• Kultivierung tierischer oder pflanzlicher Zellen in einem Nährmedium außerhalb des Organismus
• Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser Zellkultur unbegrenzt fortpflanzen können (Permanente Zelllinien)
• Es werden sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen kultiviert (Primärkultur)
• Prim ärkultur = eine nicht immortalisierte Zellkultur, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde
Zellkultur
ZelllinienZelllinie Herkunft Spezies Gewebe Morphologie
HEK-293 human embryonic Mensch Niere EpithelKidney
HeLa Henrietta Lacks Mensch Zervixkarzinom Epithel
CHO Chinese hamster Hamster Ovarien Epithelovary
Sf-9 Spodoptera Insekt Ovar Epithelfrugiperda (Nachtfalter)
bEnd.3 brain endothelial Maus Gehirn/Cortex Endothel
Zellkulturmedien
Zusammensetzung von Standardmedien:anorganische Salze AminosäurenKohlenhydrateVitaminePeptide und ProteineLipide und FettsäurenSpurenelemente
Medienzusätze
L-GlutaminNatriumpyruvatNichtessentielle AminosäurenNatriumbicarbonatPhenolrotSerum/ fetales Kälberserum
Zellkulturmethoden zum Nachweis von Virusinfektionen
• Als obligat intrazelluläre Erreger können Viren nur in Zell – oder Organkulturen (sowie in Versuchstieren) angezüchtet werden!
• Konsequenzen einer viralen Infektion für die Wirtszelle hängen von Vermehrungstrategie (Replikationsstrategie) des Virus ab
• Latente Persistenz episomaler Genome (HSV)
• Zelltod (Nekrose, Apoptose) (Poliovirus)
• Immortalisierung durch Deregulierung des Zellzyklus (Papillomviren)
Konsequenzen
Zellkulturtechniken in der virologischen Diagnostik
Methode Erreger Erreger- Materialbestandteil
Virus- fast alle Viren infektiöse Abstrich,isolation Partikel Biopsie,
Liquor, Urin
PCR alle Viren Genabschnitte Serum, Plasma,Vollblut, Liquor,Biopsien, Urin,Abstriche, etc.
Antigen- Respiratorische virale Antigene zellhaltiges Material nachweis Viren (z.B. Abstriche) (Immunfluoreszenz)
Zellkulturtechniken in der virologischen Diagnostik
Methode Erreger Erregerbestandteil Material
IFA Respirations- einzelne Struktur- Exfolierte Zellen intrakt-Viren proteine Abstrichen,Sekreten,
Rachenspühlwasser
ELISA HBV, HCV, HIV z.B. HBs-Antigen, SerumHBe-Antigen,p24-Antigen
Elektronen- Gastroenteritis-, Viruspartikel Stuhlprobemikroskopie Herpes- und Bläscheninhalt
Poxviren
Goldstandard - Virusanzucht
• Virusisolation = aufwendiges Verfahren• hoher Zeitaufwand• hohe apparativer und raumtechnischer Aufwand• einige Viren nur sehr schwer und unter
eingeschränkten Bedingungen anzüchtbar (HBV, Parvovirus B19, best. Adenoviren)
• einige können gar nicht in Zellen kultiviert werden (HCV, Papillomviren, Noroviren)
Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen
Wirt Virus
Primäre ZellkulturenAffennierenzellen Influenza-, Parainfluenza-, Enteroviren
Kaninchen-Nierenzellen (RK 13) HSVHumane embryonale Adenoviren, Enteroviren
Nierenzellen (HEK)
Diploide ZellkulturenHumane Fibroblaten (MRC-5 CMV, VZV, HSV, Rhinoviren,
oder WI-38) einige Enteroviren, Adenoviren, RSV
Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen
Wirt Virus
Permanente ZelllinienHep 2 (humanes Epidermoid- RSV, Adenovirus, HSV,
karzinom des Larynx) Masernvirus, einige
Parainfluenza und EnterovirenA549 (humanes Lungenkarzinom) HSV, Adenoviren, Enteroviren
MDCK (Hundenierenzellen) Influenzaviren
LLC-MK2 (Rhesusaffen-Nierenzellen) ParainfluenzaRhabdomyosarkom (RD) Echoviren
Verozellen (African green monkey Coxsackie-, Masern, Mumpsviren
kidney)HeLa (humanes Zervixkarzinom) Adenoviren
Host – shut - off
1. Interaktion mit Transkriptionsapparat2. Interaktion mit zellulärer RNA-Prozessierung3. Interaktion mit Translationapparat4. Interaktion mit DNA-Synthese5. Modifikation zellulärer Proteine
Intrazelluläre Vorgänge werden in einem begrenzten Spektrum an morphologischen Veränderungen sichtbar
Zytopathischer Effekt (CPE)
CPE
Rundzellige, traubenförmige Zelldegenerationbei Viren, die sich vornehmlich
von Zelle zu Zelle, nicht aber
über das Zellkulturmedium ausbreiten
Rundzellige, diffuse Degenerationuniformer Zellen, die sich über die gesamte
Kultur ausbreiten
Polymorphzellige, diffuse Zellgenerationmit Ausbildung von sich aus dem Gewebeverband
ablösenden Zellen
vakuolige (schaumzellartige) Zellveränderungkommt im Frühstadium der Ausbildung eines CPE bei zahlreichen Viren vor
Zellveränderungen sind nicht virusspezifisch und lediglich ein Hinweis auf die Infektion mit Viren!
Aus dem CPE kann nicht eindeutig auf die Identität des verursachenden Virus geschlossen werden
CPE
Identifizierung: Immunfluoreszenz, Immunperoxidasetechniken
Einige Viren rufen CPE bereits nach 24 h hervor, andere erst nach Tagen bis Wochen
CPE
Störfaktoren in der Zellkultur
Kontamination durch Mykoplasmen stellt Hauptproblem dar!
Mykoplasmen positive VerozellenHoechst-Färbung
Zellkerne Verozellen
Mykoplasmen DNA(im Cytoplasma)
Mykoplasmen
• können Bakterienfilter (0,22 µm Porengröße) passieren• kleinste Vertreter der Prokaryoten• gelten als Bakterien (Klasse: Mollicutes)• haben Fähigkeit der Zellwandbildung verloren• ~ 40 % aller Zellkulturen sind in Deutschland mit
Mykoplasmen infiziert sein• Hauptkontaminationsquelle: Mensch! (Rinder)
Auswirkungen eines Mykoplasmenbefalls auf Zellkultu r
ändern Parameter des ZellstoffwechselsAuswirkung auf:� Validität� Reproduzierbarkeit� Signifikanz von Forschungsarbeiten
Auswirkungen auf Zelle:� verlangsamtes Zellwachstum� Verminderung der Zellproliferation� starke Ansäuerung des Mediums� Absterben und Auflösung der Zellen� Veränderung Membranintegrität� Begünstigung von Viruswachstum und Infektionsrate � u.v.m.
Störfaktoren in der Zellkultur
Bakterien stellen den weitaus größten Teil der Kontaminationen im Zellkulturlabor darMeist auf Missachtung bzw. Vernachlässigung der sterilen Arbeitstechniken oder auf Mängel in der Gerätewartung zurückzuführenRegelm äßige Kontrolle der Kulturen!
Antibiotika
Lagerung, Haltbarkeit, Stabilität und Konzentration beachten!
in der Zellkultur häufig verwendet:� Penicillin – G� Streptomycin� (Tylosin)� Gentamycin