1 2 2 1 1Anne Stamm , Sarah Strauß , Peter Vogt , Thomas Scheper , Iliyana Pepelanova
Zentrum für Angewandte ChemieInstitut für Technische ChemieCallinstr. 5 , 30167 Hannover
In Studien konnte gezeigt werden, dass die epidermalen Lipoxygenasen (eLOX) aus Homo sapiens und Ambystoma mexicanum (Axolotl)an der Regeneration der Epidermis beteiligt sind und einen positiven Einfluss auf die Wundheilung haben. In Säugern ist die epidermale Lipoxygenase ALOXe3 u. a. an der Regu-lation der Differenzierung von Keratinocyten beteiligt,im Axolotl hingegen konnte eine epidermale Lipoxygenase (AmbLOXe) nachgewiesen werden,
Ziel I
.
Produktion und Analyse epidermaler Lipoxygenasen mittels biotechnologischer Methoden
die vor allem während der Neuentwicklung der Gliedmaßen exprimiertwird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass AmbLOXe eine
positive Wirkung auf die Wundheilungseigenschaften humaner Zellen hat. Aus diesen Gründen bieten
epidermale Lipoxygenasen ein vielversprechendes Werkzeug für unterschiedliche klinische An-
wendungen insbesondere in der narbenfreien Wundheilung.
Methoden & Ergebnisse
Zusammenfassung & Ausblick
Entwicklung eines
Wundheilungsassays mit
Proteinaggregaten
Nutzung de r P ro te inagg rega te (Inclusion Bodies) aus Escherichia coli
zur Gewinnung von funktionellem Enzym
Produktion und Aufreinigung der Proteine: Wundheilungsassays:
- Wundheilungsassay mit Inclusion Bodies konnte etabliert werden- Epidermale Lipoxygenasen zeigen Potential in der Wundheilung in in vitro
Experimenten
- Um bessere Reproduzierbarkeit zu erreichen, sollte das Design der Assays angepasst werden- Weitere Charakterisierung der Inclusion Bodies notwendig
Ziel II
Determininat ion der Wundhei l-ungseigenschaften der Enzyme ALOXe3 ( H . s a p i e n s ) und AmbLOXe ( A .
mexicanum) in Inclusion Bodies
Abbildung 1: Densitometrische Konzentrationsbe-stimmung anhand einer BSA Standard-reihe; Ausbeute an Inclusion Bodies (IBs): - ALOXe3 (83 kDa): 175 mg in 1 L Kulturbrühe- AmbLOXe (74 kDa): 171 mg in 1 L Kulturbrühe;Aufgetragen sind die aufgereinigten Fraktionen von ALOXe3 IBs und
AmbLOXe IBs
Abbildung 2: In Wundheilungsassays genutzte Zellverletzungs-
methoden [1](A) Scratch Assay(B) Stempeln(C) Thermales Verwunden(D) Elektrisches Verwunden mittels Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)(E) Optisches Verwunden mittels eines Lasers
Bei den hier dargestellten Methoden handelt es sich um „echte“ Zellverletzungsmethoden, da die konfluente Zellschicht verletzt wird und nicht wie sonst häufig bei Migrationsassays lediglich eine Barriere für die Zellen besteht.
Abbildung 4: (D) ECISDie höchste verwendete Inclusion Body
Konzentration (0,5 µg) führt zur schnellsten Regeneration der konfluenten Zellschicht
Abbildung 3: (A) Scratch Assay(a) Verlauf des Scratch Assays über 12 Stunden(b) Wundgröße nach 12 Stunden für Wells mit unterschiedlichen ALOXe3 Inclusion Body
Konzentrationen (0 - 1,5 µg / Well)
(a)
0
200.000
400.000
600.000
800.000
1.000.000
1.200.000
1.400.000
0 0,01 0,1 0,5 1 1,5
Wundgröße (Pixel2)
ALOXe3 IB Konzenration pro Well [±g]
(b)
Danksagung:Diese Arbeit wurde als integraler Teil der BIOFABRICATION FOR NIFE Initiative durchgeführt, welche finanziell vom
Niedersächsischen Ministerium für Wissenschaft und Kultur und der VolkswagenStiftung unterstützt wird. (NIFE ist das
niedersächsische Zentrum für Biomedizintechnik, Implantatforschung und Entwicklung, ein translationeller Forschungsverbund der
Medizinischen Hochschule Hannover, der Leibniz Universität, der Tierärztlichen Hochschule und des Laser Zentrums Hannover.)
[1] Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., and Pepelanova, I. (2016). In vitro wound healing assays – state of the art, , 17, 79–87.
1Institut für Technische Chemie, Leibniz Universität Hannover2Klinik für Plastische, Ästhetische, Hand- und Wiederherstellungschirugie, Medizinische Hochschule Hannover
7000
8000
9000
10000
11000
12000
20 25 30 35 40 45 50 55
Impedanz [Ohm]
Zeit [h]
ALOXe3 0,01 ±g ALOXe3 0,1 ±g ALOXe3 0,5 ±g Unverletzte Zellen Keine Zellen
Zelllyse
Entfernung von Rückständen
und Waschschritte
Gereinigte Inclusion
Bodies
Inclusion Bodies:- Aggregation von nicht-gefaltetem, teilweise gefaltetem und korrekt gefaltetem Proteinà Reservoir für funktionelles Enzym - mechanisch stabil- Größe: 50 nm – 1µm
Steriltest
Virusfreie Proteinproduktion in
E. coli (InclusionBodies)
Wundheilungsassay