Post on 18-Aug-2019
transcript
Tierärztliche Hochschule Hannover
Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens
zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung
von Rhodococcus equi
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Anne Riesenberg
Steinheim / Westfalen
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Stefan Schwarz Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee
PD Dr. Christiane Werckenthin Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel-sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg
1. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee
PD Dr. Christiane Werckenthin Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel-sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg
2. Gutachter: Jun. Prof. Dr. Diana Meemken, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2016
Ergebnisse dieser Dissertation wurden in international anerkannten
Fachzeitschriften mit Gutachtersystem (peer review) veröffentlicht
oder sind zur Veröffentlichung angenommen:
1. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN, L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ: Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin. J. Antimicrob. Chemother. 2013; 68, 2173-5.
2. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.
STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ: MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin. J. Antimicrob. Chemother. 2014; 69, 1045-9.
3. RIESENBERG, A., H, KASPAR, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, S.
SCHWARZ: Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test. Vet. Microbiol. 2015 Nov 26, doi: 10.1016/j.vetmic.2015.11.029 [Epub ahead of print]
Teilergebnisse dieser Dissertation wurden bei folgenden
Fachtagungen im In- und Ausland in Form einer Posterpräsentation
oder eines Vortrages präsentiert:
1. RIESENBERG, A.*, K. KADLEC, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, D.
KLARMANN, S. SCHWARZ (2012): Development of guidelines for the susceptibility testing of veterinary pathogens. Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 10.–11.8.2012, Germany, Vortrag.
2. RIESENBERG, A., L. KREIENBROCK, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D.
KLARMANN, S. SCHWARZ*, C. WERCKENTHIN (2013): Development of susceptibility testing standards for Rhodococcus equi as a veterinary pathogen. Meeting of the CLSI-Subcommittee on Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST), 10. - 11.01.2013, Tampa, FL, USA, Vortrag.
3. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D. KLARMANN, S.
SCHWARZ, C. WERCKENTHIN (2013): Revised recommendation for susceptibility testing of Rhodococcus equi. 16. Internationales Symposium der World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 05. - 08.06.2013, Berlin, Germany, Poster.
4. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,
L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2013): Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals. 5th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 30.06. - 03.07.2013, Ghent, Belgium, Poster.
5. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,
L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2013): Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals. Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 21. - 24.08.2013, Jena, Germany, Poster.
6. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN,
L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2014): Development of a new protocol for antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi by broth microdilution. Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26. - 28.05.2014, Freising, Germany, Poster.
7. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I. STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, S. SCHWARZ, C. WERCKENTHIN (2014):
Minimum Inhibitory Concentrations of 200 Rhodococcus equi Isolates to 32 Antimicrobial Agents. Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26.–28.05.2014, Freising, Germany, Poster.
8. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.
STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ* (2014): Susceptibility of 200 Rhodococcus equi isolates from North America and Europe to 32 antimicrobial agents. Tagung “Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine (AAVM)”, 16.–19.09.2014, Berlin, Germany, Vortrag.
9. RIESENBERG, A.*, C. WERCKENTHIN, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, H.
KASPAR, L. KREIENBROCK, S. SCHWARZ (2015): Erarbeitung standardisierter Verfahren zur Empfindlichkeitsbestimmung von Rhodococcus equi, Trueperella pyogenes und Arcobacter spp. 34. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe AVID, 09. - 11.09.2015, Bad Staffelstein, Germany, Vortrag.
* Präsentierender Autor
Mr. X. has a sore throat.
He buys some penicillin and gives himself, not enough to kill the
streptococci, but enough to educate them to resist penicillin.
He then infects his wife. Mrs. X gets pneumonia and is treated with penicillin.
As the streptococci are now resistant to penicillin, the treatment fails.
Mrs. X dies.
Sir Alexander Fleming
Nobel Lecture, December 11, 1945
Inhaltsverzeichnis
KAPITEL 1 Einleitung……………………….………………………........................09
KAPITEL 2 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung
mittels Bouillon-Mikrodilution von Rhodococcus equi tierischen
Ursprungs………………………………………………………………. 12
Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin
KAPITEL 3 MHK-Werte von Rhodococcus equi-Isolaten tierischen
Ursprungs für 32 Wirkstoffe.......................................................... 13
MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin
KAPITEL 4 Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine
Laborvergleichsuntersuchung ……….…………........................... 14
Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test
KAPITEL 5 Diskussion……………………………………………………………… 15
5.1 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung ……. 16 5.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi in verschiedenen Studien....... 18
5.3 Genetische Grundlagen der verminderten Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin……………………………………………………………….. 23
5.4 Laborvergleichsuntersuchung.......................................................... 24 5.5 Anerkennung der Methode durch das CLSI………………………….25
KAPITEL 6 Schlußfolgerungen………………………………………………….... 27
KAPITEL 7 Zusammenfassung………………………………………………........ 28
KAPITEL 8 Summary.......................................................................................... 30
KAPITEL 9 Literaturverzeichnis........................................................................ 32
KAPITEL 10 Tabellenverzeichnis........................................................................ 37
Abkürzungsverzeichnis
A. Arcobacter
BAL bronchoalveoläre Spülflüssigkeit
BHI Hirn-Herz-Glucose-Bouillon (engl. Brain Heart Infusion)
bp Basenpaare
CAMHB Kationen-angepasste Mueller Hinton Bouillon (engl. cation-adjusted Mueller Hinton broth)
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
DIN Deutsches Institut für Normung
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid)
E. coli Escherichia coli
EUCAST Europäischer Ausschuss für Antimikrobielle Empfindlichkeitstestung
(engl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
FKS fetales Kälberserum
LHB lysiertes Pferdeblut (engl. laked horse blood)
MHK Minimale Hemmkonzentration
NaCl Natriumchlorid
PCR Polymerase Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction)
R. Rhodococcus
T. Trueperella
spp. Spezies (Pl.)
Vap Virulenz-assoziiertes Protein
Einleitung
9
KAPITEL 1 Einleitung
Bakterielle Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen stellt sowohl in der
Veterinär- als auch in der Humanmedizin ein zunehmendes Problem dar, da sie
mitunter fehlende therapeutische Optionen bei bakteriellen Infekten zur Folge haben
kann. Daher wird das Thema nicht nur in Fachkreisen und Fachzeitschriften, sondern
auch in den allgemeinen Medien thematisiert, indem immer wieder über ein Auftreten
von resistenten Bakterien zum Beispiel in Krankenhäusern berichtet und das Thema
damit in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt wird. Um die Entstehung von
Resistenzen zu vermindern und ihre Ausbreitung einzudämmen, existieren
verschiedene Programme in Tier- und Humanmedizin. Mit den Antibiotika-Leitlinien
ermahnt die Bundestierärztekammer die Tierärzteschaft, antimikrobielle Wirkstoffe
sorgsam und zielgerichtet einzusetzen und den anzuwendenden Wirkstoff nebst
anderen Faktoren aufgrund der Resistenzlage des ursächlichen Erregers
auszuwählen (BTK 2015). Zur Ermittlung der Resistenzlage ist eine antimikrobielle
Empfindlichkeitsprüfung unumgänglich. Während es für viele bakterielle Tier- und
Humanpathogene bereits standardisierte Verfahren zur Empfindlichkeitsprüfung gibt
(CLSI 2013), ist dies für andere bakterielle Infektionserreger von Tieren bisher noch
nicht der Fall. Zur letzteren Gruppe gehört auch Rhodococcus (R.) equi.
Die Gattung Rhodococcus gehört zur Familie der Nocardiaceae innerhalb der
Unterordnung Corynebacterineae der Ordnung Actinomycetales
(http://www.bacterio.net/). Sie umfasst derzeit 49 Spezies (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/taxonomy), von denen die Mehrheit aus Umweltproben isoliert wurde. Während
für die meisten Spezies der Gattung Rhodococcus keine pathogene Bedeutung
bekannt ist, konnte ein schwedischer Forscher R. equi 1923 als ursächlichen Erreger
einer Bronchopneumonie beim Fohlen identifizieren (MAGNUSSON 1923).
Rhodococcus equi kann auch bei anderen Säugetieren wie Schweinen,
Wiederkäuern, Hunden und Katzen purulente Erkrankungen verursachen (CARMAN
u. HODGES 1987, PRESCOTT 1991, TAKAI et al. 1986) und als zoonotischer
Erreger sogar zu Infektionen immunsupprimierter Menschen führen (PRESCOTT u.
HOFFMAN 1993, KEDLAYA et al. 2001). Die Hauptzieltierart von R. equi ist
allerdings das Pferd, bei dem Vertreter dieser Spezies in Fohlen purulente
Bronchopneumonien mit teils letalem Ausgang hervorrufen können. Als Grund für die
überwiegend bei Fohlen auftretenden Infektionen wird das noch unreife
Einleitung
10
Immunsystem angesehen (YAGER 1987, TAKAI et al. 1995). Pferde ab einem Alter
von sechs Monaten erkranken nicht mehr an Rhodokokkose (WILSON 1955, YAGER
1987), können jedoch Träger des Erregers sein und somit zu seiner Ausbreitung
beitragen. Da R. equi Teil der physiologischen Darmflora beim Pferd sein kann
(PRESCOTT 1991) und der Erreger zudem eine hohe Tenazität in der Umwelt
aufweist (PRESCOTT u. HOFFMANN 1993), ist R. equi nur schwer aus Beständen
zu eliminieren und in einigen Zuchtbetrieben als endemisch anzusehen. Die
Symptomatik bei Infektionen mit R. equi reicht von subklinischen Infekten über milde
respiratorische Symptome bis hin zu schwerwiegenden fiebrigen Infekten mit teils
letalem Ausgang (VENNER 2009). Die Gruppe der Virulenz-assoziierten Proteine
(Vap), im Besonderen das VapA-Protein, spielt eine übergeordnete Rolle für die
Pathogenität des Erregers (GIGUÈRE et al. 1999). Da die Symptomatik insgesamt
wenig spezifisch ist (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993), kann eine sichere Diagnose
am lebenden Tier nur durch Anzucht des Erregers aus bronchoalveolärer
Spülflüssigkeit (BAL) erfolgen (MEYER-HAMME 2004). Die Anzucht von R. equi
erfolgt auf bluthaltigen Medien in aerober Atmosphäre, wobei der Erreger nicht
hämolysierende, mukoide, grau-weiße Kolonien bildet. Mikroskopisch stellt sich R.
equi als grampositives, säurefestes, pleomorphes Stäbchen dar (WILSON 1955,
WOOLCOCK u. MUTIMER 1980). Während subklinische Infektionen mit R. equi teils
spontan ausheilen (VENNER 2009), ist bei einer klinischen Manifestation der
Rhodokokkose eine antimikrobielle Therapie notwendig (SWEENEY et al. 1987). Sie
erfolgt üblicherweise mit einer Kombination aus Rifampicin, welches zur Klasse der
Ansamycine gehört, und einem Wirkstoff aus der Gruppe der Makrolide, wie
Erythromycin, Clarithromycin oder Azithromycin (VENNER et al. 2013, GIGUÈRE et
al. 2004). Zwar ist keine dieser Substanzen in Deutschland zur Anwendung beim
Pferd zugelassen (www.vetidata.de), im Falle eines Therapienotstandes dürfen sie
allerdings umgewidmet und bei nicht Lebensmittel liefernden Tieren eingesetzt
werden.
Eine Monotherapie mit Rifampicin ist nicht empfehlenswert, da es im rpoB-Gen,
welches für die β-Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert, rasch zu Mutationen
kommt, die zu einer verminderten Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber
Rifampicin führen können.
Um eine effiziente Therapie einleiten zu können, sollte vor Therapiebeginn die
antimikrobielle Empfindlichkeit des ursächlich am Krankheitsgeschehen beteiligten
Einleitung
11
Erregers bestimmt werden. Die Bestimmung und Beurteilung der antimikrobiellen
Empfindlichkeit von R. equi ist bisher jedoch nicht vereinheitlicht. Das Dokument
M24-A2 des US-amerikanischen Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
enthält einige Informationen zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R.
equi-Isolaten von Menschen. Dieses Dokument definiert die Inokulumdichte sowie
das zu verwendende Medium und die Inkubationstemperatur (CLSI 2011). Die Dauer
der Inkubation wird mit 24-48 h, bei schlechtem Wachstum auch bis zu 5 Tagen,
angegeben. Zudem haben einige Arbeitsgruppen über die letzten Jahre Studien zur
Resistenzlage von R. equi veröffentlicht (BARTON u. FULTON 1980, BOWERSOCK
et al. 2000, BOYEN et al. 2011, BUCKLEY et al. 2007, BURTON et al. 2013,
CARLSON et al. 2010, HOLLBERG 2011, JACKS et al. 2003, NIWA et al. 2005,
NORDMANN u. RONCO 1992, MCNEILL u. BROWN 1992, PRESCOTT 1981,
ROTHAAAR 2006, WOOLCOCK u. MUTIMER 1980). Hierbei wurden diverse Agar-
und Bouillon-basierte Methoden verwandt, um den Erreger auf seine Empfindlichkeit
gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen zu testen. Die Methoden unterschieden sich
hinsichtlich der Inkubationsdauer und -temperatur, sowie des verwendeten Mediums
und seiner Zusätze. Somit sind die Ergebnisse dieser Studien nicht miteinander
vergleichbar.
Ziele der hier vorliegenden Studie waren:
(1) ein für die veterinärmedizinische Routinediagnostik universell einsetzbares und
gut ablesbares Testsystem auf der Grundlage der Bouillon-Mikrodilution zu
entwickeln,
(2) dieses Testsystem an einer größeren Anzahl epidemiologisch unverwandter
R. equi-Feldisolate zu überprüfen,
(3) dieses Testsystem in einer deutschlandweiten Laborvergleichsuntersuchung
auf seine Praxistauglichkeit in verschiedenen Laboratorien zu untersuchen und
(4) letztendlich die Anerkennung der neuen Methode seitens CLSI zu erlangen.
MHK von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate tierischen Ursprungs
12
KAPITEL 2
Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeits-
prüfung mittels Bouillon-Mikrodilution
von Rhodococcus equi tierischen Ursprungs
Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for
Rhodococcus equi of animal origin
Anne Riesenberg, Andrea T. Feßler, Cornelia Frömke, Kristina Kadlec, Dieter
Klarmann, Lothar Kreienbrock, Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz
Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2013) 68: 2173-2175
doi: 10.1093/jac/dkt134.
MHK von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate tierischen Ursprungs
13
KAPITEL 3
MHKs von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate
tierischen Ursprungs
MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin
Anne Riesenberg, Andrea T. Feßler, Erdal Erol, Ellen Prenger-Berninghoff, Ivonne
Stamm, Reinhard Böse, Anton Heusinger, Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz
Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2014) 69: 1045-1049
doi: 10.1093/jac/dkt460
Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine Laborvergleichsuntersuchung
14
KAPITEL 4
Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine
Laborvergleichsuntersuchung
Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test.
Anne Riesenberg, Heike Kaspar, Andrea T. Feßler,
Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz
Veterinary Microbiology (2015) doi: 10.1016/j.vetmic.2015.11.029 [Epub ahead of print]
Diskussion
15
KAPITEL 5 Diskussion
Um bakterielle Infektionen sinnvoll zu therapieren ist der Einsatz von antimikrobiellen
Wirkstoffen das Mittel der Wahl (SINGER et al. 2003). Antimikrobielle Wirkstoffe sind
unverzichtbar für die Versorgung veterinär- und humanmedizinischer Patienten. Da
die Wirkstoffe häufig systemisch eingesetzt werden, wirken sie jedoch nicht
ausschließlich in dem von der Erkrankung betroffenen Organsystem, sondern im
gesamten Organismus. Daher unterliegen nahezu alle Bakterien, die den
behandelten Patienten besiedeln, einem Selektionsdruck, der die Entstehung und
Ausbreitung von Resistenzen fördern kann (MEYER et al. 2013). Um den
Selektionsdruck möglichst niedrig zu halten, muss eine zielgerichtete Antibiose
erfolgen (BTK 2015). Zu diesem Zweck wird in vielen Fällen eine mikrobiologische
Untersuchung inklusive eines Resistenztestes des Erregers vor Therapiebeginn
notwendig sein. Allerdings müssen bei der Auswahl des antimikrobiellen Wirkstoffes
auch andere Parameter, wie z.B. erreichbare Gewebespiegel oder der Immunstatus
des Patienten, berücksichtigt werden.
Die verfügbaren Methoden zur antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung
können grob in Diffusions- und Dilutionsverfahren eingeteilt werden. Beim
Agardiffusionstest wird der zu testende Erreger in definierter Dichte auf eine
Agarplatte aufgebracht. Anschließend werden Testplättchen, die mit einer definierten
Menge eines antimikrobiellen Wirkstoffs beschickt sind, aufgelegt. Die so
präparierten Agarplatten werden bebrütet und anschließend die Hemmhöfe um die
Testplättchen ausgemessen. Über den Vergleich mit klinischen Grenzwerten wird der
Erreger dann als sensibel, intermediär oder resistent gegenüber dem jeweiligen
Wirkstoff eingestuft. Da hierbei verschiedene antimikrobielle Wirkstoffe auf einer
Agarplatte getestet werden können, wird der Agardiffusionstest in der
Routinediagnostik nach wie vor eingesetzt. Allerdings erlaubt diese Methode keine
quantitative Aussage und die ermittelten Hemmhofdurchmesser können auch nicht in
Minimale Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) „umgerechnet“ werden (SCHWARZ et
al. 2010).
In der vorliegenden Studie wurden Dilutionsverfahren (Bouillon-Mikrodilution
und -Makrodilution) zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi
verwendet. In diesen Verfahren wird die Wirksamkeit verschiedener
Diskussion
16
Konzentrationsstufen der Wirkstoffe auf den Erreger überprüft. Das Ergebnis der
Testung wird als MHK-Wert angegeben. Der MHK-Wert ist die niedrigste
Wirkstoffkonzentration in einer zweifachen Verdünnungsreihe (gemessen in mg/L),
bei der kein sichtbares Erregerwachstum mehr zu verzeichnen ist (CLSI 2013). Im
Gegensatz zur Agardiffusion liefern Reihenverdünnungstests wie Bouillon-
Mikrodilution und Bouillon-Makrodilution quantative Ergebnisse, die es besser
ermöglichen, eine Veränderung der antimikrobiellen Empfindlichkeit zu beurteilen.
Die Einstufung der Ergebnisse in die Kategorien sensibel, intermediär und resistent
erfolgt für diese Methoden ebenfalls über den Vergleich mit klinischen Grenzwerten,
die für jeden antimikrobiellen Wirkstoff und Erreger tierart- und indikationsspezifisch
definiert werden (CLSI 2015).
5.1 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung
Um ein standardisiertes Verfahren zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von
R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution zu entwickeln, wurden zunächst Methoden aus
verschiedenen Studien miteinander verglichen. Eine Literaturrecherche ergab, dass
sich bisher nur wenige Autoren mit der Bouillon-Mikrodilution zur antimikrobiellen
Empfindlichkeitsprüfung von R. equi befasst haben. Die hierfür verwendeten
Verfahren unterschieden sich hinsichtlich des verwendeten Mediums, der
Inkubationstemperatur sowie der Inkubationsdauer (KAPITEL 2,Tabelle 1).
Diskussion
17
Tabelle 1: Übersicht über in der Literatur beschriebene Verfahren zur
Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution
Referenz Medium Temperatur Bebrütungs-
dauer
CARLSON et al. 2010 CAMHB 35 °C 24-48 h
HOLLBERG 2011 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h
BACH 2011 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h
ROTHAAR 2006 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h
BOWERSOCK et al. 2000 CAMHB 35 °C „overnight“
JACKS et al. 2003 CAMHB 37 °C 18-24 h
MCNEIL u. BROWN 1992 CAMHB 35 °C 24-48 h
PRESCOTT 1981 CAMHB 35 °C 36 h
FEY u. SCHMID 1995 Iso-Sensitest Bouillon 37 °C 24 h
GIACOMETTI et al. 1999 CAMHB 37 °C 18 h
SPARKS et al. 1988 Fildes-enriched Mueller-Hinton Bouillon + 2 % (v/v) LHB
37 °C 18 h
Da die meisten Autoren Verfahren auf der Basis von Kationen-angepasster
Mueller Hinton Bouillon (engl. Cation-adjusted Mueller Hinton Broth, CAMHB) mit
oder ohne Zusatz von lysiertem Pferdeblut (engl. laked horse blood, LHB) verwendet
haben, wurden diese beiden Medien in unsere Vergleichsstudie einbezogen. Die
vom CLSI für die Testung von humanen R. equi Isolaten vorgeschriebene Methode
sieht die Verwendung von CAMHB ohne jedwede Medienzusätze vor (CLSI 2011).
Als Inkubationstemperatur wurde 35 ± 2 °C gewählt, da diese Temperatur in den
meisten in der Literatur beschriebenen Studien verwendet wurde und vom CLSI für
die Empfindlichkeitsprüfung verschiedener Erreger, inklusive R. equi von Menschen,
empfohlen wird (CLSI 2013). Die Ablesung der MHK-Werte erfolgte sowohl nach 24
als auch nach 48 Stunden, um einen möglichen Einfluß der Inkubationszeit auf die
Ergebnisse bewerten zu können.
Diskussion
18
Die Empfindlichkeitsprüfung in CAMHB mit und ohne 2 % LHB (v/v) bei einer
aeroben Inkubation bei 35 ± 2 °C und Ablesung der MHK-Werte nach 24 h und 48 h
wurde an sechs R. equi Feldisolaten sowie dem R. equi-Typstamm ATCC®25729
jeweils sechsmal durchgeführt und die Ergebnisse statistisch ausgewertet (KAPITEL
2). Die Chance, exakt gleiche MHK-Werte zu erzielen, war am höchsten für CAMHB
+ 2 % (v/v) LHB mit Ablesung der MHK-Werte nach 24 h (0,648), gefolgt von CAMHB
ohne Supplement mit Ablesung der MHK-Werte nach 48 h (0,463), CAMHB ohne
Supplement mit Ablesung der MHK-Werte nach 24 h (0,427) und CAMHB + 2 % (v/v)
LHB mit einer Ablesung der MHK-Werte nach 48 h (0,286).
Die statistische Auswertung zeigte demnach, dass die Testung von R. equi
mittels CAMHB + 2 % (v/v) LHB bei einer aeroben Inkubation bei 35 ± 2 °C und einer
Ablesung der MHK-Werte nach 24 h die zuverlässigste Methode zur antimikrobiellen
Empfindlichkeitsprüfung von R. equi ist (KAPITEL 2).
Neben den statistischen Ergebnissen soll bemerkt werden, dass die Ermittlung
von MHK-Werten mit beiden Medien sowohl nach 24 h als auch nach 48 h möglich
war, wobei aber der Einsatz von LHB zu einem deutlicheren Wachstum und somit zu
einer besseren Ablesbarkeit führte.
5.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi in verschiedenen Studien
Die im ersten Schritt etablierte Methode wurde im Anschluss an einem
Stammkollektiv von 200 R. equi Feldisolaten verschiedenen Ursprungs auf ihre
allgemeine Anwendbarkeit getestet (KAPITEL 3). Dabei wurden 29 Wirkstoffe aus
verschiedenen Klassen mittels Bouillon-Mikrodilution getestet. Da Rifampicin sowie
die beiden unter Umständen ebenfalls therapeutisch relevanten Makrolide
Azithromycin und Clarithromycin nicht in den verfügbaren Mikrotiterplatten enthalten
waren, wurden diese drei Wirkstoffe im Bouillon-Makrodilutionsverfahren getestet,
wobei Medium und Inkubationsbedingungen analog zum vorab genannten Protokoll
waren. Die Testung der Feldisolate verlief sowohl in der Bouillon-Mikrodilution als
auch in der Bouillon-Makrodilution problemlos. Für die meisten der Wirkstoffe waren
die MHK-Werte normalverteilt. Für Rifampicin wurden sechs Isolate mit erhöhtem
MHK-Wert ermittelt, sowie ein weiteres Isolat mit erhöhten MHK-Werten für
Azithromycin, Clarithromycin und Erythromycin.
Diskussion
19
Im Folgenden soll trotz der methodischen Abweichungen zwischen den
verschiedenen in der Literatur beschriebenen Studien eine vergleichende Darstellung
der Ergebnisse mit denen unserer Studie erfolgen.
Tabelle 2: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegenüber Rifampicin und
verschiedenen Makrolid-Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien
Wirkstoff
KA
PIT
EL 3
JAC
KS
et a
l. 2
003
CA
RL
SO
N
et a
l. 2
010
BO
WE
RS
OC
K
et a
l. 2
000
PR
ES
CO
TT
1981
HO
LLB
ER
G
2011
BA
CH
2011
RO
TH
AA
R
2006
Rifampicin MHK50 0,06 <0,5 <0,5
0,06 0,06 0,06
MHK90 0,125 <0,5 <0,5 0,06 0,06 0,06
Azithromycin MHK50 1 0,5 1
0,5 8 2
MHK90 1 1 2 4 8 4
Clarithromycin MHK50 0,06 <0,06 <0,06
<0,03 0,12 0,06
MHK90 0,06 0,12 0,12 0,06 0,12 0,06
Erythromycin MHK50 0,5 <0,5 0,5
<0,25 0,12 1 0,25
MHK90 0,5 <0,25 0,5 <0,25 0,5 1 0,5
Tulathromycin MHK50 64
>64
64 >1024
MHK90 64 >64 >128 >1024
Tilmicosin MHK50 32
32 16
MHK90 32 64 32
Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51 110 21 127
Bei den therapeutisch wirksamen Substanzen aus der Gruppe
Makrolidantibiotika und dem Ansamycin-Wirkstoff Rifampicin ergab der Vergleich mit
anderen Studien relativ ähnliche MHK50- und MHK90-Werte (Tabelle 2). Allerdings
konnten BACH (2011) und ROTHAAR (2006) für Azithromycin höhere Werte für
MHK50 und MHK90 feststellen. BACH (2011) konnte auch für Clarithromycin und
Erythromycin etwas höhere MHK-Werte feststellen als die anderen Studien. Für
Tulathromycin ist die Abweichung der von BACH (2011) übermittelten MHK50- und
MHK90-Werte deutlich. Diese Ergebnisse könnten auf eine verminderte
Makrolidempfindlichkeit in der bei BACH (2011) und ROTHAAR (2006) untersuchten
Populationen zurückzuführen sein. Die entsprechenden Isolate aus diesen Studien
stammten allesamt von unterschiedlichen Tieren eines Bestandes mit endemischer
Rhodokokkose, in dem auch Makrolide therapeutisch eingesetzt wurden. Für
Erythromycin sind die von JACKS et al. (2003) und PRESCOTT (1981) publizierten
Diskussion
20
MHK50- und MHK90-Werte geringfügig niedriger als die der anderen Studien. Der
Grund für die Abweichungen lässt sich nicht mit Sicherheit definieren. In Betracht
kommt hier neben einer empfindlicheren Testpopulation auch die methodische
Abweichung bei der Empfindlichkeitsprüfung; in beiden Studien wurde CAMHB ohne
LHB als Supplement verwendet.
CARLSON et al. (2010) berichteten für Clarithromycin von vier Isolaten mit
erhöhten MHK-Werten (0,5 - 4 mg/L); auch ROTHAAR (2006) konnte ein Isolat mit
erhöhtem MHK-Wert (0,5 mg/L) gegenüber Clarithromycin identifizieren. Des
Weiteren berichteten CARLSON et al. (2010) von Isolaten mit erhöhten MHK-Werten
gegenüber Erythromycin, beschrieben jedoch keine Resistenz gegenüber mehreren
Wirkstoffen. In unserer Studie (KAPITEL 3) wies lediglich ein Isolat moderat erhöhte
MHK-Werte (jeweils 1 – 2 MHK-Stufen über den Werten der normalverteilten
Population) gegen Clarithromycin, Azithromycin und Erythromycin auf.
Auch eine verminderte Empfindlichkeit von R. equi gegenüber Rifampicin ist
bereits beschrieben worden. BUCKLEY et al. (2007) und BOYEN et al. (2011)
konnten mittels E-Test auf Mueller Hinton Agar mit Blutzusatz für ihre
Stammkollektive MHK-Werte gegenüber Rifampicin ermitteln. BUCKLEY et al. (2007)
beobachteten über einen 10-Jahres-Zeitraum ein Anstieg der MHK-Werte von R.
equi gegenüber Rifampicin um zwei MHK-Stufen. BOYEN et al. (2011) haben bei
zwei Isolaten eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin (MHK 1 mg/L
bzw. 8 mg/L) beschrieben. Auch im Rahmen unserer Studie wurden sechs Isolate mit
verminderter Rifampicin-Empfindlichkeit nachgewiesen, deren MHK-Werte entweder
4-8 mg/L (n=3) oder 64-256 mg/L (n=3) aufwiesen (KAPITEL 3).
Für die β-Laktam-Antibiotika zeigen sich einige Abweichungen bezüglich der
von den verschiedenen Autoren publizierten MHK50- und MHK90-Werte (Tabelle 3).
Für Ampicillin lagen die von JACKS et al. (2003) übermittelten Werte niedriger als in
der Studie von PRESCOTT (1981) und auch niedriger al in unserer Studie (KAPITEL
3). Auch bei Ceftiofur und Penicillin haben JACKS et al. (2003) niedrigere MHK50-
und MHK90-Werte ermittelt als die anderen Studien. CARLSON et al. (2010) konnten
hingegen für Penicillin höhere MHK-Werte feststellen als die anderen Autoren. Bei
BOWERSOCK et al. (2000) zeigte sich eine recht große Differenz zwischen den
MHK50- und MHK90-Werten für Ceftiofur. Während dre MHK50-Wert sich mit dem von
JACKS et al. (2003) ermittelten Wert deckt, ist der MHK90-Wert eher vergleichbar mit
den von CARLSON et al. (2000) und in unserer Studie ermittelten Werten (Kapitel 3).
Diskussion
21
Diese Unterschiede könnten durch die unterschiedlichen Testpopulationen bedingt
sein, allerdings könnte ihr Ursprung auch in den methodischen Unterschieden
zwischen den unterschiedlichen Studien liegen.
Tabelle 3: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegen verschiedene β -Laktam-
Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien
Wirkstoff
KA
PIT
EL 3
JAC
KS
et a
l. 2
003
CA
RL
SO
N
et a
l. 2
010
BO
WE
RS
OC
K
et a
l. 2
000
PR
ES
CO
TT
1981
Ampicillin MHK50 4 1
8
MHK90 8 4 8
Ceftiofur MHK50 8 <0,5 4 0,5
MHK90 16 1 >8 8
Penicillin MHK50 4 0,25 16
4
MHK90 4 1 >16 8
Vancomycin MHK50 0,5
0,5
MHK90 0,5 0,5
Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51
Bei den Wirkstoffen anderer Klassen zeigen sich abgesehen von der
Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol nur geringe Unterschiede
zwischen den verschiedenen Studien (Tabelle 4). Für Clindamycin ist der von JACKS
et al. (2003) übermittelte MHK50-Wert ein wenig niedriger als in unserer Studie
(Kapitel 3), zum MHK90-Wert lässt sich kaum eine Aussage treffen, da JACKS et al.
(2003) nur bis zu einer Konzentration von 2 mg/L getestet haben. Für Tetrazyklin
sind die MHK50- und MHK90-Werte, die PRESCOTT (1981) angibt, eine Stufe
niedriger als bei den anderen Studien, die untereinander eine sehr gute
Übereinstimmung zeigen. Bei Enrofloxacin schwanken die ermittelten MHK50- und
MHK90-Werte geringfügig; CARLSON et al. (2010) konnten etwas höhere Werte
feststellen als PRESCOTT (1981) und unsere Studie (KAPITEL 3), während der
MHK50-Wert, den JACKS et al. (2003) feststellen konnten, etwas niedriger ist. Auch
bei Gentamicin zeigen sich nur geringe Abweichungen. Bei der Kombination aus
Trimethoprim und Sulfamethoxazol waren die Abweichungen hingegen deutlich. Die
MHK50- und MHK90-Werte, die CARLSON et al. (2010) für diese Wirkstoffkombination
ermittelten, liegen höher als die der anderen Studien. Einzig ROTHAAR (2006)
Diskussion
22
konnte vergleichbare für MHK50- und MHK90-Werte feststellen. Eine mögliche
Erklärung für die höheren MHK-Werte ist eine unterschiedliche Beurteilung des
Wachstumsverhaltens, da bei der Wirkstoffkombination Trimethoprim/
Sulfamethoxazol laut CLSI eine Wachstumshemmung von 80% als Endpunkt
verwendet werden sollte (CLSI, 2011).
Tabelle 4: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegen verschiedene Wirkstoffe:
Ergebnisse verschiedener Studien
Wirkstoff
KA
PIT
EL 3
JAC
KS
et a
l. 2
003
CA
RL
SO
N
et a
l. 2
010
BO
WE
RS
OC
K
et a
l. 2
000
PR
ES
CO
TT
1981
HO
LLB
ER
G
2011
BA
CH
2011
RO
TH
AA
R
2006
Chloramphenicol MHK50 8 8 8
16
MHK90 16 16 16 16
Florfenicol MHK50 16 >8
16
MHK90 16 >8 32
Clindamycin MHK50 4 2
MHK90 8 >2
Doxyzyklin MHK50 1 0,5 1
MHK90 1 1 1
Tetrazyklin MHK50 4 4
4 2
MHK90 8 8 8 4
Enrofloxacin MHK50 1 0,5 2 1
MHK90 1 1 2 1
Gentamicin MHK50 0,5 <1 0,5
<0,25 0,25 0,5 0,5
MHK90 0,5 <1 1 <0,25 0,5 1 0,5
Trimethoprim/ Sulfamethoxazol
MHK50 0,25/4,8
1/19
0,25/4,8 0,5/9,5 1/19 MHK90 0,5/9,5 4/76 0,5/9,5 0,5/9,5 2/38
Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51 110 21 127
Die Unterschiede in den MHK-Werten, die von den verschiedenen Studien
ermittelt wurden, sind teils deutlich, teils auch nur gering ausgeprägt. Die möglichen
Gründe hierfür sind vielfältig. Möglich ist eine unterschiedliche Empfindlichkeit der
jeweiligen Testpopulationen. Auch ein Einfluss der Methodik (Medium-Zusätze,
Inkubationstemperatur und Inkubationsdauer) ist eine mögliche Erklärung. Die
Verwendung von geeigneten Stämmen zur Qualitätskontrolle der verwendeten
antimikrobiellen Wirkstoffe sowie die Anwendung einer einheitlichen, wie der von uns
Diskussion
23
publizierten und vom CLSI anerkannten Methodik (KAPITEL 2) sind notwendig, um
durch die Methode bedingte Einflüsse ausschließen zu können.
5.3 Genetische Grundlagen der verminderten Empfindlichkeit gegenüber
Rifampicin
Da sechs Isolate unseres Stammkollektivs eine verminderte Empfindlichkeit
gegenüber Rifampicin aufwiesen, wurde der genetische Hintergrund hierzu näher
untersucht. Von mehreren Autoren wurde über Mutationen im rpoB-Gen als Ursache
für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin in verschiedenen
bakteriellen Organismen berichtet (CRUCHAGA et al. 2003, KADLEC et al. 2011,
ZACZEK et al. 2009). Auch bei R. equi sind Mutationen in diesem Gen bereits als
Ursache für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin beschrieben
worden (ASOH et al. 2003, FINES et al. 2001). ASOH et al. (2003) beschreiben die
Mutationen Ser531Trp und His256Tyr als ursächlich für eine High-Level-Resistenz
(MHK ≥ 128 mg/L), sowie Ser531Leu für eine Low-Level-Resistenz (MHK 8 mg/L).
Es macht laut ASOH et al. (2003) einen merklichen Unterschied, welche Aminosäure
an Position 531 das Serin ersetzt.
In der Studie von FINES et al. (2001) wurde der Aminosäureaustausch
His526Tyr mit einem MHK-Wert von ≥256 mg/L in Verbindung gebracht, während
His526Asp einen MHK-Wert von 128 mg/L und His526Asn einen MHK-Wert von
8 mg/L zur Folge hatten. Auch hier hat demnach die das Histidin ersetzende
Aminosäure einen deutlichen Einfluss auf die MHK-Werte gegenüber Rifampicin.
Mutationen Ser531Leu führten auch diesen Autoren zufolge zu einem MHK-Wert von
8 mg/L und eine Mutation Asp516Val zu einem Wert von 2 mg/L.
In unseren Untersuchungen (KAPITEL 3) konnten wir die Ergebnisse von
FINES et al. 2001 bestätigen, denen zufolge eine Mutation His526Asp zu einem
hohen MHK-Wert gegenüber Rifampicin (256 mg/L) führt. Ebenfalls bestätigen
konnten wir die in derselben Studie beschriebene geringe Erhöhung des MHK-
Wertes (4 mg/L) bei Vorliegen einer Mutation Asp516Val. Unsere Studie ergab
darüber hinaus einen Zusammenhang zwischen einer Mutation Gln513Leu und
einem Rifampicin-MHK-Wert von 64 mg/L. Eine Mutation an dieser Lokalisation ist
bei R. equi bisher nicht beschrieben worden.
Diskussion
24
Auch konnten wir mit unserer Studie die Annahme von ASOH et al. 2003
bestätigen, dass die Mutation Ser531Leu eine verminderte Empfindlichkeit
gegenüber Rifampicin bedingt. Zwei unserer Isolate mit erhöhten MHK-Werten
gegenüber Rifampicin wiesen diese Mutation auf, ihre MHK-Werte waren jedoch
unterschiedlich (8 bzw. 128 mg/L), sodass wir einen zusätzlichen, bislang
unbekannten Resistenzmechanismus als Ursache für die unterschiedlich hohen
MHK-Werte bei gleicher Mutation im rpoB-Gen vermuten. Die These eines weiteren,
bisher unbekannten Resistenzmechanismusses wird vom Auftreten eines Isolates
mit einem Rifampicin-MHK-Wert von 8 mg/L gestützt, bei dem keine Mutation im
rpoB-Gen festgestellt werden konnte. Welcher Mechanismus zusätzlich bzw.
alternativ zu Mutationen im rpoB-Gen für die Erhöhung des MHK-Wertes gegenüber
Rifampicin verantwortlich ist, konnte in dieser Studie nicht festgestellt werden.
5.4 Laborvergleichsuntersuchung
In einer deutschlandweiten Laborvergleichsuntersuchung wurde die erarbeitete
Methode zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi an zwei Isolaten
(einem R. equi Feldisolat und dem Typstamm R. equi ATCC® 25729) in 18
verschiedenen, in der Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Erreger erfahrenen
Laboratorien angewendet (KAPITEL 4). Als Qualitätskontrolle wurde der E. coli-
Stamm ATCC® 25922 verwendet. Das Ziel der Laborvergleichsuntersuchung war es,
zu überprüfen, ob die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik praktikabel ist,
und ob die von den verschiedenen Laboren übermittelten MHK-Werte innerhalb
eines akzeptablen Bereiches liegen. Dieser akzeptable Bereich wurde - analog zur
Studie von WALLMANN et al. (2006) - auf den am häufigsten angegebenen MHK-
Wert ± 1 Verdünnungsstufe festgelegt.
In der Laborvergleichsuntersuchung zeigte sich, dass die Labore die von uns
erarbeitete Methode problemlos anwenden konnten. Als Grenze für eine erfolgreiche
Teilnahme der Labore wurde festgelegt, dass 80 % aller übermittelten MHK-Werte
innerhalb des akzeptablen Bereiches liegen sollten (WALLMANN et al. 2006).
Insgesamt waren für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC® 25922 98,3 %
aller MHK-Werte im akzeptablen Bereich. Die beiden R. equi-Stämme wiesen
Diskussion
25
durchschnittlich 92,2 % (ATCC® 25729) und 94,8 % (R. equi-Feldisolat) aller
übermittelten MHK-Werte im akzeptablen Bereich auf. Für eines der Labore und den
R. equi ATCC®25729 lagen nur 72,2 % aller übermittelten Werte im akzeptablen
Bereich. Da dieses Labor keine Probleme mit der Testung des R. equi-Feldisolates
hatte (91,7 % der MHK-Werte im akzeptablen Bereich) und auch die Testung des E.
coli ATCC® 25922 problemlos verlief (93,8 % der MHK-Werte im akzeptablen
Bereich), ist die Ursache hierfür nicht geklärt.
Bei Betrachtung der Ergebnisse für die einzelnen Wirkstoffe ergab sich die
schlechteste Übereinstimmung mit dem akzeptablen MHK-Bereich bei beiden R.
equi-Stämmen für Ceftiofur und Cefotaxim (R. equi ATCC® 25729 79,6 % und
75,9 %; R. equi-Feldisolat 88,9 % und 87,0 %). Die Testung des E. coli ATCC®
25922 mit diesen Wirkstoffen verlief problemlos (100 % bzw 98,1 %); was zu den
Problemen bei der Testung der R. equi-Isolate geführt hat, konnte retrospektiv nicht
geklärt werden. Die beste Übereinstimmungen mit dem akzeptablen Bereich zeigten
sich bei R. equi ATCC®25729 für Gentamicin, Oxacillin und Vancomycin (jeweils 100
%). Für das R. equi-Feldisolat wiesen Enrofloxacin, Marbofloxacin, Oxacillin, Tylosin
und Vancomycin die beste Übereinstimmung mit dem akzeptablen Bereich auf
(jeweils 100 %).
Abschließend lässt sich sagen, dass die Laborvergleichsuntersuchung
erfolgreich verlaufen ist; die Methode war problemlos von allen 18 Laboren
anzuwenden und die von den Laboren übermittelten MHK-Werte wiesen verglichen
mit den für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC® 25922 übermittelten MHK-
Werten eine gute Übereinstimmung mit den entsprechenden akzeptablen Bereichen
auf.
5.5 Anerkennung der Methode durch das CLSI
Die im Rahmen der Studie vorgestellte Methode wurde dem CLSI-Subkomitee
Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST) am 11.01.2013 vorgestellt. Die
neue Methode der Testung unter Verwendung von CAMHB + 2 % (v/v) LHB und
einer Inkubationszeit von 24 h wurde als neue Methode akzeptiert und wurde in die
erste Auflage des neuen CLSI-Dokuments VET06-A („Methods for Antimicrobial
Diskussion
26
Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria Isolated from
Animals“), das noch im Jahr 2016 erscheinen soll, aufgenommen.
Schlußfolgerungen
27
KAPITEL 6 Schlußfolgerungen
Der Vergleich verschiedener in der Literatur beschriebener Medien für die
antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution
zeigte, dass die bisher verwendeten Medien prinzipiell geeignet waren, um eine
Empfindlichkeitsprüfung durchzuführen. Die Ablesbarkeit war bei beiden
verwendeten Medien [CAMHB mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] sowohl nach
24 h als auch nach 48 h möglich, beim Einsatz von LHB aber deutlich besser. Die
statistische Auswertung einer wiederholten Empfindlichkeitsprüfung zeigte, dass die
Kombination aus einem Zusatz von 2 % (v/v) LHB zur CAMHB und einer Ablesung
der MHK-Werte nach 24 h die homogensten Ergebnisse ergab.
Die Testung eines Stammkollektivs von 200 R. equi-Stämmen verschiedenen
Ursprungs verlief mit dieser Methode problemlos. Die MHK-Werte für die meisten
Wirkstoffe waren normalverteilt und nur wenige Isolate wiesen eine verminderte
Empfindlichkeit gegenüber einem oder mehreren Wirkstoffen auf. Ein Isolat zeigte
eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber den Makrolid-Antibiotika Azithromycin,
Clarithromycin und Erythromycin. Insgesamt sechs Isolate wiesen unterschiedlich
stark erhöhte MHK-Werte gegenüber Rifampicin auf. Bei fünf dieser Isolate konnte
eine Mutation im rpoB-Gen als Ursache für die verminderte Empfindlichkeit
festgestellt werden. Jedoch zeigt die Studie, dass es neben Mutationen im rpoB-Gen
mindestens einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von
R. equi gegenüber Rifampicin beeinflusst.
Eine Laborvergleichsuntersuchung mit 18 teilnehmenden Laboren zeigte, dass
die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik geeignet ist. Die Ergebnisse der
MHK-Testung in den verschiedenen Laboren zeigten eine gute Übereinstimmung.
Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelte Methode wurde zudem dem CLSI
vorgestellt, als Methode für die Empfindlichkeitstestung von R. equi anerkannt und in
das neue CLSI-Dokument VET06-A aufgenommen.
Zusammenfassung
28
KAPITEL 7 Zusammenfassung
Anne Riesenberg: Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur
antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von
Rhodococcus equi
Als Erreger purulenter Bronchopneumonien beim Fohlen ist Rhodococcus equi
schon lange bekannt. Da der Erreger beim Fohlen schwerwiegende Erkrankungen
hervorruft und auch bei anderen Tierarten und beim Menschen Erkrankungen
auslösen kann, ist eine erfolgreiche Therapie der Rhodokokkose von großer
Bedeutung. Um einen Therapieerfolg sicherzustellen; sollte der Erreger vor Beginn
der Therapie auf seine antimikrobielle Empfindlichkeit getestet werden. Dies ist
insbesondere deshalb von Bedeutung, weil für das therapeutisch relevante
Rifampicin, sowie die ebenfalls häufig verwendeten Makrolide, bereits Isolate mit
verminderter Empfindlichkeit beschrieben wurden. Um die Ergebnisse verschiedener
Studien zur Empfindlichkeitsbestimmung von R. equi vergleichen zu können, ist es
notwendig, die Methodik der Testung zu standardisieren. Um dieses Ziel zu
erreichen, wurden zwei verschiedene in der Literatur beschriebene Medien [CAMHB
mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung
von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution für eine vergleichende
Empfindlichkeitsprüfung verwendet; die MHK-Werte wurden nach 24 und 48 Stunden
abgelesen. Die statistische Auswertung der Ergebnisse wiederholter
Empfindlichkeitsprüfungen zeigte, dass bei Verwendung von CAMHB mit 2 % (v/v)
LHB und einer Ablesung der MHK-Werte nach 24 Stunden die Wahrscheinlichkeit,
homogene MHK-Werte für das gleiche R. equi Isolat zu erzielen, am höchsten ist.
Mit dieser Methode wurde die Empfindlichkeit von 200 R. equi Isolaten
gegenüber 32 antimikrobiellen Wirkstoffen und Wirkstoff-Kombinationen getestet. Es
zeigten nur wenige Isolate erhöhte MHK-Werte für einige Wirkstoffe. Eines dieser
Isolate wies für die therapeutisch relevanten Makrolid-Antibiotika Erythromycin,
Clarithromycin und Azithromycin moderat erhöhte MHK-Werte auf. Weitere sechs
Isolate zeigten eine unterschiedlich stark ausgeprägte verminderte Empfindlichkeit
gegenüber Rifampicin. Bei der molekularen Untersuchung letzterer Isolate zeigte
sich, dass es zusätzlich zu Mutationen im rpoB-Gen, die dafür bekannt sind, die
Zusammenfassung
29
Empfindlichkeit von verschiedenen Bakterien gegenüber Rifampicin zu vermindern,
einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von R. equi
gegenüber Rifampicin vermindert.
Das Ergebnis einer Laborvergleichsuntersuchung, an der 18 deutsche
Laboratorien beteiligt waren, bestätigte, dass die von uns publizierte Methode zur
antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung probemlos von den Laboren angewendet
werden kann. Die Ergebnisse der MHK-Testung der verschiedenen Labore zeigten
eine gute Übereinstimmung.
Die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung mittels Bouillon-Mikrodilution von R.
equi in CAMHB + 2 % (v/v) LHB mit Inkubation in aerobem Milieu bei 35 ± 2 °C für 24
h ist eine zuverlässige, praxistaugliche Methode. Sie wurde vom Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) für die Testung von R. equi Isolaten von Tieren
anerkannt und stellt nach Aufnahme in das CLSI-Dokument VET06-A die künftige
Standardmethode zur Empfindlichkeitsprüfung von R. equi dar.
Summary
30
KAPITEL 8 Summary
Anne Riesenberg: Development of a standardised method for the
antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi
As a causative agent of purulent bronchopneumonia in foals, Rhodococcus
equi is known a fairly long time. As the pathogen causes severe infections in foals
and is furthermore capable of infecting other animals and humans, a successful
therapy is of utmost importance. To ensure therapeutical success the pathogen
should be tested for antimicrobial resistance before starting the treatment. This is of
particular importance since isolates with a reduced susceptibility have been reported
previously for the therapeutically relevant drug rifampicin as well as for the commonly
used macrolides. In order to allow a comparison of the results from different studies,
it is necessary to standardize the antimicrobial susceptibility testing of R. equi. To
achieve this goal, two media that were described in literature (CAMHB with and
without supplementation with 2 % (v/v) LHB) were used for antimicrobial
susceptibility testing of R. equi via broth microdilution; MIC values were read after 24
and 48 hours. Statistical analysis of repeated susceptibility testing showed, that the
probability to achieve homogenous MIC values was highest when using CAMHB with
2 % (v/v) LHB and reading the MIC values after 24 hours.
With this method we determined the susceptibility of 200 R. equi isolates
against 32 antimicrobial agents and combinations of agents. Only few isolates
showed elevated MIC values for one or few antimicrobial agents. One of these
isolates displayed moderately elevated MIC values against erythromycin,
clarithromycin and azithromycin. Further six isolates showed a reduced susceptibility
to rifampicin. Investigation of the molecular background of these six isolates showed,
that in addition to mutations in the rpoB-gene, that are well-known for their influence
on the susceptibility of different bacteria against rifampicin, there must be an
additional mechanism that influences the susceptibility of R. equi to rifampicin.
The results of an interlaboratory test, in which 18 German laboratories
participated, confirmed that our standardized method for the antimicrobial
susceptibility testing of R. equi could be applied without any problems and the results
of the MIC testing showed a good concordance.
Summary
31
The antimicrobial susceptibility testing of R. equi via broth microdilution using
CAMHB + 2 % (v/v) LHB and incubation in an aerobic atmosphere at 35 ± 2 °C für 24
hours is a reliable and applicable method. It has been approved by the Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) for testing of R. equi from animal origin, will be
included in the forthcoming CLSI-document Vet06-A and will therefore become the
future standard method for antimicrobial susceptibility testing of R. equi.
Literaturverzeichnis
32
KAPITEL 9 Literaturverzeichnis
ASOH N., WATANABE H., FINES-GUYON M., WATANABE K., OISHI K., KOSITSAKULCHAI W., SANCHAI T., KUNSUIKMENGRAI K., KAHINTAPONG S., KHANTAWA B., THARAVICHITKUL P., SIRISANTHANA T., NAGATAKE T. (2003): Emergence of rifampin-resistant Rhodococcus equi with several types of mutations in the rpoB gene among AIDS patients in northern Thailand. J. Clin. Microbiol. 41, 2337-2340. BACH, N. (2011): Behandlung von Fohlen mit Tulathromycin (Draxxin®) zur Vorbeugung der Rhodococcus equi-Pneumonie: Klinische Wirksamkeit, Verträglichkeit und Ausscheidung des Erregers. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. BARTON, M. D., FULTON, I. C. (1980): Antibiotic sensitivity of Corynebacterium equi. Aust. Vet. J. 56, 339-342. BOWERSOCK, T. L., SALMON, S. A., PORTIS, E. S., PRESCOTT, J. F., ROBISON, D. A., FORD, C. W., WATTS, J. L. (2000): MICs of oxazolidinones for Rhodococcus equi strains isolated from humans and animals. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1367-1369. BOYEN, F., PASMANS, F., HAESEBROUCK, F. (2011): Acquired antimicrobial resistance in equine Rhodococcus equi isolates. Vet. Rec. 168,101a. BUCKLEY, T., MCMANAMON E., STANBRIDGE S. (2007). Resistance studies of erythromycin and rifampin for Rhodococcus equi over a 10-year period. Ir. Vet. J. 60, 728-731. BUNDESTIERÄRZTEKAMMER (2015): Leitlinien für den sorgfältigen Umgang mit antibakteriell wirksamen Tierarzneimitteln – mit Erläuterungen –. Beilage zum Dtsch. Tierärztebl. 3/2015 BURTON, A. J., GIGUÈRE, S., STURGILL, T. L., BERGHAUS, L. J., SLOVIS, N. M., WHITMAN, J. L., LEVERING, C., KUSKIE, K. R., COHEN, N.D. (2013): Macrolide- and rifampin-resistant Rhodococcus equi on a horse breeding farm, Kentucky, USA. Emerg. Infect. Dis. 19, 282-285. CARLSON, K. L., KUSKIE, K. R., CHAFFIN, K. M., LIBAL, M. C., GIGUÈRE, S., LAWHON, S. D., COHEN, N.D. (2010): Antimicrobial activity of tulathromycin and 14 other antimicrobials against virulent Rhodococcus equi in vitro. Vet. Ther. 11, E1-9.
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Tabellenverzeichnis
37
KAPITEL 10 Tabellenverzeichnis
Seite
Tabelle 1………………………………………………………………………………………………………………………….. 17
Übersicht über in der Literatur beschriebene Verfahren zur Empfindlichkeitsprüfung
von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution
Tabelle 2………………………………………………………………………………………………………..………………… 19
MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für Rifampicin und verschiedene Makrolid-Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien
Tabelle 3………………………………………………………………………………………………………..………………… 21
MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für verschiedene β-Laktam-Antibiotika:
Ergebnisse verschiedener Studien
Tabelle 4………………………………………………………………………………………………..………………………… 22
MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für verschiedene Wirkstoffe: Ergebnisse
verschiedener Studien
Danksagung
Ganz besonderer Dank gilt Prof. Dr. Stefan Schwarz und PD Dr. Christiane
Werckenthin, die mir die Bearbeitung dieses Projektes anvertraut haben. Danke für Eure Unterstützung, die Hilfestellung bei Problemen jeglicher Art und die vielen sehr fruchtbaren Gespräche.
Sehr dankbar bin ich auch Andrea Feßler, PhD, für ihr außergewöhnlich großes Engagement und Herz. Du hattest zu jeder Tages- und Nachtzeit ein offenes Ohr für meine Probleme und meist auch eine Lösung. Deine unglaubliche Sorgfalt bei der Durchsicht von Manuskripten ist trotz der Nerven, die sie uns beide gekostet hat, unbezahlbar!
Prof. Dr. Heiner Niemann danke ich für die freundliche Aufnahme ins Institut für Nutztiergenetik, Friedrich-Loeffler-Institut, in Neustadt-Mariensee und die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes.
Die Laborvergleichsuntersuchung, deren Auswertung Teil dieser Arbeit ist, hat Dr.
Heike Kaspar organisiert und mir die Ergebnisse zur Verfügung gestellt. Neben dieser fachlichen Unterstützung danke ich Dir aber auch für Deine fröhliche und unkomplizierte Art, die mir so machen Nervenzusammenbruch erspart hat.
Danke an das gesamte Laborteam der MMA in Mariensee für die Einarbeitung in die Mikrobiologie sowie Eure zahlreichen Ratschläge bei jeglichen Kapriolen meiner Rhodokokken. Im Besonderen danke ich Vivian Hensel für die Begleitung meiner ersten Schritte im Labor und für ihr Radio; Ina Ott für ihre großartige Hilfe bei der Massenabfertigung und ‚Hakuna Matata’ und Regina Ronge für die Herstellung absurder Mengen Flüssigmedien und Agarplatten sowie ihre unermüdliche Arbeit in der Spülküche.
Dr. Dieter Klarmann gebührt nicht nur ein Dankeschön für die freundliche Aufnahme im LVI Oldenburg. Darüber hinaus hat er mit den zahlreichen fachlichen Gesprächen, die unter anderem beim Einhalten der Kühlkette entstanden sind, meinen Horizont erweitert.
Das Diagnostik-Team des LVI Oldenburg hat bereits im Vorfeld meiner Arbeit unermüdlich Arcobacter- und Trueperella-Isolate gesammelt und asserviert – Danke dafür, auch wenn sie nun kein Teil dieser Dissertation geworden sind. Trotz Eures eigenen Routine-Stresses habt ihr all meine Fragen immer freundlich beantwortet, mir geholfen, wo ihr nur konntet, mich ab und zu in meinem Container-Exil besucht und mir zugehört, wenn ich mal Probleme loswerden musste. Danke an Euch alle für die wunderbare Zeit in Oldenburg!
Auch dem fröhlichen PCR-Team des LVI Oldenburg möchte ich einen Dank aussprechen. Ihr habt mir sehr geholfen und mich darin bestätigt, dass nicht ich zu blöd bin, sondern meine PCR.
Ein großes Dankeschön geht an Erdal Erol PhD, Dr. Ellen Prenger-Berninghoff,
Dr. Ivonne Stamm, Dr. Anton Heusinger und Dr. Reinhard Böse. Die vielen Rhodokokken, die all diese Kollegen mir zur Verfügung gestellt haben, waren die Basis meiner Arbeit und somit wäre ohne Sie alle diese Arbeit nie zustande gekommen.
Sarah, Moni, Sonja, Kristina und Carmen: Ihr seid absolut wundervolle Kolleginnen! Dank Eurer guten Laune und Verrücktheit, Euren jederzeit offenen Ohren und Türen, und vielen fachlichen und privaten Gesprächen war meine Zeit in Mariensee großartig. Doktor-Schwestern for life!
Andreas, Ralf, Sven und Boyung, sowie allen ‚Nebendarstellern’ unserer Laufgruppe danke ich für den gemeinsamen Kampf gegen den inneren Schweinehund und den Ausgleich zur Laborarbeit.
Für Ablenkung zur rechten Zeit, motivierende Worte, kleine und große Abenteuer und für’s Zuhören, obwohl ihr nicht immer alles versteht, was ich so ‚blubbere’, danke ich all meinen Freundinnen – im besonderen Kerstin, Sarah, Lotte, Anita und Catherina – und meinen WGs, sowie Klaus.
Das riesenbergigste Dankeschön von allen geht an meine Familie. Euer Glaube an mich, Eure Unterstützung in allen Belangen und Euer Optimismus sind wertvollst. Ihr habt mich zu dem gemacht, was ich heute bin – danke dafür!
Der Beste kommt zum Schluss: Ich bin Dir unendlich dankbar für Deine Rücksichtnahme auf dieses Projekt und Deine Unterstützung dabei, für zahlreiche Motivationen, für’s Zuhören und für’s Reden. Mit Dir an meiner Seite ist der Alltag kunterbunt. Danke für Alles!