Charakterisierung von Bakterienpopulationen

auf Pflanzenwurzeln mit CLSM-VolumendatenK. Rodenacker, B. A. Hense, M. Rothballer

IBÖ/ARB

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Inhalt

Stichwörter

Material

Methoden

Beobachtungen

Zusammenfassung

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Stichwörter

• CLSM-Volumendaten -Stacks

o Automatische ErfassungStackfolgen zeitlich/örtlich

o Auflösung (pixel/voxel size):x,y: 0,64 mz: 1,00 m

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Stichwörter

• Pflanzenwurzelno Komplexer Aufbau (variabel über

Zeit und Raum)

o Multifunktionelles Organ

o Strukturierte Oberfläche

o Interaktionen mit anderen Organismen

o Autofluoreszenz

Bild aus: Ehlers/Noll: "Zellbiologie" (Serie Biologie), Westermann, Wien 

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Stichwörter

• Bakterienpopulationeno pathogene, PGPR

(plant growth promoting)

o Epiphyt/Endophyt(extra-/intrazellulär)

o Interaktionen: Nährstoffe, pathogene Substanzen, Antibiotika u.a.

o Kommunikation

10 µm

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Stichwörter

• Charakterisierungo Größe, Intensität

o Anzahl

o Lageo Nachbarschaft

räumliche Beziehung

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Material

• Bakterium: Azospirillum brasilense sp7

o Epiphyt

o GFP-Markierung

(induziert durch Wurzelexudate)

• Pflanze: Weizeno Monoxenisch

o Nährmedium

Biologische Biologische FragestellungFragestellungAufklärung der Aufklärung der molekularen molekularen Kommunikation und Kommunikation und Interaktion von Bakterien Interaktion von Bakterien auf der Wurzelauf der Wurzel

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Material

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Methoden

• Qualitativo Visualisierung

• Quantitativo Segmentation

o Interaktion

o Vermessung

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Methoden

• Qualitativo Visualisierung (Anaglyph)

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Methoden

• Qualitativo Visualisierung (orthogonale Schnitte)

Original Bearbeitetes Original

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Methoden

• Qualitativo Visualisierung

(virtual reality)Lokalisierung von Bakterien

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Methoden

• Quantitativo Segmentation

Wurzel

Fermeture Radius 13*.64µmSchwelle: 5

-> Wurzelvolumen

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Methoden

• Quantitativo Segmentation

Bakterien in zwei verschiedenen Kanälen

-> Bakterienvolumen-> Anzahl Cluster ...

Bakterien

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Methoden

• Quantitativo Vermessung

Bakterien: Volumen Projizierte Fläche Fluoreszenzintensität Lage Ausdehnung in x, y und z

o Wurzeln: Volumen Fluoreszenzintensität

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Methoden

• Quantitativ (Anzahl Bakterien)o Bestimmung der maximalen projizierten

Fläche von isolierten Bakterieno Berechnung des mittleren Volumen

-> Schätzung der Anzahl aus der Volumenverteilung-> Schätzung der Anzahl von Bakterienclustern

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Methoden

• Qualitativo Visualisierung (Größen)

interaktive Auswahl von Bakterien nach Größe

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Methoden

• Bakterieno Anzahlschätzung

für zusammen-hängende Objekte aus der Volumenverteilung

Vorgabe mittleres Volumen

Residual

Fitfunktion

isoliert

doppelt3-fach

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Beobachtungen

• Wurzel Oberfläche/Volumen

Wurzel 1 Wurzel 2

Positionen 10 10

Volumen eines Stacks 40x512x512 60x512x512 pixel

tot. Volumen 42,95 64,42 106 µm3

tot. Fläche 1,07 1,07 mm2

geschätztes Wurzelvolumen Vw 33,10 49,34 106 µm3

geschätzte Wurzeloberfläche Aw 1,00 1,03 mm2

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Beobachtungen

• Bakterien Volumen/Projizierte Fläche/Anzahlen

Wurzel 1 Wurzel 2tot. Bakterienvolumen VtB 21788,26 33284,92 µm3

proj. Bakterienfläche 6959,51 9933,62 µm2

Anzahl zhgd. Bakterien(cluster) nB 1749 1710

maximale proj. Bakterienfläche 11 15 pixel

maximale proj. Bakterienfläche 4,51 6,14 µm2

mittleres Bakterienvolumen VB 6,14 12,70 µm3

geschätzte Bakterienanzahl VtB/VB 3546 2621

aus Histogramm 3598 2555

geschätzte Bakterienanzahl isoliert 1021 1290

geschätzte Bakterienanzahl doppelt 427 210

geschätzte Bakterienanzahl 3-fach 129 174

geschätzte Bakterienanzahl 4-fach 82 0

geschätzte Bakterienanzahl 5-fach 18 0

Restvolumen 5640,49 4734,60 µm3

Restanzahl 918 323

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Beobachtungen

• Bakterien Intensität/Auftreten

Wurzel 1 Wurzel 2

Ausdehnung Z-Richtung (MODE) 4 5 µm

Fluoreszenz (MEAN) 42,24 82,41 a.u.

Bakterien/Wurzeloberfläche 3536,38 2536,19 1/mm2

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Zusammenfassung

• ProblemeDurch das Erfassungssystem gegebeno Schwund der Fluoreszenzo Verlust durch nicht ideale Transparenzo Schwer zu standardisierende EinstellbedingungenDurch das Experiment gegebeno Reproduzierbarkeit, Wurzelsphäre, Natur

• Stando Makrogesteuerte Erfassung von Stack-Folgen -Stacks für verbesserte Segmentation

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Zusammenfassung

• Zukunfto Zunehmende Anzahl von unterschiedlich markierten

Bakterien

• Info o http://rhizosphere.gsf.de

• Dank ano David Fanningo Robert Schäfero Konrad Sandau