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Tierärztliche Hochschule Hannover

Entwicklung eines Tiermodells zur Untersuchung

eines Biofilms und einer assoziierten Entzündungsreaktion bei chirurgischen Implantaten

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Silke Paret

aus Berlin

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. André Bleich, PhD Medizinische Hochschule Hannover Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium

2. Prof. Kerstin Schwabe, PhD

Medizinische Hochschule Hannover Experimentelle Neurochirurgie der Klinik für Neurochirurgie

1. Gutachter: Prof. André Bleich, PhD

Medizinische Hochschule Hannover Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium

2. Gutachter: Prof. Peter Valentin - Weigand Tierärztliche Hochschule Hannover

Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin

Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2015

Für Frederic

Inhaltsverzeichnis V

INHALTSVERZEICHNIS

I. EINLEITUNG ......................................................................................................... 1

II. LITERATURÜBERSICHT ................................................................................... 2

1. Implantatinfektionen .......................................................................................... 2

1.1. Übersicht über Implantatinfektionen .................................................................. 2

1.2. Implantatinfektionen in der Neurochirurgie....................................................... 4

1.3. Implantatinfektionen in der Tiermedizin ............................................................ 5

2. Ablauf von bakteriellen Infektionen am Implantat ..................................... 6

2.1. Entzündungsreaktionen am Implantat............................................................... 6

2.2. Die Immunantwort auf eine bakterielle Infektion.............................................. 8

2.3. Biofilme................................................................................................................... 9

2.3.1. Biofilmbildung .......................................................................................... 9

2.3.2. Nachweismethoden für Biofilme auf Implantaten ............................ 11

2.4. Staphylococcus aureus...................................................................................... 13

3. Tiermodelle für die Untersuchung von Implantatinfek tionen ............... 15

4. Fragestellung ..................................................................................................... 19

III. MATERIAL UND METHODEN ......................................................................... 20

1. Versuchstiere ..................................................................................................... 20

2. Ablauf des Tierversuches .............................................................................. 20

2.1. Versuchsgruppen................................................................................................ 20

2.2. Anzüchtung und Konzentration der Bakterien ............................................... 21

2.3. Operativer Eingriff............................................................................................... 22

2.4. Postoperative Behandlung ................................................................................ 24

2.5. Entnahme der Blutproben und weitere Bearbeitung ..................................... 25

2.6. Entnahme der Implantate und Schädelkalotten und deren weitere

Bearbeitung ......................................................................................................... 26

3. Auswertung der Proben .................................................................................. 26

3.1. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie der Implantate ............................... 26

Inhaltsverzeichnis VI

3.2. Histologie der Schädelkalotten ......................................................................... 29

3.2.1. Einbettung in Technovit........................................................................ 29

3.2.2. Erstellung der histologischen Schnitte............................................... 30

3.2.3. Histologische Beurteilung der Knochenschnitte............................... 32

4. Statistik ............................................................................................................... 36

IV. ERGEBNISSE ..................................................................................................... 37

1. Biofilmbildung an den Implantaten ............................................................. 38

2. Histologische Auswertung der Schädelkalotten ..................................... 40

V. DISKUSSION ...................................................................................................... 46

1. Biofilmbildung ................................................................................................... 46

2. Entzündungsreaktion ...................................................................................... 50

3. Beurteilung des Tiermodells ......................................................................... 56

4. Fazit und Ausblick ............................................................................................ 58

VI. ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... 60

VII. SUMMARY .......................................................................................................... 62

VIII. LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................. 64

DANKSAGUNG ..................................................................................................................... 84

Abkürzungsverzeichnis VII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ANOVA Varianzanalyse (analysis of variance)

CLSM Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

CSA Ciclosporin A

DNS Desoxyribonukleinsäure

EPS extrazelluläre Polysaccharide

°C Grad Celsius

g Gramm

h Stunde

HE Hämalaun-Eosin

IL Interleukin

i.p. intra-peritoneal

KBE Kolonie-bildende Einheiten

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

MEA 2-Methoxyethylacetat

MMA Methylmethacrylat

µl Mikroliter

µm Mikrometer

mg Milligramm

min Minute

NaCl Natrium-Chlorid

ng Nanogramm

nm Nanometer

OD optische Dichte

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PMMA Polymethylmethacrylat

% Prozent

Abkürzungsverzeichnis VIII

qPCR quantitative PCR

rt-PCR real-time PCR

S.E.M. Standardfehler (standard error of mean)

TSB Tryptic Soya Broth

VE vollentsalzt

I. Einleitung 1

I. EINLEITUNG

Implantate werden in vielen Bereichen der Medizin eingesetzt, wobei Katheter,

künstliche Gelenke, Herzschrittmacher oder Zahnimplantate hier nur einige wenige

Beispiele sind (SCHALDACH 1975; TRINDADE ET AL. 2014). Im Bereich der

Neurochirurgie werden beispielsweise ventrikuläre Shunt-Systeme zum Ausgleich

eines erhöhten Liquordruckes oder nach einem Trauma Implantate für

Kranioplastiken mit Schrauben befestigt (EL GHOUL ET AL. 2014; HUTTNER ET AL.

2008). Im Bereich der Tiermedizin wird inzwischen ebenfalls häufig mit Implantaten

gearbeitet, vor allem im orthopädischen Bereich (STIFFLER 2004; WETSCHER 2012).

Die wichtigsten Ursachen von Implantatversagen sind Infektionen und

Knochenabbau in Umgebung der Implantate (BERENDT UND BYREN 2004; BØE ET AL.

2011; SAKKA UND COULTHARD 2011). In diesem Zusammenhang ist bekannt, dass

eine Biofilmbildung, also der organisierte Zusammenschluss von Bakterien, die

bevorzugt auf inerten Oberflächen oder totem Gewebe wachsen, am Implantat mit

einer sehr hohen Komplikationsrate einhergeht. Mehr als 65% aller Infektionen des

Menschen sind mit Biofilmen assoziiert sind, wobei Staphylococcus aureus der am

häufigsten für Implantatversagen verantwortliche Keim ist (ARCHER ET AL. 2011;

CAMPOCCIA ET AL. 2006; GBEJUADE ET AL. 2015; HANKE UND KIELIAN 2012; RAMÍREZ ET

AL. 2013; SNOWDEN ET AL. 2012). Der Bedarf an Implantaten ist in den letzten Jahren

kontinuierlich angestiegen, so dass inzwischen pro Jahr über eine halbe Milliarde

Implantate weltweit verwendet werden (CAMPOCCIA ET AL. 2013; HALLAK 2014; YUE ET

AL. 2015). Diese Entwicklung zeigt, dass in diesem Bereich und vor allem im Gebiet

der Implantatinfektionen weitere Forschung und Entwicklung nötig und sinnvoll ist.

Das hier beschriebene Vorhaben hat das Ziel, ein Rattenmodell zu entwickeln und zu

charakterisieren, bei dem mit Staphylococcus aureus reproduzierbar ein Biofilm auf

einem Implantat mit begleitender Entzündungsreaktion hervorgerufen werden kann

und mit dem später neue Implantatmaterialien oder -oberflächen evaluiert werden

können.

II. Literaturübersicht 2

II. LITERATURÜBERSICHT

1. Implantatinfektionen

1.1. Übersicht über Implantatinfektionen

Innerhalb der letzten Jahre wurden zunehmend mehr Implantate eingesetzt, was an

der Entwicklung in der medizinischen Forschung und an dem demographischen

Wandel liegt (HALLAK 2014; YUE ET AL. 2015). Im Jahr 2007 wurden etwa eine halbe

Milliarde Implantate weltweit verwendet und der Bedarf ist seitdem noch gestiegen

(CAMPOCCIA ET AL. 2013). Infektionen an Implantaten sind eine der häufigsten

Ursachen für Implantatversagen, wobei in der Regel das infizierte Implantat mit dem

umgebenden Gewebe entfernt werden muss, da bei einer Biofilmbildung auf der

Implantatoberfläche gewöhnlich keine andere Behandlung erfolgreich ist (DAROUICHE

2004; HALLAK 2014; KASLIWAL ET AL. 2013; YUE ET AL. 2015). Es besteht unter

anderem die Problematik, dass kaum wirksame antibakterielle Medikamente gegen

das zunehmend resistente Erregerspektrum im Bereich der Implantatinfektionen

eingesetzt werden können, was vor allem der schwer zugänglichen Verbindung

zwischen Implantat, Knochen und umgebendem Weichgewebe geschuldet ist

(HALLAK 2014). Es kann in der Folge einer Implantatinfektion zur Besiedlung von

anderen Organen durch die Verbreitung der vorhandenen Bakterien oder zu einer

systemischen Infektion mit entsprechenden Symptomen kommen, was im

schlimmsten Fall zu einer Sepsis mit Todesfolge führen kann (CRAMTON ET AL. 1999;

WODTKE UND LÖHR 2008). Im Falle einer Infektion tritt diese in der Regel akut oder

subakut nach einer Implantation auf, jedoch ist diese bei Verbleiben der Implantate

durch eine hämatogene Absiedlung von Bakterien noch Jahre später möglich

(CAMPOCCIA ET AL. 2013).

Neben den weitreichenden Folgen für die Patienten entstehen durch

Implantatinfektionen hohe volkswirtschaftliche Kosten, da Revisionsoperationen, also

die Entfernung eines bereits infizierten Implantates um ein neues einzubringen, mit

einem erhöhten Operationsrisiko, einer höheren Komplikationsrate und einem


dadurch bedingten längeren Krankenhausaufenthalt einhergehen (DAROUICHE 2004;

STEIN 2011). Allein die Kosten für orthopädische Revisionsoperationen im Bereich

des Gelenkersatzes belaufen sich in Deutschland pro Jahr auf etwa 180 Millionen

Euro (OTTO 2008).

Nach Einbringung eines Implantates genügt im Vergleich zu Situationen, in denen

kein Fremdmaterial beteiligt ist, bereits eine millionenfach geringere Keimlast um

eine Infektion hervorzurufen (ZIMMERLI ET AL. 1982). Dies ist einer der Hauptgründe

dafür, dass 60 - 70% aller nosokomialen Infektionen auf Implantate zurückzuführen

sind (VEERACHAMY ET AL. 2014).

In der Orthopädie infizieren sich etwa 0,5 - 2% der Gelenkprothesen, wobei sehr oft

Staphylococcus aureus (S. aureus) nachgewiesen wird (GEIPEL UND HERRMANN

2004). Bei transkutanen Fixateuren, die bei einigen Frakturen verwendet werden,

zeigen sich Infektionsraten von 5% bis zu 50%, wobei diese Angaben, abhängig von

den Lokalisationen am Körper, stark schwanken (CAMPOCCIA ET AL. 2013; KRAEMER ET

AL. 2010). Zahnimplantate zeigen in bis zu 8% der Fälle eine Periimplantitis, die mit

einer Entzündungsreaktion und Knochenverlust in der Umgebung des Implantates

einhergeht (SINGH 2011; YUE ET AL. 2015). In der Neurochirurgie liegen die

Infektionsraten nach Verwendung von Implantaten in der Regel zwischen 3,4 - 8,5%

(CAMPOCCIA ET AL. 2013; STAVRAKIS ET AL. 2015). Bei Risikofaktoren wie hohem Alter,

Diabetes mellitus, Adipositas, Rauchen oder einer Immunsuppression des Patienten

kommt es zu einer deutlichen Erhöhung der Infektionsraten (BJERKNES ET AL. 2014;

HALLAK 2014; POELSTRA ET AL. 2000; STAVRAKIS ET AL. 2015). Diese werden zusätzlich

verstärkt, wenn im Operationsbereich bereits eine Infektion vorliegt oder es sich um

eine Revisionsoperation handelt (GOH ET AL. 2010).

Es gibt bis jetzt einige Ansätze zur Verminderung von Implantatinfektionen. So wird

in der Regel bei den Operationen neben der allgemeinen Asepsis eine systemische

prophylaktische antimikrobielle und antiinflammatorische Therapie durchgeführt (YUE

ET AL. 2015). Zusätzlich gibt es Versuche, bei denen Implantate mit Nanopartikeln

aus Silber beschichtet wurden, wodurch eine antibakterielle Wirkung erzielt werden

soll. Diese Art der Beschichtung zeigte erste Erfolge beim orthopädischen Einsatz.

Eine langfristige geringere Infektionsrate und Reduzierung der Biofilmvorkommen


müssen allerdings erst noch gezeigt werden (BRENNAN ET AL. 2015). Weitere Ansätze

sind die Verwendung von Kupfer in Implantaten, welches die Biofilmbildung stört,

indem es die Anheftung der Bakterien an der Oberfläche des Implantates verhindert,

die Beschichtung mit Peroxiden, die eine bakterizide Wirkung haben sollen, oder

antibakteriell wirkenden Phagen, also Viren, die spezifisch Bakterien infizieren und

zerstören (CONNAUGHTON ET AL. 2014). Bei diesen und anderen Beschichtungen

besteht leider häufig das Problem, dass sich zwar keine Bakterien mehr an die

Implantate anheften können, gleichzeitig jedoch die Anlagerung von körpereigenen

Zellen und somit eine mögliche medizinische Funktion oder die Einheilung gestört

sind (BRENNAN ET AL. 2015). Demzufolge ist durch bereits eingesetzte Substanzen

oder Implantatveränderungen zwar eine Reduktion der Infektionsraten ermöglicht

worden, letztendlich können Implantatinfektionen jedoch nicht vollständig verhindert

werden (ARCHER ET AL. 2011; CAMPOCCIA ET AL. 2013; CONNAUGHTON ET AL. 2014;

HALLAK 2014).

1.2. Implantatinfektionen in der Neurochirurgie

Die Verwendung von Implantaten in der Neurochirurgie ist in den letzten Jahren

deutlich angestiegen und hat für unterschiedliche Zwecke eine große Bedeutung

erlangt (BRAXTON ET AL. 2005; CAMPOCCIA ET AL. 2013). Am Schädel werden unter

anderem verschiedene Platten in Kombination mit Schrauben zur Rekonstruktion bei

Frakturen, einer Osteomyelitis der Schädelknochen oder bei Kraniostenosen zur

Translokation der Schädelplatten verwendet (BÜCHELER ET AL. 2002; HOSEIN ET AL.

1999; SCHMIDT 2003). Operationen, bei denen ein zunächst entferntes Knochenstück

später wieder als Implantat eingesetzt wird, werden am Schädel unter anderem zum

Verschluss nach einem intracraniellen Eingriff aufgrund von Blutungen oder Tumoren

durchgeführt (HOSEIN ET AL. 1999). An der Wirbelsäule werden Implantate

beispielsweise bei einer Fusion von Wirbelkörpern zur Stabilisierung bei einer

Spondylolisthese oder einer Osteomyelitis der Wirbelkörper verwendet (SANSUR ET

AL. 2010; SHAD ET AL. 2003).

Osseointegrative Implantate werden in der Neurochirurgie vielseitig eingesetzt und

bergen ebenso wie an anderen Stellen des Körpers immer das Risiko einer Infektion


mit möglicherweise schwerwiegenden Folgen, unter anderem durch die häufig

assoziierte Biofilmbildung und den damit verbundenen Schwierigkeiten bei der

Behandlung (BRAXTON ET AL. 2005). Bei Implantatinfektionen am Schädel und der

Wirbelsäule können die Infektion und die Entzündung auf das zentrale Nervensystem

übergehen. Ebenso sind unspezifische Kopfschmerzen und Ausfälle der

psychomotorischen Funktionen möglich (BJERKNES ET AL. 2014; CAMPOCCIA ET AL.

2013; HOSEIN ET AL. 1999). Letztendlich kann sich infolge einer Infektion eine

lebensbedrohliche Sepsis entwickeln, welche in etwa 14% der Infektionsfälle eintritt

(BRAXTON ET AL. 2005; HOSEIN ET AL. 1999). Die durchschnittliche Infektionsrate bei

neurochirurgischen Eingriffen mit Implantaten ist mit 3,4 - 8,5% etwa doppelt so hoch

wie bei Operationen, bei denen kein Implantat eingebracht wird. Ebenso wie im

orthopädischen Bereich, ist in der Neurochirurgie der am häufigsten gefundene Keim

S. aureus (BRAXTON ET AL. 2005; LIETARD ET AL. 2008; POELSTRA ET AL. 2000;

STAVRAKIS ET AL. 2015).

1.3. Implantatinfektionen in der Tiermedizin

Implantate werden auch in der Veterinärmedizin zunehmend verwendet,

hauptsächlich für orthopädische Zwecke, aber auch bei neurochirurgischen Eingriffen

(STIFFLER 2004; WETSCHER 2012). Beispiele für orthopädische Erkrankungen bei

Tieren, bei denen operativ mit osseointegrativen Implantaten gearbeitet wird, sind

Kreuzbandrisse bei Hunden, Frakturen beim Klein- und beim Großtier oder Arthrosen

der Zehengelenke beim Pferd (AIKEN ET AL. 2015; KNOX UND WATKINS 2006; NICOLL ET

AL. 2014; WETSCHER 2012). Im neurochirurgischen Bereich werden Implantate zum

Beispiel bei der Diskospondylitis beim Hund oder bei Schädelknochenverletzungen

durch Trauma sowohl beim Kleintier, als auch beim Großtier eingesetzt (AUGER ET AL.

2000; CHEN ET AL. 2014; GERDING ET AL. 2014; HUSKA ET AL. 2014).

Infektionsraten von Implantaten im Knochen beim Tier liegen zwischen 4 - 12% und

können in der Folge zu einer Osteomyelitis und bei Kontakt zu Gelenken gleichzeitig

zu einer septischen Arthritis führen. Ebenso wie beim Menschen sind systemische

Infektionen und eine Sepsis mit Todesfolge möglich (AIKEN ET AL. 2015; GALLAGHER

UND MERTENS 2012). Staphylokokken sind auch in der Veterinärmedizin die am


häufigsten an Implantatinfektionen beteiligten Keime (GALLAGHER UND MERTENS

2012). Risikofaktoren, die zu einer schlechteren Heilung nach der Operation oder zu

höheren Infektionsraten führen, sind ähnlich wie beim Menschen vor allem das Alter

des Tieres, die Dauer der Operation sowie Diabetes mellitus und Adipositas (AIKEN

ET AL. 2015).

Auch im tierexperimentellen Bereich sind Infektionen infolge von Implantaten

problematisch. In den Neurowissenschaften werden häufig Elektroden für die

elektrophysiologische Ableitung oder Stimulation von bestimmten Gehirnregionen

implantiert. Für die chronische Anwendung werden diese Implantate mit Hilfe von

kleinen Schräubchen und Knochenzement an der Schädeloberfläche befestigt. Nach

mehreren Wochen können sich ohne prophylaktische Antibiose Entzündungen

entwickeln und es kann teilweise zur Bildung von Abszessen im Gehirn kommen

(LEBLANC ET AL. 2013). Ebenso können Osteomyelitiden auftreten, die zu

Implantatverlusten führen. Diese Probleme werden in der Literatur meist als

„Tierverluste während eines Versuches“ gekennzeichent und selten als

Implantatverluste aufgrund von Infektionen benannt. Dementsprechend könnte eine

Verhinderung solcher Infektionen die Zahl der für einen Versuch verwendeten Tiere

deutlich verringern.

2. Ablauf von bakteriellen Infektionen am Implantat

2.1. Entzündungsreaktionen am Implantat

Eine lokale Entzündung im Gewebe ist eine normale Reaktion des Körpers auf das

Einbringen eines Fremdkörpers. Gleichzeitig ist eine persistierende Entzündung in

der Umgebung von Implantaten, die über diese normale Reaktion hinausgeht, eine

der Hauptursachen von Implantatversagen. Eine Entzündungsreaktion ist nicht an

eine Beteiligung von Bakterien gebunden (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008;

REFAI ET AL. 2004; TRINDADE ET AL. 2014).

Entzündungsprozesse lassen sich in drei Phasen unterteilen. Während der akuten

Entzündung, die maximal einige Tage dauert, kommt es infolge einer Verletzung


zunächst zu Blutgerinnung und Gewebekontraktion. Gleichzeitig findet eine zelluläre

Reaktion statt, die durch eine ausgeprägte Einwanderung von Leukozyten,

hauptsächlich neutrophiler Granulozyten und Monozyten gekennzeichnet ist.

Gleichzeitig zeigt sich eine Ödembildung durch Exsudation von Gewebeflüssigkeit

(ANDERSON 1988, 1993; KOCHANOWSKI 2012; REFAI ET AL. 2004). In dieser Phase

kommt es bereits zur Phagozytose von zerstörten Zellen (PAJARINEN ET AL. 2013;

TONETTI UND SCHMID 1994).

Es folgt eine chronische Entzündung, die durch die Anwesenheit von Makrophagen

und Lymphozyten geprägt ist. Die chronische Entzündung wird durch einen

persistierenden Stimulus erhalten, wobei es sich im Falle eines Implantates zum

Beispiel um die Materialbeschaffenheit oder eine permanente leichte Bewegung des

Implantates handeln kann (ANDERSON 1993; SUSKA ET AL. 2005). Auf zellulärer Ebene

findet Kollagensynthese, die Bildung extrazellulärer Matrix und die Proliferation neuer

Blutgefäße statt (ANDERSON 1993; PRIBILA ET AL. 2004). Die wichtigsten Zellen in

dieser Phase sind Makrophagen, unter anderem aufgrund ihrer Fähigkeit eine

Vielzahl an Mediatoren zu sezernieren (zum Beispiel Proteasen, Zytokine und

chemotaktische Faktoren) (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008; REFAI ET AL.

2004). Zusätzlich haben sie eine deutlich längere Überlebensdauer (Tage bis

Wochen) als neutrophile Granulozyten (24 - 48 Stunden) (ANDERSON 1988; SILVA

2011). Im weiteren Verlauf der Entzündungsreaktion kommt es zur Bildung von

Granulationsgewebe und teilweise einer Bindegewebskapsel (ANDERSON ET AL.

2008). Granulationsgewebe besteht aus neu gebildeten kleinen Blutgefäßen und

Fibroblasten und bildet sich etwa drei bis fünf Tage nach einer Implantation

(ANDERSON 1993).

Die letzte Phase der Entzündung ist durch eine Fibrose und die Bildung von

Narbengewebe gekennzeichnet (TRINDADE ET AL. 2014). Grundsätzlich sollten die

Phasen der Entzündung nicht als ein streng chronologischer Prozess betrachtet

werden, da sich die Ereignisse überlappen und ineinander übergehen (SILVA 2011).

Bei Implantaten wird die sogenannte Fremdkörper-Reaktion von einer chronischen

Entzündung differenziert (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008). Eine normale

Fremdkörper-Reaktion auf das Einbringen von Implantaten besteht aus der


Ansammlung von Makrophagen, Fremdkörper-Riesenzellen und den typischen

Komponenten des Granulationsgewebes, zu denen Makrophagen, Fibroblasten und

Kapillaren gehören (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL. 2008). Aufgrund der Größe

und der hauptsächlich nicht resorbierbaren Implantatmaterialien können nur die

ersten Schritte der Phagozytose, also die Anheftung an das Implantat und die

Erkennung als Fremdkörper, erfolgen (ANDERSON 1993). Die Folge davon ist die

sogenannte frustrierte Phagozytose, welche unter anderem zu einer Verschmelzung

von Makrophagen zu mehrkernigen Riesenzellen, auch Fremdkörper-Riesenzellen

genannt, führt (HENSON 1971; MORENO ET AL. 2007). Diese Fusion ist einer der

wichtigsten Vorgänge der Fremdkörper-Reaktion (ANDERSON 1993; ANDERSON ET AL.

2008; TRINDADE ET AL. 2014). Makrophagen und Fremdkörper-Riesenzellen, die sich

an der Implantatoberfläche angesammelt haben, setzen unterschiedliche Mediatoren

und Enzyme frei, mit dem Ziel der Phagozytose und der Zersetzung des Implantates.

Durch diesen Vorgang werden weitere Entzündungszellen angelockt und es kann zu

einem deutlichen Knochenabbau kommen, was in der Folge zu einer Lockerung und

dem Verlust des Implantates führen kann (HENSON 1971; MORENO ET AL. 2007;

TRINDADE ET AL. 2014).

Eine lokale zelluläre Fremdkörper-Reaktion kann dauerhaft bestehen bleiben, jedoch

durch eine fibröse Einkapselung vom umgebenden Gewebe abgeschirmt werden

(ANDERSON 1993; TRINDADE ET AL. 2014). Durch die Bildung von Narbengewebe um

das Implantat sollte es möglichst zur vollständigen Einheilung des Implantates

kommen. Eine unvollständige Einheilung von Implantaten begünstigt immer eine

Infektion mit Bakterien (ANDERSON 1993; TRINDADE ET AL. 2014).

2.2. Die Immunantwort auf eine bakterielle Infektio n Pathogene Bakterien führen in der Regel zu einer Reaktion des Immunsystems mit

dem Ziel der Eliminierung der eingedrungenen Mikroorganismen (GONZALEZ ET AL.

2015). Die erste Reaktion des Körpers auf Bakterien ist eine massive Infiltration des

entsprechenden Gewebes durch neutrophile Granulozyten und Makrophagen (FRANK

1980). In nahezu jedem Gewebe des Körpers gibt es ortsständige Makrophagen, die

eine direkte und sofortige Abwehr von Bakterien gewährleisten können und eine

Vielzahl proinflammatorischer Mediatoren produzieren, die wichtig für die


Rekrutierung und Aktivierung anderer Immunzellen sind (FOSTER 2005). Neutrophile

Granulozyten sezernieren als erste Antwort auf eine bakterielle Infektion zahlreiche

bakterizide Substanzen, wie Defensine, Lysozyme und Sauerstoffradikale (HANKE

UND KIELIAN 2012). Sie gelten daher als die wichtigsten Zellen der Immunreaktion auf

eine bakterielle Infektion (SILVA 2011).

2.3. Biofilme

2.3.1. Biofilmbildung

Bei Biofilmen handelt es sich um organisierte Zusammenschlüsse von Bakterien, die

bevorzugt auf inerten Oberflächen oder totem Gewebe wachsen (COSTERTON 1999;

DONLAN UND COSTERTON 2002; SHIRTLIFF ET AL. 2002). Durch die Vermehrung von

Bakterien entstehen dichte Verbände, sogenannte Plaques, die in eine extrazelluläre

Matrix aus Polysacchariden, Nukleinsäuren und verschiedenen Proteinen eingebettet

sind. Diese Matrix wird als extrazelluläre Polysaccharide (EPS) bezeichnet (BRAXTON

ET AL. 2005; DAVIES ET AL. 1998; STOODLEY ET AL. 2002). Solche mehrzelligen

Verbände stehen planktonischen Einzelzellen gegenüber (MAH UND O’TOOLE 2001).

Biofilme werden in mehreren Schritten gebildet. Dabei unterscheidet man die drei

Phasen der Anheftung, Reifung und Ablösung zur weiteren Verbreitung (ARCIOLA ET

AL. 2011; O’TOOLE ET AL. 2000; OTTO 2008).

Die Bildung von Biofilmen beginnt durch die Aggregation von Bakterien an einer

Oberfläche. Dieser Vorgang führt zu einer veränderten Genexpression der Bakterien,

wodurch die nachfolgenden Schritte der Biofilmbildung erst ermöglicht werden

(DONLAN UND COSTERTON 2002; HALL-STOODLEY ET AL. 2004). Anschließend beginnt

die Sezernierung der EPS, wodurch die Anheftung der Bakterien an der Oberfläche

verstärkt wird und in einen nahezu irreversiblen Zustand übergeht. Diese Vorgänge

sind, abhängig von der Bakterienspezies, bei optimalen Umgebungsbedingungen

meist nach wenigen Stunden abgeschlossen (STOODLEY ET AL. 2002).

In der Phase der Reifung kommt es zu einer spezifischen Ausbildung der Architektur

und der Anheftung von weiteren planktonischen, frei flotierenden Bakterien an den

bereits bestehenden Biofilm (DAVIES ET AL. 1998; STOODLEY ET AL. 2002). Während


der Reifung eines Biofilmes wird dieser hauptsächlich stabiler gegenüber äußeren

Einflüssen, was nicht immer mit einer Verdickung des Biofilms oder Vermehrung der

Bakterien einhergeht (GÜNTHER ET AL. 2009). Nach der Ausreifung können

planktonische Einzelzellen freigesetzt oder ganze Mikrokolonien abgelöst und

abgeschwemmt werden, die sich an anderen Orten im Körper ansiedeln und

Infektionen von weiteren Organen verursachen können (SHIRTLIFF ET AL. 2002;

STOODLEY ET AL. 2002).

Innerhalb eines Biofilmes bewirken unterschiedliche Mediatoren eine komplexe

Kommunikation zwischen den Zellen, welche „Quorum-sensing“ genannt wird. Dies

führt zu einer Veränderung der Stoffwechselaktivität und einem veränderten

Verhalten im Vergleich zu planktonischen Bakterien (BRAXTON ET AL. 2005; HALL-

STOODLEY ET AL. 2004; O’GARA 2007). Bakterien haben in einem Biofilm mehrere

Vorteile gegenüber planktonischen Bakterien. Durch verschiedene Mechanismen

können zum Beispiel die Umgebungsbedingungen den Bedürfnissen der Bakterien

angepasst werden. Weiterhin steigt die Überlebensrate der Mikroorganismen durch

Schutz vor der körpereigenen Abwehr sowie vor antibakteriell wirksamen

Medikamenten (ARCHER ET AL. 2011; BRAXTON ET AL. 2005; YARWOOD UND BARTELS

2004). Beispiele für solche Vorteile innerhalb von Biofilmen sind:

1. Nährstoffspeicherung in der umgebenden Matrix, vor allem von Stickstoff und

Phosphat. Die entsprechenden Moleküle können durch Biofilm-eigene kleine

Kanäle transportiert werden (BRAXTON ET AL. 2005).

2. Schutz vor Scherkräften durch die extrazelluläre Matrix (SHIRTLIFF ET AL. 2002).

3. Die Matrix als Diffusionsbarriere, die die Bakterien in einem Biofilm vor

antimikrobiellen Substanzen oder Abwehrzellen schützt (AKIYAMA ET AL. 1993;

COSTERTON 1999).

4. Absinken der Stoffwechselrate der Bakterien in einen sogenannten Persister-

Zustand. Dadurch sind die Mikroorganismen deutlich weniger durch viele

antibakteriell wirksamen Medikamente angreifbar, da diese in den

Stoffwechsel der Bakterien eingreifen (XU ET AL. 2000).


Da die Eliminierung des Biofilms durch das Immunsystem häufig nicht möglich ist,

kommt es zu einer fibrösen Einkapselung. Man geht davon aus, dass durch diesen

Vorgang der Biofilm möglichst vollständig abgegrenzt werden soll. Allerdings wird

hierdurch auch das Überleben der Bakterien gefördert, da weder weitere

Immunzellen noch antimikrobielle Wirkstoffe den infizierten Bereich erreichen können

(HANKE UND KIELIAN 2012).

Grundsätzlich wird die Anheftung von Bakterien an eine Implantatoberfläche nur

dadurch ermöglicht, dass keine gute Einheilung in das Gewebe stattgefunden hat.

Bei ausreichender Einheilung wird die Implantatoberfläche von Gewebezellen belegt,

sodass weniger Fläche für eine Biofilmbildung zur Verfügung steht. Im Gegensatz

dazu ist keine ausreichende Einheilung in das umgebende Gewebe mehr möglich,

sobald sich ein Biofilm auf der Implantatoberfläche gebildet hat (ANDERSON 1993).

2.3.2. Nachweismethoden für Biofilme auf Implantate n

Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von Bakterien und Biofilmen auf

Implantaten, die verschiedene Vor- und Nachteile haben. Für eine aussagekräftige

Beurteilung sollte die gewählte Methode eine Unterscheidung zwischen

planktonischen Bakterien und Biofilmen ermöglichen und eine Quantifizierung

erlauben. Interessant ist zudem die Darstellung, ob die Bakterien noch lebensfähig

sind.

Ein häufig gewähltes Instrument zum Bakteriennachweis ist die Polymerase-

Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) (FREIRE 2011; LI ET AL. 2008; VERMA

ET AL. 2010). Die PCR ist sehr sensitiv zur Detektierung vorhandener

Desoxyribonukleinsäure (DNS) der nachzuweisenden Keime. Nachteilig ist jedoch,

dass es sich bei einer normalen PCR um einen rein qualitativen Nachweis handelt

(AMMANN ET AL. 2013; TAVERNIER UND COENYE 2015). Eine genau Quantifizierung des

Biofilmes ist durch eine sogenannte real-time PCR (rt-PCR), oder auch quantitative

PCR (qPCR), möglich. Dabei wird mit Hilfe einer Fluoreszenz-Reaktion dargestellt,

wie viel genetisches Ausgangsmaterial vervielfältigt wurde. Somit erlaubt diese

Methode eine sehr genaue Quantifizierung vorhandener Bakterien beziehungsweise

eines Biofilmes (AMMANN ET AL. 2013).


Als weitere Möglichkeit zum Nachweis von Bakterien werden Abstriche vom

Implantat genommen, die anschließend mit Hilfe eines Ausstrichs auf einem

entsprechenden Nährmediums angezüchtet werden. Alternativ wird das Implantat

direkt auf einem Nährboden ausgerollt um anhaftende Bakterien nachzuweisen.

Danach können die Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) als Maß für die Menge der

vorhandenen Bakterien bestimmt werden (LUCKE ET AL. 2003). Diese Methode ist

kritisch zu betrachten, da dadurch eher ein qualitativer Nachweis von Bakterien

erfolgt, da mit einem solchen Vorgehen nicht alle vorhandenen Keime, insbesondere

nicht fest angehefteter Biofilm, vom Implantat abgelöst werden können. Gleichzeitig

ist zu beachten, dass ein Biofilm aus Bakterien besteht, die sich in verschiedenen

Stoffwechsel-Zuständen befinden. So sind zum Beispiel inaktive Persister-Bakterien

nahezu nicht kultivierbar, obwohl sie lebendig, vermehrungsfähig und in der Lage

sind, den Wirt zu schädigen. Des Weiteren ist bei einer Anzüchtung zu beachten,

dass je nach verwendetem Medium und gewählten Umgebungsbedingungen

bestimmte Keime selektiert werden (BJERKNES ET AL. 2014; TAVERNIER UND COENYE

2015).

Eine andere Art der mikrobiologischen Kultivierung ist die Homogenisierung und

Lösung von dem das Implantat umgebenden Gewebe, um damit ebenfalls eine

Anzüchtung zum Nachweis von Bakterien durchzuführen. Mittels der KBE wird so

eine Quantifizierung erreicht und anhand der Koloniemorphologie werden die

Bakterien identifiziert (CHEN ET AL. 2005, 2009; POELSTRA ET AL. 2000). Der Nachteil

dieses Vorgehens ist jedoch, dass nicht ersichtlich ist, ob die Keime sich direkt auf

dem Implantat oder im umgebenden Gewebe befanden. Es ist wahrscheinlich, dass

im Falle einer maturen Biofilmbildung auf dem Implantat diese Bakterien mit dem

Implantat entfernt werden und nicht im untersuchten Gewebematerial nachweisbar

sind. Außerdem ist nicht erkennbar, ob die Keime in einem Biofilm organisiert waren

(KERSTENS ET AL. 2015).

Eine Ablösung der Bakterien von Implantaten wurde zudem mittels Zentrifugation

des Implantates in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) beschrieben (CUCARELLA

ET AL. 2001; HAENLE ET AL. 2013; RUPP ET AL. 1999). Die entstandene Flüssigkeit wird

anschließend auf ein Nährmedium gegeben und mit der KBE eine Quantifizierung


erreicht. Bei diesem Vorgehen ist es wahrscheinlich, dass anhaftender maturer

Biofilm nicht abgelöst wird, sondern hauptsächlich planktonische Bakterien und

unreifer, nicht fest etablierter Biofilm nachgewiesen wird (KERSTENS ET AL. 2015). Eine

weitere Möglichkeit zur Ablösung eines Biofilms vom Implantat zur nachfolgenden

Anzüchtung und Untersuchung ist die Inkubation in einem Ultraschall-Bad, was sich

bereits in verschiedenen Untersuchungen als zuverlässig erwiesen hat (BEENKEN UND

DUNMAN 2004; KERSTENS ET AL. 2015; SNOWDEN ET AL. 2012; VAN WIJNGAERDEN ET AL.

1999).

Alle beschriebenen Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass nicht erkennbar ist,

ob es sich bei den nachgewiesenen Keimen um planktonische Keime oder um

Bakterien handelt, die in einem Biofilm organisiert waren. Zusätzlich ist keine

zuverlässige Quantifizierung mittels einer Anzüchtung zu erreichen, da ein Biofilm

aus Bakterien besteht, die sich in sehr unterschiedlichen Stoffwechsel-Zuständen

befinden und nicht kultivierbar sein können, obwohl sie noch lebensfähig sind

(BJERKNES ET AL. 2014; TAVERNIER UND COENYE 2015). Außerdem ist eine Anzüchtung

in der Regel sehr arbeits- und zeitintensiv (HANNIG ET AL. 2010).

Eine weitere Methode ist die direkte Darstellung von Bakterien auf einem Implantat

mit Hilfe der Mikroskopie, wobei die Elektronen-Scanning-Mikroskopie oder die

konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) verwendet werden kann (ALT ET AL.

2011; ARAD ET AL. 2013; SNOWDEN ET AL. 2012; WINDOLF ET AL. 2013). Insgesamt ist zu

sagen, dass sowohl die Qualifizierung als auch Quantifizierung von Bakterien auf

Implantaten sehr schwierig ist (FREIRE 2011; LI ET AL. 2008; VERMA ET AL. 2010).

2.4. Staphylococcus aureus

Der am häufigsten bei Implantat-assoziierten Infektionen nachgewiesene Keim ist

S. aureus, welcher in diesem Zusammenhang für eine hohe Morbidität und Mortalität

verantwortlich gemacht wird (GREENSPON ET AL. 2008; SCHROEDER ET AL. 2009; SMITH

ET AL. 2008). Bei S. aureus handelt es sich um aerobe, grampositive Kokken mit

saprophytärem Vorkommen. Sie sind bei Menschen und Tieren hauptsächlich auf

der Haut und den Nasenschleimhäuten zu finden und führen erst durch bestimmte

Voraussetzungen, wie zum Beispiel ein hohes Alter oder eine Immundefizienz des


Patienten oder dem Verbringen einer hohen Keimlast in eine Operationswunde, zu

schweren Erkrankungen (ARCHER ET AL. 2011; GALLAGHER UND MERTENS 2012; KLOOS

UND BANNERMAN 1994). S. aureus ist unbeweglich, gehört zu den Koagulase-

positiven Staphylokokken und ist ein häufiger Erreger nosokomialer Infektionen

(DASCHNER ET AL. 2006; KLOOS UND BANNERMAN 1994; PFANZELT 2006; SHIRTLIFF ET AL.

2002). Die pathogenen Eigenschaften Koagulase-positiver Staphylokokken sind

abhängig von Virulenzfaktoren, welches in der Regel Zellwand-assoziierte Proteine

sind und wozu zum Beispiel das Protein A, Staphylokinase, DNasen, Lipasen,

Hyaluronidasen, Hämolysine und Leukozidine gehören (FOURNIER UND PHILPOTT

2005; HARRO ET AL. 2010; LINDE UND LEHN 2002). Die Expression der Virulenzfaktoren

ist unter anderem von Quorum-sensing-Mechanismen abhängig (ARCIOLA ET AL.

2011). Um eine manifeste Infektion zu verursachen, müssen in der Regel mehrere

Virulenzfaktoren in koordinierter Form vorhanden sein (FOURNIER UND PHILPOTT

2005). S. aureus induziert unter anderem am Knochen eine Entzündungsreaktion, an

der Mediatoren beteiligt sind, die die Aktion von Osteoblasten und Osteoklasten

beeinflussen können. S. aureus ist in der Lage in Osteoblasten eindringen und über

verschiedene Signalwege eine Apoptose induzieren (ALEXANDER ET AL. 2003;

ELLINGTON ET AL. 1999; WRIGHT UND NAIR 2010).

S. aureus kann einen mehrlagigen Biofilm bilden, der unter anderem aus Blut und

Gewebeflüssigkeit besteht (ARCHER ET AL. 2011; SHIRTLIFF ET AL. 2002). Außerdem

enthält dieser viel Fibrin, wodurch er widerstandsfähig gegen physikalische und

immunologische Einflüsse ist (NEMOTO ET AL. 2000). Zur Biofilmbildung durch

S. aureus sind unterschiedliche bakterieneigene Oberflächenproteine notwendig, um

die einzelnen Schritte der Biofilmbildung zu vollziehen (ABRAHAM UND JEFFERSON

2010; AKIYAMA ET AL. 1993; ARCIOLA ET AL. 2011; CAIAZZA UND O’TOOLE 2003;

HERRMANN ET AL. 1988; SCHROEDER ET AL. 2009). S. aureus kann über verschiedene

Signalwege eine Phagozytose durch neutrophile Granulozyten verhindern (ARCHER

ET AL. 2011; FOSTER 2005; GÜNTHER ET AL. 2009; THURLOW ET AL. 2011). Zudem

kommt es zu einer Thrombus-Bildung aus Thrombozyten und Fibrin, in denen die

Bakterien wachsen, aber nicht von den neutrophilen Granulozyten eliminiert werden

können (FOSTER 2005).


Die Behandlung einer Infektion mit einem S. aureus-Biofilm ist schwierig und

langwierig, da der Biofilm vor allem im ausgereiften Zustand weitestgehend resistent

gegen die körpereigene Abwehr und gegen antimikrobielle Therapien ist (ARCHER ET

AL. 2011; THURLOW ET AL. 2011).

3. Tiermodelle für die Untersuchung von Implantatin fektionen

Tiermodelle werden in der Forschung für unterschiedliche Zwecke verwendet. Dazu

gehören unter anderem die Erprobung neuer Materialien in der Implantologie oder

die präklinische Testung von Behandlungsmöglichkeiten, bevor diese Ansätze am

Patienten untersucht werden (AMORENA UND GRACIA 1999; HAENLE ET AL. 2013;

NORDEN 1988; STAVRAKIS ET AL. 2015). Ebenso ist es möglich, pathophysiologische

Vorgänge mit Hilfe von Tiermodellen besser zu verstehen (ARAD ET AL. 2013; FOSTER

2005). Für die Untersuchung von Implantatinfektionen gibt es bereits einige

Tiermodelle, wobei der Großteil dieser Modelle mit orthopädischen oder dentalen

Implantaten durchgeführt wurde (ALT ET AL. 2011; AN UND FRIEDMAN 1998; CHEN ET AL.

2005; FREIRE 2011; VERMA ET AL. 2010).

In der Regel werden Nager für solche Modelle verwendet, wie zum Beispiel Mäuse

oder Ratten. Die Haltung dieser Tiere ist einfacher und in höherer Zahl möglich als

bei größeren Tieren, wie Hund, Schwein oder Schaf. Ratten eignen sich sehr gut als

Modelltier, da sie nach der Maus das am zweitbesten untersuchte Versuchstier sind

und aufgrund ihrer Größe erlauben, komplexere Implantate als bei Mäusen zu

untersuchen. Das Genom der Ratte ist inzwischen vollständig sequenziert worden,

wobei bei vielen Genen, die für die Entstehung von Krankheiten verantwortlich sind,

Parallelen zum Menschen gefunden wurden (GIBBS ET AL. 2004). Ein weiterer Vorteil

von Nagern ist eine große kontrollierte genetische Variabilität, die im zukünftigen

Verlauf eines Modells verwendet werden könnte. So zeigen zum Beispiel einige

Stämme eine sehr hohe Inzidenz an Diabetes mellitus, welches unter anderem ein

Faktor ist, der die Infektionsraten von Implantaten deutlich erhöht. Durch die

Verwendung solcher Tiere können zusätzlich die Einflüsse verschiedener

Risikofaktoren evaluiert werden (HALLAK 2014; HEINONEN ET AL. 2015; STAVRAKIS ET


AL. 2015). Die Verwendung von Ratten als Modelltier birgt jedoch neben den

genannten Vorteilen vor allem für Infektionsversuche auch einige Nachteile. Ratten

haben ein sehr effektives Immunsystem, was dazu führt, dass Bakterien, die

aufgrund der angestrebten prädiktiven Validität häufig humanen Ursprungs sind, sehr

schnell eliminiert werden und es schwierig ist, chronische Infektionen insbesondere

unter Beteiligung von Biofilmen hervorzurufen, wie sie beim Menschen vorkommen

(OFLUOGLU ET AL. 2007).

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, das Immunsystem der Tiere zu beeinflussen,

um eine entsprechende Infektion durch humanpathogene Bakterien auszulösen. Ein

häufig gewählter Ansatz ist die Verwendung genveränderter, immundefizienter

Nacktratten zur Untersuchung solcher Infektionen (DRAKE ET AL. 2011; OHASHI ET AL.

1999). Die Kosten für die Anschaffung sind jedoch verhältnismäßig hoch. Zudem

sind die Haltung und das Handling der Ratten insbesondere bei chirurgischen

Eingriffen vergleichsweise schwierig (JÄCKEL 2012).

Ein weiterer Ansatz wäre eine pharmakologische Immunsuppression der Tiere. Für

diesen Zweck ist oft die Behandlung mit Ciclosporin A (CSA) das Mittel der Wahl und

wurde schon in mehreren Tiermodellen erfolgreich verwendet (HANDRECK ET AL.

2015; DA SILVA PERALTA ET AL. 2015; ZIJLSTRA ET AL. 2009). Das Einsatzgebiet liegt

hauptsächlich in der Transplantationsmedizin, wo es zur Verhinderung von

Transplantatabstoßungen eingesetzt wird (SCHRAMM 2005). CSA beeinflusst durch

die spezifische Hemmung der T-Zellen die zelluläre Immunantwort und wird als

Calcineurin-Inhibitor eingestuft (SCHRAMM 2005; STUCKER UND ACKERMANN 2011). Die

Calcineurin-Hemmung wird durch eine Komplexbildung von CSA und Cyclophilin

erreicht, welches ein immunkompetentes Protein in den T-Helferzellen ist

(LADENBURGER 2003; LIU ET AL. 1991). Es erfolgt eine Blockade von aktivierten T-

Lymphozyten und zusätzlich wird die Antigen-Erkennung durch T-Zellen über

mehrere Signalwege gehemmt (ALLISON 2000; SCHRAMM 2005). CSA zeigt jedoch

relativ starke Nebenwirkungen und eine geringe therapeutische Breite (CURTIS ET AL.

1986; PADOVAN ET AL. 2002; STUCKER UND ACKERMANN 2011).

Eine Alternative zur Immunsuppression der Tiere stellt die Verwendung von


rattenpathogenen Keimen dar, um die schnelle Eliminierung von Bakterien durch das

Immunsystem zu erschweren und eine der humanen chronischen Erkrankung

ähnliche Infektion zu simulieren (MEISSNER 1959). Auch bei Ratten kommen normale

S. aureus - Stämme auf der Haut vor, sodass vor allem durch spezifisch pathogene

Keime eine erkennbare Entzündung hervorgerufen werden kann.

Es gibt bereits zahlreiche Implantatmodelle, die allerdings in manchen Aspekten

optimierbar sind. Man findet zum Beispiel häufig eine Vorbesiedlung der Implantate

mit Bakterien in vitro, was jedoch nicht der tatsächlichen Ursache einer

Implantatinfektion, nämlich der intraoperativen Kontamination oder der

postoperativen, hämatogenen Absiedlung von Bakterien an dem Fremdmaterial,

entspricht (BRAXTON ET AL. 2005; CAMPOCCIA ET AL. 2013; KLOOS UND BANNERMAN

1994). Zum Beispiel inkubierte FREIRE (2011) Implantate für die Maulhöhle bis zu drei

Tage in einer Aggregatibacter actinomycetemcomitans-Lösung, sodass zum

Zeitpunkt der Implantation bereits ein maturer Biofilm vorhanden war. Die Gruppe um

INZANA ET AL. (2015) inkubierte Implantate zur Auslösung einer Osteomyelitis

mindestens zwei Stunden vor der Operation in einer S. aureus-Lösung, sodass die

Bakterien zum Zeitpunkt der Implantation bereits am Implantat angeheftet sein

konnten. Ebenfalls wurden Zeiten von vier Stunden oder 20 Minuten bei den

Versuchen von SNOWDEN ET AL. (2012) oder LI ET AL. (2008) verwendet, um eine

solche Anheftung zu realisieren.

Zusätzlich findet man häufig lange Standzeiten der Tiere nach der Implantation. So

nutzen VERMA ET AL. (2010) in einem Infektionsmodell in der Mundhöhle von Ratten

Standzeiten von sieben bis zu zwölf Wochen. Ebenfalls findet man häufiger

Standzeiten von vier bis sechs Wochen in der Literatur (HAENLE ET AL. 2013; LUCKE ET

AL. 2003). Diese langen Zeiträume führen sowohl zu einer hohen Belastung der Tiere

und gleichzeitig zu einer geringen Praktikabilität für die Experimentatoren, um das

Modell regulär für Testungen neuer Materialien oder Oberflächen zu nutzen.

Zusätzlich sind solche langen Zeiten teuer aufgrund der langen Tierhaltung und des

sehr hohen Arbeitsaufwandes.


Gleichzeitig ist es bei der Entwicklung eines Modells wichtig, geeignete Methoden

zur Auswertung zu wählen. Diese sollten die Bakterien auf der Implantatoberfläche

nachweisen, eine Unterscheidung von planktonischen Bakterien und einem Biofilm

zulassen und gleichzeitig zumindest eine Semiquantifizierung der Keime

ermöglichen. Zusätzlich sollte die Entzündungsreaktion im umgebenden Gewebe

beurteilt werden, da diese eine sehr große Rolle bei Implantatversagen spielt.

Häufig werden die PCR oder eine mikrobielle Kultivierung zum Bakteriennachweis

verwendet. Beide Methoden wurden bereits in Kapitel 2.3.2. erörtert. Ebenfalls ist bei

bisherigen Modellen häufig zu finden, dass die Experimentatoren das

Hauptaugenmerk ausschließlich auf den Bakteriennachweis gelegt haben und die

umgebende Entzündungsreaktion vollständig vernachlässigt wurde. Ein Modell, bei

dem beides ausführlich ausgewertet wird, ist selten zu finden. Zum Beispiel haben

POELSTRA ET AL. (2000) und HAENLE ET AL. (2013) bei der Auswertung ausschließlich

Bakterien nachgewiesen. CHEN ET AL. (2014) haben eine Kombination aus einer PCR

und einer Kultivierung von Bakterien durchgeführt, die Entzündung wurde nur durch

eine makroskopische Beurteilung evaluiert. Ebenso haben ARAD ET AL. (2013) nur

vorhandene Bakterien nachgewiesen, welche einerseits mit Hilfe einer

Ultraschallbehandlung vom Implantat abgelöst und anschließend angezüchtet

wurden. Außerdem wurde noch mit einem Elektronenmikroskop die

Implantatoberfläche untersucht und somit Bakterien direkt auf dem Implantat

nachgewiesen. Die wahrscheinlich vorhandene Entzündung im umgebenden

Gewebe wurde nicht evaluiert. Neben einer Anzüchtung und einer PCR wurde ein

direkter Nachweis von Bakterien auf dem Implantat von FREIRE (2011) mit einem

konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) durchgeführt. Vorteil dieser Methode

war die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Bakterien, sowie der

gleichzeitige direkte Nachweis der Bakterien auf dem Implantat. Die

Entzündungsreaktion wurde jedoch nicht beurteilt. Eine Kombination aus Bakterien-

Anzüchtung und histologischer Auswertung der umgebenden Entzündung infolge

einer Osteomyelitis zeigten JOHANSEN ET AL. (2012), OFLUOGLU ET AL. (2007) und

LUCKE ET AL. (2003), wobei der Bakteriennachweis nur mittels Anzüchtung erfolgte

und somit die bereits genannten Nachteile aufwies. Eine sehr umfassende


Auswertung zeigten SNOWDEN ET AL. (2012). Hier wurde nach Infektion eines

cerebroventriculären Katheters neben dem Nachweis von Bakterien mittels

Elektronen-Mikroskop, CLSM, Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) und

einer Anzüchtung aus einer Lösung von Bakterien, die mit Ultraschall vom Implantat

gelöst worden waren, auch das Gehirngewebe auf Entzündungsanzeichen

untersucht.

All diese Beispiele zeigen, dass ein praktikables Modell notwendig ist, mit dem direkt

eine Biofilmbildung am Implantat nachgewiesen werden kann und gleichzeitig auch

die Entzündungsreaktion des umgebenden Gewebes beurteilt wird.

4. Fragestellung

In dieser Arbeit soll ein Rattenmodell zur Untersuchung der Biofilmbildung und der

begleitenden Entzündungsreaktion an chirurgischen Titan-Implantaten entwickelt und

charakterisiert werden. Hierbei wird eine intraoperative Besiedlung der Implantate zur

Simulierung einer Kontamination während eines operativen Eingriffes gewählt. Die

Nutzung eines rattenpathogenen S. aureus-Stammes und die Verwendung

immunsupprimierter Ratten mit CSA im Vergleich zu unbehandelten

immunkompetenten Ratten soll eine chronische Reaktion und Biofilmbildung

ermöglichen. Außerdem sollen unterschiedliche Standzeiten getestet werden, um

den zeitlichen Verlauf der Bakterienentwicklung und der assoziierten Entzündung zu

evaluieren.

Die Bakterien sollen durch eine CLSM-Untersuchung direkt auf dem Implantat

nachgewiesen werden, wobei eine semiquantitative Auswertung angestrebt wird.

Gleichzeitig erfolgt eine Beurteilung der Entzündung des umliegenden Gewebes

durch eine histologische Auswertung des Knochens mit angrenzendem

Weichgewebe.

III. Material und Methoden 20

III. MATERIAL UND METHODEN

1. Versuchstiere

Es wurden für den Versuch weibliche Sprague-Dawley Ratten (Stammcode: Crl:CD

(SD)) mit einem Gewicht von 210 - 260 g verwendet (Charles River, Sulzfeld). Die

Tiere wurden für den Versuchszeitraum im Tierhaltungsbereich des CrossBIT

Forschungszentrums, Hannover gehalten.

Die Ratten wurden in einem klimatisierten Raum (Temperatur 22 °C ± 2 °C; relative

Luftfeuchte 55% ± 10%) mit einem Tag-/Nacht-Rhythmus (14 h/ 10 h) mittels

Kunstlicht in Typ IV-Käfigen mit hohem Deckel (1800 cm2; Makrolon®-Käfige,

Tecniplast Deutschland, Hohenpeißenberg) in Gruppengrößen bis zu fünf Tieren pro

Käfig gehalten. Leitungswasser und ein pelletiertes Haltungsfutter (Altromin 1324

TPF, Altromin Spezialfutter, Lage) stand den Tieren ad libitum zur Verfügung. Nach

einer Akklimatisierungsphase von sieben Tagen wurde mit den Experimenten

begonnen.

Die Durchführung des Tierversuches wurde genehmigt vom Niedersächsischen

Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES). Der

genehmigte Tierversuchsantrag trägt das Aktenzeichen 14/1526.

2. Ablauf des Tierversuches

2.1. Versuchsgruppen

Allen Tieren wurden zwei Titan-Schrauben (Gebr. Brasseler, Lemgo) unter

Vollnarkose in die Schädelkalotte implantiert. Bei der Hälfte der Tiere wurden diese

Implantate intraoperativ mit S. aureus besiedelt. In der Kontrollgruppe wurde anstelle

der Bakterienlösung PBS (Biochrom, Berlin) verwendet. Die Tiere wurden abhängig

von der Immunkompetenz in zwei Gruppen eingeteilt, es wurden immunkompetente

Ratten (naiv) und pharmakologisch immunsupprimierte Tiere (CSA); Sandimmun®,


Novartis Pharma, Nürnberg) verwendet. Sowohl die infizierte Versuchsgruppe, als

auch die Kontrollgruppe bestand aus naiven und pharmakologisch

immunsupprimierten Tieren. Postoperativ wurden die Tiere zwei, zehn und 21 Tage

nach der Operation zur Probenentnahme euthanasiert, um den Einfluss der Zeit auf

das Bakterienwachstum und die Entzündungsreaktion zu evaluieren. Eine Übersicht

über die Versuchsgruppen mit jeweils n = 7 Ratten gibt Tabelle 1.

Tabelle 1: Übersicht über die Versuchsgruppen. Behandlung intraoperativ Immunstatus Standzeit

2 Tage 10 Tage Naiv 21 Tage 2 Tage

10 Tage

PBS, 5 µl

Immunsupprimiert (CSA) 21 Tage 2 Tage

10 Tage Naiv 21 Tage 2 Tage

10 Tage

Staphylococcus aureus, 5x107 KBE in 5 µl

Immunsupprimiert (CSA) 21 Tage

2.2. Anzüchtung und Konzentration der Bakterien

Bei den verwendeten Bakterien handelte sich um einen rattenpathogenen S. aureus-

Stamm (36/07), der vom Institut für Versuchstierkunde und Zentrales

Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover isoliert und uns zur

Verfügung gestellt wurde. Die Bakterien wurden in der Klinik für Zahnärztliche

Prothetik und Biomedizinische Werkstoffkunde der Medizinischen Hochschule

Hannover angezüchtet und für die intraoperative Besiedlung der Implantate

vorbereitet.

Es wurde eine aerobe Vorkultur der Bakterien in 5 ml Tryptic Soya Broth (TSB)

(Oxoid, ThermoFisher Scientific, Wesel) hergestellt, welchem 15 mg Yeast extract

(Carl Roth, Karlsruhe) zugegeben wurden. Diese wurde 18 Stunden bei 37 °C im

Schüttelinkubator inkubiert. Zur Herstellung der Keimsuspension wurde mit Hilfe


eines Photometers (BioPhotometer, Eppendorf, Hamburg; Wellenlänge 600 nm) eine

optische Dichte (OD) von 0,794 in der Vorkultur eingestellt. Im Anschluss wurden

davon 10 ml für 15 min mit 4000 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert

(Multifuge 1S-R, Thermo40Scientific, Waltham, USA) und der Überstand

anschließend abgegossen. Das entstandene Pellet wurde in 50 ml PBS

resuspendiert und erneut 15 min mit 4000 U/min zentrifugiert. Das zuletzt

entstandene Pellet wurde in 200 µl PBS resuspendiert, wodurch diese Suspension

eine Bakterienkonzentration von 1010 KBE/ml enthielt.

2.3. Operativer Eingriff

Vor der Operation wurde jedem Tier Metamizol (Novalgin® Tropfen 500 mg/ml;

WDT, Garbsen) in der Dosierung von 200 mg/kg Körpergewicht (KGW) oral

verabreicht um eine Analgesie während und nach der Operation zu gewährleisten.

Die Anästhesie wurde mit einer intra-peritonealen Injektion (i.p.) (1 ml Spritzen:

Injekt-F, Tuberkulin; B.Braun, Melsungen) von Xylazin (Sedaxylan® 20 mg/ml

Injektionslösung für Tiere; WDT, Garbsen; Dosierung 4 mg/kg KGW) und Ketamin

(Ketamin 10%; WDT, Garbsen; Dosierung 75 mg/kg KGW) eingeleitet. Sobald die

Ratten nach der Injektion keine Reflexe mehr zeigten, wurde das Operationsfeld

geschoren (Aesculap Exacta; B. Braun, Melsungen). Anschließend wurden die

Ratten in einem stereotaktischen Rahmen (Stoelting Co., Wood Dale, USA) mittels

abgerundeter Ohrenstifte (45° Spitze) in den äußeren Gehörgängen und einem

Gebisshalter zum Einhaken der Schneidezähne fixiert. Auf beide Augen wurde

Bepanthen Augen- und Nasensalbe (Bayer, Leverkusen) aufgetragen um ein

Austrocknen während der Operation zu verhindern. Das rasierte Operationsfeld

wurde mit 70-prozentigem Ethanol (Th. Geyer, Hamburg) desinfiziert und es wurde

das Lokalanästhetikum Prilocain (Xylonest® 2%, AstraZeneca, Wedel) im

Operationsfeld aufgetragen. Daraufhin wurde ein etwa 2 cm langer Hautschnitt in der

Medianen über dem Schädelkalotte gemacht (Skalpell Nr. 10; pfm medical ag, Köln)

und die Haut seitlich mittels Klemmen (Bulldog Serrefine, 35 mm Länge, gerade;

Fine Science Tools, Heidelberg) fixiert, sodass das Operationsfeld frei lag. Mit Hilfe

des Skalpells wurde das Periost im Bereich der geplanten Implantation entfernt.


Nun wurde mit einer Handbohrmaschine (Minimot 40/E; PROXXON Micromot

Systems, Föhren) mit dem passenden Mikrobohrer (0,5 mm; PROXXON Micromot

Systems, Föhren) die Schädelkalotte rechts und links der Medianen angebohrt zum

späteren Einschrauben der Implantate (Abbildung 1a). Zur Besiedlung der

Implantate wurde in jedes Bohrloch 5 µl Bakteriensuspension mit der Konzentration

von 1010 Keime/ml gegeben, es wurden also jeweils 5 x 107 Keime eingebracht.

Vorangegangene Studien zeigten, dass dies eine adäquate Bakterienkonzentration

zur Auslösung einer Implantat-assoziierten Infektion darstellt (AN UND FRIEDMAN 1998;

CHEN ET AL. 2009; RUPP ET AL. 1999). In der Kontrollgruppe wurden je 5 µl PBS in die

Bohrlöcher eingegeben. Anschließend wurde mit einem passenden Applikator (Gebr.

Brasseler, Lemgo) jeweils eine Titan-Schraube (Gewinde: 1,0 mm Durchmesser;

2,3 mm Länge; Gebr. Brasseler, Lemgo; Abbildung 1b) rechts und links der

Medianen in die Schädelkalotte in die vorgebohrten Löcher geschraubt.

Nach Platzierung der Schrauben wurde die Haut mit einer Nadel-Faden-Kombination

(4/0 USP, Polyamid; Resorba®, Nürnberg) vernäht. Dafür wurde als Nahtmuster ein

einfaches U-Heft verwendet um eine gute Adaptation und eine breite

Berührungsfläche der Wundränder zu gewährleisten. Nach der Operation wurde den

Tieren Kochsalzlösung (5 ml i.p., Natrium-Chlorid 0,9%; B. Braun, Melsungen)

appliziert (Spritze: 5 ml, B. Braun, Melsungen; Kanüle: 100 Sterican, 23 Gx1“; B.

Braun, Melsungen) um einer Dehydratation vorzubeugen.

Abbildung 1: Zeichnung der knöchernen Schädeloberfläche (verändert nach Paxinos and Watson 1998) zur Darstellung der Implantationsstellen beidseits zwischen Bregma und Lambda (Pfeile; a). Abbildung der verwendeten Schrauben auf Millimeterpapier (b).


2.4. Postoperative Behandlung

Nach der Operation wurden die Tiere einzeln in Typ III-Käfige mit hohem Deckel

(810 cm2, 18 cm Höhe, Makrolon®-Käfige, Tecniplast Deutschland,

Hohenpeißenberg) und Filterdeckel gesetzt um ein ungestörtes Erwachen zu

gewährleisten. Wenn die Tiere am folgenden Tag ein gutes Allgemeinbefinden

zeigten und die Naht trocken und gut adaptiert war, wurden die Tiere mit infizierten

Implantaten in Gruppen zu zwei Tieren in einen Typ III-Käfig mit Filterdeckel gesetzt.

Die Kontrolltiere wurden wie bereits vor der Operation zu fünf Tieren in einem Typ IV-

Käfig gehalten.

Anschließend wurde täglich das Allgemeinbefinden der Tiere kontrolliert. Zur

Bewertung wurde das Schema nach GRIENSVEN UND DAHLWEID (2002) verwendet, wie

in Tabelle 2 beschrieben.

Tabelle 2: Bewertungsschema zur Beurteilung des Allgemeinbefindens nach GRIENSVEN UND DAHLWEID (2002)

Punkte Bewertung Kriterien 1 sehr aktiv kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen, normale

Futteraufnahme 2 aktiv kräftig, neugierig, gelegentliche Unterbrechungen in

der Aktivität, normale Futteraufnahme 3 weniger aktiv adäquate Antworten auf exogene Reize, häufige

Unterbrechungen in der Aktivität, ggf. verminderte Futteraufnahme

4 ruhig schläfrig, langsame Bewegungen, stark verminderte Futteraufnahme

5 apathisch keine Aktivität, bewegungsarm, keine Futteraufnahme

Bei einer Bewertung von > 2 wurde den Tieren einmal täglich Metamizol (200 mg/kg

oral; Novalgin® Tropfen 500 mg/ml; WDT, Garbsen) verabreicht. Außerdem wurde

am Tag nach der Operation und nachfolgend mindestens dreimal pro Woche das

Gewicht der Tiere bestimmt.

Die Abbruchkriterien für den Versuch waren so definiert, dass während des

gesamten Versuchsverlaufes im Falle eines Gewichtsverlustes von über 20% oder

einem Allgemeinbefindens mit einem Score von 4 oder schlechter das


entsprechende Tier sofort euthanasiert wurde.

Den Tieren, die pharmakologisch immunsupprimiert wurden, wurde ab einem Tag

vor der Operation täglich zur gleichen Tageszeit CSA in einer Dosierung von

10 mg/kg KGW i.p. injiziert (2 ml Spritze, B. Braun, Melsungen). Bei den behandelten

Tieren wurde täglich das Gewicht bestimmt, da die therapeutische Breite von CSA

gering ist und somit eine möglichst genaue Dosierung erforderlich ist. Es wurde eine

1:25 Verdünnungslösung hergestellt (1 ml Ciclosporin A 50 mg/ml (Sandimmun®,

Novartis Pharma, Nürnberg) und 24 ml Natrium-Chlorid 0,9% (B. Braun,

Melsungen)), wovon den Tieren einmal täglich 0,5 ml/100 g KGW appliziert wurde.

Dieses Vorgehen zur Immunsuppression mit CSA wurde bereits mehrfach

beschrieben und ist mit einem Blutspiegel im therapeutischen Bereich von über

200 ng/ ml verbunden (HANDRECK ET AL. 2015; REIS ET AL. 1998; DA SILVA PERALTA ET

AL. 2015). Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieser Wert stichprobenartig überprüft.

2.5. Entnahme der Blutproben und weitere Bearbeitun g

Die Tiere wurden an Tag zwei, zehn oder 21 nach der Implantation der Schrauben

mittels einer Überdosis Ketamin und Xylazin euthanasiert. Sobald die Tiere keine

Reflexe mehr zeigten, wurde bei zwei zufällig ausgewählten Tieren pro

immunsupprimierter Gruppe Blut abgenommen. Dies erfolgte mittels retrobulbärer

Punktion mit Kapillaren (Natrium-Heparin Mikro-Hämatokrit Kapillaren; Brand,

Wertheim), wobei das Blut in EDTA-beschichteten Eppendorf-Gefäßen (Probengefäß

K3E; Sarstedt, Nümbrecht) aufgefangen wurde. Diese Stichproben sollten

sicherstellen, dass die Tiere einen Blutspiegel von CSA im therapeutischen Bereich

oberhalb von 200 ng/ ml aufwiesen.

Die Blutproben wurden bis zur Untersuchung bei -80 °C eingefroren. Die Analyse des

Blutes wurde im Labor für Klinische Chemie der Medizinischen Hochschule

Hannover mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektometrie

durchgeführt (LC-MS/MS).


2.6. Entnahme der Implantate und Schädelkalotten un d deren weitere

Bearbeitung

Nach Aussetzen der Atmung wurden die Tiere dekapitiert und anschließend wurde

die Haut über der Schädelkalotte eröffnet (Skalpell Nr. 10; pfm medical ag, Köln).

Nach der Freilegung der Schraubenköpfe wurden diese mittels des Applikators

(Gebr. Brasseler, Lemgo) aus der Schädelkalotte gedreht. Die Schrauben wurden

jeweils einzeln in ein Eppendorf-Gefäß (Reagiergefäß 1,5 ml easy cap; Sarstedt,

Nümbrecht) mit 1 ml PBS gegeben, damit das anhaftende Gewebe und der

gegebenenfalls vorhandene Biofilm nicht austrockneten. Eventuell vorhandene

planktonische Bakterien am Implantat wurden so schon teilweise abgelöst, während

fest anhaftender Biofilm sich nicht vom Implantat löst. Im Anschluss wurden die

Schädelkalotten der Ratten mit einer Knochenzange (Bone Pliers; Fine Science

Tools, Heidelberg) abgetragen und zur Fixierung in 4-prozentiges Formalin (10%

gepufferte Formalin-Lösung, Sigma Aldrich, Seelze; verdünnt auf 4% mit PBS)

gegeben. Von den beiden Schrauben wurde jeweils eine Schraube pro Tier unter

dem CLSM (Leica DM LFSA; Leica Mikrosysteme, Wetzlar) untersucht. Das zweite

Implantat wurde für etwaige spätere Analysen bei -80 °C eingefroren. Die

Schädelkalotten wurden für eine ausreichende Fixierung mindestens einen Tag in

Formalin gelagert. Danach wurden sie zur histologischen Untersuchung vorbereitet.

3. Auswertung der Proben

3.1. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie der Impla ntate

Zur Untersuchung der Implantate mittels des CLSM wurden die Schrauben zur

weitgehenden Entfernung planktonischer Bakterien zunächst mit 4 ml PBS gespült.

Danach erfolgte eine Lebend-Tot-Färbung (Life Technologies, ThermoFisher

Scientific, Wesel) mit anschließender Fixierung (siehe Tabelle 3). Hierzu wurden die

Farbstoffe Propidiumjodid und Syto 9 1:1000 mit PBS (je 1 µl Farbstoff + 1 ml PBS)

gemischt. Syto 9 kann alle Membranen durchdringen und färbt daher alle Zellen an,

während Propidiumjodid nur bereits beschädigte Membranen durchdringt und somit


nur die DNS von toten Bakterien anfärbt (FREIRE 2011; HANNIG ET AL. 2010). Die

Schrauben wurden mit der Färbelösung bedeckt und für 15 min im Dunkeln inkubiert.

Danach wurde die Farbstofflösung abgezogen. Für die anschließende Fixierung

wurden die Schrauben in einer 2,5-prozentigen Glutardialdehydlösung (Verdünnung

1:10, 25% Glutardialdehyd (Carl Roth, Karlsruhe) mit PBS) für 15 min im Dunkeln

inkubiert. Die Schrauben konnten noch kurzfristig bis zur Mikroskopie in PBS bei

4 °C im Dunkeln gelagert werden. Die maximale Farbstabilität lag bei etwa 24 h.

Tabelle 3: Färbung und Fixierung der Schrauben

Medium Zeit

Färbung Propidiumjodid + Syto 9 (Verdünnung 1:1000 in PBS)

15 min im Dunkeln

Fixierung 2,5% Glutardialdehyd 15 min im Dunkeln

Bei dem verwendeten Mikroskop handelt es sich um das Auflichtmikroskop Leica DM

LFSA (Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Wetzlar). Die Proben wurden in einer

Flüssigkeits-Immersion (PBS als Immersionslösung) mit einem Laser mit einer

emittierten Wellenlänge von 488 nm untersucht. Durch die Färbung wurden lebende

Zellen bei dem verwendeten Laser in grün angezeigt, tote Zellen hingegen rot. Eine

gelbe Farbe kam durch die Überlagerung der Farben grün und rot zustande. Dies ist

unter anderem der Fall bei metabolisch inaktiven Bakterien, da diese eine etwas

erhöhte Zellpermeabilität haben und somit das Propidiumjodid zumindest teilweise in

die Bakterien eindringen kann (FREIRE 2011).

Bei der Untersuchung der Schrauben am CLSM wurden die detektierten Bakterien

nach einem Scoring-System eingeteilt (Tabelle 4). Wurden keine Bakterien detektiert,

wurde der Score 0 vergeben. Ein Score von eins stand für diffus verteilte Bakterien

oder sehr kleine Mikrokolonien aus einzelnen Bakterien. Bei einer größeren, gut

abgegrenzten Mikrokolonie ergab sich ein Score von zwei. Der Score drei stand für

die Detektion von zwei bis zu fünf Mikrokolonien. Bei mehr als fünf Mikrokolonien

wurde der Score vier vergeben und eine sehr große Biofilmformation wurde mit

einem Score von fünf bewertet.


Tabelle 4: Score zur Bewertung der Bakterien auf den Schrauben im CLSM mit jeweils einer repräsentativen Aufnahme. Die unterschiedliche Größe der Maßstäbe kommt durch die Einstellungen am Mikroskop zustande.

Score 0 Score 1 Score 2

Keine Bakterien vorhanden (bei den angefärbten Strukturen

handelt es sich um Zellen)

Diffus verteilte Bakterien (kleine grüne Punkte)

Eine abgegrenzte Mikrokolonie (Pfeil)


2 - 5 Mikrokolonien (Pfeile) > 5 Mikrokolonien (Pfeile) Sehr große

Biofilmformationen (über das komplette Bild)


3.2. Histologie der Schädelkalotten

3.2.1. Einbettung in Technovit

Die Knochenproben wurden in Technovit 9100 (Heraeus Kulzer, Wehrheim)

eingebettet. Das ist ein Polymerisationssystem auf der Basis von Methylmethacrylat

(MMA), das der Einbettung von mineralisiertem Gewebe dient. Durch die

Hartschnitttechnik ist die Untersuchung mit einem Lichtmikroskop möglich.

Zu diesem Kunststoffeinbettungssystem gehören mehrere Komponenten. Die erste

Komponente ist die Basisflüssigkeit, welche aus stabilisiertem MMA besteht und für

die weitere Verwendung mit Aluminiumoxid (Carl Roth, Karlsruhe) entstabilisiert wird.

Dafür werden 800 ml Basisflüssigkeit mit 48 g Aluminiumoxid für eine Stunde

inkubiert und anschließend filtriert. Die zweite Komponente ist das

Polymethylmethacrylat- (PMMA-) Pulver, welches für einen reibungslosen

Polymerisationsablauf notwendig ist. Des Weiteren gehören die Härter 1 und 2 zu

Technovit 9100, welche zusammen die Polymerisation starten. Zusätzlich wird noch

ein Regler benötigt, der für eine gute Polymerisation sorgt.

Die Bearbeitung der Knochenproben verlief in mehreren Schritten. Zuerst wurden die

Proben fixiert. Darauf folgten die Dehydratation, die Präinfiltration, die Infiltration und

schließlich die Polymerisation. Ein Überblick über die einzelnen Schritte bietet

Tabelle 5.

Nach der Fixation der Schädelkalotten in 4-prozentigem Formalin erfolgte die

Dehydratation über sechs Tage mit einer aufsteigende Alkoholreihe aus 70-

prozentigem Ethanol, 96-prozentigem Ethanol (Th. Geyer, Hamburg) und

Isopropanol (Carl Roth, Karlsruhe) und abschließend dem Intermedium Xylol (Carl

Roth, Karslruhe). Die Proben wurden jeweils 48 h in dem entsprechenden Medium

inkubiert, wobei dreimal täglich das Medium erneuert wurde. Die komplette

Dehydratation erfolgt bei Raumtemperatur auf einem Rüttler (IKA-Vibrax VXR; IKA,

Staufen).

Anschließend erfolgte die Präinfiltration, wofür eine Lösung aus 500 ml

entstabilisierter Basislösung mit 2,5 g Härter 1 angesetzt wurde. Die Proben wurden


darin drei Tage bei 4 °C inkubiert. Es folgte die Infiltrationsphase in einer Lösung, die

aus 250 ml Präinfiltrationslösung mit 20 g gelösten PMMA-Pulver bestand. Die

Proben inkubierten sieben Tage bei 4°C in der Infiltrationslösung.

Der letzte Schritt zur Einbettung der Proben stellte die Phase der Polymerisation dar.

Dafür wurden die Stammlösung A aus 250 ml entstabilisierter Basislösung, 40 g

PMMA-Pulver und 1,5 g Härter 1 und die Stammlösung B aus 25 ml entstabilisierter

Basislösung, 2 ml Härter 2 und 1ml Regler angesetzt. Aus beiden Lösungen wurde

das Polymerisationsgemisch hergestellt, welches sofort verwendet werden musste,

da die Polymerisation direkt nach der Mischung der beiden Stammlösungen beginnt.

Nach der Einbettung der Proben in der Polymerisationslösung in den

entsprechenden Förmchen (Polyethylen-Einbettförmchen, Heraeus Kulzer,

Wehrheim) wurde mittels eines Vakuumexsikkators (VacuBottle System; Inotech

LabLogic Systems, Brandon, USA) ein Vakuum erzeugt, um vorhandene Luft aus der

Polymerisationslösung zu entfernen, da diese die Polymerisation behindert. Zur

Aushärtung wurden die Proben anschließend für mindestens 48 h bei 4 °C gelagert.

Danach war die Polymerisation abgeschlossen und die Blöcke konnten aus den

Förmchen gelöst werden.

Tabelle 5: Protokoll für die Dehydratation und Einbettung in Technovit 9100 Medium Zeit Temperatur

70% Ethanol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur 96% Ethanol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur Isopropanol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur

Xylol 2 Tage (3x Mediumwechsel/ Tag) Raumtemperatur Präinfiltratioslösung 3 Tage 4°C Infiltrationslösung 7 Tage 4°C

Polymerisationslösung 2 Tage 4°C

3.2.2. Erstellung der histologischen Schnitte

Vor dem Schneiden der Technovit-Blöcke wurden die Objektträger

(SuperFrost®Plus, Menzel, Braunschweig) mit einer Poly-L-Lysine Stammlösung

(Sigma-Aldrich, Seelze) und Ponal Express Holzleim (Henkel AG, Düsseldorf)

beschichtet. Hierfür wurden 3 g Ponal Express in 150 ml vollentsalztem (VE-)

Wasser gelöst und 7,5 ml Poly-L-Lysine mit 75 ml VE-Wasser verdünnt. Beide


Lösungen wurden gemischt und die sauberen Objektträger für 10 min in diese

Lösung gestellt. Danach mussten die Objektträger vor der Benutzung noch 24 h bei

37 °C trocknen.

Von den Blöcken wurde mit Hartschnitttechnik an einem Rotationsmikrotom (Leica

RM 2165; Leica, Wetzlar) und dem entsprechenden Messer (16 cm

Hartmetallschneide, Profil c; Leica, Wetzlar) Dünnschnitte mit einer Dicke von 5 µm

angefertigt. Die Schnitte wurden mit einer Polyethylen-Folie (Heraeus Kulzer,

Wehrheim) abgedeckt und in einer Objektträgerpresse (Heraeus Kulzer, Wehrheim)

bei 37 °C mindestens 48 h getrocknet.

Entplastung

Für die anschließende Hämalaun-Eosin-Färbung (HE-Färbung) war eine Entplastung

der Technovit-Schnitte erforderlich. Hierfür wurden die Schnitte dreimal 20 Minuten in

2-Methoxyethylacetat (MEA; Merck, Darmstadt) inkubiert.

Färbung

Anschließend wurden die Schnitte mit einer HE-Färbung angefärbt. Dies ist eine weit

verbreitete Standardfärbung, wobei es sich um eine Doppelfärbung mit zwei

Farbstoffen handelt. Hämalaun ist ein positiv geladener Farbstoff, der an saure

Gewebebestandteile bindet und somit eine blaue Kernfärbung hervorruft. Bei Eosin

handelt es sich um einen negativ geladenen Farbstoff, der an positiv geladenen

Gewebebestandteilen bindet und diese in unterschiedlichen Rottönen färbt (OTT

2011). Eine Übersicht der anfärbbaren Gewebestrukturen mittels HE-Färbung bietet

Tabelle 6.

Tabelle 6: Färbung der verschiedenen Strukturen mit Hämalaun-Eosin Gewebestruktur Färbung

Kerne Blau (Hämalaun)

Zytoplasma Rosa - Rot (Eosin)

Bindegewebe Rosa (Eosin)

Knochen Rosa – Rot (Eosin)

Bakterien (basophil) Blau (Hämalaun)


Für die HE-Färbung wurde ein Standard-Protokoll verwendet, das in Tabelle 7

aufgeführt ist.

Tabelle 7: Protokoll für die HE-Färbung Reagenz Zeit

100% Ethanol 5 min

96% Ethanol 2 min

70% Ethanol 2 min

Aqua dest. 2 min

Hämalaun (Merck, Darmstadt) 15 min

Warmes Leitungswasser Kurz spülen

0,3% Salzsäure (in 70% Ethanol) 10 sec

Fließendes Leitungswasser (warm) 10 min

Aqua dest. 2 x dippen

96% Ethanol 15 sec

Eosin (AppliChem, Darmstadt) 15 sec

96% Ethanol 2 x dippen

96% Ethanol 2 min

100% Ethanol 2 x 2 min

Roti-Histol + 100% Ethanol 5 min

Roti-Histol (Carl Roth, Karlsruhe) 2 x 5 min

Danach wurden die Schnitte eingedeckt (Menzel-Gläser 24 x 60 mm, Menzel,

Braunschweig; Vitro-Clud®, Langenbrinck, Emmendingen) und unter einem

Lichtmikroskop beurteilt.

3.2.3. Histologische Beurteilung der Knochenschnitt e

Die Beurteilung der gefärbten Knochenschnitte erfolgte mit einem Lichtmikroskop

(AXIO, Zeiss, Peine). Hierfür wurde ein Scoring-System zur Beurteilung der

Entzündungszellen im Gewebe, des Knochenumbaus, der Fremdkörper-Reaktion

und der Fibrose entwickelt und angewendet. Die Bewertung der Entzündung, des

Knochenumbaus durch Osteoklasten und der Fremdkörper-Riesenzellen erfolgte

quantitativ mittels Zellzählung (siehe Tabelle 8 bis 11).


Als Entzündungszellen wurden vor allem neutrophile Granulozyten und Lymphozyten

in dem den Knochen umgebenden Weichgewebe gefunden. Es wurden jeweils drei

Gesichtsfelder in der 40fachen Vergrößerung ausgezählt und davon der Mittelwert

gebildet. Die Scorewerte gingen von null bis fünf, wobei null für keine vorhandenen

Entzündungszellen stand und ein Wert von fünf über 320 Entzündungszellen pro

Gesichtsfeld entsprach. Die Werte von eins bis vier wurden gleichmäßig dazwischen

verteilt (Tabelle 8).

Tabelle 8: Histologischer Score zur Beurteilung der Entzündungszellen im Gewebe (Neutrophile Granulozyten, Lymphozyten, Makrophagen), Beurteilung der Gesichtsfelder in der 40er Vergrößerung


In allen histologischen

Schnitten waren

Entzündungszellen zu finden,

daher gibt es keine Abbildung

zu Score 0.

Keine Entzündungszellen Geringgradig,

< 80 Entzündungszellen pro Gesichtsfeld

Mittelgradig, 80 - 159 Entzündungszellen

pro Gesichtsfeld


Hochgradig, 160 - 239

Entzündungszellen pro Gesichtsfeld

Höchstgradig, 240 - 320

Entzündungszellen pro Gesichtsfeld

Deutliche Abszessbildung, > 320 Entzündungszellen

pro Gesichtsfeld


Der Knochenumbau wurde anhand der Anzahl der Osteoklasten im gesamten

histologischen Schnitt beurteilt. Diese wurden in der 20fachen Vergrößerung gezählt,

wobei der Score zwischen null und drei lag (Tabelle 9).

Tabelle 9: Histologischer Score zur Beurteilung des Knochenumbaus durch Osteoklasten. Die Osteoklasten sind in den Abbildungen mit Pfeilen markiert. Bewertungsgrundlage hierfür war der gesamte Schnitt.

Score 0 Score 1

Keine Osteoklasten Geringgradig, 1 - 9 Osteoklasten im gesamten Bereich der Entzündung

Score 2 Score 3

Mittelgradig, 10 - 20 Osteoklasten im gesamten Bereich der Entzündung

Hochgradig, > 20 Osteoklasten im gesamten Bereich der Entzündung


Die Fremdkörper-Reaktion wurde mit einem Score zwischen null und zwei bewertet,

wobei, wie bei den Osteoklasten, alle Fremdkörper-Riesenzellen im gesamten

histologischen Schnitt gezählt wurden (Tabelle 10).

Tabelle 10: Histologischer Score zur Beurteilung der Fremdkörper-Reaktion anhand der Anzahl der vorhandenen Fremdkörper-Riesenzellen. Die Fremdkörper-Riesenzellen sind in den Abbildungen mit Pfeilen markiert. Bewertungsgrundlage hierfür war der gesamte Schnitt.


Keine Fremdkörper-Riesenzellen vorhanden

Geringgradig, 1-12 Fremdkörper-Riesenzellen im gesamten Bereich der

Entzündung

Hochgradig, > 12 Fremdkörper-Riesenzellen im gesamten Bereich der

Entzündung

Die Beurteilung der Fibrose erfolgte in der 10fachen Vergrößerung semiquantitativ

mittels Einteilung in vier Grade, somit wurden Scorewerte zwischen null und drei

vergeben (Tabelle 11).

Tabelle 11: Histologischer Score zur Beurteilung der Fibrose Score 0 Score 1

Keine Fibrose erkennbar Geringgradige Fibrose erkennbar


Score 2 Score 3

0

Mittelgradige Fibrose erkennbar Hochgradige Fibrose erkennbar

4. Statistik

Die statistische Auswertung wurde mit dem Programm SigmaStat (Version 3.5,

Systat Software, Erkrath) durchgeführt. Ein Signifikanzniveau von p < 0,05 wurde bei

allen statistischen Tests als signifikant angesehen. Alle Daten sind als Mittelwerte ±

Standardfehler (S.E.M.; standard error of mean) angegeben.

Die Ergebnisse der CLSM-Untersuchung und der histologischen Untersuchung

wurden zunächst mit einer dreifaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit den

Faktoren Standzeit nach der Operation, Bakterienbesiedlung, also dem Einbringen

von S. aureus oder PBS und Immunstatus, also der Behandlung mit CSA,

ausgwertet. Im Anschluss erfolgte bei einem Wert p < 0.05 der paarweise Vergleich

mit einem post hoc Tukey-Test.

IV Ergebnisse 37

IV. ERGEBNISSE

Pro Gruppe wurden jeweils sieben Tiere operiert und untersucht (siehe Tabelle 12).

Da 5 Tiere nach der Einleitung der Narkose starben, wurden für die Auswertung von

84 Tieren insgesamt 89 operiert. Alle operierten Tiere nahmen während der

Versuchszeit an Gewicht zu unabhängig davon, ob die Implantate mit S. aureus

besiedelt waren. Zehn Tiere zeigten einen Tag nach der Operation ein geringgradig

reduziertes Allgemeinbefinden (Score 2-3), so dass diese Tiere noch einmalig mit

Metamizol (200 mg/kg KGW, oral) behandelt wurden. Bei der täglichen klinischen

Kontrolle der Tiere war während der gesamten Versuchszeit bei keinem Tier ein

stark eingeschränktes Allgemeinbefinden erkennbar. Die stichprobenartige

Blutuntersuchung auf einen ausreichenden CSA-Spiegel zeigte bei allen

untersuchten Tieren Werte im therapeutischen Bereich über 200 ng/ml.

Ein immunkompetentes Tier, bei dem die Implantate mit S. aureus besiedelt wurden,

hatte nach 21 Tagen Standzeit beide Schrauben abgestoßen, daher wurden in dieser

Gruppe nur die Schrauben von sechs Tieren am CLSM untersucht.

Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Tiere

Behandlung Immunstatus Standzeit Tierzahl CLSM/

Histologie 2 Tage 7 / 7

10 Tage 7 / 7 Naiv 21 Tage 7 / 7 2 Tage 7 / 7

10 Tage 7 / 7

PBS, 5 µl Immunsupprimiert

(CSA) 21 Tage 7 / 7 2 Tage 7 / 7

10 Tage 7 / 7 Naiv 21 Tage 6 / 7 2 Tage 7 / 7

10 Tage 7 / 7

Staphylococcus aureus,

5 x 107 KBE in 5 µl Immunsupprimiert (CSA)

21 Tage 7 / 7

IV Ergebnisse 38

Bei der dreifaktoriellen ANOVA zeigte sich bei keinem der ausgewerteten Parameter

ein Einfluss der CSA-Behandlung auf die Ergebnisse. Dies zeigte sich für bei allen

histologischen Parametern für den Faktor Immunstatus alleine (F1,83: 0,06 - 2,02;

p: 0,16 - 0,81), für die Interaktion zwischen dem Immunstatus und der Standzeit

(F1,83: 0,38 - 2,32; p: 0,11 - 0,69), für die Interaktion zwischen dem Immunstatus und

der Bakterienbesiedlung (F1,83: 0,06 - 3,6; p: 0,06 - 0,81) und für die Interaktion

zwischen allen drei Faktoren (F1,83: 0,45 - 2,86; p: 0,06 - 0,64).

Für die statistische Auswertung wurden daher CSA-behandelte Tiere mit den

unbehandelten Tieren in einer Gruppe zusammengefasst. Die endgültige

Auswertung erfolgte mit einer zweifaktoriellen ANOVA mit den Faktoren

Bakterienbesiedelung und Standzeit und dem entsprechenden post hoc Tukey’s

Test. Graphisch werden allerdings zur Veranschaulichung sowohl die CSA-

behandelte als auch die unbehandelten Gruppen gezeigt.

1. Biofilmbildung an den Implantaten

Die CLSM-Untersuchung zeigte auf den mit S.aureus besiedelten Schrauben ein

Bakterienwachstum, während auf keiner der Schrauben der Kontrolltiere Bakterien

nachgewiesen wurden. Zwei Tage nach der Operation war der Score deutlich größer

als an Tag zehn, blieb aber danach unverändert.

Die statistische Analyse der Biofilmbildung zeigte einen signifikanten Effekt für den

Faktor Bakterienbesiedlung (F1, 82 = 167; p < 0,001), für den Faktor Standzeit

(F2, 82 = 19,4; p < 0,001) und für die Interaktion zwischen beiden Faktoren

(F2, 82 = 19,4; p < 0,001). Die post hoc Analyse zeigte, dass an jedem Tag auf den

besiedelten Schrauben mehr Bakterienwachstum nachweisbar war, als auf den

Schrauben der Kontrolltiere (alle p < 0,001). Zudem zeigte sich, dass an Tag zwei

nach der Operation ein deutlich höherer Score erkennbar war als an den Tagen zehn

und 21 (beide p < 0,001). Der Vergleich zwischen den Tagen zehn und 21 zeigte

eine konstante Kolonisierung (p = 0,62; siehe Abbildung 2).

IV Ergebnisse 39

Die qualitative Auswertung der lebenden und toten Bakterien zeigte, dass sich über

den gesamten Versuchszeitraum das Verhältnis von mindestens zwei Drittel

lebenden zu maximal einem Drittel toter Keime nicht verändert hat.

Eine Auswertung mittels CLSM sichert nicht vollständig, ob es sich um eine

Biofilmbildung oder eine Anhäufung planktonischer Bakterien handelt. In der

histologischen Auswertung konnten Bakterienkolonien gefunden werden, die die

Interpretation der gefundenen Bakterien als einen Biofilm unterstützen. Abbildung 3

zeigt eine Bakterienkolonie mit kokkenförmigen Keimen, die in einer extrazellulären

Matrix eingebettet ist (Pfeil) und von neutrophilen Granulozyten umgeben ist. Dies

ist ein eindeutiger Hinweis auf eine adäquate Biofilmbildung durch S. aureus.

Abbildung 2: Die CLSM-Aufnahmen zeigen ein typisches Bakterienwachstum nach zwei Tagen mit einer großen Bakterienformation (a; Score 5), nach zehn Tagen mit einer Mikrokolonie (b; Pfeil, Score 2) und eine abgegrenzte Mikrokolonie (Pfeil) und verteilten Bakterien (Dreiecke) an Tag 21 (c; Score 2-3). d: Das Balkendiagramm zeigt das Bakterienwachstum als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammengefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. der Scorewerte. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).

IV Ergebnisse 40

2. Histologische Auswertung der Schädelkalotten

Im vorliegenden Experiment wurde die Entzündungsreaktion am Knochen und dem

Weichgewebe mit Hilfe eines histologischen Scores beurteilt. Hierbei wurden das

Vorkommen von Entzündungszellen, der Knochenumbau durch Osteoklasten, die

Fremdkörper-Reaktion anhand von Fremdkörper-Riesenzellen und die Ausbildung

einer Fibrose beurteilt.

Entzündungszellen

Die Anzahl der Entzündungszellen (vor allem neutrophile Granulozyten und

Lymphozyten) war zu jedem Zeitpunkt bei den Tieren mit S. aureus besiedelten

Implantaten deutlich höher als bei den Kontrolltieren. Sowohl bei den infizierten

Tieren als auch bei den Kontrolltieren änderten sich die Scorewerte im Verlauf des

Versuches nicht.

Die statistische Auswertung zeigte für den Faktor Bakterienbesiedlung einen

signifikanten Effekt (F1, 83 = 674; p < 0,001), jedoch keinen Effekt für die Standzeit

(F2, 83 = 0,79; p = 0,46) und die Interaktion zwischen den Faktoren (F2, 83 = 0,26;

p = 0,77). Der post hoc Test zeigte, dass zu jedem Zeitpunkt eine deutlich höhere

Anzahl an Entzündungszellen bei den infizierten Tieren zu finden war als bei den

entsprechenden Tieren der Kontrollgruppen (alle p < 0,001). Im Vergleich der

Standzeiten ergaben sich über den gesamten Versuchszeitraum innerhalb der

Abbildung 3: Bakterienkolonie mit kokkenförmigen Keimen, umgeben von extrazellulärer Matrix (Pfeil). Dies ist ein eindeutiger Hinweis auf eine Biofilmbildung durch S. aureus. Die Matrix wird von neutrophilen Granulozyten umgeben.

IV Ergebnisse 41

infizierten Tiere und der Kontrolltiere keine Unterschiede (alle p ≥ 0,575; siehe

Abbildung 4).

Knochenumbau

Bei der Bewertung des Knochenumbaus durch Osteoklasten wurde erst an Tag zehn

nach der Operation bei den infizierten Tieren eine stärkere Reaktion als bei den

Kontrolltieren deutlich, diese nimmt bis zu Tag 21 wieder ab.

Die statistische Auswertung zeigte einen signifikanten Effekt für die Faktoren

Bakterienbesiedlung und Standzeit, sowie für deren Interaktion (alle F-Werte > 12,5,

alle p-Werte < 0,001). Die post hoc Analyse zeigte, dass an Tag zwei nach der

Abbildung 4: Die histologischen Aufnahmen zeigen die Entzündungs-zellinfiltration im Gewebe nach zehn Tagen Standzeit bei einem Kontrolltier (a; Score 1) und einem infizierten Tier (b; Score 5). c: Das Balkendiagramm zeigt die Anzahl der Entzündungszellen als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammengefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. der Scorewerte. Signifikante Unterschiede zu den jeweiligen Kontrollgruppen sind mit einem Stern gekennzeichnet (*; ANOVA mit post hoc Tukey Test, p < 0,05).

IV Ergebnisse 42

Operation kein signifikanter Unterschied zwischen den infizierten Tieren und der

Kontrollgruppe nachweisbar war (p = 0,12). Nach zehn und 21 Tagen war die Anzahl

an Osteoklasten bei den infizierten Tieren deutlich höher als bei den entsprechenden

Tieren der Kontrollgruppen (beide p < 0,001). Bei den infizierten Tieren nimmt die

Osteoklastenanzahl von Tag zwei zu Tag zehn (p < 0,001) und zu Tag 21 (p < 0,001)

signifikant zu. Im Vergleich zu Tag zehn ist die Anzahl der Osteoklasten an Tag 21

jedoch geringer (p = 0,002). Bei den Kontrolltieren ist der Knochenumbau zu allen

Zeiten gleich (alle p ≥ 0,07; siehe Abbildung 5).

Abbildung 5: Die histologischen Aufnahmen zeigen die typische Knochenreaktion eines Kontrolltieres nach zehn Tagen mit einem einzelnen Osteoklasten (a; Pfeil, Score 1) und eines infizierten Tieres mit einer größeren Ansammlung von Osteoklasten (b; Score 3). c: Das Balkendiagramm zeigt den Knochenumbau als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammen-gefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden gekennzeichnet mit einem Stern (*). Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#), zu Tag zehn mit einem Kreis (o; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).

IV Ergebnisse 43

Fremdkörper-Reaktion

Zu allen Analysezeitpunkten war bei den Tieren mit infizierten Implantaten eine

stärkere Fremdkörper-Reaktion zu beobachten als bei den Kontrolltieren. Bei den

infizierten Tieren zeigte sich eine Vermehrung der Fremdkörper-Riesenzellen von

Tag zwei zu Tag zehn, danach blieben sie nahezu konstant. Bei den Kontrolltieren ist

nur von Tag zwei zu Tag 21 ein erkennbarer Anstieg der Zellzahl vorhanden.

Bei der statistischen Auswertung ergab sich ein signifikanter Effekt für den Faktor

Bakterienbesiedlung (F1, 83 = 111; p < 0,001), für den Faktor Standzeit (F2, 83 = 13,8;

p < 0,001) und ebenso für die Interaktion zwischen beiden Faktoren (F2, 83 = 3,14;

p = 0,05). Die post hoc Auswertung ergab, dass zu allen drei analysierten

Zeitpunkten eine deutlich stärkere Fremdkörper-Reaktion bei den infizierten Tieren

nachweisbar war als bei den Kontrolltieren (alle p < 0,001). Bei den infizierten Tieren

zeigte sich darüber hinaus eine starke Erhöhung der Zellzahl von Tag zwei zu Tag

zehn (p < 0,001), von Tag zehn zu Tag 21 blieb die Fremdkörper-Reaktion dann

konstant (p = 0,21). Dagegen nahm die Anzahl der Zellen bei den Kontrolltieren nur

im Vergleich zwischen Tag zwei und Tag 21 zu (p = 0,03; siehe Abbildung 6).

IV Ergebnisse 44

Fibrose

Die Fibrose hing hauptsächlich von der Standzeit der Tiere ab. Bei den mit

S. aureus infizierten Tieren gab es einen kontinuierlichen Anstieg der Fibrose über

alle drei Analysezeitpunkte hinweg. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die

infizierten Tiere jedoch nur an Tag 21 eine signifikant stärker ausgeprägte Fibrose.

Die Kontrolltiere wiesen nur eine Vermehrung von Tag zwei zu Tag zehn auf, danach

blieb die Fibrose unverändert.

Abbildung 6: Die histologischen Aufnahmen zeigen die Fremdkörper-Reaktion nach zehn Tagen Standzeit bei einem Kontrolltier mit wenigen Fremdkörper-Riesenzellen mit maximal drei Kernen (a; Pfeile, Score 1) und bei einem infizierten Tier mit einer deutlich größere Ansammlung von Fremdkörper-Riesenzellen mit bis zu sechs Kernen (b; Pfeile, Score 2). c: Das Balkendiagramm zeigt die Fremdkörper-Reaktion als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immunsupprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammen-gefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden gekennzeichnet mit einem Stern (*). Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).

IV Ergebnisse 45

Die statistische Analyse zeigte signifikante Effekte für die Faktoren

Bakterienbesiedlung, Standzeit und die Interaktion zwischen beiden Faktoren (alle F-

Werte > 3,92, alle p-Werte < 0,04). Die post hoc Analyse zeigte nur an Tag 21 bei

den infizierten Tieren eine stärkere Fibrose als bei den Kontrolltieren (p = 0,001).

Dagegen zeigte sich bei den Kontrolltieren ein Anstieg des Scores von Tag zwei zu

Tag zehn, anschließend blieb die Fibrose konstant. Bei den infizierten Tieren zeigte

sich ein stetiger Anstieg von Tag zwei, über Tag zehn bis zu Tag 21 (alle p < 0,001;

siehe Abbildung 7).

Abbildung 7: Die histologischen Aufnahmen zeigen die Fibrose eines infizierten Tieres an Tag zwei (a; Score 1) und an Tag 21 (b; Score 2-3). c: Das Balkendiagramm zeigt die Fibrose als Score zu den unterschiedlichen Standzeiten bei den Kontrolltieren (weiße Balken) und den Tieren mit infizierten Implantaten (graue Balken). Die immun-supprimierten Tiere sind schraffiert dargestellt, werden aber für die statistische Auswertung mit den unbehandelten Tieren zusammen-gefasst. Gezeigt werden die Mittelwerte ± S.E.M. Signifikante Unterschiede zwischen infizierten Tieren und Kontrolltieren werden gekennzeichnet mit einem Stern (*). Signifikante Unterschiede innerhalb einer Versuchsgruppe zu Tag zwei sind gekennzeichnet mit einer Raute (#), und zu Tag zehn mit einem Kreis (o; ANOVA mit post hoc Tukey Test mit p < 0,05).

V Diskussion 46

V. DISKUSSION

Die Ergebnisse unserer Versuche zeigen, dass man bei der Ratte durch die

intraoperative Besiedlung von Titan-Implantaten mit einem rattenpathogenen

S. aureus Stamm zuverlässig eine Biofilmbildung mit begleitender

Entzündungsreaktion hervorrufen kann. Die Behandlung mit CSA hatte keinen

Einfluss auf die untersuchten Parameter.

1. Biofilmbildung

Im vorliegenden Modell wurde nach der intraoperativen Infektion der Implantate

zuverlässig zu jedem Analysezeitpunkt eine Biofilmbildung mittels CLSM auf den

Titan-Implantaten nachgewiesen. Trotz des hohen Scorewertes an Tag zwei sehen

wir die Tage zehn und 21 zur Untersuchung einer chronischen Infektion mit einer

Biofilmbildung am Implantat als geeignet an. Tag zwei wird von uns nicht als der

beste Zeitpunkt zur Bewertung des Bakterienvorkommens auf dem Implantat

bewertet, da diese große Menge an Bakterien wahrscheinlich hauptsächlich auf das

kurze Zeitintervall zwischen der intraoperativen Besiedlung und der Untersuchung

der Implantate zurückzuführen ist. Ein ähnliches Ergebnis zeigte die Studie von ARAD

ET AL. (2013), die bei intraoperativ mit Methicillin-resistentem S. aureus besiedelten

Brustimplantaten bei Ratten nach vier Tagen Standzeit etwa zehnmal mehr Bakterien

nachweisen konnten als nach elf Tagen.

Die Auswertung an den Tagen zehn und 21 zeigten dann ebenfalls, dass sich diese

an Tag zwei gefundenen sehr großen Bakterienformationen nicht langfristig als

maturer Biofilm am Implantat etablieren konnten. Dies könnte ein Hinweis darauf

sein, dass es sich an Tag zwei noch nicht um einen maturen Biofilm handelte,

sondern sich die Bakterien gerade in der Phase der Anheftung und beginnenden

Reifung befinden, jedoch dauerhaft nicht resistent gegen das Immunsystem sind. In

vitro Versuche haben gezeigt, dass nach 18 bis 48 Stunden ein ausgereifter Biofilm

von S. aureus nachweisbar sein kann (AKIYAMA ET AL. 1993; COELHO ET AL. 2008;

V Diskussion 47

WAGNER ET AL. 2011). Wir würden jedoch nach unseren Untersuchungen davon

ausgehen, dass nach dieser kurzen Zeit noch keine robuste Biofilmbildung in vivo

erreicht wurde, die über einen längeren Zeitraum stabil, reproduzierbar, und somit

repräsentativ, wäre. Diese Vermutung wird unter anderem von THURLOW ET AL. (2011)

unterstützt, die zeigten, dass ein Biofilm in vitro schneller ausreift als in vivo, wo das

Immunsystem und gleichzeitig nicht optimale Nährstoffbedingungen einen negativen

Einfluss auf das Bakterienwachstum haben. Da sich die Ergebnisse an den Tagen

zehn und 21 im Bereich der Biofilmbildung nicht unterscheiden, kann man davon

ausgehen, dass die nachgewiesenen Bakterien zu diesen Zeitpunkten robust genug

gegenüber der Immunantwort der Tiere und fest am Titanimplantat angeheftet sind

(WAGNER ET AL. 2011). Somit sehen wir diese beiden Zeitpunkte zur Untersuchung

einer chronischen Infektion mit einer Biofilmbildung am Implantat als geeignet an.

Es gibt Studien, bei denen präoperativ die Implantate in einer Bakterienlösung

zwischen 20 Minuten und bis zu drei Tagen inkubiert wurden, sodass sich die Keime

zum Zeitpunkt der Implantation bereits am Implantat angeheftet oder sogar schon

einen maturen Biofilm gebildet hatten (ARAD ET AL. 2013; FREIRE 2011; INZANA ET AL.

2015; LI ET AL. 2008; SNOWDEN ET AL. 2012). Dieses Vorgehen ist nicht mit einer

klinischen Situation zu vergleichen, da dort intraoperativ sterile Implantate verwendet

werden. Die von uns verwendete Methode mit der intraoperativen Besiedlung ist

hingegen relativ nah an einer klinischen Situation, bei der es zu einer intraoperativen

Kontamination mit ubiquitär vorkommenden Bakterien kommen kann (PORTILLO ET AL.

2013; VAN WIJNGAERDEN ET AL. 1999).

Zum Nachweis von Bakterien wurden in bisherigen Arbeiten oft eine PCR oder die

Anzüchtung der Bakterien mit Hilfe passender Nährmedien gewählt. Beide Methoden

ermöglichen keine Unterscheidung zwischen planktonischen Bakterien und einem

Biofilm. Ebenfalls ist eine Quantifizierung der Bakterien nicht zuverlässig ohne

großen Aufwand möglich, ebenso wie eine Unterscheidung von lebenden und toten

Bakterien (HANNIG ET AL. 2010; KERSTENS ET AL. 2015; TAVERNIER UND COENYE 2015).

Mit der CLSM-Untersuchung, wie wir sie durchgeführt haben, ist ebenfalls nicht

sicher unterscheidbar, ob es sich um Keime handelt, die in einem Biofilm organisiert

sind oder planktonisch vorkommen. Durch das Spülen der Proben mit PBS vor der

V Diskussion 48

Färbung ist jedoch von einer weitgehenden Entfernung planktonischer Bakterien

auszugehen (BÜRGERS ET AL. 2010; FURUSTRAND TAFIN ET AL. 2015; HARRISON ET AL.

2006; KERSTENS ET AL. 2015; SMITH ET AL. 2008). Zusätzlich kann man aufgrund der

histologischen Bilder von Bakterienkolonien mit umgebender extrazellulärer Matrix

davon ausgehen, dass eine adäquate Biofilmbildung stattgefunden hat (ALT ET AL.

2011). Gleichzeitig ist durch das verwendete Score-System eine einfache

Semiquantifizierung möglich, die alle Kolonien erfasst, die sich auf der

Implantatoberfläche fest angeheftet haben.

Eine Optimierungsmöglichkeit des Modells wäre eine Kristall-Violett-Färbung der

Schrauben. Durch diese Methode wird hauptsächlich die extrazelluläre Matrix eines

Biofilmes angefärbt, unter anderem durch die Bindung an Polysaccharide, wodurch

sichergestellt wird, dass es sich tatsächlich um einen Biofilm und nicht um eine

Anhäufung planktonischer Bakterien handelt (KERSTENS ET AL. 2015; SMITH ET AL.

2008). Gleichzeitig wäre eine genaue Quantifizierung möglich, indem man nach der

Färbung mit Hilfe eines ELISAs oder eines Photometers die Menge des absorbierten

Farbstoffes misst (HANNIG ET AL. 2010; KERSTENS ET AL. 2015). Es ist jedoch nicht klar,

welchen Einfluss eine Kontamination mit Blut oder Geweberesten auf diese Methode

hätte, da darin ebenfalls unterschiedliche Polysaccharide enthalten sind. Um also

eine Kristall-Violett-Färbung in einem solchen in vivo Modell erfolgreich anwenden zu

können, müsste diese Frage erst eindeutig geklärt werden.

Ein Vorteil unseres Modells im Bereich der Beurteilung der Biofilmbildung ist die

Lebend-Tot-Färbung, wodurch der vorhandene Biofilm im CLSM nicht nur gut

sichtbar gemacht wurde, sondern zusätzlich erkennbar ist, ob es sich um lebende

oder bereits abgestorbene Bakterien handelte. Eine Auswertung dieses Parameters

ist jedoch sehr schwierig, da aufgrund der komplexen Oberfläche der Schraube,

welche von allen Seiten genau gescannt werden müsste, keine objektive quantitative

Auswertung von lebenden und toten Keimen möglich ist. Dieser Aspekt wurde somit

nur während der semiquantitativen Bewertung des vorhandenen Biofilms optisch

beurteilt. Über den gesamten Versuchszeitraum hat sich das Verhältnis von

mindestens zwei Drittel lebenden zu maximal einem Drittel toter Keime nicht

verändert.

V Diskussion 49

Bei der Charakterisierung unseres Tiermodells war eine Quantifizierung der

vorkommenden Biofilme wichtig um bei der nachfolgenden Nutzung einen

Vergleichswert zu haben. Diese haben wir semiquantitativ mittels einer Score-

Bewertung durchgeführt. Im Gegensatz dazu stehen Modellen, bei denen keinerlei

Quantifizierung der Bakterien vorgenommen wurde (ALT ET AL. 2011). Die Nutzung

eines Scores ist zwar einfach und hilfreich um Richtwerte zu erarbeiten, bietet jedoch

keine genaue quantitative Bestimmung der vorhandenen Bakterien oder der

Biofilmmasse. In diesem Bereich wäre unser Modell zu optimieren. In diesem

Zusammenhang ist die Quantifizierung mit Hilfe der Anzüchtung der Bakterien und

Zählen der KBE jedoch ebenfalls kein zuverlässiges Instrument wie bereits

beschrieben wurde. Ein Hilfsmittel in diesem Zusammenhang wäre zum Beispiel eine

qPCR, welche eine sehr genaue Quantifizierung vorhandener Bakterien

beziehungsweise eines Biofilmes erlaubt (AMMANN ET AL. 2013). Um eine wirklich

genaue Quantifizierung zu gewährleisten muss jedoch sichergestellt sein, dass alle

vorhandenen Bakterien vom Implantat abgelöst worden sind, was zum Beispiel mit

Hilfe von Ultraschall möglich wäre (FERREIRA ET AL. 2012; KERSTENS ET AL. 2015).

Derart abgelöste Keime könnten anstatt mit einer qPCR ebenso mit Hilfe einer

Durchflusszytometrie quantifiziert werden (ALMEIDA ET AL. 2011; ARAD ET AL. 2013;

KERSTENS ET AL. 2015; TAVERNIER UND COENYE 2015). Eine qPCR wäre jedoch

deutlich aufwendiger als unsere gewählte Methode und man hätte nicht den

optischen Eindruck von hauptsächlich lebenden Keimen bei der Auswertung

erhalten.

Wir konnten bereits an Tag zehn einen stabilen Biofilm nachweisen, der sich bis

Tag 21 nicht veränderte. Dies ist ein Vorteil des entwickelten Modells, da es sich um

eine relativ kurze Standzeit handelt, die trotzdem robuste Ergebnisse liefert. Neben

bereits erwähnten sehr langen Standzeiten von vier bis zu zwölf Wochen mit den

dazugehörigen Nachteilen gibt es auch Modelle mit sehr kurzen Standzeiten, von

drei bis vier Tagen (HAENLE ET AL. 2013; LUCKE ET AL. 2003; VERMA ET AL. 2010; VAN

WIJNGAERDEN ET AL. 1999). Nach unseren Untersuchungen unterstellen wir jedoch,

dass nach dieser kurzen Zeit noch keine robuste Biofilmbildung in vivo erreicht

wurde, was ebenfalls von anderen Studien unterstützt wird (THURLOW ET AL. 2011).

V Diskussion 50

Aus diesem Grund ist eine Standzeit von zehn bis maximal 21 Tagen ein großer

Fortschritt. Im Vergleich zu den langen Standzeiten werden die Belastung der Tiere

und der finanzielle Aufwand deutlich verringert und die Praktikabilität für die

Experimentatoren erhöht. Im Gegensatz zu den sehr kurzen Standzeiten, ist hier ein

robustes Ergebnis erkennbar, das tatsächlich mit einer Implantatinfektion mit

Biofilmbildung bei Menschen oder bei Tieren vergleichbar ist.

Eine genauere Quantifizierung der Bakterien wäre sicherlich eine Bereicherung für

das Modell. Es gibt bisher jedoch keine zuverlässigen Quantifizierungsmöglichkeiten

für komplexe Implantate, die aus dem lebenden Organismus entnommen wurden,

insbesondere da anhaftende Gewebe einige Auswertungsansätze in einem noch

nicht erfassbaren Maße verfälschen. Insgesamt betrachten wir daher die von uns

gewählte semiquantitiative Beurteilung der Biofilmbildung durch die CLSM-

Untersuchung als einen sinnvollen Kompromiss zu einem sehr arbeits- und apparativ

aufwendigen Quantifizierungsversuch. Für die Zukunft sollte allerding die

Entwicklung von quantitativen Methoden zum Nachweis des Biofilms weiter

vorangetrieben werden. Hierzu ist zum Beispiel auch der Verbund vom Implantat und

umgebenden Gewebe ex-vivo, oder der direkte Nachweis in vivo anzustreben.

2. Entzündungsreaktion

Bei dem entwickelten Modell wurde eine ausführliche histologische Untersuchung

des Knochens und des Weichgewebes durchgeführt, da bei einer Infektion ebenfalls

das umliegende Gewebe Entzündungsanzeichen aufweist, und nicht nur der

Knochen selbst (MCCREA 2014; OFLUOGLU ET AL. 2007). Im Gegensatz dazu haben

zum Beispiel LUCKE ET AL. (2003) nur den Knochen mit dem Knochenmark, jedoch

nicht das angrenzende Weichgewebe histologisch untersucht. Des Weiteren gibt es

mehrere Modelle, bei denen keinerlei histologische Auswertung durchgeführt wurde,

sondern ausschließlich das Vorkommen von Bakterien ermittelt wurde (CHEN ET AL.

2005; HAENLE ET AL. 2013).

V Diskussion 51

Es gibt bereits Veröffentlichungen, die wie bei unserem Modell die Infiltration des

Gewebes durch Leukozyten als das Maß für die Entzündungsreaktion verwendeten

(ERICSSON ET AL. 1995; ZIJLSTRA ET AL. 2009). Bei unseren Untersuchungen konnte zu

jedem Analysezeitpunkt bei den infizierten Tieren eine ausgeprägte

Entzündungsreaktion der Schädeldecke und des umgebenden Gewebes dargestellt

werden. Die Anzahl der Entzündungszellen, hauptsächlich neutrophile Granulozyten

und auch Lymphozyten, war bei den infizierten Tieren zu allen Analysezeitpunkten

identisch. Man kann also davon ausgehen, dass die Infektion dauerhaft zu einer

starken Infiltration des Gewebes mit Entzündungszellen führt, unabhängig von der

vorhandenen Bakterienanzahl, die an den Tagen zehn und 21 deutlich geringer war

als an Tag zwei. Ähnliche Ergebnisse zeigten SNOWDEN ET AL. (2012), die ein Maus-

Modell mit ventrikulären Kathetern entwickelten, die mit S. aureus infiziert waren. In

dieser Arbeit wurden Zellzählungen mit Hilfe von Fluoreszenz aktiviertem Cell Sorting

(FACS) im umgebenden Gewebe durchführten, wobei hauptsächlich neutrophile

Granulozyten und Makrophagen erfasst wurden. Vor allem die Anzahl der

neutrophilen Granulozyten war über einen Zeitraum von drei Wochen nahezu

konstant.

Diese dauerhaft stark ausgeprägte Infiltration des Gewebes durch

Entzündungszellen wird hauptsächlich durch den vorhandenen Biofilm verursacht.

Die Kontrolltiere wiesen ebenfalls Entzündungszellen auf, jedoch deutlich weniger als

die Tiere mit besiedelten Implantaten. Neutrophile Granulozyten sind die wichtigsten

Zellen in der Abwehr bakterieller Infektionen, wobei sie sehr gut in der Lage sind,

planktonische Bakterien durch Phagozytose zu eliminieren (FRANK 1980; HANKE UND

KIELIAN 2012; SILVA 2011). Biofilme sind hingegen deutlich resistenter und können

sich der Phagozytose weitgehend entziehen (JESAITIS ET AL. 2003). Dies ist für uns

ein weiteres Indiz, dass im vorliegenden Modell eine Biofilmbildung stattgefunden

hat. Wenn es sich ausschließlich um planktonische Keime gehandelt hätte, hätte in

der Zeit zwischen Tag zehn und Tag 21 die Bakterienanzahl durch Phagozytose

wahrscheinlich abgenommen. Somit wären wahrscheinlich ebenfalls an Tag 21

weniger Entzündungszellen zu finden gewesen als an den vorangegangenen

Analysezeitpunkten. So lange der Biofilm vorhanden ist und nicht durch eine

V Diskussion 52

umgebende Fibrose oder ähnliches eingekapselt und somit vom Immunsystem

weitestgehend abgeschottet ist, bleibt der Reiz, der zu einer permanenten Anlockung

der Entzündungszellen führt, bestehen (COSTERTON UND VEEH 2003). Gegebenenfalls

wäre bei einem längeren Versuchszeitraum zu erkennen, dass die Anzahl der

Entzündungszellen mit zunehmender umgebender Fibrose abnimmt.

Das permanent hohe Vorkommen von Entzündungszellen bei den infizierten Tieren

ist gleichzeitig durch das Phänomen der frustrierten Phagozytose zu erklären. Es

sind vor allem Makrophagen, aber auch neutrophile Granulozyten aktiv, um

vorhandenes Fremdmaterial, wie zum Beispiel den Biofilm oder auch das Implantat

zu phagozytieren. Da die Phagozytose jedoch erfolglos bleibt, kommt es zu einer

ausgeprägten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, was zu einer anhaltenden

Infiltration des Gewebes mit Entzündungszellen und zur Bildung von Fremdkörper-

Riesenzellen durch Makrophagen führt (BAINTON ET AL. 1989; BRAXTON ET AL. 2005;

HENSON 1980; LEID ET AL. 2002). Da die Kontrolltiere mit unbehandeltem Implantat

eine deutlich geringer ausgeprägte Infiltration mit Entzündungszellen zeigten, ist

davon auszugehen, dass die anhaltend hohe Zahl an Entzündungszellen im Gewebe

hauptsächlich durch den vorhandenen Biofilm hervorgerufen wurde und nicht durch

das Titan-Implantat.

MAYER (2012) zeigte, dass bei einem Entzündungsgeschehen in Umgebung von

Knochen, die Anzahl der Osteoklasten mit der Dichte des Entzündungszellinfiltrates,

vor allem mit den neutrophilen Granulozyten, korreliert. Dieses Phänomen konnten

wir nicht uneingeschränkt nachvollziehen. Bei unseren Versuchen zeigten die

infizierten Tiere zwar ein deutlich vermehrtes Vorkommen von Osteoklasten als die

Kontrolltiere an den Tagen zehn und 21, jedoch war zu diesen Zeitpunkten immer die

gleiche Anzahl an Entzündungszellen bei den infizierten Tieren nachweisbar.

Anscheinend besteht im vorliegenden Versuch ein Zusammenhang zwischen

vorhandenen Bakterien und Osteoklasten. Eine solche Annahme wird unter anderem

von LI ET AL. (2008) unterstützt, die zeigten, dass es an infizierten Implantaten zu

einem deutlich vermehrten Vorkommen von Osteoklasten mit Sequestrierung des

Knochens kommt, was ein Zeichen einer Osteomyelitis ist (KOCH UND MASCHE 1999;

LEW UND WALDVOGEL 2004). Bei uns war sowohl an Tag zehn, als auch an Tag 21 ein

V Diskussion 53

signifikanter Unterschied zwischen den Kontrolltieren und den besiedelten Tieren im

Bereich des Knochenumbaus nachzuweisen, was zeigt, dass S. aureus den

Knochenumbau nachhaltig beeinflusst. Zusätzlich verändert sich die Anzahl der

Osteoklasten bei den Kontrolltieren nicht im Laufe der Zeit, was auch dafür spricht,

dass vor allem die vorhandenen Bakterien den Knochenumbau anregen.

Untermauert werden diese Ergebnisse durch Studien, die zeigten, dass S. aureus

eine Entzündungsreaktion am Knochen hervorruft und die Aktivität von Osteoklasten

beeinflussen kann (ALEXANDER ET AL. 2003; ELLINGTON ET AL. 1999; WRIGHT UND NAIR

2010). Gleichzeitig mit dem Einfluss von S. aureus fördern die

Entzündungsmediatoren ebenfalls den Knochenumbau und -abbau (BROGGINI ET AL.

2003).

Fremdkörper-Riesenzellen werden häufig bei Versuchen mit Implantaten gefunden,

wobei die Ausprägung der Fremdkörper-Reaktion von verschiedenen Faktoren

abhängig und ihr Vorkommen unter anderem ein Ausdruck der frustrierten

Phagozytose ist (ANDERSON ET AL. 2008; BAINTON ET AL. 1989). So ist sie bei einer

ausschließlichen Implantation von unbehandelten Implantaten aus Metall oder

Keramik deutlich geringer ausgeprägt als bei gleichzeitigem Einbringen von anderem

Fremdmaterial, wie zum Beispiel Bakterien (HOLLSTEIN 2003). Im vorliegenden Modell

ist die Fremdkörper-Reaktion wie erwartet durch die Infektion mit S. aureus stärker

ausgeprägt als beim unbehandelten Titanimplantat, für das bereits eine gute

Biokompatibilität und Osseointegration gezeigt wurde (BÜCHELER ET AL. 2002; NOWAK

2010). HOLLSTEIN (2003) zeigte ebenfalls, dass gleichzeitig mit einer ausgeprägten

Fremdkörper-Reaktion infolge eines Implantates der Knochenumbau durch

Osteoklasten deutlich vermehrt ist. Dieses Phänomen können wir bestätigen, da in

unserem Modell bei den infizierten Tieren zu allen Analysezeitpunkten eine deutlich

stärkere Fremdkörper-Reaktion erkennbar ist und an Tag zehn und Tag 21 ebenfalls

ein ausgeprägter Knochenumbau durch Osteoklasten nachweisbar ist.

Bei der Fibrosebildung konnten wir nur nach 21 Tagen Standzeit bei den infizierten

Tieren eine signifikant stärkere Ausprägung dieses Parameters im Vergleich zu den

Kontrolltieren nachweisen. Dieses Ergebnis passt zu bisherigen Erkenntnissen, dass

eine Biofilm-Infektion im Körper langfristig fibrös eingekapselt wird (HANKE UND

V Diskussion 54

KIELIAN 2012). Der dahinterstehende Mechanismus ist jedoch noch weitgehend

unbekannt. Man geht davon aus, dass das Ziel eine Eindämmung und Abkapselung

der Infektion ist, wenn keine Eliminierung des Biofilmes durch das Immunsystem

möglich ist (HANKE UND KIELIAN 2012; THURLOW ET AL. 2011). Zudem fördern

bestimmte Proteine auf der Oberfläche von S. aureus die Bildung und Anlagerung

von Fibronectin und Kollagen. Somit profitiert gleichzeitig der Biofilm selbst von einer

fibrösen Einkapselung, da diese zu einer weiteren Abschottung von äußeren

Einflüssen wie Immunzellen oder antibakteriellen Substanzen führt (ALEXANDER ET AL.

2003).

Dass an den Tagen zwei und zehn nach der Operation kein Unterschied bei der

Fibrose zwischen den infizierten Tieren und der Kontrollgruppe nachweisbar ist,

jedoch bei beiden Gruppen ein signifikanter Anstieg von Tag zwei zu Tag zehn

stattgefunden hat, ist durch die normale Reaktion des Körpers auf das Einbringen

eines Implantates und auf eine Verletzung von Gewebe erklärbar. Diese Ereignisse

führen immer zu einer vorläufigen Entzündungsreaktion mit dem Ziel der

Regeneration oder Reparation des Gewebes, was mit einer Fibrose und

Narbenbildung verbunden ist (ANDERSON 1993). Dies erklärt ebenfalls, dass es in der

Kontrollgruppe von Tag zehn zu Tag 21 keinen nennenswerten Anstieg der Fibrose

mehr gab, da in diesem Zeitraum das Implantat ohne Infektion eingeheilt sein sollte

und somit keine weitere Narbenbildung mehr stattfindet (FREIRE 2011).

Als eine Ergänzung der histologischen Auswertung wären Hartschnitte oder -schliffe

mit den Implantaten möglich, was eine aufschlussreiche Beurteilung der

Osseointegration zu den unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Implantation

ermöglichen würde (HOLLSTEIN 2003; WENG ET AL. 2008). So könnte genau dargestellt

werden, ob ein guter Kontakt zwischen Knochen und Implantat besteht und wie sich

die periimplantäre Knochenneubildung und die periimplantäre Fibrose entwickeln

(MARTINEZ ET AL. 2014; SCHÄFER 2011). Hierbei wäre zu vermuten, dass nach zehn

Tagen Standzeit die Implantate am wenigsten gut in den umliegenden Knochen

integriert sind, da zu diesem Zeitpunkt der stärkste Knochenumbau durch

Osteoklasten nachgewiesen wurde.

V Diskussion 55

In mehreren Studien wurden während der Standzeit der Tiere röntgenologische oder

computertomographische Untersuchungen des Knochens mit den Implantaten

durchgeführt (CHEN ET AL. 2005; FREIRE 2011; HAENLE ET AL. 2013; LI ET AL. 2008).

Dies ist sinnvoll um den Verlauf der Einheilung in vivo beurteilen und Vergleiche

zwischen den unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Operation am gleichen Tier

anstellen zu können. Im vorliegenden Versuch mit den Implantaten in der

Schädeldecke ist eine solche Art der Beurteilung jedoch nicht so entscheidend wie

bei Implantaten, die einer deutlich höheren mechanischen Belastung ausgesetzt

sind, wie zum Beispiel bei orthopädischen oder oralen Implantaten (EERENBERG ET

AL. 1994; INZANA ET AL. 2015; WINDOLF ET AL. 2013).

Ebenso wären noch weitere Färbungen der histologischen Schnitte möglich, um

einen größeren Informationsgewinn zu erhalten (WILLBOLD UND WITTE 2010). Eine

Masson-Goldner-Trichrom-Färbung wäre zum Beispiel hilfreich um eine gute

Differenzierung des fibrösen Gewebes von den restlichen Zellen zu erreichen.

Ebenso ist durch diese Färbung eine Unterscheidung zwischen mineralisierter und

nicht-mineralisierter Knochenmatrix möglich, was den Knochenumbau sehr präzise

darstellt (NOWAK 2010; OTT 2011; WEBSTER ET AL. 2012). Eine ähnliche Aussage wäre

mit einer Toluidin-Blau-Färbung möglich, die vor allem Osteoblasten und

nicht-kalzifizierte Regionen des Knochens sichtbar macht und eine sehr genaue

Beurteilung der Knochenveränderungen durch die Unterscheidung zwischen altem

stabilem und umgebautem Knochen ermöglichst (SCHÄFER 2011; WILLBOLD UND

WITTE 2010). Eine TRAP-Färbung (Tartratresistente saure Phosphatase) zeigt

eindeutig Osteoklasten an, was ebenfalls die Beurteilung des Knochenumbaus

erweitern könnte (LI ET AL. 2008; SCHÄFER 2011). Mit Hilfe einer von-Kossa-Färbung

könnten man durch die Affinität von Silber-Ionen zu saurem Milieu die calciumreichen

Bereiche eines Knochens gezielt anfärben (WILLBOLD UND WITTE 2010). Ebenso

könnte man über eine Gramfärbung zur Detektierung der Bakterien im Gewebe

nachdenken (SCHMIDMAIER ET AL. 2006). Diese weiteren Färbungen wären jedoch

sehr arbeitsintensiv im Vergleich zu einem relativ geringen größeren

Informationsgewinn, da mit der verwendeten HE-Färbung bereits die wichtigsten

Parameter ausreichend erfasst und beurteilt werden können.

V Diskussion 56

Des Weiteren wäre zur Beurteilung der Entzündungsreaktion eine Bestimmung

unterschiedlicher spezifischer Zytokine möglich (ANDERSON 1993; WRIGHT UND NAIR

2010). Die Beurteilung der Entzündung mit Hilfe von Zytokinen kann zum Beispiel mit

Hilfe des Plasma-Spiegels des Tumor-Nekrose-Faktors-α, Interleukin-1, Interleukin-6

oder Interleukin-17 durchgeführt werden. Diese gelten als entscheidende

Entzündungsmarker, bieten unter anderem einen Nachweis der Ausprägung des

Knochenumbaus im Zuge einer Osteomyelitis und können somit als Indikatoren für

die Biokompatibilität eines Implantates dienen (ROSENGREN ET AL. 1997; SNOWDEN ET

AL. 2012; THURLOW ET AL. 2011; WRIGHT AND NAIR 2010). Durch Blutproben könnten

somit im Verlauf der Untersuchung zu unterschiedlichen Zeitpunkten am gleichen

Tier diese Entzündungsmarker ausgewertet werden. Zytokine könnten ebenfalls mit

Hilfe einer immunhistochemischen Auswertung in histologischen Schnitten beurteilt

werden (ROSENGREN ET AL. 1997; SNOWDEN ET AL. 2012). Aufgrund der höheren

Belastung der Tiere durch eine regelmäßige Blutentnahme und einem deutlich

vermehrten Arbeitsaufwand wurden diese Methoden jedoch nicht durchgeführt.

Zusammenfassend kann man über die histologische Auswertung sagen, dass diese

umfangreich und aussagekräftig ist, aber im Falle spezieller Fragestellungen

erweitert werden kann.

3. Beurteilung des Tiermodells

Wir konnten zeigen, dass bei der Ratte durch die intraoperative Besiedlung von

Titan-Implantaten mit einem rattenpathogenen S. aureus zuverlässig Auslösung

einer Biofilmbildung mit begleitender Entzündungsreaktion möglich ist, wobei die

Belastung der Tiere als gering eingestuft werden kann. Die Behandlung mit CSA

hatte keinen Einfluss auf die untersuchten Parameter.

Die tägliche Beurteilung des Allgemeinbefindens der Tiere und die regelmäßige

Gewichtskontrolle zeigten kaum Unregelmäßigkeiten. Alle Tiere hatten spätestens ab

dem zweiten Tag nach der Operation ein ungestörtes Allgemeinbefinden und alle

Tiere nahmen im Verlauf des Versuchs an Gewicht zu. Auch unmittelbar postoperativ

V Diskussion 57

kam es zu keinem Gewichtsverlust von 20%. Bei keinem Tier war die Wundheilung

gestört und trotz der Infektion wurde keine Ratte auffällig in dem Sinne, dass sie sich

verstärkt an der Implantationsstelle gekratzt hat.

Die Immunsuppression mittels CSA zeigte keinen Effekt auf die Biofilmbildung oder

die Entzündungsreaktion, sodass man für die Verwendung dieses Modells von der

täglichen Belastung der Tiere durch die i.p. Injektion absehen kann. Dies verringert

einerseits die Belastung der Tiere und gleichzeitig den Arbeitsaufwand bei

Verwendung des Modells. Die Unwirksamkeit von CSA ist wahrscheinlich darauf

zurückzuführen, dass diese Substanz mit der spezifischen Hemmung der T-Zellen

nicht direkt in die Immunabwehr gegen Bakterien eingreift, die hauptsächlich durch

neutrophile Granulozyten gewährleistet ist (FRANK 1980; SCHRAMM 2005). Ob eine

solche immunsuppressive Behandlung bei humanpathogenen Erregern vorteilhaft

wäre, können wir mit unserem Ansatz allerdings nicht erkennen.

Wir konnten in unserem Modell eine sehr starke Entzündungsreaktion nachweisen,

wohingegen es bei der Biofilmbildung wünschenswert wäre, wenn sie großflächiger

auf dem Implantat verteilt wäre. Ob eine Immunsuppression durch eine andere

Substanz die Biofilmbildung verstärken würde, müsste in weiteren Versuchen

getestet werden. Eine weitere Möglichkeiten der pharmakologischen

Immunsuppression wären zum Beispiel hochdosierte Kortikosteroide, wie etwa

Prednisolon (COSÍO ET AL. 2005; TAYLOR ET AL. 2005). Kortikosteroide hätten in einem

Infektionsversuch jedoch mehrere Nachteile. Sie bewirken eine ausgeprägte

Entzündungshemmung, unter anderem durch eine Stabilisierung von

Zellmembranen, eine Reduktion der Kapillarpermeabilität, eine reduzierte

Freisetzung von Zytokinen und eine Beeinträchtigung der Funktion von Makrophagen

(COSÍO ET AL. 2005; TAYLOR ET AL. 2005). Dieser Effekt ist jedoch für das entwickelte

Modell nicht sinnvoll, da mit der Biofilmbildung gleichzeitig die Entzündungsreaktion

beurteilt wurde. Zum anderen ist in vorangegangenen Versuchen gezeigt worden,

dass Kortikosteroide einen negativen Einfluss auf das Wachstum von S. aureus

haben, was durch die angestrebte Biofilmbildung ebenfalls nicht erwünscht war

(GOGGIN ET AL. 2014). Zusätzlich beeinflussen sie den Knochenstoffwechsel und

führen durch eine erhöhte Resorptionsrate zu einer geringeren Knochendichte und

V Diskussion 58

somit einem erhöhten Frakturrisiko, was die Evaluierung der Knochenreaktion auf ein

infiziertes Implantat erschwert. Die hochdosierte Gabe von Kortikosteroiden zur

Immunsuppression führt zudem zu ausgeprägten Nebenwirkungen, wie einem

erhöhten Infektionsrisiko. Bei einer chronischen Applikation kommt es zusätzlich zu

einem vermehrten Vorkommen von Tumoren, sowie Herz-Kreislauf- und

Stoffwechselerkrankungen (HSU ET AL. 2008; SCHÄCKE ET AL. 2002; TAYLOR ET AL.

2005). Somit wären die Kortikosteroide als Alternative zum CSA für den vorliegenden

Infektionsversuch an Implantaten nicht geeignet.

4. Fazit und Ausblick

Im Vergleich aller Ergebnisse gab es zwischen den Standzeiten von zehn und 21

Tagen keine großen Differenzen, während Tag zwei weder als Biofilm- noch als

Entzündungsmodell geeignet ist. Zu diesem Zeitpunkt ist das Bakterienvorkommen

noch nicht stabil und die histologische Auswertung zeigt, dass weder die Fibrose

noch der Knochenumbau durch Osteoklasten bei den infizierten Tieren stärker

ausgeprägt ist als bei den Kontrolltieren. Bei den Entzündungszellen und den

Fremdkörper-Riesenzellen zeigten sich keine Unterschiede bei den Ergebnissen an

den Tagen zehn und 21, nur die Zahl der Osteoklasten und die Fibrosebildung

zeigten Abweichungen. Ebenso war das Bakterienvorkommen auf den Implantaten

zu diesen Zeitpunkten vergleichbar. Aufgrund der nur halb so langen Standzeit und

der daher geringeren Belastung der Tiere, wäre somit eine Standzeit von zehn

Tagen zu empfehlen. Im Falle einer Untersuchung, die gezielt auf die

Knochenreaktion oder die umgebende Narben- und Fibrosebildung ausgerichtet ist,

wäre individuell zu entscheiden, ob eine Standzeit von zehn oder von 21 Tagen von

Vorteil ist.

Es gibt die Möglichkeit, das Modell für einen größeren Informationsgewinn durch

weitere Untersuchungen zu erweitern. Diese bringen immer den Nachteil eines

deutlich höheren Arbeitsaufwandes und teilweise auch einer höheren Belastung der

Tiere mit sich. Dabei wäre entsprechend individuell zu entscheiden, ob ein größerer

Erkenntnisgewinn dies rechtfertigen würde. Eines der Ziele bei der Entwicklung

V Diskussion 59

unseres Modells war die Praktikabilität. Vor allem bei der Semiquantifizierung der

Biofilme würde das Modell von einer optimierten Methode profitieren, welche jedoch

bei heutigem Kenntnisstand nur schwierig zu realisieren ist. Für die histologische

Auswertung könnten die oben erwähnten zusätzlichen Methoden im Falle einer

spezifischen Fragestellung zusätzlich angewendet werden.

Zudem spricht die geringe Belastung der Tiere für die Eignung als Screening-Modell.

Somit können mit Hilfe dieses Modells neue Implantatmaterialien oder

-beschichtungen in vivo im Vergleich zu Titan untersucht werden. Diese könnten

dann später in aufwendigeren Ansätzen mit humanpathogenen Erregern verifiziert

werden. Des Weiteren bietet das Modell die Möglichkeit der Weiterentwicklung von

Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten von Implantatinfektionen. Es gibt

bereits einige Innovationen in diesen Bereichen, wie zum Beispiel unterschiedliche

Beschichtung von Implantaten. Die zuverlässige Wirksamkeit dieser Optionen muss

jedoch erst tierexperimentell untersucht werden, wofür sich unser Ansatz als

Screening-Modell eignet.

VI Zusammenfassung 60

VI. ZUSAMMENFASSUNG

Silke Paret

Entwicklung eines Tiermodells zur Untersuchung eine s Biofilms und einer

assoziierten Entzündungsreaktion bei chirurgischen Implantaten

Implantatinfektionen sind sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin ein

großes Problem in vielen Bereichen der Chirurgie und sehr häufig mit einer

Biofilmbildung assoziiert. Aufgrund der abweichenden Verhaltensweisen der

Bakterien in einem Biofilm gegenüber planktonischen Bakterien sind solche

Infektionen sehr schwierig zu behandeln. Durch verschiedene

Resistenzmechanismen sind konservative antimikrobielle Therapien in der Regel

nahezu wirkungslos und das infizierte Implantat muss entfernt werden mit einem

großzügigen Debridement des umgebenden Gewebes. Diese Behandlungen sind

sehr kostenintensiv und haben gleichzeitig ein hohes Risiko einer erneuten Infektion.

Aus diesem Grund befassen sich zahlreiche Arbeitsgruppen mit dem Thema der

Implantatinfektionen und es gibt bereits einige Tiermodelle zu unterschiedlichen

Implantaten im Körper. Bei vielen dieser Modelle ist jedoch kein direkter Nachweis

eines Biofilms auf den Implantaten gelungen und gleichzeitig wird nur selten die

Entzündungsreaktion des umgebenden Gewebes bewertet, obwohl diese

entscheidend an den Vorgängen des Implantatversagens beteiligt ist.

Vor diesem Hintergrund sollte in diesem Dissertationsvorhaben ein Rattenmodell

entwickelt werden, das sowohl praktikabel aufgrund der gewählten Standzeit und der

verwendeten Methoden ist und gleichzeitig aussagekräftig die Biofilmbildung und die

assoziierte Entzündungsreaktion bewertet.

Mittels einer intraoperativen Besiedlung von zwei Schrauben mit einem

rattenpathogenen Staphylococcus aureus, die in die Schädelkalotte von Ratten

eingebracht wurden, wurde eine intraoperative Kontamination von Implantaten mit

einer anschließenden Implantatinfektion simuliert. Es wurden sowohl

immunkompetente als auch mit Ciclosporin A immunsupprimierte Tiere verwendet,

VI Zusammenfassung 61

um einen Einfluss der Immunsuppression auf die Biofilmbildung zu evaluieren.

Nach zwei, zehn und 21 Tagen wurden die Tiere euthanasiert um die Entwicklung

eines Biofilms auf der Implantatoberfläche mit Hilfe eines konfokalen Laser-

Scanning-Mikroskops und einem Score zu evaluieren. Durch eine histologische

Untersuchung der Schädelkalotten wurde die assoziierte Entzündungsreaktion

ebenfalls mit Hilfe eines Scores beurteilt. Dafür wurden die Anzahl der

Entzündungszellen, der Knochenumbau durch Osteoklasten, die

Fremdkörperreaktion und die Fibrose jeweils einzeln mit einem Score bewertet.

Zu allen Zeitpunkten war bei den infizierten Tieren eine Biofilmbildung nachweisbar,

die mit einer ausgeprägten Entzündungsreaktion einherging, wobei aufgrund der

Ausprägung der unterschiedlichen Parameter zu den verschiedenen Zeitpunkten die

Tage zehn und 21 als geeignet betrachtet werden können.

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass sich die intraoperative Besiedelung

eines Implantats mit Staphylococcus aureus eignet, um als Screening-Modell zur

Untersuchung neuer Implantatmaterialien oder -oberflächen zu dienen um ihren

Einfluss auf die Biofilmbildung und die assoziierte Entzündungsreaktion in vivo zu

testen. Für spezielle Fragestellungen wäre jedoch eine Erweiterung der Methoden

zur Auswertung möglich und sinnvoll.

VII Summary 62

VII. SUMMARY

Silke Paret

Development of an animal model for the investigatio n of biofilms and the

associated inflammatory reaction on surgical implan ts

In human and in veterinary medicine implant infections is a major problem in most of

the surgery fields and often associated with biofilm formation. These infections need

long term and elaborate treatment because of the altered properties of bacteria in a

biofilm in comparison to planktonic bacteria. They have several mechanisms of

resistance against conservative antimicrobial treatment and the infected implant often

needs to be removed with a large debridement. This therapy is very expensive and

the risk of a new infection is high. For this reason, numerous working groups deal

with the issue of implant infections and some animal models for different aspects of

this topic are already available. Most of these models, however, did not detect

bacteria directly on the implants. Further, the inflammatory reaction of the

surrounding tissue has been evaluated only in a few cases although it is one of the

main reasons of implant failure.

For this reason we aimed to develop a rat model for implant infection with a

reasonable but short duration and direct detection of bacteria on the implants for

evaluation of a biofilm and the associated inflammatory reaction.

During implantation of two titanium screws in the cranium of rats, an intraoperative

contamination was simulated by giving Staphylococcus aureus in the drillholes.

Immunocompetent and immunosuppressed rats (Ciclosporin A) were used to

evaluate the influence of immunosuppression on biofilm formation.

Two, ten and 21 days after surgery, the implants and the cranial bone were

harvested for examination. Biofilm formation on the implant surface was investigated

with a confocal laser scanning microscope and rated with a score between zero and

five. The cranial bone was evaluated histologically with a four parameter score for

VII Summary 63

quantity of inflammatory cells, bone remodeling by osteoclasts, foreign-body reaction

and fibrosis.

At every timepoint of analysis, biofilm formation and a significant higher inflammatory

reaction was detectable on the infected animals. With respect to the severity of the

different parameter used for histological evaluation, either day 10 or day 21 are

considered appropriate for the use of this animal model.

In conclusion, we suggest that intra-operative contamination of implants with

staphylococcus aureus can be used as a valid in-vivo screening-model to evaluate

new implant materials and surfaces with respect to biofilm formation and the

associated inflammatory reaction. However, an extension of the methods of analysis

would be possible and useful for specific questions.

VIII. Literaturverzeichnis 64

VIII. LITERATURVERZEICHNIS

ABRAHAM, N. M. UND K. K. JEFFERSON. 2010. “A low molecular weight component of serum inhibits biofilm formation in Staphylococcus aureus.” Microbial pathogenesis 49(6):388–91.

AIKEN, M. J., T. K. HUGHES, R. H. ABERCROMBY, M. A. HOLMES UND A. A. ANDERSON. 2015. “Prospective, randomized comparison of the effect of two antimicrobial regimes on surgical site infection rate in dogs undergoing orthopedic implant surgery.” Veterinary Surgery 44:661-667.

AKIYAMA, H., R. TORIGOE UND J. ARATA. 1993. “Interaction of Staphylococcus aureus cells and silk threads in vitro and in mouse skin.” Journal of Dermatological Science 6(93):247–57.

ALEXANDER, E.H., F. A. RIVERA, I. MARRIOTT, J. ANGUITA, K. L. BOST UND M. C. HUDSON. 2003. “Staphylococcus aureus - induced tumor necrosis factor - related apoptosis - inducing ligand expression mediates apoptosis and caspase-8 activation in infected osteoblasts.” BMC microbiology 3(5):1-11.

ALLISON, A.C. 2000. “Immunosuppressive drugs: The first 50 years and a glance forward.” Immunopharmacology 47(2-3):63–83.

ALMEIDA, C., N. F. AZEVEDO, S. SANTOS, C. W. KEEVIL UND M. J. VIEIRA. 2011. “Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH).” PloS one 6(3):1–13.

ALT, V., K. S. LIPS, C.HENKENBEHRENS, D. MUHRER, M. C. OLIVEIRA CAVALCANTI, M. CAVALCANTI-GARCIA, UR.SOMMER, U. THORMANN, G. SZALAY, C. HEISS, T. PAVLIDIS, E.DOMANN UND R. SCHNETTLER. 2011. “A new animal model for implant-related infected non-unions after intramedullary fixation of the tibia in rats with fluorescent in situ hybridization of bacteria in bone infection.” Bone 48(5):1146–53.

AMMANN, T. W., N. BOSTANCI, G. N. BELIBASAKIS UND T. THURNHEER. 2013. “Validation of a quantitative real-time PCR assay and comparison with


fluorescence microscopy and selective agar plate counting for species-specific quantification of an in vitro subgingival biofilm model.” Journal of Periodontal Research 48(4):517–26.

AMORENA, B. UND E. GRACIA. 1999. “Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro.” Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:43–55.

AN, Y. UND R. FRIEDMAN. 1998. “Animal models of orthopedic implant infection.” Investigative Surgery 11:139–46.

ANDERSON, J. M. 1988. “Inflammatory response to implants.” ASAIO transactions / American Society for Artificial Internal Organs 34:101–7.

ANDERSON, J. M. 1993. “Mechanisms of inflammation and infection with implanted devices.” Cardiovascular Pathology 2(3):33–41.

ANDERSON, J. M., A. RODRIGUEZ UND D. T. CHANG. 2008. “Foreign body reaction to biomaterials.” Seminars in Immunology 20:86–100.

ARAD, E., S.NAVON-VENEZIA, E. GUR, B. KUZMENKO, R. GLICK, D. FRENKIEL-KRISPIN, E. KRAMER, Y. CARMELI UND Y. BARNEA. 2013. “Novel rat model of methicillin-resistant Staphylococcus aureus-infected silicone breast implants: A study of biofilm pathogenesis.” Plastic and reconstructive surgery 131(2):205–14.

ARCHER, N.K., M. J. MAZAITIS, J. W. COSTERTON, J. G. LEID, M. E. POWERS UND M. E. SHIRTLIFF. 2011. “Staphylococcus aureus biofilms. Properties, regulation and roles in human disease.” Virulence 25(October):445–59.

ARCIOLA, C. R., L. VISAI, F. TESTONI, S. ARCIOLA, D. CAMPOCCIA, P. SPEZIALE UND L. MONTANARO. 2011. “Concise survey of Staphylococcus aureus virulence factors that promote adhesion and damage to peri-implant tissues.” The International journal of artificial organs 34(9):771–80.

AUGER, J., J. DUPUIS, A. QUESNEL UND G. BEAUREGARD. 2000. “Surgical treatment of lumbosacral instability caused by discospondylitis in four dogs.” Veterinary Surgery 29(1):70–80.


BAINTON, D. F., R. TAKEMURA, P. E. STENBERG UND Z. WERB. 1989. “Rapid fragmentation and reorganization of golgi membranes during frustrated phagocytosis of immobile immune complexes by macrophages.” The American Journal of Pathology 134(1):15–26.

BEENKEN, K.E. UND P.M. DUNMAN. 2004. “Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.” Journal of bacteriology 186:4665–84.

BERENDT, T. UND I. BYREN. 2004. “Bone and joint infection.” Clinical medicine (London, England) 4(6):510–18.

BJERKNES, S., I.M. SKOGSEID, T.SÆHLE, E. DIETRICHS UND M. TOFT. 2014. “Surgical site infections after deep brain stimulation surgery: Frequency, characteristics and management in a 10-year period.” PLoS ONE 9(8):1–9.

BØE, B., T. HEIER UND L. NORDSLETTEN. 2011. “Measurement of early bone loss around an uncemented femoral stem.” Acta orthopaedica 82(3):321–24.

BRAXTON, E.E., G.D. EHRLICH, L.HALL-STOODLEY, P. STOODLEY, R. VEEH, C. FUX, F. Z. HU, M. QUIGLEY UND J. C. POST. 2005. “Role of biofilms in neurosurgical device-related infections.” Neurosurgical review 28(4):249–55.

BRENNAN, S. A, C. NÍ FHOGHLÚ, B. M. DEVITT, F. J. O. MAHONY, D. BRABAZON UND A. WALSH. 2015. “Silver nanoparticles and their orthopaedic applications.” The Bone & Joint Journal 97-B:582–89.

BROGGINI, N., L. M. MCMANUS, J. S. HERMANN, R. U. MEDINA, T. W. OATES, R. K. SCHENK, D. BUSER, J. T. MELLONIG UND D. L. COCHRAN. 2003. “Persistent acute inflammation at the implant-abutment interface.” Journal of dental research 82:232–37.

BÜCHELER, M., S. WEIHE UND H. EUFINGER. 2002. “Rekonstruktion des Os frontale mit individuellen Titanimplantaten nach chirurgischer Therapie der Stirnbeinosteomyelitis.” HNO 50:339–46.

BÜRGERS, R., T. GERLACH, S. HAHNEL, F. SCHWARZ, G. HANDEL UND M. GOSAU. 2010. “In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces.” Clinical oral implants research 21(2):156–64.


CAIAZZA, N. C. UND G. A. O’TOOLE. 2003. “Alpha-toxin Is required for biofilm formation by Staphylococcus aureus.” Journal of bacteriology 185(10):3214–17.

CAMPOCCIA, D., L. MONTANARO UND C. R. ARCIOLA. 2006. “The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance.” Biomaterials 27:2331–39.

CAMPOCCIA, D., L. MONTANARO UND C. R. ARCIOLA. 2013. “A review of the clinical implications of anti-infective biomaterials and infection-resistant surfaces.” Biomaterials 34(33):8018–29.

CHEN, W. H., L. S. JIANG UND LI YANG DAI. 2009. “A novel canine model of acute pyogenic spondylodiscitis.” Neurosurgical Review 32(4):485–90.

CHEN, W. H., Y. J. KANG, L. Y. DAI, B. WANG, C. LU, J. LI UND GUO HUA LÜ. 2014. “Bacteria detected after instrumentation surgery for pyogenic vertebral osteomyelitis in a canine model.” European Spine Journal 23(4):838–45.

CHEN, X., D. T. TSUKAYAMA, L. S. KIDDER, C. BOURGEAULT, A. H. SCHMIDT UND W. D. LEW. 2005. “Characterization of a chronic infection in an internally-stabilized segmental defect in the rat femur.” Journal of Orthopaedic Research 23(4):816–23.

COELHO, L.R., R. R. SOUZA, F. A. FERREIRA, M. A. GUIMARÃES, B. T. FERREIRA-CARVALHO UND A. M. SÁ FIGUEIREDO. 2008. “Agr RNAIII divergently regulates glucose-induced biofilm formation in clinical isolates of Staphylococcus aureus.” Microbiology 154(11):3480–90.

CONNAUGHTON, A., A. CHILDS, S. DYLEWSKI UND V. J. SABESAN. 2014. “Biofilm disrupting technology for orthopedic implants: What’s on the horizon?” Frontiers in Medicine 1:1–4.

COSÍO, B. G., A. TORREGO UND I. M. ADCOCK. 2005. “Molecular mechanisms of glucocorticoids.” Archivos de bronconeumologia 41(1):34–41.

COSTERTON, J. W. 1999. “Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.” Science 284(5418):1318–22.


COSTERTON, W. UND R. VEEH. 2003. “The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections.” The Journal of Clinical Investigantion 112(10):1466–77.

CRAMTON, S. E., C. GERKE, N. F. SCHNELL, W. W. NICHOLS UND F. GÖTZ. 1999. “The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation.” Infection and immunity 67(10):5427–33.

CUCARELLA, C., C.SOLANO UND J. VALLE. 2001. “Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation.” Journal of bacteriology 183(9):2888–96.

CURTIS, J. J., R. G. LUKE, E. DUBOVSKY, A. G. DIETHELM, J. D. WHELCHEL UND P. JONES. 1986. “Cyclosporin in therapeutic doses increases renal allograft vascular resistance.” Lancet 2(8505):477–79.

DAROUICHE, R.O. 2004. “Treatment of infections associated with surgical implants.” The New England journal of medicine 350(14):1422–29.

DASCHNER, F., M. DETTENKOFER, U. FRANK, UND M. SCHERRER. 2006. Praktische Krankenhaushygiene und Umweltschutz. 3. Auflage, Springer Verlag, Freiburg

DAVIES, D.G., M. R. PARSEK, J. P. PEARSON, B. H. IGLEWSKI, J. W. COSTERTON UND E. P. GREENBERG. 1998. “The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm.” Science 280:295–98.

DONLAN, R.M. UND J.W. COSTERTON. 2002. “Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.” Clinical microbiology reviews 15(2):167–93.

DRAKE, M. T., C. BESCH-WILLIFORD, M. H. MYLES, J. W. DAVIS UND R. S. LIVINGSTON. 2011. “In vivo tropisms and kinetics of rat theilovirus infection in immunocompetent and immunodeficient rats.” Virus Research 160(1-2):374–80.

EERENBERG, J. P., P. PATKA, H. J. HAARMAN UND B. J. DWARS. 1994. “A new model for posttraumatic osteomyelitis in rabbits.”


Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical

Research 7(5):453–65.

ELLINGTON, J. K., S. S. REILLY, W. K. RAMP, M. S. SMELTZER, J. F. KELLAM U ND M. C. HUDSON. 1999. “Mechanisms of Staphylococcus aureus invasion of cultured osteoblasts.” Microbial pathogenesis 26:317–23.

ERICSSON, I., L. G. PERSSON, T. BERGLUNDH, C. P. MARINELLO, J. LINDHE UND B. KLINGE. 1995. “Different types of inflammatory reactions in peri-implant soft tissues.” Journal of clinical periodontology 22:255–61.

FERREIRA, F. A., R. RODRIGUES SOUZA, R. R. BONELLI, M. A. AMÉRICO, S. E.LONGO FRACALANZZA U ND A.M. SÁ FIGUEIREDO. 2012. “Comparison of in vitro and in vivo systems to study ica-independent Staphylococcus aureus biofilms.” Journal of microbiological methods 88(3):393–98.

FOSTER, T. J. 2005. “Immune evasion by staphylococci.” Nature reviews. Microbiology 3(December):948–58.

FOURNIER, B. UND D. J. PHILPOTT. 2005. “Recognition of Staphylococcus aureus by the innate immune system.” Clinical Microbiology Reviews 18(3):510–40.

FRANK, R. M. 1980. “Bacterial penetration in the apical pocket wall of advanced human periodontitis.” Journal of periodontal research 15(1978):563–73.

FREIRE, M. O. 2011. “Development of an animal model for Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilm-mediated oral osteolytic infection: A preliminary study.” Journal of periodontology 82(5):778–89.

FURUSTRAND TAFIN, U., B. BETRISEY, M. BOHNER, T. ILCHMANN, A. TRAMPUZ UND M. CLAUSS. 2015. “Staphylococcal biofilm formation on the surface of three different calcium phosphate bone grafts: A qualitative and quantitative in vivo analysis.” Journal of Materials Science: Materials in Medicine 26(3):130.


GALLAGHER, A. D. UND W. D. MERTENS. 2012. “Implant removal rate from infection after tibial plateau leveling osteotomy in dogs.” Veterinary Surgery 41:705–11.

GBEJUADE, H. O., A. M. LOVERING UND J. C. WEBB. 2015. “The role of microbial biofilms in prosthetic joint infections.” Acta Orthopaedica 86(2):147–58.

GEIPEL, U. UND M. HERRMANN. 2004. “The infected implant. Part 1: Bacteriology.” Der Orthopäde 33(12):1411–28.

GERDING, J. C., A. CLODE, B. C. GILGER UND K. W. MONTGOMERY. 2014. “Equine orbital fractures: A review of 18 cases (2006-2013).” Veterinary Ophthalmology 17(1):97–106.

EL GHOUL, W., S. HARRISSON UND A. BELLI. 2014. “Autologous cranioplasty following decompressive craniectomy in the trauma setting.” British Journal of Neurosurgery 29(April 2014):1–6.

GIBBS, R., G. WEINSTOCK UND M. METZKER. 2004. “Genome sequence of the brown norway rat yields insights into mammalian evolution.” Nature 428(6982):493–521.

GOGGIN, R., C. JARDELEZA, P.-J. WORMALD UND S.VREUGDE. 2014. “Corticosteroids directly reduce Staphylococcus aureus biofilm growth: An in vitro study.” The Laryngoscope 124(3):602–7.

GOH, R. C. W., C. N. CHANG, C. L. LIN UND L. J. LO. 2010. “Customised fabricated implants after previous failed cranioplasty.” Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery 63(9):1479–84.

GONZALEZ, R. J., M. C. LANE, N. J. WAGNER, E. H. WEENING UND V.L. MILLER. 2015. “Dissemination of a highly virulent pathogen: Tracking the early events that define infection.” PLOS Pathogens 11:e1004587.

GREENSPON, A. J., E. S. RHIM, G. MARK, J. DESIMONE UND R. T. HO. 2008. “Lead-associated endocarditis: The important role of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.” PACE 31:548–53.


GRIENSVEN, M. VAN UND F.M. DAHLWEID. 2002. “Dehydroepiandrosterone (DHEA) modulates the activity and the expression of lymphocyte subpopulations induced by cecal ligation and puncture.” Shock 18(5):445–49.

GÜNTHER, F., G. H. WABNITZ, P. STROH, B. PRIOR, U. OBST, Y. SAMSTAG, CHRISTOF

WAGNER UND G. M. HÄNSCH. 2009. “Host defence against Staphylococcus aureus biofilms infection: Phagocytosis of biofilms by polymorphonuclear neutrophils (PMN).” Molecular immunology 46(8-9):1805–13.

HAENLE, M., C.ZIETZ, T. LINDNER, K. ARNDT, A. VETTER, W. MITTELMEIER, A. PODBIELSKI, UND R. BADER. 2013. “A model of implant-associated infection in the tibial metaphysis of rats.” The Scientific World Journal (481975):1–8.

HALLAK, G. 2014. “Wirksamkeit des quantitativen Rapid-PCR-Screenings für den Nachweis einer Kolonisation mit methicillin-resistenten Staphylococcus-aureus-Spezies (MRSA) sowie der unmittelbaren Kontaktisolierung positiv-getesteter Patienten zur Reduktion von nosokomialen MRSA-Infektionen und direkten Kosten in einem Traumazentrum.” Berlin, Charité Universitätsmedizin, Medizinische Fakultät, Diss.

HALL-STOODLEY, L., J. W. COSTERTON UND P. STOODLEY. 2004. “Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.” Nature reviews. Microbiology 2(2):95–108.

HANDRECK, A., E. M. MALL, D. A. ELGER, L. GEY UND M. GERNERT. 2015. “Different preparations, doses, and treatment regimens of cyclosporine A cause adverse effects but no robust changes in seizure thresholds in rats.” Epilepsy Research 112:1–17.

HANKE, M. L. UND T. KIELIAN. 2012. “Deciphering mechanisms of staphylococcal biofilm evasion of host immunity.” Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2(May):1–12.

HANNIG, C., M. FOLLO, E. HELLWIG UND A. AL-AHMAD. 2010. “Visualization of adherent micro-organisms using different techniques.” Journal of medical microbiology 59(Pt 1):1–7.

HARRISON, J. J., H. CERI, J. YERLY, C. STREMICK, Y. HU, R. MARTINUZZI UND R. J. TURNER. 2006. “The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the calgary biofilm device.” Biological procedures online 8(1):194–215.


HARRO, J.M., B. M. PETERS, G. A. O’MAY, N. ARCHER, P. KERNS, R. PRABHAKARA UND M. E. SHIRTLIFF. 2010. “Vaccine development in Staphylococcus aureus: Taking the biofilm phenotype into consideration.” FEMS Immunology and Medical Microbiology 59:306–23.

HEINONEN, M. T., A. P. LAINE, C. SODERHALL, O. GRUZIEVA, S. RAUTIO, E. MELEN, G. PERSHAGEN, H. J. LAHDESMAKI, M. KNIP, J. ILONEN, T. A. HENTTINEN, J. KERE UND R. LAHESMAA. 2015. “GIMAP GTPase family genes: Potential modifiers in autoimmune diabetes, asthma and allergy.” The Journal of Immunology 194:5885–94.

HENSON, P. M. 1971. “The immunologic release of constituents from neutrophil leukocytes: II. Mechanisms of release during phagocytosis, and adherence to nonphagocytosable surfaces.” Journal of Immunology 107:1547–57.

HENSON, P. M. 1980. “Mechanisms of exocytosis in phagocytic inflammatory cells.” American Journal of Pathology 101(3):494–511.

HERRMANN, M., P. E. VAUDAUX, D. PITTET, R. AUCKENTHALER, P. D. LEW, F. SCHUMACHER-PERDREAU, G. PETERS UND F. A. WALDVOGEL. 1988. “Fibronectin, fibrinogen and laminin act as mediators of adherence of clinical staphylococcal isolates to foreign material.” The Journal of infectious diseases 158(4):693–701.

HOLLSTEIN, E.-P. 2003. “Knöcherne Integration und Biokompatibilität eines neuen resorbierbaren Polymers zur Schraubenaugmentation im osteoporotischen Knochen.” München, Ludwig-Maximilian-Universität, Institut für Tierzucht, Bereich Versuchstierkunde, Diss.

HOSEIN, I. K., D. W. HILL UND R. H. HATFIELD. 1999. “Controversies in the prevention of neurosurgical infection.” Journal of Hospital Infection 43(1):5–11.

HSU, D. C. UND C. H. KATELARIS. 2008. “Long-term management of patients taking immunosuppressive drugs.” Australian Prescriber 32(3):68–71.

HUSKA, J. L., L. GAITERO, B.A. BRISSON, S. NYKAMP, J. THOMASON UND W. C. SEARS. 2014. “Presence of residual material following mini-hemilaminectomy in dogs with


thoracolumbar intervertebral disc extrusion.” The Canadian Veterinary Journal 55:975–80.

HUTTNER, H. B., D. STAYKOV, J. BARDUTZKY, C. NIMSKY, G. RICHTER, A DOERFLER UND S. SCHWAB. 2008. “Treatment of intraventricular hemorrhage and hydrocephalus.” Der Nervenarzt 79(12):1369–70, 1372–74, 1376.

INZANA, J.A., E. M. SCHWARZ, S.L. KATES UND H. A. AWAD. 2015. “A novel murine model of established staphylococcal bone infection in the presence of a fracture fixation plate to study therapies utilizing antibiotic-laden spacers after revision surgery.” Bone 72:128–36.

JÄCKEL, S. 2012. “Rekonstruktion von kritischen Knochendefekten am Kiefer immundefizienter Ratten durch xenogene Transplantation humaner adulter fettabgeleiteter Stammzellen.” Gießen, Justus-Liebig-Universität, Fachbereich Veterinärmedizin, Diss.

JESAITIS, A. J., M. J. FRANKLIN, D. BERGLUND, M. SASAKI, C. I. LORD, J. B. BLEAZARD, J. E. DUFFY, H. BEYENAL UND Z. LEWANDOWSKI. 2003. “Compromised host defense on Pseudomonas aeruginosa biofilms: Characterization of neutrophil and biofilm interactions.” The Journal of Immunology 171(8):4329–39.

JOHANSEN, L. K., J. KOCH, D. FREES, B. AALBÆK, O. L. NIELSEN, P. S. LEIFSSON, T. M. IBURG, E. SVALASTOGA, L. E. BUELUND, T. BJARNSHOLT, N. HØIBY UND H. E. JENSEN. 2012. “Pathology and biofilm formation in a porcine model of staphylococcal osteomyelitis.” Journal of Comparative Pathology 147(2-3):343–53.

KASLIWAL, M. K., L. TAN UND V.C. TRAYNELIS. 2013. “Infection with spinal instrumentation: Review of pathogenesis, diagnosis, prevention, and management.” Surgical neurology international 4(Suppl 5):S392–403.

KERSTENS, M., G. BOULET, M. VAN KERCKHOVEN, S.CLAIS, E. LANCKACKER, P. DELPUTTE, L. MAES UND P. COS. 2015. “A flow cytometric approach to quantify biofilms.” Folia Microbiologica 60(4).

KLOOS, W. E. UND T. L. BANNERMAN. 1994. “Update on clinical significance of coagulase-negative staphylococci.” Clinical Microbiology Reviews 7(1):117–40.


KNOX, P. M. UND J. P. WATKINS. 2006. “Proximal interphalangeal joint arthrodesis using a combination plate-screw technique in 53 horses (1994-2003).” Equine Veterinary Journal 38(6):538–42.

KOCH, T. UND U. P. MASCHE. 1999. “Gelenk- und Knocheninfektionen.” pharma-kritik 11:41–44.

KOCHANOWSKI, A. 2012. “Differenzierte morphometrische Bewertung der lokalen Entzündungsreaktion nach Implantation von Phospholipid-beschichteten Titanimplantaten im Tiermodell Ratte.” Greifswald, Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Fachber. Medizinische Biochemie, Diss.

KRAEMER, P., M. B. LEE, H.ENGLEHARDT, J. R. CHAPMAN UND R. J. BRANSFORD. 2010. “Infectious pin complication rates in halo vest fixators using ceramic versus metallic pins.” Journal of spinal disorders & techniques 23(8):e59–62.

LADENBURGER, S. 2003. “Relevanz der Galenik am Beispiel des Critical Dose Pharmakons Ciclosporin: Untersuchungen zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik verschiedener galenischer Formulierungen an gesunden Probanden.” Regensburg, Universität, Fachber. Pharmakologie, Diss.

LEBLANC, M., K. BERRY, H. MCCORT UND J. D. REUTER. 2013. “Brain abscess in a rhesus macaque (Macaca Mulatta) with a cephalic implant.” Comparative Medicine 63(4):367–72.

LEID, J. G., M. E. SHIRTLIFF, J. W. COSTERTON UND P. STOODLEY. 2002. “Human leukocytes adhere to, penetrate and respond to Staphylococcus aureus biofilms.” Infection and immunity 70(11):6339–45.

LEW, D.P. UND F.A. WALDVOGEL. 2004. “Osteomyelitis.” The Lancet 364(9431):369–79.

LI, D., K. GROMOV, K. SOBALLE, J. E. PUZAS, R. J. O’KEEFE, H. AWAD, H. DRISSI UND E. M. SCHWARZ. 2008. “Quantitative mouse model of implant-associated osteomyelitis and the kinetics of microbial growth, osteolysis and humoral Immunity.” Journal of Orthopedic Research 26:96–105.


LIETARD, C., V. THÉBAUD, G. BESSON UND B. LEJEUNE. 2008. “Risk factors for neurosurgical site infections: An 18-month prospective survey.” Journal of neurosurgery 109(4):729–34.

LINDE, H. J. UND N. LEHN. 2002. “Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA).” Der Hautarzt 53(10):690–701.

LIU, J., J. D. FARMER, W. S. LANE, J. FRIEDMAN, I. WEISSMAN UND S. L. SCHREIBER. 1991. “Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes.” Cell 66(4):807–15.

LUCKE, M., G. SCHMIDMAIER, S. SADONI, B. WILDEMANN, R. SCHILLER, A. STEMBERGER, N. P. HAAS UND M. RASCHKE. 2003. “A new model of implant-related osteomyelitis in rats.” Journal of biomedical materials research. Part B, Applied biomaterials 67(1):593–602.

MAH, T. F. UND G. A O’TOOLE. 2001. “Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.” Trends in microbiology 9(1):34–39.

MARTINEZ, A., F. GUITIÁN, R. LÓPEZ-PÍRIZ, J. F. BARTOLOMÉ, B. CABAL, L. ESTEBAN-TEJEDA, R.TORRECILLAS UND J. S. MOYA. 2014. “Bone loss at implant with titanium abutments coated by soda lime glass containing silver nanoparticles: A histological study in the dog.” PloS one 9(1):e86926.

MAYER, B.C.G. 2012. “Knochenabbau in der Osteitis - Rolle neutrophiler Granulozyten bei der Osteoklastogenese.” Heidelberg, Universität, Fachber. Immunologie, Diss.

MCCREA, S. J. J. 2014. “Advanced peri-implantitis cases with radical surgical treatment.” Journal of periodontal & implant science 44(1):39–47.

MEISSNER, G.. 1959. “Untersuchungen an atypischen Mycobakterien.” Beiträge zur Klinik der Tuberkulose und Spezifischen Tuberkulose-Forschung 121(3):365–80.

MORENO, J. L., I. MIKHAILENKO, M. M. TONDRAVI UND A.D. KEEGAN. 2007. “IL-4 promotes the formation of multinucleated giant cells from macrophage precursors by a STAT6-dependent, homotypic mechanism: Contribution of E-


cadherin.” Journal of leukocyte biology 82(December):1542–53.

NEMOTO, K., K. HIROTA, T. ONO, K. MURAKAMI, D. NAGAO UND Y. MIYAKE. 2000. “Effect of varidase (streptokinase) on biofilm formed by Staphylococcus aureus.” Chemotherapy 46(2):111–15.

NICOLL, C., A.SINGH UND J. S. WEESE. 2014. “Economic impact of tibial plateau leveling osteotomy surgical site infection in dogs.” Veterinary Surgery 43:899–902.

NORDEN, C. W. 1988. “Lessons learned from animal models of osteomyelitis.” Reviews of infectious diseases 10(1):103–10.

NOWAK, I. 2010. “Die knöcherne Einheilung von Zirkon- und Titanimplantaten - Eine histologische und ultrastrukturelle Untersuchung.” Düsseldorf, Heinrich-Heine-Universität, Klinik für Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie, Diss.

O’GARA, J.P. 2007. “Ica and beyond: Biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.” FEMS microbiology letters 270(2):179–88.

O’TOOLE, G., H.B. KAPLAN UND R. KOLTER. 2000. “Biofilm formation as microbial development.” Annual Reviews Microbiology 54:49–79.

OFLUOGLU, E. A., M. ZILELI, D. AYDIN, Y. S. BARIS, O. KUÇUKBASMACI, N. GONULLU, O. OFLUOGLU UND H.TOPLAMAOGLU. 2007. “Implant-related infection model in rat spine.” Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery 127(5):391–96.

OHASHI, T., S. HANABUCHI, H. KATO, Y. KOYA, F. TAKEMURA, K. HIROKAWA, T. YOSHIKI, Y. TANAKA, M. FUJII UND M. KANNAGI. 1999. “Induction of adult T-cell leukemia-like lymphoproliferative disease and its inhibition by adoptive immunotherapy in T-cell-deficient nude rats inoculated with syngeneic human T-cell leukemia virus type 1-immortalized cells.” Journal of virology 73(7):6031–40.

OTT, M. D. F. 2011. “Knochenkompakta als Osteosynthesematerial. Vergleichende histologische Studie unter Verwendung von autoklaviertem und gammabestrahltem


kompakten Knochen am Kaninchen.” Düsseldorf, Heinrich-Heine-Universität, Fachber. Unfall- und Handchirurgie, Diss.

OTTO, M. 2008. “Klassifikation bei Protheseninsuffizienz und Partikelbestimmung.” Pathologe 29(2):232–39.

OTTO, M. 2008. “Staphylococcal biofilms.” Current Topics in Microbioogy andl Immunology. 322:207–28.

PADOVAN, C. S., P. SOSTAK UND A. STRAUBE. 2002. “Neurologische Komplikationen nach Organtransplantation.” Aktuelle Neurologie 29(6):282–87.

PAJARINEN, J., V.-P. KOURI, E. JÄMSEN, T.-F. LI, J. MANDELIN UND Y. T. KONTTINEN. 2013. “The response of macrophages to titanium particles is determined by macrophage polarization.” Acta biomaterialia 9(11):9229–40.

PAXINOS, G. UND C. WATSON. 1998. The Rat Brain in Stereotactic Coordinates. 4. Auflage, Academic Press, San Diego

PFANZELT, D. 2006. “Epidemiologie boviner Staphylococcus epidermidis Isolate: Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene und klonale Verwandtschaft mit humanen Isolaten.” Hannover, Tieräztliche Hochschule, Institut für Mikrobiologie, Diss.

POELSTRA, K. A, N. A BAREKZI, D. W. GRAINGER, A G. GRISTINA UND T. C. SCHULER. 2000. “A novel spinal implant infection model in rabbits.” Spine 25(4):406–10.

PORTILLO, M. E., S. CORVEC, O. BORENS UND A. TRAMPUZ. 2013. “Propionibacterium acnes: An underestimated pathogen in implant-associated infections.” BioMed Research International 1–10.

PRIBILA, J. T., A. C. QUALE, K. L. MUELLER UND Y. SHIMIZU. 2004. “Integrins and T cell-mediated immunity.” Annual review of immunology 22:157–80.

RAMÍREZ, P., M. GORDÓN, A. SORIANO, S. GIL-PEROTIN, V. MARTI, E. M. GONZALEZ-BARBERA, M. T. SANCHEZ-AGUILAR, J. A SIMAL UND J. BONASTRE. 2013.


“Assessment of the in vivo formation of biofilm on external ventricular drainages.”

European journal of clinical microbiology & infectious diseases : official

publication of the European Society of Clinical Microbiology 32(11):1437–43.

REFAI, A. K., M. TEXTOR, D. M. BRUNETTE UND J. D. WATERFIELD. 2004. “Effect of titanium surface topography on macrophage activation and secretion of proinflammatory cytokines and chemokines.” Journal of biomedical materials research. Part A 70:194–205.

REIS, A., T. REINHARD, C. BRAUNSTEIN, E. GODEHARD UND R. SUNDMACHER. 1998. “Perforierende Keratoplastik im Rattenmodell: Vergleichende Untersuchung des immunsuppressiven Effektes von Cyclosporin A (CSA), Mycophenolatemofetil (MMF) und der Kombination CSA/MMF auf die Abstoßungsreaktion nach allogener, orthotoper Hornhauttransplan.” Spektrum Augenheilkunde 12/4:137–39.

ROSENGREN, A., N. DANIELSEN UND L. M. BJURSTEN. 1997. “Inflammatory reaction dependence on implant localization in rat soft tissue models.” Biomaterials 18(14):979–87.

RUPP, M. E., J. S. ULPHANI, P. D. FEY, K. BARTSCHT UND D. MACK. 1999. “Characterization of the importance of polysaccharide intercellular adhesin/hemagglutinin of Staphylococcus epidermidis in the pathogenesis of biomaterial-based infection in a mouse foreign body infection model.” Infection and Immunity 67(5):2627–32.

SAKKA, S. UND P. COULTHARD. 2011. “Implant failure: Etiology and complications.” Medicina Oral Patología Oral y Cirugía Bucal 16(1):42–44.

SANSUR, C. A., D. L. REAMES, J. S. SMITH, D. K. HAMILTON, S.H. BERVEN, P. A

BROADSTONE, T. J. CHOMA, M.J. GOYTAN, H. H. NOORDEEN, D. R. KNAPP, R. HART, R. D. ZELLER, W. F. DONALDSON, D. W. POLLY, J. H. PERRA, O. BOACHIE-ADJEI UND

C. I. SHAFFREY. 2010. “Morbidity and mortality in the surgical treatment of 10,242 adults with spondylolisthesis.” Journal of neurosurgery. Spine 13(5):589–93.

SCHÄCKE, H., W. D. DÖCKE UND K. ASADULLAH. 2002. “Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids.” Pharmacology & therapeutics 96(1):23–43.


SCHÄFER, M.. 2011. “Vergleichende histologische Untersuchungen von intramedullären Implantaten auf Magnesiumbasis im Kaninchenmodell.” Hannover, Tierärztliche Hochschule, Klinik für Kleintiere, Diss.

SCHALDACH, M. 1975. “Implantierbare Materialien.” Klinische Wochenschrift 53(21):1029–39.

SCHMIDMAIER, G., M. LUCKE, B. WILDEMANN, N. P. HAAS UND M. RASCHKE. 2006. “Prophylaxis and treatment of implant-related infections by antibiotic-coated implants: A review.” Injury 37 (Suppl 2):S105–12.

SCHMIDT, C. 2003. “Komplikationsanalyse der frontoorbitalen Mobilisation bei Kraniostenosen. Eine retrospektive Studie.” München, Technische Universität, Fakultät Medizin, Diss.

SCHRAMM, D. 2005. “Einfluss der Dauer der Ciclosporin A-Therapie und der Höhe des Ciclosporin A-Spiegels auf die Entwicklung der akuten Transplantatabstoßung und der Transplantatvaskulopathie am heterotopen Herztransplantationsmodell der Ratte.” Franfurt, Johann Wolfgang Goethe-Universität, Fachber. Kardiologie, Diss.

SCHROEDER, K., M. JULARIC, S. M. HORSBURGH, N. HIRSCHHAUSEN, C. NEUMANN, A. BERTLING, A. SCHULTE, S. FOSTER, B. E. KEHREL, G. PETERS UND C. HEILMANN. 2009. “Molecular characterization of a novel Staphylococcus aureus surface protein (SasC) involved in cell aggregation and biofilm accumulation.” PloS one 4(10):1–14.

SHAD, A., S. SHARIFF, J. FAIRBANK, I. BYREN, P. J. M. A D. TEDDY, T. A D. CADOUX-HUDSON UND K. DONS. 2003. “Internal fixation for osteomyelitis of cervical spine: The issue of persistence of culture positive infection around the implants.” Acta Neurochirurgica 145(11):957–60.

SHIRTLIFF, M.E., J.T. MADER UND A.K. CAMPER. 2002. “Molecular interactions in biofilms.” Chemistry & biology 9(02):859–71.

SILVA, M. T. 2011. “Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: A cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation.” Journal of leukocyte biology 89(May):675–83.


DA SILVA PERALTA, F., D. PALLOS, C. SILVA QUEIROZ UND L. HERNANDES RICARDO. 2015. “Previous exposure to cyclosporine A and periodontal breakdown in rats.” Archives of Oral Biology 60(4):566–73.

SINGH, P. 2011. “Understanding peri-Implantitis: A strategic review.” Journal of Oral Implantology 37(5):622–26.

SMITH, K., A. PEREZ, G. RAMAGE, D. LAPPIN, C. G. GEMMELL UND S. LANG. 2008. “Biofilm formation by scottish clinical isolates of Staphylococcus aureus.” Journal of Medical Microbiology 57(8):1018–23.

SNOWDEN, J. N., M. BEAVER, M. S. SMELTZER UND T. KIELIAN. 2012. “Biofilm-infected intracerebroventricular shunts elicit inflammation within the central nervous system.” Infection and immunity 80(9):3206–14.

STAVRAKIS, A. I., A. H. LOFTIN, E. L. LORD, Y. HU, J. E. MANEGOLD, E. M. DWORSKY, A. A. SCADUTO UND N. M. BERNTHAL. 2015. “Current animal models of postoperative spine infection and potential future advances.” Frontiers in Medicine 2(May):1–5.

STEIN, K. 2011. “Mittelfristige Ergebnisse von Hüft-TEP Wechseloperationen unter Verwendung des kurvierten zementlosen Revisionsschaftes „ Revitan Kurviert “ (Zimmer GmbH, Winterthur, Schweiz).” Hamburg, Universität, Medizinische Fakultät, Diss.

STIFFLER, K. S. 2004. “Internal fracture fixation.” Clinical Techniques in Small Animal Practice 19(3):105–13.

STOODLEY, P., K. SAUER, D. G. DAVIES UND J. W. COSTERTON. 2002. “Biofilms as complex differentiated communities.” Annual review of microbiology 56:187–209.

STUCKER, F. UND D. ACKERMANN. 2011. “Immunsuppressiva - Wirkungen, Nebenwirkungen und Interaktionen.” Therapeutische Umschau 68(12):679–86.

SUSKA, F., C. GRETZER, M. ESPOSITO, L. EMANUELSSON, A. WENNERBERG, P.TENGVALL

UND P. THOMSEN. 2005. “In vivo cytokine secretion and NF-κB activation around titanium and copper implants.” Biomaterials 26:519–27.


TAVERNIER, S. UND T. COENYE. 2015. “Quantification of Pseudomonas aeruginosa in multispecies biofilms using PMA-qPCR.” PeerJ 3:1–15.

TAYLOR, A. L., C. J. E. WATSON UND J. A.BRADLEY. 2005. “Immunosuppressive agents in solid organ transplantation: Mechanisms of action and therapeutic efficacy.” Critical Reviews in Oncology/Hematology 56:23–46.

THURLOW, L. R., M. L. HANKE, T. FRITZ, A. ANGLE, A. ALDRICH, S. H. WILLIAMS, I. L. ENGEBRETSEN, K. W. BAYLES, A. R. HORSWILL UND T. KIELIAN. 2011. “Staphylococcus aureus biofilms prevent macrophage phagocytosis and attenuate inflammation in vivo.” Journal of immunology 186(11):6585–96.

TONETTI, M. S. UND J. SCHMID. 1994. “Pathogenesis of implant failures.” Periodontology 2000 4:127–38.

TRINDADE, R., T. ALBREKTSSON UND P. TENGVALL. 2014. “Foreign body reaction to biomaterials: On mechanisms for buildup and breakdown of osseointegration.” Clinical Implant Dentistry and Related Research: 1–12.

VEERACHAMY, S., T. YARLAGADDA, G. MANIVASAGAM UND P. K. YARLAGADDA. 2014. “Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review.” Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine 228(10):1083–99.

VERMA, R. K., S. RAJAPAKSE, A. MEKA, C. HAMRICK, S. POLA, I. BHATTACHARYYA, M. NAIR, S. M. WALLET, I. AUKHIL UND L.KESAVALU. 2010. “Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola mixed microbial infection in a rat Model of periodontal disease.” Interdisciplinary perspectives on infectious diseases 2010:1-10

WAGNER, C., S. AYTAC UND G. M. HÄNSCH. 2011. “Biofilm growth on implants: Bacteria prefer plasma coats.” The International journal of artificial organs 34(9):811–17.

WEBSTER, T. J., A A PATEL, M. N. RAHAMAN UND B. SONNY BAL. 2012. “Anti-infective and osteointegration properties of silicon nitride, poly(ether ether ketone), and titanium implants.” Acta biomaterialia 8(12):4447–54.

WENG, D., M. J. H. NAGATA, M. BELL, A. F. BOSCO, L. G. NASCIMENTO DE MELO UND E.-J. RICHTER. 2008.


“Influence of microgap location and configuration on the periimplant bone morphology in submerged implants. An experimental study in dogs.” Clinical oral implants research 19(11):1141–47.

WETSCHER, A.-P. 2012. “Retrospektive Analyse ausgewählter Frakturen der Schultergliedmaße bei der Katze – Behandlung und Ergebnisse.” München, Ludwig-Maximilian-Universität, Zentrum für klinische Tiermedizin, Diss.

VAN WIJNGAERDEN, E., W. E. PEETERMANS, J. VANDERSMISSEN, S. VAN LIERDE, H. BOBBAERS UND J. VAN ELDERE. 1999. “Foreign body infection: A new rat model for prophylaxis and treatment.” The Journal of antimicrobial chemotherapy 44(5):669–74.

WILLBOLD, E. UND F. WITTE. 2010. “Histology and research at the hard tissue-implant interface using technovit 9100 new embedding technique.” Acta biomaterialia 6(11):4447–55.

WINDOLF, C. D., W. MENG, T. T. LÖGTERS, C. R. MACKENZIE, J. WINDOLF UND S. FLOHÉ. 2013. “Implant-associated localized osteitis in murine femur fracture by biofilm forming Staphylococcus aureus: A novel experimental model.” Journal of Orthopaedic Research 31(12):2013–20.

WODTKE, J. UND J. F. LÖHR. 2008. “Das infizierte Implantat.” Der Orthopäde 37(3):257–67.

WRIGHT, JOHN A. AND SEAN P. NAIR. 2010. “Interaction of staphylococci with bone.” International Journal of Medical Microbiology 300(2-3):193–204.

XU, K. D., G. A. MCFETERS UND P. S. STEWART. 2000. “Biofilm resistance to antimicrobial agents.” Microbiology (March):547–49.

YARWOOD, J. M. UND D. J. BARTELS. 2004. “Quorum sensing in Staphylococcus aureus biofilms.” Journal of bacteriology 186(6):1838–50.

YUE, C., B. ZHAO, Y. REN, R. KUIJER, H. C. VAN DER MEI, H. J. BUSSCHER UND E. T. J. ROCHFORD. 2015. “The implant infection paradox: Why do some succeed when others fail? Opinion and discussion paper.” European Cells and Materials 29:303–13.


ZIJLSTRA, G.S., J. WOLTING, J. PROP, A. H. PETERSEN, W. L. J. HINRICHS, D. R. A UGES, H. A M. KERSTJENS, W. VAN DER BIJ UND H. W. FRIJLINK. 2009. “Efficacy of a new pulmonary cyclosporine A powder formulation for prevention of transplant rejection in rats.” Journal of Heart and Lung Transplantation 28(5):486–92.

ZIMMERLI, W., F. A WALDVOGEL, P. VAUDAUX UND U. E. NYDEGGER. 1982. “Pathogenesis of foreign body infection: Description and characteristics of an animal model.” The Journal of infectious diseases 146(4):487–97.

Danksagung 84

DANKSAGUNG

Ich danke Herrn Prof. André Bleich für die Übernahme der Arbeit für die Tierärztliche

Hochschule Hannover.

Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Prof. Kerstin Schwabe für die Überlassung des

Themas und die jederzeit hervorragende wissenschaftliche Betreuung. Ich möchte

mich für die stetige Hilfsbereitschaft und ihr Vertrauen bedanken, was zu so einem

tollen Arbeitsklima geführt hat.

Vielen Dank an Dr. Silke Glage für die Hilfe bei der Entwicklung des histologischen

Scores und für die ganze Zeit, meine anschließenden Fragen zu beantworten.

Herzlichen Dank an Dr. Andreas Winkel, der mir bei vielen Fragen sehr geholfen und

somit diese Arbeit unterstützt hat.

Ich bedanke mich bei Marly Dalton für die Anzüchtung und Konzentration der

Bakterien und für die jederzeit nette Unterstützung.

Ebenso gilt mein Dank der Abteilung Mikrobiologie des Institutes für

Versuchstierkunde und Zentralem Tierlaboratorium für die Überlassung des

rattenpathogenen Staphylococcus aureus Stammes.

Ich danke der gesamten Arbeitsgruppe der Experimentellen Neurochirurgie, dass sie

mich so nett aufgenommen hat, für eine tolle Arbeitsatmosphäre und die viele Hilfe.

Vielen Dank an Nadine John für die netten Gespräche und die wissenschaftliche

Unterstützung. Lieben Dank an Anne Beck, dass ich so oft zu ihr kommen konnte für

eine kurze Abwechslung und Motivation. Vielen Dank an Svilen Angelov für die nette

Tischnachbarschaft. Ebenso gilt mein Dank Jürgen Wittek und Monika van Iterson für

die jederzeit tolle Unterstützung.

Ich danke Claudia Feldbusch und Veronique Watzlaw für die immer sehr nette und

zuverlässige Betreuung der Tiere.

Ich danke Luzie Rettenbeck für die „fachfremde Korrektur“ meiner Arbeit, ihre

Danksagung 85

gesamte Unterstützung und die tolle Freundschaft.

Ich danke Alexandra Thoms, Uta Böttner, Maria Leurs, Eva Nordemann, Inga

Konieczny und Anna Tippe dafür, dass sie mich aufgeheitert haben, wenn es nötig

war. Dafür, dass sie mich abgelenkt haben, mir zugehört haben, mich unterstützt

haben und ich mich immer auf sie verlassen kann.

Ein großer Dank gilt meinen Eltern für die Unterstützung auf meinem Weg dorthin,

wo ich heute bin. Ohne sie wäre vieles nicht möglich gewesen.

Ich danke Triny und Onida für das Glück, das sie mir jeden Tag schenken.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Mann Frederic, auf den ich mich immer

verlassen kann und der mich unterstützt, unabhängig davon, was ich mir

vorgenommen habe, was bestimmt nicht immer leicht für ihn ist. Ich bin unendlich

dankbar dafür, dass er mein Leben jeden Tag aufs Neue so sehr bereichert.

Zuletzt danke ich „Biofabrication“ für die finanzielle Unterstützung meiner

Doktorarbeit.

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