Date post: | 05-Apr-2015 |
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Charakterisierung von Bakterienpopulationen
auf Pflanzenwurzeln mit CLSM-VolumendatenK. Rodenacker, B. A. Hense, M. Rothballer
IBÖ/ARB
© Rodenacker
Inhalt
Stichwörter
Material
Methoden
Beobachtungen
Zusammenfassung
© Rodenacker
Stichwörter
• CLSM-Volumendaten -Stacks
o Automatische ErfassungStackfolgen zeitlich/örtlich
o Auflösung (pixel/voxel size):x,y: 0,64 mz: 1,00 m
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Stichwörter
• Pflanzenwurzelno Komplexer Aufbau (variabel über
Zeit und Raum)
o Multifunktionelles Organ
o Strukturierte Oberfläche
o Interaktionen mit anderen Organismen
o Autofluoreszenz
Bild aus: Ehlers/Noll: "Zellbiologie" (Serie Biologie), Westermann, Wien
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Stichwörter
• Bakterienpopulationeno pathogene, PGPR
(plant growth promoting)
o Epiphyt/Endophyt(extra-/intrazellulär)
o Interaktionen: Nährstoffe, pathogene Substanzen, Antibiotika u.a.
o Kommunikation
10 µm
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Stichwörter
• Charakterisierungo Größe, Intensität
o Anzahl
o Lageo Nachbarschaft
räumliche Beziehung
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Material
• Bakterium: Azospirillum brasilense sp7
o Epiphyt
o GFP-Markierung
(induziert durch Wurzelexudate)
• Pflanze: Weizeno Monoxenisch
o Nährmedium
Biologische Biologische FragestellungFragestellungAufklärung der Aufklärung der molekularen molekularen Kommunikation und Kommunikation und Interaktion von Bakterien Interaktion von Bakterien auf der Wurzelauf der Wurzel
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Material
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Methoden
• Qualitativo Visualisierung
• Quantitativo Segmentation
o Interaktion
o Vermessung
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Methoden
• Qualitativo Visualisierung (Anaglyph)
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Methoden
• Qualitativo Visualisierung (orthogonale Schnitte)
Original Bearbeitetes Original
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Methoden
• Qualitativo Visualisierung
(virtual reality)Lokalisierung von Bakterien
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Methoden
• Quantitativo Segmentation
Wurzel
Fermeture Radius 13*.64µmSchwelle: 5
-> Wurzelvolumen
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Methoden
• Quantitativo Segmentation
Bakterien in zwei verschiedenen Kanälen
-> Bakterienvolumen-> Anzahl Cluster ...
Bakterien
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Methoden
• Quantitativo Vermessung
Bakterien: Volumen Projizierte Fläche Fluoreszenzintensität Lage Ausdehnung in x, y und z
o Wurzeln: Volumen Fluoreszenzintensität
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Methoden
• Quantitativ (Anzahl Bakterien)o Bestimmung der maximalen projizierten
Fläche von isolierten Bakterieno Berechnung des mittleren Volumen
-> Schätzung der Anzahl aus der Volumenverteilung-> Schätzung der Anzahl von Bakterienclustern
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Methoden
• Qualitativo Visualisierung (Größen)
interaktive Auswahl von Bakterien nach Größe
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Methoden
• Bakterieno Anzahlschätzung
für zusammen-hängende Objekte aus der Volumenverteilung
Vorgabe mittleres Volumen
Residual
Fitfunktion
isoliert
doppelt3-fach
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Beobachtungen
• Wurzel Oberfläche/Volumen
Wurzel 1 Wurzel 2
Positionen 10 10
Volumen eines Stacks 40x512x512 60x512x512 pixel
tot. Volumen 42,95 64,42 106 µm3
tot. Fläche 1,07 1,07 mm2
geschätztes Wurzelvolumen Vw 33,10 49,34 106 µm3
geschätzte Wurzeloberfläche Aw 1,00 1,03 mm2
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Beobachtungen
• Bakterien Volumen/Projizierte Fläche/Anzahlen
Wurzel 1 Wurzel 2tot. Bakterienvolumen VtB 21788,26 33284,92 µm3
proj. Bakterienfläche 6959,51 9933,62 µm2
Anzahl zhgd. Bakterien(cluster) nB 1749 1710
maximale proj. Bakterienfläche 11 15 pixel
maximale proj. Bakterienfläche 4,51 6,14 µm2
mittleres Bakterienvolumen VB 6,14 12,70 µm3
geschätzte Bakterienanzahl VtB/VB 3546 2621
aus Histogramm 3598 2555
geschätzte Bakterienanzahl isoliert 1021 1290
geschätzte Bakterienanzahl doppelt 427 210
geschätzte Bakterienanzahl 3-fach 129 174
geschätzte Bakterienanzahl 4-fach 82 0
geschätzte Bakterienanzahl 5-fach 18 0
Restvolumen 5640,49 4734,60 µm3
Restanzahl 918 323
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Beobachtungen
• Bakterien Intensität/Auftreten
Wurzel 1 Wurzel 2
Ausdehnung Z-Richtung (MODE) 4 5 µm
Fluoreszenz (MEAN) 42,24 82,41 a.u.
Bakterien/Wurzeloberfläche 3536,38 2536,19 1/mm2
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Zusammenfassung
• ProblemeDurch das Erfassungssystem gegebeno Schwund der Fluoreszenzo Verlust durch nicht ideale Transparenzo Schwer zu standardisierende EinstellbedingungenDurch das Experiment gegebeno Reproduzierbarkeit, Wurzelsphäre, Natur
• Stando Makrogesteuerte Erfassung von Stack-Folgen -Stacks für verbesserte Segmentation
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Zusammenfassung
• Zukunfto Zunehmende Anzahl von unterschiedlich markierten
Bakterien
• Info o http://rhizosphere.gsf.de
• Dank ano David Fanningo Robert Schäfero Konrad Sandau