Öl-in-Wasser
OFS engl.: opacity factor of S. suis
PBS engl.: phosphate buffered saline
PCR engl.: polymerase chain reaction
POD Peroxidase
prae imm. prae immun
PRRS Porzines Respiratorisches und Reproduktives Syndrom
post imm. post immun
prae Inf prae infectionem
post Inf. post infectionem
S. Streptococcus
SAS Statistical Analysis System for Windows
SDS engl.: sodium dodecylsulfate
SDS-PAGE engl.: sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SLY Suilysin
ST Serotyp
Taq Thermus aquaticus
TCA Trichloressigsäure
TEMED Tetramethylethylendiamin
TEN Tris EDTA NaCl
THB Todd-Hewitt Broth
Th Helfer –T-Lymphozyten
TSB Tryptone Soya Broth
WO Wasser-in-Öl
(w/v) engl.: weight per volume (Gewicht pro Volumen)
V Volt
(v/v) engl.: volume per volume (Volumen pro Volumen)
z.B. zum Beispiel
Einleitung
11
1 Einleitung
Streptococcus (S.) suis kann beim Schwein, vor allem in den ersten Lebenswochen,
Meningitis, Septikämie, Polyarthritis und plötzliche Todesfälle hervorrufen (BUSQUE
et al. 1997; HOLT et al. 1989; LAPOINTE et al. 2002; PALLARES et al. 2003;
REAMS et al. 1994). Zudem ist S. suis ein Zoonoseerreger, der beim Menschen vor
allem Meningitis auslösen kann (ARENDS u. ZANEN 1988; BUSQUE et al. 1997;
HOLT et al. 1989; LAPOINTE et al. 2002; REAMS et al. 1994). S. suis-Erkrankungen
gehören zu den Faktorenerkrankungen, da neben dem Infektionserreger biotische
und abiotische Faktoren eine wichtige Rolle für die Krankheitsentstehung spielen
(BAUMS et al. 2006; BERTHELOT-HERAULT et al. 2001; BERTHELOT-HERAULT
et al. 2005; CLIFTON-HADLEY et al. 1986).
Darüber hinaus besitzt der Erreger die Fähigkeit, Tonsillen, Schleimhäute des
Nasopharynx und des Genitaltraktes zu besiedeln, ohne jedoch eine Erkrankung
auszulösen (CLIFTON-HADLEY u. ALEXANDER 1980; KING et al. 2002; NORTON
et al. 1999; WILLIAMS et al. 1973). Inapparente Trägertiere können Ferkel mit einem
virulenten S. suis-Stamm durch Kontakt, wie zum Beispiel über den Genitaltrakt der
Sau, infizieren (CLIFTON-HADLEY et al. 1986).
Aufgrund der hohen Diversität der Kapselpolysaccharide sind derzeit 33 Serotypen
von S. suis bekannt. In Mitteleuropa werden Erkrankungen beim Hausschwein
hauptsächlich durch die Serotypen 2 und 9 verursacht (WISSELINK et al. 2001).
Für die Prophylaxe von S. suis-Erkrankungen steht in Deutschland kein kommerziell
erhältlicher Impfstoff zur Verfügung. Bei Bestandsproblemen mit S. suis werden oft
stallspezifische Vakzinen eingesetzt. Bei diesen handelt es sich um inaktivierte
Ganzzellvakzinen. S. suis-Subunitvakzinen kamen bis heute nur in experimentellen
Untersuchungen zum Einsatz. Experimentell wurden für unterschiedliche
Immunogene protektive Wirkungen gegenüber einer homologen Belastungsinfektion
aufgezeigt, d. h. Belastungsinfektionen mit dem selben Stamm. In der Praxis ist aber
auch mit dem Auftreten unterschiedlicher Serotypen zu rechnen, so dass die
protektive Wirkung gegenüber heterologen Serotypen für den Erfolg eines
Impfstoffes entscheidend ist. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der
Etablierung eines experimentellen Modells für Serotyp-9-Infektionen im Schwein.
Einleitung
12
Dieses Modell sollte in Immunisierungsversuchen zur Untersuchung auf eine
heterologe Protektion gegenüber Serotyp 2 und Serotyp 9 eingesetzt werden. In
Vorarbeiten war bereits ein S. suis-Serotyp-2-Modell etabliert worden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die protektive Wirkung einer Subunitvakzine mit
einem Ganzzellimpfstoff in homologen und heterologen Belastungsversuchen
verglichen. Da viele Oberflächenproteine von Bakterien wichtige Antigene darstellen,
wurde die Subunitvakzine auf der Basis der Murein-assoziierten Fraktion hergestellt.
Literatur
13
2 Literatur
2.1 S. suis
Bei S. suis handelt es sich um unbewegliche, grampositive, ovoide Kokken mit einer
Größe von ca. 1 μm. Diese liegen in Paaren oder selten in Kurzketten vor. Sie zeigen
ein fakultativ anaerobes Wachstum (KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987). Die
Kolonien auf Blutagar haben nach 24 Stunden Bebrütung einen Durchmesser von
1-2 mm und sind grau und teilweise schleimig. Auf Schafblutagar zeigt S. suis eine
α-Hämolyse.
2.2 Klinik von S. suis- Infektionen
S. suis ist in der Lage, beim Schwein eine Reihe von sehr unterschiedlichen
Krankheitsbildern hervorzurufen. Nach einer Inkubationszeit von zwei bis zehn
Tagen treten klinische Veränderungen in Abhängigkeit von dem Manifestationsorgan
auf (WALDMANN u. WENDT 2004). Bei der „Enzootischen Streptokokkenmeningitis“
stellen sich im Verlauf der Erkrankung neben unspezifischen Symptomen, wie
Inappetenz und Fieber, zentralnervöse Störungen ein. Dies äußert sich meist in
motorischen Ausfallerscheinungen, wie Ataxien und Paresen. Häufig ist dieses
Erscheinungsbild mit einem Opisthotonus verbunden. Im fortgeschrittenen Stadium
treten Seitenzwangslage und Nystagmus auf. Im Zusammenhang mit einer
S. suis-Infektion kommt es weiterhin häufig zu akuten und hochgradigen Lahmheiten
mit schmerzhafter Schwellung und Rötung der Gelenke. Wenn mehrere Gelenke
betroffen sind, kann es zum Festliegen der Tiere kommen. Die Synovia hat meist
einen serofibrinösen bis eitrigen Charakter. Bei einer akuten S. suis-assoziierten
Peritonitis zeigen die Tiere eine Kyphose und eine starke Bauchdeckenspannung.
Bei einer Pleuritis kommt es zu erhöhter Atemfrequenz: Der Atemtyp wechselt von
costoabdominal zu abdominal. Des Weiteren können Pneumonie, Otitis media und
Endocarditis auftreten (REAMS et al. 1994; STAATS et al. 1997; STAATS et al.
1998a; STAATS et al. 1998b; STAATS et al. 1999a; STAATS et al. 1999b;
TORREMORELL u. PIJOAN 1998). Bei zentralnervösen Störungen sind neben der
Steptokokkenmeningitis noch Morbus Aujeszky, Kochsalzvergiftung und die
Krampfformen der Kolienterotoxämie differentialdiagnostisch in Betracht zu ziehen
Literatur
14
(WALDMANN u. WENDT 2004). Die Haemophilus parasuis Polyserositis ist eine
wichtige Differentialdiagnose zur S. suis-assoziierten Peritonitis und Pleuritis.
2.3 Pathologie von S. suis- Infektionen
Fibrinös-eitrige Meningitiden gehören neben den akuten eitrigen Polyarthritiden,
fibrinösen Pleuritiden und Peritonitiden zu den pathologischen Veränderungen bei
S. suis-Serotyp-2-Infektionen. In Untersuchungen von MADSEN et al. (2002) über
S. suis-Serotyp 2, in denen nur die infizierten Tiere mit Läsionen berücksichtigt
wurden, zeigten 81% der Tiere typischene makroskopische Läsionen einer diffusen
exsudativen Meningitis, während 24% der Tiere eine exsudative Arthritis aufwiesen.
WILLIAMS und BLAKEMORE (1990b) fanden nach experimenteller intravenöser
Infektion die ersten Veränderungen im Gehirn am Plexus choroideus (Tabelle 1). Die
Autoren postulierten daher, dass der Eintritt von S. suis-Serotyp 2 ins Gehirn über
den Plexus choroideus erfolgt. S. suis-Infektionen manifestieren sich weiterhin häufig
in Gelenken, vor allem im Tarsal– und Karpalgelenk, und an der Serosa (WILLIAMS
u. BLAKEMORE 1990a). Bei einer Serositis, die auch mehrere Körperhöhlen
betreffen kann, treten fibrinöse Veränderungen auf (WILLIAMS u. BLAKEMORE
1990a). SANDFORD (1987) untersuchte pathologische und histologische
Veränderungen bei 53 Schweinen mit Anzeichen einer S. suis-Meningitis. Subakute
Meningoencephalitis und Meningoencephalomyelitis waren die häufigsten
Diagnosen, wobei das Alter der Tiere zwischen 5 Tagen und 26 Wochen lag. Häufige
pathologische Diagnosen waren außerdem Hyperämie der Gefäße und Blutungen im
Liquor cerebrospinalis. Histologisch konnten subakute und chronische
Leptomeningitis und Encephalitis festgestellt werden (SANFORD et al. 1987).
Weitere Untersuchungen zur Pathologie von S. suis-Serotyp 9-Infektionen wurden
von VASCONCELOS et al. (1994) durchgeführt. Das Krankheitsbild ähnelte sehr
dem der S. suis-Serotyp-2-Infektion. Auch hier erkrankten die Tiere an Meningitis,
Arthtritis, Peritonitis und Pleuritis. Der Schwerpunkt der Erkrankung lag allerdings bei
der Arthritis.
Literatur
15
2.4 Diagnostischer Nachweis von S. suis
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, S. suis zu identifizieren. Alle S. suis-Stämme
wachsen auf Nährboden mit Schaf- oder Pferdeblut (DEVRIESE et al. 1991). Auf
Schafblutagar wachsen sie mit einer α-Hämolyse, auf Pferdeblutagar mit einer
β-Hämolyse. Bei mikroaerophiler Anzucht verstärken sich das Wachstum und die
Hämolyse (DEVRIESE et al. 1991). TARRADAS et al. (1994) stellten Vergleiche der
biochemischen Profile verschiedener Serotypen auf und konnten eine große
Heterogenität feststellen. Zur Identifikation von S. suis sind dennoch nur einige
wenige Parameter in Betracht zu ziehen. Der Voges-Proskauer- Test (VP) ermöglicht
die Differenzierung von S. suis und S. bovis. Bei S. suis ist der VP-Test negativ
(HIGGINS u. GOTTSCHALK 1990; TARRADAS et al. 1994). Des Weiteren kann
S. suis Äskulin zu Glucose und Äsculetin spalten, Äsculetin reagiert daraufhin mit
FeIII-Ionen. Trehalose wird ebenfalls gespalten. Ferner wächst S. suis nicht in
Abwesenheit von 6,5% NaCl (TARRADAS et al. 1994).
Eine Identifikation von S. suis-Isolaten kann auch durch eine Genotypisierung
erfolgen. OKWUMABUA et al. (2003) zeigten, dass durch den Nachweis des
gdh-Gens (Glutamat-Dehydrogenase) von S. suis mit der PCR der Erreger von
anderen Streptokokken unterschieden werden kann. Durch eine Multiplex-PCR nach
SILVA et al. (2006) ist es möglich, den Erreger durch ein gdh spezifisches Amplifikat
nachzuweisen und gleichzeitig die Serotypen 1, 2, 7 und 9 zu differenzieren.
Über die Immunhistochemie gibt es eine weitere Möglichkeit, eine S. suis-Infektion
zu diagnostizieren. MADSEN et al. (2002) stellten Vergleiche zwischen der
bakteriologischen Untersuchung und der Immunhistochemie an. Nach ihren
Ergebnissen korrelierten bei 50% der Tiere beide Untersuchungsmethoden
miteinander.
Literatur
16
Tabelle 1: Vergleiche von Tiermodellen für S. suis- Stamm (nur Wildtyp Stämme)
Literatur
17
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Literatur
18
2.5 Epidemiologie von S. suis
Zurzeit sind 33 Serotypen von S. suis bekannt, die anhand ihrer unterschiedlichen
Kapselpolysaccharide differenziert werden. Als Krankheitserreger ist der Serotyp 2
der am häufigsten vorkommende Serotyp weltweit (KING et al. 2002; MAROIS et al.
2007; STAATS et al. 1997; WISSELINK et al. 2000).
Die Verbreitung der Serotypen von S. suis kann regional sehr unterschiedlich sein.
Es besteht außerdem die Möglichkeit, dass sich die Prävalenzen der Serotypen in
einer Region verändern (KING et al. 2002; WISSELINK et al. 2001). So war in
Dänemark 1983 der Serotyp 7 und 1998 hauptsächlich der Serotyp 2 vorhanden
(AARESTRUP et al. 1998; PERCH et al. 1983). In den Niederlanden ist seit 1995
nicht mehr der Serotyp 2, sondern der Serotyp 9 am häufigsten (JACOBS et al.
1995; VECHT et al. 1985; WISSELINK et al. 2001). Serotyp-9-Stämme wurden in
Europa außerdem noch in Belgien und Deutschland häufig von erkrankten
Schweinen isoliert (WISSELINK et al. 2001). In Spanien kommt der Serotyp 9 mit
einer Prävalenz von 64,9% vor, gefolgt von Serotyp 2 mit 14,8% (VELA et al. 2003).
In England waren früher 1 und 14 die am häufigsten aus erkrankten Tieren isolierten
Serotypen (WISSELINK et al. 2001), seit einigen Jahren dominiert hier Serotyp 2
(HIGGINS et al. 1995).
2.6 Pathogenese von S. suis- Infektionen
Eine wichtige Eintrittsforte für S. suis ist der obere Respirationstrakt. Dort besiedelt
S. suis die Tonsillen und die Conchae nasales, wo dieser Erreger inapparent
persistieren kann (BAELE et al. 2001). Die Trägerrate von S. suis-Serotyp 2 variiert
zwischen 0 und 80% sehr stark. Bei vier bis zehn Wochen alten Ferkel ist die
Mehrheit der Tiere Träger von S. suis (CLIFTON-HADLEY et al. 1984). Bei S. suis-
Erkrankungen handelt es sich meist um Faktorenerkrankungen, das heißt, dass
biotische und/oder abiotische Faktoren die Erkrankung begünstigen. Zu den
biotischen Faktoren gehören virale Primärerkrankungen im Atmungstrakt, wie zum
Beispiel PRRS (GALINA et al. 1994; SCHMITT et al. 2001). Eine prädisponierende
Wirkung kann aber auch von anderen Erregern ausgehen. Durch experimentelle
Untersuchungen konnten VECHT et al. (1992) beispielsweise zeigen, dass durch
Bordetella bronchiseptica verursachte Schleimhautläsionen S. suis leichter in den
Literatur
19
Wirtsorganismus eindringen kann (Tabelle 1). Zu den prädisponierenden abiotischen
Faktoren zählen unter anderem Stallüberbelegung, schlechte Lüftung und Umstallen
(HEINRITZI 1998).
Monozyten gelangen über das Blut in die Tonsillen und nehmen S. suis auf. Es wird
angenommen, dass die Monozyten-assoziierten Bakterien über das Blut und den
Plexus choroideus in den Liquor cerebrospinales gelangen (GALINA et al. 1994;
GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; WILLIAMS u. BLAKEMORE 1990b).
2.7 Virulenzfaktoren von S. suis
Die Kapsel schützt S. suis vor der Phagozytose, so dass der Erreger im
Wirtsorganismus überleben kann (GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; SMITH et al.
1999). Die bisherigen Untersuchungen zur Bedeutung der Kapsel als Virulenzfaktor
beziehen sich auf die S. suis-Serotypen 2 und 1.
VECHT et al. (1992) beschreiben zwei Proteine, die als Faktoren hochvirulenter
Serotyp 1 und 2 Stämme eine wichtige Rolle spielen können. Zum einen das
„Muramidase-released Protein“ (MRP), das eine Größe von 136 kDa hat, und zum
anderen der „Extracellular Factor“ (EF) mit einer Größe von 110 kDa. Die
dazugehörigen Gene werden mit mrp und epf bezeichnet. Innerhalb des Serotyps 2
lassen sich durch die Differenzierung von MRP und EF drei unterschiedlich virulente
S. suis-Phänotypen differenzieren. Tierexperimentelle Untersuchungen von VECHT
et al. (1992) haben gezeigt, dass MRP+EF+ Serotyp-2-Stämme wesentlich virulenter
sind als MRP+ EF* oder MRP- EF- Serotyp-2-Stämme. Der Phänotyp MRP+ EF* wird
aufgrund der tierexperimentellen Ergebnisse für das Schwein als schwach virulent
beschrieben (VECHT et al. 1991). Trotzdem zeigten epidemiologische
Untersuchungen eine große Bedeutung von MRP+ EF* Serotyp-2-Stämmen für
invasive S. suis-Erkrankungen in Mitteleuropa und Brasilien (MARTINEZ et al. 2003;
SILVA et al. 2006; WISSELINK et al. 2001). S. suis-Isolate von erkrankten Menschen
gehören auch auffallend häufig zu diesem Phänotyp (GOTTSCHALK u. SEGURA
2000; SMITH et al. 1999; VECHT et al. 1992). Der Großteil der S. suis-Serotyp-2-
Erkrankungen von Schweinen in Europa geht aber auf MRP+ EF+ Stämme zurück
(GOTTSCHALK u. SEGURA 2000; SMITH et al. 1999; WISSELINK et al. 2001).
Da für isogene mrp und epf Mutanten keine Abschwächung in experimentellen
Infektionen nachgewiesen werden konnte (VECHT et al. 1991), ist bis heute unklar,
Literatur
20
welche Bedeutung MRP und EF als putativen Virulenzfaktoren zukommt. Bei einer
Studie von SMITH et al. (1993) ergaben vergleichende Untersuchungen über EF*
und EF+, dass bei EF* zusätzliche Sequenzabschnitte vorhanden sind, ansonsten
sind diese beiden Proteine aber identisch. Aufgrund der unterschiedlichen
Längenvarianten wurde EF* in die Klassen eins bis fünf eingeteilt. Allerdings wird
bisher davon ausgegangen, dass nur das 110 kDa EF mit der Virulenz von
S. suis-Infektionen assoziiert ist.
Auch bei MRP gibt es verschiedene Varianten, die kleinere Variante wird mit MRPs,
die größeren mit MRP* bzw. MRP** bezeichnet. SILVA et al. (2006) etablierten eine
PCR zur Differenzierung der unterschiedlichen mrp-Varianten.
S. suis-Serotyp-2-Stämme besitzen überwiegend die mrp+ Variante, die für das
136 kDa Protein kodiert. Serotyp 9-Isolate aus Mitteleuropa enthalten meistens die
mrp* Variante, die etwas größer ist (MRP*: 151 kDa).
Ein weiterer wichtiger Virulenz-assoziierter Faktor ist das Hämolysin Suilysin (Gen:
sly). Es hat eine Größe von 54 kDa und gehört zur Familie der Thiol-aktivierten
Zytolysine (JACOBS et al. 1994). Bei in vitro Versuchen konnte eine zytotoxische
Wirkung des Suilysins festgestellt werden (NORTON et al. 1999). Das Suilysin
könnte durch die Lyse von Epithel- und Endothelzellen das Überwinden der
Schleimhautbarriere erleichtern. Es wurde gezeigt, dass nicht alle virulenten Stämme
Suilysin produzieren (ALLGAIER et al. 2001; JACOBS et al. 1994).
Auch der Serumtrübungsfaktor OFS (BAUMS et al. 2006) und das Fibronektin- und
Fibrinogen-Bindeprotein (FBP) von S. suis (DE GREEFF et al. 2002) gehören zu den
Virulenz-assoziierten Faktoren.
Neben MRP, EF und Suilysin spielen noch andere Faktoren bei der Pathogenese
eine Rolle, wie z.B. die Arginin Deiminase (ArcA). GRUENING et al (2006)
untersuchten die Struktur, Regulation und Funktion des ArcA bei S. suis und fanden
heraus, dass ArcA an der Zelloberfläche von S. suis exprimiert wird. Weitere
Untersuchungen zeigten, dass die ArcA-Aktivität mit reduzierten Sauerstoff und
Glucosegehalt ansteigt (FULDE 2007; GRUENING et al. 2006). Im Gegensatz dazu
wird ArcA durch einen Temperaturanstieg von 32°C auf 42°C induziert. ArcA verleiht
S. suis die Fähigkeit, im sauren Milieu überleben zu können (GRUENING et al. 2006;
WINTERHOFF et al. 2002). Diese Funktion könnte für die Pathogenese von S. suis
eine wichtige Rolle spielen, da S. suis in sauren Kompartimenten innerhalb der
Wirtszellen überleben kann.
Literatur
21
In Immunisierungsversuchen mit rekombinantem Surface antigen one (SAO) konnte
eine Protektion gegenüber homologen Belastungsinfektionen aufgezeigt werden
(LI et al. 2007).
2.8 Therapie und Prophylaxe von S. suis- Infektionen
Zu den prophylaktischen Maßnahmen gehören Verminderung von Stressfaktoren,
Verbesserung der Stallhygiene, Vermeidung einer Stallüberbelegung und eine gute
Belüftung der Stallungen. Ist ein Tier dennoch an einer S.suis-Infektion erkrankt,
kann eine antibiotische Behandlung zur Heilung führen. Erfolgt keine Therapie, führt
die Erkrankung häufig innerhalb von wenigen Tagen zum Tode (WALDMANN u.
WENDT 2004). Eine wirksame Prophylaxe ist eine Immunisierung, auf die im
Folgenden näher eingegangen wird.
2.9 Immunisierungen zum Schutz gegen S. suis- Infektionen
Gegenwärtig ist kein kommerzieller Impfstoff in Deutschland verfügbar. Bei
Bestandsproblemen wird häufig eine stallspezifische Vakzine eingesetzt. Diese
Impfstoffe sind mit Formalin inaktivierte Ganzzellimpfstoffe, die unter Verwendung
eines von dem entsprechenden Bestand isolierten S. suis-Stammes hergestellt
werden. WISSELINK et al. (2001,2002a) konnten durch experimentelle
Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer inaktivierten Ganzzellvakzine einen
Schutz dieser Vakzine aufzeigen (Tabelle 2).
Um eine Erkrankung der Ferkel zu minimieren, ist es möglich, eine
Muttertiervakzination, z.B. in der sechsten und zweiten Woche vor der Geburt,
durchzuführen. Somit wird der Antikörperspiegel gegen S. suis in der Kolostralmilch
erhöht (HAESEBROUCK et al. 2004).
WISSELINK et al. (2001), JACOBS et al. (1996) und LI et al. (2006, 2007) führten
Immunisierungsversuche mit Virulenz-assoziierten Faktoren durch. Versuche mit
einem rekombinanten Impfstoff wurden bis jetzt nur von LI et al. (2007)
unternommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Immunisierungsversuche mit einer heterologen Belastungsinfektion, d. h. mit einem
anderen Serotyp als dem, der für die Vakzine verwendet wurde, wurden noch nicht
Literatur
22
beschrieben. Eine Serotyp-übergreifende Schutzwirkung ist daher bis heute für keine
S. suis-Vakzine nachgewiesen worden.
Tabelle 2: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit experimenteller Belastungsinfektion (Auswahl)
Autoren Anzahl
der Tiere
Adjuvans/ Besonder-
heit Impfstoff
Belastungsstamm
(Serotyp)
Morbidität/Mortalität geimpfte Tiere(%)
Morbidität /Mortalität
Kontrolltiere(%)
LACOBS et al. 1996 3 Diluvac
Forte SLY ST 2 (P 1/7)1 20/ 0 100/100
152 Lebend-impfstoff
ST 2 (#1330)
ST 2 (# 999) 6,6/ 0 73 / 53
BUSQUE et al. 1997
153 Lebend-impfstoff
ST 2 (#1330)
ST 2 (# 999) 20 /6,6 20/6,6
HALBUR et al. 2000 10 -
PRRSV und ST2
(ISU VDL 40634/94)
Inaktivierte GZV
(SS VX)4 40/40 63/63
4 WO5 MRP (Subunit)
ST 2 (# 4005)6 -7/75
4 WO EF (Subunit)
ST 2 (# 4005) 6 -7/75
4 WO MRP und
EF (Subunit)
ST 2 (# 4005) 6 -7/25
-7/100
5 WO inaktivierte
GZV9
(#4005)
ST 2 (# 3881)6 -7/0 -7/75
5 AH8 MRP und
EF (Subunit)
ST 2 (# 3881) 6 -7/40
WISSELINK et al. 2001
5 AH inaktivierte GZV9
ST 2 (#3881) 6 -7/80
-7/80
Literatur
23
Autoren Anzahl
der Tiere
Adjuvans/ Besonder-
heit Impfstoff
Belastungsstamm
(Serotyp)
Morbidität/Mortalität geimpfte Tiere(%)
Morbidität /Mortalität
Kontrolltiere(%)
5 WO
inaktivierteKapsel-mutante
(10cps∆EF)
ST 2 (#10)10 80/0
5 Lebend- impfstoff 10cps∆EF ST 2
(#10) 10 100/40
WISSELINK et al. 2002b
5 WO 10 ST 2 (#10) 10 0/0
100/100
LI et al.2006 8 ÖW11 SAO12
(re-kombinant)
ST 2 (#166) 37,5 / 37,5 37,5 / 37,5
FITTIPALDI et al. 2007 7 Lebend-
impfstoff BD 101 ST 2 (S735) 0 / 0 100/100
LI et al. 2007 12 Saponin13
SAO (re-
kombinant)ST 2 (#166) 18/18 58/58
1 hochvirulenter MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stamm 2 Die Tiere wurden dreimal immunisiert 3 Die Tiere wurden zweimal immunisiert 4 Es erfolgten zwei Immunisierungen, die erste mit Emulsigen®, die zweite mit Aluminiumhydroxid als
Adjuvans. 5 Wasser-in-Öl Emulsion 6 MRP +EF+ 7 Keine Angaben 8 Aluminiumhydroxid 9 Ganzzellvakzine 10 Stamm 10 (MRP+EF+SLY+) 11 Emulsigen® 12 Surface antigen one
13Quil A®
2.10 Subunitvakzinen
Subunitvakzinen basieren im Gegensatz zu Ganzzellvakzinen auf immunogenen
viralen oder bakteriellen Bestandteilen. Es wird nicht mehr der gesamte Erreger als
Impfstoffgrundlage verwendet, dafür aber eine Anreicherung der immunogenen
Strukturen, wodurch eine stärker ausgeprägte Immunantwort erzielt werden soll
(VETION 2007). Subunitvakzinen sind jedoch, mehr als Ganzzellvakzinen, auf den
Literatur
24
Zusatz von Adjuvantien für eine ausreichend hohe Stimulationswirkung angewiesen
(GUPTA et al. 1993; HOLT et al. 1989; REAMS et al. 1994). Bis heute sind nur
wenige Subunitvakzine von S. suis im Tierversuch auf ihre protektive Wirkung
getestet worden. WISSELINK et al. (2001) untersuchten eine Subunitvakzine auf der
Grundlage von MRP und EF und erreichten damit eine partielle protektive Wirkung
gegenüber einer homologen Belastungsinfektion mit einem MRP+ EF+ SLY+ S. suis-
Serotyp-2-Stamm (Tabelle 2). Das Suilysin von S. suis erzeugte ebenfalls als
Subunitvakzine eine partielle protektive Wirkung gegenüber einer homologen
Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stamm
(Tabelle 2).
2.10.1 Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien
Die Applikation von Proteinen ohne Zusätze induziert häufig nur eine schwache, kurz
andauernde Immunantwort. Für eine bessere immunogene Wirkung werden
Gemische aus dem Protein und einem Adjuvans eingesetzt (JANEWAY 2002).
Adjuvantien (lat., adjuvare= helfen) sind definiert als eine Gruppe heterologer
Bestandteile, die verwendet werden, um eine Immunantwort auf ein Antigen zu
erreichen oder zu verstärken (GUPTA et al. 1993; SCHIJNS 2000).
In der Veterinärmedizin werden Adjuvantien bei Totimpfstoffen und Toxoiden
eingesetzt, um den Antikörpertiter zu erhöhen. Bei Tieren werden häufig Mineralgele,
wie z.B. Aluminiumhydroxid, verwendet. Diese induzieren eine starke Th 2 Antwort,
sind sicher und preiswert (COX u. COULTER 1997). Mineralgele, aber auch
Öl-in-Wasser-Emulsionen, verzögern die Freisetzung von Antigen und verstärken die
Aufnahme von Antigen in die Makrophagen (JANEWAY 2002). Öl-in-Wasser-Emulsionen bestehen aus Mikrotropfen Öl, typischerweise aus Squalen
oder Squalane, mit einer Größe von 200 nm, die in einer kontinuierlichen
Wasserphase durch oberflächenaktive Stoffe stabilisiert werden. Sie sind sicher,
preiswert und gut geeignet für amphipathische Moleküle. Für die Wirksamkeit ist es
wichtig, das Immunogen in die Ölphase einzugliedern (COX u. COULTER 1997).
Emulsigen® ist ein Beispiel für eine Öl-in-Wasser-Emulsion. Es ist eine sterile,
milchig-weiße Emulsion, die durch einen Depoteffekt die Antigene nach und nach
freisetzt und zum Schutz gegen Bakterien und Viren eine humorale Immunantwort
Literatur
25
auslöst. Emulsigen® kann bei Ganzzell- und Subunitvakzinen eingesetzt werden
(MVP LABORATORIES 2006).
Wasser-in-Öl-Emulsionen bestehen hingegen aus Mikrotropfen Wasser, die in einer
kontinuierlichen Ölphase durch einen Oberflächen-aktiven Stoff, wie Mannit-
Monooleat, stabilisiert werden. Bei der Ölphase handelt es sich meist um Mineralöle,
Squalen oder Squalane wie zum Beispiel beim “Freund’s incomplete adjuvans“
(FIA).
WISSELINK et al. (2001) vergleichen in S. suis-Immunisierungsexperimenten das
Adjuvans Aluminiumhydroxid mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion. Die Autoren stellten
fest, dass die Wasser-in-Öl-Emulsion in Bezug auf die Stimulation der
Antikörperbildung und einer protektiven Immunität dem Aluminiumhydroxid
wesentlich überlegen war (Tabelle 2).
Material und Methoden
26
3 Material und Methoden
3.1 S. suis-Stämme
Der hochvirulente Serotyp 2 S. suis-Stamm 10 wurde für die Herstellung der
Ganzzell- und der Subunitvakzine sowie zur homologen Belastungsinfektion
eingesetzt. Dieser Stamm exprimiert eine Vielzahl Virulenz-assoziierter Faktoren,
insbesondere MRP, EF, SLY, FBPS, ArcA und OFS (BAUMS et al. 2006; DE
GREEFF et al. 2002; FULDE 2007; WISSELINK et al. 2001). In verschiedenen
experimentellen Infektionsversuchen (Tabelle 1) konnte mit dem S. suis-Stamm 10
eine hohe Mortalität bei Absetzferkeln und Läuferschweinen hervorgerufen werden
(BAUMS et al. 2006; DE GREEFF et al. 2002; SMITH et al. 1993). Für die
heterologen Belastungsinfektionen wurde auf den Serotyp-9-Stamm A3286/94
zurückgegriffen. A3286/94 wurde ursprünglich von einem Schwein mit Meningitis
isoliert (ALLGAIER et al. 2001; REHM et al. 2007). Dieser Stamm besitzt eine große
Variante des MRP (MRP*) und enthält das Suilysingen sly (SILVA et al. 2006).
Sowohl Stamm 10 als auch A3286/94 wurden weiterhin für die Gewinnung von
Antigenen für unterschiedliche ELISA-Tests genutzt. Außerdem konnten REHM et al.
2007 mittels der „Amplified Fragment-Lenth Polymorphism“ (AFLP) und Multi-locus
sequence typing (MLST) zeigen, dass A3286/94 eine große genotypische Ähnlichkeit
mit anderen invasiven Serotyp-9- Isolaten besitzt.
3.2 Kultivierung der Bakterien
S. suis wurde auf Columbia Nährboden mit 6% Schafblut (im Folgenden:
Blutnährboden) (Oxoid, Wesel), in BactoTM „Todd Hewitt Broth“ (THB) oder in
„Tryptone Soya Broth“ (TSB), (Becton Dickson Diagnostik, Heidelberg) kultiviert. Bei
der Herstellung der Vakzinen wurden Sterilitäts- und Reinheitskontrollen der
Flüssigkulturen durch fraktionierte Ausstriche auf Blutnährböden durchgeführt. Die
Anzüchtung von E. coli erfolgte in flüssigen oder auf festen Luria-Bertani (LB) Medien
bei einer Temperatur von 37°C. Für die Selektion von E. coli-Klonen wurden folgende
Antibiotikakonzentrationen eingesetzt: 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin.
Material und Methoden
27
3.3 Gewinnung und Einstellung der Belastungskultur
Für die Gewinnung der Belastungskulturen für beide Infektionsrouten (i.n. und i.v.),
wurden 500 μl einer Übernachtkultur in 100 ml frisches TSB-Medium überführt. Die
Inkubation der Kultur erfolgte bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3. Es folgte die
Zentrifugation der Kultur für 10 min. bei 9270 x g mit anschließender Resuspension
des Sediments in 3 ml PBS. Die Tiere wurden mit 1,7 ml von dieser Suspension
infiziert. Durch Anlegen einer Verdünnungsreihe und Auftropfen von dreimal 20 μl
dieser Suspension auf eine Blutagarplatte konnten die KBE durch Auszählung
bestimmt werden. Aufgrund der Durchführbarkeit wurden Platten mit 20-100 KBE
ausgezählt. Anschließend erfolgte die Berechnung der KBE/ μl.
3.4 Durchführung der Infektionsversuche (Allgemeine Ausführungen)
3.4.1 Tierversuchsgenehmigungen
Im Rahmen dieser Dissertation sollten unterschiedliche Infektionsversuche mit
Schweinen durchgeführt werden. Die Etablierung eines Tiermodells für
S. suis-Serotyp-9-Infektionen fiel unter den Tierversuchsantrag „Infektion von
Schweinen mit S. suis zur Bestimmung der infektiösen Keimzahl, die Septikämie-
bzw. Meningitissymptome nach intranasaler oder intravenöser Applikation auslöst“
(Genehmigung: 509.6-42502-04/829, ehemalige Bezirksregierung Hannover). In den
Immunisierungsversuchen dieser Arbeit wurde die protektive Wirkung einer
S. suis-Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen mit einer Ganzzellvakzine
verglichen (Genehmigungen: 33-42502-06/1063 und 1093, ehemalige
Bezirksregierung Hannover). Die Behandlung der Tiere stand im Einklang mit der
“European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for
Experimental and Other Scientific Purposes” (European Treaty Series, no. 123:
http://conventions.coe.int/treaty/EN/Menuprincipal.htm).
Material und Methoden
28
3.4.2 Herkunftsbestand
Die für die gesamten experimentellen Versuche eingesetzten 82 Tiere kamen von
einem Schweinebestand der Züchtungszentrale Deutsches Hybridschwein. Dieser
Betrieb ist frei von sly+ mrp+ epf+ cps2+ und sly+ mrp* cps9+ S. suis-Stämmen
(BAUMS 2007).
3.4.3 Klinische Untersuchung
Während der gesamten Versuchszeit wurden die Tiere morgens und abends auf
ihren klinischen Allgemeinzustand untersucht. Zunächst erfolgte eine Adspektion, bei
der der Ernährungszustand, die Anteilnahme an der Umgebung, die Haltung, die
Bewegung, das Fress- und das Sozialverhalten der Tiere erfasst wurde. Die
Körperinnentemperatur wurde bei allen Tieren morgens und abends gemessen.
Beim Auftreten von Fieber (> 40,5°C), bei einer Störung des Allgemeinbefindens
oder bei spezifischen Anzeichen einer S. suis-Erkrankung, insb. bei zentralnervösen
Störungen oder Lahmheiten, wurde eine genauere klinische Untersuchung
durchgeführt. Nach der Auskultation von Herz und Lunge der erkrankten Tiere
erfolgte eine Untersuchung des Bewegungsapparates mit Adspektion und Palpation
der Gelenke sowie die Untersuchung des Nervensystems, die sich auf die
Anteilnahme an der Umgebung, Haltung und Bewegung des Tieres beschränkte. Bei
einer hochgradigen oder einer persistierenden, d. h. länger als 24 h anhaltenden,
mittelgradigen Störung des Allgemeinbefindens, wurden die Tiere durch eine
intravenöse Applikation mit Pentobarbital euthanasiert. Zentralnervöse Störungen
oder Anzeichen einer akuten Polyarthritis waren in jedem Fall ausreichende Kriterien
für die unmittelbare Euthanasie des entsprechenden Schweines.
Material und Methoden
29
3.4.4 Entnahme von Blutproben für die Erstellung eines Blutbildes und Gewinnung von Serum
Tabelle 3: Zeitpunkte der Blutentnahmen
Tage der Blutentnahme Probenart 1 3 Tage vor der Immunisierung EDTA-Blut, Serum
Tag der ersten Immunisierung EDTA-Blut
1 Tag nach der ersten Immunisierung EDTA-Blut
Tag der 2. Immunisierung EDTA-Blut
2 Tage nach der 2. Immunisierung EDTA-Blut, Serum
Tag der Belastungsinfektion2 EDTA-Blut, Serum
2 Tage nach Belastungsinfektion EDTA-Blut, Serum
4 Tage nach der Belastungsinfektion EDTA-Blut
6 Tage nach der Belastungsinfektion EDTA-Blut
10 Tage nach der Belastungsinfektion EDTA-Blut, Serum 1 EDTA-Blut für die Untersuchung eines Blutbildes. Serum für die Bestimmung des
Antikörpertiters. 2 Beginn der Blutentnahme für den Etablierungsversuch für S. suis-Serotyp-9-Infektion
Für die Blutentnahme wurden die Tiere in Rückenlage fixiert. Die Entnahme erfolgte
aus der Vena cava cranialis. Das Manubrium sterni und die erste Rippe dienten als
Orientierungspunkte. Der Einstich wurde senkrecht und ggf. leicht median
durchgeführt. Bei den oben aufgeführten Probenentnahmen (Tabelle 3) wurde ein
9 ml EDTA-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) und ggf. noch ein 10 ml Serum-
Röhrchen (Sarstedt) gefüllt. Die Zählung der Leukozyten im Haemozytometer und
deren Differenzierung in klassischen Blutausstrichen nach Wright wurde
dankenswerter Weise von dem Labor der Klinik für kleine Klauentiere und
forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik ausgeführt. Vor der Gewinnung des
Serums erfolgte für einige Stunden eine Kühlung der mit Blut gefüllten
Serum-Röhrchen auf 8°C. Anschließend wurden die Röhrchen für 5 min. bei
3000 x g zentrifugiert. Der Überstand (Serum) wurde in 2 ml Reaktionsgefäße
(Sarstedt) überführt und bis zur Bestimmung der Antikörpertiter bei -70°C gelagert.
Die Antikörperbestimmung erfolgte im Serum, welches drei Tage vor der
Material und Methoden
30
Immunisierung und am Tag der Belastungsinfektion entnommen worden war. Die
übrigen Serumproben wurden für weitere Untersuchungen bei –70°C asserviert.
3.4.5 Anästhesie der Versuchstiere
Eine Anästhsie der Tiere erfolgte zur komplikationslosen Entnahme der
Tupferproben von der Tonsillenoberfläche, der Applikation von Essigsäure und zur
anschließenden Infektion mit S. suis. Die Anästhesie wurde mit 2 mg Azaperon/kg
Körpergewicht und 10 mg Ketamin/kg Körpergewicht durch intramuskuläre
Applikation am Ohrgrund des Tieres durchgeführt.
3.4.6 Ablauf der Sektion zur Untersuchung auf eine S. suis-Infektion
Die Durchführung der Sektion und weitere postmortale Untersuchungen der
Schweine verfolgten das Ziel, das Vorliegen einer S. suis-Infektion abzuklären und
dadurch verursachte krankhafte Veränderungen zu erfassen. Mit Ausnahme von
zusätzlichen Gelenkuntersuchungen bei Lahmheiten wurden von jedem Tier die
gleichen Proben für die bakteriologischen und histologischen Untersuchungen
gewonnen. Grundsätzlich erfolgte von jeder histologisch untersuchten Lokalisation
auch eine kulturelle bakteriologische Untersuchung auf S. suis.
Nach der Euthanasie wurden zunächst ein Tarsalgelenkpunktat und Liquor
cerebrospinalis gewonnen und makroskopisch beurteilt. Die entsprechenden
Hautbereiche wurden vor der Punktion rasiert und mit 80% Ethanol desinfiziert. Die
Punktion zur Gewinnung des Liquor cerebrospinalis erfolgte durch das Foramen
atlanto-occipitale. Bei einer Lahmheit wurde zusätzlich auch eine Punktion des
betroffenen Gelenkes durchgeführt. Bei Unklarheit, insbesondere bei makroskopisch
unauffälligen Gelenkpunktaten, wurden alle Gelenke der betroffenen Gliedmaße
punktiert.
Nach dem Anbringen von Entlastungsschnitten und dem Enthäuten der ventralen
Bauchdecke wurde die Bauchhöhle von kaudal nach kranial in der Linea alba
eröffnet. Vor der vollständigen Öffnung der Bauchhöhle wurde eine Tupferprobe vom
Peritoneum für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Im Anschluss folgte
die adspektorische und palpatorische Untersuchung der Bauchhöhle und deren
Organe. Für die histologischen Untersuchungen wurden von Leber, Milz und
Material und Methoden
31
Peritoneum Organstücke in Formalin fixiert. Benachbarte Gewebestücke von Milz
und Leber wurden für die bakteriologische Untersuchung gewonnen. Nach der
Eröffnung des Thorax in der Rippen-Rippenknorpelgrenze von kaudal nach kranial
wurden Pleura- und Perikardhöhle mit Tupfern beprobt. Zusammen mit der Zunge,
dem Waldeyerschen Rachenring, Trachea und Ösophagus wurden die Brustorgane
exenteriert. Nach der Adspektion und Palpation der exenterierten Organe wurde ein
Lobus cranialis der Lunge sowie die Tonsilla veli palatini für weitere bakteriologische
und histologische Untersuchungen entnommen. Zusätzlich wurden Pleura costalis
aus einem Interkostalspalt und Synovialmembran von allen punktierten Gelenken,
d. h. mindestens von einem Tarsalgelenk, in Formalin fixiert. Untersuchungen auf
Endokarditis, Otitis media und Otitis interna wurden im Rahmen dieser Dissertation
nicht durchgeführt. Diese Entscheidung stand im Zusammenhang mit Erfahrungen
aus vorangegangenen Infektionsversuchen (BAUMS 2007).
Nach dem Abtrennen des Kopfes im Atlanto-Okzipitalgelenk wurden die Haut und
Muskulatur des Kopfes entfernt. Das Eröffnen des Schädels erfolgte durch Anlegen
zweier Querschnitte durch die Schädelkarlotte in Höhe der lateralen Augenwinkel. Es
folgte ein Längsschnitt vom Foramen occipitale bis zu den Endpunkten der
Querschnitte. Nach dem Entfernen des Schädeldaches und der Dura mater wurden
die Nervenabgänge mit einer Schere durchtrennt. Das Gehirn wurde für die
pathohistologische Untersuchung in Formalin fixiert.
3.4.7 Pathohistologische Untersuchung
Für die pathohistologischen Untersuchungen wurden bei der Sektion zur
Untersuchung auf eine S. suis-Infektion Organproben (Tonsilla veli palatini, Lobus
cranialis der Lunge, Pleura, Leber, Milz, Peritoneum, Gehirn, Tarsalgelenk und ggf.
weitere Gelenke) wie unter 3.4.6 beschrieben entnommen. Diese wurden in
gepuffertem 10 % Formalin fixiert. Die pathohistologischen Untersuchungen wurden
dankenswerter Weise von Dr. Andreas Beinecke (Institut für Pathologie, Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover) durchgeführt.
Die Ergebnisse wurden in einem Pathoscore Verfahren, wie bei BAUMS et al. (2006)
beschrieben, zusammengefasst. Mittelgradige bis hochgradige, multifokale oder
diffuse, fibrinös-eitrige Veränderungen wurden in Abhängigkeit von dem Organ mit
einem Score von 5 oder 4 beurteilt (Gehirn: 5; anderes Gewebe außer Gehirn wie
Material und Methoden
32
Serosa und Synovia: 4). Im Fall einer geringgradigen, fokalen, fibrinös-eitrigen
Meningitis oder Plexus chorioiditis wurde der Score 3 vergeben. Geringgradige,
fokale, fibrinös-eitrige Veränderungen aller Organe außer dem Gehirn resultierten in
einem Score von 2. Minimale fibrinös-eitrige Veränderungen bekamen einen Score
von 1. Lymphoplasmazelluläre Infiltrationen und granulomatöse Entzündungen
wurden in diesem Score nicht in Betracht gezogen. Um einen Vergleich zwischen
den Tiergruppen zu ermöglichen, wurden die höchsten Scores der einzelnen Tiere
zusammengefasst und durch die Tierzahl der Gruppe dividiert (ω = Σscoremax/nTiere).
3.5 Etablierung des Tiermodells für S. suis-Serotyp 9
3.5.1 Intranasale Infektion
Die Tiere wurden mit einem Alter von 7-8 Wochen in zwei Gruppen eingestallt. Die
Einteilung erfolgte randomisiert. Vier Tage nach der Aufstallung wurde unter Narkose
eine Tupferprobe von der Tonsillenoberfläche entnommen. Anschließend wurden
den Tieren 3 ml 1% Essigsäure mit einem Actuator (Valois Deutschland GmbH,
Düsseldorf) intranasal verabreicht. Zwei Stunden nach der Applikation der
Essigsäure wurden die Tiere erneut anästhesiert, um die intranasale Infektion mit
S. suis-Stamm 10 (Serotyp 2) bzw. Stamm A3286/94 (Serotyp 9) durchzuführen
(Applikation erneut mit einem Actuator). Die Infektionsdosis betrug 109 KBE. Elf Tage
nach der Infektion erfolgte in Narkose eine Tupferentnahme an der
Tonsillenoberfläche von den mit Stamm A3286/94 infizierten Tieren, da diese Tiere
keine Anzeichen einer Erkrankung aufwiesen. Am 20. Tag nach der Infektion wurden
alle überlebenden Schweine euthanasiert.
3.5.2 Intravenöse Infektion
Vier Tiere im Alter von 8 Wochen wurden einen Tag nach der Aufstallung und
vorheriger Anästhesie intravenös belastet. Vor der Infektion wurde eine Tupferprobe
von der Tonsillenoberfläche entnommen. Anschließend bekamen die Tiere über die
laterale Ohrvene 108 KBE A3286/94 (Serotyp 9) appliziert.
Material und Methoden
33
3.6 Herstellung der Vakzinen
3.6.1 Ganzzellvakzine
Für die Herstellung der Ganzzellvakzine wurde eine THB-Übernachtkultur von
S. suis-Stamm 10 eingesetzt (Inkubation bei 37°C in einem Kulturvolumen von
18 ml). Nach der Reinheitskontrolle erfolgte die Zugabe von Formaldehyd in einer
finalen Konzentration von 0,1%. Die Kultur wurde dann für 6-8 Stunden gerührt und
anschließend auf Sterilität kontrolliert. Die inaktivierte Kultur verblieb bis zum
Gebrauch bei 8°C. Um einen Vergleich der Wirkung der S. suis-Antigene aus der
Ganzzell- mit denen aus der Subunitvakzine zu ermöglichen, wurden zu den
inaktivierten Bakterien 18 ml PBS hinzugefügt. Dadurch wurden vergleichbare
Proteinkonzentrationen und Volumina erreicht. Als Adjuvantien kamen Emulsigen® in
einer finalen Konzentration von 20% bzw. Aluminiumhydroxid in einer finalen
Konzentration von 0,4% zum Einsatz. Die Impfdosis betrug 108 KBE.
3.6.2 Subunitvakzine
Es wurde eine Subunitvakzine hergestellt, die sich im wesentlichen aus den Murein-
assoziierten Proteinen zusammensetzte, die von einem virulenten Serotyp-2-Stamm
unter Stressbedingungen, wie sie auch bei einer Infektion auftreten, gebildet werden.
Die Induktion der Stressbedingungen erfolgte durch eine Erhöhung der
Kultivierungstemperatur von 37°C auf 42°C.
Ausgang für die Herstellung der Subunitvakzine war eine bei 37°C inkubierte 100 ml
THB S. suis-Kultur von Stamm 10 mit einer OD600 von 0,3 (frühe exponentielle
Phase). Zur Kontrolle der Induktion wurden 20 ml von der Kultur abgenommen und
für 15 min. bei 9270 x g und 4°C zentrifugiert. Die übrige für die Herstellung der
Subunitvakzine eingesetzte Kultur wurde einer Temperaturanhebung auf 42°C für
zwei Stunden unterzogen und anschließend wurde eine OD600-Messung
durchgeführt. Nach der Zentrifugation beider Kulturen wurde das Sediment in
Muramidasepuffer (30 mM Tris HCl pH =7,5; 25% (w/v) Saccharose; 0,2 mg/ml
Lysozym; 0,5 M Na EDTA) resupendiert und für 45 min. bei 37°C inkubiert. Nach
Zentrifugation der Protoplasten erfolgte die Präzipitation der im Überstand
befindlichen Murein-assoziierten Proteine durch die Zugabe von Trichloressigsäure
Material und Methoden
34
in einer finalen 10% Konzentration über Nacht bei 8°C. Nach dem zweimaligen
Waschen der sedimentierten Murein-assoziierten Proteine mit 80% Aceton wurde
das Sediment in PBS resuspendiert (100 μl PBS für den vor der
Temperaturanhebung und 3 ml PBS für den nach der Temperaturanhebung
gewonnenen Protoplastenüberstand). Im Anschluss wurde eine
Proteinkonzentrationsbestimmung durchgeführt. Es folgte die Zugabe von
Formaldehyd zum Protoplastenüberstand, so dass eine Endkonzentration von 0,1%
erreicht wurde. Die Lösung wurde daraufhin über Nacht bei 4°C gekühlt und
anschließend für 6-8 Stunden gerührt. Im Anschluß erfolgte die Zugabe von 21 ml
THB. Dann wurden Emulsigen® oder Aluminiumhydroxid als Adjuvans mit einer
finalen Konzentration von 20% bzw. 0,4% hinzugegeben, und die Präparate wurden
für 6-8 Stunden weiter gerührt. Vor der Applikation der Lösung wurde diese
nochmals für 6-8 Stunden gerührt. Für die Immunisierung wurden 2,5 mg Protein/Tier
eingesetzt.
Placebo Zur Herstellung des Placebos wurde steriles THB-Medium, PBS und Emulsigen® in
den Anteilen wie in der eingesetzten Subunit- und Ganzzellvakzine gemischt. Es
erfolgte die Zugabe von Formaldehyd (finale Konzentration: 0,1%). Den Tieren der
Kontrollgruppe wurden 2,5 ml des Placebos appliziert.
3.7 Immunisierungsversuche
Die Ferkel wurden mit einem Alter von drei bis vier Wochen (Tag des Absetzens) auf
Hartgummifußboden bei einer konstanten Stalltemperatur von 29°C aufgestallt,
Wasser stand den Tieren durch Nippeltränken frei zur Verfügung. Die Fütterung
erfolgte morgens und abends mit Gerstenschrot und Sojapellets. Zur Beschäftigung
erhielten die Tiere einmal täglich Heucops.
Es erfolgte eine randomisierte Einteilung in jeweils drei gleich große Gruppen.
Sieben und 18 Tage nach der Aufstallung wurde bei jedem Versuch jeweils einer
Gruppe die Ganzzell-, die Subunitvakzine oder das Placebo am Ohrgrund subcutan
appliziert.
Die Belastungsinfektion der Tiere erfolgte 14 Tage nach der letzten Immunisierung.
Zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion waren die Tiere sieben bis acht Wochen alt.
Material und Methoden
35
Während der gesamten Versuchszeit wurden die Tiere im Abstand von acht bis 14
Stunden auf ihren klinischen Allgemeinzustand wie unter 3.4.3 beschrieben
untersucht. Die Euthanasie und Sektion der Tiere folgte nach den in 3.4.3 und 3.4.6
festgelegten Kriterien.
3.7.1 Immunisierungsversuche mit homologer Belastungsinfektion
Im Immunisierungsversuch mit homologer Belastungsinfektion erfolgte sowohl die
Herstellung der Vakzinen als auch die Belastungsinfektion mit dem S. suis-Stamm10.
Nach Prädisposition mit 1% Essigsäure wurden die Tiere intranasal mit 109 KBE
S. suis-Stamm 10 infiziert. Dieses Experiment wurde mit zwei unterschiedlichen
Adjuvantien durchgeführt. Im ersten Versuch wurde Aluminiumhydroxid verwendet.
Im darauffolgenden Versuch verwendeten wir Emulsigen®, eine Öl-in-Wasser
Emulsion. Die Tiergruppen hatten jeweils eine Größe von acht Absetzferkeln. In der
Gruppe der Ganzzellvakzine starb jeweils ein Tier aus unbekannter Ursache vor der
ersten Immunisierung (Tabelle 4).
3.7.2 Immunisierungsversuch mit heterologer Belastungsinfektion
Im Gegensatz zum Immunisierungsversuch mit homologer Belastungsinfektion
erfolgte die heterologe Belastungsinfektion mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm
A3286/94. Dieser Stamm wurde intravenös über die laterale Ohrvene in einer
Konzentration von 108 KBE appliziert. Sechs Tiere waren jeweils in den einzelnen
Gruppen aufgestallt (Tabelle 4).
Material und Methoden
36
Tabelle 4: Übersicht der Infektions- und Immunisierungsversuche mit Schweinen
Anzahl der Tiere
S. suis-Stamm der Vakzine 1 Vakzine Adjuvans
S. suis-Belastungs-
stamm2,3
Applikationsart bei der
Infektion
6 - - - 10 i.n.
6 - - - A3286/94 i.n.
4 - - - A3286/94 i.v.
7 10 GZV4 AH 10 i.n.
8 10 SUV5 AH 10 i.n.
8 Placebo K6 AH 10 i.n.
7 10 GZV4 ÖW 10 i.n.
8 10 SUV5 ÖW 10 i.n.
8 Placebo K6 ÖW 10 i.n.
6 10 GZV4 ÖW A3286/94 i.v
6 10 SUV5 ÖW A3286/94 i.v
6 Placebo K6 ÖW A3286/94 i.v 1,2 Stamm 10 ist ein MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stamm. 3 A3286/94 ist ein MRP* SLY+ Serotyp-9-Stamm. 4 Ganzzellvakzine 5 Subunitvakzine 6 Kontrollgruppe (Placebo)
3.8 Kulturelle Untersuchung auf S. suis
Grundsätzlich erfolgte für alle histologisch untersuchten Gewebe auch eine kulturelle
Untersuchung auf S. suis wobei andere Infektionserreger ausgeschlossen wurden.
Hierfür wurden Gewebeproben der Tonsilla veli palatini, eines
Lungenspitzenlappens, der Milz und der Leber gewonnen. Liquor cerebrospinalis,
Gelenkpunktate sowie Tupfer von Pleura, Peritoneum und Perikard kamen als
Untersuchungsmaterial für die anderen Lokalisationen zum Einsatz. Die Entnahme
der Tupferproben der serösen Auskleidungen der Körperhöhlen erfolgte unmittelbar
nach dem Eröffnen der Körperhöhle, d. h. bevor die Organe zur genaueren
Material und Methoden
37
Untersuchung dargestellt wurden. Bei allen Tieren wurde mindestens ein
Tarsalgelenkpunktat untersucht. Die Gewinnung weiterer Gelenkpunktate erfolgte
nur im Fall von Lahmheiten.
Im Labor wurden die Organproben mit Ausnahme der Lunge in Alkohol getaucht und
abgeflammt. Nach Herstellung einer frischen Schnittfläche erfolgte die Isolierung auf
Blutagar und Streptokokken-Staphylokokken Selektivnährboden (Oxoid). Die
Tupferproben vom Peritoneum, Pleura und Perikard sowie Liquor cerebrospinalis
und Synovia wurden ebenfalls auf Blut- und Streptokokken-Staphylokokken
Selektivnährboden fraktioniert ausgestrichen. Die Isolierung aus eitrigen
Gelenkpunktaten erfolgte nach vorheriger Anreicherung in 10 ml THB unter aeroben
Bedingungen für 24 Stunden bei 37°C. Die Anreicherungskultur wurde fraktioniert auf
den genannten Nährböden ausgestrichen. Nach der makroskopischen Beurteilung
der Kulturen auf den festen Nährböden wurden die α-hämolysierenden
Streptokokken auf Blutagar subkultiviert. Die Diagnose „S. suis“ und die Bestimmung
des S. suis-Genotyps erfolgte nach Präparation der chromosomalen DNA der
isolierten α-hämolysierenden Steptokokken über eine Multiplex-PCR (SILVA et al.
2006).
3.9 Genotypische Differenzen von S. suis
3.9.1 Präparation chromosomaler Streptokokken-DNA
Benötigte Reagenzien:
TEN-Puffer 50 mM Tris-HCl pH = 8; 1 mM EDTA, 100 mM NaCl
SDS-Lösung 20%
Lysozym Stammlösung mit 100 mg/ml
RNAse Stammlösung mit 10 mg/ml
Proteinnase K- Lösung Stammlösung mit 20 mg/ml
CTAB- Lösung 10% in 0,7 M NaCl
NaCl- Lösung 4 M
Chloroform/Isoamylalkohol 24:1
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1
Isopropanol- Lösung 100%
Ethanol- Lösung 80% Alle aufgeführten Chemikalien wurden von der Firma Roth bezogen.
Material und Methoden
38
Durchführung:
Eine 10 ml THB- Übernachtkultur der isolierten α -hämolysierenden Streptokokken,
die unter aeroben Bedingungen und bei 37°C bebrütet wurde, wurde für 15 min. bei
5000 x g und 4°C abzentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das
Sediment in 500 μl TEN-Puffer mit 10 mg/ml Lysozym und 0,18 mg/ml RNAase
resuspendiert. Es erfolgte eine Inkubation für eine Stunde bei 37°C. Nach Zugabe
von 15 μl 20%iger SDS-Lösung und 10 μl 20 mg/ml Proteinase K-Lösung und
wiederholtem Schwenken wurde erneut für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurden 125 μl 4 M NaCl und, nach vorsichtigem Mischen, 80 μl von
einer auf 60°C erwärmten 10% CTAB-Lösung zugegeben und für 10 min. bei 60°C
inkubiert. Die DNA-Extraktion erfolgte durch die Zugabe von 780 μl
Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) und wiederholtem Schwenken. Nach der
Zentrifugation für 15 min. bei 10.000 x g wurde der Überstand, von der Interphase
abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu dem Extrakt wurden
780 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gegeben. Nach Schwenken und
einer Zentrifugation für 10 min. bei 10.000 x g wurde der Überstand in ein neues
Reaktionsgefäß überführt. Durch die Zugabe von 500 μl Isopropanol und
vorsichtigem Mischen wurde die DNA ausgefällt. Es folgte eine erneute
Zentrifugation für 30 min. bei 10.000 x g und 4°C. Anschließend wurde nach dem
Verwerfen des Überstandes noch durch die Zugabe von 500 μl –20°C kalter 80%
Ethanol-Lösung und Zentrifugation für 30 min. bei 10.000 x g die DNA gewaschen.
Der Überstand wurde daraufhin abgenommen, die DNA getrocknet und anschließend
in 50 μl Wasser (Sigma) über Nacht bei 8°C aufgenommen.
Material und Methoden
39
3.9.2 Multiplex-PCR
Benötigte Reagenzien:
Chromosomale DNA der α-hämolysierenden Streptokokken-Isolate
10x PCR Puffer 200 mM Tris-HCl pH 8,4 ; 500mM KCl
MgCl2-Lösung 50 mM
dATP,dCTP,dGTP,dTTP
Lösung (dNTP)
Stammlösungen mit 100mM je dNTP
Taq DNA-Polymerase 5 U/ μl
Primer- Stammlösung 50 μM
100 bp DNA Leiter Alle aufgeführten Reagenzien wurden von Invitrogen, Karlsruhe, bezogen.
In einem 200 μl Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht) wurde eine 1:50 Verdünnung
der gereinigten DNA (3.9) in A. bidest. hergestellt. Von dieser Verdünnung wurden
5 μl in 35 μl A. bidest. überführt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 10 μl eines
Mastermixes, so dass sich folgende Konzentrationen im Reaktionsansatz befanden:
1x PCR-Puffer; 1,5 mM MgCl2 ; je 20 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP; 19,8 nM
mrpR; 19,8 nM mrpL; 36,5 nM epf1BRR; 36,5 epfL; 43,8 nM cps1JL; 43,8 nM
cps1JR; 35,4 nM cps2JL; 35,4 nM cps2JR; 30,2 nM cps 7HL; 30,2 nM cps7HR; 26,1
nM cps9HR; 26,1 nM cps9HL; 18,8 nM slynewL; 18,8 nM slynewR; 18,8 nM adiSnL;
18,8 nM adiSnR; 20,8 nM gdhsuisL; 20,8 nM gdhsuisR und 2 Units Taq DNA-
Polymerase. Die Proben durchliefen sofort im Anschluss folgendes PCR-Programm:
initiale Denaturierung bei 94°C für 2 min.; 30 Zyklen: 1 min. bei 94°C,1 min. bei 58°C
und ersten 30 min. bei 72°C sowie eine finale Extension bei 72°C für 2 min. Der
Nachweis von Amplifikaten erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Der
Größenstandard wurde unter Verwendung der 100bp DNA-Leiter durchgeführt
(MANIATIS 1989). Im Anschluß erfolgte die Fotographie des Agarosegels und die
digitale Verarbeitung (Imago, MWG, München). Die Sequenzen der aufgeführten
Primer sowie weitere Angaben zu dieser MP-PCR wurden bereits von SILVA et al.
(2006) publiziert.
Material und Methoden
40
3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Benötigte Reagenzien:
Carbonatpuffer 50mM NaHCO3 50mM Na2CO3 (pH=9,6)
PBST (20) pH = 7,4 0,1 M NaCl
0,01 M Na2HPO4 x 12H2O
0,002 M KCl
0,001 M KH2PO4
0,05 %Tween 20
Citrat-Phosphatpuffer, pH=4,25
(für ABTS)
50 mM C6H8O7 H2O mit 50 mM Na2H2PO4
H2O auf pH= 4,25 einstellen
ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-
6-sulfonsäure)1,
0,1 M Citrat-Phosphatpuffer
H2O2 0,002%
Rinderserumalbumin (BSA) 5 μg BSA/Vertiefung in Carbonatpuffer
Magermilchpulver 5% in PBST
Ziege anti-Schwein IgG (H+L) Artikelnummer: 114-035-003; Dianova,
Hamburg Falls keine anderen Angaben vorliegen, wurden die Chemikalien von der Firma Roth
bezogen. 1 Boehringer, Mannheim
In Vorversuchen wurden unterschiedliche ELISA-Bedingungen ausgetestet. Es
erfolgte ein Vergleich unterschiedlicher Mikrotiterplatten, die Bestimmung einer
geeigneten Antigenkonzentrationen für das Beschichten der Vertiefungen und der
Vergleich möglicher Referenzseren in Verdünnungssreihen.
Als Referenzprobe für den anti-MRP- und anti-EFfrag ELISA diente ein
Rekonvaleszenzserum, das 20 Tage nach einer experimentellen intranasalen
Infektion mit 109 KBE S. suis-Stamm 10 von einem Läuferschwein in einem
vorangegangenen Versuch gewonnen wurde. Dieses Tier stammte ursprünglich aus
demselben Herkunftsbetrieb wie die Versuchstiere dieser Arbeit. Es zeigte in Folge
der experimentellen Infektion mehrere Fieberschübe und wurde 20 Tage nach der
Infektion euthanasiert. Die nach der doppelt logarithmischen Auswertung über eine
Regressionsanalyse berechnete Aktivität dieses Rekonvaleszenzserums wurde mit
Material und Methoden
41
100 ELISA-Units festgelegt. Als Negativkontrollen dienten Serumproben, die in
vorangegangenen Versuchen vor experimentellen Infektion gewonnen worden
waren.
Als Referenzprobe für die beiden ELISAs zur Bestimmung von Antikörpern gegen
Murein-assoziierte Proteine (anti-MAP ELISAs) kam ein Pool aus 10
Hyperimmunseren zum Einsatz, die im Rahmen einer vorangeganen Ph.D.-These
(BENGA 2004) nach einer dreimaligen Immunisierung von Schweinen mit MAP-
Fraktionen des MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stammes I9841/1 gewonnen wurden, der
für diesen Zweck bei 32°C kultiviert worden war (MAP32).
In dieser Dissertation wurden Serumproben auf Antikörpertiter im ELISA untersucht,
die drei Tage vor den Immunisierungen und am Tag der Belastungsinfektion von den
Tieren entnommen wurden. Maxisorb-Platten (Nunc, Wiesbaden) wurden mit
verschiedenen Antigenen beschichtet (MRP, EFfrag) (3.11). Als Antigene wurde eine
Fraktion aus Murein-assoziierten Proteinen (Protoplastenüberständen) von S. suis-
Serotyp 2 oder 9 in einer Konzentration von 5 μg Protein/Vertiefung in
Carbonatpuffer (pH = 9,6) eingesetzt und über Nacht im Kühlschrank inkubiert. Die
letzten beiden Reihen auf der „96-microwell“ Platte wurden mit 5 μg
Rinderserumalbumin (BSA) pro Vertiefung beschichtet. Nach der Inkubation wurden
die Platten drei mal mit PBST gewaschen. Anschließend wurden die Platten zwei
Stunden bei 37°C in 5% Magermilch in PBST geblockt (200 µl pro Vertiefung). Nach
dreimaligem Waschen mit PBST erfolgte die Belegung der Platte mit
Serumverdünnungen. Jede Serumprobe wurde in einer Verdünnungsreihe von vier
aufeinander folgenden 1:2 Verdünnungsstufen gemessen (beginnend bei 1:200). Alle
Messungen erfolgten als Duplikate. Die Platte wurde für eine Stunde schüttelnd bei
37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen erfolgte die Zugabe von 100 μl einer
1:20000 Verdünnung eines Peroxidase (POD)-Konjugates, das alle IgG-Klassen vom
Schwein erkennt. Nach einer Stunde Inkubation und dreimaligen Waschen wurden
100 μl des ABTS Substrats (ABTS mit 0,002% H2O2) hinzugefügt. Nach 15 min.
wurde die OD405 fotometrisch (Tecan Grödig, Österreich) bestimmt. Alle
Waschschritte wurden mit einem Dynatch „microplate washer“ durchgeführt.
Der ELISA sollte Qualitätskriterien genügen, die in Anlehnung an eine WHO-
Richtlinie zur Bestimmung von ELISA-Units zur Kontrolle von
Pneumokokkenimpfungen beim Menschen festgelegt wurden
(www.vaccine.uab.edu).
Material und Methoden
42
Für den anti-MRP ELISA wurden folgende Qualitätskriterien festgelegt:
1. Die Standardabweichung der beiden Messungen (Duplikate) einer
Probenverdünnung durfte nicht mehr als 22 % betragen.
2. Die Negativkontrolle (Tier 101 prae inf.) musste Werte unter 5 ELISA-Units
annehmen.
3. Als Positivkontrolle wurde das anti-MRP Hyperimmunserum 667 fbl.
eingesetzt. Dieses Serum stammt von einem Immunisierungsversuch des
Impfstoffwerkes Dessau Tornau, bei dem ein Jungschwein (667) einmal mit
1 mg und weitere drei Male mit 0,5 mg MRP immunisiert wurde (Einsatz
eines Adjuvans, Aluminiumhydroxid, nur bei der letzten Immunisierung).
Für 667 fbl. wurden Werte zwischen 50 und 130 ELISA-Units akzeptiert.
4. Die Steigung der Regressionsgeraden des Referenzserums (Tier 101 fbl.)
sollte einen Wert zwischen 0,8 und 1,2 annehmen.
5. Der Korrelationskoeffizient der Regressionsanalyse des Referenzserums
musste mind. 0,98 betragen.
Für die ELISAs zur Bestimmung von Antikörpern gegen Murein-assoziierte Proteine
von Stamm 10 bzw. Stamm 9 wurden folgende Qualitätskriterien festgelegt:
1. Die Standardabweichung der beiden Messungen (Duplikate) einer
Probenverdünnung durfte nicht mehr als 22 % betragen.
2. Da keine Seren von Gnotobioten zur Verfügung standen, wurden als
„Negativkontrollen“ Seren von nicht immunisierten bzw. nicht infizierten
Absetzferkeln des Herkunftsbestandes eingesetzt, für die Werte bis zu 22
ELISA-Units akzeptiert wurden.
3. Das Rekonvaleszenzserum „116 fbl.“ aus dem Vorversuch dieser
Dissertation fungierte als Positivkontrolle. Für „116 fbl.“ wurden Werte
zwischen 45 und 80 ELISA-Units akzeptiert.
4. Die Steigung der Regressionsgeraden des Serumpools MAP32 sollte einen
Wert zwischen 0,8 und 1,2 annehmen.
5. Der Korrelationskoeffizient der Regressionsanalyse des Referenzserums
musste mind. 0,98 betragen.
Material und Methoden
43
3.11 Herstellung eines rekombinanten EF-Fragmentes (rEFfrag) als ELISA-Antigen
Der Virulenz-assoziierte extrazelluläre Faktor (EF) von virulenten
S. suis-Serotyp 1- und 2-Stämmen induziert bei einer Infektion mit diesen Stämmen
die Bildung von anti-EF Antikörpern (SMITH et al. 1993; VECHT et al. 1991). Die
Subunitvakzine auf der Grundlage der Murein-assoziierten Proteine war frei von EF.
Aus diesem Grund konnte durch die Bestimmung von
EF-spezifischen Antikörpern eine Unterscheidung von mit der Subunitvakzine
immunisierten und mit EF+ S. suis-Stämmen infizierten Schweinen ermöglicht
werden (DIVA-Prinzip), (MAAS et al. 2006). Aufgrund dieser Zusammenhänge wurde
für die Etablierung eines ELISAs zur Bestimmung von EF-spezifischen Antikörpern
die Gewinnung eines rekombinanten EF-Fragmentes vorgenommen.
Das rekombinante EF-Fragment (rEFfrag) sollte die Aminosäuren 576 bis 840 von
EF beinhalten (siehe „gene accession“ Nummer QO7289). Zur Herstellung dieses
Fragmentes aus chromosomaler DNA von S. suis-Stamm 10 wurde zunächst mit den
Primern EpfBamHI (GAACTGGATCCTACGGGAGC) and EpfendSphI
(TGCCGCATGCGTTCGACTGGTTAATAG) das 801 bp lange epf-Amplifikat
generiert. In dieser PCR wurden die gleichen Bedingungen wie in der Multiplex-PCR
zur Typisierung der S. suis-Isolate eingesetzt (3.9.2). Die Elution des 801 bp
epf-Amplifikates aus dem Gel erfolgte mit dem „Gel Extraction Kit“ (Sigma) nach den
Angaben des Herstellers. Für die Klonierung wurden das epf-Amplifikat und der
pQE31-Vektor (Qiagen) mit den Restriktionsenzymen BamHI und SphI (New
England Biolabs) geschnitten. Die Ligation der beiden Fragmente erfolgte nach
Phenol/Chloroform-Extraktion und Präzipitation (Isopropanol/Alkohol) nach den
Angaben des Herstellers der Ligase (Promega). Nach Elektroporation in E. coli M15
und phänotypischer Expression in LB bei 37°C für eine Stunde mussten zur
Selektion der transformierten Bakterien Proben auf LB Nährböden mit Ampicillin und
Kanamycin ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert werden. Nach der
Subkultivierung wurde die Plasmid-DNA der Klone isoliert und über einen
Restriktionsverdau analysiert. Nach der Gewinnung eines Klons mit dem erwarteten
801 bp großen epf-Insert (im Folgenden: M15 pQEepffrag) konnte die phänotypische
Überprüfung wie folgt durchgeführt werden: Nach dem Wachstum bis zu einer OD600
von 0,4 wurde 1M IPTG hinzugeben und für drei Stunden bei 37°C inkubiert. Als
Material und Methoden
44
Negativkontrolle wurde vor IPTG Zugabe 1 ml von der Kultur abgenommen,
zentrifugiert und in 2fachem Probenpuffer resuspendiert. Beide Proben wurden durch
SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western Blot und einem monoklonalen
EF-Antikörper entwickelt. Die Reinigung von rEFfrag über eine
Ni2+- Affinitätschromatographie unter nativen Bedingungen erfolgte nach den
Angaben des Herstellers (Machery-Nagel).
3.11.1 Herstellung eines Anti-rEF Antiserums
Die Herstellung eines polyklonalen Anitserums gegen gereinigtes rEFfrag erfolgte
durch dreifache Immunisierung eines Kaninchens mit 0,1 mg gereinigten Protein in
„Freund’s incomplete Adjuvans“. Die Immunisierungen bzw. Booster erfolgten im
Abstand von zehn Tagen subkutan. Vor und nach den Immunisierungen wurden
Serumproben für Untersuchung im Western Blot entnommen. Das polyklonale
Antiserum gegen rEFfrag wurde durch Entblutung des Kaninchens gewonnen.
3.11.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der BIORAD Dc Assay nach den
Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Proteine wurden in einer Mikrotiterplatte
(96 well) verdünnt und durch eine fotometrische Messung bei 595 nm die
Proteinkonzentration mit Standard bestimmt.
3.11.3 SDS-PAGE
Benötigte Reagenzien für ein 8% SDS-Gel (Mini-V 8-10):
Trenngel Sammelgel
H2O 2,3 ml 1,75 ml
Acrylamid 1,35 ml 0,4 ml
1,5 M Tris pH=8,8 1,25 ml
0,5 M Tris pH=8,8 0,75 ml
20% SDS 25 µl 12,5 µl
TEMED 3 µl 2,5 µl
10% APS 100 µl 50 µl
Material und Methoden
45
Die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) nach
LAEMMLI (1970) wurde in einem vertikalen System durchgeführt. Es wurde zunächst
ein Trenngel gegossen. Nach einer 30 min. Polymerisation wurde dieses Trenngel
(8%) mit einem Sammelgel (8%) überschichtet. Die Proben wurden vorher mit PBS
auf die gleiche Proteinkonzentration eingestellt. Durch eine Erhitzung auf 95°C für
10 min. erfolgte eine vollständige Denaturierung der Proteine. Die
Elektrophoresekammer (Biorad, München) wurde mit einem SDS-Laufpuffer gefüllt,
und die vorbereiteten Proben wurden auf das Gel geladen und für eine Stunde bei
150 V aufgetrennt.
3.11.4 Comassieblau-Färbung
Färbelösung 0,25% (w/v) Commassie Brilliant Blau
R250 (Sigma, Steinheim), 45% (v/v)
Methanol, 10% (v/v) Essigsäure
Entfärbelösung 30%(v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure
Geltrocknungslösung 25% (v/v) Ethanol, 8% (v/v) Essigsäure,
10% (v/v) Glyzerin
Das SDS-Gel wurde für ca. 20 min. mit der Färbelösung gefärbt. Anschließend
erfolgte die Entfärbung des Hintergrundes mit der Entfärbelösung. Alle Schritte
wurden auf einem Schwenktisch durchgeführt. Vor dem Trocknen des Geles wurde
es mit einem Scanner digital dokumentiert. Nach vollständiger Entfärbung erfolgte
die Konservierung durch eine Geltrocknung. Hierfür wurde eine Zellophanfolie in eine
Geltrocknungslösung gelegt. Die entfärbten Gele wurden luftblasenfrei zwischen
zwei Folien gelegt und in einen Rahmen gespannt. Die dreistündige Trocknung
erfolgte durch einen Geltrockner (Biorad, München).
Material und Methoden
46
3.11.5 Western Blot (BURNETT 1981)
Benötigte Reagenzien:
Transferpuffer 24,8 mM Tris, 113 mM Glycin, 20% Methanol, 10% SDS
TBST 10 mM Tris pH = 8; 150 mM NaCl ; 0,05% Tween 20
Nach der Auftrennung der Proteine wurde das Gel von den Glasplatten gelöst, das
Sammelgel wurde abgetrennt und das Trenngel in Transferpuffer eingelegt. Auch die
Nitrozellulosemembran (NZ-Membran), das Filterpapier und der Schaumstoff wurden
10 min. in Transferpuffer eingelegt. Danach erfolgte das luftblasenfreie Schichten
von Schaumstoff-Filterpapier-NZ-Membran-Filterpapier-Schaumstoff. Nach dem
Schließen wurde der Halter in das Tank Blot System eingelassen, indem sich
ebenfalls der Tansferpuffer befand. Der Transfer von dem Gel auf die NZ-Membran
erfolgte für 90 min. bei 100 V. Anschließend wurde das Gel verworfen und die
NZ-Membran in 3% Magermilch in TBST über Nacht geblockt, um unspezifische
Bindungen zu vermeiden. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurde nun ein
Primär-Antikörper (Anti-rEF) in der erforderlichen Verdünnung (1:250) für eine
Stunde auf die NZ-Membran gegeben. Nach dreimaligem Waschen folgte die
Inkubation mit dem Antikörper-POD-Konjugat (1:20.000) für eine Stunde. Die
Antikörper wurden jeweils in Waschpuffer verdünnt. Alle Waschschritte erfolgten für
eine Dauer von jeweils 5 min. Die Inkubationsschritte wurden auf einem
Schwenktisch, die Waschschritte auf einem Schüttler durchgeführt.
Nach dem zweite Antikörper und mehrmaligem Waschen wurde die NZ-Membran
durch Filterpapier gründlich getrocknet und mit einer Chemolumineszenz-Lösung
(Pierce, Rockford) für 4 min. beschichtet. Nach erneutem Trocknen wurde ein
Röntgenfilm (Biomax,Kodak) auf die NZ-Membran gelegt und entwickelt.
3.12 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem „Statistical Analysis System for
Windows“, SAS® und wurde zusammen mit Herrn Dr. Beyerbach (Institut für
Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung, Tierärztliche Hochschule
Hannover) durchgeführt. Der zeitliche Verlauf der Merkmale Mortalität und Morbidität
wurde in Kaplan-Meyer-Diagrammen dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte
mit dem Log-Rank-Test.
Ergebnisse
47
4 Ergebnisse
4.1 Etablierung eines S. suis-Serotyp-9-Tiermodells
In dem ersten Teil der Arbeit wurden zwei invasive S. suis-Pathotypen in einem
intranasalen Infektionsmodell von Läuferschweinen auf ihre virulenten Eigenschaften
hin miteinander verglichen. Wie in den folgenden Infektionen der
Immunisierungsversuche kam zum einen der hochvirulente MRP+ EF+ SLY+
Serotyp-2-Stamm 10 zum Einsatz, zum anderen wurde erstmals ein
Serotyp-9-Stamm in experimentellen S. suis-Infektionen getestet. Der ausgewählte
Serotyp-9-Stamm (A3286/94) war von einem Schwein mit Meningitis isoliert worden
(ALLGAIER et al. 2001).
4.1.1 Vergleichende experimentelle Infektion mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-Stamm A3286/94
Fünf von sechs Tieren, die mit dem S. suis-Serotyp-2-Stamm-10 infiziert worden
waren, entwickelten klinische Symptome mit Fieber und Leukozytose. Zwei der Tiere
(106 und 119) zeigten zentralnervöse Störungen, wie Tremor, Opisthotonus und
Ataxie. Bei zwei weiteren Tieren (120 und 107) konnten hochgradige Lahmheiten
festgestellt werden. Ein Tier (148) zeigte im klinischen Bild eine Kyphose und
Apathie (Tabelle 5). Im Gegensatz dazu konnten während der gesamten
Versuchszeit von 20 Tagen keine klinischen Anzeichen bei den sechs Tieren
beobachtet werden, die mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 intranasal
infiziert worden waren. Die Körpertemperatur lag bei allen Messungen unter 40°C
(Tabelle 5). Dennoch stiegen innerhalb von elf Tagen nach der Infektion bei fünf der
sechs Tiere, die mit Serotyp 9 intranasal infiziert worden waren, die Leukozyten
temporär auf Werte über 22G/l an (Tabelle 5). Daraufhin wurden vier weitere Tiere
intravenös mit 108 KBE A3286/94 infiziert. Drei dieser Tiere (97, 99, 100) zeigten
innerhalb von 24 Stunden Anzeichen einer akuten Polyarthritis. Das vierte Schwein
(98) wies zentralnervöse Störungen mit Ataxie und Tremor auf. Dieses Tier (98) hatte
auch eine extrem hohe Körpertemperatur (42,7°C). Zwei weitere intravenös infizierte
Ergebnisse
48
Tiere (97, 99) zeigten ebenfalls eine Erhöhung der Körpertemperatur auf Werte
> 40,5°C. Bei einem Tier (100) konnte trotz Erkrankung keine Erhöhung der
Körpertemperatur festgestellt werden. Alle vier Schweine wurden aufgrund ihres
schweren Krankheitsbildes innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion
euthanasiert. Als Ergebnis ist festzuhalten, dass klinisch manifeste Erkrankungen bei
Läuferschweinen mit dem S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 durch eine
intravenöse, nicht jedoch durch eine intranasale Applikation hervorgerufen werden
konnten. Im Gegensatz dazu wurden durch eine intranasale Applikation des
S. suis-Serotyp-2-Stammes 10 in der gleichen Altersklasse schwere Erkrankungen
mit hohem Fieber und zum Teil mit zentralnervösen Störungen induziert.
Tabelle 5: Virulenz von S. suis-Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) und Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) in experimentellen Infektionen von Läuferschweinen
Experimentelle S. suis -Infektion
max. Körper-
temperatur (°C)
max. Leukozyten-zahl (G/l) 2 Anzahl der
infizierten Tiere
Stamm Appl. KBE Morbi-dität
Morta-lität
klinische Symp-tome 1
≤40 40 –40,5 ≥40,5 ≤ 22 22 –
30 ≥ 30
6 10 i. n. 109 5/6 4/6 4/6 1/6 3/6 2/6 1/6 4/6 1/6
6 A3286/94 i. n. 109 0/6 0/6 0/6 6/6 0/6 0/6 1/6 5/6 0/6
4 A3286/94 i. v. 108 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 3/4 2/4 2/4 0/4 1 Klinische Symptome, wie Apathie, Anorexie, zentralnervöse Störungen und akute Lahmheit. 2 Leukozytenwerte von Blutproben aus der Vena cava craniallis, die 3, 5, 7 und 11 Tage nach
der Infektion entnommen wurden. Alle Tiere wiesen vor der Infektion Werte unter 20 G/l auf.
4.1.2 Pathologische und pathohistologische Befunde nach experimentellen Infektionen mit S. suis-Serotyp 2 und Serotyp-9-Stamm A3286/94
Alle Versuchstiere wurden in einer Sektion auf Veränderungen durch eine
S. suis-Infektion untersucht (3.4.6). Wie unter 4.1 aufgeführt, wurden vier von sechs
der intranasal mit Stamm 10 und bei allen vier intravenös mit Stamm A3286/94
infizierten Tieren vorzeitig euthanasiert und anschließend seziert aufgrund einer
Ergebnisse
49
schweren akuten Erkrankung. Alle übrigen Versuchstiere wurden 20 Tage nach der
Infektion euthanasiert und pathologisch untersucht.
Bei den drei Tieren (106, 116, 98), die aufgrund von zentralnervösen Störungen
euthanasiert wurden, konnten keine makroskopischen Veränderungen in der Sektion
festgestellt werden. Das Tier (148) mit der Kyphose zeigte in der Sektion eine
hochgradig fibrinöse Peritonitis. Die an Lahmheit erkrankten Tiere (120, 97, 99, 100)
wiesen in den betroffenen Gelenken eine milchig-gelbe Synovia auf.
Die Proben für die pathohistologischen Untersuchungen wurden im Rahmen der
Sektion zur Untersuchung auf typische Veränderungen einer S. suis-Infektion nach
einem im Vorfeld festgelegten Ablauf gewonnen (3.4.6). Die pathohistologischen
Untersuchungen der Tiere, die mit A3286/94 intranasal infiziert worden waren,
ergaben Läsionen und Infiltrationen in mehreren Organen (Tabelle 6). Gerringgradige
Peritonitis und/oder Pleuritis wurde bei allen sechs Schweinen diagnostiziert. Bei vier
Tieren waren diese fibrinös-eitrig (7, 10, 116,132), zwei andere Tiere wiesen
lymphoplasmazelluläre Infiltrationen in Pleura und/oder Peritoneum auf (6, 8). Von
den mit A3286/94 intranasal infizierten Schweinen war bei dem Tier 116 der Grad
und die Ausdehnung der Entzündungen im Gehirn am stärksten. Es konnte eine
geringgradige multifokale, teils lymphoplasmazytäre, teils fibrinös-eitrige Meningitis
sowie eine mittelgradige multifokale fibrinöse Ventrikulitis festgestellt werden
(Abbildung 16). Eine geringgradige fokale eitrige Meningitis lag in derselben Gruppe
bei dem Schwein 10 vor. Die anderen vier Läufer dieser Gruppe (6, 7, 8, 132) zeigten
lymphoplasmazelluläre Infiltrationen der Meningen und/oder des Plexus chorioideus
bzw. eine multifokale granulomatöse Enzephalitis (132).
Nur in der Gruppe, die intranasal mit Stamm10 infiziert worden war, konnten mittel-
bzw. hochgradige fibrinös-eitrige Meningitiden diagnostiziert werden. Zwei Tiere (106
und 119), die bereits durch zentralnervöse Störungen aufgefallen waren, zeigten
diese pathologischen Veränderungen (Tabelle 6 und Abbildung 13). Ähnlich wie bei
den mit Serotyp 9 intranasal infizierten Tieren wurden bei drei anderen Tieren dieser
Gruppe eine lymphoplasmazelluläre Meningitis und teils eine Plexus chorioiditis
festgestellt. Fibrinös-eitrige Veränderungen unterschiedlichen Grades waren bei den
Tieren dieser Versuchsgruppe noch in anderen Geweben zu erkennen (Tabelle 6).
Ergebnisse
50
Bei dem Tier 148 lag beispielsweise eine hochgradige diffuse bzw. multifokale
fibrinös-eitrige Pleuritis und Peritonitis vor (Abbildung 15).
Die geschilderten pathohistologischen Veränderungen führten zu einem höheren
Pathoscore bei der mit Stamm 10 (3,2) als bei der mit Stamm A3286/94 (2,5)
infizierten Gruppe (Tabelle 6).
Einen hohen Pathoscore von 4,0 wies ferner die Gruppe auf, die intravenös mit
A3286/94 infiziert worden war. Drei Tiere (97, 99, 100) zeigten mittelgradige bis
hochgradige neutrophile Infiltrationen in der Synovialis des Tarsalgelenks (Abbildung
14). Zudem lagen bei allen vier Tieren eine eitrige Splenitis und eine multifokale,
eitrige Pneumonie in unterschiedlichen Schweregraden vor (Tabelle 6). Das Schwein
98 zeigte im Gegensatz zu den anderen drei Tieren nicht nur eine hochgradige
multifokale eitrige Splenitis sondern auch eine mittelgradige multifokale eitrige
Hepatitis.
Zusammenfassend konnten schwerwiegende Befunde durch die pathohistologische
Untersuchung hauptsächlich in den intranasal mit MRP+EF+SLY+ Serotyp-2-Stamm
10 und in den intravenös mit Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Tieren
festgestellt werden. Die Tiere, die mit dem Serotyp-9-Stamm intranasal infiziert
worden waren, zeigten meist nur minimale bis geringgradig fokale Veränderungen in
den Serosen und im Gehirn. Neutrophile Infiltrationen waren in mehreren Organen
aufzufinden. Nach der intravenösen Infektion mit dem Serotyp-9-Stamm waren die
Veränderungen hauptsächlich in den Gelenken vorhanden.
Ergebnisse
51
Tabelle 6: Fibrinös-eitrige Entzündungen bei mit S. suis-Stamm 10 oder mit Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Läuferschweinen.
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Ergebnisse
52
4.1.3 Reisolierung der Belastungsstämme (A3286/94 und Stamm 10)
Als Nachweis der Belastungsstämme galt die Identifizierung des Genotyps.
Der Infektionsstamm konnte in unterschiedlichen Organen erkrankter Tiere, die mit
Stamm 10 intranasal oder mit A3286/94 intravenös infizierten worden waren, kulturell
nachgewiesen werden. Bis auf den Tonsillentupfer von Tier 8 war allerdings in allen
Proben der mit Stamm A3286/94 intranasal infizierten Schweine der
Belastungsstamm kulturell nicht nachweisbar (Tabelle 7).
Bei den Tieren mit mittel- oder hochgradiger fibrinös-eitriger Meningitis (106 und 119)
konnte der Infektionsstamm aus dem Liquor cerebrospinalis isoliert werden. Der
gleiche Stamm wurde auch aus der Leber und dem Peritoneum des mit Stamm 10
infizierten Schweines 148 isoliert.
Der Belastungsstamm A3286/94 wurde in dem Liquor cerebrospinals von Tier 98
nach intravenöser Applikation kulturell diagnostiziert. Alle weiteren
Gehirnflüssigkeitsproben waren in der kulturellen Untersuchung auf S. suis negativ
(Tabelle 7). Aus der Gelenkflüssigkeit konnte nur bei den drei Schweinen 97, 99 und
100 mit fibrinös-eitriger Tarsitis bzw. Karpitis nach intravenöser A3286/94 Infektion
der Belastungsstamm isoliert werden. Bei dem Tier 98 wurde der Belastungsstamm
in der Leber, Milz und dem Pleuratupfer, bei Tier 97 in dem Peritonealtupfer kulturell
nachgewiesen (Tabelle 7).
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass der Belastungsstamm bei drei von sechs
mit Stamm 10 intranasal und allen mit Stamm A3286/94 intravenös belasteten
Schweinen in inneren Organen nachgewiesen wurde. Der kulturelle Nachweis der
Belastungsstämme war mit Ausnahme der Tonsillenproben mit fibrinös-eitrigen
Organveränderungen assoziiert. Für die subklinischen pathohistologischen
Veränderungen der intranasal mit A3286/94 infizierten Schweine gelang im Rahmen
dieser Dissertation kein Erregernachweis.
Ergebnisse
53
Tabelle 7: Reisolierung des Belastungsstammes von Läuferschweinen, die mit S. suis-Stamm 10 oder Stamm A3286/94 infiziert worden sind.
Experimentelle S. suis- Infektion
Anzahl der Tiere in denen der S. suis-Belastungsstamm1 isoliert werden konnte Infizierte
Tiere Tonsille2
Alter n Stamm Appl.2 KBE
2-11 dpi
20 dpi Lu
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7-8 6 10 i. n. 109 2/6 1/2 0/6 0/6 1/6 2/6 0/6
7-8 6 A3286/94 i. n. 109 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
7-8 4 A3286/94 i. v. 108 1/4 3/4 2/4 2/4 1/4 3/4
1 Der Belastungsstamm konnte von der Kultur mit einer MP-PCR differenziert werden
(siehe 3.8). 2 Tonsillentupfer oder Organprobe, Tage nach der Infektion (dpi). 3Untersuchung eines Lobus cranialis. 4Pleura-, Peritoneal- und/oder Perikardhöhle. 5Tarsal- und Karpalgelenkpunktate.
4.2 Protektive Wirkungen einer Ganzzell- und Subunitvakzine gegenüber homologen und heterologen Belastungsinfektionen mit S. suis-Serotyp 2 bzw. 9 Stämmen
Im zweiten Teil der Dissertation wurde die protektive Wirkung einer Subunitvakzine
aus Murein-assoziierten Proteinen mit der protektiven Wirkung einer Ganzzellvakzine
verglichen, beide auf der Grundlage des Serotyp-2-Stammes 10.
Insgesamt wurden drei Immunisierungsversuche durchgeführt, zwei mit homologer
und einer mit heterologer Belastungsinfektion. In dem Vorversuch zur Etablierung
eines Serotyp-9-Infektionsmodells (4.1) wurde festgestellt, dass der für die homologe
Belastungsinfektion eingesetzte hochvirulente Serotyp-2-Stamm 10 im intranasalen
Infektionsmodell eine hohe Morbidität hervorrief, während der für die heterologen
Belastungsinfektion ausgewählte MRP* SLY+ Serotyp-9-Stamm A3286/94 erst nach
Ergebnisse
54
intravenöser Applikation zu klinisch manifesten Erkrankungen führte. Aus diesem
Grund wurden die homologen Belastungsinfektionen intranasal und die heterologen
intravenös durchgeführt. Der einzige Unterschied der beiden homologen
Belastungsversuche war die Wahl des Adjuvans. Im ersten Immunisierungsversuch
kam Aluminiumhydroxid, im zweiten eine Öl-in-Wasser-Emulsion (Emulsigen®) zum
Einsatz.
Nach den jeweiligen Immunisierungen zeigten die Tiere, die mit Aluminiumhydroxid
als Adjuvans immunisiert worden waren, keine klinisch erkennbare Reaktion auf die
Immunisierung. Die Tiere des zweiten und dritten Immunisierungsversuches, denen
eine Öl-in-Wasser-Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans appliziert worden war, fielen
sechs bis acht Stunden nach der Immunisierung durch deutliche Reaktionen auf. Alle
Tiere, einschließlich der mit dem Placebo behandelten Kontrollgruppe, hatten eine
Körpertemperatur über 40°C. Sie zeigten verminderte Aufmerksamkeit und Anorexie.
24 Stunden nach der Immunisierung war die Körpertemperatur bei allen Tieren
wieder unter 40°C. Die Tiere waren aufmerksam und zeigten Appetit.
4.2.1 Protektive Wirkung einer S. suis-Ganzzellvakzine
4.2.1.1 Homologe Belastungsinfektion
Im ersten Versuch verhielt sich die mit der Ganzzellvakzine immunisierte Gruppe in
Bezug auf Morbidität und Mortalität in Folge der homologen Belastungsinfektion nicht
signifikant unterschiedlich zur Placebogruppe (Morbidität: P = 0,1455; Mortalität:
P = 0,2668). Es verstarben fünf von sieben Tiere (51-57) aus der Gruppe der
Ganzzellvakzine und fünf von acht aus der Placebo-Gruppe (71-78) an den Folgen
einer Infektion mit dem homologen Belastungsstamm (Abbildung 1, Tabelle 8). In
dieser Ganzzellvakzinegruppe stellten sich bei zwei Tieren zentralnervöse Störungen
ein. Eines dieser Tiere (51) zeigte hochgradigen Tremor. Das andere Tier (55) fiel
durch krampfartiges Stehen mit hochgradigem Tremor auf. Ein weiteres Tier (52)
wies eine hochgradige Lahmheit der vorderen linken Gliedmaße auf. Es konnte eine
Umfangsvermehrung des Karpalgelenkes und milchig-gelblich trübe Synovia
beobachtet werden. Zwei weitere Tiere (53, 57) zeigten Apathie und wiesen eine
Ergebnisse
55
Körpertemperatur von > 41°C auf. Bei den klinisch nicht erkrankten Tieren (54, 56)
konnte während der gesamten Versuchszeit keine Erhöhung der Körpertemperatur
registriert werden (< 40,5°C) (Tabelle 8). Bei den hämatologischen Untersuchungen
wurde bei drei erkrankten Tieren (51, 52, 53) ein Anstieg der Leukozyten auf > 22 G/l
festgestellt (Tabelle 8). Auch bei Tier 54, welches keine Anzeichen einer klinischen
Erkrankung und keine Temperaturerhöhung aufwies, erfolgte ein Anstieg der
Leukozyten auf >22 G/l. Tier 56, welches ebenfalls klinisch nicht erkrankte, zeigte
wie die Tiere 55 und 57, keinen Anstieg (< 22 G/l) der Leukozyten (Tabelle 8).
In der Placebo-Gruppe zeigten zwei Schweine (74, 71) zentralnervöse Störungen
und drei weitere Tiere (72, 73, 75) Apathie.
Sowohl in der Ganzzellvakzine- als auch in der Placebogruppe konnte der
Belastungsstamm bei der Mehrzahl der erkrankten Tiere aus den betroffenen
Geweben isoliert werden (Tabelle 9). In beiden Gruppen wurden bei allen erkrankten
Tieren in den histologischen Untersuchungen pathologische Veränderungen
diagnostiziert, die mit dem klinischen Bild der Tiere korrelierten (Tabelle 10).
Beispielsweise lagen bei den beiden Tieren (51, 55) mit zentralnervösen Störungen
aus der Ganzzellvakzinegruppe hochgradige diffuse fibrinös-eitrige Meningitiden vor,
die mit dem Nachweis des Belastungsstammes im Liquor cerebrospinalis bzw.
Gehirntupfer mit hochgradigem Keimgehalt assoziiert waren. Bei jeweils vier Tieren
aus der Ganzzellvakzine- bzw. Kontrollgruppe konnten fibrinös-eitrige bzw. eitrige
Entzündungen in mehreren Organen nachgewiesen werden. So konnten zum
Beispiel bei dem Tier 55 mit der klinisch manifesten Meningitis noch zusätzlich eine
mittel- bzw. geringgradige multifokale eitrige Polyserositis und Splenitis festgestellt
werden. In minimal und geringgradig entzündetem Gewebe erfolgte, wie in anderen
Infektionsversuchen, häufig kein Nachweis des Belastungsstammes. Weiterhin war
es nicht möglich, in dem Gelenkpunktat von Tier 52 mit der hochgradigen diffusen
fibrinös-eitrigen Synovialitis den Erreger zu bestätigen. Dieses Phänomen der
eitrigen sterilen Gelenkpunktate wurde in den unterschiedlichen
Belastungsversuchen dieser Dissertation wiederholt beobachtet. In anderen
entzündlich veränderten Geweben der entsprechenden Tiere konnte der
Belastungsstamm jedoch häufig nachgewiesen werden (Tabelle 9 und 10).
Ergebnisse
56
Beispielsweise wurde bei dem Tier 52 noch eine mittelgradige diffuse fibrinös-eitrige
Pleuritis diagnostiziert, die mit einem Nachweis des Belastungsstammes im
Pleuratupfer assoziiert war.
Im zweiten Versuch mit der Öl-in-Wasser Emulsion konnte im Vergleich zur Placebo
behandelten Gruppe bezüglich der Mortalität und Morbidität eine signifikante
protektive Wirkung (P=0,005) erzielt werden (Abbildung 3 und 4). In dieser
Ganzzellvakzinegruppe verstarben zwei von sieben Tieren. Zu den Symptomen
dieser beiden Tiere gehörten zum einen eine zentralnervöse Störung (93) zum
anderen Lahmheiten (98). Die Körpertemperatur dieser beiden Tiere war zum
Zeitpunkt der Euthanasie auf > 40,5°C angestiegen. Die Temperatur der anderen
Tiere dieser Gruppe lag bis zum Ende des Versuches unter 40,5°C (Tabelle 8). Das
an Lahmheit erkrankte Tier (98) zeigte, wie drei klinisch nicht erkrankte Tiere, eine
Erhöhung der Leukozytenwerte auf > 22 G/l (Tabelle 8). Abgesehen von einer
Ausnahme in der Placebogruppe (48) konnte bei allen klinisch erkrankten Tieren der
Ganzzellvakzinegruppe (93, 98) und der Placebo-Gruppe im zweiten Versuch der
Belastungsstamm in mindestens einem inneren Organ nachgewiesen werden
(Tabelle 9). Die Erregernachweise gingen in jedem dieser Fälle mit fibrinös-eitrigen
Entzündungen der entsprechenden Organe einher. Zusätzlich konnte bei Tier 98
eine geringgradig fokal eitrige Peritonitis festgestellt werden, ohne dass ein
Erregernachweis vorlag. Bei den klinisch nicht erkrankten Tieren der
Ganzzellvakzinegruppe konnte der Belastungsstamm bei vier von fünf Tieren aus
den Tonsillen post mortem reisoliert werden (Tabelle 9). Grundsätzlich waren im
zweiten Experiment in der Placebogruppe Nachweise des Belastungsstammes aus
mehreren inneren Organen häufiger als in den beiden immunisierten Gruppen
(Tabelle 9). So konnte bei vier Tieren (41, 44, 45, 46) der Placebogruppe der
Belastungsstamm in mindestens drei unterschiedlichen inneren Lokalisationen (d. h.
außer Lunge und Tonsille) nachgewiesen werden, während dieses Merkmal einer
generalisierten bakteriellen Erkrankung bei keinem der mit der Ganzzellvakzine
immunisierten Tiere vorlag. Die protektive Wirkung der Ganzzellvakzine im zweiten
Immunisierungsexperiment manifestierte sich auch in einem sehr niedrigen
Pathoscore von nur 1,25, während die Placebogruppe des gleichen Versuches 3,75
Ergebnisse
57
erreichte (Tabelle 10). Im Einklang mit den klinischen und bakteriologischen
Ergebnissen konnte hingegen die Ganzzellvakzine im ersten Immunisierungsversuch
mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans keinen Schutz vor fibrinös-eitrigen
Veränderungen als Folge einer homologen Belastungsinfektion vermitteln
(Pathoscore von 3,2; Tabelle 10). Die pathohistologischen Veränderungen waren
hauptsächlich Meningitiden und Serositiden. Unterschiede in Bezug auf die
Manifestationsorgane waren zwischen den einzelnen Gruppen des ersten und
zweiten Versuches nicht zu erkennen (Tabelle 10).
4.2.1.2 Heterologer Belastungsinfektion
Im dritten Immunisierungsversuch erzielte die Applikation der Ganzzellvakzine in
Bezug auf die Mortalität keinen signifikanten protektiven Schutz (P = 0,2841)
gegenüber der heterologen Belastungsinfektion (Abbildung 5). Im Gegensatz zur
Placebogruppe, in der fünf von sechs Tiere verendeten, überlebten aber in der
Ganzzellvakzinegruppe drei Tiere. In dieser Ganzzellvakzinegruppe zeigten zwei
Tiere (201, 203) hochgradige Lahmheiten. Bei Tier 203 waren zwei Gliedmaßen
betroffen, wodurch das Tier in der Bewegung stark eingeschränkt war. Obwohl die
Tiere 201 und 203 der Ganzzellvakzinegruppe das klinische Bild einer akuten
Arthritis zeigten, blieb der Nachweis einer Synovialitis in der histologischen
Untersuchung aus (Abbildung 10). Die Ursache dafür ist unklar, insbesondere da bei
einem Tier (203) das Gelenkpunktat makroskopisch verändert war (getrübt und
gelblich). Ein weiteres Tier (205) zeigte zentralnervöse Störungen in Form von
Kreisbewegungen und Tremor. In der Placebo-Gruppe kamen zwei Tiere (214, 218)
durch hochgradige Lahmheit der Hintergliedmaße zum Festliegen. Zwei weitere
Tiere (215, 216) zeigten zentralnervöse Störungen, wie Tremor und
Gleichgewichtsstörungen (215). Ein Tier (217) wurde tot aufgefunden.
Im Gegensatz zur Mortalität lag im dritten Versuch für die Morbidität eine statistisch
signifikante protektive Wirkung (P = 0,0426) der Ganzzellvakzine im Vergleich zum
Placebo vor (Abbildung 6). Während in der Placebogruppe in Folge der heterologen
Infektion fünf von sechs Tieren Fieber entwickelten, blieben in der
Ganzzellvakzinegruppe die drei klinisch nicht erkrankten Tiere (202, 204, 206) bei
Ergebnisse
58
allen Messungen unter 40,5°C (Tabelle 8). Alle Tiere der Ganzzellvakzinegruppe, bis
auf 206, zeigten jedoch nach der Belastungsinfektion eine Leukozytose. Bei drei
erkrankten Tieren (214, 217, 218) der Placebogruppe konnte hingegen kein Anstieg
der Leukozyten (Tabelle 8) dokumentiert werden. Dieser Unterschied stand
wahrscheinlich in Zusammenhang mit dem perakuten Krankheitsverlauf der
Placebogruppe. Bei den klinisch erkrankten Tieren gab es, wie in den ersten beiden
Immunisierungsversuchen keine deutlichen Unterschiede im Krankheitsbild zwischen
den beiden Gruppen. Zentralnervöse Störungen und hochgradige Lahmheiten
prägten das Krankheitsbild (Tabelle 8). Die ersten Tiere erkrankten in allen Gruppen
bereits am ersten Tag nach der Belastungsinfektion (Abbildung 6). Die
Körpertemperatur der klinisch erkrankten Tiere der Ganzzellvakzinegruppe lag wie in
der Placebogruppe über 40,5°C. Die Reisolierung des Belastungsstammes erfolgte
nur bei jeweils zwei Tieren der Ganzzellvakzine- (201, 205) bzw. der Placebogruppe
(215, 217). Der Erregernachweis war in der Milz von Tier 205 und im Perikard von
Tier 201 möglich. In der Placebo-Gruppe konnte bei einem verstorbenen Tier (217) in
vier verschiedenen Organen (Lunge, Milz, Leber, Gehirn) der Erreger nachgewiesen
werden. Ein Isolat des Belastungsstammes aus dem Gehirn lag auch bei dem Tier
215 vor (Tabelle 9). Alle eitrigen Gelenkpunktate (203, 212, 214) des heterologen
Belastungsversuches erwiesen sich als steril.
In der pathohistologische Auswertung des dritten Immunisierungsversuches mit der
heterologen Belastungsinfektion gab es deutliche Unterschiede zwischen der
Ganzzellvakzine- und der Placebogruppe (Tabelle 10). In der Ganzzellvakzinegruppe
konnten bei keinem Tier fibrinös-eitrige Veränderungen festgestellt werden, die über
den Grad geringgradig hinausgingen oder die sich als diffus darstellten.
Einschränkend ist aber zu berücksichtigen, dass für die beiden Tiere aus der
Ganzzellvakzinegruppe mit akuter Lahmheit der Nachweis der Synovialitis ausblieb.
Die schwersten dokumentierten Veränderungen in dieser Gruppe hatte das Tier 203,
bei dem eine geringgradige fibrinös-eitrige, multifokale Pleuritis und eine
geringgradige eitrige, multifokale Splenitis diagnostiziert wurde. Im Gegensatz dazu
hatten in der Placebogruppe drei Tiere mittel- oder hochgradige fibrinös-eitrige
Entzündungen, insbesondere lagen bei den Tieren 215 und 217 hochgradige
Ergebnisse
59
fibrinös-eitrige, diffuse Meningitiden vor (Tabelle 10). Diese Unterschiede kamen
auch in den sehr unterschiedlichen Pathoscores der beiden Gruppen zum Ausdruck:
Die Ganzzellvakzinegruppe erzielte einen sehr niedrigeren Score von nur 0,8 im
heterologen Belastungsversuch, während die Placebo-Gruppe 3,0 erreichte (Tabelle
10).
4.2.1.3 Fazit zur S. suis-Ganzzellvakzine
Die S. suis-Ganzzellvakzine rief bei Absetzferkeln nach zweimaliger Applikation
einen signifikanten Schutz gegenüber einer homologen intranasalen
Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm hervor, die 14 Tage
nach der zweiten Immunisierung erfolgte. Diese Protektion konnte mit einem Öl-in-
Wasser Adjuvans (Emulsigen®), jedoch nicht mit dem Adjuvans Aluminiumhydroxid,
erzielt werden. Diese Arbeit lieferte erstmalig Hinweise, dass eine Serotyp-2-
Ganzzellvakzine auch einen eingeschränkten partiellen Schutz gegenüber einer
heterologen intravenösen Belastungsinfektion mit einem Serotyp-9-Stamm vermitteln
kann. Hierfür sprachen geringe Unterschiede in Mortalität und Morbidität sowie
deutliche Unterschiede bei den pathohistologischen Befunden im Vergleich zur
Placebogruppe.
4.2.2 Untersuchung der protektiven Wirkung einer S. suis-Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP)
4.2.2.1 Homologe Belastungsinfektion
Parallel zu den Immunisierungen mit der Ganzzellvakzine wurde immer auch eine
Gruppe gleichaltriger Schweine mit einer S. suis-Subunitvakzine behandelt, die sich
aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) zusammensetzte.
Im ersten Versuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans verstarben in dieser
Subunitvakzinegruppe mit vier von acht Tieren annähernd so viele Tiere wie in der
Placebogruppe (Tabelle 8 sowie Abbildung 1). Fünf Tiere dieser
Ergebnisse
60
Subunitvakzinegruppe wiesen im ersten Versuch eine vorübergehende
Körpertemperatur von > 40,5°C auf (Tabelle 8). Ein Tier (68) mit Fieber zeigte keine
weiteren klinischen Anzeichen einer Erkrankung. Bei den anderen erkrankten Tieren
prägten zentralnervöse Störungen und akute hochgradige Lahmheiten das klinische
Bild. Zwei Tiere (62, 67) erkrankten an einer fibrinös-eitrige Synovialitis der
Tarsalgelenke (Tabelle 9). In diesen beiden Fällen gelang der kulturelle Nachweis
des Belastungsstammes aus den eitrigen Gelenkpunktaten. Das Tier 67 zeigte eine
hochgradige Störung des Allgemeinbefindens mit Festliegen im Zusammenhang mit
Symptomen einer beidseitigen Tarsitis. Bei diesem Tier konnten mit dem
Serotyp-2-Belastungsstamm assoziierte gering- oder mittelgradige multifokale
fibrinös-eitrige Entzündungen in insgesamt fünf unterschiedlichen Geweben
diagnostiziert werden (Lunge, Milz, Peritoneum, Meningen, Tarsalgelenke). Ein
ähnliches Bild zeichnete sich bei den Tieren 63 und 66 ab, bei denen fibrinös-eitrige
Entzündungen in drei unterschiedlichen Geweben festgestellt wurden. Im
Vordergrund standen bei diesen beiden Tieren mittelgradige multifokale
fibrinös-eitrige Meningitiden, die in einem Fall (66) mit zentralnervösen Störungen
und in dem anderen (63) mit Apathie assoziiert waren. Der Nachweis von
multifokalen fibrinös-eitrigen Entzündungen in mindestens drei unterschiedlichen
Geweben der drei Tiere 63, 66 und 67 sprach für generalisierte bakterielle
Erkrankungen, die mit Ausnahme der Ganzzellvakzinegruppe des zweiten
Experimentes in allen mit Stamm 10 belasteten Gruppen auftrat. In der
Subunitvakzinegruppe des ersten Experimentes erfolgte der Nachweis einer
Leukozytose in Folge der Belastungsinfektion bei drei von fünf erkrankten Tieren (62,
63, 66) und bei einem klinisch unauffälligen Tier (64). Deutliche Unterschiede in
Bezug auf die Ausbildung einer Leukozytose waren somit im ersten Experiment
zwischen den drei Gruppen nicht erkennbar (Tabelle 8). Im Einklang mit dem
ungestörten Allgemeinempfinden konnte bei den klinisch nicht erkrankten Tieren kein
Reisolat aus inneren Organen gewonnen werden. Die pathologischen
Untersuchungen ergaben jedoch bei zwei Tieren Veränderungen in Form einer
mittelgradigen (64) bzw. geringgradigen (61) fokalen fibrinös-eitrigen Meningitis
(Tabelle 10).
Ergebnisse
61
Im zweiten Versuch mit Emulsigen als Adjuvans konnte die MAP-Subunitakzine
keine mit der Ganzzellvakzine vergleichbare Schutzwirkung gegenüber einer
homologen Belastungsinfektion mit dem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm erzielen
(Tabelle 8, Abbildung 3 und 4). Ein verzögertes Eintreten der mittel- bis
hochgradigen Störung des Allgemeinbefindens bei den erkrankten Tieren der MAP-
Subunitvakzinegruppe im Vergleich zu den erkrankten Tieren der Placebo-Gruppe
war im zweiten Versuch aber auffällig. In der statistischen Auswertung der Kaplan-
Meyer Diagramme (Abbildung 3 und 4) resultierte dies in schwach signifikanten
Unterschieden zwischen der MAP-Subunitvakzine- und der Placebogruppe bezüglich
der Morbidität (P = 0,0065), jedoch nicht der Mortalität (P = 0,3974).
Das Spektrum der Symptomatik und Pathologie war in der Subunitvakzinegruppe
des zweiten Experimentes sehr vielfältig (Tabelle 8 und 10). Bei zwei Tieren traten
akute Lahmheiten (85, 90) auf. Zwei weitere Tiere (86, 87) verstarben in Folge
hochgradiger diffuser fibrinös-eitriger Meningitiden, die mit dem Nachweis des
Belastungsstammes im Liquor cerebrospinalis bzw. im Gehirntupfer korrelierten. Vier
Tiere (84, 85, 86, 88) entwickelten in Folge der Belastungsinfektion fibrinös-eitrige
Pleuritiden bzw. in einem Fall (88) sogar eine teils fibrinöse teils nekrotisierende
Pleuropneumonie. Ein Tier (90) fiel durch eine fokale eitrige Hepatitis auf. Es ist
festzuhalten, dass bei den pathohistologischen Untersuchungen insgesamt keine
deutlichen Unterschiede in Bezug auf den Grad und die Ausdehnung der fibrinös-
eitrigen Veränderungen zwischen der Subunit- und der Placebogruppe festgestellt
wurden (Tabelle 10). Dies kommt auch in den Pathoscores der beiden Gruppen zum
Ausdruck (3,1 bzw. 3,75, Tabelle 10).
4.2.2.2 Heterologe Belastungsinfektion
Im dritten Versuch mit der heterologen Belastungsinfektion überlebte in der
Subunitvakzine- wie in der Placebogruppe nur eines von sechs Tieren. Die
statistische Auswertung des Verlaufs des Merkmals Mortalität im Kaplan-Meyer-
Diagramm (Abbildung 5) ergab entsprechend keine signifikanten Unterschiede
zwischen der Subunitvakzine- und der Placebogruppe (P =0,4785). Fünf Tiere dieser
Ergebnisse
62
Gruppe zeigten hochgradige Lahmheiten. Meist waren mehrere Gelenke betroffen,
so dass drei Tiere (208, 210, 211) nicht mehr in der Lage waren aufzustehen. Tier
208 zeigte trotz Lahmheit zusammen mit dem gesunden Tier (209) keinen Anstieg
der Leukozyten. In der Kontrollgruppe zeichnete sich ein ähnliches Bild ab. Auch hier
lag der Schwerpunkt der Erkrankung bei hochgradigen Lahmheiten. Bei den
erkrankten Tieren der Kontrollgruppe konnte ein Temperaturanstieg von >40,5°C
gemessen werden. Während in der Gruppe der Subunitvakzine nur drei Tiere (208,
211, 212) einen Anstieg der Körpertemperatur zeigten. Dies manifestierte sich bei
der statistischen Auswertung der Morbidität im Vergleich zur Placebogruppe in einem
schwach signifikanten Schutz (P = 0,0170) (Abbildung 6). Der kulturelle Nachweis
des Belastungsstammes konnte nur bei einem Tier (210) der Subunitvakzinegruppe
in zwei Organen (Lunge, Peritoneum) erbracht werden (Tabell 9). Im Gegensatz zu
den homologen Belastungsversuchen konnte in den eitrigen Gelenkpunktaten trotz
Anreicherung kein Erreger nachgewiesen werden. In der pathohistologischen
Untersuchung konnten in der Subunitvakzinegruppe zwei (211, 212) mittelgradige
multifokale fibrinös-eitrige Synovialitiden diagnostiziert werden. Für drei Tiere (207,
208, 210) mit akuten Lahmheiten fehlte aber der Nachweis einer Synovialitis. Der
Pathoscore lag mit 1,5 unter dem der Placebogruppe, die durch den Nachweis
hochgradiger fibrinös-eitriger Entzündungen im Gehirn, Gelenk, Leber und/oder Milz
einen hohen Score von 3,0 erzielte (Tabelle 10).
4.2.2.3 Fazit zur Subunitvakzine
Abschließend ist festzuhalten, dass in keiner mit der Subunitvakzine immunisierten
Gruppe ein signifikanter Schutz vor Mortalität im Vergleich zur Placebogruppe erzielt
werden konnte. Im Vergleich zur Placebogruppe konnte aber unter Berücksichtigung
des zeitlichen Verlaufes im zweiten und dritten Versuch eine schwach signifikante
Schutzwirkung in Bezug auf das Merkmal Morbidität nachgewiesen werden
(Abbildung 4 und 6). Im Gegensatz zum ersten Versuch zeigte auch das Merkmal
Mortalität im zweiten homologen Belastungsversuch mit Emulsigen® als Adjuvans in
der Gruppe der Subunitvakzine einen weniger steilen Anstieg als in der
Placebogruppe (Abbildung 4). Im Immunisierungsversuch mit der heterologen
Ergebnisse
63
Belastungsinfektion verendeten in der Gruppe der Subunitvakzine genauso viele
Tiere wie in der Placebogruppe. Die pathologischen Ergebnisse sprachen aber für
ein geringeres Ausmaß fibrinös-eitriger Entzündungen in der Subunitvakzine- im
Vergleich zur Placebogruppe (Tabelle 10).
Ergebnisse
64
Abbildung 1: Mortalität bei Schweinen, die nach einer zweimaligen Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer Diagramm)
Abbildung 2: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8)aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer Diagramm)
Ergebnisse
65
Abbildung 3: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)
Abbildung 4: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)
Ergebnisse
66
Abbildung 5: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine(n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) intravenös mit dem heterologen Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®).(Kaplan-Meyer Diagramm)
Abbildung 6: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8) heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-Meyer Diagramm)
Ergebnisse
67
Tabelle 8: Klinische Befunde bei Schweinen, die nach einer Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.
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Ergebnisse
68
Tabelle 9: Reisolation des Belastungsstammes von Schweinen, die mit einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) immunisiert und anschließend homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.
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Ergebnisse
69
Tabelle 10: Differenzierung von fibrinös-eitrigen Entzündungen bei Schweinen nach homologer (Stamm 10) oder heterologer (Stamm A3286/94) Belastungsinfektion in Immunisierungsexperimenten mit einem Pathoscore von 1 bis 5 (1: minimal; 2 und 3: geringgradig und fokal; 4 und 5: mittel- oder hochgradig sowie multifokal oder diffus) 1
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Ergebnisse
70
4.3 Antikörperantworten von Schweinen nach experimenteller Infektion mit S. suis- Serotyp-2-Stamm 10 und Serotyp-9-Stamm A3286/94
Im dritten Teil dieser Dissertation wurde untersucht, wie sich der Gehalt der
spezifischen Immunglobuline G im Serum der Versuchstiere in Folge der Infektion
bzw. der Immunisierung veränderte. Es wurden zunächst ELISA-Verfahren für die
Bestimmung von relativen Antikörpertitern gegen MAP und MRP sowie EF etabliert.
Diese Etablierungsarbeiten ermöglichten das Festlegen von Qualitätskriterien (3.10).
Eine Berücksichtigung von Messwerten für diesen Ergebnisteil erfolgte nur, wenn alle
Kriterien erfüllt waren. Trotz wiederholter Versuche war es nicht möglich, einen
Ganzzell-ELISA zu etablieren, der ähnlichen Qualitätskriterien standhielt. Das in allen
ELISAs eingesetzte Konjugat erkannte nach Herstellerangaben alle IgG-Subtypen.
4.3.1 Experimentelle Infektion zur Etablierung des S. suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 Modells
Im Rahmen der Etablierung eines Modells für S. suis-Serotyp-9-Stamm Schweine
intranasal mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 infiziert. Keines der Tiere entwickelte
Symptome einer S. suis-Erkrankung. In hämatologischen und pathologische
Untersuchungen konnten aber Hinweise auf entzündliche Veränderungen in Folge
dieser intranasalen Belastungsinfektion gewonnen werden (siehe 4.1 und BEINEKE
et al. 2007). Es sollten die relativen Antikörpertiter gegen MAP und MRP sowie EF
prae und 20 Tage post infectionem verglichen werden. Bei der Interpretation der
Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass die Versuchstiere aus einem Bestand
kamen, der frei von Serotyp-9-Stämmen, aber nicht frei von S. suis war. In Proben
von Tieren dieses Bestandes wurden bis heute keine S. suis-Stämme nachgewiesen,
die positiv für das EF-Gen epf waren (BAUMS 2007). Vereinzelt konnten aber von
den Tonsillen Stämme isoliert werden, die das mrp-Gen trugen.
In Abbildung 7 sind die Antikörpertiter für die intranasal mit Stamm A3286/94
infizierte Gruppe vor und nach der Infektion dargestellt. Alle Tiere dieser Gruppe
zeigten einen Anstieg MRP-spezifischer Antikörper. Dieser Titeranstieg erreichte
Ergebnisse
71
jedoch bei keinem dieser Tiere Werte über 100 ELISA-Units. Bei fünf dieser sechs
Tiere konnte ein Anstieg spezifischer Antikörper gegen MAP Stamm A3286/94
festgestellt werden. Nach der Infektion wurde bei zwei Tieren (8, 116) ein anti-MAP
Antikörpertiter über 100 ELISA Units gemessen. In der Untersuchung des
Antikörperspiegels gegen EF konnte bei diesen mit A3286/94 infizierten Tieren wie
erwartet kein Anstieg ermittelt werden (Abbildung 7). In der mit Stamm 10 infizierten
Gruppe zeigten zwei der drei Tiere (119, 150), die mindestens die ersten fünf Tage
nach der Belastungsinfektion überlebten, eine Erhöhung des Antikörpertiters gegen
EF von 6 bzw. 8,7 ELISA-Units auf über 20 ELISA-Units. Bei diesen beiden Tieren
erfolgte auch ein Anstieg der Antikörpertiter gegen MRP und MAP auf Werte über
100 ELISA Units.
Abbildung 7: Antikörper gegen MRP (136 kDa Variante), MAP von A3286/94 und EF (110 kDa Variante) vor bzw. 20 Tage nach der intranasalen Infektion mit dem MRP+ SLY+ Serotyp 9 Stamm A3286/94 (EF negativ).
Ergebnisse
72
4.3.2 Immunisierungs- und Belastungsversuche
Die Etablierung des anti EF-ELISAs stand in Zusammenhang mit der Möglichkeit, auf
Grundlage der MAP-Subunitvakzine das DIVA-Konzept für MRP+ EF+
Serotyp-2-Stämme umzusetzen. Aufgrund der mangelhaften protektiven Wirkung der
Subunitvakzine wurde in den serologischen Untersuchungen zunächst auf die
Untersuchung der Antikörpertiter gegen EF verzichtet. Zum Nachweis der Induktion
der Antikörperbildung in Folge der Immunisierung mit der MAP-Subunit- bzw. der
Ganzzellvakzine wurde der MRP- und der MAP-ELISA eingesetzt.
In den beiden ersten Immunisierungsversuchen mit homologer Belastungsinfektion
konnte sowohl in der Ganzzell- als auch in der Subunitvakzinegruppe ein Anstieg der
Antikörper gegen MRP und MAP festgestellt werden (Abbildungen 8 und 9). Im
ersten Immunisierungsversuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans lagen jedoch 14
Tage nach der zweiten Immunisierung die relativen Antikörpertiter gegen MRP und
MAP bei allen Tieren unter 100 ELISA Units (Abbildung 8). Im Gegensatz dazu
entwickelten im zweiten Immunisierungsversuch mit Emulsigen® als Adjuvans alle
Tiere der Ganzzellvakzinegruppe 14 Tage nach der zweiten Immunisierung relative
MRP-spezifische Antikörpertiter über 100 ELISA-Units. Mit Ausnahme von zwei
Tieren (83, 85) konnte auch bei den Tieren der Subunitvakzinegruppe im zweiten
Immunisierungsversuch ein Anstieg der Antikörper auf Werte über 100 ELISA Units
festgestellt werden (Abbildung 9). Der Mittelwert des relativen Antikörperspiegels lag
bei Tieren der Ganzzellvakzinegruppe mit 369 ELISA-Units deutlich über dem der
Subunitvakzinegruppe mit 238 ELISA-Units. In den Kontrollgruppen des ersten und
zweiten Immunisierungsversuches konnte bei keinem Tier ein Anstieg des
MRP-spezifischen Antikörpertiters auf Werte über 100 ELISA-Units nachgewiesen
werden (Abbildungen 8 und 9).
Im dritten Immunisierungsexperiment zeigte sich wie im zweiten Versuch ein
deutlicher Anstieg des Titers der MRP-spezifischen Antikörper bei allen Tieren der
Ganzzell- und der Subunitvakzinegruppe (Abbildung 10). Die Varianz der
Antikörpertiter nach der Vakzinierung mit der Ganzzell- oder der Subunitvakzine war
im dritten wie auch zuvor im zweiten Immunisierungsexperiment sehr groß
(Standardabweichungen von 160 bis 230 ELISA-Units innerhalb einer Gruppe).
Ergebnisse
73
Trotzdem waren die Mittelwerte der MRP-spezifischen Antikörpertiter im zweiten und
dritten Immunisierungsexperiment gut reproduzierbar. Die Mittelwerte der
Ganzzellvakzine- bzw. Subunitvakzinegruppe im dritten Versuch waren 348 bzw. 265
ELISA-Units.
Die Tiere des zweiten und dritten Immunisierungsversuches wurden serologisch
auch auf einen Anstieg des Antikörpertiters gegen die Fraktion aus Murein-
assoziierten Proteinen von Stamm 10 untersucht. In Folge der Immunisierung trat bei
allen Tieren sowohl in der Ganzzell- als auch in der Subunitvakzinegruppe in beiden
Immunisierungsversuchen eine deutliche Serokonversion auf. Beide Gruppen
verhielten sich in Bezug auf diese Antikörpertiter sehr ähnlich und erreichten in
beiden Versuchen Mittelwerte zwischen 200 und 300 ELISA-Units (Abbildungen 11
und 12). Die Varianz der Antikörpertiter war 14 Tage nach der zweiten
Immunisierung innerhalb einer Gruppe sehr groß (Standardabweichungen von 80 bis
230 ELISA-Units innerhalb einer Gruppe). Mit Ausnahme von zwei Tieren erreichten
alle Tiere dieser immunisierten Gruppen MAP-spezifische Antikörpertiter mit Werten
über 100 ELISA-Units. Nur das Tier 94 der Ganzzellvakzinegruppe im zweiten
Versuch und das Tier 209 der Subunitvakzinegruppe des dritten Versuches blieben
mit 95 bzw. 70 ELISA-Units am 14. Tag nach der zweiten Immunisierung unter
diesem Grenzwert. Im dritten Immunisierungsversuch hatten in allen drei Gruppen
jeweils zwei Tiere Ausgangstiter mit Werten über 20 ELISA-Units, die im Vergleich zu
den positiven und negativen Kontrollen des ELISA als schwach positiv auffielen.
Diese schwach positiven relativen Titer, die auch in der Kontrollgruppe beobachtet
wurden, waren vermutlich Ausdruck der Auseinandersetzung mit anderen S. suis-
Stämmen, die bei allen Versuchstieren in den Tonsillen nachgewiesen wurden
(Ergebnisse nicht gezeigt).
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass in allen drei Immunisierungsversuchen
sowohl in den Ganzzell- als auch in den Subunitvakzinegruppen im Gegensatz zu
den Kontrollgruppen Serokonversionen gegenüber MRP in Folge der Immunisierung
nachgewiesen wurden. Die MRP-spezifischen Antikörpertiter erreichten in beiden
Versuchen mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans im Gegensatz
zu dem ersten Versuch mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans Werte, die deutlich über
Ergebnisse
74
dem relativen Titer von 100 ELISA-Units des Rekonvaleszenzserums lagen. In den
beiden letzten Versuchen mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) waren die
MRP-spezifischen Antikörpertiter in der Ganzzellvakzinegruppe tendenziell höher als
in der Subunitvakzinegruppe. Untersuchungen der Antikörpertiter gegen die Fraktion
der Murein-assoziierten Proteine ergaben ein sehr ähnliches Bild. Die
Ganzzellvakzinegruppe erzielte sowohl im zweiten als auch im dritten Versuch
höhere Mittelwerte für MAP-spezifische Antikörper als die entsprechende
MAP-Subunitvakzinegruppe.
Abbildung 8: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung (Alter von 3-4 Wochen) sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 51-57), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 61-68) oder einem Placebo (K, Tier 71-78) bei Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans. (1. Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion).
Ergebnisse
75
Abbildung 9: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8 Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. ( 2. Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion).
Abbildung 10: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8 Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans ( 3. Immunisierungsversuch, vor der heterologen Belastungsinfektion).
Ergebnisse
76
Abbildung 11: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10 vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans (2. Immunisierungsversuch, vor homologer Belastungsinfektion).
Abbildung 12: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10 vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. (3. Immunisierungsversuch, vor heterologer Belastungsinfektion).
Ergebnisse
77
4.3.3 Abschätzung der Bedeutung von MRP- und MAP-spezifischen Antikörpertitern (Gesamt IgG) als prognostische Indikatoren
Mehr als die Hälfte aller Versuchstiere mit Antikörpertitern > 100 ELISA-Units sowohl
gegen MRP als auch gegen MAP erkrankten bzw. verstarben in Folge der
S. suis-Infektion (Tabelle 11). Im zweiten Versuch entwickelte ein Tier (98) aus der
Ganzzellvakzinegruppe und zwei Tiere (86, 87) aus der Subunitvakzinegruppe eine
hochgradige diffuse fibrinös-eitrige Meningitis, obwohl diese Versuchstiere vor der
homologen Belastungsinfektion sowohl gegenüber MRP als auch gegenüber MAP
Antikörpertiter über 150 ELISA-Units aufwiesen. In dem dritten Versuch mit
heterologer Belastungsinfektion war in den immunisierten Gruppen gleichfalls kein
Zusammenhang zwischen hohen Antikörpertitern und Protektion zu erkennen. Die
Tiere 211 und 212 aus der MAP-Subunitvakzinegruppe hatten beispielsweise vor der
Belastungsinfektion sehr hohe MRP- und MAP-spezifische Antikörpertiter von über
400 bzw. 160 ELISA-Units. Trotzdem entwickelten beide Tiere schwere Lahmheiten
im Zusammenhang mit mittelgradigen multifokalen fibrinös-eitrigen Tarsitiden.
Ergebnisse
78
Tabelle 11: Mortalität und Morbidität aller Versuchstiere im Zusammenhang mit Antikörpertitern gegen MRP bzw. MAP vor der experimentellen Belastungsinfektion
MRP MAP-Serotyp 2
ELISA-Units 14 Tage nach der 2. Immunisierung > 100 < 100 > 100 < 100
Anzahl der überlebenden Tiere 9 13 10 3 Mortalität
Anzahl der verstorbenen Tiere 13 29 18 10
Positiver prädiktiver Wert für Protektion vor Mortalität 0,41 0,36
Negativer prädiktiver Wert für Protektion vor Mortalität 0,59 0,77
Anzahl nicht erkrankter Tiere 8 10 8 3
Morbidität
Anzahl erkrankter Tiere 15 31 17 13
Positiver prädiktiver Wert für Protektion vor Morbidität 0,35 0,32
Negativer prädiktiver Wert für Protektion vor Morbidität 0,76 0,81
Diskussion
79
5 Diskussion
In dem ersten Teil dieser Arbeit sollte ein Infektionsmodell für
S. suis-Serotyp-9-Stämme etabliert werden. Ein erheblicher Anteil von etwa 20% der
invasiven S. suis Erkrankungen in Europa kann auf Serotyp-9-Stämme zurückgeführt
werden (SILVA et al. 2006; WISSELINK et al. 2002b). Eine vergleichbare Bedeutung
besitzen vor allem in Mitteleuropa nur noch Serotyp-2-Stämme. Die Etablierung
eines Infektionsmodells für S. suis-Serotyp 9 eröffnete die Möglichkeit, in
Immunisierungsexperimenten mit Vakzinen aus Serotyp 2 Antigenen deren
Schutzwirkung gegenüber einer heterologen Belastungsinfektion mit Serotyp-9-
Stämmen zu untersuchen. Der Bedarf an einem Impfstoff mit einer solchen
heterologen Schutzwirkung ist in Europa erheblich. Es wäre erstmalig möglich,
S. suis-Erkrankungen in der Schweineproduktion prophylaktisch mit stallspezifischen
Vakzinen entgegen zu wirken.
Im Gegensatz zu dem Serotyp-2-Stamm 10 führte die intranasale Applikation des
Serotyp-9-Stammes A3286/94 bei sieben bis acht Wochen alten Ferkeln nicht zu
klinisch manifesten Erkrankungen. Aufgrund dieses Ergebnisses könnten Zweifel
aufkommen, ob der ausgewählte Stamm A3286/94 wirklich ein Vertreter der
virulenten Serotyp-9-Stämme ist, die in Europa für erhebliche Tierverluste
verantwortlich sind. Dieser Kritikpunkt erscheint vor allem plausibel, da bei S. suis
sehr unterschiedliche Genotypen zu einem Serotyp gehören können (KING et al.
2002; REHM et al. 2007; SMITH et al. 1997), die sich in der Virulenz erheblich
unterscheiden können. Aus folgenden Gründen erscheinen diese Zweifel aber
unberechtigt: A3286/94 wurde aus dem Gehirn von einem Schwein mit Meningitis
isoliert. Dieser Stamm exprimiert eine große Variante des „Muramidase-released
Proteins“ (MRP*) und besitzt das Suilysingen sly (SILVA et al. 2006). Beide Faktoren
sind Marker virulenter S. suis-Stämme (ALLGAIER et al. 2001; STAATS et al. 1999a;
VECHT et al. 1991). Typisierungen mit der AFLP und MLST zeigen, dass A3286/94
genetisch eng verwandt mit anderen Serotyp-9-Stämmen ist, die auch aus inneren
Organen von erkrankten Tieren isoliert wurden (REHM et al. 2007). Insbesondere
gehört A3286/94 zum klonalen Komplex 87. Klonale Komplexe stehen häufig im
Zusammenhang mit besonderen Virulenz- und Resistenzmerkmalen der
entsprechenden Stämme. Obwohl die intranasale Infektion mit A3286/94 klinisch
unauffällig verlief, spricht der Anstieg der Leukozyten im Blut in der ersten Woche
Diskussion
80
nach der Infektion für eine akute Infektion. Ferner konnten in den
pathohistologischen Untersuchungen dieser Tiere 20 Tage nach der Infektion
entzündliche Veränderungen der Serosen und im Gehirn festgestellt werden. Im
Einklang mit dem ungestörten Allgemeinbefinden waren diese Veränderungen alle
geringgradig und fokal begrenzt. Mit den im Rahmen dieser Dissertation
durchgeführten kulturellen bakteriologischen Untersuchungen war es nicht möglich,
den Erreger zu isolieren. Mit immunhistologischen und molekularbiologischen
Untersuchungen des Gehirns konnte aber in drei dieser sechs Fälle der
Belastungsstamm nachgewiesen werden (BEINECKE et al. 2007). Bei den anderen
drei Tieren konnten keine anderen Infektionserreger durch die bakteriologische
Untersuchung festgestellt werden. Nach intravenöser Applikation des
Serotyp-9-Stammes A3286/94 entwickelten alle vier infizierten Schweine klinisch
manifeste S. suis-Erkrankungen, insbesondere Synovialitis, Serositis und Meningitis.
Aufgrund der schwachen Virulenz des Serotyp-9-Stammes A3286/94 im intranasalen
Infektionsmodell wurden die Belastungsinfektionen mit A3286/94 in den
Immunisierungsversuchen intravenös ausgeführt.
In dem zweiten Teil der Arbeit sollte die protektive Wirkung einer Ganzzell- und einer
Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen verglichen werden. Die protektive
Wirkung von Ganzzellvakzinen gegenüber homologen Belastungsinfektionen mit
Serotyp-2-Stämmen konnte in vorangegangenen Studien von Wisselink et al. (2001,
2002) und BUSQUE et al. (1997) experimentell belegt werden (Tabelle 2).
Ganzzellvakzinen in der Form stallspezifischer Impfstoffe sind in Deutschland heute
vor allem bei Bestandsproblemen ein wichtiges Instrument zur Bekämpfung von
S. suis-Erkrankungen. Diese Form der Vakzinierung besitzt aber eine Reihe von
Nachteilen: Die Vakzinierung kann erst erfolgen, nachdem Erkrankungen aufgetreten
sind und die Diagnostik sowie die Herstellung der stallspezifischen Vakzine
abgeschlossen wurde. Die Herstellung der stallspezifischen Vakzinen erfolgt nicht
nach einer tierexperimentellen Prüfung der protektiven Wirkung.
Obwohl für S. suis keine Belastungsversuche mit heterologen Serotypen
beschrieben wurden (Tabelle 2), wird S. suis-Ganzzellvakzinen grundsätzlich keine
Serotyp-übergreifende Schutzwirkung zugesprochen (BAUMS 2007), Rekombinante
Impfstoffe und Subunitvakzinen lassen sich genauer standardisieren.
Ganzzellvakzinen aus Wildtypstämmen ermöglichen im Allgemeinen keine
Unterscheidung von infizierten und immunisierten Tieren. Aufgrund dieser Nachteile
Diskussion
81
wurde in dieser Arbeit der Einsatz einer Subunitvakzine als Alternative zu einer
Ganzzellvakzine geprüft. Die untersuchte Subunitvakzine bestand im Wesentlichen
aus den Murein-assoziierten Proteinen. Diese Faktoren sind an der Oberfläche der
Bakterien mit der Zellwand verankert und häufig gute Immunogene. Somit bestanden
grundsätzlich gute Voraussetzungen, dass entsprechende Antikörper eine
opsonisierende Wirkung entfalten könnten. In dieser Arbeit konnte aber im
Gegensatz zur untersuchten Ganzzellvakzine durch die Applikation der
Subunitvakzine kein signifikanter Schutz vor Mortalität in Folge einer homologen
Belastungsinfektion erzielt werden. Für die Entwicklung zukünftiger Impfstoffe könnte
das Verständnis der unterschiedlichen Wirkung der beiden Vakzinen eine wichtige
Rolle spielen. Eine nahe liegende Erklärung wäre, dass in der Subunitvakzine
bestimmte Faktoren fehlten, die in der Ganzzellvakzine als Immunogene eine
wichtige Funktion erfüllten. JACOBS et al. (1996) und WISSELINK et al. (2001)
konnten zeigen, dass Immunisierungen mit Suilysin bzw. EF zur Protektion
gegenüber hochvirulenten MRP+ EF+ SLY+ Serotyp-2-Stämmen beitragen. Da diese
beiden Faktoren sekretiert werden, fehlen sie in der untersuchten Subunitvakzine. In
der Ganzzellvakzine sind sie aber in geringen Mengen vorhanden. Antikörper gegen
sekretierte Faktoren können keine opsonisierende sondern nur eine neutralisierende
Wirkung entfalten. Um zu klären, ob Antikörper gegen sekretierte Faktoren für die
beobachteten Unterschiede eine Rolle spielen, sollte in zukünftigen Experimenten
analysiert werden, ob sich die Seren der immunisierten Tiere beider Gruppen in ihren
opsonisierenden Eigenschaften unterscheiden. Ferner sollten die EF-spezifischen
Antikörper bei diesen Versuchstieren bestimmt werden.
Die Kapsel von S. suis-Serotyp-2-Stämmen ist eine weitere Möglichkeit den Erreger
vor der Phagozytose zu schützen (SMITH et al. 1999). Epitope von Oberflächen-
assoziierten Proteinen, insbesondere auch solche von MAP, sind im bekapselten
Zustand häufig maskiert, so dass eine Bindung von Antikörpern unterbleibt. Dies
könnte ein Grund sein, warum die Tiere der MAP-Subunitvakzinegruppen trotz
vorhandener MAP-spezifischer Antikörper keinen ausreichenden Schutz gegen die
S. suis-Stamm aufwiesen. In der Ganzzellvakzine liegen die Bakterien im
bekapselten Zustand vor.
Die Immunisierung mit der Ganzzellvakzine könnte somit auch eine
Antikörperbildung gegen Kapselbestandteile provoziert haben, obwohl Polysacharide
grundsätzlich schlechte Immunogene sind. Die Bildung Kapsel-spezifischer
Diskussion
82
Antikörper bei den Tieren der Ganzzellvakzinegruppen des zweiten und dritten
Versuches wäre auch eine Erklärung für die bessere Schutzwirkung der
Ganzzellvakzine gegen den hochvirulenten homologen Serotyp-2-Stamm als gegen
den weniger virulenten heterologen Serotyp-9-Stamm. Die Bestimmung Kapsel-
spezifischer Antikörpertiter in zukünftigen Untersuchungen könnte daher zu einem
besseren Verständnis beitragen. Nach der enttäuschenden Wirkung der MAP-
Subunitvakzine sollte Impfstoffen mit S. suis-Kapselbestandteilen vermehrt
Aufmerksamkeit geschenkt werden. In der Humanmedizin haben sich
Kombinationsvakzinen aus Kapselbestandteilen von unterschiedlichen
Pneumokokken-Serotypen als Impfstoffe durchgesetzt (MARCHESE et al. 2006).
Problematisch ist in diesem Zusammenhang allerdings, dass bakterielle
Kapselpolysaccharide eine Antikörperbildung vorwiegend unabhängig von T-Zellen
induzieren, so dass bei Kindern unter zwei Jahren nur eine unzureichende
Antikörperbildung stattfindet (SNAPPER et al. 2001). Es liegen jedoch noch keine
Untersuchungen vor, dass diese Vakzine auf Ferkel übertragen werden kann.
Die serologischen Untersuchungen im dritten Abschnitt zeigen, dass die Applikation
der Subunitvakzine mit der Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans zur
Induktion von MRP- und MAP-spezifischen Antikörpern führte. Der durchschnittliche
Antikörpertiter war 14 Tage nach der zweiten Immunisierung in der
Ganzzellvakzinegruppe aber größer als in der Subunitvakzine. Dieser Unterschied ist
bemerkenswert, da in der Subunitvakzinegruppe ausschließlich mit MAP immunisiert
wurde. Außerdem war die mit einer Immunisierung applizierte Menge dieser Proteine
in der Subunitvakzine weit größer als die zu erwartende Menge der Murein-
assoziierten Proteine in einer Impfdosis der Ganzzellvakzine. Der Grund für diese
Diskrepanz könnte mit dem Lysozym-Verdau in dem Protokoll zur Herstellung der
MAP-Fraktion für die Subunitvakzine zusammenhängen. In der Ganzzellvakzine sind
die Murein-assoziierten Proteine fest mit der Zellwand assoziiert. Ein Großteil dieser
Proteine ist über das LPXTG-Motif sogar kovalent mit dem Mureingerüst verbunden.
Durch den Lysozymverdau wird bei der Herstellung der MAP-Fraktion dieses
Mureingerüst größtenteils degradiert. Das Mureingerüst besitzt Eigenschaften eines
Adjuvans. In neuen experimentellen Immunisierungsansätzen in der
humanmedizinischen Forschung werden Antigene mit dem Mureingerüst von
Laktokokken verankert, um diese Adjuvanseigenschaften zu nutzen (AUDOUY et al.
2006; MANNAM et al. 2004; MOORTHY u. RAMASAMY 2007). Das Mureingerüst
Diskussion
83
bzw. die Zellwand von S. suis aktiviert über den Toll-like Rezeptor 2 des Wirtes die
Expression zahlreicher Interleukine (GRAVELINE et al. 2007). KHAN et al. (2005)
konnten im S. pneumoniae Mausmodell zeigen, dass Toll-like Rezeptor 2-Aktivierung
die humorale Immunantwort, insbesondere die Th1-Antwort, moduliert. Somit könnte
das Mureingerüst über seine immunmodulatorischen Eigenschaften in der
Ganzzellvakzine eine verstärkte Antikörperproduktion, insbesondere auch eine Th1-
Antwort, gegen die Murein-assoziierten Proteine bewirkt haben, die in der
Subunitvakzine trotz der höheren Konzentration der Murein-assoziierten Proteine
ausgeblieben ist. Da aber weder der MRP- noch der MAP-Antikörpertiter sich als
zuverlässiger prognostischer Indikator erwies (4.3.3), ist zu erwarten, dass noch
andere Faktoren für die unterschiedliche protektive Wirkung der beiden Vakzinen
eine wichtige Rolle gespielt haben.
Neben dem Antigen besitzt die Wahl des Adjuvans eine wichtige Funktion für die
protektive Wirkung einer Vakzine. Die Bedeutung des Adjuvans für eine
S. suis-Vakzine wird in einem Vergleich der Ergebnisse des ersten und zweiten
Immunisierungsexperimentes dieser Arbeit deutlich. Eine signifikante protektive
Wirkung der Ganzzellvakzine konnte nur mit der Öl-in-Wasser Emulsion nicht aber
mit Aluminiumhydroxid hervorgerufen werden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang
mit Immunisierungsversuchen von WISSELINK et al. (2001), die mit einem
Wasser-in-Öl Adjuvans nicht aber nicht mit Aluminiumhydroxid eine protektive
Wirkungen einer S. suis-Ganzzellvakzine aufzeigen. Die in dieser Arbeit eingesetzte
Öl-in-Wasser Emulsion könnte als Adjuvans für die Ganzzellvakzine eine sehr gute
Wirkung, für die Subunitvakzine aber eine nicht hinreichende Wirkung erzielt haben.
Wobei die Unterschiede in der Verträglichkeit in diesen Versuchen nicht genauer
untersucht wurden. Öl-in-Wasser Emulsionen sind hervorragend geeignet für
amphipathische Moleküle, da diese in der Ölphase verankert werden (COX u.
COULTER 1997). In der Ganzzellvakzine sind neben Murein-assoziierten Proteinen
noch Lipoproteine und andere mit der Zellmembranassoziierte Proteine vorhanden,
die diesen optimalen amphipatischen Aufbau für eine Öl-in-Wasser Emulsion
besitzen. Bei einem großen Teil der Proteine der Subunitvakzine könnte die
Inkorporation in die Öltropfen aufgrund fehlender hydrophober Domänen
ausgeblieben sein. In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass LI et al.
(2006, 2007) Emulsigen® als unzureichendes Adjuvans für einen rekombinanten
S. suis-Impfstoff auf der Grundlage des Proteins Sao beschreiben. Nach ihren
Diskussion
84
Ergebnissen wurde mit Emulsigen® vorwiegend die Bildung von Immunglobulin G1-
Antikörpern ohne opsonophagozytierende Wirkung induziert. Das Protein Sao ist
über ein LPXTG-Motif kovalent mit dem Mureingerüst verbunden. Es gehört somit zu
den Murein-assoziierten Proteinen von S. suis-Serotyp-2-Stämmen LI et al. (2006)
und sollte damit Bestandteil der MAP-Subunitvakzine sein. In zukünftigen Arbeiten
sollte eine weiterführende serologische Untersuchung der Seren der Versuchstiere
dieser Arbeit einschließlich einer Bestimmung von IgG-Subtypen vorgenommen
werden. Diese Differenzierungen zusammen mit Untersuchungen auf
opsonosierende Eigenschaften sollten zeigen, ob die Ergebnisse von LI et al. (2006)
auch für die MAP-Subunitvakzinegruppe zutreffen.
Die Abstände zwischen den Impfungen und der Belastungsinfektion wurden aufgrund
der Versuchsbedingungen gewählt. Die Stallungen boten nicht ausreichend Platz,
um die Tiere unter Versuchsbedingungen über längere Zeit zu halten. In
weiterführenden Untersuchungen sind überlegungen zu treffen, die Abstände
zwischen der ersten und der zweiten Impfung von 11 Tage auf 21 Tage zu
vergrößern, um eventuell einen besseren Schutz der Vakzine zu erreichen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass unter Verwendung einer
Öl-in-Wasser Emulsion als Adjuvans eine S. suis-Serotyp-2-Ganzzellvakzine einen
wesentlich besseren, jedoch noch nicht einen zufriedenstellenden Schutz gegen
S. suis-Infektionen hervorruft, als eine Subunitvakzine aus Murein-assoziierten
Proteinen. Diese Protektion war gegenüber dem homologen hochvirulenten Serotyp-
2-Stamm hoch signifikant und manifestierte sich in zahlreichen Unterschieden zur
Kontrollgruppe, zum Beispiel in einem niedrigeren Pathoscore und dem Ausbleiben
einer generalisierten bakteriellen Erkrankungen. Erstmalig wurden in dieser Arbeit
Hinweise gewonnen, dass eine Serotyp-2-Ganzzellvakzine auch einen schwachen
Schutz vor Morbidität und Mortalität in Folge einer heterologen Belastungsinfektion
mit einem Serotyp-9-Stamm vermittelt. Die genauere Analyse dieser protektiven
Wirkungen der Ganzzellvakzine in zukünftigen Untersuchungen verspricht die
Möglichkeit, durch Modifikationen, gegebenenfalls auch durch Kombination
unterschiedlicher Stämme, einen Impfstoff mit signifikanter Serotyp-übergreifender
Schutzwirkung zu entwickeln.
Zusammenfassung
85
6 Zusammenfassung
Katharina Benneke: Vergleichende Untersuchungen zur protektiven Wirkung einer Streptococcus
suis Ganzzell- und einer Subunitvakzine
Streptococcus suis ist ein invasiver Krankheitserreger, der unter anderem Meningitis,
Septikämie und Arthritis verursacht. Der Erreger zeichnet sich durch eine große
Vielfalt an Serotypen aus. Die Entwicklung eines Impfstoffes mit einer Serotyp
übergreifenden Schutzwirkung ist daher ein wichtiges Forschungsziel. Da viele
Oberflächenproteine wie das „Muramidase-released Protein“ (MRP) wichtige
Antigene darstellen, versprach eine Subunitvakzine aus Murein-assoziierten
Proteinen (MAP) eine gute Schutzwirkung. In dieser Arbeit sollte festgestellt werden,
ob eine MAP-Subunitvakzine einen besseren Schutz als eine Ganzzellvakzine
gegenüber Belastungsinfektionen mit einem homologen und einem heterologen
S. suis-Stamm erzielt. Die heterologen Belastungsinfektionen wurden mit einem
MRP*SLY+ Serotyp-9-Stamm durchgeführt, da dieser Pathotyp in Europa wie auch
der homologe MRP+ EF+ SLY+ Serotyp 2 eine große Bedeutung besitzt.
Im ersten Teil der Arbeit erfolgte die Etablierung eines Infektionsmodels für den
MRP*SLY+ Serotyp-9-Stamm A3286/94. Klinische Erkrankungen konnten im
Gegensatz zu dem hochvirulenten Serotyp-2-Stamm 10 nicht durch eine intranasale
sondern, nur durch eine intravenöse Infektion hervorgerufen werden. Daher wurden
die folgenden homologen Belastungsinfektionen mit Stamm 10 intranasal und die
heterologen mit Stamm A3286/94 intravenös durchgeführt.
Im zweiten Teil wurden drei Immunisierungsversuche mit jeweils drei Gruppen
durchgeführt. Die Tiere erhielten in allen Versuchen jeweils zwei Immunisierungen im
Alter von vier und sechs Wochen mit Antigenen des MRP+ EF+ SLY+
Serotyp-2-Stammes 10 (1.Gruppe: Ganzzellvakzine; 2. Gruppe: MAP-
Subunitvakzine). Als Negativkontrolle wurde in der dritten Gruppe ein Placebo
appliziert. Die beiden S. suis-Immunisierungsversuche mit homologer
Belastungsinfektion unterschieden sich nur in der Wahl des Adjuvans. Mit
Aluminiumhydroxid als Adjuvans konnte weder durch die Applikation der Ganzzell-
noch der MAP-Subunitvakzine ein Schutz gegen die Belastungsinfektion mit Stamm
10 induziert werden. Im Gegensatz dazu erzielte die Ganzzellvakzine im zweiten
Zusammenfassung
86
Versuch unter Einsatz einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®) einen signifikanten
Schutz bezogen auf die Morbidität und Mortalität in Folge der homologen
Belastungsinfektion. Die mit MAP immunisierte Gruppe zeigte auch bei Einsatz
dieser Öl-in-Wasser Emulsion nur geringfügige Unterschiede zur Placebogruppe.
Diese klinischen Beobachtungen standen im Einklang mit einem blind
durchgeführten pathohistologischen Screening der fibrinös-eitrigen Entzündungen in
sieben unterschiedlichen inneren Organen. So manifestierte sich die protektive
Wirkung der Ganzzellvakzine in einem sehr niedrigen Pathoscore der
entsprechenden Gruppe. Der Pathoscore der Subunitvakzinegruppe lag nur leicht
unter dem der Kontrollgruppe. Mittel- und hochgradige fibrinös-eitrige Veränderungen
waren in der Mehrzahl der Fälle mit dem kulturellen Nachweis des homologen
Belastungsstammes assoziiert. Im zweiten Versuch konnte bei vier von acht Tieren
der Placebogruppe der hochvirulente homologe Serotyp-2-Stamm in mehr als drei
inneren Lokalisationen nachgewiesen werden. In der Ganzzellvakzinegruppe des
zweiten Versuches lag dieses Merkmal einer generalisierten bakteriellen Erkrankung
bei keinem der Tiere vor.
Diese Arbeit lieferte erstmalig Hinweise, dass eine Serotyp-2-Ganzzellvakzine auch
einen schwächeren partiellen Schutz gegenüber einer heterologen intravenösen
Belastungsinfektion mit einem Serotyp-9-Stamm vermitteln kann. Hierfür sprachen
geringe Unterschiede in Mortalität und Morbidität sowie sehr deutliche Unterschiede
bei den pathohistologischen Befunden im Vergleich zur Placebogruppe. Die
MAP-Subunitvakzine zeigte auch in Bezug auf die heterologe Belastungsinfektion
keine Schutzwirkung.
Im dritten Teil wurden durch die Etablierung unterschiedlicher ELISAs zur
Bestimmung von S. suis spezifischen Antikörpern die Voraussetzungen geschaffen,
die Gruppen auf Serokonversion vergleichend zu untersuchen. In allen drei
Immunisierungsversuchen konnten Serokonversionen gegen MRP und MAP in der
Ganzzell- und MAP-Subunitvakzinegruppe nachgewiesen werden. Im ersten Versuch
mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans waren die Antikörpertiter nach der
Immunisierung deutlich niedriger als in den beiden Versuche mit der Öl-in-Wasser
Emulsion Emulsigen® . Die Applikation der Ganzzellvakzine führte sowohl in Bezug
auf MRP als auch MAP im Durchschnitt zu höheren Antikörpertitern als die
Applikation der MAP-Subunitvakzine, obwohl diese viel größere Mengen dieser
Proteine beinhaltete. Weder die Gesamt-IgG Antikörpertiter gegen MAP noch gegen
Zusammenfassung
87
MRP erwiesen sich aber als zuverlässige prognostische Indikatoren für einen Schutz
vor einer Erkrankung bzw. vor einem Verendeten in Folge einer experimentelllen
S. suis-Infektion.
Summary
88
7 Summary
Katharina Benneke: Comparative investigations of the protection provided by a Streptococcus suis bacterin and a subunit vaccine
Streptococcus suis is an invasive pathogen causing mainly meningitis, septicaemia
and arthritis in young pigs. This pathogen displays a large variety of serotypes. The
development of a vaccine which provides effective protection against different
serotypes remains an important unsolved problem in S. suis research. Many surface
proteins, such as the ”muramidase-released protein“ (MRP), are bound to murein
and constitute important antigens. In this study a subunit vaccine made up of murein-
associated proteins (MAP) was investigated as a vaccine candidate. The objective of
this study was to compare a MAP subunit vaccine and a bacterin in homologous and
heterologous challenge experiments. The heterologous challenge was performed
with an MRP* SLY+ serotype 9 strain, as this pathotype, like the homologous
MRP+EF+SLY+ serotype 2, causes substantial economic losses in Europe.
Firstly, an infection model for the MRP*SLY+ serotype 9 strain A3286/94 was
established. In contrast to the highly virulent S. suis serotype 2 strain 10, disease
with clinical manifestation could not be induced by intranasal application of A3286/94,
but by intravenous application. Therefore, the following homologous challenges with
strain 10 were performed intranasally, and the heterologous challenges with strain
A3286/94 intravenously.
Secondly, three immunisation experiments were conducted with three groups each.
In all experiments, the animals received two immunisations with antigens of the
MRP+ EF+ SLY+ serotype 2 strain 10 at the ages of 4 and 6 weeks, respectively. (1st
group: bacterin; 2nd group: MAP-subunit vaccine). The third group received a placebo
as a negative control. The only difference in the two S. suis immunization
experiments with homologous exposure was the choice of adjuvant. It was neither
possible with the bacterin nor with the MAP-subunit vaccine to induce protection
against strain 10 with aluminium hydroxide as adjuvant. In contrast, a significant
protection concerning morbidity and mortality after homologous infection was
achieved through bacterin immunisation in the second experiment with an oil-in-water
emulsion (Emulsigen®) as adjuvant. However, the group immunized with MAP in the
Summary
89
oil-in-water emulsion showed only very little difference to the placebo group. These
clinical observations were in agreement with the results of a blind histological
screening of fibrinosuppurative inflammations in seven different internal organs. The
protective effect of the bacterin in the oil-in-water emulsion corresponded to a low
pathological score of the respective group. The pathological score of the respective
MAP-subunit group was only slightly below the control group. In the majority of
cases, moderate and severe fibrinosuppurative inflammations were associated with
detection of the homologous challenge strain by culture. In the second experiment
the highly virulent serotype 2 strain was isolated from more than three internal
localisations in four out of eight animals in the placebo group. This characteristic
feature of a generalised bacterial infection was not found in any of the animals
immunised with the bacterin in oil-in-water emulsion.
This study suggested for the first time that a serotype 2 bacterin might also provide
partial protection against a heterologous intravenous exposure to a serotype 9 strain.
This was supported both by the slight differences in morbidity and mortality and the
very clear differences in the histological findings in comparison to the placebo group.
The MAP subunit vaccine did not provide any protection against heterologous
challenge.
In the third part, ELISAs were established to determine antibody titres specific for
S. suis. This allowed investigation of seroconversion in the different immunisation
groups. Seroconversion against MRP and MAP was demonstrated in the bacterin
and MAP subunit vaccine groups of all three experiments. In the first experiment with
aluminium hydroxide as adjuvant, the antibody titres after immunisation were much
lower than in the two experiments with the oil-in-water emulsion Emulsigen®. The
application of the bacterin led to higher average antibody titres against MRP and also
MAP than application of the MAP subunit vaccine, although the latter contained much
higher amounts of these proteins. However, neither the IgG antibody titre against
MAP nor that against MRP were reliable prognostic indicators of protection against
disease or death caused by experimental infection with S. suis.
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Anhang
105
9 Anhang
Tabelle 12: Pathohistologische Diagnosen und Nachweise der Belastungstämme von allen Tieren im Überblick
Anhang
106
Anhang
107
Anhang
108
Anhang
109
Anhang
110
Anhang
111
Anhang
112
Anhang
113
* fibrinöse und/oder eitrige Entzündungen
** (+) = geringgradiger,
(++) = mittelgradiger;
(+++) = hochgradiger Keimgehalt α-hämolysierender Streptokokken
Anhang
114
Abbildung 13: Tier 119 mit hgr. diffuse fibrinös-eitrige Meningitis nach intranasaler S. suis Stamm 10 Infektion. HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.
Abbildung 14: Tier 97 mit hgr. multifokaler fibrinös-eitriger Synovialitis nach intravenöser Infektion mit S. suis A3286/94 (Serotyp 9). HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.
Anhang
115
Abbildung 15: Tier 148 mit hgr. diffuser fibrinös-eitriger Pleuritis nach intranasaler S. suis Infektion mit Stamm 10. HE-Färbung. Vergrößerung 20 x.
Abbildung 16: Tier 116 mit mgr. multifokaler fibrinöser Ventrikulitis (F= Fibrin) einschließlich Plexus Choroiditis (CP). HE-Färbung. Vergößerung 40 x.
Anhang
116
9.1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Mortalität bei Schweinen, die nach einer zweimaligen
Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine
(n=8) aus Murein-assoziierten Proteinen oder einem Placebo
(Kontrollgruppe, n=8) intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+
epf+ sly+ cps2) infiziert wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid.
(Kaplan-Meyer Diagramm)..............................................................................64
Abbildung 2: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit
einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8)aus Murein-
assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8)
intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert
wurden. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxid. (Kaplan-Meyer
Diagramm) ......................................................................................................64
Abbildung 3: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit
einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-
assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe, n=8)
intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert
wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®).
(Kaplan-Meyer Diagramm)..............................................................................65
Abbildung 4: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit
einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-
assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8)
intranasal mit dem homologen Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) infiziert
wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®).
(Kaplan-Meyer Diagramm)..............................................................................65
Abbildung 5: Mortalität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit
einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine(n=8) aus Murein-
assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8)
intravenös mit dem heterologen Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9)
infiziert wurden. Als Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion
(Emulsigen®).(Kaplan-Meyer Diagramm) ........................................................66
Abbildung 6: Morbidität bei Schweinen, die nach zweimaliger Immunisierung mit
einer Ganzzellvakzine (n=7), einer Subunitvakzine (n=8) aus Murein-
Anhang
117
assoziierten Proteinen oder einem Placebo (Kontrollgruppe,n=8)
heterolog mit Stamm A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. Als
Adjuvans diente eine Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®). (Kaplan-
Meyer Diagramm) ...........................................................................................66
Abbildung 7: Antikörper gegen MRP (136 kDa Variante), MAP von A3286/94
und EF (110 kDa Variante) vor bzw. 20 Tage nach der intranasalen
Infektion mit dem MRP+ SLY+ Serotyp 9 Stamm A3286/94 (EF negativ).......71
Abbildung 8: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten
Immunisierung (Alter von 3-4 Wochen) sowie 14 Tage nach der 2.
Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 51-57), einer
Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 61-68)
oder einem Placebo (K, Tier 71-78) bei Verwendung von
Aluminiumhydroxid als Adjuvans. (1. Immunisierungsversuch, vor der
homologen Belastungsinfektion). ....................................................................74
Abbildung 9: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten
Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8
Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer
Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90)
oder einem Placebo (K, Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-
Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans. ( 2.
Immunisierungsversuch, vor der homologen Belastungsinfektion). ................75
Abbildung 10: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MRP vor der ersten
Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung (Alter von 7 - 8
Wochen) mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer
Subunitvakzine aus Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212)
oder einem Placebo (K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-
Wasser Emulsion (Emulsigen®) als Adjuvans ( 3.
Immunisierungsversuch, vor der heterologen Belastungsinfektion). ...............75
Abbildung 11: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10
vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung
mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 93-99), einer Subunitvakzine aus
Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 83-90) oder einem Placebo (K,
Tier 41-48) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion (Emulsigen®)
Anhang
118
als Adjuvans (2. Immunisierungsversuch, vor homologer
Belastungsinfektion)........................................................................................76
Abbildung 12: Relative Antikörpertiter (Gesamt IgG) gegen MAP von Stamm 10
vor der ersten Immunisierung sowie 14 Tage nach der 2. Immunisierung
mit einer Ganzzellvakzine (GZV, Tier 201-206), einer Subunitvakzine aus
Murein-assoziierten Proteinen (MAP, Tier 207-212) oder einem Placebo
(K, Tier 213-218) unter Verwendung einer Öl-in-Wasser Emulsion
(Emulsigen®) als Adjuvans. (3. Immunisierungsversuch, vor heterologer
Belastungsinfektion)........................................................................................76
Abbildung 13: Tier 119 mit hgr. diffuse fibrinös-eitrige Meningitis nach
intranasaler S. suis Stamm 10 Infektion. HE-Färbung. Vergrößerung 20
x. ...................................................................................................................114
Abbildung 14: Tier 97 mit hgr. multifokaler fibrinös-eitriger Synovialitis nach
intravenöser Infektion mit S. suis A3286/94 (Serotyp 9). HE-Färbung.
Vergrößerung 20 x. .......................................................................................114
Abbildung 15: Tier 148 mit hgr. diffuser fibrinös-eitriger Pleuritis nach
intranasaler S. suis Infektion mit Stamm 10. HE-Färbung. Vergrößerung
20 x. ..............................................................................................................115
Abbildung 16: Tier 116 mit mgr. multifokaler fibrinöser Ventrikulitis (F= Fibrin)
einschließlich Plexus Choroiditis (CP). HE-Färbung. Vergößerung 40 x.......115
9.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Vergleiche von Tiermodellen für S. suis- Stamm (nur Wildtyp
Stämme) .........................................................................................................16
Tabelle 2: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit experimenteller
Belastungsinfektion (Auswahl) ........................................................................22
Tabelle 3: Zeitpunkte der Blutentnahmen..................................................................29
Tabelle 4: Übersicht der Infektions- und Immunisierungsversuche mit
Schweinen ......................................................................................................36
Tabelle 5: Virulenz von S. suis-Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) und Stamm
A3286/94 (mrp* sly+ cps9) in experimentellen Infektionen von
Läuferschweinen.............................................................................................48
Anhang
119
Tabelle 6: Fibrinös-eitrige Entzündungen bei mit S. suis-Stamm 10 oder mit
Serotyp-9-Stamm A3286/94 infizierten Läuferschweinen. ..............................51
Tabelle 7: Reisolierung des Belastungsstammes von Läuferschweinen, die mit
S. suis-Stamm 10 oder Stamm A3286/94 infiziert worden sind. .....................53
Tabelle 8: Klinische Befunde bei Schweinen, die nach einer Immunisierung mit
einer Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-
assoziierten Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) homolog mit
Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm A3286/94
(mrp* sly+ cps9) infiziert wurden. ....................................................................67
Tabelle 9: Reisolation des Belastungsstammes von Schweinen, die mit einer
Ganzzellvakzine (GZV), einer Subunitvakzine aus Murein-assoziierten
Proteinen (MAP) oder einem Placebo (K) immunisiert und anschließend
homolog mit Stamm 10 (mrp+ epf+ sly+ cps2) oder heterolog mit Stamm
A3286/94 (mrp* sly+ cps9) infiziert wurden.....................................................68
Tabelle 10: Differenzierung von fibrinös-eitrigen Entzündungen bei Schweinen
nach homologer (Stamm 10) oder heterologer (Stamm A3286/94)
Belastungsinfektion in Immunisierungsexperimenten mit einem
Pathoscore von 1 bis 5 (1: minimal; 2 und 3: geringgradig und fokal; 4
und 5: mittel- oder hochgradig sowie multifokal oder diffus) 1 .........................69
Tabelle 11: Mortalität und Morbidität aller Versuchstiere im Zusammenhang mit
Antikörpertitern gegen MRP bzw. MAP vor der experimentellen
Belastungsinfektion.........................................................................................78
Tabelle 12: Pathohistologische Diagnosen und Nachweise der
Belastungstämme von allen Tieren im Überblick ..........................................105
Danksagung
Mein erster Dank geht an Herrn Prof. Dr. P. Valentin-Weigand und Herrn Prof. Dr. K. H. Waldmann für die Bereitstellung des interessanten Themas, für die Betreuung und bereitwillige Unterstützung. Herrn Dr. C. G. Baums möchte ich herzlich für die Organisation, Planung und Unterstützung bei der Durchführung der Tierversuche, für die Betreuung der Laborarbeit und für die Hilfe bei der Zusammenstellung der Dissertation danken. Danken möchte ich auch Frau Dr. C. Schroeder für die aktive Unterstützung in den Tierversuchen und der Beratung in klinischen Fragen. Für die Bearbeitung der Blutproben möchte ich ganz herzlich Herrn Prof. Dr. Ganter und seiner Arbeitsgruppe, hier insbesondere Frau Großmann, danken. Die Arbeitsgruppe der Abteilung Valentin-Weigand unterstützte mich während der gesamten Dissertation. Vor allem bedanke ich mich bei Frau C. Neis, Herrn PhD M. Fulde, Herrn PhD L. Benga für die tatkräftige Hilfe bei der Durchführung der Sektionen. Einen wichtigen Teil dieses Forschungsprojektes konnte durch die pathohistologischen Untersuchungen der Organproben von Herrn Dr. A. Beineke vom Institut für Pathologie verwirklicht werden. Herrn Fiedler und Herrn Richter danke ich für die problemlosen Tiertransporte zur Tierärztliche Hochschule Hannover. Weiterhin möchte ich Herrn Henstorf für die Bereitstellung von Nährböden danken. Auch Herrn W. Scharnhorst danke ich für die sorgfältige Reinigung und Desinfektion der Stallungen nach den Tierversuchen sowie für die Unterstützung bei den Vorbereitungsarbeiten im Tierstall. Für die Unterstützung und Beratung zur Etablierung des ELISAs danke ich Herrn Dr. T. Rehm. Des Weiteren danke ich Herrn Dr. Fischer aus der IVD GmbH für die Bereitstellung von Elmulsigen® und für die professionelle Beratung zur Herstellung der Ganzzellvakzine. An dieser Stelle möchte ich mich auch bei Herrn Dr. M. Beyerbach vom Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung meiner Daten und bei Herrn J. Merkel für die Hilfestellung zur digitalen Bearbeitung bedanken. Finanziert wurde diese Arbeit von der IDT Biologika GmbH, Dessau-Tornau, auch hierfür herzlichen Dank. Mein besonderer Dank gilt meiner Familie und Philipp, die mich im gesamten Studium tatkräftig unterstützt haben und mir das Erreichen meiner Ziele ermöglichten.